JP2011509074A - 活性剤を細胞内に輸送するためのカチオン性脂質の新規なクラス - Google Patents
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Abstract
Description
中性脂質と組み合わせて販売されるDOTMA(N−[1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド)(Felgner、P.L. et al.(1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(21)、7413−7417)、リポフェクチン(Lipofectin(商標登録))という名称でのDOPE(ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン);DOTAP(1,2−ジオレオイ−3−トリメチルアンモニウムプロパン)等の代謝可能なDOTMAの類似物(Leventis、R. and Silvius、J.R.(1990)Biochim. Biophys. Acta 1023、124-132);DMRIE(Felgner、J.H. et al.(1994)、J. Biol. Chem. 269(4)、2550-2561);又はトランスフェクテース(TransfectACE)(商標登録)という名称で中性脂質と組み合わせて販売されるDDAB(ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド)等の第4級アンモニウム塩の形態での一価のカチオン性脂質;
SAINT−2(N−メチル−4−(ジオレイル)メチルピリジニウムクロリド)等のピリジニウム塩の形態での一価のカチオン性脂質(Ruiters、M.H.J.、PCT WO2006/043809);
DC−Chol(3β[N−(N’−N’,−ジメチルアミノメタン)−カルバモイル]コレステロール)等のカチオン性コレステロール誘導体(Gao、X. & Huang、L.(1991)Biochem. Biophys. Res. Commun. 179(1)、280-285)
結果的に、同一分子内に核酸の複合体化機能及び標的化機能を包含する新たなカチオン性脂質の開発は、更なる標的因子(細胞膜及び核)の使用の省略を可能とし、そしてこれらの主要な障害を解決するであろう。
それにもかかわらず、カチオン性脂質又はリポプレックスの非常に過剰な使用は頻繁に顕著な毒性を伴う。
現在、核酸の輸送のために特別に開発された様々な市販のカチオン性脂質(トランスフェクション試薬)がある。これらの試薬を使用するトランスフェクション手段は、大抵の生物医学研究所において一般的に使用される。興味深いことに、かなりのリソースがペプチド、抗体、抗原及び組み換え型タンパク質の分離及び評価に投下されているにもかかわらず、ペプチド及びタンパク質等の他の生体分子の輸送専用の試薬のデザインに関して進歩はそれほどなされていない。
さらに、これらのシステムの有効性は、輸送される分子の構造及びサイズに大きく依存している。構造的多様性を示すペプチド又は水溶性の小タンパク質の場合にはそれらは非常に効果的であるが、複合体及び多重結合のシステムの場合には制限される。
従って、ペプチド、タンパク質、抗体及び他の生体分子の細胞内の輸送のために、トランスフェクション剤と同様に単純で且つ頑強な輸送のシステムを開発することが極めて重要である。
従って、核酸は別として、タンパク質、ペプチド及び他の分子の細胞内ベクター化は、非常に隔絶され且つ制限されたアプローチのままである。
1.標的に向けた活性分子の輸送及びベクター化を可能にする組織化された構造(リポソーム、ミセル等)を形成するためのカチオン性脂質の両親媒性特性、負に帯電する核酸との非共有の複合体(リポプレックス)を形成するそれらの特性、及び細胞膜を不安定化させるそれらの特性。
Rは、親油性領域を表し、
-1又は複数の分岐状又は直鎖状であり、不飽和又は飽和であり、任意にフッ素化されているアルキル鎖であり、6〜24個の炭素元素を含んでなり、好ましくは10〜18個の炭素元素を含んでなるアルキル鎖;或いは
-天然又は合成の脂質;
を含むことができ、Rは、これらの異なる基の組み合わせによって任意に構成することができる。Rは、1又は複数のヘテロ原子を含むことができる。
mは、0又は1に等しい整数であり;
AAは、アミノ酸ラジカルを表し;
nは、0又は1に等しい整数であり;
W1及びW2は、同一であるか又は相違する、直鎖状又は分岐状の炭化水素基であって、1〜15個の、好ましくは1〜6個の炭素原子を含むことができ、そして1又は複数のヘテロ原子を任意に含むことができる炭化水素基を表し;
-刺激であって、pHの低下等の刺激に対して感受性がある(例えば、ビニルエーテル、又はアシルヒドラゾン基は、酸性媒体に対して感受性がある)、又は酸化還元電位における変化等の刺激に対して感受性がある(例えば、還元性媒体で切断されるジスルフィド結合);
-酵素に対して感受性がある(例えば、内因性のエステラーゼによって切断されるエステル結合);或いは
-光放射に対して感受性がある(例えば、有している感光性基);
ため、細胞内媒体で迅速に切断される官能基を表し、
Yは、分岐状の炭化水素基であって、1〜20個の、好ましくは1〜12個の炭素原子を含むことができ、さらに/又は1若しくは複数のヘテロ原子を含むことができ、そして一方でW2又はAA又はE又はR基と、そして他方では少なくとも2つのY及び/又はZ基と任意に共有結合することができる炭化水素基であり;
qは、0〜8の、好ましくは0〜3の整数であり;
Zは、塩基性アミノ酸又はセリンを表し;
rは、1〜16の、好ましくは1〜8の整数であって、ただしqが1に等しい場合には、rは少なくとも2であり、そしてrが1より大きい場合には、Z基は同一であっても相違していてもよい、と理解することができる整数であり;
sは、1又は2の整数である)
のカチオン性両親媒性の化合物、及びその生理的に認容される付加塩である。
W1及びW2に関して、これらは同一である又は相違する場合、これらは直鎖状又は分岐状の炭化水素基を表し、1〜15個の、好ましくは1〜6個の炭素原子を含むことができ、1又は複数のヘテロ原子を含むことができ、この1又は複数のヘテロ原子は、窒素、酸素、硫黄及び例えば臭素、ヨウ素、塩素及びフッ素等のハロゲンから選択することができ、好ましくは窒素、硫黄及び例えば臭素、ヨウ素、塩素及びフッ素等のハロゲンから選択することができる。
同様にまた、「炭化水素基」は、1又は複数の水素原子へ任意に結合された、1又は複数の炭素原子を含んでなるいずれかの基を意味する。
R1及びR2は、同一である又は相違し、直鎖状の、分岐状の及び/又は環式の、飽和又は不飽和の炭化水素基を表し、これは6〜24個の、好ましくは10〜18個の炭素原子を含んでなり、
A及びBは、同一である又は相違し、−C(O)−O−;−O−C(O)−;−CO−NH−;−NH−CO−;−NH−又はO−基を表し、
aは、1〜6の整数であって、好ましくはaは、1又は2に等しい整数であり、
bは、0〜6の整数であって、好ましくはbは、0又は1に等しい整数であり、
Dは、−NH−、−CO−、−O−又はS−基を表す)
に相当する。
式(III)及び(IV)において、R1及びR2は好ましくは、C12〜C18のアルキル、アルケニル又はアルキニル鎖を表す。
本発明に記載の化合物の中で、Eは好ましくは式CO−X1−COに相当し、式中、X1は、上記と同じ意味を有し、そして、一方において親油性領域Rと、そして他方においてAAラジカルと又は直接W1又はY又はZ基とアミド結合によって結合する。
I.1
本発明の他の主題は、少なくとも式(I)に相当する1つの化合物を含んでなる組成物、特に化粧品用の及び/又は医薬用の組成物、又は実験用の試薬に関連する。
かかる組成物は、式(I)に相当する化合物と、生物学的に活性な分子と又は輸送剤/生物学的に活性な分子の複合体と結合することができ、さらにそのトランスフェクトするパワー及び薬効薬理を改善することができるアジュバントもまた含むことができる。従って、本発明に記載のかかる組成物は、アジュバントとして1又は複数の中性の(双性である又はイオン電荷がない)、アニオン性の又はカチオン性の脂質を含むことができる。
本発明に記載の組成物は、好ましくは、0〜20の、より好ましくは0.5〜3のアジュバント/輸送剤のモル比を有する。
本発明の他の主題は、核酸、ポリペプチド又はその他の生物学的に活性な分子の細胞内への導入のための、上記に定義される輸送剤の使用に関連する。生物的に注目の分子の輸送が必要ないずれの分野でも、これを使用することができる。これは、特に化粧品及び/又は医薬の分野、又は実験用の試薬に適用する。
本発明はまた、核酸、ポリペプチド又はその他の生物学的に活性な分子の細胞内への導入のために、少なくとも式(I)の化合物を1つ含んでなる組成物の使用に関連する。
好ましくは、本発明の医薬組成物は、注入可能な製剤のための、特に目的とする器官内への直接的な注入のための、又は局所的なルートによる投与のための医薬的に認容されるビヒクル(vehicle)を含む。これらは、特に滅菌の、等張性の溶媒、又は乾燥した、特に冷凍乾燥した組成物とすることができ、これは場合に応じて滅菌水又は生理的血清を添加することによって、注入可能な溶媒の形成を可能にする。注入及び投与の数に応じて使用される核酸、ポリペプチド又はその他の生物学的に活性な分子の用量は、異なるパラメータの作用に応じて、そして特に使用される投与方法、関与する病理、発現される遺伝子、又は治療の求められる期間に応じて適合させることができる。より詳細には投与方法に関しては、これは、組織内へ又は循環ルート内への直接的な注入か、或いは、その後に注入又は移植による再移植が続く培養中の細胞の処理とすることができる。
1.活性分子/輸送剤複合体を形成するために生物学的に注目の分子を、上記に定義される式(I)に相当する輸送剤と、又は既に定義される組成物と接触させる段階
2.細胞を、1で形成された複合体と接触させる段階
を含んでなる。
好ましくは、この方法はインビトロで及び/又は既に単離された細胞を用いて実行される実験で及び/又はインビボで使用される。
本発明に記載の化合物の有効な特性により、組成物、特にワクチンでの特にアジュバントとしての使用等の他の多くの使用を予想することができるようになる。
以下の記述は、この開示において頻繁に使用される特定の語の理解を促進するために提供される:
「ポリペプチド」とは、サイズに関係なくいずれのアミノ酸鎖も意味する。従って、この用語は特にペプチド及びタンパク質を含む。
特に、出願人は、本発明に記載の輸送剤の調製のために使用することが可能である制限のない様々な操作プロトコル、及び反応中間体を提案する。もちろん、これらのプロトコル又は中間生成物によって、同様の化合物を生産するための類似する方法を開発することが誘導されることは、当業者の技術範囲内である。
a)材料
主要な試薬及び溶媒は、Merck(Darmstadt、Germany)、VWR Prolabo(Briare、France)、Sigma-Aldrich SARL(Saint Quentin Fallavier、France)及びFluka(Division of Sigma-Aldrich、Saint Quentin Fallavier、France)から得られる。グリセロ脂質誘導体(DOGS、DPGS、DMGS、DLGS)は、Avanti Polar Lipids(Alabaster、AL、USA)から得られる。保護アミノ酸(Boc-Orn(Boc)-OH、Boc-Lys(Boc)-OH、Boc-Arg(Boc)2-OH、H-Glu(OtBu)-OtBu.HCl)は、Bachem Biochimie SARL(Voisin-le-Bretonneux、France)から得られる。全ての無水溶媒は、Sigma-Aldrich及びFlukaから得られ、そしてそのまま用いられる。
・クロマトグラフィ法
薄膜のクロマトグラフィ法(TLC)は、シリカゲル60F254(Merck)で覆われた5×7.5cmのアルミニウム上で実行される。この化合物は、紫外線(λ=254nm)の下で、ヨードを用いて、第一アミン官能基を有している化合物の場合には、ニンヒドリン展開液(ブタノール中0.2%)へ浸漬され、その後150℃での加熱段階により展開され、或いは硫黄を含む化合物の場合には、セリウム/濃縮モリブデン酸塩(H2O/H2SO4/(NH4)6Mo7O24.4H2O/Ce(SO4)2.3H2O展開液: 90/10/15/1)へ浸漬され、その後110℃での加熱段階により展開される。
かかる合成生成物は、シリカ上のクロマトグラフィのカラム上で精製される。フラッシュクロマトグラフィによる分離は、シリカゲル60(230〜400mesh ASTM)(Merck)上で実行される。
サンプルの調製:
分析される生成物は、メタノール/水の混合50/50(v/v)中で、或いは、アセトニトリル/水の混合50/50(v/v)中で溶解され(0.01mg.mL-1)、そして溶液はシリンジポンプ(Harvard Apparatus、Les Ulis、France)によって直接エレクトロスプレーソースの中へ導入される(5μL.min-1)。
質量スペクトルは、空気圧で補助されるエレクトロスプレーイオンソース(Z-spray)が備えられたWaters-Micromass Q−TOF装置(Manchester、U.K.)上で生成される。窒素は、各々250L/h及び50L/hの流速で脱溶媒和ガス及び噴霧ガスとして使用される。そのソース及び脱溶媒和ガスの温度はそれぞれ80及び150℃に固定される。毛細管圧は、±180V(±QD)である。衝突誘起解離(CID)実験のために、5×10-5Torrに設定された分析器圧力及び90Vに調整された衝突エネルギーで、アルゴンが衝突ガスとして使用される。
精密質量測定は、空気圧で補助されるエレクトロスプレーソース(Z-spray)が備えられ、対照化合物(NaI)のためにさらなる噴霧器(Lockspray)が提供されるWaters-Micromass LCT装置(Manchester、U.K.)上で実行される。窒素は、各々500L/h及び20L/hの流速で脱溶媒和ガス及び噴霧ガスとして使用される。ソース及び脱溶媒和ガスの温度はそれぞれ80℃及び120℃に固定される。毛細管圧は±3.0kVであり、コーンプレッシャー(cone pressure)は±100V(±QD)である。
スペクトルは、100〜3500umaの質量範囲となるように、1スキャンが3秒の速度で蓄積される。使用される解像度は、Q-TOFに対して9000 FWHMであり、LCTに対して3000 FWHMである。データ収集及び処理は、program MassLynx V3.5を用いて実行される。
特定の化合物は、マススペクトロメトリーに加えて高性能液体クロマトグラフィ法(HPLC)(LC/MS)によって析される。HPLCは、Alltech Prevail(商標登録)C18分析カラム(Lexington、KY、USA)が備えられるWaters Alliance 2695装置を用いて実行される。検出は、Waters−Micromass Q−TOF質量分析計によってHPLCカラムのアウトレットで実行される。
実施例1: ジオレオイル-グリセロ-スクシニル-シスタミド-オルニチン(化合物1d:(181GSCO))の調製
TLC: Rf 1b =0.6(CH2Cl2/MeOH 8/2(v/v))
ESI-MS +: [M+H]+としての実測値m/z 467.1は、C19H39N4O5S2の計算値467.2に相当する。
TLC: Rf 1c=0.8(CH2Cl2/MeOH 9/1(v/v))
ESI-MS +: [M+H]+としての実測値m/z 1169.6は、C62H113N4O12S2の計算値1169.8に相当し、[M+H+Na]2+としての実測値m/z 569.4は、C62H113N4O12S2Naの計算値569.4に相当する。
総合成収率(3段階)は、34%である。
TLC: Rf 1d = 0.1(CH2Cl2/MeOH 9/1(v/v))
HPLC: Rt = 39.73min
(三元勾配 H2O/CH3CN/CH3CN + 10% CH3COOH、流速=1mL/min)
ESI-HRMS(ポジティブモードでの検出を用いた高分解能): [M+H]+としての実測値m/z 969.6739は、C52H97N4O8S2の計算値969.6748に相当する。(偏差: 0.9ppm)
181GSCR、又は式2d:
TLC: Rf 2b = 0.6(CH2Cl2/MeOH 8/2(v/v))
ESI-MS +: [M+H]+としての実測値m/z 609.2は、C25H49N6O7S2の計算値609.3に相当する。
TLC: Rf 2c =0.9(CH2Cl2/MeOH 9/1(v/v))
ESI-MS +: [M+H]+としての実測値m/z 1311.7は、C68H123N6O14S2の計算値1311.9に相当し、[M+H+Na]2+としての実測値m/z 667.4は、C68H123N6O14S2Naの計算値667.4に相当する。
化合物2c(0.17mmol; 220mg)は、50mLのフラスコ内で5mLのCH2Cl2中に溶解され、そして5mLのトリフルオロ酢酸がこの反応溶液へ添加される。そしてこの反応は、周囲温度での攪拌の下で1時間継続される。反応溶液は、乾燥するまで低真空下で蒸発される。過剰なトリフルオロ酢酸の痕跡を除去するために、最終残留物は3回連続して5mLのジクロロメタン中に溶解され、そして蒸発乾固される。このような方法で、210mgの化合物2dがトリフルオロ酢酸塩の形態で単離される。この反応は定量的である。
総合合成収率(3段階)は、26%である。
TLC: Rf 2d = 0.1(CH2Cl2/MeOH 9/1(v/v))
HPLC: Rt = 39.46分
(三元勾配 H2O/CH3CN/CH3CN + 10% CH3COOH、流速=1mL/min)
ESI-HRMS(ポジティブモードでの検出を用いた高分解能): [M+H]+としての実測値m/z 1011.6984は、C53H99N6O8S2の計算値1011.6966に相当する(偏差:1.8ppm)。
TLC: Rf 3 =0(CH2Cl2/MeOH 9/1(v/v))
ESI-HRMS(ポジティブモードでの検出を用いた高分解能): [M+H]+としての実測値m/z 819.5356は、C40H77N4O8S2の計算値819.5339に相当する(偏差: 2.1ppm)。
181GSGlu(CO)2、又は式4e:
TLC: Rf 4b = 0.9(CHCl3/MeOH/AcOH 95/5/0.2(v/v/v))
ESI-MS +: [M+Na]+としての実測値m/z 984.8は、C56H99NO11Naの計算値984.7に相当する。
TLC: Rf 4c =0.1(CHCl3/MeOH/AcOH 95/5/0.2(v/v/v); Rf 4b=0.9)
ESI-MS +: [M+Na]+としての実測値m/z 871.6は、C48H82NO11Naの計算値871.6に相当する。
TLC: Rf 4d = 0.35(CH2Cl2/MeOH 95/5(v/v))
ESI-MS +: [M+Na]+としての実測値m/z 1769.2は、C86H155N9O19S4Naの計算値1769.0に相当する。
化合物4d(0.011mmol; 20mg)は、10mLのフラスコ内で1.6mLのCH2Cl2中に溶解され、そして400μLのトリフルオロ酢酸がこの反応溶液へ添加される。そしてこの反応は、周囲温度での攪拌の下で1時間継続される。反応溶液は、乾燥するまで低真空下で蒸発される。過剰なトリフルオロ酢酸の痕跡を除去するために、最終残留物は5mLのジクロロメタン中に連続して3回溶解され、そして蒸発乾固される。このような方法で、19.5mgの化合物4eはトリフルオロ酢酸塩の形態で単離される。この反応は定量的である。
TLC: Rf 4e = 0(CH2Cl2/MeOH 9/1(v/v); Rf 4d=0.9)
ESI-MS +: [M+H]+としての実測値m/z 1346.9は、C66H124N9O11S4の計算値1346.8に相当し、[M+Na]+としての実測値m/z 1368.9は、C66H123N9O11S4Naの計算値1368.8に相当する。
181GSCL2、又は式5f:
式5e:
TLC: Rf 5e = 0.4(CHCl3/MeOH 9/1(v/v))
ESI-MS +: [M+Na]+としての実測値m/z 854.4は、C38H71N8O12Naの計測値854.5に相当する。
TLC: Rf 5f =0(CH2Cl2/MeOH 9/1(v/v))
ESI-HRMS(ポジティブモードでの検出を用いた高分解能): [M+H]+としての実測値m/z 1269.9072は、C65H125N10O10S2の計算値1269.9021に相当する(偏差: 4.0ppm)。
実施例6: 水中におけるリポソーム、小胞又はミセルの形態での製剤
前記の実施例で説明したカチオン性脂質の1つは、クロロホルム中で所定の濃度で溶解される。一方、共脂質(ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン、コレステロール、コレステロール-アミン等)もまた、クロロホルム中で所定の濃度で溶解される。ピルボックス(pill box)でこれらの2つの溶液を異なる量で混合することにより、カチオン性脂質及び共脂質の混合物の異なる組成物を得られる。そして、ピルボックスの壁(wall)に沿って脂質膜を得るために、クロロホルムは低真空下で蒸発される。この膜は、所定量の滅菌の脱イオン水を用いて再水和される。この膜の完全な再水和の後に、小さな単層リポソームを形成するためにこの分散は超音波処理を受ける。
前記の実施例で説明したカチオン性脂質の1つは、クロロホルム中で所定の濃度で溶解される。一方、共脂質(ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン、コレステロール、コレステロール-アミン等)もまた、クロロホルム中で所定の濃度まで溶解される。ピルボックスでこれらの2つの溶液を異なる量で混合することにより、カチオン性脂質及び共脂質の混合物の異なる組成物が得られる。そして、ピルボックスの壁に沿って脂質膜を得るために、クロロホルムは低真空下で蒸発される。そしてこの膜は、少量のエタノール(製剤の最終体積の3〜5%)中で再溶解される。そして、このエタノール溶液は、攪拌下でハミルトンシリンジを使用して所定の体積の脱イオン水の中に迅速に注入される。
前記の実施例で説明したカチオン性脂質の1つは、クロロホルム中で所定の濃度で溶解される。一方、共脂質(ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン、コレステロール、コレステロール-アミン等)もまた、クロロホルム中で所定の濃度で溶解される。ピルボックスでこれらの2つの溶液を異なる量で混合することにより、カチオン性脂質及び共脂質の混合物の異なる組成物が得られる。そして、ピルボックスの壁に沿って脂質膜を得るために、クロロホルムは低真空下で蒸発される。そしてこの膜は、激しい攪拌下でエタノール/脱イオン水溶液80/20(v/v)中で再溶解される。
例えば、クロロホルム中に181GSCO(実施例1)が10mg.mL-1である溶液600μL(6mg; 5μmol)、及びクロロホルム中にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)が10mg.mL-1である溶液372μL(3.72mg; 5μmol)がピルボックス内で混合される。このクロロホルムは乾燥するまで低真空下で蒸発され、そして得られる脂質膜は5mLのエタノール/水溶液80/20(v/v)中で再溶解される。
実施例9: 生細胞内へDNAを輸送するための、本発明に記載の輸送剤の使用
9.1 材料
細胞をトランスフェクトすることを目的とするプラスミドは、pCMV-LacZ、又はpCMV-EGFPである。pCMV-LacZは、酵素であるβ-ガラクトシダーゼをコードする、CMV遺伝子プロモーターの制御下にある遺伝子を含んでなる。細胞で産生されるβ-ガラクトシダーゼの活性は、比色試験を使用して容易に測定することができる。pCMV-EGFPは、タンパク質、GFPをコードする、CMV遺伝子プロモーターの制御下にある遺伝子を含んでなる。細胞で産生されるGFPは、蛍光顕微鏡を用いて観察され、そしてFACSによって定量化される。プラスミドは、細菌培養(E. Coli)から調製され、そしてアフィニティーカラム上で精製される。得られる核酸の溶液は、水で1mg.mL-1に希釈され、そして-20℃で保存される。
1.細胞の調製
接着不死化細胞(Vero、NIH-3T3、HeLa)は、トランスフェクションテストの前に1日、96ウェルの培養プレートで培養され(100μLのDMEM中で1ウェルにつき15,000細胞)、指数増殖期中であり80%のコンフルエンス状態である間にトランスフェクトされる。
懸濁液中の不死化細胞(Jurkat、K562)は、1mLにつき2〜5×106個の細胞の密度に、トランスフェクションの前日に調製される。トランスフェクションの日には、0.5〜1×105個の細胞が96ウェルの培養プレートで培養される。
DNAの溶液及び実施例6に従って得られる脂質製剤は、トランスフェクションに使用される前に、周囲温度にし、そして溶液を数回ピペッティングし、吸引しそして分注することにより、入念に攪拌される。DNA/脂質製剤の複合体は、次の通り異なるDNA含有量を用いてそして脂質製剤中で調製される。
脂質製剤は、1.5mLのエッペンドルフチューブ中で培地(DMEM)によって希釈される。異なる脂質製剤濃度で希釈される3つの溶液が調製される(表1)。
10.1 材料
細胞をトランスフェクトすることを目的とするプラスミドは、抗EGFP siRNA(Ambion、TX、USA)であり、その配列は、
5’−GCAAGCUGACCCUGAAGUUCUU(センス)
及び
5’−GAACUUCAGGGUCAGCUUGCUU(アンチセンス)である。
細胞で生成されるGFPの抑制におけるかかる配列の有効性は、蛍光顕微鏡を用いて観察され、そしてFACSによって測定される。対照siRNAは、非特異的な抑制の測定のために使用される。RNA溶液は、水中で1μmol.L-1で存在し、そして-20℃で貯蔵される。
1.細胞の調製
Hela-GFP細胞は、トランスフェクションテストの前に24ウェルの細胞培養プレート(400μLのDMEM中、1ウェルにつき60、000細胞)で1日培養され、そして指数増殖期であり80%のコンフルエンス状態である間にトランスフェクトされる。
11.1 材料
細胞内へ輸送することを目的とするポリペプチドは、予めフルオレセインで標識された精製ヤギIgG(Sigma-Aldrich SARL、Saint Quentin Fallavier、France)、R-フィコエリトリン(インビトロジェン、San Diego、CA、USA)及びβ-ガラクトシダーゼ(Merck KGaA、Darmstadt、Germany)である。このポリペプチドは、PBS中に100μg.mL-1の濃度で溶解して使用される。標識されたポリペプチドの細胞内への輸送の有効性は、蛍光顕微鏡で観察されそしてFACSで定量化される。細胞で生成されるβ−ガラクトシダーゼの活性は、比色試験を用いて容易に測定される。
1.細胞の調製
接着不死化細胞(Vero、NIH-3T3、HeLa)は、実験中に指数増殖期であり80%のコンフルエンス状態であるように、ポリペプチド、タンパク質又は抗体の輸送テストの前に24ウェルの細胞培養プレート(400μLのDMEM中、1ウェルにつき75、000細胞)で1日培養される。
懸濁液中の不死化細胞(Jurkat、K562)は、トランスフェクションの前日に1mLにつき2〜5×106個の細胞の密度に調製される。トランスフェクションの日には、1.5〜5×105個の細胞が96ウェルの培養プレートで培養される。
3.2μLの脂質製剤は、1.5mLのエッペンチューブの底面へ添加される。
5.そして、100μLの培地(DMEM)は、ポリペプチド/脂質製剤の混合物へ添加され、そして溶液は数回ピペッティングされ、吸引されそして分注されることにより、入念に攪拌される。
7.細胞は、標準条件下で5%CO2を含む湿度雰囲気において37℃で培養される。ポリペプチド又はタンパク質又は抗体の細胞内の輸送の有効性は、3〜48時間の培養後に分析される(図7、8及び10)。
Claims (32)
- 式(I):
Rは、親油性領域を表し、
- 1又は複数のアルキル鎖であって、6〜24個の、好ましくは10〜18個の炭素原子を含んでなり、分岐状又は直鎖状であり、不飽和又は飽和であり、任意にフッ素化されているアルキル鎖;或いは
- 親油性であることが知られている1又は複数の環式又は多環式の基であって、ステロイド基(例えば、コレステロール誘導体)、ポリ芳香族基(例えば、ナフタレン、ダンシル、又はアントラセン誘導体)、又はアルカロイド誘導体基等である環式又は多環式の基;或いは
- 天然又は合成の脂質;
から選択される1又は複数の基を含むことができ、
Eは、直鎖状又は分岐状の炭化水素基であって、1〜15個の、好ましくは1〜8個の炭素原子を含むことができ、そして1又は複数のヘテロ原子を任意に含むことができる炭化水素基を表し;
mは、0又は1に等しい整数であり;
AAは、アミノ酸ラジカルを表し;
nは、0又は1に等しい整数であり;
W1及びW2は、同一であるか又は相違する、直鎖状又は分岐状の炭化水素基であって、1〜15個の、好ましくは1〜6個の炭素原子を含むことができ、1又は複数のヘテロ原子を任意に含むことができる炭化水素基を表し;
Lは、その環境に対して感受性がある結合を少なくとも1つ包含することができる官能基であって、細胞外媒体において安定であり、そして
- 刺激であって、pHの低下等の刺激に対して感受性がある(例えば、ビニルエーテル、又はアシルヒドラゾン基は、酸性媒体に対して感受性がある)、又は酸化還元電位における変化等の刺激に対して感受性がある(例えば、還元性媒体で切断されるジスルフィド結合);
- 酵素に対して感受性がある(例えば、内因性のエステラーゼによって切断されるエステル結合);或いは
- 光放射に対して感受性がある(例えば、有している感光性基);
ため、細胞内媒体で迅速に切断される官能基を表し、
Pは、0又は1に等しい整数であり;
Yは、分岐状の炭化水素基であって、1〜20個の、好ましくは1〜12個の炭素原子を含むことができ、さらに/又は1若しくは複数のヘテロ原子を含むことができ、そして一方でW2又はAA又はE又はR基と、そして他方では少なくとも2つのY及び/又はZ基と任意に共有結合することができる炭化水素基であり;
qは、0〜8の、好ましくは0〜3の整数であり;
Zは、塩基性アミノ酸又はセリンを表し;
rは、1〜16の、好ましくは1〜8の整数であって、ただしqが1に等しい場合には、rは少なくとも2であり、そしてrが1より大きい場合には、Z基は同一であっても相違していてもよい、と理解することができる整数であり;
sは、1又は2の整数である)
のカチオン性の両親媒性化合物、及びその生理的に認容される付加塩。 - 前記式中のRが、1又は複数のヘテロ原子を含んでなることを特徴とする、請求項1記載の化合物。
- 前記式中のRが、式(II)
R1及びR2は、同一である又は相違し、直鎖状、分岐状及び/又は環式の、飽和又は不飽和の炭化水素基であって、6〜24個の、好ましくは10〜18個の炭素原子を含んでなる炭化水素基を表し、
A及びBは、同一である又は相違し、−C(O)−O−;−O−C(O)−;−CO−NH−;−NH−CO−;−NH−又はO−基を表し、
aは、1〜6の整数であって、好ましくはaは、1又は2に等しい整数であり、
bは、0〜6の整数であって、好ましくはbは、0又は1に等しい整数であり、
Dは、−NH−、−CO−、−O−又はS−基を表す)
に相当することを特徴とする、請求項1又は2記載の化合物。 - 前記式中のRが、式(III)
に相当することを特徴とする、請求項3記載の化合物。 - 前記式中のEが、式(V):−G1−X1−x−G1
(式中、
-X1は、1〜8個の、好ましくは1〜4個の炭素原子を含んでなる架橋アルキレン基を表し、そして、
-G1は、−CO−又はNH−基を表す)
に相当することを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項記載の化合物。 - 前記式中のEが、式CO−X1−COに相当し、式中X1は、請求項5の記載と同じ意味を有することを特徴とする、請求項5記載の化合物。
- 前記式中のW1が、式−G2−X2−に相当し、そしてW2が式(VII):−X3−G3−に相当し、式中、X2及びX3は、同一である又は相違し、1〜8個の、好ましくは1〜4個の炭素原子を含んでなる架橋アルキレン基を表し、さらにG2及びG3は、同一である又は相違し、−CO−、−NH−又はO−基を表すことを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項記載の化合物。
- 前記式中のLが、エステル(−CO−O−)、ジスルフィド(−S−S−)、ビニルエーテル(−O−C=C−)、アシルヒドラゾン(−CO−NR−N=CR’R’’)基を、好ましくはエステル又はジスルフィド基を表すことを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項記載の化合物。
- 前記式中のYが、式(VIII):−CO−X4−NH−X5−N−[X6−NH]2−又は式(IX):−NH−X5−N−[X6−NH]2−、
(式中、X4、X5及びX6は、同一であるか又は相違し、1〜8個の、好ましくは1〜4個の炭素原子を含んでなる架橋アルキレン基を表す)
に相当することを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項記載の化合物。 - 前記式中のX4が、メチレンを表すことを特徴とする、請求項9記載の化合物。
- 前記式中のX5及びX6が、1〜4個の、好ましくは2個の炭素原子を含んでなる架橋アルキレン基を表すことを特徴とする、請求項9又は10記載の化合物。
- 前記式中のZが、塩基性アミノ酸を表し、好ましくはリジン、オルニチン、アルギニン、ヒスチジンから選択されることを特徴とする、請求項1〜11のいずれか1項記載の化合物。
- 前記の生理的に認容される付加塩の対イオンが、有機アニオンから、好ましくはCF3COO-及びCH3COO-から選択され、又は無機アニオンから、好ましくはBr-、Cl-、I-及びF-から選択されることを特徴とする、請求項1〜12のいずれか1項記載の化合物。
- 式:
- 請求項1〜14のいずれか1項に定義される式(I)の化合物を含んでなる、好ましくは化粧品用の又は医薬用の又は実験用の試薬である組成物。
- 少なくとも1つの核酸又はポリヌクレオチドを含んでなることを特徴とする、請求項15記載の組成物。
- 式(I)の化合物及び核酸が、核酸の負電荷に対する式(I)の化合物の正電荷の割合が、0.1〜50である、好ましくは0.5〜20である量で存在することを特徴とする、請求項16記載の組成物。
- 式(I)の化合物の量が、核酸1μg当たり1〜12ナノモルである、そして好ましくは1〜9ナノモルであることを特徴とする、請求項16又は17記載の組成物。
- 少なくとも1つのポリペプチド又はタンパク質もまた含んでなることを特徴とする、請求項5記載の組成物。
- 式(I)の化合物及びポリペプチド又はタンパク質が、
式(I)の化合物の量が、ポリペプチド1μg当たり化合物1〜10ナノモル、好ましくは1〜3ナノモルである量で存在することを特徴とする、請求項19記載の組成物。 - 核酸又はポリペプチド以外の、少なくとも1つの生物学的に活性な分子、例えば活性成分、多糖類、脂質、ペプトイド等もまた含んでなることを特徴とする、請求項15記載の組成物。
- 少なくとも1つの以下のようなアジュバント:
- 1又は複数の中性の(双性である又はイオン電荷がない)、アニオン性の又はカチオン性の脂質であって、例えば2つの脂肪鎖、コレステロール、又はコレステロール誘導体を有する中性の脂質であって、より詳細には、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、オレオイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(POPE)、ジステアロイル−、ジパルミトイル−、ジミリストイル−、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE、DPPE、DMPE、DLPE)、及びこれらの1〜3回のNメチル化誘導体(DOPC、DPPC、DMPC)、フォスファチジルグリセロール、グリコシルジアシルグリセロール、セレブロシド(特にガラクトセレブロシド等)、スフィンゴ脂質(特にスフィンゴミエリン等)、アシアロガングリオシド(特にアシアロGM1及びGM2等)、から選択される脂質
- 或いは、脂質エーテル等、又は単脂肪鎖を含んでなる脂質であって、リゾホスファタイド、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルセリンを含む脂質等、
- 或いは、天然の又は合成のリゾホスファチジン酸等、
- 或いは、1又は複数の重合体、天然の又は合成の、共重合体及び/又はデンドリマー等であって、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリオルニチン、又はポリブレン及びキトサンも含むポリアミン等のカチオン性のもの、又はポリグルタミン酸、ポリプロピルアクリル酸、ヒアルロン酸及びポリ乳酸-co-グリコール酸(PGLA)等のアニオン性のもの、又はポリエチレングリコール(PEG)又はガラクトマンナン等の特定の多糖類等の中性のもの、
- 或いは、ナノ粒子等、特に磁性粒子、有機又は無機化合物に基づく粒子、又はポリペプチド、タンパク質、単糖、グリセロール、シクロデキストリン、ヒストン、デオキシコール酸及び輸送の有効性及び薬効薬理を改善するその他の「活性化因子」(「エンハンサー」)等
- 或いは、細胞の表面及び/又は細胞内の決定因子を特に標的とすることができる、式(I)に相当する化合物へ又は式(I)の化合物を含んで成る組成物に含まれるその他の分子へ任意に共有結合又は非共有結合するアジュバントであって、例えば標的細胞の表面で発現される受容体のリガンドである、例えば糖、葉酸、トランスフェリン、インスリン、ホルモン、ペプチド、抗体、代謝生成物、ビタミン、又は細胞外の受容体を認識することが可能なその他の分子、又はミトコンドリア、核又は細胞質等の特定の区画を標的とするための細胞内ベクター化の因子等である、例えば核の又はミトコンドリアの局在化シグナル等の、例えば糖、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、リガンド又はリガンドフラグメント等といった、アジュバント、
- 或いは、ローダミン、フルオレセイン又はビオチン等の蛍光色素分子
- 或いは、例えばレンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス等のウイルス、及び/又は例えば細菌、イースト、菌類又は寄生虫等の単細胞生物、
もさらに含んでなることを特徴とする、請求項15〜21のいずれか1項記載の組成物。 - 核酸、ポリペプチド又はその他の生物活性分子の細部内への輸送のための、請求項1〜14のいずれか1項に定義される式(I)の化合物の使用。
- 核酸、ポリペプチド又はその他の生物活性分子の細胞内への輸送を目的とする組成物の調製のための、請求項1〜14のいずれか1項に定義される式(I)の化合物の使用。
- 核酸、ポリペプチド又はその他の生物活性分子の細胞内への輸送のための、請求項15〜22のいずれか1項に定義される、式(I)の少なくとも1つの化合物を含んでなる組成物の使用。
- 生物学的に注目の分子を細胞内へ輸送するための方法であって、
1.活性分子/輸送剤複合体を形成するために生物学的に注目の分子を、請求項1〜14のいずれか1項に定義される、式(I)に相当する化合物と、又は請求項15〜22のいずれか1項に定義される組成物と接触させる段階
2.細胞を、1で形成された複合体と接触させる段階
を含んでなる方法。 - 使用される細胞が、予め単離された細胞であることを特徴とする、請求項26記載の方法。
- インビトロ(in vitro)で又はインビボ(in vivo)で又はエクスビボ(ex vivo)で実施されることを特徴とする、請求項26又は27記載の方法。
- 式(I)の化合物を、1又は複数の他のトランスフェクション剤及び/或いは1又は複数のアジュバントと接触させる1又は複数の段階もまた含んでなることを特徴とする、請求項26〜28のいずれか1項記載の方法。
- 式(I)の化合物を1又は複数の他のトランスフェクション剤と接触させる段階、及び/或いは式(I)の化合物を前記の1つのアジュバント又は複数のアジュバントと接触させる段階が、段階1より先行することを特徴とする、請求項26〜29のいずれか1項記載の方法。
- 少なくとも、請求項1〜14のいずれか1項記載の式(I)に相当する1つの化合物、又は請求項15〜22の1項記載の組成物を含んでなることを特徴とする、生体物質の輸送のためのキット。
- 少なくとも、請求項1〜14のいずれか1項記載の式(I)に相当する1つの化合物、又は請求項15〜22の1項記載の組成物を含んでなることを特徴とする、請求項26〜30のいずれか1項記載の方法の実施のための輸送キット。
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