DE69725877T2

DE69725877T2 - Kationische lipid-nukleinsäure komplexe

Info

Publication number: DE69725877T2
Application number: DE69725877T
Authority: DE
Inventors: Rainer Bischoff
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1996-08-26
Filing date: 1997-08-25
Publication date: 2004-07-22
Anticipated expiration: 2017-08-26
Also published as: EP0941066A1; AU729077B2; ATE252891T1; CA2264140A1; DK0941066T3; EP0941066B1; WO1998008489A1; JP2000516948A; AU3781597A; US6271208B1; PT941066E; ES2208936T3; DE69725877D1

Description

Einführung
Die Erfindung ist auf stabile Komplexe von kationischen Lipiden und Nukleinsäure, die verwendet werden können, um Nukleinsäure an eine Zelle abzugeben zum Zwecke der Bereitstellung eines therapeutischen Moleküls für die Zellen eines Individuums, welches eines solche Behandlung benötigt, und auf Verfahren zur Herstellung von stabilen kationisches Lipid-Nukleinsäure-Komplexen gerichtet.
Hintergrund der Erfindung
Eine erfolgreiche Gentherapie hängt von der effizienten Abgabe von genetischer Information an die und Expression von dieser genetischen Information innerhalb der Zellen eines lebenden Organismus ab. Die meisten Abgabemechanismen, die bislang verwendet werden, umfassen virale Vektoren. Viren haben unterschiedliche und hochkomplexe Mechanismen entwickelt, um dieses Ziel zu erreichen, einschließlich des Durchquerens der Zellmembran, Entkommen des lysosomalen Abbaus, Abgabe von deren Genom an den Zellkern, und sind folglich im Rahmen von vielen Genabgabe-Anwendungen verwendet worden.
Nicht-virale Vektoren, die auf Rezeptor-vermittelten Mechanismen (Perales et al., Eur. J. Biochem. 226: 255–266, 1994; Wagner et al., Advanced Drug Delivery Reviews 14: 113–135, 1994) oder auf Lipid-vermittelter Transfektion (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 7413–7417, 1987; Behr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6982–6986, 1989; Gao et al., Biochem. Biophys. Res. Communic. 179: 280–285, 1991; Behr, Bioconjugate Chemistry 5: 382–389, 1994; Fahrhood et al., Annals New York Academy of Sciences, 716: 23–35, 1994; Ledley, Human Gene Therapy 6: 1129–1144, 1995) beruhen, versprechen, in Hinblick auf eine Produktion in großem Maßstab, verringerte Risiken bezogen auf virale Vektoren, zielgerichtetes Ansteuern von transfizierbaren Zellen, geringerer Immunogenität und dem Vermögen, größere Fragmente von DNA abzugeben, Vorteile zu haben.
Die Entwicklung von nicht-viralen Vektoren für die Abgabe von Nukleinsäuren in Zellen erfordert Moleküle, die mit Nukleinsäuren eine Assoziation eingehen können, um es diesen großen hydrophilen Polyanionen zu erlauben, die Zellmembran, die eine hydrophobe, negativ geladene Barriere aus einer Phospholipid-Doppelschicht ist, zu durchqueren, diesen helfen können, dem lysosomalen Abbau zu entrinnen, und deren Eintreten in den Zellkern erleichtern können. Eine Expression des Gens von Interesse hängt auch von der Zugänglichkeit der abgegebenen Nukleinsäure gegenüber der zellulären Transkriptionsmaschinerie ab, welche höchstwahrscheinlich eine Dissoziation der Komplexe erforderlich machen.
Obwohl sie bereits in 1965 beschrieben worden sind (Bangham et al., J. Mol. Biol. 13: 238–252, 1965), sind Liposome, die Moleküle von Interesse für eine Abgabe an die Zelle verkapseln können, als injizierbare Therapeutika bei Menschen erst in den 90er Jahren des letzten Jahrhunderts auf den Markt gekommen (Gregoriadis, Trends in Biotechnol. 13: 527–537, 1995). Diese Verzögerung kann Schwierigkeiten bei der Herstellung reproduzierbarer Formulierungen mit akzeptablen Stabilitäten zugeschrieben werden. Ein hauptsächlicher Durchbruch war die Entwicklung von "sterisch stabilisierten ("stealth") Liposomen", die einen bestimmten Prozentsatz von Polyethylenglycol (PEG)-modifizierten Phospholipiden (PEG-PLs) enthielten (Gregoriadis, Trends in Biotechnol. 13: 527– 537, 1995; Lasic, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 1685–1698, 1994). Diese PEG-PL enthaltenden Liposome erwiesen sich als erfolgreicher bei dem Entkommen der Detektion und der Eliminierung durch das retikuloendotheliale System, was zu stark erhöhten Halbwertszeiten im Blutkreislauf führte. Obwohl (PEG)-modifizierte Liposome am intensivsten verwendet worden sind, sind andere hydrophile Polymere, wie Poly(vinylpyrrolidon), die die Stabilität von Liposomen erhöhen, wenn sie auf deren Oberfläche aufgepfropft werden, beschrieben worden (Torchilin, V. P., et al., Biochim. Biophys. Acta 1195: 181– 184, 1994).
Der Fortschritt bei dem Lipid-vermittelten Nukleinsäuretransfer in Zellen wurde mit der Einführung von kationischen Lipiden als Vehikel für den Transfer von Nukleinsäuren in Zellen vorangebracht (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 7413–7417, 1987; Behr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 6982–6986, 1989; Gao et al., Biochem. Biophys. Res. Communic. 179: 280–285, 1991; Behr, Bioconjugate Chemistry 5: 382–389, 1994; Fahrhood et al., Annals New York Academy of Sciences 716: 23–35, 1994; Ledley, Human Gene Therapy 6: 1129– 1144, 1995). Da kationische Lipide positiv geladen sind, sind sie in der Lage, einen Komplex mit negativ geladenen Nukleinsäuren zu bilden. Anders als Liposome erfordern diese Komplexe keinen Verkapselungsschritt und werden durch einfaches Mischen von Bestandteilen hergestellt. Die Komplexe umfassen im wesentlichen Lipid-überzogene Nukleinsäure, bei denen der positiv geladene Überzug des Komplexes die negativen Ladungen der Nukleinsäure neutralisiert und auch effizient an die negativ geladene Zelloberfläche binden kann, wodurch der Eintritt von Nukleinsäure in die Zelle vereinfacht wird (Farhood et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 716: 23–35, 1994).
Die Vorteile einer Verwendung von kationischen Lipiden, um den Transfer von Nukleinsäuren durch Transfektion zu vermitteln, umfassen die Einfachheit der Herstellung der Komplexe, die Fähigkeit der Lipidkomponente, einen Komplex mit dem größten Teil der Nukleinsäure zu bilden, ein breites Spektrum von Zelltypen, welche für eine Transfektion zugänglich sind, eine hohe Effizienz des Transfers, ein Fehlen von Immunogenität der Komplexe und die Verfügbarkeit der kationischen Lipide durch chemische Synthese (Farhood et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 716: 23–35, 1994).
Die durch kationische Lipide vermittelte Abgabe von Nukleinsäure an eine große Vielzahl von Zelltypen ist in vitro und in vivo gezeigt worden. Beispielsweise ist Nukleinsäure, die den zystische Fibrose-Transmembranleitfähigkeitsregulator (CFTR) kodiert, komplexiert mit kationischen Lipiden an Lungen von Mäusen durch intratracheale Installation (Instillation) (Yoshimura et al., Nucleic Acids Res. 20: 3233– 3240, 1992) oder durch Aerosol-Abgabe (Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 11277–11281, 1992) abgegeben worden. Die Abgabe von CFTR unter Verwendung von kationischen Lipiden an ein Mäuse-Modell von zystischer Fibrose (CF) bewirkte eine Korrektur des Ionenkanaldefekts (Hyde et al., Nature 362: 250–255, 1993). Klinische Studien am Menschen mit einer durch kationische Lipide vermittelten Abgabe des CFTR-Gens an CF-Patienten zeigte eine Expression des Gens im Nasenepithel und keine abträglichen klinischen Wirkungen (Caplen et al., Nature Medicine 1: 39–46, 1995).
Eine systemische Genexpression eines Reportergens nach einer einzelnen intravenösen Injektion eines kationischen Lipid-DNA-Komplexes ist in Mäusen gezeigt worden (Zhu et al., Science 261: 209–211, 1993). Darüber hinaus haben Sicherheitsuntersuchungen mit systemisch verabreichten kationischen Lipid-Nukleinsäure-Komplexen bei Nagetieren und nichtmenschlichen Primaten keine mit der Verabreichung solcher Komplexe verbundene signifikante Toxizität gezeigt (Parker et al., Human Gene Therapy 6: 575–590, 1995).
Es ist gezeigt worden, dass ein durch kationische Lipide vermittelter Transfektions-Transfer von mRNA in Gewebekultur zur Translation des Transkript führte (Malone et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 6077–6081, 1989). Eine Abgabe von Antisinn-Oligonukleotiden an menschliche Endothelzellen unter Verwendung von kationischen Lipiden ermöglichte eine erhöhte zelluläre Aufnahme der Oligonukleotide in die und eine erhöhte Aktivität von diesen in den Zellen (Bennett et al., Mol. Pharm. 41: 1023–1033, 1992). Die Verwendung von kationischen Lipiden, welche in Form eines Komplexes mit retroviralen Partikeln vorliegen, hat eine virale Infektion von Zellen, denen der passende Virusrezeptor fehlte, (Innes et al., J. Virol. 64: 957–962, 1990) oder eine verstärkte retrovirale Transduktion unter Verwendung von als Virosomen bekannten Komplexen (Hodgson et al., Nature Biotechnol. 14: 339–342, 1996) ermöglicht.
Eine Immuntherapie für Krebs unter Verwendung von kationisches Lipid-Nukleinsäure-Komplexen, welche Haupthistokompatibilitäts (MHC)-Gene enthalten und direkt in Mäusetumore injiziert wurden, löste Immunantworten aus, welche zu einer Tumorregression führten (Plautz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 4645–4649, 1993).
Es laufen gegenwärtig klinische Studien beim Menschen unter Verwendung einer durch kationische Lipide vermittelten Abgabe von DNA-Sequenzen, welche immuntherapeutische Moleküle kodieren, bei menschlichen Patienten mit Melanomen, Kolorektal- und Nierenkrebs (Nabel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 11307–11311, 1993; Crystal, Science 270: 404–410, 1995).
Die kationische Lipide enthaltenden Formulierungen enthalten gegenwärtig oftmals das Phospholipid Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) eingebaut. Es wird angenommen, dass dieses Phospholipid die endosomale Membran zerreißt, indem es deren Doppelschichtstruktur destabilisiert, wodurch es dem Lipid-Nukleinsäure-Komplex ermöglicht wird, dem endosomalen Abbau zu entrinnen und in das Zytoplasma einzutreten (Farhood et al., Biochem. Biophys. Acta 1235: 289–295, 1995).
Ein signifikantes Hindernis für die weitverbreitete Verwendung von kationische Lipide enthaltenden Komplexen für eine Nukleinsäureabgabe an Zellen stellt jedoch die Tendenz der Komplexe, in Lösung große Aggregate zu bilden, dar.
Tatsächlich beschreiben Wasan et al. (J. Pharm. Sci. 85: 427– 433, 1996) die Herstellung von Lipid-Nukleinsäure-Komplexen, bei welchen eine Beschallung erforderlich ist, um eine Aggregation zu vermeiden.
Die Patentanmeldungen WO 96/40963 und WO 96/40962, welche nach dem Anmeldetag dieser Anmeldung veröffentlicht worden sind, schlagen vor, die Aggregation zu verringern, indem das DNA-Flüssigkeits (Lipid)-Verhältnis verändert wird, und legen eine Größenauftrennungsprozedur nahe. Die Patentanmeldung WO 96/34109, welche nach dem Anmeldetag dieser Anmeldung veröffentlicht worden ist, erwähnt die Verwendung eines Stabilisators in DNA-Flüssigkeits (Lipid)-Komplexen nicht.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung ist auf stabile Komplexe oder Teilchen von kationischen Lipiden und Nukleinsäure gerichtet, die verwendet werden können, um Nukleinsäure an eine Zelle abzugeben zu dem Zweck, den Zellen eines Individuums, welches eine solche Behandlung benötigt, ein therapeutisches Molekül zur Verfügung zu stellen. Die Erfindung ist auch auf stabile Komplexe oder Teilchen von kationischen Lipiden und Nukleinsäure gerichtet, die einen stabilisierenden Zusatzstoff enthalten. Die Erfindung ist des weiteren auf Verfahren zur Herstellung von homogenen Suspensionen von stabilen kationisches Lipid-Nukleinsäure-Komplexen oder -Teilchen durch Zusammengeben von einem oder mehreren kationischen Lipiden, einem oder mehreren Colipiden, einem oder mehreren stabilisierenden Zusatzstoffen und einer Nukleinsäure oder einem andersartigen Ligand gerichtet. Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Herstellung einer homogenen Suspension von stabilen kationisches Lipid-Nukleinsäure-Komplexen oder -Teilchen unter gegebenenfalls erfolgender Anwendung von Prozeduren, wie Extrusion, die als abschließender Sterilisationsschritt in dem Herstellungsverfahren von Lipid-Nukleinsäure-Komplexen für eine Verabreichung an Patienten für therapeutische Zwecke verwendet werden kann.
Die Erfindung ist des weiteren auf eine homogene Suspension von stabilen Lipid-Nukleinsäure-Komplexen oder -Teilchen, welche durch die obigen Verfahren hergestellt werden, gerichtet.
Die Erfindung kann unter Bezugnahme auf die Zeichnungen, von welchen das Folgende eine kurze Beschreibung darstellt, verstanden werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein schematisches Diagramm des Plasmids pCMVluc.
2 zeigt die Rückgewinnung von Plasmid-DNA nach einer Extrusion von DNA-Vektor-Komplexen, welche Spermidin-Chol/DOPE komplexiert mit 200 μg/ml DNA enthalten, durch eine 200 nm-Porengröße. Die prozentuale Ausbeute ist als Funktion des molaren Prozentsatzes von Distearoylphosphatidylethanolamin-polyethylenglycol (DSPE-PEG) und des Ladungsverhältnisses (+/–) des Komplexes gezeigt.
3 zeigt die Integrität von pCMVluc-Plasmid-DNA nach einer Extrusion von Lipid-DNA-Komplexen bei 200 nm Porendurchmesser, bestimmt durch Agarose-Gelelektrophorese (Bahn 1: pCMVluc; Bahn 2: pCMVluc vor der Extrusion von Komplexen, enthaltend 200 μg/ml Plasmid-DNA komplexiert an Spermidin-Chol/DOPE (1 : 1 bezogen auf das Gewicht) und 2 mol-% DSPE-PEG2000 mit einem (+/–)-Ladungsverhältnis = 5; Bahn 3: pCMVluc-Plasmid-DNA in der gleichen Zubereitung nach Extrusion bei 0,2 μm; Bahn 4: die gleiche Zubereitung wie in Bahn 3 gezeigt, gefolgt von einer Extraktion der Lipide, um die komplexierte DNA zu isolieren). Der Fleck auf der Unterseite des Gels entspricht Träger-t-RNA, welche verwendet wird, um die Plasmid-DNA cozupräzipitieren.
4(A–D) zeigt den Effekt des Molprozentsatzes von DSPE-PEG2000 auf die Stabilität von Lipid-DNA-Komplexen bei 4°C für unterschiedliche kationische Lipide bei 20 μg/ml DNA-Konzentration als Funktion der Zeit, wie gemessen durch Photonenkorrelationsspektroskopie nach oder ohne Extrusionsschritt. Schwarze Balken geben die Größe von unterschiedlichen, 10% DSPE-PEG2000 enthaltenden DNA-kationisches Lipid-Komplexen, welche ohne Extrusionsschritt hergestellt worden sind, an; weiße Balken zeigen die Größe von unterschiedlichen, 10% DSPE-PEG2000 enthaltenden DNA-kationisches Lipid-Komplexen nach einer Extrusion; und graue Balken zeigen die Größe von unterschiedlichen DNA-kationisches Lipid-Komplexen, welche 0% DSPE-PEG2000 enthalten und ohne Extrusionsschritt hergestellt worden sind. A: DC-Chol/DOPE; B: Spermidin-Chol/DOPE; C: Spermin-Chol/DOPE; D: DOGS/DOPE.
5 zeigt den Effekt von unterschiedlichen Konzentrationen von DSPE-PEG2000 und von verschiedenen (+/–)-Ladungsverhältnissen auf die Stabilität von Lipid-DNA-Komplexen, welche Spermidin-Chol/DOPE mit einer DNA-Konzentration von 200 μg/ml enthalten, nach einer Extrusion als Funktion der Zeit. Schwarze Balken zeigen den +/–: 5-Ladungsverhältniseffekt; weiße Balken zeigen den +/–: 2,5-Ladungsverhältniseffekt; und graue Balken zeigen den +/–: 1-Ladungsverhältniseffekt. A: 10% DSPE-PEG2000, B: 5% DSPE-PEG2000, C: 2% DSPE-PEG2000.
6 zeigt den Effekt von unterschiedlichen Konzentrationen von DSPE-PEG2000 und von verschiedenen (+/–)-Ladungsverhältnissen auf die Stabilität von Lipid-DNA-Komplexen, welche Spermidin-Chol/DOPE mit einer DNA-Konzentration von 200 μg/ml enthalten, vor einer Extrusion als Funktion der Zeit. Schwarze Balken zeigen den +/–: 5-Ladungsverhältniseffekt; weiße Balken zeigen den +/–: 2,5-Ladungsverhältniseffekt; und graue Balken zeigen den +/–: 1-Ladungsverhältniseffekt. A: 10% DSPE-PEG2000, B: 5% DSPE-PEG2000, C: 2% DSPE-PEG2000.
7 zeigt den Effekt von DSPE-PEG2000 auf die in vitro-Transfektionsaktivität von Lipid-DNA-Komplexen in A549-Zellen als Funktion der Plasmid-DNA-Konzentration. A) Expressionsniveau in Gegenwart von 10 mol-% DSPE-PEG2000 bezogen auf einen Puffer-Leerwert und b) im Vergleich zu einer Zubereitung ohne DSPE-PEG2000.
8 zeigt die Luciferaseaktivität (RLU/mg Protein) nach intratrachealer Injektion von unterschiedlichen kationisches Lipid-DNA-Komplexen in Mäuse als Funktion des Tags nach der Injektion verglichen mit der Injektion von nur freier DNA oder einer rekombinanten Adenovirus-Kontrolle.
9 zeigt die Luciferaseaktivität (RLU/mg Protein) nach intratrachealer Injektion von SpermidinChol/DOPE-pCMVluc-Komplexen + 10% DSPE-PEG2000 +/– Extrusion in Mäuse. Die Gewebeorte des Assays für jede numerierte Maus sind, wie folgt: (T: Trachea; PG: linke Lunge; PD: rechte Lunge).
10 zeigt den Einfluss von Ladungsverhältnissen und DSPE-PEG2000 (PEG-PL) auf die Luciferaseaktivität (RLU/mg Protein) nach intravenöser Injektion von kationisches Lipid-DNA-Komplexen, welche DC-Chol/DOPE enthalten, in Mäuse verglichen mit der Injektion von freier DNA. Es sind die Gewebeorte der Assays angegeben.
11 ist eine schematische Darstellung der Synthese des kationischen Glycerolipids pcTG56.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung ist auf stabile Komplexe oder Teilchen aus kationischen Lipiden und Nukleinsäure gerichtet, die verwendet werden können, um Nukleinsäure an eine Zelle abzugeben, für den Zweck, den Zellen eines Individuums, welches eine solche Behandlung benötigt, ein therapeutisches Molekül zur Verfügung zu stellen. Die Erfindung ist auch auf stabile Komplexe oder Teilchen aus kationischen Lipiden und Nukleinsäure gerichtet, die einen stabilisierenden Zusatzstoff enthalten.
Die Erfindung ist des weiteren auf Verfahren zur Herstellung von homogenen Suspensionen von stabilen kationisches Lipid-Nukleinsäure-Komplexen durch Zusammengeben von einem oder mehreren oder von Mischungen von kationischen Lipiden, einem oder mehreren Colipiden, einem oder mehreren stabilisierenden Zusatzstoffen und einer Nukleinsäure oder eines andersartigen Liganden gerichtet. Die Erfindung umfasst ein Verfahren zur Herstellung einer homogenen Suspension von stabilen Nukleinsäurekomplexen oder -teilchen, welches umfasst, ein oder mehrere kationische Lipide, ein oder mehrere Colipide und einen oder mehrere stabilisierende Zusatzstoffe zusammenzugeben, um eine Lipidsuspension zu bilden, die Lipidsuspension mit einer Nukleinsäure zusammenzugeben, um einen Komplex oder ein Teilchen zu bilden, ohne den Komplex oder das Teilchen einer Größenauftrennungsprozedur zu unterwerfen, um Komplexe oder Teilchen von homogener Größe zu bilden. Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Herstellung einer homogenen Suspension von stabilen kationisches Lipid-Nukleinsäure-Komplexen oder -Teilchen unter Verwendung von Prozeduren, wie Extrusion, welche als der abschließende Sterilisationsschritt in dem Herstellungsverfahren von Lipid-Nukleinsäure-Komplexen für eine Verabreichung an Patienten für therapeutische Zwecke verwendet werden kann.
Die Komplexe oder Teilchen der Erfindung umfassen ein oder mehrere kationische Lipide, ein oder mehrere Coplipide, einen oder mehrere stabilisierende Zusatzstoffe und eine Nukleinsäure oder einen andersartigen Liganden.
Die Erfindung ist auch auf eine homogene Suspension von stabilen Lipid-Nukleinsäure-Komplexen oder -Teilchen gerichtet, welche hergestellt wird durch:

a) Zusammengeben von einem oder mehreren kationischen Lipiden, einem oder mehreren Colipiden und einem oder mehreren stabilisierenden Zusatzstoffen, um eine Lipidsuspension zu bilden,
b) Zusammengeben der Lipidsuspension mit einer Nukleinsäure, um einen Komplex oder ein Teilchen zu bilden,
c) ohne Unterwerfen des Komplexes oder des Teilchens einer Größenauftrennungsprozedur.

Die Erfindung umfasst auch die obige homogene Suspension, wobei die Lipidsuspension des weiteren einer Größenauftrennungsprozedur unterworfen wird derart, dass eine Suspension von Komplexen oder Teilchen von homogener Größe erzeugt wird.
"Stabile Komplexe oder Teilchen" bedeutet, dass unabhängig von deren Größe die Komplexe oder Teilchen keine Aggregate bilden.
"Homogene Suspension" ist insbesondere das Ergebnis einer Suspension, welche nicht-aggregierte Komplexe oder Teilchen enthält.
Kationische Lipide oder Mischungen von kationischen Lipiden, die in den Komplexen der Erfindung verwendet werden können, umfassen Lipofectin^TM (eine Mischung von DOTMA (N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid) und DOPE, 1 : 1 bezogen auf das Gewicht), GIBCO-BRL; DDAB (Dimethyldioctadecylammoniumbromid); DMRIE (1,2-Dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethylammoniumbromid); Spermidin-Cholesterol (Spermidin-Chol); Spermin-Cholesterol (Spermin-Chol); DC-chol (3b[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)-carbamoyl]cholesterol); Transfectam^TM (DOGS, Dioctadecylamidoglycylspermin), Promega; DOSPER (1,3-Dioleoyloxy-2-(6-carboxyspermyl)propylamid), Boehringer Mannheim; DOTAP (N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniummethylsulfat), Boehringer Mannheim; Tfx^TM50 (eine Mischung von N,N,N',N'-Tetramethyl-N,N'-bis(2-hydroxyethyl)-2,3-dileoyloxy-1,4-butamdiammoniumiodid und DOPE), Promega; Lipofectamine^TM (DOSPA), Lipofectace^TM (eine Mischung von DDAB und DOPE, 1 : 2,5 bezogen auf das Gewicht), GIBCO-BRL.
Die kationischen Lipide der Erfindung werden vorzugsweise unter Spermidin-Cholesterol, Spermin-Cholesterol, DC-chol und DOGS ausgewählt. Am meisten bevorzugt ist das kationische Lipid ein beliebiges der Isomere von Spermidin-Cholesterol.
Colipide werden zu den Komplexen hinzugefügt, um den Eintritt der Nukleinsäure in die Zelle zu vereinfachen oder um Zusatzstoffe zu konjugieren, die die Stabilität erhöhen. Colipide der Erfindung umfassen neutrale, zwitterionische und anionische Lipide.
Ein bevorzugtes Colipid, das zu den Komplexen hinzugefügt werden kann, um den Eintritt der Komplexe in die Zelle zu vereinfachen, ist Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Colipid DOPE an das kationische Lipid komplexiert, um den Transport des Komplexes durch die Zellmembran hindurch zu vereinfachen und einen endosomalen Abbau zu verhindern.
Die Verhältnisse von kationischem Lipid zu Colipid (auf einer Gew./Gew.-Basis) können von 1 : 0 bis 1 : 10 reichen. In bevorzugten Ausführungsformen reicht das Verhältnis von 1 : 0,5 bis 1 : 4.
Zu den Komplexen der Erfindung können auch andere Colipide zugesetzt werden, um die Anheftung von stabilisierenden Zusatzstoffen an den Komplex zu ermöglichen. Das Colipid kann eine Gruppierung sein, die es dem stabilisierenden Zusatzstoff ermöglicht, in den Komplex der Erfindung eingebaut zu werden. Eine Derivatisierung des Lipids mit einem Zusatzstoff ermöglicht es der Gruppierung, den stabilisierenden Zusatzstoff an dem kationisches Lipid-Komplex zu verankern. Das Colipid kann an Zusatzstoffe konjugiert werden, die eine Aggregation und Ausfällung von kationisches Lipid-Nukleinsäure-Komplexen verhindern.
Colipide, die verwendet werden können, um solche Zusatzstoffe in die kationisches Lipid-DNA-Komplexe der Erfindung einzubauen, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf zwitterioni sche oder andersartige Phospholipide. Vorzugsweise ist das Colipid, welches verwendet wird, um einen stabilisierenden Zusatzstoff zu konjugieren, eine Komponente, welche in der Lage, in die Komplexe der Erfindung eingebaut zu werden. Mehr bevorzugt ist ein solches Colipid inert und biologisch verträglich.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Phospholipid Distearoylphosphatidylethanolamin (DSPE) mit einem stabilisierenden Zusatzstoff derivatisiert und ist die Komponente, die in der Lage ist, in die kationisches Lipid-Nukleinsäure-Komplexe der Erfindung eingebaut zu werden.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können kationische Lipide synthetisiert werden, so dass sie stabilisierende Zusatzstoffe, wie Polyethylenglycol (PEG), enthalten, welches Produkt an Nukleinsäure in einem Komplex der Erfindung durch elektrostatische Wechselwirkungen binden würde.
Stabilisierende Zusatzstoffe können zu den Komplexen der Erfindung auch zugesetzt werden, um die Integrität der Komplexe aufrechtzuerhalten, um die Komplexstabilität während Größenauftrennungsprozeduren aufrechtzuerhalten und um die Lagerungsstabilität zu erhöhen. Die Zusatzstoffe sind vorzugsweise an eine Komponente gebunden, welche in der Lage ist, in den Komplex eingebaut zu werden oder an einen solchen zu binden, beispielsweise ein Colipid. Solche Zusatzstoffe werden im allgemeinen ausgewählt unter hydrophilen Polymeren, die Polyethylenglycol, Polyvinylpyrrolidin, Polymethyloxazolin, Polyethyloxazolin, Polyhdroxypropylmethacrylamid, Polymilchsäure, Polyglycolsäure und derivatisierte Cellulosen, wie Hydroxymethylcellulose oder Hydroxyethylcellulose (PCT-Veröffentlichung Nr. WO 94/22429, veröffentlicht am 13. Oktober 1994) umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind. Andere stabilisierende Zusatzstoffe, die im Rahmen der Erfindung nützlich sind, umfassen perfluorierte oder partiell fluorierte Alkylketten, fluorierte Phospholipide, Fettsäuren und perfluoralkylierte Phospholipide und Polyglucuronsäuren (Oku et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 11: 231–270, 1994).
Vorzugsweise wird das Phospholipid DSPE mit Polyethylenglycol (PEG) derivatisiert unter Bildung des stabilisierenden Zusatzstoffs DSPE-PEG. Mehr bevorzugt reicht das Molekulargewicht des PEG, welches verwendet werden kann, von 300 bis 20000 Da. In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform wird PEG2000 als stabilisierender Zusatzstoff verwendet.
Das PEG-Lipid-Konjugat kann durch mehrere Methoden hergestellt werden, einschließlich der Verwendung des Linkers Cyanurchlorid (U.S.-Patent Nr. 5,225,212, welches in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird). Es können andere Aktivierungsverfahren verwendet werden, einschließlich jenen, die Carbonyldiimidazol (C=O), Bernsteinsäureanhydrid (-CO-CH₂-CH₂-CO-) oder Tosylat: -(CH₂-CH₂-O-)_n-1CH₂-CH₂-NH-PE verwenden.
Eine vorgeschlagene allgemeine Struktur von Zusatzstoffen ist, wie folgt (PE = Phosphatidylethanolamin):
Wenn das Polymer Polyethylenglycol ist: CH₃O-(CH₂-CH₂-O)_n-X-NH-PE YO-(CH₂-CH₂-O)_n-X-NH-PE Durchschnittliches Molekulargewicht: 300–10000 Da, (n = 5–250)
X: Linker (CO; Cyanurchlorid, siehe U.S.-Patent 5,225,212)
Y: Ligand (Peptid, Kohlenhydrat, Protein, Digionukleotid, Vitamin, Rezeptorantagonist oder -agonist, ...)
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann ein Ligand an den Stabilisator oder die PEG-Komponente eines Kom plexes der Erfindung unter Verwendung einer freien -OH-Gruppe gekoppelt werden. Solche Liganden umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Peptide, Kohlenhydrate, Proteine, Nukleinsäuren, Vitamine, Rezeptorantagonisten und Rezeptoragonisten. Wenn der Ligand ein Digionukleotid ist, kann ein PEG-Digionukleotid-Konjugat hergestellt werden. Verfahren zur Aktivierung der -OH-Gruppe für eine Kopplung des Liganden umfassen jene, die Carbonyldiimidazol, Cyanurchlorid, Bernsteinsäureanhydrid oder Tosylat verwenden. Der Ligand enthält vorzugsweise eine freie NH₂- oder SH-Gruppe, welche für eine Kopplung zur Verfügung steht.
Ein Beispiel ist das Folgende: Ligand-NH-CO-O-PEG-O-CO-NH-DSPE.
Die Kopplung des Liganden kann in einem beliebigen von mehreren Stadien der Komplexbildung erfolgen, einschließlich auf der molekularen Ebene zwischen DSPE-PEG-OH und dem Ligand, auf der Ebene der Lipidsuspension oder auf der Ebene des Lipid-DNA-Komplexes. Die Kopplung wird vorzugsweise in einem späteren Stadium der Komplexbildung ausgeführt mit einer erhöhten Wahrscheinlichkeit, dass der Ligand sich auf der Oberfläche des Komplexes befinden und dementsprechend zugänglich sein wird.
Stabilisierende Zusatzstoffe, welche eine verbesserte Lagerung der kationisches Lipid-Nukleinsäure-Komplexe ermöglichen, können den Komplexen zugesetzt werden, um eine solche Langzeitstabilität zu erzielen, müssen aber so zugesetzt werden, dass die Zusatzstoffe mit der Bindung der Nukleinsäure an das kationische Lipid nicht interferieren, insbesondere bei niedrigeren Ladungsverhältnissen.
Das Molverhältnis eines stabilisierenden Zusatzstoffs, wie eines derivatisierten Phospholipids, zu dem Colipid (beispielsweise DSPE-PEG2000/DOPE) kann von 0,01 bis 1 (0,5 mol-% bis 50 mol-% in Bezug auf die gesamte Lipidmenge) reichen. In einer bevorzugten Ausführungsform kann der stabilisierende Zusatzstoff der Mischung von kationischem Lipid und Colipid in Konzentrationen von 1 bis 20 mol.-% des gesamten Lipids zugesetzt werden. In einer mehr bevorzugten Ausführungsform kann das Molverhältnis von stabilisierendem Zusatzstoff zu Colipid von 0,04 bis 0,2 reichen.
Die Komplexe der Erfindung umfassen auch eine gewünschte Nukleinsäure-Komponente, die an eine Zelle, welche ein solches Molekül benötigt, abgegeben werden soll. Die Nukleinsäure, die mit der Lipidsuspension oder dem kationischen Lipid komplexiert ist, kann ein DNA- oder RNA-Molekül, welches einzel- oder doppelsträngig sein kann, sein. Die Nukleinsäure kann unter anderem eine genomische DNA, eine cDNA, eine mRNA, eine Antisinn-RNA oder ein Ribozym sein. Die Nukleinsäure kann auch in Form eines Plasmids oder einer linearen Nukleinsäure, das bzw. die eine exprimierbare Sequenz von Nukleinsäure, die ein Protein, Ribozym, Antisinn-Molekül oder andersartiges Molekül von Interesse bei einer Abgabe an eine Zelle erzeugen kann, enthält, vorliegen. Die Nukleinsäure kann auch ein Oligonukleotid sein, das an die Zelle angegeben werden soll, z. B. für Antisinn- oder Ribozymfunktionen. In einer bevorzugten Ausführungsform unter Verwendung einer exprimierbaren Nukleinsäure wird Plasmid-DNA verwendet. Konzentrationen von Nukleinsäure, die zu den kationischen Lipiden oder Lipidsuspensionen zur Bildung der Komplexe der Erfindung zugesetzt werden können, reichen von 10 μg/ml bis 1000 μg/ml. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung reicht die Konzentration von Nukleinsäure von 20 μg/ml bis 500 μg/ml.
Die kationisches Lipid-Nukleinsäure-Komplexe der Erfindung können auch durch ihr (+/–)-Ladungsverhältnis, das das Verhältnis der positiv geladenen kationischen Lipidkomponente zu der negativ geladenen Nukleinsäurekomponente des Komplexes ist, charakterisiert werden. Im allgemeinen vereinfacht ein Überschuss von positiver Ladung auf dem Komplex die Bindung des Komplexes an die negativ geladene Zelloberfläche. Das Ladungsverhältnis eines Komplexes der Erfindung kann berechnet werden, indem die Summe der positiven Ladungen durch die negativen Ladungen an dem Komplex dividiert wird. Eine Bestimmung der positiven Ladung pro Mol kann für ein spezielles kationisches Lipid oder Colipid derart vorgenommen werden, dass ein gegebenes Gewicht von Lipid eine spezielle positive Ladung repräsentieren wird. Eine analoge Bestimmung kann in Bezug auf die Nukleinsäure oder das Colipid vorgenommen werden, um die negative Ladung pro Mol zu ermitteln, so dass ein gegebenes Gewicht von Nukleinsäure oder Colipid eine spezielle negative Ladung repräsentieren wird. Indem alle positiven Ladungen durch alle negativen Ladungen dividiert werden, wird das insgesamte (+/–)-Ladungsverhältnis des Komplexes bestimmt.
Der Bereich des Ladungsverhältnisses der Komplexe der Erfindung beträgt vorzugsweise 1 bis 20 (+/–). Der Bereich beträgt mehr bevorzugt 2,5 bis 10 (+/–).
Die Erfindung ist auch auf Verfahren zur homogenen Größeneinstellung der Lipidsuspensionen (vor einer Zugabe von Nukleinsäure) unter Verwendung von Größenauftrennungsmethoden, die die Teilchengröße der Lipidsuspensionen standardisieren, gerichtet. Eine Extrusion vor der Zugabe von Nukleinsäure würde die Nukleinsäurebindung an Lipidaggregate verringern. Verfahren, die verwendet werden können, um homogene Präparationen/Zubereitungen oder Suspensionen der Komplexe herzustellen, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Extrusion, Beschallung und Mikrofluidisierung, Größenausschlusschromato graphie, Flussfeld-Fließ-Fraktionierung, Elektrophorese und Ultrazentrifugation.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren verwendet, welches eine Extrusion von Lipidsuspensionen durch Membranen von definiertem Porendurchmesser umfasst, um Teilchen oder Zubereitungen der Komplexe der Erfindung von homogener Größe ohne Modifizierung der komplexierten Nukleinsäure herzustellen. Es kann ein Extruder verwendet werden, in welchem Polycarbonatmembranen mit definiertem Porendurchmesser so gestapelt sind, dass die Suspension durch die Membranen unter Druck gedrückt wird (beispielsweise von Lipex Biomembranes, Inc., Vancouver, Kanada). Lipidsuspensionen können durch Membranen mit Poren von 50 bis 500 nm Durchmesser extrudiert werden. Bevorzugte Membranen haben einen Porendurchmesser von 200 nm. Eine Extrusion der Komplexe kann als abschließender Sterilisationsschritt in dem Herstellungsverfahren von kationisches Lipid-Nukleinsäure-Komplexen für eine Verabreichung an Patienten für therapeutische Zwecke verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die Teilchengröße eines kationisches Lipid-Nukleinsäure-Komplexes von 25 bis 500 nm reichen. Mehr bevorzugt beträgt die Teilchengröße eines Komplexes 200 nm. Die Teilchengröße kann für eine optimale Verwendung im Rahmen einer speziellen Anwendung ausgewählt werden. Wenn beispielsweise eine spezielle klinische Anwendung eine Extravasation der kationisches Lipid-Nukleinsäure-Komplexe umfasst, kann die Komplexgröße ungefähr 80 nm oder weniger betragen.
Messungen der Teilchengröße können durch verschiedene Techniken erfolgen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf dynamische Laserlichtstreuung (Photonenkorrelationsspektroskopie, PCS), wie auch andere Techniken, die den Fachleuten auf die sem Gebiet bekannt sind (siehe Washington, Particle Size Analysis in Pharmaceutics and other Industries, Ellis Horwood, New York, 1992, S. 135–169).
Nachdem die Komplexe der Erfindung einer Prozedur, z. B. Extrusion, unterworfen worden sind, kann der Prozentsatz der Ausbeute berechnet werden, um die Rückgewinnung zu bestimmen. Diese Berechnung beruht auf der Bestimmung der Nukleinsäure-Konzentration in den Komplexen vor und nach der Prozedur. Wenn beispielsweise eine Suspension von DNA enthaltenden Komplexen durch Größenauftrennungsmembranen extrudiert wird, kann die DNA-Konzentration in der Suspension unter Verwendung von Standardtechniken, z. B. Messung der Absorption bei 260 nm (A260), welche Nukleinsäure detektiert, bestimmt werden. Die Anwesenheit von 10% DMSO vereinfacht die Bestimmung der DNA-Konzentration in Gegenwart von Lipid. Der Prozentsatz der Ausbeute nach der Extrusion kann aus dem Verhältnis der vor und nach der Extrusion bestimmten DNA-Konzentrationen berechnet werden.
Um die strukturelle Integrität oder Unversehrtheit der Nukleinsäure in den Komplexen nach einer Prozedur zu bestimmen, kann die Nukleinsäure beispielsweise durch Agarose-Gelelektrophorese nach Lösemittelextraktion der Lipide analysiert werden. Die Verwendung einer Restriktionskartierung der Nukleinsäure kann zusätzliche Einzelheiten beispielsweise in Hinblick auf den Zustand eines Plasmids liefern. Unter Verwendung von solchen Techniken ist es möglich, zu bestimmen, ob die Nukleinsäure in einem Komplex strukturell intakt bleibt und nicht durch Scherkräfte während einer unter Druck erfolgenden Filtration oder andersartige mechanische Belastungen, welche im Rahmen von Prozeduren erzeugt werden, abgebaut wird.
Es ist auch möglich, die strukturelle Stabilität der Komplexe zu bestimmen in Hinblick darauf, wie eng die DNA gebunden und durch die Lipid- oder Lipidstabilisator-Komponente des Komplexes bedeckt ist. Dies kann gemessen werden, indem die DNA-Wanderung in einem Agarosegel bestimmt wird (keine Wanderung zeigt an, dass die DNA mit dem Lipid bedeckt ist), oder durch Inkubation mit DNAse I, gefolgt von einer Lipidextraktion und Agarose-Gelelektrophorese, um zu bestimmen, ob die DNA in dem Komplex an der Oberfläche exponiert war.
Die Komplexe der Erfindung können bei 4°C für optimale Stabilität aufbewahrt werden. Die Stabilität der Komplexe über die Zeit kann durch in Zeitabständen erfolgende Ermittlung der Teilchengröße unter Verwendung von Methoden, die zuvor für solche Messungen beschrieben worden sind, bestimmt werden.
Die kationisches Lipid-Nukleinsäure-Komplexe sind auch für einen Transfer von Nukleinsäure in Zellen für den Zweck des Verfolgens des Verhaltens der Nukleinsäure in der Zellumgebung nützlich. Es kann beispielsweise ein Transfer eines Gens in Zellen von Interesse durch mittels kationische Lipide vermittelte Transfektion verwendet werden, um regulatorische Parameter zu bestimmen, die die Expression des Gens ermöglichen – Enhancer, Promotoren u. s. w., indem diese Elemente an das Gen von Interesse gekoppelt werden und die Expression bestimmt wird.
Die kationisches Lipid-Nukleinsäure-Komplexe können für eine Abgabe der Nukleinsäure an die Zellen eines Individuums, welches eine Behandlung durch solche Moleküle benötigt, verwendet werden. Verabreichungsrouten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf direkte Injektion (z. B. intratracheal), Vernebelung, intramuskuläre, intratumorale und intravenöse Routen für eine in vivo-Verabreichung. Ein Transfer von Nukleinsäure in Zellen durch mittels kationische Lipide ver mittelte Transfektion, welcher bei ex vivo-Transplantationsprozeduren verwendet wird, kann auch verwendet werden, um Nukleinsäure an ein Individuum, welches solche Moleküle benötigt, abzugeben.
Therapeutische Transgene, die als Nukleinsäure-Komponente der Komplexe der Erfindung verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf CFTR für zystische Fibrose, a1-Antitrypsin für Emphyseme, lösliches CD4 für AIDS, ADA für Adenosindesaminasedefizienz, Dystrophin für Muskeldystrophie, Zytokingene für die Krebsbehandlung, immuntherapeutische oder Tumorsuppressorgene für eine Krebsbehandlung und jegliche anderen Gene, die in diesem Fachgebiet als nützlich für eine Gentherapie anerkannt sind. Die Nukleinsäure-Komponente kann auch mRNA umfassen. Transgene Nukleinsäuren, die Moleküle, wie Ribozyme, Antisinn-RNA oder Oligonukleotide kodieren, können ebenfalls in der Nukleinsäure-Komponente eines Komplexes der Erfindung enthalten sein. Alternativ können Ribozyme, Antisinn-Nukleinsäure oder Oligonukleotide direkt in die Komplexe der Erfindung eingebaut werden. Die Nukleinsäurekonstrukte können auch regulatorische Elemente enthalten, die die Expression des Gens steuern, wie Enhancer und Promotoren.
Wenn Komplexe, welche eine exprimierbare Nukleinsäure umfassen, an eine große Vielzahl von Zellarten abgegeben werden, z. B. durch verschiedene Verabreichungsrouten, einschließlich intravenöser Verabreichung, welche zu einer systemischen Aufnahme der Lipid-Nukleinsäure-Komplexe führen, kann die Expression der Nukleinsäure auf spezielle Gewebe durch die Verwendung von gewebespezifischen Promotoren begrenzt werden. Eine zeitliche Kontrolle der Nukleinsäure-Expression kann auch durch die Verwendung von induzierbaren Promotoren, die in Reaktion auf einen exogenen Stimulus oder Reiz aktiviert werden, z. B. durch einen MMTV-Promotor, welcher durch Metallothionin aktiviert wird, einen TAR/RRE umfassenden Promotor, welcher in Gegenwart der TAT/REV-Proteine von HIV aktiviert wird, oder einen auf Hormone ansprechenden Promotor, erzielt werden.
Wenn die Nukleinsäure-Komponente des Komplexes ein exprimierbares Gen umfasst, kann die biologische Funktion von diesem durch Standardtechniken, einschließlichd Bestimmung von mRNA durch Northern-Blot oder S1-Analyse und/oder den Nachweis von Protein unter Verwendung von Western-Blotting, Immunpräzipitation oder Assays auf funktionales Protein, bestimmt werden. Die Letztgenannten sind besonders nützlich, wenn ein Gen ein geeignetes Markerprotein, z. B. Luciferase oder b-Galactosidase, kodiert.
Die kationisches Lipid-Nukleinsäure-Komplexe können die Nukleinsäure von Interesse zu Zellen in vitro zum Zweck der Bestimmung der Funktion einer solchen Nukleinsäure oder zum Zweck, solche Zellen mit einer Nukleinsäure, die einen therapeutischen Nutzen bereitstellt, auszustatten, oder zum Zweck, die Effizienz und Spezifität der Komplexe für eine Nukleinsäureabgabe zu bestimmen, transferieren. Solche Zellen können etablierte Zelllinien, z. B. A549, NIH3T3, HeLa, wie auch primäre Zellen oder andere Zellen, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, umfassen, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Die Nukleinsäure von Interesse kann auch in vivo an Zellen eines Tiermodells, das verwendet werden kann, um die Effizienz und Spezifität eines Transfers an die Gewebe eines gesamten Organismus zu bestimmen, abgegeben werden. Solche Tiere umfassen Mäuse (z. B. C57 Black/10 oder Balb/c), Kaninchen und Primaten wie auch andere. Tiermodelle für Krankheitszustände beim Menschen können verwendet werden, um die Wirksamkeit von bestimmten Molekülen für eine therapeutische Behandlung zu untersuchen, z. B. transgene Mäuse, die gentech nich so modifiziert worden sind, dass sie ein mutiertes CFTR-Gen exprimieren, als ein Modell für zystische Fibrose.
Die Erfindung umfasst auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Komplexe der Erfindung enthalten, die in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht werden können, um eine gewünschte Nukleinsäure an ein Individuum, welches eine Therapie benötigt, abzugeben. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare Träger, einschließlich jeglicher relevanter Lösemittel, enthalten. Wie hier verwendet, umfasst "pharmazeutisch annehmbarer Träger" jegliche und alle Lösemittel, Dispergierungsmedien, Überzüge, antibakterielle und antifungale Mittel, isotonische und absorptionsverzögernde Mittel und dergleichen. Nur mit Ausnahme dessen, dass ein bestimmtes herkömmliches Medium oder Mittel mit dem Wirkstoff nicht verträglich ist, wird dessen Verwendung in den therapeutischen Zsuammensetzungen in Betracht gezogen.
Die praktische Ausführung der Erfindung setzt, sofern nicht anders angegeben, herkömmliche Techniken der in vitro-DNA-Rekombinationstechnik, Proteinchemie, Mikrobiologie und Virologie, die im Vermögen der Fachleute auf diesem Gebiet liegen, ein. Solche Techniken werden in der Literatur vollständig erläutert. Siehe z. B. Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg., John Wiley & Sons, Inc., New York, 1995.
Die Erfindung wird durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiel 1: Herstellung von kationisches Lipid-Nukleinsäure-Komplexen
Kationische Lipide DC-Chol (3b[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterol) (synthetisiert nach Gao, X., und Huang, L., Biochem. Biophys. Res. Communic. 179: 280–285, 1991); Spermidin-Cholesterol (Spermidin-Chol) (synthetisiert bei Transgène, S.A.) (Caffey et al., J. Biol. Chem. 270: 31391–31396, 1995; Französische Anmeldung Nr. 96 01347, welche beide in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen werden), Spermin-Cholesterol (Spermin-Chol) (synthetisiert bei Transgene, S.A.) (Caffey et al., J. Biol. Chem. 270: 31391–31396, 1995; Französische Anmeldung Nr. 96 01347) und Dioctadecylamidoglycylspermin (DOGS) (großzügiges Geschenk von Dr. Jean-Paul Behr (Behr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 6982–6986, 1989, welche in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird) und Colipide Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) (Sigma, Ref. P5058, Charge 75H8377) und Distearoylphosphatidylethanol-amin-PEG2000 (DSPE-PEG2000, Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA, Ref. 880120, Charge 180PEG2PE-21) wurden in den erforderlichen Verhältnissen (Verhältnisse von kationischem Lipid : DOPE von 1 : 1; Verhältnis von DSPE-PEG2000 zu gesamtem Lipid von 2, 5 und 10 mol-%) zusammengegeben durch Mischen der jeweiligen Lösungen in Chloroform/Ethanol (8 : 2) und Verdampfen der Lösemittel unter einem Stickstoffstrom, wodurch ein getrockneter Lipidfilm erzeugt wurde. Restliche Lösemittel wurden unter Vakuum verdampft. Der getrocknete Lipidfilm wurde bei 4°C über Nacht unter leichter Bewegung in 20 mM Hepes, pH 7,8, 0,9% NaCl rehydratisiert und durch Beschallung für 8 min in einem Badbeschallungsgerät (Bransonic 221) suspendiert.
Die kationisches Lipid/Colipid-Mischungen wurden bei 200 nm extrudiert, bevor sie mit DNA in unterschiedlichen (+/–)-Ladungsverhältnissen komplexiert wurden. Die Extrusion erfolgte unter Verwendung eines Extruders von Lipex Biomembranes, Inc. (Vancouver, Kanada), welcher mit einem Stapel von 2 Polycarbonatmembranen mit Poren von 0,2 μm Durchmesser (Nucleopore, Costar Corp., Cambridge, MA, USA) ausgestattet war. Die Suspension wurde durch die Membranen unter einem Stickstoffgasdruck von ungefähr 10 bar bei 50°C gedrückt.
In einem speziellen Beispiel wurden die folgenden Lipide gemischt und getrocknet: 422 μl Spermidin-Chol (10 mg/ml), 422 μl DOPE (10 mg/ml) und 145 μl DSPE-PEG2000 (25 mg/ml) unter einem Stickstoffstrom, gefolgt von einer Verdampfung von restlichem Lösemittel unter Vakuum. Eine Rekonstitution erfolgte durch Zugabe von 4,32 ml 20 mM Hepes, pH 7,8 + 0,9% NaCl über Nacht bei 4°C auf einem Schüttler, gefolgt durch Beschallung in einem Badbeschallungsgerät (Bransonic 221) für 8 min, um die folgenden Lipidkonzentrationen zu erhalten: Spermidin-Chol: 1,75 mM, DOPE: 1,31 mM, DSPE-PEG: 0,31 mM. Die Lipidsuspension wurde durch einen Stapel von 2 Membranen mit 200 nm Porendurchmesser extrudiert. Die Suspension wurde durch die Membranen unter Stickstoffgasdruck von ungefähr 10 bar bei 50°C gedrückt. 200 μl pCMVluc-Plasmid-DNA (1,46 mg/ml in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA) wurden zu einem Aliquot von 1,26 ml der Lipidsuspension zugesetzt, um ein Endvolumen von 1,46 ml zu erreichen. Die Konzentrationen der Komponenten in der endgültigen Zubereitung des Komplexes betrugen: Spermidin-Chol: 1,51 mM; DOPE: 1,13 mM; DSPE-PEG: 0,27 mM; DNA: 200 μg/ml. Bei einer DNA-Konzentration von 200 μg/ml enthält ein solcher Komplex 10 mol-% DSPE-PEG2000 und weist ein Ladungsverhältnis von 5 auf.
Die Lipid-DNA-Komplexe wurden erneut bei 50°C und ungefähr 10 bar Stickstoffdruck durch eine 200 nm-Porendurchmesser-Polycarbonatmembran extrudiert. Siehe 4 für einen Vergleich der Stabilität von extrudierten und nicht-extrudierten Lipid-DNA-Komplexen.
Das das Luciferase-Gen unter der Kontrolle des CMV-Promotors enthaltende Plasmid pCMVluc ist in 1 gezeigt.
Die Teilchengröße der kationisches Lipid-Nukleinsäure-Komplexe, die erhalten worden waren, wurde durch Photonenkorrelationsspektroskopie (welche auch als dynamische Lichtstreuung bezeichnet wird), eine Technik, die auf Laserlichtstreuung basiert, bestimmt. PCS misst die Brownsche Bewegung von Teilchen in dem illuminierten Volumen des Laserstrahls und berechnet eine Korrelationsfunktion, die die Fluktuationen beim gestreuten Licht mit dem Diffusionskoeffizienten der Teilchen verknüpft. Die Teilchengröße wird dann aus dem Diffusionskoeffizienten unter Verwendung der Stokes-Einstein-Beziehung: D = kT/3phd (k: Boltzmann-Konstante; T: absolute Temperatur; h: Viskosität; d: Teilchendurchmesser (siehe Olive Washington, Particle Size Analysis in Pharmaceutics and other Industries, Ellis Horwood publisher, New York 1992, S. 135–169; enthält auch Kapitel über andere Methoden) abgeleitet.
PCS wurde an einem Aliquot vor der Extrusion ausgeführt, während der Rest durch eine 200 nm-Membran bei 50°C extrudiert wurde. Der Teilchendurchmesser wurde nach der Extrusion erneut durch PCS bestimmt. Die kationisches Lipid-Nukleinsäure-Komplexe wurden bei 4°C verschiedene Zeitspannen aufbewahrt, um deren Stabilität zu bestimmen.
Die DNA-Konzentration in den kationisches Lipid-Nukleinsäure-Präparaten wurde bestimmt, indem die Lipidsuspension mit 10% (Vol./Vol.) Dimethylsulfoxid (DMSO) geklärt wurde. Die Absorption wurde bei 260 nm gemessen unter Verwendung der Beziehung, die definiert, dass 50 μg/ml DNA gleich 1 Absorptionseinheit bei einer Weglänge von 1 cm ist. Messungen wurden bei den verschiedenen Präparaten vor und nach der Extrusion ausgeführt und mit der Konzentration von nicht-komplexierter Plasmid-DNA verglichen. Der Prozentsatz der Ausbeute wird berechnet, indem das Verhältnis A260 (nach der Extrusion)/A260 (vor der Extrusion) (× 100) herangezogen wird.
Die körperliche Unversehrtheit der DNA in den Komplexen wurde durch Agarose-Gelelektrophorese nach Lösemittelextraktion der Lipide bestimmt. Dafür wurde 1 ml kationisches Lipid-Nukleinsäure-Suspension mit 0,4 ml Wasser, 2 ml Methanol und 1 ml Chloroform gemischt und 2 min gevortext. Nach Zentrifugation für 5 min bei 3000 Upm wurde die obere Phase in ein separates Röhrchen transferiert und unter Vakuum getrocknet. Das Pellet wurde in 250 μl Wasser erneut gelöst, wozu 27 μl 3 M Natriumacetat und 5 μg Transfer-RNA hinzugesetzt wurden, gefolgt von der Zugabe von 700 μl absolutem Ethanol, das auf –20°C abgekühlt worden war. Nach kurzem Vortexen und 1 h bei –20°C wurde das DNA-Pellet durch Zentrifugation bei 15000 Upm für 30 min bei 4°C zurückgewonnen. Die Flüssigkeit wurde abdekantiert und das übrigbleibende Pellet wurde zweimal mit 200 μl 70%-igem wässrigem Ethanol (auf –20°C gekühlt) gewaschen und nach jeder Wäsche durch Zentrifugation zurückgewonnen. Das Pellet wurde dann unter Vakuum getrocknet und in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA zu einer ungefähren Endkonzentration von 0,5 μg/μl erneut gelöst. Eine Agarose-Gelelektrophorese wurde in untergetauchten Plattengelen (14 × 10 × 0,8 cm) in 1% Agarose (Sigma, Ref. A-6877, Charge 123HO552) in Tris (4,86 g), Natriumacetat × 3H₂O (0,68 g) und EDTA (0,336 g, alle Gewichte sind für 1 Liter Endvolumen, eingestellt auf pH 7,8 mit Essigsäure, bestimmt) bei 60 Volt für 2 h ausgeführt. DNA-Banden wurden mit Ethidiumbromid in dem obigen Puffer in einer Konzentration von 60 μg/l angefärbt.
Eine Teilchengrößenanalyse erfolgte durch Laserlichtstreuung (10 mW-He-Ne-Laser bei 632,8 nm), kombiniert mit PCS (Coulter N4 Plus, Miami, FL, USA) über den Bereich von 3–10000 nm. Gestreutes Licht wurde bei einem Winkel von 90° von der in 20 mM Hepes, pH 7,8, 0,9% NaCl verdünnten Probe gemessen, wodurch zwischen 5 × 104 und 106 Zählimpulse/Sekunde erhalten wurden. Das Endvolumen betrug 500 μl. Die Messung wurde nach 3-minütiger Äquilibrierung bei 25°C unter Verwendung der folgenden Parameter gestartet: automatische vorab erfolgende Maßstabeinstellung ("automatic prescale"); Probennahmedauer ("sample time"): automatisch; Laufdauer ("run time"): automatisch (3 min bei 90°); SDP (Algorithmus, um zwischen unterschiedlichen Populationen zu unterscheiden): Analyse von 3 bis 10000 nm unter Verwendung von 25 Behältern; Brechungsindex: 1,33252; Viskosität: 0,8904 Centipoise.
Nach einer unter den obigen Bedingungen ausgeführten ersten Analyse wurden die Messbedingungen verfeinert, indem die Größe des Fensters verringert wurde und indem die Anzahl von Behältern erhöht wurde. Das System wurde mit Latexkörnchen von definiertem durchschnittlichem Teilchendurchmesser (Coulter Größenkontrollen ("size controls"): CEI Nr. 6602336; 90, 170, 300 und 500 nm) kalibriert. Die Anpassung der Verzögerungszeit ("delay time") erfolgte automatisch und es wurde regelmäßig durch manuelle Messungen an den kalibrierten Körnchen verifiziert, dass sie sich in dem korrekten Bereich befand.
Ergebnisse
Ein Einbau von PEG-Phospholipiden (PEG-PL), wie Distearoylphosphatidylethanolamin, gekoppelt an PEG2000 (DSPE-PEG) in Molverhältnissen von 10% verbesserte die DNA-Rückgewinnung nach einer Extrusion signifikant, während deren Unversehrtheit oder Integrität durch Verhütung einer Aggregation beibehalten wurde (2 und 3). Diese nützliche Wirkung war bereits bei visueller Inspektion der erhaltenen Komplexe, die homogene Dispersionen im Falle von zugesetzten PEG-PLs waren, aber schnell ausflockten, wenn der stabilisierende Zusatzstoff weggelassen wurde, ersichtlich. Anfängliche Versuche, Lipid-Nukleinsäure-Komplexe, die keine stabilisierenden Zusatzstoffe enthielten, durch Polycarbonatmembranen mit einem Porendurchmesser von 200 nm zu extrudieren, hatten gezeigt, dass die meiste DNA auf der Filtermembran höchstwahrscheinlich aufgrund des Vorhandenseins von Aggregaten verloren ging.
Stabilitätsuntersuchungen unter Verwendung von verschiedenen kationischen Lipiden, welche mit 20 μg/ml Plasmid-DNA komplexiert waren, bei 4°C zeigten, dass der durchschnittliche Teilchendurchmesser der Komplexe, wie durch PCS bestimmt, für wenigstens 2 Monate stabil blieb (4A–D; A: DC-Chol/DOPE; B: Spermidin-Chol/DOPE; C: Spermin-Chol/DOPE; D: DOGS/DOPE). Die anfängliche Teilchengröße ist am Tag 0 gezeigt und die Teilchengröße wurde über einen Zeitraum von 63 Tagen als Funktion der mol-% von DSPE-PEG2000 und davon, ob eine Extrusion der DNA-Lipid-Komplexe ausgeführt wurde ("ex"), gemessen. Die Daten zeigen, dass die Zugabe von 10% DSPE-PEG die Teilchen in gleichförmiger Größe hielt, wobei eine Aggregation verhindert wurde, im Gegensatz zu den Präparationen ohne DSPE-PEG (0%).
Die stabilisierende Wirkung von DSPE-PEG wurde auch bei Lipid-DNA-Komplexen beobachtet, welche Spermidin-Chol/DOPE komplexiert mit höheren Plasmid-DNA-Konzentrationen (200 μg/ml), die für in vivo-Transfektionen erforderlich sind, enthalten (5). Die Ergebnisse zeigen, dass die stabilisierende Wirkung von DSPE-PEG2000 für unterschiedliche Mengen des Zusatzstoffs (2, 5 und 10 mol-%) ebenso wie für unterschiedliche (+/–)-Ladungsverhältnisse beobachtet wird. Geringfügige Schwankungen bei der durch PCS gemessenen Größe zeigen keine Instabilitäten der Präparationen an, da sie sich mit der Zeit nicht verändern. Es ist wahrscheinlicher, dass Größenabschätzungen durch PCS diese Schwankungen eingeführt haben könnten, möglicherweise aufgrund von geringfügigen Veränderungen bei der Gestalt der Komplexe.
Die Teilchengröße von Lipid-DNA-Komplexen, welche PEG-PLs enthalten, wurde auch stabilisiert, wenn der abschließende Extrusionsschritt weggelassen wurde (6). Diese stabilisierende Wirkung war bei unterschiedlichen (+/–)-Ladungsverhältnissen und unterschiedlichen Konzentrationen von PEG-PLs ersichtlich. Insbesondere wurden Lipid-DNA-Komplexe mit hohen (+/–)-Ladungsverhältnissen effizient stabilisiert, aber alle Präparationen hatten mittlere Teilchendurchmesser von weniger als 400 nm und in den meisten Fällen von weniger als 200 nm verglichen mit Teilchengrößen von mehr als 1000 nm in Abwesenheit von PEG-PLs (4A–D Die Abwesenheit von PEG-PL in den Komplexen führte zu sichtbarer Ausflockung und Ausfällung nach der Zugabe von Plasmid-DNA zu den kationischen Lipiden zu einer Endkonzentration von 200 μg/ml, was aussagekräftige PCS-Messungen verhinderte.
Stabilitätsuntersuchungen bei 4°C zeigten, dass die extrudierten Komplexe bei einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von ungefähr 170 nm (PCS-Messung) für wenigstens 2 Monate stabil blieben. Darüber hinaus ermöglichen solche Kom- plexe eine in vivo-Transfektion über die intratracheale oder intravenöse Route, wie in Beispiel 3 gezeigt. Die Zusatzstoffe stabilisieren Komplexe zwischen kationischen Lipiden und Nukleinsäuren und ermöglichen eine Extrusion von solchen Komplexen durch Membranen mit definierter Porengröße ohne Modifizierung der komplexierten Nukleinsäure. Mit Polyethylenglycol derivatisierte Phospholipide erweisen sich als effizient bei der Verhütung einer Aggregation und Ausfällung von Lipid-DNA-Komplexen.
Beispiel 2: Transfektion von Zellen unter Verwendung von kationisches Lipid-Nukleinsäure-Komplexen
Methoden
Ausgehend von anfänglichen 20 ml Zellkultur, welche 2 × 106 Zellen enthielten, wurden 2 × 104 Zellen pro Vertiefung (Kulturplatte mit 96 Vertiefungen) in 200 μl DMEM-Medium, ergänzt mit Glutamin und 10% fötalem Kälberserum, am Tag 1 ausplattiert. Am Tag 2 wurden zwei Mikrotiterplatten hergestellt: eine Platte enthielt unterschiedliche Verdünnungen von Plasmid-DNA in 70 μl Medium ohne Serum pro Vertiefung (Ausgangskonzentration: 0,16 mg/ml) und eine Platte enthielt die Lipidsuspension in 60 μl pro Vertiefung (Ausgangskonzentration: 0,187 mg/ml). Es wurden Reihenverdünnungen (Faktor 2) sowohl von der DNA als auch von den Lipiden erstellt und die erforderliche Menge von DNA wurde in die Vertiefung, welche die erforderliche Menge von Lipiden enthielt, transferiert. Das Medium wurde von den Zellen durch Ansaugen entfernt und die Lipid-DNA-Komplexe (100 μl) wurden auf die Zellen transferiert. Nach 4 h bei 37°C wurden 5% CO2 und 50 μl Medium, welches 30% fötales Kälberserum enthielt, zugesetzt. Am Tag 3 wurden zusätzliche 100 μl Medium, welches 10% fötales Kälberserum enthielt, zugesetzt und am Tag 4 wurden die Zellen mikroskopisch auf Lebensfähigkeit hin untersucht. Die Transfektion wurde gestoppt, indem das Medium entfernt wurde, und die Zellen wurden mit 100 μl Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Nach Zugabe von 50 μl Lysepuffer (Promega, 5-fach verdünnt in Wasser) wurden die Zellen wenigstens 15 min auf –80°C eingefroren. Die produzierte Luciferasemenge wurde in 20 μl der Lyselösung 1 min unter Verwendung des Luciferase Assay System (Promega) in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Berthold) im Kinetik-Modus eines Berthold LB 96 P-Luminometers bestimmt.
Ergebnisse
Ein Einbau von 10 mol-% PEG-PLs blockierte die in vitro-Transfektionsaktivität der Lipid-DNA-Komplexe bei kultivierten A549-Zellen vollständig (7A und B). Dieser Effekt kann auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass die PEG-PLs einen effizienten Kontakt zwischen den Vektorkomplexen und Zellen in Kultur verhindern. Es war dementsprechend sogar noch überraschender, festzustellen, dass diese Vektoren eine Transfektion in vivo durch entweder die intratracheale (i.t.) oder intravenöse (i.v.) Verabreichungsroute ermöglichten (siehe nachfolgende Ergebnisse).
Beispiel 3: In vivo-Verabreichung von kationisches Lipid-Nukleinsäure-Komplexen
Methoden
Intratracheale Injektion in Mäuse: 5 bis 6 Wochen alte Mäuse (C57 Black/10 oder Balb/c) wurden unter Verwendung von Ketamin anästhesiert und 125 μl Vektor-Präparationen, welche 25 μg pCMVluc-Plasmid-DNA komplexiert an kationische Lipide in unterschiedlichen Ladungsverhältnissen enthielten, wurden in die Trachea injiziert. Komplexe waren nicht extrudiert und enthielten kein DSPE-PEG2000. Nach 48 h wurden die Mäuse getötet und die Trachea, die linke und die rechte Lunge wurden entfernt, in flüssigem N2 eingefroren und bei –70°C aufbewahrt.
Intravenöse Injektion in Mäuse: 5 bis 6 Wochen alten Mäusen (C57 Black/10 oder Balb/c) wurden 400 μl Vektor-Präparationen in die Schwanzvene injiziert. Die Präparationen enthielten 75 μg pCMVluc-DNA komplexiert an kationische Lipide in unterschiedlichen Ladungsverhältnissen. Nach sieben Tagen wurden Organe (Lunge, Herz, Milz, Leber, Skelettmuskel) entnommen, in flüssigem N2 eingefroren und bei –70°C aufbewahrt.
Herstellung von Proteinextrakten und Bestimmung der Luciferaseaktivität: Luciferaseextrakte wurden, wie beschrieben (Manthorpe, Human Gene Therapy 4: 419–43, 1993), hergestellt mit den folgenden Modifizierungen. Gefrorenes Gewebe wurde in vorgekühlten Mörsern auf Trockeneis pulverisiert. Das Pulver wurde in 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen transferiert und in 500 μl Reporter Lysis Buffer (Promega) unter Verwendung von 3 Einfrier-Auftau-Zyklen in flüssigem N2 und bei 37°C extrahiert. Lysate wurden bei 14000 Upm 10 min in einer Eppendorf-Zentrifuge bei Raumtemperatur zentrifugiert und Überstände in neue Röhrchen überführt. Das Pellet wurde gegebenenfalls für eine DNA-Extraktion verwendet. Extrakte wurden in flüssigem N2 eingefroren und bei –70°C aufbewahrt.
Proteinkonzentrationen wurden mit dem Quantify Protein Assay System (Promega) bestimmt. Luciferaseaktivität wurde in 10 μl-Aliquots von Extrakten unter Verwendung des Luciferase Assay System (Promega) in Mikroliterplatten mit 96 Vertiefungen (Berthold) unter Verwendung des Kinetik-Modus eines Berthold LB 96 P-Luminometers gemessen. Luciferaseaktivitäten wurden an Organproben, d. h. Trachea, linke und rechte Lunge, die Mäusen, die eine Injektion erhalten hatten, entnommen worden waren, gemessen. Nach Hybridisierung und Lyse in Reporter Lysis Buffer (Promega) wurden 10 oder 20 μl-Aliquots mit 100 μl Substrat (Luciferase Assay System, E1501, Promega) gemischt. Ein Minuten-Ablesungen wurden an dem Luminometer gemäß dem. Protokoll des Herstellers vorgenommen. Luciferaseaktivitäten wurden entweder als RLU/mg Protein oder als fg Luciferase/mg Protein mit Hilfe einer Luciferase-Standardkurve, welche mittels gereinigtem Enzym (Promega), verdünnt in einem negativen Gewebeextrakt, erstellt worden war, berechnet.
Ergebnisse
Intratracheale Verabreichung: 8 fasst ein Experiment mit unterschiedlichen kationischen Lipiden (DC-Chol, Spermidin-Chol, Spermin-Chol), formuliert mit dem Colipid DOPE, welche verwendet worden waren, um pCMVluc-DNA mit einem Ladungsverhältnis von 5 : 1 zu komplexieren, zusammen. Das Verhältnis von kationischem Lipid : DOPE beträgt 1 : 1 bezogen auf das Gewicht. Lipid-DNA-Komplexe in diesem Experiment wurden hergestellt und unverzüglich i.t. den Testtieren injiziert, um die Bildung von großen Aggregaten, die die Transfektionseffizienz der Komplexe verringern könnte, zu vermeiden. Luciferaseaktivitäten wurden, wie zuvor beschrieben, an Organproben, d. h. Trachea, rechter und linker Lunge, welche injizierten Mäusen 1, 2 und 3 Tage nach der i.t.-Injektion entnommen worden waren, gemessen unter Verwendung eines rekombinanten Adenovirus, welches das Luciferasegen enthielt, als Kontrolle.
Luciferaseaktivität konnte für mit DC-Chol/DOPE oder mit Spermin-Chol/DOPE komplexierte DNA nach 24 und 48 h detektiert werden. Das gleiche traf zu für Adenovirus in 0,9% NaCl. Keine Aktivität wurde gefunden für freie DNA und in diesem Experiment für DNA, welche mit Spermidin-Chol/DOPE komplexiert war.
Extrudierte Komplexe mit Zusatzstoffen: Der nächste Satz von Experimenten untersuchte Lipid-DNA-Formulierungen, welche eine definierte Teilchengröße und eine erhöhte Stabilität nach der Formulierung aufwiesen. Zu diesem Zweck wurden Komplexe durch Extrusion, welche Teilchen mit einer durchschnittlichen Größe von ungefähr 200 nm erzeugt, hergestellt. Die Zugabe von DSPE-PEG2000 als Bestandteil von Lipid-DNA-Komplexen in diesen Formulierungen wurde ebenfalls untersucht.
Spermidin-Chol/DOPE wurde mit 25 μg pCMVluc bei einem Ladungsverhältnis von 5 : 1 in Gegenwart von 10 mol-% DSPE-PEG2000 komplexiert. Das Verhältnis von kationischem Lipid : DOPE beträgt 1 : 1 bezogen auf das Gewicht. Proben wurden entweder direkt durch intratracheale Injektion 6 Wochen alten C57 Black/10-Mäusen injiziert oder durch Extrusion vor der Injektion größenfraktioniert. Nach 48 h wurden die Tiere getötet und die Luciferaseaktivität in der Trachea (T), der linken (PG) und der rechten (PD) Lunge von jedem Tier bestimmt. 9 zeigt die Luciferaseaktivitäten nach einer Injektion von Spermidin-Chol/DOPE-pCMVluc-Komplexen in Mäuse. Maus 11 erhielt eine Injektion von 25 μg freier pCMVluc-DNA. Nach 48 h konnte keine Luciferaseaktivität nachgewiesen werden. Die Mäuse 13 und 14 erhielten Komplexe, die nicht extrudiert worden waren, und die Mäuse 17, 18, 19 und 20 erhielten Komplexe nach einer Extrusion. Für Tracheas und Lungen von allen Mäusen wurden Luciferaseaktivitäten im Bereich von 1000 bis 7000 RLU/mg Protein gemessen mit Ausnahme von Maus 18, die keine Aktivität in der Trachea zeigte.
Effekt des Ladungsverhältnisses und des stabilisierenden Zusatzstoffs: Der Einfluss des Ladungsverhältnisses von Spermidin-Chol/DOPE-pCMVluc-Komplexen und die Konzentration von DSPE-PEG2000 in diesen Komplexen wurde weiter untersucht. Es wurden Spermidin-Chol/DOPE-pCMVluc-Komplexe mit Ladungsverhältnissen von 5 : 1, 2,5 : 1 und 1 : 1 hergestellt. Für jedes Ladungsverhältnis wurde DSPE-PEG2000 zu 10, 5 oder 2 mol-% zugesetzt. 48 h nach einer i.t.-Injektion in C57 Black/10-Mäuse wurden die Luciferaseaktivitäten in den Tracheas und Lungen von diesen Tieren bestimmt. Die Tabelle 1 fasst die Ergebnisse dieses Experiments zusammen.
Tabelle 1. Einfluss von Ladungsverhältnissen und der DSPE-PEG2000-Konzentration auf die i.t.-Aktivität von Spermidin-Chol/DOPE- pCMVluc-Komplexen
Luciferaseaktivität in Lungen war nach einer Injektion von Komplexen mit einem Ladungsverhältnis von 5 : 1 messbar. Eine Verringerung von DSPE-PEG2000 von 10 auf 2 mol-% führte zu einer Zunahme der Luciferaseaktivität im Rahmen dieses Experiments. Bei niedrigeren Ladungsverhältnissen wurde in den Lungen nicht länger Luciferaseaktivität nachgewiesen. In den Tracheas nahm die Luciferaseaktivität mit abnehmenden Ladungsverhältnissen zu. Die DSPE-PEG2000-Konzentration beeinflusst diese Aktivität wahrscheinlich ebenfalls.
Eine Erklärung dafür ist, dass DSPE-PEG2000 möglicherweise die kationisches Lipid/DNA-Komplexe destabilisiert in Bezug darauf, wie eng die DNA an das kationische Lipid gebunden ist und durch dieses bedeckt wird. Dieser Effekt wäre bei niedrigeren Ladungsverhältnissen bedeutender. Aufgrund dieses Effekts sind nur Komplexe mit einem hohen Ladungsverhältnis stabil genug, um Lungenzellen zu erreichen und zu transfizieren. Bei niedrigeren Ladungsverhältnissen werden die Komplexe instabil und können Zellen in der Trachea in der Nähe des Injektionsorts effizient transfizieren, dringen aber nicht tief genug in die Lunge ein, um Lungengewebe zu transfizieren.
Intravenöse Verabreichung: Um den Einfluss von unterschiedlichen Ladungsverhältnissen und der Anwesenheit von DSPE-PEG2000 auf Formulierungen für eine i.v.-Abgabe zu untersuchen, wurden 75 μg pCMVluc-DNA zu Ladungsverhältnissen von 1 : 2, 1 : 4 und 1 : 6 mit DC-Chol/DOPE in Gegenwart oder Abwesenheit von 10% DSPE-PEG2000 komplexiert und i.v. in 400 μl-Volumen injiziert. Das Verhältnis von kationischem Lipid : DOPE betrug 1 : 1 bezogen auf das Gewicht. Die Komplexe waren nicht extrudiert.
Luciferaseaktivitäten wurden sieben Tage später in der Lunge, Leber, dem Herzen, Skelettmuskel und der Milz bestimmt. Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt. Die Luciferaseaktivität ist als RLU/mg Protein +/– (Standardabweichung) für Gruppen von 4 unabhängigen Mäusen pro Formulierung angegeben. Im Muskel und in der Milz kann keine Luciferaseaktivität gefunden werden. Geringe Aktivitäten werden in Herz und Leber bei Ladungsverhältnissen von 1 : 4 (800 μg Gesamtlipid (400 μg DC- Chol): 75 μg DNA) und 1 : 6 (1200 : 75) gefunden. In der Lunge werden relativ hohe Werte nachgewiesen, beginnend bei einem Ladungsverhältnis von 1 : 2 (400 : 75) + 10% DSPE-PEG2000.
Das Verhältnis von Lipiden zu DNA wurde in diesen Experimenten verändert, um den Einfluss dieses Parameters wie auch der Anwesenheit von DSPE-PEG2000 auf die in vivo-Transfektion auszuwerten. Der Grund hinter der Erhöhung der Menge von Lipiden war, dass die DNA möglicherweise in vivo stabiler sein könnte und dass ein positiveres Ladungsverhältnis möglicherweise zu einem modifizierten Tropsmus der Komplexe führen könnte. Anhand dieses Experiments scheint es, dass höhere Ladungsverhältnisse zu konsistenteren Transfektionen führen. Es ist auch bemerkenswert, dass die Anwesenheit von DSPE-PEG2000 sichtbare Ausfällungen, die sich in allen Präparationen, die den Zusatzstoff nicht enthielten, bildeten, verhinderte.
Beispiel 4: Herstellung von kationisches Lipid-Nukleinsäure-Komplexen, welche kationische Glycerolipide pcTG56 enthalten
Synthese von kationischen Glycerolipiden pcTG56
PcTG56 ist gemäß dem folgenden Protokoll hergestellt worden (siehe auch 15):
Cyanosäure 1
Eine Lösung von Acrylnitril (9,6 ml, 146 mmol) in 1,4-Dioxan (50 ml) wurde tropfenweise zu einer eiskalten Lösung von Glycin (10,0 g, 132 mmol) und von 1 N Natriumhydroxid (133 ml) in einer 1/1-Mischung von Wasser und Dioxan (200 ml) zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei 0°C 1 h und bei Raumtemperatur weitere 4 h gerührt. Dann wurde eine Lösung von Ditert.-butyldicarbonat (35,0 g, 159 mmol) in 1,4-Dioxan (100 ml) tropfenweise zugesetzt und die Reaktionsmischung wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach einer Extraktion mit Ether (2 × 100 ml) wurde die wässrige Phase mit 1 N Salzsäure angesäuert (pH 2–3) und mit Ethylacetat (2 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert. Die Cyanosäure 1 (24,4 g; 81% Ausbeute) wurde als ein weißer Feststoff erhalten, welcher ohne weitere Reinigung verwendet wurde. Schmp. = 87–89°C.
¹H-NMR (200 MHz, D₂O): d 3,88 und 3,87 (2 s, 2H, -CH₂-CO₂H), 3,48 und 3,45 (2 t, J = 6,3 Hz, 2H, -CH₂-N(BOC)-), 2,58 und 2,56 (2 t, J = 6,3, 6,4 Hz, 2H, -CH₂-CN); 1,30 und 1,24 (2 s, 9H, t-Bu-).
Aminosäure 2
Eine Lösung von Cyanosäure 1 (11,5 g, 50,4 mmol) in Ethanol (100 ml), welches Natriumhydroxid (4,04 g, 100 mmol) enthielt, wurde in Gegenwart von Raney-Nickel (3,2 g) 18 h bei Raumtemperatur hydriert. Die Mischung wurde sorgfältig mittels Celite filtriert und der Katalysator wurde mit Methanol (2 × 30 ml) gewaschen. Das Filtrat wurde mit 10%-iger wässriger Salzsäure angesäuert (pH 4–5) und im Vakuum aufkonzentriert, wodurch ein weißer Feststoff erhalten wurde, der in Chloroform (50 ml) gelöst wurde, um die Hauptmenge des Natriumchlorids auszufällen. Nach Filtration, Aufkonzentration des Filtrats im Vakuum und Umkristallisation in Tetrachlorkohlenstoff wurde die Aminosäure 2 (10,4 g; 89%) erhalten. Schmp. = 201–202°C.
¹H-NMR (200 MHz, D₂O): d 3,53 (s, 2H, -CH₂-CO₂H), 3,17 (t, J = 6,6 Hz, 2H, -CH₂-N(BOC)-), 2,83 (t, J = 7,5 Hz, 2H, -CH₂-NH₂), 1,69 (quint., J = 7 Hz, 2H, -CH₂-), 1,26 und 1,21 (2 s, 9H, t-Bu-).
Cyanosäure 3
Die gleiche Vorgehensweise wie für 1 erlaubte die Herstellung der Cyanosäure 3 aus 2.
¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃): d 4,00–3,85 (m, 2H, -CH₂-CO₂H), 3,55–3,43 (m, 2H, -CH₂-CH₂-CN), 3,31 (t, J = 7,2 Hz, 4H, -CH₂-N(BOC)-), 2,61 (m, 2H, -CH₂-CN), 1,78 (quint., J = 7,2 Hz, 2H, -CH₂-), 1,47 und 1,44 (2 s, 18H, t-Bu-).
Aminosäure 4
Die Aminosäure 4 (87% Ausbeute; Reinigung durch Chromatographie an einer Kieselgelsäule, Elutionsmittel: Methanol/Dichlormethan 3/7, dann 6/4) wurde aus 3 durch die gleiche Vorgehensweise wie die Aminosäure 2 erhalten. Schmp. = 189– 190°C.
¹H-NMR (200 MHz, D₂O): d 3,57 und 3,54 (2 s, 2H, -CH₂-CO₂H), 3,2–3,0 (m, 6H, -CH₂-N(BOC)-), 2,80 (t, J = 7,7 Hz, 2 H, -CH₂-NH₂), 1,80–1,50 (m, 4H, -CH₂-), 1,27 und 1,22 (2 s, 18H, t-Bu-).
Cyanosäure 5
Die gleiche Vorgehensweise wie für 1 ermöglichte die Herstellung der Cyanosäure 5 aus 4.
¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃): d 3,85 (br s, 2H, -CH₂-CO₂H), 3,47 (t, J = 6,6 Hz, 2H, -CH₂-CH₂-CN), 3,35–3,05 (m, 8H, -CH₂-N(BOC)-), 2,60 (m, 2H, -CH₂-CN), 1,85–1,60 (m, 4H, -CH₂-), 1,46 und 1,44 (2 s, 27 H, t-Bu-).
Aminosäure 6
Die Aminosäure 6 (83% Ausbeute; Reinigung durch Chromatographie an einer Kieselgelsäule, Elutionsmittel: Methanol/Dichlormethan 3/7, dann 6/4) wurde aus 5 durch die gleiche Vorgehensweise wie die Verbindung 2 erhalten.
¹H-NMR (200 MHz, D₂O): d 3,76 und 3,73 (2 s, 2H, -CH₂-CO₂H), 3,25–2,75 (m, 12H, -CH₂-N(BOC)- und -CH₂-NH₂), 1,85– 1,50 (m, 6H, -CH₂-), 1,28 und 1,23 (2 s, 27H, t-Bu-).
Cyanosäure 7
Die gleiche Vorgehensweise wie für 1 ermöglichte die Herstellung der Cyanosäure 7 aus 6.
¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃): d 3,95 und 3,87 (2 br s, 2H, -CH₂-CO₂H), 3,47 (t, J = 6,5 Hz, 2H, -CH₂-CH₂-CN), 3,40–3,05 (m, 12H, -CH₂-N(BOC)-), 2,61 (m, 2H, -CH₂-CN), 1,90–1,60 (m, 6 H, -CH₂-), 1,47, 1,45 und 1,44 (3 s, 36H, t-Bu-).
Aminosäure 8
Die Aminosäure 8 (71% Ausbeute; Reinigung durch Chromatographie an einer Kieselgelsäule, Elutionsmittel: Methanol/Dichlormethan 1/9, dann 3/7) wurde aus 7 durch die gleiche Vorgehensweise wie die Verbindung 2 erhalten.
¹H-NMR (200 MHz, D₂O): d 3,76 und 3,73 (2 s, 2H, -CH₂-CO₂H), 3,25–2,75 (m, 12H, -CH₂-N(BOC)- und -CH₂-NH₂), 1,85– 1,50 (m, 6H, -CH₂-), 1,28 und 1,23 (2 s, 27H, t-Bu-).
Säure 9
Di-tert.-butyldicarbonat (1,19 g, 5,45 mmol), gelöst in CH₂Cl₂ (5 ml), wurde zu einer Lösung von Verbindung 8 (3,20 g, 4,55 mmol) und Triethylamin (0,95 ml, 6,83 mmol) in CH₂Cl₂ (45 ml) zugesetzt. Die Mischung wurde 16 h bei Raumtemperatur gerührt, dann mit 5%-iger HCl auf pH 3 angesäuert und zweimal mit CH₂Cl₂ (30 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser (20 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und auf konzentriert, wodurch ein farbloses Öl erhalten wurde, das durch Kieselgelsäulenchromatographie (Methanol/Dichlormethan 5/95, dann 10/90) gereinigt wurde, wodurch die Verbindung 9 (3,37 g, 92%) erhalten wurde.
¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃): d 3,85 (m, 2H, -CH₂-CO₂H), 3,45– 3,05 (m, 16H, -CH₂-N(BOC)-), 1,85–1,60 (m, 8H, -CH₂-), 1,45, 1,44 und 1,43 (3 s, 36H, t-Bu-).
Ester 10
Dicyclohexylcarbodiimid (0,53 g, 2,59 mmol) in trockenem Dichlormethan (1 ml) wurde zu einer Lösung der Säure 9 (1,60 g, 1,99 mmol), von (S)-(+)-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol (0,34 g, 2,59 mmol) und von 4-(Dimethylamino)pyridin (24 mg, 0,2 mmol) in trockenem Dichlormethan (4 ml) zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 16 h bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde der Niederschlag von Dicyclohexylharnstoff durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde im Vakuum auf konzentriert und einer Chromatographie an einer Kieselgelsäule (Elutionsmittel: Ether/Hexan 5/5, dann 6/4) unterzogen, wodurch der Ester 10 (1,73 g; 95%) erhalten wurde.
¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃): d 4,35–4,04 (m, 4H), 3,99–3,92 (2 s, 2H, -CH₂-CO), 3,74 (m, 1H), 3,30–3,00 (m, 16H, -CH₂-N(BOC)-), 1,85–1,55 (m, 8H, -CH₂-), 1,46, 1,45, 1,44 und 1,42 (4 s, 48H, t-Bu- und Me-), 1,36 (s, H, Me-).
Dihydroxyester 11
Eine Lösung von Ester 10 (1,55 g, 1,69 mmol) und von 1 N Salzsäure (0,68 ml) in Methanol (29 ml) wurde 16 h bei Raumtemperatur gerührt. Triethylamin (1 ml) wurde dann zu der Lösung zugesetzt, bis sie neutral war. Eindampfen im Vakuum und Kieselgelsäulenchromatographie (Elutionsmittel: Methanol/Dichlormethan 5/95) ergaben den Dihydroxyester 11 (1,23 g; 83%) als ein farbloses Öl.
¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃): d 4,25 (m, 2H, -CH₂-OCO-), 4,00– 3,40 (m, 5H, CH-OH, -CH₂OH und -CH₂-CO₂-), 3,40–3,00 (m, 116 H, CH₂-N(BOC)-), 1,90–1,6 (m, 8H, -CH₂-), 1,46, 1,45, 1,44 und 1,42 (4 s, 45H, t-Bu-).
Triester 12
Dicyclohexylcarbodiimid (0,71 g, 3,42 mmol) in trockenem Dichlormethan (1 ml) wurde zu einer Lösung von Dihydroxyester 11 (1,00 g, 1,14 mmol), Ölsäure (0,97 g, 3,42 mmol) und 4-(Dimethylamino)pyridin (14 mg, 0,11 mmol) in trockenem Dichlormethan (3 ml) zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 16 h bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde der Niederschlag von Dicyclohexylharnstoff durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde im Vakuum aufkonzentriert und einer Chromatographie an einer Kieselgelsäule (Elutionsmittel: Ether/Hexan 4/6) unterzogen, wodurch der Triester 12 (754 mg; 47%) als ein farbloses Öl erhalten wurde.
¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃): d 5,34 (m, 4H, -CH=), 5,26 (m, 1 H, CH-OCO-), 4,40–4,05 (m, 4H, -CH₂-OCO-), 3,95 und 3,89 (2 m, 2H, -N(BOC)-CH₂-CO₂-), 3,35–3,00 (m, 16H, -CH₂-N(BOC)-)-, 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4H, -CH₂-CO₂-), 2,01 (m, 8H, allylisches H), 1,85–1,50 (m, 12H, -CH₂-), 1,46, 1,44, 1,43 und 1,41 (4 s, 45H, t-Bu-), 1,30 und 1,27 (2 br s, 44 H, -CH₂-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6H, Me-).
Kationische Glycerolipide pcTG56
Der Triester 12 (0,52 g, 0,37 mmol) in trockenem Dichlormethan (1 ml) wurde 3 h mit einer 1/1-Mischung von Trifluoressigsäure und trockenem Dichlormethan (74 ml) bei 0°C behandelt. Dann wurde Hexan (100 ml) zugesetzt und die Mischung im Vakuum eingedampft, wodurch ein dünner Film zurückblieb, der in destilliertem Ether suspendiert wurde (Vortex). Eine Filtration ergab ein weißes Pulver, das mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet wurde, wodurch das Lipid 13 (510 mg; 93%) erhalten wurde.
¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃ – CF₃CO₂D): d 5,36 (m, 5H, -CH= und CH-OCO-), 4,60–4,15 (m, 4H, -CH₂-OCO-), 4,00 (s, 2H, -NH₂ ⁺-CH₂-CO₂-), 3,45–3,10 (m, 16H, -CH₂-NH₂ ⁺-), 2,41 (t, J = 7,5 Hz, 4H, -CH₂-CO₂-), 2,28 (m, 8H, -CH₂-CH₂-NH₂ ⁺-), 2,01 (m, 8H, allylisches H), 1,61 (m, 4H, -CH₂-CH₂-CO₂-), 1,30 und 1,27 (2 s, 44H, -CH₂-), 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 6H, Me-).
Formulierung von DNA-Lipid-Komplexen, welche pcTG56 enthalten
Es wurden DNA-Lipid-Komplexe mit einer Endkonzentration von 0,5 oder 1 mg/ml DNA bei einem Ladungsverhältnis von 5 (Verhältnis zwischen positiven Ladungen, welche das kationische Lipid trägt, und negativen Ladungen, welche die DNA trägt) mit einer äquimolaren Menge von Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE) hergestellt. Die Menge von kationischem Lipid, welche zugesetzt werden musste, wurde basierend auf dessen Molekulargewicht, der Anzahl von positiven Ladungen pro Molekül und dem gewünschten Ladungsverhältnis bestimmt. Als Beispiel ist, um einen Komplex von pcTG56/DOPE mit einem Ladungsverhältnis von 5 und einer DNA-Endkonzentration von 0,5 mg/ml zu erhalten, die folgende Berechnung anwendbar:
0,5 mg/ml DNA entsprechen einer Konzentration von 0,5/330 mmol/ml = 1,5 mmol/ml negativen Ladungen (330 Da wird als durchschnittliches Molekulargewicht eines Nukleotids genommen). Um einen Komplex mit dem Ladungsverhältnis 5 zu erhalten, muss die Konzentration von positiven Ladungen 7,5 mmol/ml (Molekulargewicht von pcTG56 in Form von dessen Trifluoracetatsalz: 1476 g/mol; 5 positive Ladungen pro Molekül) oder 1,5 mmol/ml pcTG56 (2,2 mg/ml) betragen. Um eine äquimolare Konzentration zu erreichen, wurden 1,5 mmol DOPE zugesetzt (Molekulargewicht: 744 g/mol; Endkonzentration von 1,1 mg/ml). Distearoylphosphatidylethanolamin (DSPE), gekoppelt an Polyethylenglycol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 5000 Da (PEG5000), (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, U.S.A.; Ref. 880220) (durchschnittliches Molekulargewicht als 5750 g/mol genommen) wurde zugesetzt, um die erforderlichen Endkonzentrationen von 2, 5 oder 10 mol-% bezogen auf die Gesamtmenge von Lipid zu erzielen.
Lipide wurden ausgehend von ihren jeweiligen Lösungen in Chloroform/Methanol (1/1) gemischt. Die Lipidlösung wurde getrocknet (200 mbar, 45°C, 45 min) unter Vortexen (40 Umdrehungen pro Minute) (Labconco, Rapidvap, Uniequip, Martinsried, Deutschland) und der Lipidfilm wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO)/Ethanol (1/1) aufgenommen. Als ein Beispiel wurden 2,2 mg pcTG56 und 1,1 mg DOPE in 45 ml Dimethylsulfoxid/Ethanol aufgenommen. 175 ml 20 mM (N-[2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]) (HEPES), pH 7,5, wurden zugesetzt, um eine Endkonzentration von 10 mg/ml an kationischem Lipid zu erreichen. 500 ml Plasmid-DNA (pTG11033; 1 mg/ml in 10 mM (Tris)[hydroxymethyl]aminomethan) (Tris), 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), pH 7,5) wurden mit 280 ml 20 mM HEPES, pH 7,5, verdünnt, 220 ml der obigen Lipidsuspension wurden zu dieser Lösung durch schnelles Ansaugen-Pipettieren (10-mal) zugesetzt, um 1 ml des endgültigen Komplexes mit einer DNA-Konzentration von 0,5 mg/ml und einem Ladungsverhältnis von 5 zu erhalten. Präparationen mit 1 mg/ml DNA mit und ohne DSPE-PEG5000 wurden unter Verwendung des gleichen Verfahrens durch entsprechendes Anpassen der Mengen von DNA, Lipiden und Stabilisierungsmittel rekonstituiert. Die erhaltenen Lipid-DNA-Komplexe wurden bei 4°C aufbewahrt.
Ergebnisse
Die Teilchengröße der kationisches Lipid-Nukleinsäure-Komplexe wurde durch Photonenkorrelationsspektroskopie gemessen und ist als das normalisierte Mittelwertgewicht angegeben (siehe Beispiel 1). Tabelle 2 fasst die Ergebnisse dieses Experiments zusammen.
Tabelle 2: Einfluss der DNA-Konzentration und des Prozentsatzes (%) von DSPE-PEG5000 auf die Teilchengrößenstabilität
Die oben gezeigten Ergebnisse erweitern unsere vorigen Erkenntnisse darin, dass:

a) Lipid-DNA-Komplexe mit höherer (1 mg/ml) DNA-Konzentration (zuvor 0,2 mg/ml) hergestellt werden können;
b) dass DSPE-PEG mit Lipiden aus anderen Strukturklassen, wie kationischen Glycerolipiden (pcTG56), verträglich ist, und
c) dass DSPE-PEG5000 DSPE-PEG2000 ersetzen kann.

Zusätzlich zeigen sie, dass unsere Methodik mit anderen Zusatzstoffen, wie DMSO, die einen in vivo-Gentransfer verstärken können, verträglich ist.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer homogenen Suspension von stabilen Lipid-Nukleinsäure-Komplexen oder -Teilchen, welches umfasst: a) Zusammengeben von einem oder mehreren kationischen Lipiden, einem oder mehreren Colipiden und einem oder mehreren stabilisierenden Zusatzstoffen, um eine Lipidsuspension zu bilden, b) Zusammengeben der Lipidsuspension mit einer Nukleinsäure, um einen Komplex oder ein Teilchen zu bilden, und c) Unterlassen einer Größenauftrennungsprozedur an den Komplexen oder Teilchen, die in Schritt b) erhalten worden sind.
Verfahren nach Anspruch 1, welches ferner den Schritt umfasst, die Lipidsuspension vor ihrem Zusammengeben mit der Nukleinsäure einer Größenauftrennungsprozedur zu unterwerfen, so dass eine Suspension von Komplexen oder Teilchen von homogener Größe gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Lipid-Nukleinsäure-Komplexe oder -Teilchen in der Suspension mit homogener Größe eine Größe von 500 nm oder weniger aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Lipid-Nukleinsäure-Komplexe oder -Teilchen in der Suspension mit homogener Größe eine Größe von 200 nm oder weniger aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das kationische Lipid aus der aus Spermidin-Cholesterol, Spermin-Cholesterol, 3β-[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl]chole sterol, Dioctadecylamidoglycylspermin und Mischungen davon bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Colipid Dioleoylphosphatidylethanolamin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der stabilisierende Zusatzstoff Polyethylenglycol ist, welches an eine Gruppierung, welche in der Lage ist, in den Lipid-Nukleinsäure-Komplex oder das Lipid-Nukleinsäure-Teilchen inkorporiert zu werden, gekoppelt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der stabilisierende Zusatzstoff aus der aus perfluorierten oder teilweise fluorierten Alkylketten, welche an eine Gruppierung, welche in der Lage ist, in den Komplex oder das Teilchen inkorporiert zu werden, gekoppelt sind, bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der stabilisierende Zusatzstoff Polyglucuronsäure ist, welche an eine Gruppierung, welche in der Lage ist, in den Komplex oder das Teilchen inkorporiert zu werden, gekoppelt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der stabilisierende Zusatzstoff Distearoylphosphatidylethanolaminpolyethylenglycol ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei die Gruppierung ein Phospholipid ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Gruppierung ein zwitterionisches Phospholipid ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Nukleinsäure aus der aus genomischer DNA, cDNA, synthetischer DNA, RNA, mRNA, Ribozymen, Antisinn-RNA und Oligonukleotiden bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Nukleinsäure ein Plasmid umfasst.
Homogene Suspension von stabilen Lipid-Nukleinsäure-Komplexen oder -Teilchen, welche durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 hergestellt worden ist.
Suspension nach Anspruch 15, wobei die kationischen Lipide Mischungen von kationischen Lipiden umfassen.
Suspension nach einem der Ansprüche 15 oder 16, wobei die Komplexe oder Teilchen in der Suspension mit homogener Größe eine Größe von 500 nm oder weniger aufweisen.
Suspension nach einem der Ansprüche 15 oder 16, wobei die Komplexe oder Teilchen in der Suspension mit homogener Größe eine Größe von 200 nm oder weniger aufweisen.
Lipid-Nukleinsäure-Komplex, welcher ein oder mehrere kationische Lipide, ein oder mehrere Colipide, einen oder mehrere stabilisierende Zusatzstoffe und eine Nukleinsäure-Komponente umfasst, wobei der Komplex eine Größe von 500 nm oder weniger aufweist.
Komplex nach Anspruch 19, wobei der Komplex eine Größe von 200 nm oder weniger aufweist.
Zusammensetzung, welche die Suspension nach einem der Ansprüche 15 bis 18 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Zusammensetzung, welche den Komplex nach einem der Ansprüche 19 oder 20 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 21 oder 22 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Abgabe einer Nukleinsäure an die Zellen eines Individuums, welches eine derartige Nukleinsäure benötigt.
Verwendung nach Anspruch 23, wobei die Nukleinsäure aus der aus genomischer DNA, cDNA, synthetischer DNA, RNA, mRNA, Ribozymen, Antisinn-RNA und Oligonukleotiden bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 23 oder 24, wobei die Nukleinsäure ein Plasmid umfasst.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 21 oder 22 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Abgabe einer Nukleinsäure, welche ein CFTR kodierendes Gen umfasst, zur Behandlung von zystischer Fibrose.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 21 oder 22 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Abgabe einer Nukleinsäure, welche ein lösliches CD4 kodierendes Gen umfasst, zur Behandlung von AIDS.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 21 oder 22 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Abgabe einer Nukleinsäure, welche ein ADA kodierendes Gen umfasst, zur Behandlung von Adenosindesaminase-Mangel.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 21 oder 22 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Abgabe einer Nukleinsäure, welche ein Dystrophin kodierendes Gen umfasst, zur Behandlung von Muskeldystrophie.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 21 oder 22 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Abgabe einer Nukleinsäure, welche ein ein Zytokin kodierendes Gen umfasst, zur Behandlung von Krebs.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 21 oder 22 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Abgabe einer Nukleinsäure, welche ein Tumorsuppressorgen umfasst, zur Behandlung von Krebs.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 21 oder 22 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Abgabe einer Nukleinsäure, welche ein immuntherapeutisch wirksames Gen umfasst, zur Behandlung von Krebs.