DE69531402T2 - Kationische transport-reagenzien - Google Patents

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Description

  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Es werden kationische Lipide bereitgestellt, welche Polynucleotide, Polypeptide, pharmazeutische Substanzen und andere biologisch aktive Spezies binden und durch Membranbarrieren transportieren. Genauer gesagt werden symmetrische kationische Diaminlipide beschrieben, welche mit ausgewählten molekularen Spezies komplexieren und die Zuführung von diesen ausgewählten Spezies in und durch Membranen und vergleichbaren Grenzstrukturen erleichtern.
  • 2. Beschreibung des Standes der Technik
  • Zellulare Transfektionsstrategien zu Gentherapie und ähnlichen Zielen wurden entworfen und durchgeführt, jedoch involvieren viele dieser Prozeduren rekombinante Virusvektoren, und verschiedene Probleme liegen mit diesen Viral-Gen-Transfersystemen vor. Selbst allgemein vorteilhafte Adenovirus-Techniken führen zu Schwierigkeiten, da die meisten Menschen Antikörper für die Adenovirus-Serogruppen, einschließlich jenen, welche als Vektoren gewählt worden sind, besitzen. Eine adenovirale Superinfektion vom Wild-Typ eines mit adenoviralem Vektor behandelten Patienten kann zu einer Propagation des rekombinanten Vektors als einen schädlichen viralen Partikel führen, und zwar mit der Fähigkeit, viele Individuen unerwünscht zu infizieren (wenn so gewählt, dass eine seltene Serogruppe vorliegt). Die Chance einer adenoviralen Kontamination ist ziemlich gering, jedoch nicht unmöglich. Die Sicherheit der Verwendung dieser genetischen Materialien in Menschen bleibt unklar und ist somit gefährlich.
  • Sichere, nichtvirale Vektorverfahren zur Transfektion oder Gentherapie sind essenziell. Es wurden wenige solcher sicheren Lipidzuführsysteme zum Transport von DNA, Proteinen und anderen chemischen Materialien über Membrangrenzen durch Forschungsgruppen und Businesseinrichtungen synthetisiert. Die meisten der Syntheseschemata sind relativ komplex und erzeugen Transporter mit nur begrenzten Transfektionsvermögen. Es besteht ein Bedarf im Bereich von kationischen Lipidtransportern für kationische Spezies, welche eine hohe Transporteffizienz für Biopolymere besitzen. Es ist seit einiger Zeit bekannt, dass von quaternärem Ammonium abgeleitete (kationische) Liposomen spontan mit den DNA assoziieren, mit Zellmembranen verschmelzen und die DNA in das Cytoplasma überführen. LIPOFECTINTM stellt eine erste Gene ration der Entwicklung einer Formulierung aus kationischem Liposom dar. LIPOFECTINTM besteht aus einer 1 : 1-Formulierung der quaternäres Ammonium enthaltenden Verbindung DOT-MA und Dioleoylphosphatidylethanolamin, welche unter Ultraschall zu kleinen unilamellaren Vesikeln in Wasser gemacht wurde. Ein Problem mit LIPOFECTINTM ist das, dass es nichtmetabolisierbare Etherbindungen erhält. Andere Probleme mit LIPOFECTINTM sind eine Inhibition der Proteinkinase-C-Aktivität und eine direkte Cytotoxizität. Als Gegenreaktion auf diese Probleme wurde eine Vielzahl von anderen verwandten Verbindungen entwickelt. Die Diaminverbindungen, die den Gegenstand der Erfindung bilden, verbessern die Fähigkeiten von existierenden kationischen Transportern und dienen als sehr effizientes Zuführmittel für biologisch aktive Chemikalien.
  • Wie direkt oben angegeben, wurden verschiedene kationische Lipide in früheren Referenzen synthetisiert. Zum Beispiel beschreibt das US-Patent-Nr. 4 812 449 eine in situ-aktive Verbindungsanordnung von biologisch aktiven Mitteln an Ziellokationen in Bevorzugung von Umgebungen, welche wünschenswerterweise nicht beeinflusst werden. Mehrere geladene und ungeladene Aminderivate sind beschrieben.
  • In dem US-Patent Nr. 5 171 678 werden Lipopolyamine und ihre Verwendung zur Transfektion von eukaryontischen Zellen eingeführt. Ein Polynukleotid wird mit dem den Gegenstand bildenden Lipopolyamin gemischt und mit den zu behandelnden Zellen kontaktiert.
  • Das US-Patent Nr. 5 186 923 und 5 277 897 betrifft eine Steigerung der zellularen Akkumulation von lipophilen kationischen organometallischen Verbindungen durch die Reduktion des Intramembranpotenzials. Technetium enthaltende Verbindungen sind beschrieben.
  • Lipophile kationische Verbindungen werden in dem US-Patent Nr. 5 208 036 vorgestellt. Asymmetrische Aminverbindungen werden synthetisiert und in einem Verfahren zur DNA-Transfektion angewandt.
  • Das US-Patent Nr. 5 264 618 beschreibt kationische Lipide zur intrazellulären Zuführung von biologisch aktiven Molekülen. Asymmetrische Ammonium enthaltende kationische Lipide werden zum Transport von Molekülen in membran-umgrenzenden Systemen vorgestellt.
  • Die Transfektion von Nukleinsäuren in tierische Zellen über ein neutrales Lipid und ein kationisches Lipid wird in dem US-Patent Nr. 5 279 833 enthüllt. Liposomen mit einer Nukleinsäure-Transfektionsaktivität werden aus dem neutralen Lipid und dem Ammoniumsalz enthaltenden kationischen Lipid gebildet.
  • Das US-Patent Nr. 5 334 761 beschreibt andere aminhaltige kationische Lipide. Kationische Lipide werden eingesetzt, um Aggregate zur Zuführung von Makromolekülen und anderen Verbindungen in Zellen zu bilden.
  • Helvetica Chimica Acta 60 (2), S. 301–325, beschreibt die Herstellung von Hilfsmaterialien für asymmetrische Synthesen aus Weinsäure und die Addition von Butyllithium zu Aldehyden in chiralen Medien. Beschriebene Verbindungen schließen (S,S)-1,4-Butandiaminium,2,3-dimethoxy-N,N,N,N',N',N'-hexamethyldüodid und 1,4-Butandiaminium,2,3-dimethoxy-N,N,N,N',N',N'-hexamethyldiperchlorat ein.
  • J. Electrochem. Soc. 136 (1), S. 113–119, beschreibt stereoselektive Prozesse an mit einem cholesterischen Flüssigkristall modifizierten Elektroden. Verbindungen, die bei der Herstellung von optisch aktiven Elektrolyten verwendet werden, schließen (S,S)- und (R,R)-2,3-Butandiaminium,2,3-dimethoxy-N,N,N,N',N',N'-hexamethyldüodid und ihre Di((-) und (+)-10-Camphorsulfonat)-Äquivalente ein.
  • Huaxue Xuebao 49 (5), S. 507–512, beschreibt die asymmetrische Alkylierung, welche durch chirale Phasentransferkatalysatoren vermittelt wird. Beschriebene Verbindungen schließen 1,4-Butandiaminium-N,N'-Dibutyl-2,3-dimethoxy-N,N,N',N'-tetramethyldibromid und 1,4-Butandiaminium-2,3-dimethoxy-N,N,N'N'-tetramethyl-N-N'-bis(phenylmethyl)dichlorid ein.
  • Chem. Abstr. 58: 3304 beschreibt einige Derivate von 1,4-Bis-(dimethylamino)- und 1,4-Bis(diethylamino)-2,3-dihydroxybutan, einschließlich meso-2,3-Diacetoxytetramethylen-l,4-bis(trimethylammonium)diiodid.
  • Die WO-A-95/17373 beschreibt eng gepackte polykationische Ammonium-, Sulfonium- und Phosphoniumlipide, welche zur Herstellung von Lipidaggregaten zur Zuführung von Makromolekülen und anderen Verbindungen in Zellen brauchbar sind.
  • Die vorstehenden Patente und anderen Dokumente reflektieren den Stand der Technik, von dem die Anmelder Kenntnis haben und sind vor dem Hintergrund zu sehen, dass der Anmelder die wohlbekannte Pflicht zur Offenheit bei der Darlegung von Information hat, welche zu der Untersuchung dieser Anmeldung gehören. Es wird jedoch respektvoll dargelegt, dass keines dieser Dokumente die vom Anmelder beanspruchte Erfindung lehren oder offensichtlich machen, weder einzeln, noch wenn in Kombination betrachtet.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine Kategorie von Diaminen zu offenbaren, welche in starkem Maße die Zuführung von biologisch aktiven Verbindungen durch Membranstrukturen erleichtert.
  • Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine Gruppe von symmetrischen kationischen Diaminverbindungen vorzulegen, welche bei dem Transport von gewählten Makromolekülen und anderen Substanzen in und durch Membrangrenzen unterstützend zu sein.
  • Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist der Bezug auf eine Sammlung von Transportern für biologisch aktive Moleküle mit leicht zu variierenden Lipidkomponenten, die an einer symmetrischen Polyhydroxyl enthaltenden Diaminkernstruktur gebunden sind.
  • Beschrieben sind neue kationische Diamintransportermoleküle, welche die Zuführung von solchen Verbindungen wie Polynukleotiden, Polypeptiden und dergleichen in und durch Membranwände erleichtern.
  • Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung eine Verbindung mit folgender Struktur bereitzustellen:
    Figure 00040001
    worin m = 1 – 10 ist; R1 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe, eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe oder ein Alkyl- oder Alkenylgruppen-haltiger Ether ist; R2 eine Acylgruppe ist;
    R3 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe, eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe oder ein Alkyl- oder Alkenylgruppen-haltiger Ether ist; R4 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe, eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe oder eine Ether-haltige Gruppe ist; und X– ein Anion ist.
  • Die vorliegende Erfindung sieht ebenfalls ein Verfahren zur Transfektion von Zellen ex vivo mit einer biologisch aktiven Spezies vor, umfassend die folgenden Schritte:
    • a) Erzeugen von Lipidvesikeln, welche die biologisch aktiven Spezies, ein Lipid und eine Verbindung der Erfindung umfassen;
    • b) Komplexieren der Vesikel mit einer biologisch aktiven Spezies; und
    • c) Kontaktieren der Lipidvesikel mit zu transfizierenden Zellen.
  • Ebenfalls wird die Verwendung einer Verbindung der Erfindung zur Herstellung einer pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung zur Transfektion von Zellen mit einer biologisch aktiven Spezies bereitgestellt.
  • Insbesondere sind bevorzugte Zusammensetzungen der Erfindung N,N,N',N'-Tetramethyl-N,N'bis(2-hydroxyethyl)-2,3-di(oleoyloxy)-1,4-butandiaminiumiodid, wobei der Spitzname PolyGum im Hinblick auf seine Bindungsaffinität gegeben wurde; O-alkylierte Derivate von PolyGum, N,N'-Dimethyl-N,N,N',N'-tetra(2-hydroxyethyl)-2,3-di(oleoyloxy)-1,4-butandiaminiumiodid und O-alkylierte Derivate von N,N'-Dimethyl'-N,N,N',N'-tetra(2-hydroxyethyl)-2,3-di(oleoyloxy)-1,4-butandiaminiumiodid. Obgleich diese bevorzugte Zusammensetzungen sind, ist die Länge und die Doppelbindungscharakteristik der R2-Gruppe (wie unten detailliert aufgeführt) variabel.
  • Andere Ziele, Vorteile und neue Merkmale der vorliegenden Erfindung werden aus der detaillierten Beschreibung, die folgt, ersichtlich werden, wenn sie in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen betrachtet wird.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die 1 ist eine Grafik, die die Wirksamkeit einer 50 : 50-Mischung von DOPE : PolyGum mit DNA im Vergleich mit DNA allein bei der Transfektion von NIH 3T3-Zellen in einer serumfreien Umgebung zeigt.
  • Die 2 ist eine Grafik, welche zeigt, dass die Liposomstruktur (SV- versus MLV-Formen) die Effizienz des Transfizierens von NIH 3T3-Zellen beeinflusst.
  • Die 3 ist eine Grafik, die die Wirkungen von Serum auf die durch PolyGum (MLV) vermittelte Transfektion von NIH 3T3-Zellen zeigt.
  • Die 4 ist eine Grafik, die den Einfluss von Phosphatidylethanolamin (PE)-Seitenkettenstruktur auf die Transfektion von NIH 3T3-Zellen unter Verwendung einer 50 : 50-Mischung der PE-Derivate und PolyGum in Gegenwart von 10% Kälberserum und ohne Serum zeigt.
  • Die 5 ist eine Grafik, die die Optimierung des Molverhältnisses von DOPE zu Poly-Gum (SV) bei der serumfreien Transfektion von NIH-3T3-Zellen zeigt.
  • Die 6 ist eine Grafik, welche die Optimierung des Ladungsverhältnisses von Poly-Gum (SV) zu DNA bei der serumfreien Transfektion von NIH 3T3-Zellen zeigt.
  • Die 7 ist eine Grafik, welche einen Effizienzvergleich der Nutzung von kationischen Lipiden bei der serumfreien Transfektion von DU-145-Zellen darstellt.
  • Die 8 ist eine Grafik, welche einen Effizienzvergleich von verwendeten kationischen Lipiden bei der Transfektion von DU-145-Zellen in Gegenwart von 2% FBS zeigt.
  • Die 9 ist eine Grafik, welche eine Transfektionsanalyse mit hydrophoben und polaren Domänen von PolyGum und PolyGum-Methoxyderivaten zeigt.
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
  • In Bezug auf die nun folgende Beschreibung und auf die in den 1–9 dargelegten Daten wird eine bevorzugte Ausführungsform eines symmetrischen kationischen Diamins mit mindestens einem Paar an identischen Lipoylresten, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Alkylkette, einer Alkenylkette und einer Alkyl oder Alkenyl enthaltenden Acylkette, beschrieben.
  • Allgemein ist das Diamin polyhydroxyliert und besitzt die folgende verallgemeinerte Struktur:
    Figure 00060001
    worin m = 1 – 10, vorzugsweise 1, ist; R1 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe ist; R2 eine Acylgruppe ist; R3 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe, eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe ist; R4 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe, oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe oder Ether-haltige Gruppe ist; und X– ein Anion ist. Die extra Anzahl, mit m mehr als 1, an Methylen wird durch Standard prozeduren eingeführt, welche die beschriebenen den Gegenstand bildenden synthetischen Wege ergänzen. Die vorliegende Erfindung sieht ebenfalls ein Verfahren der Transfektion von Zellen ex vivo mit einer biologisch aktiven Spezies vor, wobei Lipidvesikel, welche die biologisch aktiven Spezies, ein Lipid und die oben beschriebene Verbindung enthalten, erzeugt werden und mit einer biologisch aktiven Spezies komplexiert werden und mit zu transfizierenden Zellen kontaktiert werden. Die Erfindung sieht ebenfalls die Verwendung dieser Verbindung zur Herstellung einer pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung zur Transfektion von Zellen mit einer biologisch aktiven Spezies vor.
  • Genauer gesagt ist eine bevorzugte Struktur der Verbindung Folgende
    Figure 00070001
    Verbindung A worin für Verbindung A Folgendes gilt: n = 0 – 10, für gewöhnlich zwischen 0 und 3, vorzugsweise 1; R1 ist eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe, im Allgemeinen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise einem Kohlenstoffatom; R2 ist eine Acylgruppe; R3 ist eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe, häufig eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise eine Methylgruppe; und X– ist ein Anion, für gewöhnlich ein Halogenid und vorzugsweise Iodid.
  • Eine zweite bevorzugte Struktur ist:
    Figure 00080001
    Verbindung B wobei für die Verbindung B Folgendes gilt: n = 0 – 10, für gewöhnlich zwischen 0 und 3, vorzugsweise 1; R2 ist eine Acylgruppe, R3 ist eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe, häufig eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise einer Methylgruppe; und X– ist ein Anion, für gewöhnlich ein Halogenid und vorzugsweise Iodid.
  • Eine dritte bevorzugte Struktur ist:
    Figure 00080002
    Verbindung C in der für Verbindung C Folgendes gilt: n = 0 – 10, für gewöhnlich zwischen 0 und 3, vorzugsweise 1; R1 ist eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe, im Allgemeinen mit 1 bis 10 Kohlenstoffstoffen, vorzugsweise einem Kohlenstoff; R2 ist eine Acylgruppe; R3 ist eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe, häufig eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise eine Methylgruppe; R5 ist eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffen; und X– ist ein Anion, für gewöhnlich ein Halogenid und vorzugsweise Iodid.
  • Eine vierte bevorzugte Struktur ist:
    Figure 00090001
    Verbindung D wobei für Verbindung D Folgendes gilt: n = 0 – 10, für gewöhnlich zwischen 0 und 3, vorzugsweise 1; R2 ist eine Acylgruppe; R3 ist eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe, häufig eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, vorzugsweise eine Methylgruppe; R5 ist eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, vorzugsweise eine Methylgruppe; R6 ist eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, vorzugsweise eine Methylgruppe; und X– ist ein Anion, für gewöhnlich ein Halogenid und vorzugsweise Iodid.
  • Um die Diskussion der den Gegenstand bildenden Verbindungen zu erleichtern, folgt eine Liste von Abkürzungen, Spitznamen oder Akronymen:
    DC Cholesterol 3β-[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)-carbamoyl]cholesterol
    DCPE Dicaproylphosphatidylethanolamin
    DMAP 4-(N,N-Dimethylamino)pyridin
    DMEM Dulbecco's modifiziertes Eagles-Medium
    DMPE Dimyristoylphosphatidylethanolamin
    DOGS Dioctadecylamidoglycylspermidin
    DOHME N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N-[1-(2-hydroxyethyl)]-N,Ndimethylammoniumiodid
    DOPE Dioleoylphosphatidylethanolamin
    DOSPA 2,3-Dioleoyloxy-N-[2-(spermincarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-lpropanaminiumtrifluoracetat
    DOTAP N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumiodid
    [DIESTER] (Boehringer Mannheim GmbH)
    DOTMA N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumbromid
    [DIETHER]
    DSPE Distearoylphosphatidylethanolamin
    DU-145 menschliche Prostata-Karzinomzellen für eine repräsentative Human-Tumorzelllinie
    FBS fötales Rinderserum
    Lipofectamin DOSPA + DOPE
    Lipofectin-Reagenz DOTMA + DOPE (Vical Inc.)
    NIH 3T3 Mäuse-Fibroblastenzellen für eine repräsentative Humanzelllinie
    MLV multilamellare Vesikel
    PE Phosphatidylethanolamin
    PolyGum (DO-PG-OH) N,N,N',N'-Tetramethyl-N,N'-bis(2-hydroxyethyl)-2,3-di(oleoyloxy)-1,4-butandiaminiumiodid
    SV ultrabeschallte oder extrudierte Vesikel
    Transfectam-Reagenz DOGS
    DM-PG-OH PolyGum mit Palmitoyl anstelle von Oleoyl
    DO-PG-Me Methoxyderivat von PolyGum
    DP-PG-Me Methoxyderivat von PolyGum mit Palmitoyl anstelle von Oleoyl
    DM-PG-Me Methoxyderivat von PolyGum mit Myristoyl anstelle von Oleoyl
    DL-PG-Me Methoxyderivat von PolyGum mit Lauroyl anstelle von Oleoyl
  • Obgleich andere mögliche Verfahren zur Synthese der den Gegenstand bildenden Verbindungen möglich sind, sind bevorzugte und allgemeine synthetische Schemata für kationische Diaminverbindungen Folgende: Verallgemeinertes Syntheseschema für Verbindung-A-Derivate
    Figure 00110001
    worin: n = 0 – 10; R1 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe ist; R2 eine Acylgruppe ist; R3 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe ist; und X– ein Anion ist.
  • Bei dem allgemeinen Syntheseschema für die Verbindung A involviert die erste Stufe das Umsetzen eines tert-Butyldiphenylsilyloxy-derivatisierten Materials (welches über eine Reaktion des Hydroxyethyl-Ausgangsmaterials mit ClSiPh2tBu hergestellt wurde) mit 1,3-Butandiepoxid in Gegenwart von Lithiumperchlorat in absolutem Ethanol. Die zweite Stufe ist eine Reaktion mit einem Alkyl- oder Alkenylhalogenid oder einem Alkyl oder Alkenyl enthaltenden Acylhalogenid. Die dritte Stufe ist die Tetrabutylammoniumfluorid- und THF-initiierte Entfernung der tert-Butyldiphenylsilyloxy-Schutzgruppen, um die allgemeine Vorläuferverbindung herzustellen. Die allgemeine Vorläuferverbindung wird dann mit einem ausgewählten Alkyl, Alkenyl oder hydroxylierten Alkyl- oder Alkenylhalogenid umgesetzt. Verallgemeinertes Syntheseschema für Verbindung-B-Derivate
    Figure 00120001
    worin: n = 0 – 10; R2 eine Acylgruppe ist; R3 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe ist; und X– ein Anion ist.
  • Bei dem allgemeinen Syntheseschema für die Verbindung B involviert die erste Stufe das Umsetzen eines tert-Butyldiphenylsilyloxy-derivatisierten Materials (welches über eine Reaktion des Dihydroxyethyl-Ausgangsmaterials mit ClSiPh2tBu hergestellt wurde) mit 1,3-Butandiepoxid in Gegenwart von Lithiumperchlorat in absolutem Ethanol. Die zweite Stufe ist eine Reaktion mit einem Alkyl- oder Alkenylhalogenid oder einem Alkyl oder Alkenyl enthaltenden Acylhalogenid. Die dritte Stufe ist die Tetrabutylammoniumfluorid- und THF-initiierte Entfernung der tert-Butyldiphenylsilyloxy-Schutzgruppen, um die allgemeine Vorläuferverbindung herzustellen. Die allgemeine Vorläuferverbindung wird dann mit einem gewählten Alkyl, Alkenyl oder hydroxylierten Alkyl- oder Alkenylhalogenid umgesetzt. Verallgemeinertes Syntheseschema für Verbindung-C-Derivate
    Figure 00130001
    worin: n = 0 – 10; R1 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe ist; R2 eine Acylgruppe ist; R3 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe ist; R5 eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist und X– ein Anion ist.
  • Bei dem allgemeinen Syntheseschema für die Verbindung C involviert der erste Schritt die Umsetzung eines etherhaltigen Ausgangsmaterials mit 1,3-Butandiepoxid in Gegenwart von Lithiumperchlorat in absolutem Ethanol. Die zweite Stufe ist eine Reaktion mit einem Alkyl- oder Alkenylhalogenid oder einem Alkyl- oder einem Alkenyl-haltigen Acylhalogenid. Die allgemeine Vorläuferverbindung wird dann mit einem gewählten Alkyl-, Alkenyl- oder hydroxyliertem Alkyl- oder Alkenylhalogenid umgesetzt. Allgemeines Syntheseschema für Verbindung-D-Derivate
    Figure 00140001
    worin: n = 0 – 10 ist; R2 eine Acylgruppe ist; R3 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe ist; R5 eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise eine Methylgruppe; R6 eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise eine Methylgruppe ist; und X– ein Anion ist.
  • Bei dem allgemeinen Syntheseschema für die Verbindung D involviert die erste Stufe die Umsetzung eines Diether enthaltenden Ausgangsmaterials mit 1,3-Butandiepoxid in Gegenwart von Lithiumperchlorat in absolutem Ethanol. Die zweite Stufe ist eine Reaktion mit einem Alkyloder Alkenylhalogenid oder einem Alkyl oder Alkenyl enthaltenden Acylhalogenid. Die allgemeine Vorläuferverbindung wird dann mit einem gewählten Alkyl-, Alkenyl- oder hydroxyliertem Alkyl- oder Alkenylhalogenid umgesetzt.
  • Eine bevorzugte den Gegenstand bildende Zusammensetzung besitzt folgende Struktur:
    Figure 00150001
    Ein Verbindung-A-Derivat worin R eine Alkyl- oder Alkenylgruppe, vorzugsweise -CH2(CH2)6CH=CH(CH2)7CH3, - (CH2)14CH3, -(CH2)12CH3 oder -(CH2)10CH3 ist, und X– ein Anion, vorzugsweise ein Halogenid wie Iodid, ist.
  • Eine stärker bevorzugte Verbindung-A-Spezies der vorliegenden Erfindung besitzt den Namen N,N,N',N'-Tetramethyl-N,N'-bis(2-hydroxyethyl)-2,3-di(oleoyloxy)-1,4-butandiaminiumiodid (PolyGum) der folgenden Struktur:
  • Figure 00150002
  • Ein Syntheseschema für die bevorzugte Verbindung ist wie folgt:
  • Spezifisches Syntheseschema für ein Verbindung-A-Derivat (PolyGum)
    Figure 00160001
  • Eine zweite bevorzugte Zusammensetzung besitzt die Struktur:
    Figure 00170001
    Ein Verbindung-B-Derivat worin R eine Alkyl- oder Alkenylgruppe, vorzugsweise -CH2(CH2)6CH=CH(CH2)7CH3, -(CH2)14CH3, -(CH2)12CH3 oder -(CH2)10CH3, ist, und X– ein Anion, vorzugsweise ein Halogenid wie Iodid, ist.
  • Insbesondere besitzt eine Verbindung-B-Spezies der vorliegenden Erfindung den Namen N,N'-Dimethyl-N,N,N',N'-tetra(2-hydroxyethyl)-2,3-di(oleoyloxy)-1,4-butandiaminiumiodid mit der folgenden Struktur:
  • Figure 00170002
  • Ein Syntheseschema für die allgemein bevorzugte Verbindung-B-Spezies ist wie folgt:
  • Spezifisches Syntheseschema für ein Verbindung-B-Derivat
    Figure 00180001
  • Eine dritte bevorzugte Zusammensetzung besitzt die Struktur:
    Figure 00190001
    Ein Verbindung-C-Derivat worin R eine Alkyl- oder Alkenylgruppe, vorzugsweise -CH2(CH2)6CH=CH(CH2)7CH3, (CH2)14CH3, -(CH2)12CH3 oder -(CH2)10CH3, ist, und X– ein Anion, vorzugsweise ein Halogenid wie Iodid ist.
  • Insbesondere besitzt eine bevorzugte Verbindung-C-Spezies der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung N,N,N',N'-Tetramethyl-N,N'-bis(2-methoxyethyl)-2,3-di(oleoyloxy)-1,4-butandiaminiumiodid mit der folgenden Struktur:
  • Figure 00190002
  • Ein Syntheseschema für die allgemein bevorzugte Verbindung-C-Spezies ist wie folgt:
  • Spezifisches Syntheseschema für ein Verbindung-C-Derivat
    Figure 00200001
  • Eine vierte bevorzugte Zusammensetzung besitzt die Struktur:
    Figure 00200002
    Ein Verbindung-D-Derivat worin R eine Alkyl- oder Alkenylgruppe, vorzugsweise -CH2(CH2)6CH=CH(CH2)7CH3, -(CH2)14CH3, -(CH2)12CH3 oder -(CH2)10CH3, ist, und X– ein Anion, vorzugsweise ein Halogenid wie Iodid, ist.
  • Eine vierte stärker bevorzugte Verbindung-D-Spezies der vorliegenden Erfindung besitzt den Namen N,N'-Dimethyl-N,N,N',N'-tetra(2-methoxyethyl)-2,3-di(oleoyloxy)-1,4-butandiaminiumiodid mit der folgenden Struktur:
  • Figure 00210001
  • Ein Syntheseschema für die allgemein bevorzugte Verbindung-D-Spezies ist wie folgt:
  • Spezifisches Syntheseschema für ein Verbindung-D-Derivat
    Figure 00220001
  • Beweggründe für Variationen in der hydrophoben Domäne
  • Wie in der bevorzugten Verbindung, PolyGum, sichtbar, sind die langen Lipidschwänze beide Oleoylgruppen, gleichwohl sind andere Lipidschwänze akzeptabel und innerhalb des Bereichs dieser Offenbarung. Eine Untersuchung (Balasubramaniam, R. P., Bennett, M. J., Gruenert, D., Malone, R. W. und Nantz, M. H., "Hydrophobic Domain of Cationic Lipids Influence Respiratory Epithelial Cell DNA Transfection", Manuskript in der Herstellung, welche hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist), welche kationische Lipide, die eine N,N-Dimethyl-N-(2-hydroxyethyl)ammonium-Gruppe [(CH3)2(HOCH2CH2–)N+-R] als hydrophile Domäne (in Poly-Gum vorliegende polare Kopfgruppenkomponente) enthält, und welche verschiedene Fettsäurekombinationen, um die hydrophobe Domäne zu bilden, enthält, hat gezeigt, dass mäßige Ände rangen in der Zusammensetzung der hydrophoben Domäne in der Tat das Leistungsvermögen dieser Lipide als Mediatoren der Polynukleotidzuführung in Säugerzellen (Transfektion) beeinflussen. Gleichwohl zeigten in allen Beispielen die kationischen Lipide Aktivität als Mittel für eine Polynukleotidtransfektion. Deshalb bedeuten die verschiedenen Kombinationen von Fettsäureseitenketten nur analoge Änderungen in der Gesamtstruktur des kationischen Lipids, und in jedem Fall ist das kationische Lipid dazu geeignet, Transfektionsaktivität zu zeigen.
  • Die Derivatisierung von DOHME (ein kationisches asymmetrisches Lipid, welches eine Mono-Ammonium-Kopfgruppe enthält), welches Änderungen in der hydrophoben Domäne involviert, hat zu der Erkenntnis geführt, dass alle Derivate Transfektionsaktivität, jedoch in variierenden Ausmaßen, zeigen. Durch einen Analogienschluss werden Änderungen in der hydrophoben Domäne von PolyGum zu neuen Lipiden führen, welche Transfektionsaktivität besitzen. Zusätzlich wird diese Erwartung durch die jüngste Literaturarbeit (Felgner, P. L. et al. J. Biological Chem. 1994, 269, 2 550) unterstützt, welche zeigt, dass Änderungen in der hydrophoben Domäne in Bezug auf eine konstante polare Kopfgruppe zu Verbindungen führen, welche Transfektionsaktivität zu unterschiedlichen Ausmaßen zeigen.
  • Transfektion oder Membranpenetration wird durch den Einbau der den Gegenstand bildenden Diamine in verschiedene Liposom/DNA-Komplexe und das Exponieren der Zellen unter gewünschten Bedingungen zur Initiierung einer Transfektion gezeigt. Wie es in 1 ersichtlich ist, wobei die Wirksamkeit durch Luciferase-Licht-Emissionen bestimmt wurde (das Luciferase-Plasmid pCMVL, siehe unten, wurde in standardmäßiger Weise eingesetzt, um Transfektionslevel zu detektieren), vermitteltes serumfreies 50 : 50 DOPE : PolyGum SV im Vergleich zu DNA allein in sehr effizienter Weise die DNA-Transfektion von NIH 373-Zellen.
  • Die strukturelle Natur der Transfektionsvesikel beeinflusst die Effizienz der Transfektion. Die 2 zeigt deutlich, dass mit einer 50 : 50 DOPE : PolyGum-Formulierung die SVs viel fähigere Transfektionsträger sind.
  • Die Wirkungen von Serum auf durch PolyGum (MLV) vermittelte Transfektion von NIH 3T3-Zellen wird in der 3 veranschaulicht. Unter diesen Transfektionsbedingungen wird eine deutlich gesteigerte Transfektion unter serumfreien Bedingungen als bei der Gegenwart von 10% Kälberserum gefunden. Unter anderen Transfektionsbedingungen wird wenig Änderung bei einer Serumtransfektion festgestellt. Die 4 zeigt einfach, wie die Transfektion von Zel len mit und ohne Serum beeinflusst wird, wobei die Seitenkettencharakteristika des Phosphatidylethanolamins zur Erzeugung der Vesikel eingesetzt wird. Die 50 : 50 PolyGum : DOPE-Formulierung ist für eine serumfreie Transfektion überlegen, während die 50 : 50 Polygum : DMPE-Formulierung im Fall mit Serumzusetzung das Rennen macht.
  • Wenn das Molverhältnis von DOPE zu Polygum in SVs erhöht wird (siehe 5), wird die Transfektionseffizienz in einer im Allgemeinen linearen Weise gesenkt.
  • Für Polygum enthaltende SVs zeigt die 6 die Optimierungsdaten des DNA-Beladungsverhältnisses. Für die dargelegten Bereiche maximiert ein PolyGum : DNA-Phosphat-Verhältnis von 2 : 1 die Transfektion klar.
  • Wie in den 7 und 8 ersichtlich, verändert die Gegenwart von 2% FBS im Vergleich zu serumfreien Bedingungen die Transfektionslevel für unterschiedliche Formulierungen. Ohne Serum und bei einem Lipid-DNA-Phosphat-Verhältnis von 2 : 1 ist die 50 : 50 DOPE : PolyGum (SV)-Formulierung für eine Transfektion am meisten effizient. Mit Serum ist die 50 : 50 DO-PE : POHME (MLV)-Formulierung in einem Verhältnis von 2 : 1 am effizientesten, gleichwohl ist die 50 : 50 DOPE : PolyGum-Spezies die zweithöchste in der Effizienz zur Transfektion ist. Bei einem Verhältnis von 4 : 1 ist mit Serum die 50 : 50 DOPE : PolyGum (SV)-Formulierung erneut das effizienteste Transfektionsmittel, wobei die MLV 50 : 50 DOPE : PolyGum-Zusammensetzung die zweite ist. Entschieden sei gesagt, dass das PolyGum-Reagenz ein brauchbares Mittel zur Transfektion von Zellen ist.
  • Die 9 stellt Optimierungsdaten für Methoxy-PolyGum-Derivate dar, in welchen der Typ der hydrophoben Seitenkette verändert ist. DP-PG-Me ist am meisten effektiv bei der Transfektion, während das DL-PG-Me-Derivat bei der Transfektion am wenigsten effektiv ist. Es sei angemerkt, dass die Zugabe der Methoxygruppe die Transfektion zu erhöhen scheint, solange die hydrophobe Seitenkette von einem geeigneten Typ ist. Der Vergleich von DM-PG-OH mit DM-PG-Me veranschaulicht, dass, wenn identische hydrophobe Seitenketten vorliegen, die Methoxyform effizienter bei der Transfektion als die Nicht-Methoxy-Form ist.
  • Die Toxizität der den Gegenstand bildenden Verbindungen wurde durch Anwendung der Alamar Blue-Toxizitäts-Standardprozedur evaluiert. Die Ergebnisse zeigen weniger Toxizität sowohl für PolyGum MLV- als auch für SV-Formulierungen als für LIPOFECTiNTM und mehrere andere Amin enthaltende Vesikel.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Chemikalien
  • Dioleoylphosphatidylethanolamin wurde von Avanti Polar Lipids Inc. (Birmingham, Al) gekauft. Lipofectamin wurde von Life Technologies erhalten. Eine DOTAP enthaltende Liposompräparation wurde von Boehringer Mannheim erhalten. Cholesterol wurde von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) gekauft. Alamar blue wurde von Alamar Biosciences (Sacramento, CA) erhalten. 2-Hydroxyethylmethylamin, Di(2-Hydroxyethyl)methylamin, 2-Methoxyethylmethylamin und Di(2-Methoxyethyl)methylamin als Ausgangsmaterialien waren von Aldrich Chemical Company verfügbar.
  • Beispiel 2: Synthese von (±)-2,3-Dihydroxy-l,4-[N,N'-bis(2-tert-butyldiphenylsilyloxyethyl)-N,N'-dimethyl]butandiamin (siehe Verbindung 3 im obigen spezifischen Schema)
  • Zu einer Mischung von (±)-1,3-Butadiendiepoxid (siehe Verbindung 2 im obigen spezifischen Schema, welches von der Aldrich Chemical Company verfügbar ist), (0,93 g, 12,0 mMol) und Lithiumperchlorat (5,09 g, 47,8 mMol) in absolutem Ethanol (50 ml) wurde N-Methyl-2(tertbutyldiphenylsilyloxy)ethylamin (hergestellt gemäß der Prozedur in Chaudhary, S. K.; Hernandez, 0. Tetrahedron Lett. 1979, 99) (siehe Verbindung 1 im obigen spezifischen Schema) (15,0 g, 47,8 mMol) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde auf 60°C erwärmt und 24 Stunden lang gerührt. Nach dieser Zeit ließ man die Reaktionslösung auf Raumtemperatur abkühlen, und dann wurde sie zu einem Et2O (75 ml) enthaltenden Scheidetrichter überführt. Die resultierende Mischung wurde mit gesättigter wässriger NaHCO3 gewaschen. Die organische Schicht wurde abgetrennt und anschließend mit H2O und Kochsalzlösung gewaschen und dann getrocknet (Na2SO4). Das Trocknungsmittel wurde filtriert, und das Filtrat wurde durch Rotationsverdampfung konzentriert, wodurch man das rohe Produkt als ein gelbes Öl erhielt. Die Reinigung wurde durch SiO2-Säulenchromatographie (3% MeOH in CH2Cl2) bewerkstelligt, wodurch man 6,96 g (81%) der Verbindung 3 (im obigen spezifischen Schema) als ein Öl erhielt.
    Rf = 0,44 (10 : 90 Methanol : Dichlormethan); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,67 (m, 8H), 7,39 (m, 12H), 3,74 (t, J = 6 Hz, 4H), 3,64 (m, 2H), 2,73–2,58 (m, 6H), 2,53 (dd, J = 4, 13, 2H). 2,32 (s, 6H), 1,04 (s, 18H); 13C-NMR (75 MHz, CDCl3) δ 135,3, 133,3, 129,6, 127,6, 68,6, 61,5, 60,7, 59,6, 42,9, 26,7, 19,0; IR (KBr) 3 420, 2 931, 1 112 cm–1.
  • Beispiel 3: Synthese von (±)-2,3-Dioleoyloxy-l,4-[N,N'-bis(2-tertbutyldiphenylsilyloxyethyl)-N,N'-dimethyl]butandiamin (siehe Verbindung 4 im obigen spezifischen Schema)
  • Zu einer Mischung einer Diaminverbindung 3 (4,26 g, 5,97 mMol), Triethylamin (1,83 ml, 13,1 mMol) und 4-Dimethylaminopyridin (0,146 g, 1,19 mMol) in CH2Cl2 (30 ml) bei 0°C wurde tropfenweise Oleoylchlorid (3,954 g, 13,14 mMol) gegeben. Nach vollständiger Zugabe wurde die Reaktionsmischung bei 0°C 4 h lang gerührt, woraufhin eine zusätzliche Portion an CH2Cl2 (20 ml) hinzugegeben wurde. Die Reaktionsmischung wurde dann in einen Scheidetrichter überführt, und die organische Schicht wurde der Reihe nach mit gesättigter wässriger NaH-CO3, H2O und Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (Na2SO4), filtriert und das Filtratlösungsmittel im Vakuum entfernt. Das so erhaltene rohe Produkt wurde durch SiO2-Säulenchromatographie (1% MeOH in CH2Cl2) gereinigt, wodurch man 4,21 g (57%) der Verbindung 4 als ein Öl erhielt.
    Rf = 0,31 (1 : 99 Methanol : Dichlormethan); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,66 (m, 8H), 5,35 (m, 4H), 5,15 (m, 2H), 3.68 (t, J = 6 Hz, 4H), 2,59 (t, J = 6 Hz, 4H), 2,49 (m, 4H), 2,27–2,22 (m, 10H), 2,01 (m, 8H), 1,28 (m, 48H), 1,04 (s, 18H), 0,89 (t, J = 7 Hz, 6H); 13C-NMR (75 MHz, CDCl3) δ 172,8, 135,4, 133,6, 129,9, 129,8, 129,6 (2), 129,4, 128,5, 127,5, 70,0, 62,2, 59,7 (2), 58,1, 43,0, 34,2, 31,8, 29,7, 29,4, 29,3, 29,2, 29,1, 29,0, 27,1 (2), 26,7, 24,9, 22,6, 19,0, 14,0; IR (KBr) 2 927, 1 733,2, 1 112 cm–1.
  • Beispiel 4: Synthese von (±)-2,3-Dioleoyloxy-l,4-[N,N'-bis(2-hydroxyethyl)-N,N'dimethyl]butandiamin (siehe Verbindung 5 im obigen spezifischen Schema)
  • Zu einer Lösung von Diaminverbindung 4 (4,21 g, 3,39 mMol) in THF (10 ml) bei 0°C wurde tropfenweise eine Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid (20,4 ml einer 1 M-Lösung in THF, 20,4 mMol) gegeben. Die Reaktion wurde bei 0°C 15 h lang gerührt, wobei nach dieser Zeit die Analyse durch Dünnschichtchromatographie enthüllte, dass kein Ausgangsmaterial mehr vorlag. Die Reaktionsmischung wurde mit CH2Cl2 (20 ml) verdünnt und durch Zugabe von gesättigter wässriger NaHCO3 (50 ml) gelöscht. Die organische Schicht wurde abgetrennt und der Reihe nach mit H2O und Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet (Na2SO4). Nach der Filtration wurde die organische Schicht durch Rotationsverdampfung konzentriert, wodurch man das rohe Produkt als ein gelbes Öl erhielt. Das rohe Produkt wurde durch eine kurze Säule aus Silicagel unter Verwendung von 5% MeOH in CH2Cl2 als Eluent geleitet, um eine Mischung von Produk ten zu erhalten. Ein zweiter chromatographischer Schritt unter Verwendung der SiO2-Säulenchromatographie (5% MeOH in CH2Cl2) ergab 2,00 g (77%) von 5 als ein Öl.
    Rf = 0,48 (5 : 95 Methanol : Dichlormethan); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,33 (m, 6 H), 5,62 (s, 2H); 3,55 (t, J = 5 Hz, 4H), 2,61–2,50 (m, 8H), 2,37 (t, J = 8Hz, 4H), 2,28 (s, 6H), 1,98 (m, 8H), 1,63 (m, 4H), 1,28 (m, 48H); 0,87 (t, J = 5 Hz, 6H); 13C-NMR (75 MHz, CDCl3) δ 173,3, 129,9, 129,7 (3), 129,5, 129,4, 69,5, 69,4, 59,7, 59,6, 59,5 (2), 58,6, 57,8, 42,3, 34,2, 34,0, 31,8, 29,6 (2), 29,4, 29,2 (2), 29,1, 29,0, 27,1, 27,0, 26,8, 24,8, 22,5, 22,4, 14,0, 13,9; IR (KBr) 3 447, 2 925, 1 739, 1 512 cm–1.
  • Beispiel 5: (±)-N,N,N',N'-Tetramethyl-N,N'-bis(2-hydroxyethyl)-2,3-di(oleoyloxy)-1,4-butandiaminiumiodid (siehe Verbindung 6, welches PolyGum im obigen spezifischen Schema ist)
  • Ein 25 ml großer Rundkolben wurde mit Diaminodiolverbindung 5 (1,26 g, 1,65 mMol) und Methyliodid (16,5 ml, 2,65 mMol) befüllt. Die Lösung wurde bei Umgebungstemperatur 24 h lang gerührt. Nach dieser Zeit wurde das Methyliodid unter Zuhilfenahme eines beständigen Stroms an Stickstoffgas abgedampft (Anmerkung: dieser Vorgang muss in einer Abzugshaube durchgeführt werden). Der bei der Entfernung des Methyliodids erhaltene Rückstand wurde zweifach aus Acetonitril umkristallisiert, wodurch man 0,40 g (23%) der Verbindung 6 als ein weißes Pulver erhielt (Schmp.: 169–171°C).
    Rf = 0,28 (5 : 95 Methanol : Dichlormethan); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,60 (m, 2H), 5,33 (m, 4H), 4,53 (m, 8H), 3,47 (s, 6H), 3,42 (s, 6H), 2,50 (m, 4H), 2,00 (m, 8H), 1,65 (m, 4H), 1,29 (m, 44H), 0,88 (t, 6H); IR (KBr) 3 355, 2 901, 1 753, 1 467 cm–1. Die analytische Berechnung für C4gHg472N2O6 ist: C = 54,96; H = 9,03; und N = 2,67 und die gefundenen Mengen waren: C = 54,78; H = 9,04; und N = 2,63.
  • Beispiel 6: Synthese von anderen den Gegenstand bildenden Verbindungen
  • Durch analoge Prozeduren zu jenen für das Oleoylderivat im obigen Beispiel 3 wurden verschiedene Derivate mit hydrophober Seitenkette synthetisiert. In gleicher Weise wurden die Derivate, die aus den Di(2-Hydroxyethyl)methylamin-, 2-Methoxyethylmethylamin- und Di(2-methoxyethyl)methylamin-Ausgangsmaterialien hergestellt worden waren, in einer analogen Weise zu den in den Beispielen 1–5 für das Silan geblockte 2-Hydroxyethylmethylamin dargestellten Stufen synthetisiert, außer dass für die von 2-Methoxyethylmethylamin und Di(2-Methoxyethyl)methylamin abgeleiteten Materialien keine Einführung oder Entfernung von Silan-Blockierungsgruppen erforderlich war (siehe spezifische Schemata für die Verbindungen B und D, oben).
  • Beispiel 7: Gewebekultur und Plasmide
  • NIH 3T3-Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagles-Medium (DMEM) + 10% fötalem Kälberserum wachsen gelassen. Das DNA-Plasmid pCMVL wurde durch Standardverfahren hergestellt und als eine 369 ng/μl-Lösung in TE, pH = 7,6, verwendet. Das Luciferase-Reporterplasmid pCMVL wurde bei UC Davis hergestellt und bestand aus P. pyralis-LuciferasecDNA, die in das Plasmid pRc/CMV (Invitrogen) subkloniert worden war.
  • Beispiel 8: Bildung von MLVs und SVs
  • Multilamellare und kleine ultrabeschallte Vesikel wurden durch Zugabe von kationischem Lipid DOHME zusammen mit DOPE, beide als Lösungen in Chloroform, zu einem 5 ml großen Probenfläschchen hergestellt. Das Chloroform wurde mittels Rotationsverdampfung entfernt, wobei das Wasserbad auf eine konstante Temperatur von 37°C gestellt wurde. Die resultierenden dünnen Lipidfilme wurden über Nacht unter hohem Vakuum gehalten, um sicherzustellen, dass alle Spuren an Lösungsmitteln entfernt worden sind. Die Lipidmischung wurde erneut unter Verwendung von destilliertem Wasser suspendiert (2 mMol Gesamtlipid/1 ml Wasser) und mittels eines Vortex gemischt, um eine Suspension an MLVs zu erhalten. Diese trübe Suspension wurde 15 Minuten lang unter Verwendung eines Ultraschallbads ultrabeschallt, bis eine klare, SVs enthaltende Suspension erhalten worden war.
  • Beispiel 9: Bildung von Liposom/DNA-Komplexen
  • Die sequenzielle Zugabe von DMEM (mit und ohne 10% fötalem Kälberserum), pCMVL-Plasmid (für n = 4, 4 μg) und Liposomformulierung zu einem 2 ml großen Eppendorf-Röhrchen ergab ein Gesamtvolumen von 800 μl. Die relative Menge an verwendetem Liposom : pCMVL-Plasmid wurde durch das gewünschte kationische Lipid: DNA-Phosphat-Ladungsverhältnis bestimmt. Das Mischen dieser Substanzen erfolgte durch Vortexen.
  • Beispiel 10: Transfektion von NIH 3T3-Zellen
  • Für gewöhnlich wurden Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen, welche 5,0 × 104 Zellen/Vertiefung enthielten, die schnell adhärente NIH 3T3-Zellen pro Vertiefung abtrennten, transfiziert. Das Wachstumsmedium wurde durch Wasserstrahlabsaugung entfernt, und die Zellen wurden einmal mit 0,5 ml PBS/Vertiefung gewaschen. Ein 200 μl großes Aliquot an Liposom-DNA-Komplex wurde jeder Vertiefung hinzugesetzt, und die Zellen wurden 4 h lang bei 37°C inkubiert. Sofern erwünscht, wurde während dieser Zeit 1 ml DMEM + 10% fötalem Käl berserum/Vertiefung hinzugesetzt, und die Zellen wurden weitere 48 h lang inkubiert, wonach Tests bezüglich der Toxizität und/oder Effizienz durchgeführt wurden. Äquivalente Prozeduren kamen für DU-145-Zellen zum Einsatz.
  • Beispiel 11: Bestimmung der relativen Luciferase-Lichtemissionen
  • Die Transfektionsaktivität wurde unter Verwendung des Luciferase-Tests gemessen. Luciferase-Tests wurden mit einem Luciferase-Testkit (gekauft von Analytical Luminescence Laboratories) unter Verwendung eines Monolight 2010-Luminometers (Analytical Luminescence Laboratories, San Diego, CA) gemäß den Instruktionen des Herstellers durchgeführt. Die Medien wurden von den transfizierten Zellen mittels Wasserstrahlabsaugung entfernt. 0,5 ml Luciferase-Puffer/Vertiefung wurden hinzugesetzt, und die Zellen wurden 15 Min. auf Eis gegeben. Luciferase-Lichtemissionen von 100 μl des Lysats wurden unter Verwendung des Luminometers gemessen.
  • Beispiel 12: Optimierung der hydrophoben Seitenketten
  • In 9 sind Transfektionsergebnisse mit hydrophober und polarer Domäne für verschiedene synthetisierte PolyGum-Derivate gezeigt. In den Tests wurden 1,0 × 105 NIH 3T3-Fibroblasten 24 Stunden vor der Transfektion ausplattiert. Zelllysate wurden 48 Stunden nach der Transfektion erhalten und bezüglich der spezifischen Luciferase-Aktivität untersucht. Die in der 9 dargelegten Daten entsprechen dem Vermögen des den Gegenstand bildenden kationischen Lipids, die Zuführung von 1 Mikrogramm Plasmid-DNA (pGL3I+) zu vermitteln.
  • Beispiel 13: Alamar Blue-Toxizitätstest
  • Alamar Blue (Alamar Biosciences, Sacramento, CA) wurde in Zellkulturmedium auf 10% verdünnt, Zellen hinzugesetzt und bis zu zwei Stunden inkubiert. Reduzierter Farbstoff wurde unter Verwendung eines CytoFluor 2300-Fluoreszenz-Plattenlesegerätes mit einem 530 nm-Anregungsfilter und einem 590 nm-Emissionsfilter quantifiziert. Die angegebenen Werte stehen für die Fluoreszenz minus Hintergrund. Die gleichen transfizierten Zellen können anschließend bezüglich der Reporterproteinaktivität nach der Alamar Blue-Analyse getestet werden.

Claims (31)

  1. Verbindung der Struktur:
    Figure 00300001
    worin m = 1 – 10 ist; R1 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe, eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe oder ein Alkyl- oder Alkenylgruppen-haltiger Ether ist; R2 eine Acylgruppe ist; R3 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe, eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe oder ein Alkyl- oder Alkenylgruppen-haltiger Ether ist; R4 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe, eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe oder ein Alkyl- oder Alkenylgruppen-haltiger Ether ist; und X– ein Anion ist.
  2. Verbindung nach Anspruch 1 der Struktur:
    Figure 00300002
    worin n = 0 – 10 ist; R2 eine Acylgruppe ist; R3 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe ist; und X– ein Anion ist.
  3. Verbindung nach Anspruch 2, wobei n zwischen 0 und 3 ist und R3 eine Alkylgruppe von 1 bis 10 Kohlenstoffen ist.
  4. Verbindung nach Anspruch 2, wobei n zwischen 0 und 3 ist und R3 eine Methylgruppe ist.
  5. Verbindung nach Anspruch 1 der Struktur:
    Figure 00310001
    worin n = 0 – 10 ist; R1 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe ist; R2 eine Acylgruppe ist; R3 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe ist; R5 eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffen ist; und X– ein Anion ist.
  6. Verbindung nach Anspruch 5, wobei n zwischen 0 und 3 ist, R1 eine Alkylgruppe von 1 bis 10 Kohlenstoffen ist, R3 eine Alkylgruppe von 1 bis 10 Kohlenstoffen ist und R5 eine Alkyloder Alkenylgruppe von 1 bis 10 Kohlenstoffen ist.
  7. Verbindung nach Anspruch 5, wobei n zwischen 0 und 3 ist, R1 eine Methylgruppe ist, R3 eine Methylgruppe ist und R5 eine Methylgruppe ist.
  8. Verbindung nach Anspruch 7, wobei n 1 ist.
  9. Verbindung nach Anspruch 1 der Struktur:
    Figure 00320001
    worin n = 0 – 10 ist; R2 eine Acylgruppe ist; R3 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe ist; R5 eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, vorzugsweise eine Methylgruppe, ist; R6 eine Alkyl- oder Alkenylgruppe von 1 bis 10 Kohlenstoffen, vorzugsweise eine Methylgruppe, ist; und X– ein Anion ist.
  10. Verbindung nach Anspruch 9, wobei n zwischen 0 und 3 ist, R3 eine Alkylgruppe von 1 bis 10 Kohlenstoffen ist, R5 eine Alkyl- oder Alkenylgruppe von 1 bis 10 Kohlenstoffen ist und R6 eine Alkyl- oder Alkenylgruppe von 1 bis 10 Kohlenstoffen ist.
  11. Verbindung nach Anspruch 9, wobei n zwischen 0 und 3 ist, R3 eine Methylgruppe ist, R5 eine Methylgruppe ist und R6 eine Methylgruppe ist.
  12. Verbindung nach Anspruch 11, wobei n 1 ist.
  13. Verbindung nach Anspruch 1 der Struktur:
    Figure 00330001
    worin R eine Alkyl- oder Alkenylgruppe ist; und X– ein Anion ist.
  14. Verbindung nach Anspruch 13, wobei X– ein Halogenid ist.
  15. Verbindung nach Anspruch 1 der Struktur:
    Figure 00330002
    worin R eine Alkyl- oder Alkenylgruppe ist; und X– ein Anion ist.
  16. Verbindung nach Anspruch 15, wobei X– ein Halogenid ist.
  17. Verbindung nach Anspruch 1 der Struktur:
    Figure 00340001
    worin R eine Alkyl- oder Alkenylgruppe ist; und X– ein Anion ist.
  18. Verbindung nach Anspruch 17, wobei X– ein Halogenid ist.
  19. Verbindung nach Anspruch 1 der Struktur:
    Figure 00340002
    worin n = 0 – 10 ist; R1 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe ist; R2 eine Acylgruppe ist; R3 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe ist; und X– ein Anion ist.
  20. Verbindung nach Anspruch 19, wobei n zwischen 0 und 3 ist, R1 eine Alkylgruppe von 1 bis 10 Kohlenstoffen ist und R3 eine Alkylgruppe von 1 bis 10 Kohlenstoffen ist.
  21. Verbindung nach Anspruch 19, wobei n zwischen 0 und 3 ist, R1 eine Methylgruppe ist und R3 eine Methylgruppe ist.
  22. Verbindung nach Anspruch 21, wobei n 1 ist.
  23. Verbindung nach Anspruch 1 der Struktur:
    Figure 00350001
    worin R eine Alkyl- oder Alkenylgruppe ist; und X– ein Anion ist.
  24. Verbindung nach Anspruch 23, wobei R -CH2(CH2)6CH=CH(CH2)7CH3 ist.
  25. Verbindung nach Anspruch 23 oder 24, wobei X– ein Halogenid ist.
  26. Verbindung nach Anspruch 1 der Struktur:
    Figure 00350002
  27. Verbindung nach Anspruch 1 mit der Bezeichnung: N,N,N',N'-Tetramethyl-N,N'-bis(2-hydroxyethyl)-2,3-di(oleoyloxy)-1,4-butandiaminiumiodid.
  28. Verfahren zur Transfektion von Zellen in vitro mit einer biologisch aktiven Spezies, umfassend die Schritte: a) Erzeugen von Lipidvesikeln, enthaltend die biologisch aktive Spezies, ein Lipid und eine Verbindung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche; b) Komplexieren der Vesikel mit einer biologisch aktiven Spezies; und c) Kontaktieren der Lipidvesikel mit zu transfizierenden Zellen.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Verbindung die folgende Struktur aufweist:
    Figure 00360001
    worin m = 1 – 10 ist; R1 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe ist; R2 eine Acylgruppe ist; R3 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe ist; R4 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe ist; und X– ein Anion ist.
  30. Verwendung einer Verbindung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 27 für die Herstellung einer pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung zur Transfizierung von Zellen mit einer biologisch aktiven Spezies.
  31. Verwendung gemäß Anspruch 30, wobei die Verbindung folgende Struktur besitzt:
    Figure 00370001
    worin m = 1 – 10 ist; R1 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe ist; R2 eine Acylgruppe ist; R3 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe ist; R4 eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine hydroxylierte Alkyl- oder Alkenylgruppe ist; und X– ein Anion ist.
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