ES2208936T3 - Complejos de lipidos cationicos-acidos nucleicos. - Google Patents
Complejos de lipidos cationicos-acidos nucleicos.Info
- Publication number
- ES2208936T3 ES2208936T3 ES97934685T ES97934685T ES2208936T3 ES 2208936 T3 ES2208936 T3 ES 2208936T3 ES 97934685 T ES97934685 T ES 97934685T ES 97934685 T ES97934685 T ES 97934685T ES 2208936 T3 ES2208936 T3 ES 2208936T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- nucleic acid
- lipid
- complexes
- suspension
- complex
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
- A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR UNA SUSPENSION HOMOGENEA DE COMPLEJOS O PARTICULAS DE ACIDOS NUCLEICOS-LIPIDOS ESTABLES, QUE COMPRENDE: A) LA COMBINACION DE UNO O MAS LIPIDOS CATIONICOS, UNO O MAS COLIPIDOS, Y UNO O MAS ADITIVOS ESTABILIZANTES PARA FORMAR UNA SUSPENSION DE LIPIDOS; B) COMBINAR LA SUSPENSION DE LIPIDOS CON UN ACIDO NUCLEICO PARA FORMAR UN COMPLEJO O UNA PARTICULA, Y OPCIONALMENTE C) EXPONER EL COMPLEJO O LA PARTICULA A UN PROCEDIMIENTO DE CONFORMACION. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A UNA SUSPENSION HOMOGENEA PRODUCIDA POR EL PROCEDIMIENTO DESCRITO.
Description
Complejos de lípidos catiónicos-ácidos
nucleicos.
La presente invención se refiere a complejos
estables de lípidos catiónicos y ácidos nucleicos que se pueden
utilizar para administrar ácidos nucleicos a una célula con el fin
de proporcionar una molécula terapéutica a las células de un
paciente que necesita dicho tratamiento, así como a procedimientos
para la preparación de complejos estables de lípido catiónico-ácido
nucleico.
El éxito en terapia génica depende de la eficacia
de la administración y de la expresión de la información genética
dentro de las células de un organismo vivo. La mayoría de los
mecanismos utilizados hasta ahora implican vectores virales. Los
virus han desarrollado mecanismos diversos y sumamente sofisticados
para conseguir este objetivo que incluyen el paso a través de la
membrana celular, la inhibición de la degradación lisosómica, la
administración de su genoma al núcleo y, por consiguiente, se han
utilizado en muchas aplicaciones de administración génica.
Los vectores no víricos, que están basados en
mecanismos mediados por el receptor (Perales et al., Eur.
J. Biochem. 226:255-266, 1994; Wagner et
al., Advanced Drug Delivery Reviews
14:113-135, 1994) o en la transfección mediada por
lípidos (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
84:7413-7417 1987; Behr et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6982-6986, 1989; Gao
et al., Biochem. Biophys. Res. Communic.
179:280-285, 1991; Behr, Bioconjugate
Chemistry 5:382-389, 1994; Fahrhood et
al., Annals New York Academy of Sciences,
716:23-35, 1994; Ledley, Human Gene Therapy
6:1129-1144, 1995) auguran presentar ventajas con
respecto a la producción en gran escala, a los riesgos reducidos
relacionados con los vectores víricos, al direccionamiento de las
células transfectables, a la inmunogeneicidad más baja y a la
capacidad para administrar fragmentos mayores de ADN.
El desarrollo de vectores no víricos para la
administración de ácidos nucleicos dentro de las células necesita
moléculas que se puedan asociar a los ácidos nucleicos para permitir
a estos grandes polianiones hidrófilos atravesar la membrana
celular, que es una barrera hidrófoba, cargada negativamente de una
bicapa de fosfolípido, ayudarlos a escapar de la degradación
lisosómica y facilitar su acceso a los núcleos. La expresión del gen
en cuestión depende además de la accesibilidad del ácido nucleico
administrado a la maquinaria de transcripción celular, que necesita
muy probablemente la disociación de los complejos.
Aunque ya se habían descrito en 1965 (Bangham
et al., J. Mol. Biol. 13:238-252,
1965), los liposomas, que pueden encapsular las moléculas en
cuestión para la administración a la célula, no consiguen la
comercialización como agentes terapéuticos inyectables en pacientes
humanos hasta los 90 (Gregoriadis, Trends in Biotechnol.
13:527-537, 1995). Esta demora es atribuible a
dificultades para obtener formulaciones reproducibles con
estabilidades aceptables. Un inconveniente principal fue el
desarrollo de "liposomas estéricamente estabilizados (sigilo)"
que contenían un determinado porcentaje de fosfolípidos modificados
con polietilenglicol (PEG) (PEG-PL) (Gregoriadis,
Trends in Biotechnol. 13:527-537, 1995;
Lasic, Angew. Chem. Int. Ed. Engl.
33:1685-1698, 1994). Estos liposomas que contienen
PEG-PL demostraron tener más éxito para evitar la
detección y la eliminación por el sistema reticuloendotelial, lo que
dio como resultado periodos de conservación muy aumentados en la
circulación. Aunque los liposomas modificados con PEG se han
utilizado muy ampliamente, se han descrito (Torchilin, V.P. et
al., Biochim. Biophys. Acta 1195:181-184,
1994) otros polímeros hidrófilos tal como
poli(vinilpirrolidona) que aumentan la estabilidad cuando se
injertan en su superficie.
La evolución en la transferencia del ácido
nucleico mediado por lípidos en las células fue anticipada por la
introducción de lípidos catiónicos como vehículos para la
transferencia de ácidos nucleicos dentro de las células (Felgner
et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
84:7413-7417, 1987; Behr et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. 86:6982-6986, 1989; Gao et
al., Biochem. Biophys. Res. Communic.
179:280-285, 1991; Behr, Bioconjugate
Chemistry 5:382-389, 1994; Fahrhood et
al., Annals New York Academy of Sciences,
716:23-35, 1994; Ledley, Human Gene Therapy
6:1129-1144, 1995). Debido a que los lípidos
catiónicos están cargados positivamente, son capaces de acomplejarse
con ácidos nucleicos cargados negativamente. A diferencia de los
liposomas, estos complejos no necesitan una etapa de encapsulación y
se preparan por simple mezcla de los componentes. Estos complejos se
componen fundamentalmente de ácido nucleico recubierto de lípido, en
el que la capa del complejo cargada positivamente neutraliza las
cargas negativas del ácido nucleico y, además, puede unirse
eficazmente a la superficie celular cargada negativamente,
facilitando el acceso del ácido nucleico a la célula (Fahrhood et
al., Annals N.Y. Acad. Sci. 716:23-35,
1994).
Las ventajas de utilizar lípidos catiónicos para
mediar la transfección de los ácidos nucleicos incluyen la
sencillez de la preparación de los complejos, la capacidad del
componente lípido para acomplejar la mayor parte del ácido nucleico,
una amplia gama de tipos celulares susceptibles de transfección, una
gran eficacia de transferencia, pérdida de inmunogeneidad de los
complejos y disponibilidad de los lípidos catiónicos mediante la
síntesis química (Fahrhood et al., Annals N.Y. Acad. Sci.
716:23-35, 1994).
Se ha demostrado in vitro e in vivo
la administración del ácido nucleico mediada por lípidos catiónicos
a una gran variedad de tipos celulares. Por ejemplo, el ácido
nucleico que codifica el regulador de conductibilidad de la
transmembrana en la fibrosis quística (CFTR) acomplejado con lípidos
catiónicos se ha administrado a pulmones de ratón por vía
intratraqueal (Yoshimura et al., Nucleic Acids Res.
20:3233-3240, 1992) o mediante administración por
aerosol (Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
89:11277-11281, 1992). La administración de CFTR
utilizando lípidos catiónicos a un modelo de ratón de fibrosis
quística (CF) produjo la corrección del defecto del canal iónico
(Hyde et al., Nature 362:250-255,
1993). Los estudios clínicos humanos con administración mediada por
lípidos del gen de CFTR a pacientes con CF demostraron la expresión
del gen en el epitelio nasal y ningún efecto clínico desfavorable
(Caplen et al., Nature Medicine
1:39-46, 1995).
Se ha demostrado en ratones la expresión génica
generalizada de un gen indicador después de una sola inyección
intravenosa de un complejo de lípido catiónico y ADN (Zhu et
al., Science 261:209-211, 1993). Además,
los estudios de seguridad en roedores y en primates no humanos de
los complejos de lípido catiónico y ácido nucleico administrados de
forma generalizada no han demostrado ninguna toxicidad significativa
asociada a la administración de dichos complejos (Parker et
al., Human Gene Therapy 6:575-590,
1995).
Se demostró que la transfección del ARNm mediada
por lípidos catiónicos en el cultivo del tejido conducía a la
traducción del transcrito (Malone et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. 86:6077-6081, 1989). La
administración de oligonucleótidos de cadena complementaria a las
células endoteliales humanas utilizando lípidos catiónicos
proporcionó un aumento de la absorción celular de los
oligonucleótidos y aumentó la actividad de los mismos en las células
(Bennett et al., Mol. Pharm.
41:1023-1033, 1992). La utilización de lípidos
catiónicos acomplejados con partículas retrovíricas ha permitido la
infección vírica de células que carecían de receptor del virus
apropiado (Innes et al., J. Virol.
64:957-962, 1990) o aumentó la transducción
retrovírica utilizando complejos conocidos como virosomas (Hodgson
et al., Nature Biotechnol. 14:339-342,
1996).
La inmunoterapia para el cáncer utilizando
complejos de lípido catiónico y ácido nucleico que contienen genes
con histocompatibilidad principal (MHC) inyectados directamente en
tumores de ratón produjeron respuestas inmunitarias que dieron como
resultado la remisión del tumor (Plautz et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. 90:4645-4649, 1993).
Actualmente están en marcha estudios clínicos
humanos utilizando la administración mediada por lípidos catiónicos
de las secuencias de ADN que codifican las moléculas
inmunoterapéuticas en pacientes humanos de melanoma, cáncer
colorrectal y renal (Nabel et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. 90:11307-11311, 1993; Crystal,
Science 270:404-410, 1995).
Las formulaciones de lípidos catiónicos hasta la
fecha han incorporado con frecuencia el fosfolípido
dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE). Este fosfolípido se cree que
destruye la membrana endosómica desestabilizando la estructura
bicapa, permitiendo al complejo de lípido y ácido nucleico escapar
de la degradación endosómica y acceder dentro del citoplasma
(Farhood et al., Biochem. Biophys. Acta
1235:289-295, 1995).
Sin embargo, un obstáculo importante en la
utilización difundida de los complejos de lípido catiónico para la
administración del ácido nucleico a las células es la tendencia de
los complejos para formar grandes agregados en solución.
De hecho, Wasan et al., (J. Pharm.
Sci. 85:427-433, 1996) describen la preparación
de los complejos de lípido y ácido nucleico en las que se requiere
tratamiento con ultrasonidos para impedir la agregación.
Las solicitudes de patente WO 96/40963 y WO
96/40962, publicadas después de la fecha de presentación de esta
solicitud proponen reducir la agregación cambiando la relación ADN
a lípido y sugieren un proceso de medición. La solicitud de patente
WO 96/34109, publicada después de la fecha de presentación de esta
solicitud no menciona la utilización de un estabilizante en los
complejos de lípido y ADN.
La presente invención se refiere a complejos
estables o partículas de lípidos catiónicos y ácido nucleico que se
pueden utilizar para administrar ácido nucleico a una célula con el
fin de proporcionar una molécula terapéutica a las células de un
individuo que necesita dicho tratamiento. La invención se refiere
también a complejos o partículas estables de lípidos catiónicos y
ácido nucleico que contienen un aditivo estabilizante. Esta
invención se refiere además a los procedimientos para la preparación
de suspensiones homogéneas de complejos estables de lípido catiónico
y ácido nucleico o a partículas por combinación de uno o más lípidos
catiónicos, uno o más colípidos, uno o más aditivos estabilizantes y
un ácido nucleico u otro ligando. La invención también comprende un
procedimiento para preparar una suspensión homogénea de complejos
estables de lípido catiónico y ácido nucleico utilizando
opcionalmente procedimientos tal como la extrusión, que se puede
también utilizar como etapa de esterilización final en el
procedimiento de producción de los complejos de lípido y ácido
nucleico para la administración a pacientes con fines
terapéuticos.
La invención se refiere además a una suspensión
homogénea de complejos estables de lípido y ácido nucleico o de
partículas producidas por los procedimiento anteriores.
La invención debe entenderse haciendo referencia
a los dibujos, que se describen brevemente a continuación.
La Figura 1 muestra un diagrama esquemático del
plásmido pCMVluc.
La Figura 2 muestra la recuperación del ADN del
plásmido después de la extrusión de los complejos del vector de ADN
que contienen espermidina-Chol/DOPE acomplejado con
200 \mug/ml de ADN en todo un tamaño de poro de 200 nm. El
porcentaje de rendimiento se muestra en función del porcentaje
molar de
diestearoilfosfatidil-etanolamina-polietilenglicol
(DSPE-PEG) y de la relación de carga (+/-) del
complejo.
La Figura 3 muestra la integridad del ADN del
plásmido pCMVluc después de la extrusión de los complejos de lípido
y del ADN en el diámetro de poro de 200 nm determinados por
electroforesis en gel de agarosa (vía 1: pCMVluc; vía 2: pCMVluc
antes de la extrusión de los complejos que contienen 200 \mug/ml
de ADN del plásmido acomplejado con
espermidina-Chol/DOPE (1:1 en peso) y
DSPE-PEG2000 2% mol a una relación de carga +/- = 5;
vía 3: ADN del plásmido pCMVluc en la misma preparación después de
la extrusión a 0,2 \mum; vía 4: la misma preparación mostrada en
la vía 3 seguida de extrusión de los lípidos para aislar el ADN
acomplejado). La mancha en el fondo del gel corresponde al ARNt
portador que se utiliza para coprecipitar el ADN del plásmido.
La Figura 4 (A-D) muestra el
efecto del porcentaje molar de DSPE-PEG2000 sobre
la estabilidad de los complejos de lípido y ADN a 4ºC para
diferentes lípidos catiónicos a una concentración de ADN de 20
\mug/ml en función del tiempo, medida por espectroscopía de
correlación de fotones después de o sin etapa de extrusión. Las
columnas en negro muestran el tamaño de los diferentes complejos de
lípidos catiónicos y ADN que contienen el 10% de
DSPE-PEG2000 preparado sin etapa de extrusión; las
columnas en blanco muestran el tamaño de los diferentes complejos de
lípidos catiónicos y ADN que contienen el 10% de
DSPE-PEG2000 después de la extrusión; y las columnas
en gris muestran el tamaño de los diferentes complejos de lípidos
catiónicos y ADN que contienen el 10% de
DSPE-PEG2000 y preparados sin etapa de extrusión. A:
Chol/DOPE; B: Espermidina-Chol/DOPE; C:
Espermidina-Chol/DOPE; D: DOGS/DOPE.
La Figura 5 muestra el efecto de diferentes
concentraciones de DSPE-PEG2000 y de diferentes
relaciones de carga +/- sobre la estabilidad de los complejos de
lípidos y ADN que contienen espermidina-Chol/DOPE a
una concentración de ADN de 200 \mum/ml después de la extrusión en
función del tiempo. Las columnas en negro muestran el efecto de las
relaciones de carga +/- :5; las columnas en blanco muestran el
efecto de las relaciones de carga +/- :2,5 y las columnas en gris
muestran el efecto de las relaciones de carga +/- :1; A:
DSPE-PEG2000 al 10%, B: DSPE-PEG2000
al 5%, DSPE-PEG2000 al 2%.
La Figura 6 muestra el efecto de diferentes
concentraciones de DSPE-PEG2000 y de diferentes
relaciones de carga +/- sobre la estabilidad de los complejos de
lípido y ADN que contienen espermidina-Chol/DOPE a
una concentración de ADN de 200 \mum/ml antes de la extrusión en
función del tiempo. Las columnas en negro muestran el efecto de las
relaciones de carga +/- :5; las columnas en blanco muestran el
efecto de las relaciones de carga +/- :2,5 y las columnas en gris
muestran el efecto de las relaciones de carga +/- :1; A:
DSPE-PEG2000 al 10%, B: DSPE-PEG2000
al 5%, DSPE-PEG2000 al 2%.
La Figura 7 muestra el efecto de
DSPE-PEG2000 sobre la actividad de la transfección
in vitro de los complejos de lípido y ADN en las células A459
en función de la concentración de ADN en el plásmido. A) Nivel de
expresión en presencia de DSPE-PEG2000 al 10% con
respecto a un blanco de tampón y B) en comparación con una
preparación sin DSPE-PEG2000.
La Figura 8 muestra la actividad de la luciferasa
(RLU/mg de proteína) después de la inyección intratraqueal de
diferentes complejos de lípido catiónico y ADN en ratones en
función de del día después de la inyección comparada con la
inyección sin ADN solamente o de una referencia de adenovirus
recombinante.
La Figura 9 muestra la actividad de la luciferasa
(RLU/mg de proteína) después de la inyección intratraqueal de
complejos de
espermidina-Chol/DOPE-pCMVluc +
DSPE-PEG2000 al 10% +/- extrusión en ratones. Las
zonas del tejido del análisis para cada ratón numerado son las
siguientes: (T: tráquea; PG: pulmón izquierdo; PD: pulmón
derecho).
La Figura 10 muestra la influencia de las
relaciones de carga y DSPE-PEG2000
(PEG-PL) sobre la actividad de la luciferasa (RLU/mg
de proteína) después de la inyección intravenosa de diferentes
complejos de lípido catiónico y ADN que contienen
DC-Chol/DOPE en ratones,
comparada con la inyección sin ADN. Se muestran las zonas de tejido
del análisis.
La Figura 11 es una representación esquemática de
la síntesis del glicerolípido catiónico pcTG56.
La presente invención se refiere a complejos
estables o a partículas de lípidos catiónicos y ácido nucleico que
se pueden utilizar para administrar ácido nucleico a una célula con
el fin de proporcionar una molécula terapéutica a las células de un
individuo que necesita dicho tratamiento. La invención se refiere
también a complejos estables o partículas de lípidos catiónicos y
ácido nucleico que contienen un aditivo estabilizante. La invención
se refiere además a procedimientos para la preparación de
suspensiones homogéneas de complejos estables de lípido catiónico y
ácido nucleico combinando uno o más o mezclas de lípidos
catiónicos, uno o más colípidos, uno o más aditivos estabilizantes y
un ácido nucleico u otro ligando. La invención incluye un
procedimiento para preparar una suspensión homogénea de complejos o
partículas estables de ácido nucleico, que comprende combinar uno o
más lípidos catiónicos, uno o más colípidos y uno o más aditivos
estabilizantes para formar una suspensión de lípido, combinar la
suspensión de lípido con un ácido nucleico para formar un complejo
o una partícula sin someter al complejo o a la partícula a un
procedimiento de medida para formar complejos o partículas de tamaño
homogéneo. La invención también incluye un procedimiento para
preparar una suspensión homogénea de complejos o partículas
estables de lípido catiónico y ácido nucleico utilizando
procedimientos tal como el de extrusión, que se puede utilizar como
etapa de esterilización final en el procedimiento de producción de
complejos de lípido y ácido nucleico para la administración a
pacientes con fines terapéuticos.
Los complejos o partículas de la invención
incluyen uno o más lípidos catiónicos, uno o más colípidos, uno o
más aditivos estabilizantes y un ácido nucleico u otro ligando.
La presente invención se refiere también a una
suspensión homogénea de complejos o partículas estables de lípido y
ácido nucleico, producida:
a) combinando uno o más lípidos catiónicos, uno o
más colípidos y uno o más aditivos estabilizantes para formar una
suspensión de lípido,
b) combinando la suspensión de lípido con un
ácido nucleico para formar un complejo o una partícula,
c) sin someter el complejo o la partícula a un
proceso de medición.
La invención comprende también la suspensión
homogénea anterior en la que la suspensión de lípido está sometida
además a un proceso de medición de modo que se produce una
suspensión de complejos o partículas de tamaño homogéneo.
"Complejos o partículas estables" significa
que, independientemente de su tamaño, dichos complejos o partículas
no forman agregados.
"Suspensión homogénea" es, notablemente, el
resultado de una suspensión que contiene complejos o partículas no
agregados.
Los lípidos catiónicos o las mezclas de lípidos
catiónicos que se pueden utilizar en los complejos de la invención
incluyen Lipofectina^{TM} (mezcla de DOTMA (cloruro de
N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio)
y DOPE, 1:1 en peso), GIBCO-BRL; DDAB (bromuro de
dimetil-dioctadecilamonio); DMRIE (bromuro de
1,2-dimiristil-oxipropil-3-dimetil-hidroxietilamonio);
espermidina-colesterol
(espermidina-Chol);
espermina-colesterol
(espermina-Chol); DC-chol
(3\beta[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil
colesterol); Transfectam^{TM} (DOGS,
dioctadecilaminoglicilespermida), Promega; DOSPER
(1,3-di-oleiloxi-2-(6-carboxi-espermil)-propilamina),
Boehringer Mannheim; DOTAP (N-[1-(metilsulfato de
2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N,-trimetilamonio),
Boehringer Mannheim; Tfx^{TM}50 (mezcla de
N,N,N',N',-tetrametil-N,N',-bis (yoduro de
2-hidroxietil)-2,3-dileoiloxi-1,4-butanodiamonio
y DOPE), Promega; Lipofectamina^{TM} (DOSPA), Lipofectace^{TM}
(mezcla de DDAB y DOPE, 1:2,5 en peso),
GIBCO-BRL.
Preferentemente, los lípidos catiónicos de la
presente invención se seleccionan de entre
espermidina-colesterol,
espermina-colesterol, DC-chol y
DOGS. Más preferentemente, el lípido catiónico es cualquiera de los
isómeros de espermidina-colesterol.
Los colípidos se añaden a los complejos para
facilitar el acceso del ácido nucleico a la célula o para conjugar
los aditivos que aumentan la estabilidad. Los colípidos de la
invención incluyen lípidos neutros, iónicos dipolares y
aniónicos.
Un colípido preferido que se puede añadir a los
complejos para facilitar el acceso de los complejos a la célula es
la dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE).
En una forma de realización preferida, el
colípido DOPE está acomplejado con el lípido catiónico para
facilitar el transporte del complejo a través de la membrana
celular e impedir la degradación endosómica.
Las relaciones de lípido catiónico a colípido (en
base peso-peso) pueden oscilar entre 1:0 y 1:10. En
las formas de realización preferidas, la relación oscila entre 1:0,5
y 1:4.
Se pueden añadir también otros colípidos a los
complejos de la invención para permitir la unión de aditivos
estabilizantes al complejo. El colípido puede ser un grupo que
permite al aditivo estabilizante incorporarse al complejo de la
invención. La derivación del lípido con un aditivo permite al grupo
anclar el aditivo estabilizante en el complejo de lípido catiónico.
El colípido se puede conjugar con aditivos que impiden la agregación
y precipitación de los complejos de lípido catiónico y ácido
nucleico.
Los colípidos que se pueden utilizar para
incorporar dichos aditivos a los complejos de lípido catiónico y
ADN de la invención comprenden, pero no están limitados a, iones
dipolares u otros fosfolípidos. Preferentemente, el colípido
utilizado para conjugar un aditivo estabilizante es un grupo capaz
de incorporarse en los complejos de la invención. Más
preferentemente, dicho colípido es inerte y biocompatible.
En una forma de realización preferida, el
fosfolípido diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) se deriva con
un aditivo estabilizante y es el grupo capaz de incorporarse en los
complejos de lípido catiónico y ácido nucleico de la invención.
En otra forma de realización de la invención, los
lípidos catiónicos se pueden sintetizar para contener aditivos
estabilizantes tal como el polietilenglicol (PEG), cuyo producto se
uniría al ácido nucleico en un complejo de la invención mediante
interacciones electrostáticas.
Los aditivos estabilizantes se pueden también
añadir a los complejos de la invención para mantener la integridad
de los complejos, para mantener la estabilidad del complejo durante
los procesos de medición y para aumentar el periodo de conservación.
Los aditivos se unen preferentemente a un grupo capaz de
incorporarse o de unirse al complejo, por ejemplo, a un colípido.
Dichos aditivos generalmente se seleccionan de entre polímeros
hidrófilos, que comprenden, pero no están limitados a,
polietilenglicol, polivinilpirrolidona, polimetiloxazolina,
polihidroxilpropilmetacrilamida, ácido poliláctico, ácido
poliglicólico y celulosas derivadas tales como hidroximetilcelulosa
o hidroxietilcelulosa (publicación TCP nº WO 94/22429, publicada el
13 de octubre de 1994). Otros aditivos estabilizantes útiles en
presente invención comprenden cadenas de alquilo perfluorado o
parcialmente perfluorado, fosfolípidos fluorados, ácidos grasos y
fosfolípidos perfluoralquilados y ácidos poliglucurónicos (Oku
et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier
Systems 11:231-270, 1994).
Preferentemente, el fosfolípido DSPE se deriva
con polietilenglicol (PEG) para formar el aditivo estabilizante
DSPE-PEG. Más preferentemente, el peso molecular de
PEG que se puede utilizar oscila entre 300 y 20.000 Da. En una
forma de realización todavía más preferida, se utiliza PEG2000 como
aditivo estabilizante.
El conjugado de PEG y lípido se puede preparar
por varios procedimientos, incluyendo la utilización del conector
cloruro de cianuro (patente U.S. nº 5.225.212, icorporada a la
presente memoria como referencia). Se pueden utilizar otros
procedimientos de activación, incluyendo los que utilizan
carbonildiimidazol (C=O), anhídrido succínico
(-CO-CH_{2}-CH_{2}-CO-)
o toxilato:
-(CH_{2}-CH_{2}-O-)_{n-1}CH_{2}-CH_{2}-NH-PE
Una estructura general propuesta de aditivos es
la siguiente (PE=fosfatidiletanolamina):
En la que el polímero es polietilenglicol:
CH_{3}O-(CH_{2}-CH_{2}-O-)_{n}-X-NH-PE
\hskip2cmYO-( CH_{2}-CH_{2}-O-)_{n}-X-NH-PE
Peso molecular medio: 300 a 10.000 Da,
(n=5-250)
X: conector (CO; cloruro de cianuro, véase la
patente U.S. nº 5.225.212)
Y: ligando (péptido, hidrato de carbono,
proteína, digionucleótido, vitamina, antagonista o agonista de
\hbox{receptor, ...).}
En otra forma de realización de la invención, se
puede acoplar un ligando al estabilizador o al grupo PEG de un
complejo de la invención utilizando un grupo -OH libre. Tales
ligandos comprenden pero no se limitan a péptidos, hidratos de
carbono, proteínas, ácidos nucleicos, vitaminas, antagonistas de
receptor y agonistas de receptor. Cuando el ligando sea un
digionucleótido, se puede preparar un conjugado de PEG y
digionucleótido. Los procedimientos para activar el grupo -OH para
acoplamiento del ligando incluyen los que utilizan
carbonildiimidazol, cloruro de cianuro, anhídrido succínico o
toxilato. Preferentemente, el ligando contiene un grupo NH_{2} o
SH libre disponible para el acomplamiento.
Un ejemplo es el siguiente:
El acoplamiento del ligando se puede hacer en
cualquiera de las diversas etapas de formación del complejo,
incluyendo en el nivel molecular entre
DSPE-PEG-OH- y el ligando, en el
nivel de suspensión de lípido, o en el nivel del complejo de lípido
y ADN. Preferentemente, el acoplamiento se realiza en una etapa
posterior a la formación del complejo, con una probabilidad
aumentada de que el ligando esté sobre la superficie del complejo
y, por consiguiente, accesible.
Se pueden añadir a los complejos aditivos
estabilizantes que permiten aumentar el almacenaje de complejos de
lípido catiónico y ácido nucleico con el fin de conseguir tal
estabilidad a largo plazo, pero se deben añadir de modo que los
aditivos no interfieran en la unión del ácido nucleico al lípido
catiónico, especialmente a relaciones de carga más bajas.
La relación molar de un aditivo estabilizante,
tal como un derivado de fosfolípido, al colípido (por ejemplo,
DSPE-PEG2000/DOPE) puede oscilar entre 0,01 y 1
(0,5% mol a 50% mol con respecto a la cantidad total de lípido). En
una forma de realización preferida, el aditivo estabilizante se
puede añadir a la mezcla de lípido catiónico y colípido en las
concentraciones comprendidas entre 1 y 20% mol de lípido total. En
una forma de realización más preferida, la relación molar del
aditivo estabilizante al colípido puede oscilar entre 0,04 y
0,2.
Los complejos de la presente invención incluyen
también un componente deseado de ácido nucleico que se ha de
administrar a una célula que necesita dicha molécula. El ácido
nucleico que está acomplejado con la suspensión de lípido o con el
lípido catiónico puede ser una molécula de ADN o de ARN, que puede
ser de una o doble cadena. El ácido nucleico puede ser, entre otros
un ADN genómico, un ADNc, un ARNm, un ARN de cadena complementaria o
un ribozima. El ácido nucleico puede estar también en forma de
plásmido o de ácido nucleico lineal que contiene una secuencia
expresable de ácido nucleico que puede generar una proteína,
ribozima, cadena complementaria u otra molécula en cuestión en la
administración a una célula. El ácido nucleico también puede ser un
oligonucleótido que se ha de administrar a la célula, p. ej. para
las funciones de cadena complementaria o de ribozima. En una forma
de realización preferida que utiliza ácido nucleico expresable, se
utiliza ADN de plásmido. Las concentraciones de ácido nucleico que
se pueden añadir a los lípidos catiónicos o a las suspensiones de
lípido para formar los complejos de la invención oscilan entre 10
\mug/ml y 1.000 \mug/ml. En una forma de realización preferida
de la invención, la concentración de ácido nucleico oscila entre 20
\mug/ml y 500 \mug/ml.
Los complejos de lípido catiónico y ácido
nucleico de la invención se pueden caracterizar también por su
relación de carga (+/-), que es la relación del componente de lípido
catiónico cargado positivamente al componente de ácido nucleico
cargado negativamente del complejo. En general, una carga positiva
en exceso sobre el complejo facilita la unión del complejo a la
superficie celular cargada negativamente. La relación carga de un
complejo de la invención se puede calcular dividiendo la suma de
cargas positivas por las cargas negativas del complejo. Se puede
realizar una determinación de la carga positiva por mol para un
lípido o colípido catiónico específico, de modo que un peso dado de
lípido represente una carga positiva específica. Una determinación
análoga se puede realizar con respecto al ácido nucleico o al
colípido para dar la carga negativa por mol, de modo que un peso
dado de ácido nucleico o de colípido represente una carga negativa
específica. Dividiendo todas las cargas positivas por todas las
cargas negativas, se determina la relación de carga neta (+/-) del
complejo.
Preferentemente, el intervalo de la relación de
carga de los complejos de la invención está comprendido entre 1 y
20 (+/-). Más preferentemente, el intervalo está comprendido entre
2,5 y 10 (+/-).
La invención se refiere también a los
procedimientos para la medición homogénea de las suspensiones de
lípido (antes de la adición del ácido nucleico) utilizando procesos
de medición que estandarizan el tamaño de partícula de las
suspensiones de lípido. La extrusión antes de la adición del ácido
nucleico reduciría el ácido nucleico que se une a los agregados de
lípido. Los procedimientos que se pueden utilizar para producir
preparaciones o suspensiones homogéneas de los complejos incluyen,
pero no se limitan a, extrusión, tratamiento con ultrasonidos y
microfluidización, cromatografía por exclusión de tamaño,
fraccionamiento del flujo del campo, electroforesis y
ultracentrifugación.
En una forma de realización preferida de la
invención, se utiliza un procedimiento que comprende la extrusión
de suspensiones de lípido a través de membranas de diámetro de poro
definido para preparar partículas o preparaciones de tamaño
homogéneo de los complejos de la invención sin modificación del
ácido nucleico acomplejado. Se puede utilizar un extrusor en el que
las membranas de policarbonato de diámetro de poro defenido están,
amontonadas de modo que se fuerza la suspensión a través de las
membranas a presión, por ejemplo, Lipex Biomembranes, Inc.,
Vancouver, Canadá). Las suspensiones de lípido se pueden extruir a
través de membranas con poros de diámetro 50 a 500 nm. Las membranas
preferidas tienen un diámetro de poro de 200 nm. La extrusión de los
complejos se puede utilizar como etapa final de esterilización en el
procedimiento de producción de complejos de lípido catiónico y ácido
nucleico para la administración a pacientes con fines
terapéuticos.
En una forma de realización preferida de la
invención, el tamaño de partícula de un complejo de lípido
catiónico y ácido nucleico puede oscilar entre 25 y 500 nm. Más
preferentemente, el tamaño de partícula de un complejo es de 200 nm.
El tamaño de partícula se puede seleccionar para su utilización
óptima en una aplicación determinada. Por ejemplo, cuando una
aplicación clínica determinada implica el extravasado de los
complejos de lípido catiónico y ácido nucleico, el tamaño del
complejo puede ser aproximadamente de 80 nm o inferior.
Las mediciones del tamaño de partícula se pueden
realizar mediante numerosas técnicas que incluyen pero no se
limitan a barrido dinámico con luz de láser (espectroscopía de
correlación de fotones, PCS), además de otras técnicas conocidas por
los expertos en la materia (véase Washington, Particle Size Analysis
in Pharmaceutics and other Industries, Ellis Horwood, Nueva York,
1992, págs. 135-169).
Después que los complejos de la invención se han
sometido a un procedimiento, p. ej.: extrusión, se puede calcular
el porcentaje de rendimiento para evaluar la recuperación. Este
cálculo está basado en determinar la concentración de ácido nucleico
en los complejos antes y después del procedimiento. Por ejemplo,
cuando una suspensión de complejos que contiene ADN se extruye a
través de las membranas de medición, se puede determinar la
concentración de ADN en la suspensión utilizando técnicas estándar,
p. ej.: medición de la absorbancia a 260 nm (A260), que detecta el
ácido nucleico. La presencia de DMSO facilita la determinación de
concentración de ADN en presencia de lípido. El porcentaje de
rendimiento después de la extrusión se puede calcular a partir de la
relación de las concentraciones determinadas antes y después de la
extrusión.
Para determinar la integridad estructural del
ácido nucleico en los complejos después de un procedimiento, se
puede analizar el ácido nucleico, por ejemplo, por electroforesis
en gel de agarosa después de la extracción de los lípidos con
disolvente. La utilización de la cartografía de restricción del
ácido nucleico puede proporcionar, por ejemplo, un detalle adicional
por lo que se refiere al estado del plásmido. Utilizando dichas
técnicas, es posible determinar si el ácido nucleico en un complejo
permanece estructuralmente intacto y no se degrada mediante fuerzas
de cizallamiento durante la filtración a presión u otras tensiones
mecánicas generadas en los procedimientos.
También es posible evaluar la estabilidad
estructural de los complejos desde el punto de vista de cuán
estrechamente unido está el ADN y recubierto por el lípido o por el
componente estabilizante del lípido del complejo. Esto se puede
medir evaluando la migración del ADN en un gel de agarosa (ninguna
migración indica que el ADN está recubierto por el lípido) o
mediante incubación con ADNseI seguida de extración del lípido y
electroforesis en gel de agarosa para evaluar si el ADN en el
complejo se expuso a la superficie.
Los complejos de la invención se pueden almacenar
a 4ºC para su estabilidad óptima. La estabilidad de los complejos a
lo largo del tiempo se puede determinar mediante evaluación
periódica del tamaño de partícula, utilizando los procedimientos
descritos anteriormente para dicha medición.
Los complejos de lípido catiónico y ácido
nucleico son también útiles para la transferencia del ácido
nucleico dentro de las células con el fin de controlar el
comportamiento del ácido nucleico en el medio celular. Por ejemplo,
se puede utilizar la transfección del lípido catiónico de un gen
dentro de las células en cuestión, para determinar los parámetros
reguladores que permiten la expresión del gen (potenciadores,
promotores, etc.) uniendo estos elementos al gen en cuestión y
analizando la expresión.
Los complejos de lípido catiónico y ácido
nucleico se pueden utilizar para la administración del ácido
nucleico a las células de un paciente que necesita tratamiento con
dichas moléculas. Las vías de administración comprenden, pero no se
limitan a la inyección directa por las vías (p. ej.:
intratraqueal), por aerosol, intramuscular, intratumoral e
intravenosa para la administración in vivo. La transfección
del ácido nucleico mediada por el lípido catiónico dentro de las
células utilizada en los procedimientos de trasplante ex vivo
se puede también utilizar para administrar el ácido nucleico a un
individuo que necesita dichas moléculas.
Los transgenes terapéuticos que se pueden
utilizar como componente de ácido nucleico de los complejos de la
invención comprenden, pero no se limitan a, CFTR para fibrosis
quística, \alpha1-antitripsina para enfisema, CD4
soluble para SIDA, AD para insuficiencia de
adenosin-desaminasa, distrofina para distrófia
muscular, genes de citocina para tratamiento del cáncer, genes
inmunoterapéuticos o supresores tumorales para el tratamiento del
cáncer y cualesquiera otros genes que están reconocidos en la
materia por ser útiles en terapia génica. El componente del ácido
nucleico puede también incluir el ARNm. Los ácidos nucleicos
transgénicos que codifican moléculas tales como ribozimas, ARN con
cadena complementaria u oligonucleótidos pueden además estar
contenidos en el componente del ácido nucleico de un complejo de la
invención. Por otra parte, los ribozimas, el ácido nucleico con
cadena complementaria o los oligonucleótidos se pueden incorporar
directamente a los complejos de la invención. Las construcciones del
ácido nucleico pueden contener también elementos reguladores que
gobiernan la expresión del gen, tales como potenciadores y
promotores.
Cuando los complejos que comprenden un ácido
nucleico expresable se administra a una gran variedad de tipos
celulares, p. ej., por diversas vías de administración incluyendo
la administración intravenosa, que conduce a la absorción
generalizada de los complejos de lípido y ácido nucleico, la
expresión del ácido nucleico puede estar limitada a tejidos
específicos mediante la utilización de promotores específicos para
el tejido. El control temporal de la expresión del ácido nucleico se
puede también conseguir con la utilización de promotores inducibles
que se activan en respuesta a un estímulo exógeno, p. ej., un
promotor de MMTV activado por metalotionina, un TAR/RRE que
comprende el promotor activado en presencia de las proteínas TAT/REV
del VIH o un promotor responsable de la hormona.
Cuando el componente del ácido nucleico del
complejo comprende un gen expresable, la función biológica del
mismo se puede analizar mediante técnicas estándar, incluyendo la
detección del ARNm mediante la transferencia de Northern o por
análisis de S1 y/o detección de la proteína utilizando la
transferencia de Western, la inmunoprecipitación o el análisis de la
proteína funcional. El último es particularmente útil cuando un gen
codifica a una proteína con marcador adecuado, p. ej., luciferasa o
\beta-galactosidasa.
Los complejos de lípido catiónico y ácido
nucleico pueden transferir in vitro el ácido nucleico en
cuestión a células con el fin de determinar la función de dicho
ácido nucleico, o con el fin de proveer dichas células de un ácido
nucleico que proporciona un beneficio terapéutico, o con el fin de
determinar la eficacia y la especificidad de los complejos para la
administración del ácido nucleico. Dichas células pueden incluir,
pero no se limitan a, líneas celulares probadas, p. ej.: A549,
NIH3T3, HeLa, además de células primarias u otras células conocidas
por los expertos en la materia.
El ácido nucleico en cuestión se puede también
administrar in vivo a las células de un modelo animal que se
puede utilizar para determinar la eficacia y la especificidad de
transferencia a los tejidos de un organismo en su conjunto. Dichos
animales incluyen ratones (p. ej.: C57 Black/10 o Balb/c), conejos y
primates además de otros. Se pueden utilizar modelos animales de los
estados patológicos humanos para probar la eficacia de determinadas
moléculas para tratamiento terapéutico, p. ej.: ratones transgénicos
modificados genéticamente para expresar un gen mutante de CFTR como
modelo de fibrosis quística.
La presente invención también abarca las
composiciones farmacéuticas que contienen los complejos de la
invención que se pueden administrar en una cantidad
terapéuticamente eficaz para administrar un ácido nucleico deseado a
un paciente que necesita la terapia. Las composiciones farmacéuticas
pueden incluir excipientes farmacéuticamente aceptables, incluyendo
cualquier disolvente relevante. Tal como se utiliza en la presente
memoria "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye
cualquier y todos los disolventes, medios de dispersión,
recubrimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos, agentes
isotónicos y retardadores de absorción y similares. Excepto en la
medida en que cualquier medio o agente convencional sea compatible
con el principio activo, se contempla su utilización en las
composiciones terapéuticas.
La práctica de la invención emplea, a menos que
se indique de otra manera, técnicas convencionales de tecnología de
ADN recombinante, química de las proteínas, microbiología y
virología que están comprendidas dentro de la experiencia en la
materia. Dichas técnicas están completamente explicadas en la
bibliografía. Véase, p. ej.: Current Protocols in Molecular Biology,
Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., Nueva
York, 1995.
La invención se ilustra por referencia a los
ejemplos siguientes.
Los lípidos catiónicos DC-Chol
(3\beta[N-(N',N'-dimetil-aminoetano)-carbamoil]
colesterol) (sintetizado según Gao, X. y Huang, L., Biochem.
Biophys. Res. Communic. 179:280-285, 1991),
espermidina-colesterol
(espermidina-Chol) (sintetizado en Transgène, S.A.)
(Caffey et al., J. Biol. Chem.
270:31391-31396, 1995; solicitud francesa nº 96
01347, incorporados ambas en la presente memoria como referencia)
espermina-colesterol
(espermina-Chol) (sintetizado en Transgène, S.A.)
(Caffey et al., J. Biol. Chem.
270:31391-3196, 1995; solicitud francesa nº 96
01347) y
dioctadecilamido-glicil-espermina
(DOGS) (donación generosa del Dr. Jean Paul Behr (Behr et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86:6982-6986,
1989, incorporada a la presente memoria como referencia) y los
colípidos dioleoilfosfatidiletanolamina
\hbox{(DOPE)}
(Sigma, Ref. P5058, lote 75H8377) y
diestearoil-fosfatidil-etanolamina-PEG2000
(DSPE-PEG2000, Avanti Polar Lipids, Alabaster,
Alabama, USA, Ref. 880120, lote 18OPEG2PE-21) se
combinaron en las relaciones requeridas (relaciones de lípido
catiónico:DOPE de 1:1; relación de DSPE-PEG2000 a
lípido total de 2, 5 y 10% mol) mezclando las respectivas soluciones
en cloroformo/etanol (8:2) y evaporando los disolventes en una
corriente de nitrógeno para producir una película seca de lípido.
Los disolventes residuales se evaporaron al vacío. La película seca
de lípido se rehidrató a 4ºC durante toda la noche con agitación
suave en Hepes 20 mM, pH 7,8, NaCl al 0,9% y se puso en suspensión
mediante ultrasonidos durante 8 min en un baño con ultrasonidos
(Bransonic 221).
Las mezclas de lípido catiónico y colípido se
extruyeron a 200 nm antes de acomplejarlas con ADN a diferentes
relaciones de carga +/-. La extrusión se realizó utilizando un
extrusionador de Lipex Biomembranes, Inc. (Vancouver, Canadá) dotado
de un paquete de 2 membranas de policarbonato con poros de diámetro
de 0,2 \mum (Nucleopore, Costar Corp. Cambridge, MA, USA). La
suspensión se hizo pasar a través de las membranas bajo una presión
de gas nitrógeno de aproximadamente 10 bar a 50ºC.
En un ejemplo particular, se mezclaron y se
secaron los lípidos siguientes: 422 \mul de
espermidina-Chol (10 mg/ml), 422 \mul de DOPE (10
mg/ml) y 145 \mul de DSPE-PEG2000 (25 mg/ml) bajo
una corriente de nitrógeno, seguida de evaporación del disolvente
residual al vacío. La redisolución se consiguió añadiendo 4,32 ml de
Hepes 20 mM, pH 7,8, NaCl al 0,9% durante toda la nocha a 4ºC en un
agitador, seguida de tratamiento con ultrasonidos en un baño con
ultrasonidos (Bransonic 221) durante 8 min para dar las siguientes
concentraciones de lípido: espermidina-Chol: 1,75
mM, DOPE: 1,31 mM, DSPE-PEG: 0,31 mM. La suspensión
de lípido se extruyó a través de un paquete de 2 membranas, de
diámetro de poro 200 nm. La suspensión se hizo pasar a través de las
membranas bajo una presión de gas nitrógeno de aproximadamente 10
bar a 50ºC. Se añadieron 200 \mul de ADN del plásmido pCMVluc
(1,46 mg/ml en Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM) a
una alícuota de 1,26 ml de la suspensión del lípido para alcanzar un
volumen final de 1,46 ml. Las concentraciones de los componentes en
la preparación final del complejo fueron:
espermidina-Chol: 1,51 mM, DOPE: 1,13 mM,
DSPE-PEG: 0,27 mM; ADN: 200 \mug/ml. Dicho
complejo contiene DSPE-PEG2000 10% mol y presenta
una relación de carga de 5 a una concentración de ADN de 200
\mug/ml.
Los complejos de lípido y ADN se difundieron de
nuevo a través de una membrana de policarbonato de diámetro de poro
200 nm a 50ºC y aproximadamente a una presión de nitrógeno de 10
bar. Para comparación de la estabilidad de los complejos de lípido
y ADN extruidos y no extruidos, véase la Fig. 4.
En la Figura 1 se muestra el plásmido pCMVluc que
contiene el gen de luciferasa bajo el control del promotor de
CMV.
El tamaño de partícula de los complejos de lípido
catiónico y ácido nucleico que se obtuvieron se determinó por
espectroscopía de correlación de fotones (denominada también
barrido con luz dinámica), técnica que se basa en el barrido con luz
de láser. PCS mide el movimiento browniano de las partículas en el
volumen iluminado del rayo de láser y calcula una función de
correlación que enlaza las fluctuaciones en la luz barrida con el
coeficiente de difusión de las partículas. El tamaño de partícula
procede entonces del coeficiente de difusión utilizando la relación
de Stokes-Einstein: D=kT/3\pi\etad (k: constante
de Boltzmann; T: temperatura absoluta; \eta: viscosidad; d:
diámetro de partícula (véase Clive Washington, Particle Size
Analysis in Pharmaceutics and other Industries, editor Ellis
Horwood, Nueva York, 1992, págs. 135-169; contiene
también capítulos sobre otros procedimientos).
Se realizó la PCS en una alícuota antes de la
extrusión, mientras que el resto se extruyó a través de una
membrana de 200 nm a 50ºC. Se determinó de nuevo el tamaño de
partícula por PCS después de la extrusión. Los complejos de lípido
catiónico y ácido nucleico se almacenaron a 4ºC durante varios
periodos de tiempo para determinar su estabilidad.
Se determinó la concentración de ADN en las
preparaciones de lípido catiónico y ácido nucleico aclarando la
suspensión de lípido con dimetilsulfóxido (DMSO) al 10%
(peso/peso). Se midió la absorbancia a 260 nm utilizando la relación
que define 50 \mug/ml de ADN igual a 1 unidad de absorbancia como
una longitud de paso de 1 cm. Las mediciones para diferentes
preparaciones se realizaron antes y después de la extrusión y se
compararon con la concentración del ADN no acomplejado del plásmido.
El porcentaje de rendimiento se calcula tomando la relación A260
(después de la extrusión)/A260 (antes de la
extrusión)(\times100).
Se determinó la integridad física del ADN en los
complejos por electroforesis en gel de agarosa después de la
extracción de los lípidos con disolvente. Con este fin, se mezcló 1
ml de suspensión de lípido catiónico y ácido nucleico con 0,4 ml de
agua, 2 ml de metanol y 1 ml de cloroformo y se agitó fuertemente
durante 2 min. Después de la centrifugación durante 5 min a 3.000
rpm, se transfirió la fase superior a un tubo separado y se secó al
vacío. El precipitado se redisolvió en 250 \mul de agua a la que
se añadió 27 \mul de acetato de sodio 3 M y 5 \mug de ARN de
transferencia, seguido de la adición de 700 \mul de etanol
absoluto que se había enfriado a -20ºC. Después de una breve
agitación fuerte y de 1 h a -20ºC, se recuperó el precipitado de ADN
por centrifugación a 15.000 rpm durante 30 min a 4ºC. Se decantó el
líquido y el sedimento restante se lavó dos veces con 200 \mul de
etanol acuoso al 70% (enfriado a -20ºC) y se recuperó por
centrifugación después de cada lavado. El sedimento se secó a
continuación al vacío y se redisolvió en Tris-HCl 10
mM, pH 7,5, EDTA 1 mM hasta una concentración final aproximada de
0,5 \mug/\mul. La electroforesis en gel de agarosa se realizó en
geles de costa submarina (14 \times 10 \times 0,8 cm) en agarosa
al 1% (Sigma, Ref. A-6877, lote 123HO552) en Tris
(4,86 g), acetato de sodio \times 3 H_{2}O (0,68 g) y EDTA
(0,336 g, todos los pesos son para un volumen final de 1 litro,
ajustado a pH 7,8 con ácido acético) a 60 voltios durante 2 h. Las
bandas de ADN se tiñeron con bromuro de etidio en el tampón anterior
a 60 \mug/l.
Se realizó el análisis de tamaño de partícula por
barrido con luz de láser (láser de He-Ne de 10 mW a
632,8 nm) combinado con PCS (Coulter N4 Plus, Miami, FL, USA) en
todo el intervalo de 3 a 10.000 nm. Se midió la luz de barrido en un
ángulo de 90º de la muestra diluida en Hepes 20 mM, pH 7,8, NaCl al
0,9% para obtener entre 5 \times 10^{4} y 10^{6} cuentas/sg.
El volumen final fue de 500 \mul. La medición se inició después de
3 minutos de equilibrado a 25ºC utilizando los siguientes
parámetros: preescala automática; periodo de muestra: automático;
periodo automático de recorrido (3 min a 90º); SDP (algoritmo para
discriminar entre diferentes poblaciones) análisis de 3 a 10.000 nm
utilizando 25 bins; índice de refracción: 1,33252; viscosidad:
0,8904 centipoises.
Después de realizar un primer análisis en las
condiciones anteriores, se afinaron las condiciones de medición
reduciendo el tamaño de la ventana y aumentando el número de bins.
Se calibró el sistema con granos de látex de diámetro de partícula
medio definido (controles de tamaño de Coulter: CEI nº 6602336; 90,
170, 300 y 500 nm). Se realizó automáticamente el ajuste del tiempo
de retardo y se verificó regularmente para que estuviera en el
intervalo correcto mediante mediciones manuales en los granos
calibrados.
La incorporación de fosfolípidos con PEG
(PEG-PL) tal como diestearoilfosfatidiletanolamina
acoplada a
PEG2000 (DSPE-PEG) en relaciones molares del 10% mejoró de forma significativa la recuperación del ADN después de la extrusión mientras se mantiene su integridad impidiendo la agregación (Figuras 2 y 3). Este efecto beneficioso era ya evidente en la inspección visual de los complejos obtenidos que eran dispersiones homogéneas en el caso de los PEG-PL, pero se hacían rápidamente floculentos si se omitía el aditivo estabilizante. Los intentos iniciales para extruir los complejos de lípido y ácido nucleico que no contenían aditivos estabilizantes a través de las membranas de policarbonato con un diámetro de poro de 200 nm han demostrado que la mayoría del ADN se perdía en la membrana del filtro muy probablemente debido a la presencia de agregados.
PEG2000 (DSPE-PEG) en relaciones molares del 10% mejoró de forma significativa la recuperación del ADN después de la extrusión mientras se mantiene su integridad impidiendo la agregación (Figuras 2 y 3). Este efecto beneficioso era ya evidente en la inspección visual de los complejos obtenidos que eran dispersiones homogéneas en el caso de los PEG-PL, pero se hacían rápidamente floculentos si se omitía el aditivo estabilizante. Los intentos iniciales para extruir los complejos de lípido y ácido nucleico que no contenían aditivos estabilizantes a través de las membranas de policarbonato con un diámetro de poro de 200 nm han demostrado que la mayoría del ADN se perdía en la membrana del filtro muy probablemente debido a la presencia de agregados.
Los estudios de estabilidad utilizando diversos
lípidos catiónicos acomplejados con 20 \mug/ml de ADN de plásmido
a 4ºC demostraron que el diámetro de partícula medio de los
complejos determinado por PCS permanecía estable durante, por lo
menos, 2 meses (Figura 4A-D; A:
DC-Chol/DOPE; B:
espermidina-Chol/DOPE; C:
espermina-Chol/DOPE; D: DOGS/DOPE). El tamaño de
partícula inicial se muestra el día 0, y el tamaño de partícula se
midió durante un periodo de 63 días, en función del % mol de
DSPE-PEG 2000 y en caso de realizar la extrusión
("ex") de los complejos de ADN y lípido. Los datos demuestran
que la adición de DSPE-PEG mantenian las partículas
con tamaño uniforme, evitando la agregación, a diferencia de las
preparaciones sin DSPE-PEG (0%).
Se observó también el efecto estabilizante de
DSPE-PEG para los complejos de lípido y ADN que
contienen espermidina-Chol/DOPE acomplejados con
concentraciones mayores de ADN del plásmido (200 \mug/ml) que son
necesarias para las transfecciones in vivo (Figura 5). Los
resultados demuestran que el efecto estabilizante de
DSPE-PEG2000 se observa para diferentes cantidades
de aditivo (2, 5 y 10% mol), además de para diferentes relaciones de
carga +/-. Menores flutuaciones del tamaño medido mediante PCS no
indican inestabilidades de las preparaciones, ya que no evolucionan
con el tiempo. Es más probable que las estimaciones de tamaño por
PCS puedan haber introducido estas flutuaciones, posiblemente debido
a ligeros cambios en la forma de los complejos.
El tamaño de partícula de los complejos de lípido
y ADN que contienen PEG-PL se estabilizó también al
omitir la etapa final de extrusión (Figura 6). Este efecto
estabilizante fue evidente para diferentes relaciones de carga +/- y
para diferentes concentraciones de PEG-PL. El
particular, los complejos de lípido y ADN con elevadas relaciones
de carga +/- se estabilizaron eficazmente, pero todas las
preparaciones presentaron diámetros de partícula medios menores de
400 nm y, en la mayoría de los casos, menores de 200 nm comparados
con los tamaños de partícula de más de 1.000 nm en ausencia de
PEG-PL (Figuras 4A-D). La ausencia
de PEG-PL en los complejos produjo una floculación
visible y la precipitación después de la adición del ADN del
plásmido a los lípidos catiónicos a una concentración final de 200
\mug/ml, que impidió las mediciones significativas por PCS.
Los estudios de estabilidad a 4ºC demostraron que
los complejos extruidos permanecen estables en un diámetro de
partícula medio de aproximadamente 170 nm (medición por PCS) durante
por lo menos 2 meses. Además, dichos complejos permiten la
transfección in vivo por vía intratraqueal e intravenosa, tal
como se muestra en el Ejemplo 3. Los aditivos estabilizan los
complejos entre lípidos catiónicos y ácidos nucleicos y permiten la
extrusión de dichos complejos a través de membranas de tamaño de
poro definido sin modificación del ácido nucleico acomplejado. Los
fosfolípidos derivados con polietilenglicol se demuestra que son
eficaces para impedir la agregación y la precipitación de los
complejos de lípido y ADN.
A partir de 20 ml iniciales de cultivo celular
que contiene 2 \times 10^{6} células, el día 1 se colocaron en
placas 2 \times 10^{4} células por pocillo (placas de cultivo de
96 pocillos) en 200 \mul de medio DMEM complementado con glutamina
y suero de ternero fetal. El día 2, se prepararon dos placas de
microvaloración: una placa contenía diferentes soluciones de ADN de
plásmido en 70 \mul de medio por pocillo sin suero (concentración
inicial: 0,16 mg/ml) y otra placa contenía la suspensión de lípido
en 60 \mul por pocillo (concentración inicial: 0,187 mg/ml). Tanto
el ADN como los lípidos se diluyeron en serie (factor de 2) y la
cantidad requerida de ADN se transfirió al interior del pocillo que
contenía la cantidad requerida de lípidos. Se separó por aspiración
el medio de las células y se transfirieron los complejos de lípido y
ADN (100 \mul) a las células. Después de 4 h a 37ºC, se añadió
CO_{2} al 5% y 50 \mul de medio que contiene suero de ternero
fetal al 30%. El día 3, se añadieron 100 \mul adicionales que
contenían suero de ternero fetal al 10% y el día 4, se inspeccionó
la viabilidad de las células al microscopio. Se detuvo la
transfección eliminando el medio y se lavaron las células con 100
\mul de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después de la
adición de 50 \mul de tampón de lisis (Promega, 5\times diluido
en agua) se congelaron las células a -80ºC durante, por lo menos, 15
min. Se determinó la cantidad de luciferasa producida en 20 \mul
de la solución de lisis durante 1 min utilizando el Luciferase Assay
System (Promega) en placas de microvaloración de 96 pocillos
(Berthold) en el modo de cinética de un luminómetro Berthold LB 96
P.
La incorporación del 10% mol de
PEG-PL bloqueó completamente la actividad de
transfección in vitro de los complejos de lípido y ADN en
células A549 cultivadas (Figuras 7A y B). Este efecto puede ser
debido al hecho de que PEG-PL impide el contacto
eficaz entre los complejos del vector y las células en el cultivo.
Fue aún más sorprendente, por lo tanto, observar que estos vectores
permitían la transfección in vivo por vía de administración
intratraqueal (i.t.) o intravenosa (i.v.) (véase resultados a
continuación).
Inyección intratraqueal en ratones: se
anestesiaron ratones de 5 a 6 semanas (C57 Black/10 o Balb/c)
utilizando Ketamina y se inyectaron en la tráquea 125 \mul de
preparaciones del vector que contenían 25 \mug de ADN de plásmido
pCMVluc acomplejado con lípidos catiónicos a diferentes relaciones
de carga. No se extruyeron los complejos y no contenían
DSPE-PEG2000. Después de 48 horas, se sacrificaron
los ratones y se congeló la tráquea en N_{2} líquido, se
estirparon los pulmones izquierdo y derecho, y se guardaron a
-70ºC.
Inyección intravenosa en los ratones: se
inyectaron ratones de 5 a 6 semanas (C57 Black/10 o Balb/c) con 400
\mul de preparaciones del vector en la vena de la cola. Las
preparaciones contenían 75 \mug de ADN de pCMVluc acomplejado con
lípidos catiónicos a diferentes relaciones de carga. Después de
siete días, se extirparon los órganos (pulmón, corazón, bazo,
hígado, músculo estriado), se congelaron en N_{2} líquido y se
almacenaron a -70ºC.
Se prepararon extractos de luciferasa según
describió (Manthorpe, Human Gene Therapy
4:419-43, 1993) con las siguientes
modificaciones. Se trituró tejido congelado en un mortero enfriado
previamente en nieve carbónica. Se transfirió el polvo a tubos de
Eppendorf de 1,5 ml y se extrajó en 500 \mul de Reporter Lysis
Buffer (Promega) utilizando 3 ciclos de
congelación-descongelación en N_{2} líquido y a
37ºC. Los lisados se centrifugaron a 14.000 rpm durante 10 min en
una centrifugadora Eppendorf a temperatura ambiente y los
sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos. El sedimento se
utilizó finalmente para la extracción del ADN. Los extractos se
congelaron en N_{2} líquido y se almacenaron a -70ºC. Se
determinaron las concentraciones de proteína con el Quantify Protein
Assay System (Promega). Se midió la actividad de la luciferasa en 10
\mul de alícuotas de extractos utilizando el Luciferase Assay
System (Promega) en placas de microvaloración de 96 pocillos
(Berthold) utilizando el modo de cinética de un luminómetro Berthold
LB 96 P. Se midieron las actividades de luciferasa en muestras de
órganos, a saber, tráquea, pulmón derecho e izquierdo que se
extrajeron de los ratones inyectados. Después de la hibridación y de
la lisis en reporter lysis buffer (Promega), se mezclaron 10 ó 20
\mul de alícuotas con 100 \mul de sustrato (Luciferasa Assay
System, E1501, Promega). Se tomaron lecturas cada minuto en el
luminómetro según el protocolo del fabricante. Se calcularon las
actividades de luciferasa como RLU/mg de proteína o como fg de
luciferasa/mg de proteína con la ayuda de una curva patrón de
luciferasa, que se había probado con enzima purificada (Promega)
diluida en un extracto negativo de tejido.
Administración intratraqueal: La Figura 8 resume
un experimento con diferentes lípidos catiónicos
(DC-Chol, espermidina-chol,
espermina-chol) formulado con el colípido DOPE que
se utilizaron para acomplejar el ADN del pMCVluc a una relación de
carga de 5:1. La relación lípido catiónico:DOPE es 1:1 en peso. Se
prepararon en este experimento complejos de lípido y ADN y se
inyectaron inmediatamente por vía intratraqueal a los animales de la
prueba para impedir la formación de grandes agregados que reducirían
la eficacia de la transfección de los complejos. Se midieron las
actividades de la luciferasa en las muestras de órganos, tal como se
describió anteriormente, a saber, tráquea, pulmón derecho e
izquierdo, extraídos de los ratones inyectados 1, 2 y 3 días después
de la inyección i.t., utilizando un adenovirus recombinante que
contiene el gen de luciferasa como referencia.
La actividad de la luciferasa se pudo detectar
para el ADN acomplejado con DC- Chol/DOPE o
espermina-Chol/DOPE a las 24 y a las 48 horas. Esto
mismo vale para el adenovirus en NaCl al 0,9%. No se observó
ninguna actividad para el ADN libre en este experimento para ADN
acomplejado con espermidina-Chol/DOPE.
Complejos extruidos con aditivos: La siguiente
serie de experimentos probó formulaciones de lípido y ADN con un
tamaño de partícula definido y una estabilidad aumentada después de
la formulación. Con este fin, se prepararon complejos mediante
extrusión que generan partículas con un tamaño medio de
aproximadamente 200 nm. También se probó en estas formulaciones la
adición de DSPE-PEG2000 como componente de los
complejos de lípido y ADN.
Se acomplejó
espermidina-Chol/DOPE con 25 \mug de pMCVluc a una
relación de carga de 5:1 en presencia de
DSPE-PEG2000 al 10% mol. La relación de lípido
catiónico:DOPE es 1:1 en peso. La muestras se administraron
directamente por inyección intratraqueal en ratones C57 Black/10 de
6 semanas o se fraccionaron por extrusión antes de la inyección.
Después de 48 horas, se sacrificaron los animales y se determinó la
actividad de la luciferasa en la tráquea (T), pulmones izquierdo
(PG) y derecho (PD) de cada animal. La Figura 9 muestra las
actividades de la luciferasa después de la inyección de los
complejos
espermidina-Chol/DOPE-pCMVluc en los
ratones. El ratón 11 se inyectó con 25 \mug de ADN de pCMNluc
libre. No se detectó actividad de luciferasa después de 48 h. Los
ratones 13 y 14 recibieron complejos que no estaban extruidos y los
ratones 17, 18, 19 y 20 recibieron complejos después de la
extrusión. Se midieron las actividades de luciferasa comprendidas en
el intervalo de 1.000 a 7.000 RLU/mg de proteína para las tráqueas y
pulmones de todos los ratones, a excepción del ratón 18 que no
presentaba actividad en la tráquea.
Efecto de la relación de carga y del aditivo
estabilizante: Se estudió además la influencia de la relación de
carga de los complejos de
espermidina-Chol/DOPE-pCMVluc y la
concentración de DSPE-PEG2000 en estos complejos. Se
prepararon complejos de
espermidina-Chol/DOPE-pCMVluc con
relaciones de carga 5:1, 2,5:1 y 1:1. Para cada relación de carga
DSPE-PEG2000 se añadió a 10,5 ó 2% mol. 48 horas
después de la inyección i.t. se determinaron las actividades de
luciferasa en ratones C57 Black/10 en las tráqueas y en los
pulmones de estos animales. La Tabla 1 resume los resultados de este
experimento.
La actividad de luciferasa en los pulmones se
pudo medir después de la inyección de complejos a una relación de
carga 5:1. Una disminución de DSPE-PEG2000 de 10 al
2% mol produjo un aumento en la actividad de luciferasa en este
experimento. A relaciones de carga más bajas, no se detectó ya
actividad de luciferasa en los pulmones. En las tráqueas, la
actividad de luciferasa aumentó al disminuir las relaciones de
carga. La concentración de DSPE-PEG2000 está
probablemente influyendo en esta actividad.
Una explicación para esto es que
DSPE-PEG2000 puede desestabilizar los complejos de
lípido catiónico con respecto a cuán extrechamente está unido el ADN
y recubierto por el lípido catiónico. Este efecto sería más
importante para relaciones de carga más bajas. Debido a este efecto,
únicamente los complejos a una relación de carga elevada son lo
suficiente estables para alcanzar y transfectar las células del
pulmón. A relaciones de carga más bajas, los complejos se hacen
inestables y pueden transfectar las células de manera eficaz en la
tráquea junto al punto de inyección pero no penetrar lo suficiente
profundo dentro del pulmón para transfectar los tejidos
pulmonares.
Para probar la influencia de diferentes
relaciones de carga y la presencia de DSPE-PEG2000
sobre las formulaciones para administración i.v. se complejaron 75
\mug de ADN de pCMVluc a las relaciones de carga 1:2, 1:4 y 1:6
con DC-Chol/DOPE en presencia o ausencia de
DSPE-PEG2000 al 10% y se inyectaron i.v. en
volúmenes de 400 \mul. La relación de lípido catiónico:DOPE fue
1:1 en peso. Los complejos no se extruyeron.
Se determinaron las actividades de luciferasa
siete días después en el pulmón, hígado, corazón, músculo estriado
y bazo. Los resultados se muestran en la Figura 10. La actividad de
luciferasa está indicada como RLU/mg de proteína +/- (desviación
estándar) para grupos de 4 ratones independientes por formulación.
No se puede observar ninguna actividad de luciferasa en el músculo
y bazo. Se observaron actividades bajas en el corazón y en el hígado
para relaciones de carga 1:4 (800 \mug de lípido total (400 \mug
DC-Chol):75 \mug de ADN) y 1:6 (1200:75). En el
pulmón se detectan valores relativamente altos que empiezan a una
relación de carga 1:2 (400:75) + DSPE-PEG2000 al
10%.
Se cambió la relación de lípidos a ADN en estos
experimentos para evaluar la influencia de este parámetro además de
la presencia de DSPE-PEG2000 sobre la transfección
in vivo. La razón oculta que aumenta la cantidad de lípidos
fue que el ADN debe ser menos estable in vivo y que una
relación de carga más positiva debe conducir a un tropismo
modificado de los complejos. Parece a partir de este experimento que
las relaciones de carga mayores conducen a transfecciones más
lógicas. Es también notable que la presencia de
DSPE-PEG2000 impidió las precipitaciones que se
forman en todas las preparaciones que no contiene el aditivo.
Se ha preparado pcTG56 según el siguiente
protocolo (véase también la Figura 15):
Se añadió gota a gota una solución de
acrilonitrilo (9,6 ml, 146 mmoles) en 1,4-dioxano
(50 ml) a una solución enfriada en hielo de glicina (10,0 g, 132
mmoles) y de hidróxido de sodio 1N (133 ml) en una mezcla 1/1 de
agua y de 1,4-dioxano (200 ml). Se agitó la reacción
a 0ºC durante 1 h y a temperatura ambiente durante 4 h más. Se
añadió gota a gota a continuación una solución de dicarbonato de
ditertiobutilo (35,0 g, 159 mmol) en 1,4-dioxano
(100 ml) y se agitó la mezcla de reacción durante 2 h a temperatura
ambiente. Después de la extracción con éter (2 \times 100 ml), se
acidificó la fase acuosa (pH 2-3) con ácido
clorhídrico 1 N y se extrajo con acetato de etilo (2 \times 100
ml). Se secaron las fases orgánicas combinadas con sulfato de sodio
y se concentró al vacío. Se obtuvo el cianoácido 1 (24,4 g;
rendimiento del 81%) como sólido blanco que se utilizó sin
purificación posterior. Punto de fusión =
87-89ºC.
^{1}H RMN (200 MHz, D_{2}O): d 3,88 y 3,87 (2
s, 2 H, -CH_{2}-CO_{2}H), 3,48 y 3,45 (2 t, J =
6,3 Hz, 2 H, -CH_{2}N(BOC)-), 2,58 y 2,56 (2 t, J = 6,3,
6,4 Hz, 2 H, -CH_{2}-CN), 1,30 y 1,24 (2 s, 9 H,
t-Bu-).
Se hidrogenó una solución de cianoácido 1 (11,5
g, 50,4 mmoles) en etanol (100 ml) que contiene hidróxido de sodio
(4,04 g, 100 mmoles) en presencia de níquel Raney (3,2 g) durante
18 h a temperatura ambiente. Se filtró la mezcla con cuidado sobre
Celite y el catalizador se lavó con metanol (2 \times 30 ml). Se
acidificó el filtrado (pH 4-5) con ácido clorhídrico
al 10% y se concentró al vacío para dar un sólido blanco que se
disolvió en cloroformo (50 ml) para precipitar la mayor parte del
cloruro de sodio. Después de la filtración, concentración al vacío
del filtrado y recristalización en tetracloruro de carbono, se
obtuvo el aminoácido 2 (10,4 g; 89%). Punto de fusión =
201-202ºC.
^{1}H RMN (200 MHz, D_{2}O): d 3,53 (s, 2 H,
-CH_{2}-CO_{2}H), 3,17 (t, J = 6,6 Hz, 2
H,-CH_{2}N(BOC)-), 2,83 (t, J = 7,5 Hz, 2 H,
-CH_{2}-NH_{2}), 1,69 (quint., J = 7 Hz, 2 H,
-CH_{2}-), 1,26 y 1,21 (2 s, 9 H, t-Bu-).
El mismo procedimiento que para el 1 permitió la
obtención del cianoácido 3 a partir del 2.
^{1}H RMN (200 MHz, CDCl_{3}): d
4,00-3,85 (m, 2 H,
-CH_{2}-CO_{2}H), 3,55-3,43 (m,
2 H, -CH_{2}-CH_{2}-CN), 3,31
(t, J = 7,2 Hz, 4 H, -CH_{2}-N(BOC)-), 2,61
(m, 2 H, -CH_{2}-CN), 1,78 (quint., J = 7,2 Hz, 2
H, -CH_{2}-), 1,47 y 1,44 (2 s, 18 H, t-Bu-).
El aminoácido 4 (87% de rendimiento, purificación
por cromatografía en columna de gel de sílice, eluyente:
metanol/diclorometano 3/7, después 6/4) se obtuvo a partir de 3 por
el mismo procedimiento que el aminoácido 2. Punto de fusión =
189-190.
^{1}H RMN (200 MHz, D_{2}O): d 3,57 y 3,54
(s, 2 H, -CH_{2}-CO_{2}H),
3,2-3,0 (m, 6 H, -CH_{2}N(BOC)-), 2,80 (t,
J = 7,7 Hz, 2 H, -CH_{2}-NH_{2}),
1,80-1,50 (m, 4 H, -CH_{2}-), 1,27 y 1,22 (2 s, 18
H, t-Bu-).
El mismo procedimiento que para el 1 permitió la
obtención del cianoácido 5 a partir del 4.
^{1}H RMN (200 MHz, CDCl_{3}): d 3,85 (br s,
2 H, -CH_{2}-CO_{2}H), 3,47 (t, J = 6,6 Hz, 2 H,
-CH_{2}-CH_{2}-CN),
3,35-3,05 (m, 8 H,
-CH_{2}-N(BOC)-), 2,60 (m, 2 H,
-CH_{2}-CN), 1,85-1,60 (m, 4 H,
-CH_{2}-), 1,46 y 1,44 (2 s, 27 H, t-Bu-).
El aminoácido 6 (83% de rendimiento, purificación
por cromatografía en columna de gel de sílice, eluyente:
metanol/diclorometano 3/7, después 6/4) se obtuvo a partir de 5 por
el mismo procedimiento que el compuesto 2.
^{1}H RMN (200 MHz, D_{2}O): d 3,76 y 3,73 (2
s, 2 H, -CH_{2}-CO_{2}H),
3,25-2,75 (m, 12 H, -CH_{2}N(BOC)- y
-CH_{2}-NH_{2}), 1,85-1,50 (m, 6
H, -CH_{2}-), 1,28 y 1,23 (2 s, 27 H, t-Bu-).
El mismo procedimiento que para el 1 permitió la
obtención del cianoácido 7 a partir del 6.
^{1}H RMN (200 MHz, CDCl_{3}): d 3,95 y 3,87
(2 br s, 2 H, -CH_{2}-CO_{2}H), 3,47 (t, J = 6,5
Hz, 2 H, -CH_{2}-CH_{2}-CN),
3,40-3,05 (m, 12 H,
-CH_{2}-N(BOC)-), 2,61 (m, 2 H,
-CH_{2}-CN), 1,90-1,60 (m, 6 H,
-CH_{2}-), 1,47, 1,45 y 1,44 (3 s, 36 H,
t-Bu-).
El aminoácido 8 (71% de rendimiento, purificación
por cromatografía en columna de gel de sílice, eluyente:
metanol/diclorometano 1/9, después 3/7) se obtuvo a partir del 7 por
el mismo procedimiento que el compuesto 2.
^{1}H RMN (200 MHz, D_{2}O): d 3,76 y 3,73 (2
s, 2 H, -CH_{2}-CO_{2}H),
3,25-2,75 (m, 12 H, -CH_{2}N(BOC)- y
-CH_{2}-NH_{2}), 1,85-1,50 (m, 6
H, -CH_{2}-), 1,28 y 1,23 (2 s, 27 H, t-Bu-).
Se añadió dicarbonato de ditertiobutilo (1,19 g,
5,45 mmoles) disuelto en CH_{2}Cl_{2} (5 ml) a una solución del
compuesto 8 (3,20 g, 4,55 mmoles) y trietilamina (0,95 ml, 6,83
mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (45 ml). La mezcla se agitó durante 16 h
a temperatura ambiente, a continuación se acidificó a pH 3 con HCl
al 5% y se extrajo dos veces con CH_{2}Cl_{2} (30 ml). Se lavó
la fase orgánica con agua para dar un aceite incoloro que se
purificó por cromatografía en columna de gel de sílice
(metanol/diclorometano 5/95, después 10/90) para dar el compuesto 9
(3,37 g, 92%).
^{1}H RMN (200 MHz, CDCl_{3}): d 3,85 (m, 2
H, -CH_{2}-CO_{2}H), 3,45-3,05
(m, 16 H, -CH_{2}-N(BOC)-),
1,85-1,60 (m, 8 H, -CH_{2}-), 1,45, 1,44 y 1,43 (3
s, 36 H, t-Bu-).
Se añadió diciclohexilcarbodiimida (0,53 g, 2,59
mmoles) en diclorometano anhidro (1 ml) a una solución del ácido 9
(1,60 g, 1,99 mmoles), de
(S)-(+)-2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-metanol
(0,34 g, 2,59 mmoles) y de 4-(dimetilamino)piridina (24 mg,
0,2 mmoles) en diclorometano anhidro (4 ml). Se agitó la mezcla de
reacción durante 16 h a temperatura ambiente. A continuación se
separó por filtración el precipitado de diciclohexilurea y el
filtrado se concentró al vacío y se cromatografió en una columna de
gel de sílice (eluyente: éter/hexano 5/5, después 6/4) para dar el
éster 10 (1,73 g; 95%).
^{1}H RMN (200 MHz, CDCl_{3}): d
4,35-4,04 (m, 4 H), 3,99-3,92 (2 s,
2 H, -CH_{2}-CO), 3,74 (m, 1 H),
3,30-3,00 (m, 16 H,
-CH_{2}-N(BOC)-), 1,85-1,55
(m, 8 H, -CH_{2}-), 1,46, 1,45, 1,44 y 1,42 (4 s, 48 H,
t-Bu- y Me-), 1,36 (s, 3 H, Me-).
Se agitó una solución del éster 10 (1,55 g, 1,69
mmoles) y de ácido clorhídrico 1 N (0,68 ml) en metanol (29 ml)
durante 16 h a temperatura ambiente. Se añadió a continuación
trietilamina (1 ml) a la solución hasta la neutralidad. La
evaporación al vacío y la cromatografía en columna de gel de sílice
(eluyente: metanol/diclorometano 5/95) dieron el dihidroxiéster 11
(1,23 g; 83%) como un aceite incoloro.
^{1}H RMN (200 MHz, CDCl_{3}): d 4,25 (m, 2
H, -CH_{2}-OCO-), 4,00-3,40 (m, 5
H, CH-OH, -CH_{2}OH y
-CH_{2}-CO_{2}-), 3,40-3,00 (m,
16 H, -CH_{2}-N(BOC)-),
1,90-1,6 (m, 8 H, -CH_{2}-), 1,46, 1,45, 1,44 y
1,42 (4 s, 45 H, t-Bu-).
Se añadió diciclohexilcarbodiimida (0,71 g, 3,42
mmoles) en diclorometano anhidro (1 ml) a una solución de
dihidroxiéster 11 (1,00 g, 1,14 mmoles), ácido oleico (0,97 g, 3,42
mmoles) y 4-(dimetilamino)piridina (14 mg, 0,11 mmoles) en
diclorometano anhidro (3 ml). Se agitó la mezcla de reacción durante
16 h a temperatura ambiente. A continuación se separó el precipitado
de diciclohexilurea por filtración y el filtrado se concentró al
vacío y se cromatografió en una columna de gel de sílice (eluyente:
éter/hexano 4/6) para dar el triéster 12 (754 mg; 47%) como aceite
incoloro.
^{1}H RMN (200 MHz, CDCl_{3}): d 5,34 (m, 4
H, -CH=), 5,26 (m, 1 H, CH-OCO-),
4,40-4,05 (m, 4 H, -CH_{2}-OCO-),
3,95 y 3,89 (2 m, 2 H,
-N(BOC)-CH_{2}-CO_{2}-),
3,35-3,00 (m, 16 H,
-CH_{2}-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H,
-CH_{2}-CO_{2}-), 2,01 (m, 8 H, H alílico),
1,85-1,50 (m, 12 H, -CH_{2}-), 1,46, 1,44, 1,43 y
1,41 (4 s, 45 H, t-Bu-), 1,30 y 1,27 (2 br s, 44 H,
-CH_{2}-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-).
Se trató el triéster 12 (0,52 g, 0,37 mmoles) en
diclorometano anhidro (1 ml) durante 3 h con una mezcla 1/1 de
ácido trifluoracético y diclorometano anhidro (74 ml) a 0ºC. Se
añadió a continuación hexano (100 ml) y se evaporó al vacío la
mezcla para dejar una película delgada que se puso en suspensión
(vórtex) en éter destilado. La filtración dio un polvo blanco que se
lavó con éter y se secó al vacío para dar el lípido 13 (510 mg;
93%).
^{1}H RMN (200 MHz, CDCl_{3}-
CF_{3}CO_{2}D): d 5,36 (m, 5 H, -CH= y CH-OCO-),
4,60-4,15 (m, 4 H, -CH_{2}-OCO-),
4,00 (s, 2 H,
-NH_{2}^{+}-CH_{2}-CO_{2}-),
3,45-3,10 (m, 16 H,
-CH_{2}-NH_{2}^{+}-), 2,41 (t, J = 7,5 Hz, 4
H, -CH_{2}-CO_{2}-), 2,28 (m, 8 H,
-CH_{2}-CH_{2}-NH_{2}^{+}-),
2,01 (m, 8 H, H alílico), 1,61 (m, 4 H,
-CH_{2}-CH_{2}-CO_{2}-), 1,30
y 1,27 (2 s, 44 H, -CH_{2}-), 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-).
Se prepararon complejos de ADN y lípido con una
concentración final de 0,5 ó 1 mg/ml de ADN a la relación de carga
5 (relación entre cargas positivas que lleva el lípido catiónico y
cargas negativas que lleva el ADN) con una cantidad equimolecular de
dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE). La cantidad
de lípido catiónico a añadir se determinó basándose en su peso
molecular, el número de cargas positivas por molécula y la relación
de carga deseada. Como ejemplo, para obtener un complejo de
pcTG56/DOPE a una relación de carga 5 y a una concentración final de
ADN de 0,5 mg/ml, se aplica el cálculo siguiente:
0,5 mg/ml de ADN corresponde a una concentración
de 0,5/330 mmoles/ml = 1,5 mmoles/ml de cargas negativas (se toma
como peso molecular medio de un nucleótido 330 Da). Para obtener un
complejo a una relación de carga 5, la concentración de cargas
positivas debe ser 7,5 mmoles/ml (peso molecular de pcTG56 en forma
de su sal trifluoroacetato: 1476 g/mol; 5 cargas positivas por
molécula) o 1,5 mmol/ml de pcTG56 (2,2 mg/ml). Para alcanzar una
concentración equimolecular, se añadió 1,5 mmol/ml de DOPE (peso
molecular: 744 g/mol; concentración final de 1,1 mg/ml). Se añadió
diestearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE) acoplado a
polietilenglicol de un peso molecular medio de 5.000 Da (PEG5000)
(Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA, Ref. 880220 (peso
molecular medio de 5.750 g/mol) para alcanzar las concentraciones
finales requeridas de 2,5 ó 10% mol con respecto a la cantidad total
de lípido.
Se mezclaron los lípidos procedentes de sus
respectivas soluciones en cloroformo/metanol (1/1). Se secó la
solución de lípido (200 mbar, 45ºC, 45 min) con fuerte agitación (40
revoluciones por minuto) (Labconco, Rapidvap, Uniequip, Martinsried,
Alemania) y se extrajo la película de lípido en dimetilsulfóxido
(DMSO)/etanol (1/1). Como ejemplo, se extrajeron 2,2 mg de pcTG56 y
1,1 mg de DOPE en 45 ml de dimetilsulfóxido/etanol. Se añadieron 175
ml de
(N-[2-hidroxietil]piperazina-N'-[ácido
2-etanosulfónico] (HEPES) 20 mM, pH 7,5 para
alcanzar una concentración final de 10 mg/ml en lípido catiónico.
500 ml de ADN de plásmido (pTG11033; 1 mg/ml en
(tris)[hidroximetil]aminometano) (Tris) 10 mM, ácido
etilendiamintetraacético (EDTA) 1 mM, pH 7,5) se diluyeron con 280
ml de HEPES 20 mM, pH 7,5. Se añadieron 220 ml de la suspensión de
lípido anterior a esta solución mediante pipeteado rápido por
aspiración (10 veces) para obtener 1 ml del complejo final a una
concentración de ADN de 0,5 mg/ml y a una relación de carga de 5.
Las preparaciones a 1 mg/ml de ADN con y sin
DSPE-PEG5000 se redisolvieron utilizando el mismo
procedimiento, ajustando las cantidades de ADN, lípidos y
estabilizante según lo anterior. Los complejos de lípido y ADN
obtenidos se almacenaron a 4ºC.
El tamaño de partícula de los complejos de lípido
catiónico y ácido nucleico se midieron por espectroscopía de
correlación de fotones y se da como peso de valor medio normalizado
(véase Ejemplo 1). La Tabla 2 resume los resultados de este
experimento.
(Tabla pasa a página
siguiente)
Los resultados mostrados anteriormente amplían
nuestros descubrimientos anteriores en lo siguiente:
a) los complejos de lípido y ADN se pueden formar
con mayor concentración de ADN (1 mg/ml) (anteriormente 0,2
mg/ml);
b) este DSPE-PEG es compatible
con lípidos y otras clases estructurales tales como glicerolípidos
catiónicos (pcTG56), y
c) este DSPE-PEG5000 puede
sustituir a DSPE-PEG2000.
Además, demuestran que esta metodología es
compatible con otros aditivos tales como DMSO, que puede potenciar
la transferencia génica in vivo.
Claims (32)
1. Procedimiento para preparar una suspensión
homogénea de complejos o partículas estables de lípido-ácido
nucleico, que comprende:
a) combinar uno o más lípidos catiónicos, uno o
más colípidos y uno o más aditivos estabilizantes para formar una
suspensión de lípido,
b) combinar la suspensión de lípido con un ácido
nucleico para formar un complejo o una partícula, y
c) omitir un proceso de medición en dichos
complejos o partículas obtenidos en la etapa b).
2. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende además la etapa de someter dicha suspensión de lípido a un
proceso de medición antes de su combinación con dicho ácido
nucleico de modo que se forme una suspensión de complejos o
partículas de tamaño homogéneo.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el
que los complejos o partículas de lípido y ácido nucleico en la
suspensión medida de forma homogénea presenta un tamaño de 500 nm o
menor.
4. Procedimiento según la reivindicación 2, en el
que los complejos o partículas de lípido y ácido nucleico en la
suspensión medida de forma homogénea presenta un tamaño de 200 nm o
menor.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el lípido catiónico se selecciona
de entre el grupo constituido por
espermidina-colesterol,
espermina-colesterol,
3\beta[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]
colesterol), dioctadecilaminoglicilespermida y mezclas de los
mismos.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el colípido es
dioleoilfosfatidiletanolamina.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el aditivo estabilizante es
polietilenglicol acoplado a un grupo capaz de incorporarse en el
complejo o partícula de lípido y ácido nucleico.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el aditivo estabilizante se
selecciona de entre el grupo constituido por cadenas de alquilo
perfluorado o parcialmente fluorado acopladas a un grupo capaz de
incorporarse en el complejo o partícula.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el aditivo estabilizante es ácido
poliglucurónico acoplado a un grupo capaz de incorporarse en el
complejo o partícula.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el aditivo estabilizante es
diestearoilfosfatidiletanolamina-polietilenglicol.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9, en el que el grupo es un fosfolípido.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que el grupo es un fosfolípido iónico dipolar.
13. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que el ácido nucleico se selecciona
de entre el grupo constituido por ADN genómico, ADNc, ADN sintético,
ARN, ARNm, ribozimas, ARN con cadena complementaria y
oligonucleótidos.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en
la que el ácido nucleico comprende un plásmido.
15. Suspensión homogénea de complejos o
partículas estables de lípido-ácido nucleico, producida por el
procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
16. Suspensión según la reivindicación 15, en la
que los lípidos catiónicos incluyen mezclas de lípidos
catiónicos.
17. Suspensión según cualquiera de las
reivindicaciones 15 ó 16, en la que los complejos o partículas en la
suspensión medida de forma homogénea presentan un tamaño de 500 nm
o menor.
18. Suspensión según cualquiera de las
reivindicaciones 15 ó 16, en la que los complejos o partículas en la
suspensión medida de forma homogénea presentan un tamaño de 200 nm
o menor.
19. Complejo de lípido-ácido nucleico que
comprende uno o más lípidos catiónicos, uno o más colípidos, uno o
más aditivos estabilizantes y un componente de ácido nucleico, en el
que dicho complejo presenta un tamaño de 500 nm o menos.
20. Complejo según la reivindicación 19, en el
que el complejo presenta un tamaño de 200 nm o menos.
21. Composición que comprende la suspensión según
cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 y un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
22. Composición que comprende el complejo según
cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20 y un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
23. Utilización de una composición según
cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22, para la preparación de
un medicamento para la administración de un ácido nucleico a las
células de un paciente que necesita dicho ácido nucleico.
24. Utilización según la reivindicación 23, en la
que el ácido nucleico se selecciona de entre el grupo constituido
por ADN genómico, ADNc, ADN sintético, ARN, ARNm, ribozimas, ARN con
cadena complementaria y oligonucleótidos.
25. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 23 ó 24, en la que el ácido nucleico comprende un
plásmido.
26. Utilización de una composición según
cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22, para la preparación de
un medicamento para la administración de un ácido nucleico, que
comprende un gen que codifica CFTR, para el tratamiento de la
fibrosis quística.
27. Utilización de una composición según
cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22, para la preparación de
un medicamento para la administración de un ácido nucleico, que
comprende un gen que codifica CD4 soluble, para el tratamiento del
SIDA.
28. Utilización de una composición según
cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22, para la preparación de
un medicamento para la administración de un ácido nucleico, que
comprende un gen que codifica ADA, para el tratamiento de la
insuficiencia de adenosin-desaminasa.
29. Utilización de una composición según
cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22, para la preparación de
un medicamento para la administración de un ácido nucleico, que
comprende un gen que codifica la distrofina, para el tratamiento de
la distrofia muscular.
30. Utilización de una composición según
cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22, para la preparación de
un medicamento para la administración de un ácido nucleico, que
comprende un gen que codifica una citocina, para el tratamiento del
cáncer.
31. Utilización de una composición según
cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22, para la preparación de
un medicamento para la administración de un ácido nucleico, que
comprende un gen supresor del tumor, para el tratamiento del
cáncer.
32. Utilización de una composición según
cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22, para la preparación de
un medicamento para la administración de un ácido nucleico, que
comprende un gen inmunoterapéutico, para el tratamiento del
cáncer.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP96401819 | 1996-08-26 | ||
| EP96401819 | 1996-08-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2208936T3 true ES2208936T3 (es) | 2004-06-16 |
Family
ID=8225285
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES97934685T Expired - Lifetime ES2208936T3 (es) | 1996-08-26 | 1997-08-25 | Complejos de lipidos cationicos-acidos nucleicos. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6271208B1 (es) |
| EP (1) | EP0941066B1 (es) |
| JP (1) | JP2000516948A (es) |
| AT (1) | ATE252891T1 (es) |
| AU (1) | AU729077B2 (es) |
| CA (1) | CA2264140A1 (es) |
| DE (1) | DE69725877T2 (es) |
| DK (1) | DK0941066T3 (es) |
| ES (1) | ES2208936T3 (es) |
| PT (1) | PT941066E (es) |
| WO (1) | WO1998008489A1 (es) |
Families Citing this family (47)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6509032B1 (en) | 1991-08-28 | 2003-01-21 | Mcmaster University | Cationic amphiphiles |
| US6008202A (en) | 1995-01-23 | 1999-12-28 | University Of Pittsburgh | Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production |
| US5795587A (en) | 1995-01-23 | 1998-08-18 | University Of Pittsburgh | Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production |
| US5981501A (en) * | 1995-06-07 | 1999-11-09 | Inex Pharmaceuticals Corp. | Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers |
| US6120794A (en) | 1995-09-26 | 2000-09-19 | University Of Pittsburgh | Emulsion and micellar formulations for the delivery of biologically active substances to cells |
| CA2251543A1 (en) * | 1996-04-12 | 1997-10-23 | University Of Pittsburgh | Novel cationic cholesteryl derivatives containing cyclic polar groups |
| US6093816A (en) * | 1996-06-27 | 2000-07-25 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Cationic lipids |
| US6410328B1 (en) * | 1998-02-03 | 2002-06-25 | Protiva Biotherapeutics Inc. | Sensitizing cells to compounds using lipid-mediated gene and compound delivery |
| EP1013772A1 (en) * | 1998-12-21 | 2000-06-28 | Transgene S.A. | Method for preparing suspension of stable posiplexes |
| DE19944262A1 (de) * | 1999-09-15 | 2001-03-29 | Cardiogene Gentherapeutische S | Pharmazeutische Zusammensetzung in Form eines Nukleinsäure-Lipid-Komplexes, ihre Herstellung und Verwendung in der Gentherapie |
| US7189705B2 (en) * | 2000-04-20 | 2007-03-13 | The University Of British Columbia | Methods of enhancing SPLP-mediated transfection using endosomal membrane destabilizers |
| IL155699A0 (en) * | 2000-11-29 | 2003-11-23 | Gencell Sa | Neutral and anionic colloidal particles for gene delivery |
| US20030203865A1 (en) * | 2001-04-30 | 2003-10-30 | Pierrot Harvie | Lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production |
| EP1359228B1 (en) * | 2002-04-23 | 2013-11-27 | Accenture Global Services Limited | DNA authentification based on scattered-light detection |
| US20040180438A1 (en) | 2002-04-26 | 2004-09-16 | Pachuk Catherine J. | Methods and compositions for silencing genes without inducing toxicity |
| JP4868739B2 (ja) * | 2002-05-06 | 2012-02-01 | アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | 核酸の送達法 |
| AU2003274906A1 (en) * | 2002-07-31 | 2004-02-16 | Nucleonics, Inc. | Double stranded rna structures and constructs, and methods for generating and using the same |
| US20040187445A1 (en) * | 2003-03-28 | 2004-09-30 | Hildebrand John Joseph | Gripping arm assembly for loading a filled inner container into an outer container |
| DE602004017342D1 (de) | 2003-10-23 | 2008-12-04 | Otsuka Pharma Co Ltd | Sterile injizierbare aripiprazol-formulierung mit kontrollierter freisetzung und verfahren |
| CN101023119B (zh) | 2004-09-22 | 2010-05-05 | 日本化药株式会社 | 新型嵌段共聚物，胶束制剂以及含胶束制剂为活性组分的抗癌剂 |
| JP5249016B2 (ja) | 2006-03-28 | 2013-07-31 | 日本化薬株式会社 | タキサン類の高分子結合体 |
| KR20090009241A (ko) | 2006-05-18 | 2009-01-22 | 니폰 가야꾸 가부시끼가이샤 | 포도필로톡신류의 고분자 결합체 |
| EP2080779B1 (en) | 2006-11-06 | 2016-05-18 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | Polymeric derivative of nucleic acid metabolic antagonist |
| EP2090607B1 (en) | 2006-11-08 | 2015-05-20 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | Polymeric derivative of nucleic acid metabolic antagonist |
| US8357531B2 (en) | 2007-07-03 | 2013-01-22 | Transgene S.A. | Immortalized avian cell lines |
| NZ582415A (en) | 2007-07-31 | 2012-05-25 | Otsuka Pharma Co Ltd | Methods for producing aripiprazole suspension and freeze-dried formulation |
| JP5349318B2 (ja) | 2007-09-28 | 2013-11-20 | 日本化薬株式会社 | ステロイド類の高分子結合体 |
| EP2258397B1 (en) * | 2008-03-18 | 2017-10-11 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | Polymer conjugate of physiologically active substance |
| WO2009136572A1 (ja) | 2008-05-08 | 2009-11-12 | 日本化薬株式会社 | 葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体 |
| RU2476204C2 (ru) * | 2008-06-19 | 2013-02-27 | Ниппон Синяку Ко., Лтд. | Носитель лекарственного средства |
| EP2431403B1 (en) | 2009-05-15 | 2016-09-28 | Nipponkayaku Kabushikikaisha | Polymer conjugate of bioactive substance having hydroxy group |
| PL3338765T3 (pl) | 2009-12-01 | 2019-06-28 | Translate Bio, Inc. | Pochodna steroidowa dla dostarczania mrna w ludzkich chorobach genetycznych |
| JP5856069B2 (ja) | 2010-11-17 | 2016-02-09 | 日本化薬株式会社 | 新規なシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体 |
| WO2012075040A2 (en) | 2010-11-30 | 2012-06-07 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | mRNA FOR USE IN TREATMENT OF HUMAN GENETIC DISEASES |
| EP4043025A1 (en) | 2011-06-08 | 2022-08-17 | Translate Bio, Inc. | Lipid nanoparticle compositions and methods for mrna delivery |
| RU2623426C2 (ru) | 2011-09-11 | 2017-06-26 | Ниппон Каяку Кабусики Кайся | Способ получения блок-сополимера |
| EP2859102A4 (en) | 2012-06-08 | 2016-05-11 | Shire Human Genetic Therapies | NUCLEASE RESISTANT POLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF |
| EP2970955B1 (en) | 2013-03-14 | 2018-11-14 | Translate Bio, Inc. | Methods for purification of messenger rna |
| PT2968586T (pt) | 2013-03-14 | 2018-11-13 | Ethris Gmbh | Composições de arnm de cftr e métodos e utilizações relacionados |
| JP6620093B2 (ja) * | 2013-07-23 | 2019-12-11 | アービュートゥス バイオファーマ コーポレイションＡｒｂｕｔｕｓ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | メッセンジャーｒｎａを送達するための組成物及び方法 |
| WO2015061491A1 (en) | 2013-10-22 | 2015-04-30 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Mrna therapy for phenylketonuria |
| AU2014340092B2 (en) | 2013-10-22 | 2019-09-19 | Translate Bio, Inc. | mRNA therapy for Argininosuccinate Synthetase Deficiency |
| SG11201608725YA (en) | 2014-04-25 | 2016-11-29 | Shire Human Genetic Therapies | Methods for purification of messenger rna |
| WO2018157154A2 (en) | 2017-02-27 | 2018-08-30 | Translate Bio, Inc. | Novel codon-optimized cftr mrna |
| EP3624824A1 (en) | 2017-05-16 | 2020-03-25 | Translate Bio, Inc. | Treatment of cystic fibrosis by delivery of codon-optimized mrna encoding cftr |
| KR102056144B1 (ko) | 2018-03-08 | 2019-12-16 | 주식회사 파마리서치프로덕트 | Dna 단편 혼합물이 고농도로 함유된 유동성을 갖는 액제 조성물 및 이의 제조방법 |
| AU2019325702A1 (en) | 2018-08-24 | 2021-02-25 | Translate Bio, Inc. | Methods for purification of messenger RNA |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5527528A (en) | 1989-10-20 | 1996-06-18 | Sequus Pharmaceuticals, Inc. | Solid-tumor treatment method |
| US5225212A (en) * | 1989-10-20 | 1993-07-06 | Liposome Technology, Inc. | Microreservoir liposome composition and method |
| US5013556A (en) * | 1989-10-20 | 1991-05-07 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
| US5283185A (en) | 1991-08-28 | 1994-02-01 | University Of Tennessee Research Corporation | Method for delivering nucleic acids into cells |
| EP0826063A1 (en) | 1995-04-25 | 1998-03-04 | Vical Incorporated | Single-vial formulations of dna/lipid complexes |
| CA2220950A1 (en) * | 1995-05-26 | 1996-11-28 | Somatix Therapy Corporation | Delivery vehicles comprising stable lipid/nucleic acid complexes |
| US5830878A (en) * | 1995-06-07 | 1998-11-03 | Megabios Corporation | Cationic lipid: DNA complexes for gene targeting |
| US5705385A (en) * | 1995-06-07 | 1998-01-06 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer |
| US5932241A (en) | 1995-06-07 | 1999-08-03 | Valentis, Incorporated | Cationic lipid DNA complexes for gene targeting |
| JP4335310B2 (ja) * | 1995-06-07 | 2009-09-30 | ザ ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア | 疎水性脂質−核酸複合中間体を通して調製される脂質−核酸粒子、及び遺伝子移送のための使用 |
-
1997
- 1997-08-25 CA CA002264140A patent/CA2264140A1/en not_active Abandoned
- 1997-08-25 AU AU37815/97A patent/AU729077B2/en not_active Ceased
- 1997-08-25 JP JP10511435A patent/JP2000516948A/ja not_active Ceased
- 1997-08-25 US US09/254,149 patent/US6271208B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-08-25 DE DE69725877T patent/DE69725877T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-08-25 DK DK97934685T patent/DK0941066T3/da active
- 1997-08-25 ES ES97934685T patent/ES2208936T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-25 AT AT97934685T patent/ATE252891T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-08-25 EP EP97934685A patent/EP0941066B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-25 WO PCT/IB1997/001030 patent/WO1998008489A1/en active IP Right Grant
- 1997-08-25 PT PT97934685T patent/PT941066E/pt unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69725877T2 (de) | 2004-07-22 |
| JP2000516948A (ja) | 2000-12-19 |
| EP0941066B1 (en) | 2003-10-29 |
| EP0941066A1 (en) | 1999-09-15 |
| US6271208B1 (en) | 2001-08-07 |
| CA2264140A1 (en) | 1998-03-05 |
| AU729077B2 (en) | 2001-01-25 |
| DK0941066T3 (da) | 2004-02-23 |
| DE69725877D1 (de) | 2003-12-04 |
| AU3781597A (en) | 1998-03-19 |
| ATE252891T1 (de) | 2003-11-15 |
| PT941066E (pt) | 2004-03-31 |
| WO1998008489A1 (en) | 1998-03-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2208936T3 (es) | Complejos de lipidos cationicos-acidos nucleicos. | |
| Karmali et al. | Cationic liposomes as non‐viral carriers of gene medicines: resolved issues, open questions, and future promises | |
| Draghici et al. | Synthetic nucleic acid delivery systems: present and perspectives | |
| US7772201B2 (en) | Highly branched HK peptides as effective carriers of siRNA | |
| US5705385A (en) | Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer | |
| US20080306153A1 (en) | Lipids and lipid assemblies comprising transfection enhancer elements | |
| US20050260261A1 (en) | Neutral-cationic lipid for nucleic acid and drug delivery | |
| KR20060028655A (ko) | 지질 캡슐화된 간섭 ｒｎａ | |
| US20120021044A1 (en) | Novel Cationic Lipid, A Preparation Method of the Same and A Delivery System Comprising the Same | |
| JP2011509074A (ja) | 活性剤を細胞内に輸送するためのカチオン性脂質の新規なクラス | |
| Mével et al. | Paromomycin and neomycin B derived cationic lipids: synthesis and transfection studies | |
| US8338643B2 (en) | Reagent for introduction of protein or gene | |
| US20080145413A1 (en) | Lipids and lipid assemblies comprising transfection enhancer elements | |
| EP2157096A1 (en) | Amphipathic molecule, molecular aggregate comprising the amphipathic molecule, and use of the molecular aggregate | |
| EP1938843A1 (en) | Lipids and lipid assemblies comrising transfection enhancer elements | |
| US20040166150A1 (en) | Neutral-cationic lipid for systemic delivery of Factor VIII gene | |
| KR20150061946A (ko) | 효소 절단성 링커 또는 올리고 라이신을 포함하는 폴리에틸렌글리콜-리피드를 이용한 안정화된 플라스미드-지질 입자 | |
| US20040077888A1 (en) | Polyamine-mediated transfection | |
| KR100373844B1 (ko) | 유전자 및 생물학적 활성 약물 전달용 양이온성 지질과이의 제조방법 | |
| KR100373845B1 (ko) | 유전자 및 생물학적 활성 약물 전달용 양이온성 지질과이의 제조방법 | |
| JP2024518379A (ja) | ペプチド－脂質コンジュゲート | |
| Habib | Galactosylated liposomes with proton sponge capacity: a novel hepatocyte-specific gene transfer system. | |
| Song | Intravenous transfection using cationic liposomes as a carrier | |
| Zhang | Characterization of novel cationic amphiphiles for gene delivery | |
| KR20020022869A (ko) | 유전자 및 생물학적 활성 약물 전달용 양이온성 지질과이의 용도 |