DE10064870B4 - Schwefelhaltige Amphiphile für den Transfer von biologisch aktiven Molekülen in Zellen - Google Patents

Schwefelhaltige Amphiphile für den Transfer von biologisch aktiven Molekülen in Zellen Download PDF

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Abstract

Verbindungen der allgemeinen Formel I
Figure 00000002
wobei
R1 ein Acylrest aus der Gruppe Lauroyl, Myristoyl, Palmitoyl, Stearoyl, Oleoyl, Linoyl, Linoleyl ist, die Gruppe A ein Rest Lauroyloxy oder Myristoyloxy oder Oleoyloxy ist, wobei A gleich oder von R, verschieden sein kann, wobei bei Vorhandensein eines Stereozentrums das mit A verbundene Methin-Kohlenstoffatom sowohl R- als auch S-konfiguriert oder racemisch vorliegen kann, X eine Gruppe
Figure 00000003
bedeutet,
Y eine Gruppe N+R3R4R5Z- oder eine Gruppe NR3R4 bedeutet, wobei R3 bis R5 unabhängig voneinander einen Rest Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen, eine Gruppe -(CH2)i-OH oder eine Gruppe Gruppe -(CH2)i-NH2 mit i=2-6 bedeuten und Z- ein pharmazeutisch akzeptables Anion darstellt, und wobei m und n unabhängig voneinander eine ganze Zahl von 1 bis 6 bedeuten.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft amphiphile, kationische sulpho-substituierte Phosphatidylethanolamin-Analoga und deren Salze, die in der Lage sind, biologisch aktive Makromoleküle (insbesondere DNA und RNA) in eukaryotische Zellen einzuschleusen.
  • In den letzten 10 Jahren hat sich der Transfer von Biopolymeren, insbesondere von DNA, RNA und Oligonukleotiden, in eukaryotische Zellen zu einem fundamentalen Arbeitsgebiet in der Molekularbiologie und der molekularen Medizin entwickelt[P.A. Martin, S.M. Thomas; Human Gene Therapy 9 (1998) 87–114]. Hierbei sind vor allem gentherapeutische Ansätze, aber auch diagnostische Methoden von besonderem Interesse. Heute bereits teilweise etablierte Verfahren zur Einbringung von DNA in eukaryotische Zellen beruhen darauf, die betreffende DNA-Sequenz mit Hilfe von replikationsdefizienten, rekombinanten Retro-, Adeno- oder adenoassoziierten Viren einzuschleusen. Diese haben jedoch den Nachteil, daß sie bislang nahezu ausschließlich auf ex vivo Anwendungen beschränkt sind, da die viralen Proteine mitunter zu heftigen Immunreaktionen führen und replikationskompetente Viren nicht immer ausgeschlossen werden können. Retroviren weisen zudem den Nachteil auf, daß sie unspezifisch stabil in das Wirtsgenom integrieren und somit potentiell maligne Mutationen auslösen können. Aufgrund dieser Eigenschaften ist es verständlich, daß diese Verfahren extrem hohe Sicherheitsanforderungen stellen und sich nur mit großem finanziellen Aufwand ausführen lassen. Biophysikalische Methoden wie zum Beispiel der Beschuß von Zellen mit DNA-beladenen Goldpartikeln („Biolistik") oder die Elektroporation sind aus offensichtlichen Gründen ebenfalls nur ex vivo anwendbar. Die seit langem bekannte Calciumphosphat-Copräzipitation und die DEAE-Dextran Methode erscheinen wegen ihrer geringen Effizienz als wenig geeignet.
  • Eine weiteres in den letzten Jahren entwickeltes Verfahren zur Einschleusung von biologisch aktiven Makromolekülen in eukaryotische Zellen verwendet kationische Polymere wie Poly-L-lysin, Polyethylenimin oder PAMAM-Dendrimere. Polyanionen wie DNA, RNA oder Oligonukleotide bilden mit diesen über elektrostatische Wechselwirkungen Aggregate und werden in dieser Form von den Zellen vermutlich über Endocytose aufgenommen.
  • Poly-L-lysin muß jedoch zuvor durch chemische Reaktion mit Rezeptorliganden (z.B. Transferrin, Glycoproteine)[E. Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 3410–3414] oder endosomolytischen Peptiden [E. Wagner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 7934–7938] modifiziert werden um eine hinreichende Effizienz aufzuweisen.
  • Deshalb und aufgrund ihres polymeren Charakters sind Verbindungen dieses Typs sehr heterogen zusammengesetzte Substanzgemische und lassen sich daher nur mit großem Aufwand in definierter Form produzieren.
  • Ein weiteres Verfahren, welches in den letzten Jahren stark an Bedeutung gewonnen hat, basiert auf den grundlegenden Arbeiten von Felgner et al.. Dabei werden aus kationischen, lipidischen Amphiphilen, pur oder in Mischung mit neutralen Phospholipiden wie Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), liposomale oder auch micellare Strukturen generiert [Felgner et al., WO 91/16024]. Diese bilden aufgrund elektrostatischer Wechselwirkungen mit anionischen Biopolymeren (wie DNA oder RNA) Aggregate, welche daraufhin effizient von eukaryotischen Zellen aufgenommen werden. DNA kann so in den Zellkern transportiert werden und führt dann zur Expression des entsprechenden Proteins. Obgleich der Mechanismus hierfür bislang noch nicht aufgeklärt ist, herrscht doch inzwischen Einigkeit darüber, daß die Aggregate durch endocytotische Prozesse über Endosomen in das Zellinnere gelangen. Damit die internalisierten Biopolymere in andere Zellkompartimente (z.B. Cytoplasma oder Zellkern) gelangen können, müssen sie aus den Endosomen austreten, da sie anderweitig in den Lysosomen enzymatisch abgebaut werden. Dieses wird in den meisten Fällen durch die Zumischung des Phospholipids DOPE erreicht, welches aufgrund seiner besonderen konischen Molekülgeometrie in der Lage ist, bereits weit unterhalb (ca. 10°C) einer physiologischen Temperatur von 37°C invertierte hexagonale flüssigkristalline Phasen zu induzieren [J.O. Rädler et al., Science 281 (1998) 78–81]. Diese weisen eine hohe Tendenz zur Verschmelzung mit Doppelschichtstrukturen (z.B. biologische Membranen, endosomale Membranen) auf. In einer Arbeit von Szoka et al. wird postuliert, daß durch diesen Verschmelzungsprozeß anionische, zelluläre Lipide die Ladung der eingeschleusten kationischen Lipide neutralisieren und so die komplexierte DNA ins Cytosol freisetzen [Szoka et al. Biochemistry 35 (1996) 5616–5623].
  • Seit der erstmaligen Beschreibung durch Felgner ist eine Vielzahl, zumeist empirisch gefundener, kationischer Amphiphile für den Transfer von anionischen Makromolekülen, wie z.B. DNA, synthetisiert worden [A.D. Miller, Angew. Chem. 110 (1998) 1862–1880; L. Huang, X. Gao; Gene Therapy 2 (1995) 710–722]. Die bislang bekannten kationischen Amphiphile haben den Nachteil, daß sie keine invertierten hexagonalen Phasen induzieren können. Sie haben daher kaum fusogene Eigenschaften und es müssen Helferlipide wie z.B. DOPE zugemischt werden. Einige Lipide, wie zum Beispiel DOGS [J.P.Behr et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. 86 (1989) 6982–6986]] sind nicht in der Lage, Doppelschichtstrukturen auszubilden und liegen in micellaren Strukturen vor. Auch hier müssen Helferlipide zugemischt werden, um eine hohe Gentransfereffizienz zu erzielen. Die meisten bislang beschriebenen Reagenzien sind daher Multikomponentengemische und die verwendeten Helferlipide, z.B. DOPE, sind hydrolyse- und oxidationsempfindlich. Die Herstellung der . biologisch aktiven Formulierungen ist daher aus pharmazeutischer Sicht mit erheblichem Aufwand verbunden, da die Qualität jeder einzelnen Komponente gesichert sein muß. Viele der bekannten kationischen Lipide, wie z.B. DOTMA oder DLRIE, haben den Nachteil, daß sie aufgrund von Etherbindungen nur schwer metabolisierbar sind und daher deutliche zelltoxische Eigenschaften aufzeigen.
  • Der Erfindung lag somit die Aufgabe zugrunde, neue Amphiphile für den Transfer von Biopolymeren (insbesondere von DNA und RNA) in eukaryotische Zellen zur Verfügung zu stellen,
    • – die leicht metabolisierbar sind und eine geringe Zelltoxizität aufweisen,
    • – die in der Lage sind, hexagonale Phasen zu induzieren und somit stark fusogene Eigenschaften besitzen und dabei gleichzeitig kationisch geladen sind,
    • – die leicht und kostengünstig in großen Mengen produziert werden können.
  • Ein im Hinblick auf die genannten Anforderungen überraschend effizienter Transfer von Biomolekülen, insbesondere von DNA und RNA, in eukaryotische Zellen (Transfektion) läßt sich erreichen, durch die erfindungsgemäßen amphiphilen Polyamine der allgemeinen Formel I,
    Figure 00030001
    wobei
    R1 ein Acylrest aus der Gruppe Lauroyl, Myristoyl, Palmitoyl, Stearoyl, Oleoyl, Linoyl, Linoleyl ist, die Gruppe A ein Rest Lauroyloxy oder Myristoyloxy oder Oleoyloxy ist, wobei A gleich oder von R1 verschieden sein kann, wobei bei Vorhandensein eines Stereozentrums das mit A verbundene Methin-Kohlenstoffatom sowohl R- als auch S-konfiguriert oder racemisch vorliegen kann„
    X eine Gruppe bedeutet,
    Figure 00040001

    Y eine Gruppe N+R3R4R5Z- oder eine Gruppe NR3R4 bedeutet, wobei R3 bis R5 unabhängig voneinander einen Rest Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen, eine Gruppe -(CH2)i-OH oder eine Gruppe Gruppe -(CH2)i-NH2 mit i=2-6 bedeuten und Z- ein pharmazeutisch akzeptables Anion darstellt, und wobei m und n unabhängig voneinander eine ganze Zahl von 1 bis 6 bedeuten.
  • Bevorzugt sind dabei solche Verbindungen, bei denen der Rest R1 ein Alkyl- oder Acylrest aus der Gruppe Laur(o)yl, Myrist(o)yl, Palmit(o)yl, Stear(o)yl, Ole(o)yl, Lin(o)yl, Linoleyl ist und m=2 und n=3 ist. Ganz besonders geeignet sind Moleküle, bei denen R1 ein Rest Lauroyl oder Myristoyl oder Oleoyl ist, die Gruppe A ein Rest Lauroyloxy oder Myristoyloxy oder Oleoyloxy ist, m=2 und n=3 ist, X eine Gruppe -SO2- ist und Y eine Gruppe -NH3 +Z- oder -NH2 bedeutet. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem pharmazeutisch akzeptablen Anion um ein Ion aus der Gruppe Halogenid, Acetat, Trifluoracetat, Phosphat, Tartrat oder Citrat.
  • Die erfindungsgemäßen Lipide eignen sich für den Transfer von biologisch aktiven Makromolekülen, insbesondere von DNA und RNA in eukaryotische Zellen. Dabei können die Lipide in wäßriger (liposomaler) Dispersion oder als Lösung in mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln vorliegen, wobei gleichzeitig andere, bereits bekannte Lipide, wie Phospholipide oder membranassoziierte Steroide, zugemischt sein können. Die DNA (RNA) kann mit Polykationen, insbesondere mit Protaminsulfat vorkomplexiert sein.
  • Die Verwendung der erfindungsgemäßen Reagenzien zum Transfer von biologisch aktiven, anionischen Makromolekülen in eukaryotische Zellen wird gemäß Anspruch 5 realisiert, die Unteransprüche 6 bis 10 sind Vorzugsvarianten
  • Gegenüber den bislang bekannten Transfektionsreagenzien weisen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine Reihe entscheidender Vorteile auf. Moleküle der beschriebenen Art sind strukturell sehr eng mit Phosphatidylethanolamin-Lipiden verwandt. Die Struktureinheit
    Figure 00040002
    der Phophatidylethanolamine ist bei den erfindungsgemäßen Lipiden durch die isoelektronische Gruppe
    Figure 00050001
    ersetzt. Aufgrund der strukturellen Analogie weisen sie eine konische Molekülgeometrie auf und besitzen daher stark membranfusogene Eigenschaften. Dabei wird jedoch die negative Ladung der Phosphorsäureester-Einheit vermieden, so daß die erfindungsgemäßen Lipide positiv geladen sind. Sie können daher mit negativ geladenen Biomolekülen elektrostatische Wechselwirkungen eingehen und diese komplexieren. Ein weiterer Vorteil ist, daß die hier beschriebenen sulphoanalogen Lipide, wie andere Sulphoxide oder Sulfone (z.B. DMSO), eine hohe Membrangängigkeit besitzen. Gegenüber vielen bislang bekannten kationischen Lipiden weisen die erfindungsgemäßen Lipide außerdem Esterbindungen auf und sind daher leicht metabolisierbar und daher potentiell nicht toxisch.
  • Die Herstellung der Verbindungen erfolgt in wenigen Reaktionsschritten aus preiswerten Ausgangschemikalien unter Anwendung der dem Fachmann geläufigen Methoden [Methoden der organischen Chemie (Houben-Weyl) 4. Aufl. Thieme Verlag (Stuttgart) 1952] und Schutzgruppentechniken [T. Greene, P. Wuts; Protective Groups in Organic Synthesis; second ed.; John Wiley & Sons, Inc (New York) 1991).
  • Obwohl die in den Abbildungen gezeigten Reaktionswege und die verwendeten Reagenzien bevorzugte Ausführungsformen repräsentieren, soll der Umfang der Erfindung durch sie nicht eingeschränkt werden (1, 2).
  • Die Erfindung wird nachfolgend durch konkrete Ausführungsbeispiele näher erläutert.
  • Beispiel 1
  • Herstellung von 2-(2,2-Diethyl-1,3-dioxolan-4-yl)ethanol (1)
  • Im 250 ml Rundkolben werden 10,61 g (0,1 mol) 1,2,4-Butantriol in 70 ml wasserfreiem THF gelöst und mit 16 ml (0,15 mol) 3-Pentanon und 580 mg Toluolsulfonsäure versetzt. Daraufhin werden 19 g frisch getrocknetes Molsieb zugesetzt und die Mischung bei RT für 48 Stunden gut geschüttelt.
  • Nach dieser Zeit werden 5 g trockener Ambersep 900 OH Ionenaustauscher zugefügt, für 20 min geschüttelt und dann filtriert. Das Filtrat wird am Rotationsverdampfer vom Lösungsmittel befreit und der Rückstand in 170 ml Ethylacetat aufgenommen. Die Lösung wird dreimal mit je 15 ml ges. NaHCO3-Lösung und dreimal mit je 15 ml ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird über Na2SO4 getrocknet, filtriert und am Rotationsverdampfer vom Lösungsmittel befreit. Nach Trocknung im Vakuum erhält man 5,90 g (34 mmol) eines viskosen, farblosen Öls.
  • Beispiel 2
  • Herstellung von 2-(2,2-Diethyl-1,3-dioxolan-4-yl)ethyl-1-tosylat (2)
  • Im 250 ml Rundkolben werden 5,90 g (34 mmol) Verbindung 1 in 50 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst und mit 9,5 ml Triethylamin versetzt. Über einen Tropftrichter werden dann 7,15 g (37,5 mmol) Tosylchlorid, gelöst in 100ml wasserfreiem Dichlormethan, innerhalb von 20 min unter Rühren bei RT zugetropft. Die Mischung wird 24 h bei RT gerührt und dann mit 557μl (5,1 mmol) N,N-Dimethylethylendiamin versetzt (um überschüssiges Tosylchlorid zu zersetzen). Die Lösung wird in einen Scheidetrichter überführt und dann mit Wasser und verdünnter Salzsäure gewaschen. Abschließend wird noch einmal mit 15ml ges. NaHCO3 Lösung und einmal mit 15ml ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird über Na2SO4 getrocknet, filtriert und am Rotationsverdampfer vom Lösungsmittel befreit. Nach Vakuumtrocknung erhält man 10,21g (31,2 mmol) eines sehr leicht gelblichen, zähen Öls.
  • Beispiel 3
  • Herstellung von S-Acetyl-2-(2,2-diethyl-1,3-dioxolan-4-yl)ethyl-1-thiol (3)
  • Im 250ml Rundkolben werden 6,0 g (18,3mmo1) Verbindung 2 in 150 ml Aceton gelöst und mit 4,18 g (36,6 mmol) fein pulverisiertem Kaliumthioacetat versetzt. Die Mischung wird unter Argon für 72 h bei RT gerührt und daraufhin vom Feststoff abfiltriert. Das Filtrat wird am Rotationsverdampfer vom Lösungsmittel befreit und der Rückstand in 170 ml Ethylacetat aufgenommen.
  • Die Lösung wird im Scheidetrichter 6 mal mit je 40 ml Wasser und abschließend einmal mit 40ml ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird über Na2SO4 getrocknet, filtriert und am Rotationsverdampfer vom Lösungsmittel befreit. Nach Vakuumtrocknung erhält man 4,10 g (17,6 mmol) eines rötlich braunen Öls.
  • Beispiel 4
  • Herstellung von 3-{[2-(2,2-Diethyl-1,3-dioxolan-4-yl)ethyl]thio}propyl-1-tert-butylcarbamat (4)
  • In einem 25 ml Schlenkkolben werden unter Argon 1,243g (5,35 mmol) Verbindung 3 vorgelegt und mit 5,35 ml einer 1 M Lösung von Natriummethanthiolat in wasserfreiem Methanol versetzt. Die Mischung wird für 30min bei RT gerührt und dann das Lösungsmittel im Vakuum unter leichtem Erwärmen entfernt. Die zurückbleibende rotbraune Paste wird noch 15min im Vakuum getrocknet, dann mit Argon der Kolben belüftet und die Masse in 5ml wasserfreiem Methanol gelöst. Daraufhin wird eine Lösung von 1,062 g (4,46 mmol) 3-(Boc-amino)propyl bromid in 5ml wasserfreiem Methanol zugesetzt und die Mischung für 4 h bei RT unter Argon gerührt. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand in 150ml Ethylacetat aufgenommen. Die Lösung wird vier mal mit je 20 ml Wasser und zwei mal mit je 15 ml ges NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird über Na2SO4 getrocknet, filtriert und am Rotationsverdampfer vom Lösungsmittel befreit. Nach Vakuumtrocknung erhält man 2,04 g eines rotbraunen Rohproduktes. Die anschließende chromatographische Reinigung auf 50 g Kieselgel 60 mit Hexan/Essigester als Eluent ergab 1,55 g (4,46mmol) eines farblosen Öls.
  • Beispiel 5
  • Herstellung von 3-{[2-(2,2-Diethyl-l,3-dioxolan-4-yl)ethyl]sulfinyl}propyl-l-tert-butylcarbamat (5)
  • Im 50ml Rundkolben mit aufgesetztem Gasableitungsrohr werden 648 mg Verbindung 4 vorgelegt und mit 169 μl einer 35%igen Wasserstoffperoxidlösung versetzt. Die Mischung wird unter starkem Rühren für 15 h auf 38°C erwärmt, wonach sich eine homogene Phase ausbildet. Nach dieser Zeit wird der Rückstand in 50ml Ethylacetat aufgenommen und mit wenig wasserfreiem Na2SO4 verrührt. Dann wird abfiltriert, gründlich mit Ethylacetat nachgewaschen und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Die anschließende chromatographische Reinigung auf 50 g Kieselgel 60 mit Dichlormethan/Methanol (13:1) als Eluent ergab 594 mg (1,63 mmol) eines farblosen, zähen Öls.
  • Beispiel 6
  • Herstellung von 3-{[2-(2,2-Diethyl-l,3-dioxolan-4-yl)ethyl]sulfonyl}propyl-l-tert-butylcarbamat (6)
  • In einem 50 ml Rundkolben mit aufgesetztem Gasableitungsrohr werden 352 mg Verbindung 5 vorgelegt und mit einer Lösung von 158 mg Kaliumpermanganat in 2ml ges. NaHCO3 Lösung versetzt. Die Mischung wird für 15 h unter Rühren auf 35–38°C erwärmt. Danach wird der Rückstand intensiv mit 70ml Ethylacetat verrührt und anschließend vom unlöslichen Braunstein abfiltriert. Die organische Phase wird über Na2SO4 getrocknet, filtriert und am Rotationsverdampfer vom Lösungsmittel befreit. Die anschließende chromatographische , Reinigung des Rohproduktes auf 50 g Kieselgel 60 mit Dichlormethan/Methanol (20:1) als Eluent ergab 301 mg (0,793 mmol) eines farblosen, sehr zähen Öls.
  • Beispiel 7
  • Herstellung von Herstellung von 3-[(3,4-Dioleoyloxybutyl)sulfonyl]propyl-1-tert-butylcarbamat (7)
  • In einem 10ml Schlenkkolben werden unter Argon 174 mg (459μmol) Verbindung 6 in 1,5 ml wasserfreiem Methanol gelöst. Dann werden über einen Zeitraum von 8 h 6 Portionen von je 100μl einer Lösung von 23,2μl BF3-Etherat in 2ml wasserfreiem MeOH unter Rühren bei RT zugefügt. Danach werden 100 mg eines trockenen Ambersep 900OH- Ionenaustauschers zugegeben und für 5 min gerührt. Nach Abfiltrieren wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand durch Chromatographie auf 20 g Kieselgel 60 mit Dichlormethan/Methanol (10:1) als Eluenten gereinigt. Man erhält 81 mg (260μmol) eines farblosen, sehr zähen Öls.
  • Dieses wird in einem 10ml Rundkolben in 3,5 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst und mit 111 μl Triethylamin versetzt. Unter Rühren und Kühlung werden dann 210 mg Ölsäurechlorid (Reinheit (GC) 99%) langsam über eine Spritze zugefügt. Es wird noch eine katalytische Menge DMAP zugesetzt und die Mischung 18 h bei RT im abgedunkelten Kolben gerührt. Anschließend wird die Lösung. mit 40ml Dichlormethan in einen Scheidetrichter überführt und zwei mal mit je 5 ml leicht HCl-saurem Wasser und ein mal mit 5 ml Wasser gewaschen. Dann wird noch einmal mit 5ml leicht alkalischem Wasser (NaHCO3) gewaschen und die organische Phase nach Trocknung über Na2SO4 am Rotationsverdampfer vom Lösungsmittel befreit. Die anschließende chromatographische Reinigung auf 20 g Kieselgel 60 mit Hexan/Essigester (2:1) als Eluent ergab 105 mg (125 μmol) eines farblosen, zähen Öls.
  • Beispiel 8
  • Herstellung von
  • Herstellung von 3-[(3,4-Dioleoyloxybutyl)sulfinyl]propyl-1-tert-butylcarbamat (8)
  • In einem 10ml Schlenkkolben werden unter Argon 200 mg (550μmol) Verbindung 5 in 1,5 ml wasserfreiem Methanol gelöst.
  • Dann werden über einen Zeitraum von 8 h 6 Portionen von je 100μl einer Lösung von 27,6 μ1 BF3-Etherat in 2ml wasserfreiem MeOH unter Rühren bei RT zugefügt. Danach werden 120 mg eines trockenen Ambersep 900OH- Ionenaustauschers zugegeben und für 5 min gerührt. Nach Abfiltrieren wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand (182mg) durch Chromatographie auf 20 g Kieselgel 60 mit Dichlormethan/Methanol (9:1) als Eluenten gereinigt. Man erhält 66 mg (223μmol) eines farblosen, sehr zähen Öls.
  • Dieses wird in einem 10ml Rundkolben in 3,5 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst und mit 125μl Triethylamin versetzt. Unter Rühren und Kühlung werden dann 250 mg Ölsäurechlorid (Reinheit (GC) 99%) langsam über eine Spritze zugefügt. Es wird noch eine katalytische Menge DMAP zugesetzt und die Mischung 18 h bei RT im abgedunkelten Kolben gerührt. Anschließend wird die Lösung mit 40ml Dichlormethan in einen Scheidetrichter überführt und zwei mal mit je 5 ml leicht HCl-saurem Wasser und ein mal mit 5 ml Wasser gewaschen. Dann wird noch einmal mit 5ml leicht alkalischem Wasser (NaHCO3) gewaschen und die organische Phase nach Trocknung über Na2SO4 am Rotationsverdampfer vom Lösungsmittel befreit. Die anschließende chromatographische Reinigung auf 20 g Kieselgel 60 mit Hexan/Essigester (1:1) als Eluent ergab 64 mg (78 μmol) eines farblosen, zähen Öls.
  • Beispiel 9
  • Herstellung von Herstellung von 3-[(3,4-Dioleoyloxybutyl)sulfonyl]propyl-l-ammonium trifluoracetat (9) (Sulfectin A)
  • In einem 10ml Schlenkkolben werden unter Argon 52 mg (62 μmol) Verbindung 7, gelöst in 600 μ1 wasserfreiem Dichlormethan, vorgelegt. Unter Kühlung und Rühren werden dann 400 μ1 Trifluoressigsäure zugefügt und die Mischung für 30min bei RT gerührt. Dann wird im Hochvakuum das Lösungsmittel ohne Wärmezufuhr entfernt und der Rückstand 1 h im Vakuum getrocknet. Der zurückbleibende Lipidfilm wird zwei mal mit je 1,5 ml wasserfreiem Dichlormethan aufgenommen und im Vakuum vom Lösungsmittel befreit.
  • Abschließend wird diese Prozedur einmal mit 1ml Methanol wiederholt und der Lipidfilm zuletzt für 3 h im Hochvakuum getrocknet. Man erhält 52,4 mg (61,3 μmol) eines farblosen Lipidfilms.
  • Beispiel 10
  • Herstellung von Herstellung von 3-[(3,4-Dioleoyloxybutyl)sulfinyl]propyl-1-ammonium trifluoracetat (10) (Sulfectin B)
  • In einem 10ml Schlenkkolben werden unter Argon 44 mg (54 μmol) Verbindung 8, gelöst in 600 μl wasserfreiem Dichlormethan, vorgelegt. Unter Kühlung und Rühren werden dann 400 μl Trifluoressigsäure zugefügt und die Mischung für 30min bei RT gerührt. Dann wird im Hochvakuum das Lösungsmittel ohne Wärmezufuhr entfernt und der Rückstand 1 h im Vakuum getrocknet. Der zurückbleibende Lipidfilm wird zwei mal mit je 1,5 ml wasserfreiem Dichlormethan aufgenommen und im Vakuum vom Lösungsmittel befreit. Abschließend wird diese Prozedur einmal mit 1ml Methanol wiederholt und der Lipidfilm zuletzt für 3 h im Hochvakuum getrocknet. Man erhält 45 mg (53,6 μmol) eines farblosen Lipidfilms.
  • Beispiel 11
  • Liposomale Formulierung der erfindungsgemäßen Lipide für die Transfektionsexperimente
  • Die Lipide 9 und 10 werden in Chloroform gelöst und im Vakuum zu einem Lipidfilm eingetrocknet. Gegebenenfalls werden sie zuvor mit 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE) in unterschiedlichen molprozentualen Verhältnissen gemischt. Letzte Lösungsmittelreste werden im Hochvakuum entfernt. Daraufhin werden die Lipidfilme in sterilem Wasser rehydratisiert und durch Ultraschallbehandlung die Liposomen generiert. Die Gesamt-Lipidkonzentration der resultierenden Dispersion beträgt dabei 1mg/ml.
  • Beispiel 12
  • Transfektion von adhärenten Zellinien
  • Allgemeines: Die verwendeten Zellinien HeLa (human cervix carcinom), F98 (rat glioblastoma), IMR90 (human embryonal Jung) werden unter Standardbedingungen (gemäß ATCC bzw. EACC-Angaben) bei 37°C/5% CO2 kultiviert (HeLa/MEM-Medium; F98/DMEM-Medium; IMR90/DMEM-Medium). Die kommerziellen Transfektionsreagenzien LipofectAMINETM, Lipofectin®, DOTAP und DAC-30 wurden gemäß den Herstellerangaben verwendet.
  • Beispiel 13
  • Transfektion mit pUT 651-Plasmid
  • Als Reportergen wurde pUT 651-Plasmid (CAYLA, France), welches lacZ unter der Kontrolle eines CMV-Promotors codiert, eingesetzt.
  • Am Tag vor der Transfektion werden 5000-10000 Zellen pro well einer 96-well-Zellkulturplatte ausgesät, so daß sie zur Transfektion eine Konfluenz von ca. 70% aufweisen. Kurz vor der Transfektion wird das Medium durch 80μl/well frisches Medium (10% FCS) ersetzt.
  • Auf einer separaten 96-well-Platte werden die Lipoplexe präpariert, indem 2μg DNA in 40μl serumfreiem Medium mit 2-20μl Liposomendispersion in 40μl serumfreiem Medium gemischt werden. Nach einer Inkubationszeit von ca. 30min bei RT werden je 20μl der Lipoplexdispersion pro well zu den Zellen pipettiert.
  • Nach einer Transfektionszeit von 24 h wird das Medium gewechselt und die Zellen für weitere 48 h inkubiert. Danach wird das Medium abgenommen und die Zellen mit Triton X-100 lysiert. Das Lysat wird mit Chlorphenolrot-β-galactopyranosid (Roche Diagnostics, 1mg/ml in HBSS) als Substrat für β-Galactosidase versetzt und die optische Dichte in unterschiedlichen Zeitabständen mit einem Microplatten-Reader (Dynex) bestimmt (Meßwellenlänge 540nm/Referenzwellenlänge 630nm).

Claims (9)

  1. Verbindungen der allgemeinen Formel I
    Figure 00130001
    wobei R1 ein Acylrest aus der Gruppe Lauroyl, Myristoyl, Palmitoyl, Stearoyl, Oleoyl, Linoyl, Linoleyl ist, die Gruppe A ein Rest Lauroyloxy oder Myristoyloxy oder Oleoyloxy ist, wobei A gleich oder von R, verschieden sein kann, wobei bei Vorhandensein eines Stereozentrums das mit A verbundene Methin-Kohlenstoffatom sowohl R- als auch S-konfiguriert oder racemisch vorliegen kann, X eine Gruppe
    Figure 00130002
    bedeutet, Y eine Gruppe N+R3R4R5Z- oder eine Gruppe NR3R4 bedeutet, wobei R3 bis R5 unabhängig voneinander einen Rest Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen, eine Gruppe -(CH2)i-OH oder eine Gruppe Gruppe -(CH2)i-NH2 mit i=2-6 bedeuten und Z- ein pharmazeutisch akzeptables Anion darstellt, und wobei m und n unabhängig voneinander eine ganze Zahl von 1 bis 6 bedeuten.
  2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R1 ein Rest Lauroyl oder Myristoyl oder Oleoyl ist, m=2 und n=3 ist, X eine Gruppe -SO2- ist und Y eine Gruppe – NH3 +Z- oder -NH2 bedeutet.
  3. Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem pharmazeutisch akzeptablen Anion um ein Ion aus der Gruppe Halogenid, Acetat, Trifluoracetat, Phosphat, Tartrat oder Citrat handelt.
  4. Verwendung eines Reagenzes zum Transfer von biologisch aktiven, anionischen Makromolekülen in eukaryotische Zellen für pharmazeutische oder diagnostische Zwecke, dadurch gekennzeichnet, daß aus dem Reagenz, welches mindestens eine Verbindung der Ansprüche 1 bis 3 enthält, wobei zusätzlich weitere lipidische Verbindungen in unterschiedlichen Anteilen beigemischt sein können, und den biologisch aktiven, anionischen Makromolekülen Aggregate gebildet werden und diese in vivo oder in vitro mit den Zellen in Kontakt gebracht werden.
  5. Verwendung eines Reagenzes nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den biologisch aktiven, anionischen Makromolekülen um DNA, RNA, Antisense-DNA, Antisense-RNA, Oligonukleotide, Ribozyme, Peptide oder Proteine handelt.
  6. Verwendung eines Reagenzes nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die zusätzlich beigemischten lipidischen Verbindungen der Phospholipid- oder Steroidklasse angehören, wobei 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin besonders geeignet ist.
  7. Verwendung eines Reagenzes nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz als Dispersion in wäßrigen Medien oder als Lösung in einem mit Wasser . mischbaren Lösungsmittel vorliegt, wobei im Falle einer wäßrigen Dispersion gleichzeitig Kryo-Schutzmittel aus der Gruppe Lactose, Trehalose, Sucrose, Glucose, Fructose, Galactose, Maltose, Mannitol oder Polyethylenglykol gelöst sein können.
  8. Verwendung eines Reagenzes nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktiven, anionischen Makromoleküle als Komplexe mit polykationischen Molekülen aus der Gruppe Spermin, Spermidin, Protaminsulfat, Histon H1, Histon H2A, Histon H2B, Histon H3, Histon H4, HMG1 oder HMG17 Protein vorliegen können.
  9. Verwendung eines Reagenzes nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die aus den Lipiden und den anionischen Makromolekülen gebildeten Aggregate in lyophilisierter Form gelagert werden, und vor der Anwendung in einem geeignetem wäßrigen Medium rehydratisiert werden.
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