JPH09173067A - 細胞のトランスフェクション - Google Patents
細胞のトランスフェクションInfo
- Publication number
- JPH09173067A JPH09173067A JP8307745A JP30774596A JPH09173067A JP H09173067 A JPH09173067 A JP H09173067A JP 8307745 A JP8307745 A JP 8307745A JP 30774596 A JP30774596 A JP 30774596A JP H09173067 A JPH09173067 A JP H09173067A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- transfection
- formula
- compound
- cells
- palmitoyl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Polyamides (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 細胞をトランスフェクションするための非ウ
イルス性システムの担体であって、体液中で安定であっ
て、in vivo におけるトランスフェクションを効率良く
行うことのできる担体を提供する。 【解決手段】 式（Ｉ）：Ｒ1 −ＮＨ−Ａ（式中、Ｒ1
は、Ｃ10-42 の脂肪族アシル基であり、ＮＨ−Ａは、オ
リゴペプチド残基である）で示される化合物又はその誘
導体を含む、ポリヌクレオチド又はその他のアニオン性
巨大分子により細胞をトランスフェクションするための
担体、及びそれを含む組成物。
イルス性システムの担体であって、体液中で安定であっ
て、in vivo におけるトランスフェクションを効率良く
行うことのできる担体を提供する。 【解決手段】 式（Ｉ）：Ｒ1 −ＮＨ−Ａ（式中、Ｒ1
は、Ｃ10-42 の脂肪族アシル基であり、ＮＨ−Ａは、オ
リゴペプチド残基である）で示される化合物又はその誘
導体を含む、ポリヌクレオチド又はその他のアニオン性
巨大分子により細胞をトランスフェクションするための
担体、及びそれを含む組成物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞をトランスフ
ェクションするための担体に関する。
ェクションするための担体に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】遺伝子
導入技術は、関心の高い分野の技術となっている。外因
性遺伝子を細胞に導入する（つまり、トランスフェクシ
ョン）ことは、遺伝子調節及び組換えタンパク質の産生
から、遺伝子療法まで、多くの重要な科学的及び医学的
な用途に適用することができる。
導入技術は、関心の高い分野の技術となっている。外因
性遺伝子を細胞に導入する（つまり、トランスフェクシ
ョン）ことは、遺伝子調節及び組換えタンパク質の産生
から、遺伝子療法まで、多くの重要な科学的及び医学的
な用途に適用することができる。
【０００３】ウイルスは、遺伝子導入に対して細胞が有
する各種障壁をすり抜けるよう進化してきたため、今で
はトランスフェクションのための優れたベクターとなっ
ている。レトロウイルス、アデノウイルス又はヘルペス
ウイルスなどの多くのウイルスが現在では、治療遺伝子
を担うよう加工されて、ヒトにおける遺伝子療法のため
の臨床試験に使用されている。しかし、それでも感染及
び免疫反応が起こる危険があり、またウイルスの大規模
な生産は困難で、時間もかかる。
する各種障壁をすり抜けるよう進化してきたため、今で
はトランスフェクションのための優れたベクターとなっ
ている。レトロウイルス、アデノウイルス又はヘルペス
ウイルスなどの多くのウイルスが現在では、治療遺伝子
を担うよう加工されて、ヒトにおける遺伝子療法のため
の臨床試験に使用されている。しかし、それでも感染及
び免疫反応が起こる危険があり、またウイルスの大規模
な生産は困難で、時間もかかる。
【０００４】このような各種の理由から、ＤＮＡを細胞
へ導入するために、非ウイルス性システム、例えばカチ
オン性脂質であるジオレオイルオキシトリメチルアンモ
ニウムに基づくトランスフェクション技術(Felgner et
al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417, 1
987)（リポフェクチン（Lipofectin、登録商標）として
発売）が開発されている。このトランスフェクション技
術の発見以来、よりカチオン性である脂質が多く合成さ
れ、実験室用用途のためのトランスフェクション試薬と
して市販されているものもある（ＤＯＧＳ（トランスフ
ェクタム(Transfectam、登録商標））、ＤＯＳＰＡ（リ
ポフェクタミン（Lipofectamine 、登録商標））、ＤＯ
ＴＡＰ（登録商標）など）。
へ導入するために、非ウイルス性システム、例えばカチ
オン性脂質であるジオレオイルオキシトリメチルアンモ
ニウムに基づくトランスフェクション技術(Felgner et
al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417, 1
987)（リポフェクチン（Lipofectin、登録商標）として
発売）が開発されている。このトランスフェクション技
術の発見以来、よりカチオン性である脂質が多く合成さ
れ、実験室用用途のためのトランスフェクション試薬と
して市販されているものもある（ＤＯＧＳ（トランスフ
ェクタム(Transfectam、登録商標））、ＤＯＳＰＡ（リ
ポフェクタミン（Lipofectamine 、登録商標））、ＤＯ
ＴＡＰ（登録商標）など）。
【０００５】しかし、非ウイルス性遺伝子到達システム
の開発が大きな進歩を遂げたにもかかわらず、より効率
の良い技術が求められている。合成化合物によるシステ
ムのトランスフェクションの効率は、ウイルス性ベクタ
ーの場合よりも低いからである。更に、in vivo では多
くの問題が生じており、生物の体液中において非ウイル
ス性システムが不安定であるため、in vivo におけるト
ランスフェクションを効率良く、再現可能に行うことが
できない。
の開発が大きな進歩を遂げたにもかかわらず、より効率
の良い技術が求められている。合成化合物によるシステ
ムのトランスフェクションの効率は、ウイルス性ベクタ
ーの場合よりも低いからである。更に、in vivo では多
くの問題が生じており、生物の体液中において非ウイル
ス性システムが不安定であるため、in vivo におけるト
ランスフェクションを効率良く、再現可能に行うことが
できない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明によると、脂肪酸
部分と結合したオリゴペプチドが、核酸と結合すること
ができるため、このオリゴペプチドを、細胞のトランス
フェクションのために使用することができることが認め
られた。
部分と結合したオリゴペプチドが、核酸と結合すること
ができるため、このオリゴペプチドを、細胞のトランス
フェクションのために使用することができることが認め
られた。
【０００７】したがって、本発明は、一つの面におい
て、式（Ｉ）： Ｒ1 −ＮＨ−Ａ （式中、Ｒ1 は、Ｃ10-42 、特にＣ12-40 の脂肪族アシ
ル基であり、ＮＨ−Ａは、オリゴペプチド残基である）
で示される化合物又はその誘導体を含む、ポリヌクレオ
チド又はその他のアニオン性巨大分子により細胞をトラ
ンスフェクションするための担体に関する。
て、式（Ｉ）： Ｒ1 −ＮＨ−Ａ （式中、Ｒ1 は、Ｃ10-42 、特にＣ12-40 の脂肪族アシ
ル基であり、ＮＨ−Ａは、オリゴペプチド残基である）
で示される化合物又はその誘導体を含む、ポリヌクレオ
チド又はその他のアニオン性巨大分子により細胞をトラ
ンスフェクションするための担体に関する。
【０００８】「Ｃ10-42 」の語は、炭素原子数が１０〜
４２であることを示す。アシル基部分であるＲ1 は、直
鎖状又は分岐鎖状の、飽和又は不飽和のアシル基部分で
ある。好ましくは、アシル基部分Ｒ1 は、１２〜４０
個、特に１２〜２０個の炭素原子を含む。このようなア
シル基部分の例としては、ラウロイル、パルミトイル、
ステアロイル、オレオイル、及び（ＣＨ3 （ＣＨ2)n)2
ＣＨＣＯ−（ここで、ｎは、３〜１９の整数である）が
挙げられる。パルミトイル及びオレオイルが最も好まし
い。「オリゴペプチド」の語は、少なくとも１個の塩基
性アミノ酸を含む、２０個まで、好ましくは１０個ま
で、より好ましくは２〜６個のアミノ酸残基を含むペプ
チドを示す。「誘導体」の語は、オリゴペプチドの末端
カルボキシル基が、エステル化されて、特にメチル及び
エチルエステルなどの低級アルキルエステルを形成して
いるか；あるいはアミド、低級アルキルアミドもしくは
ジ−低級アルキルアミド、又はヒドラジドに変換されて
いる誘導体を示す。ヒドラジドが、好ましい誘導体であ
る。「低級」の語は、１〜６個の炭素原子を含む基を示
す。「塩基性アミノ酸」の語は、カルボキシル基よりも
より塩基性である基（アミノ、アミジノ又はグアニジノ
など）を含むアミノ酸を示す。このような塩基性アミノ
酸の例としては、α，β−ジアミノプロピオン酸、α，
γ−ジアミノ酪酸、リシン、アルギニン、オルニチン、
及びｐ−アミノフェニルアラニンなどの天然及び非天然
ジアミノ−モノカルボン酸が挙げられる。アミノ酸は、
Ｌ−もしくはＤ−体、又はラセミ体であることができ、
α，γ−ジアミノ酪酸、リシン及びオルニチンが、式
（Ｉ）の化合物の好ましいアミノ酸成分である。ポリヌ
クレオチドの例としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）
及びリボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられる。ポリヌクレオチ
ド以外のアニオン性巨大分子の例としては、リボ核タン
パク質などのタンパク質、及び免疫に使用するタンパク
質、例えばウイルス性タンパク質が挙げられる。
４２であることを示す。アシル基部分であるＲ1 は、直
鎖状又は分岐鎖状の、飽和又は不飽和のアシル基部分で
ある。好ましくは、アシル基部分Ｒ1 は、１２〜４０
個、特に１２〜２０個の炭素原子を含む。このようなア
シル基部分の例としては、ラウロイル、パルミトイル、
ステアロイル、オレオイル、及び（ＣＨ3 （ＣＨ2)n)2
ＣＨＣＯ−（ここで、ｎは、３〜１９の整数である）が
挙げられる。パルミトイル及びオレオイルが最も好まし
い。「オリゴペプチド」の語は、少なくとも１個の塩基
性アミノ酸を含む、２０個まで、好ましくは１０個ま
で、より好ましくは２〜６個のアミノ酸残基を含むペプ
チドを示す。「誘導体」の語は、オリゴペプチドの末端
カルボキシル基が、エステル化されて、特にメチル及び
エチルエステルなどの低級アルキルエステルを形成して
いるか；あるいはアミド、低級アルキルアミドもしくは
ジ−低級アルキルアミド、又はヒドラジドに変換されて
いる誘導体を示す。ヒドラジドが、好ましい誘導体であ
る。「低級」の語は、１〜６個の炭素原子を含む基を示
す。「塩基性アミノ酸」の語は、カルボキシル基よりも
より塩基性である基（アミノ、アミジノ又はグアニジノ
など）を含むアミノ酸を示す。このような塩基性アミノ
酸の例としては、α，β−ジアミノプロピオン酸、α，
γ−ジアミノ酪酸、リシン、アルギニン、オルニチン、
及びｐ−アミノフェニルアラニンなどの天然及び非天然
ジアミノ−モノカルボン酸が挙げられる。アミノ酸は、
Ｌ−もしくはＤ−体、又はラセミ体であることができ、
α，γ−ジアミノ酪酸、リシン及びオルニチンが、式
（Ｉ）の化合物の好ましいアミノ酸成分である。ポリヌ
クレオチドの例としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）
及びリボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられる。ポリヌクレオチ
ド以外のアニオン性巨大分子の例としては、リボ核タン
パク質などのタンパク質、及び免疫に使用するタンパク
質、例えばウイルス性タンパク質が挙げられる。
【０００９】本発明において使用されるＤＮＡの例とし
ては、プラスミド及び遺伝子、特にそれに対する遺伝子
療法計画が着手されているもの（嚢胞性線維症のトラン
スメンブラン調節物質（ＣＦＴＲ）、アデノシンデアミ
ナーゼ（ＡＤＡ）、チミジンキナーゼ（ｔｋ）及びＨＬ
Ａ Ｂ７など）；並びにレポーター遺伝子（β−ガラク
トシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールト
ランスフェラーゼ、及びα−１ アンチトリプシンな
ど）が挙げられる。
ては、プラスミド及び遺伝子、特にそれに対する遺伝子
療法計画が着手されているもの（嚢胞性線維症のトラン
スメンブラン調節物質（ＣＦＴＲ）、アデノシンデアミ
ナーゼ（ＡＤＡ）、チミジンキナーゼ（ｔｋ）及びＨＬ
Ａ Ｂ７など）；並びにレポーター遺伝子（β−ガラク
トシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールト
ランスフェラーゼ、及びα−１ アンチトリプシンな
ど）が挙げられる。
【００１０】ＤＮＡのその他の例としては、アンチセン
ス、アプタメール(aptamer) 又は「三重らせん」剤とし
て使用されているオリゴデオキシヌクレオチド及びその
アナログが挙げられる。ＲＮＡの例としては、リボザイ
ム又はオリゴリボヌクレオチドアンチセンス分子が挙げ
られる。
ス、アプタメール(aptamer) 又は「三重らせん」剤とし
て使用されているオリゴデオキシヌクレオチド及びその
アナログが挙げられる。ＲＮＡの例としては、リボザイ
ム又はオリゴリボヌクレオチドアンチセンス分子が挙げ
られる。
【００１１】本発明において使用される式（Ｉ）の化合
物の例としては、Ｎα−パルミトイル−Ｌ−リシル−Ｌ
−リシン並びにそのメチル及びエチルエステル；Ｎγ−
パルミトイル−Ｄ−（α，γ−ジアミノブチリル）−Ｌ
−（α，γ−ジアミノ酪酸）ヒドラジド；及びＮγ−パ
ルミトイル−Ｄ−（α，γ−ジアミノブチリル）−Ｄ−
（α，γ−ジアミノブチリル）−Ｌ−（α，γ−ジアミ
ノ酪酸）ヒドラジドが挙げられる。式（Ｉ）の化合物
は、それ自体公知である（Helv. Chim. Acta 47(1964)
p. 526-543 を参照）。
物の例としては、Ｎα−パルミトイル−Ｌ−リシル−Ｌ
−リシン並びにそのメチル及びエチルエステル；Ｎγ−
パルミトイル−Ｄ−（α，γ−ジアミノブチリル）−Ｌ
−（α，γ−ジアミノ酪酸）ヒドラジド；及びＮγ−パ
ルミトイル−Ｄ−（α，γ−ジアミノブチリル）−Ｄ−
（α，γ−ジアミノブチリル）−Ｌ−（α，γ−ジアミ
ノ酪酸）ヒドラジドが挙げられる。式（Ｉ）の化合物
は、それ自体公知である（Helv. Chim. Acta 47(1964)
p. 526-543 を参照）。
【００１２】トランスフェクションされる細胞の特性
は、狭義に限定されるものではない。細胞は、原核又は
真核細胞、哺乳類又は植物細胞であることができる。
は、狭義に限定されるものではない。細胞は、原核又は
真核細胞、哺乳類又は植物細胞であることができる。
【００１３】本発明により細胞を、例えばＤＮＡ又はＲ
ＮＡによりトランスフェクションするには、式（Ｉ）の
化合物と、ＤＮＡ又はＲＮＡの比は、正に電荷している
式（Ｉ）の化合物と、負に電荷しているＤＮＡ又はＲＮ
Ａとの間の＋／−電荷比が、好ましくは０．１〜１０、
より好ましくは０．５〜５である程度とする。
ＮＡによりトランスフェクションするには、式（Ｉ）の
化合物と、ＤＮＡ又はＲＮＡの比は、正に電荷している
式（Ｉ）の化合物と、負に電荷しているＤＮＡ又はＲＮ
Ａとの間の＋／−電荷比が、好ましくは０．１〜１０、
より好ましくは０．５〜５である程度とする。
【００１４】本発明の好ましい面においては、トランス
フェクションは、ヘルパー脂質及び／又は短鎖リン脂質
及び／又はその他の公知の少なくとも１個のトランスフ
ェクションコンピテント分子の存在下で行う。ヘルパー
脂質の例としては、ホスファチジルコリンもしくはホス
ファチジルエタノールアミン又はその混合物などのリン
脂質が挙げられる。好ましいヘルパー脂質は、ジオレオ
イルホスファチジルエタノールアミンなどのホスファチ
ジルエタノールアミンである。短鎖リン脂質の例として
は、２個のＣ6-12脂肪酸残基を有するホスファチジルコ
リンが挙げられる。好ましい短鎖リン脂質は、ジカプロ
イル−及びジカプリロイルホスファチジルコリンであ
る。ヘルパー脂質及び／又は短鎖リン脂質は、リポソー
ム、混合ミセル、有機溶液、又は水性分散液の形態であ
るのが適当である。
フェクションは、ヘルパー脂質及び／又は短鎖リン脂質
及び／又はその他の公知の少なくとも１個のトランスフ
ェクションコンピテント分子の存在下で行う。ヘルパー
脂質の例としては、ホスファチジルコリンもしくはホス
ファチジルエタノールアミン又はその混合物などのリン
脂質が挙げられる。好ましいヘルパー脂質は、ジオレオ
イルホスファチジルエタノールアミンなどのホスファチ
ジルエタノールアミンである。短鎖リン脂質の例として
は、２個のＣ6-12脂肪酸残基を有するホスファチジルコ
リンが挙げられる。好ましい短鎖リン脂質は、ジカプロ
イル−及びジカプリロイルホスファチジルコリンであ
る。ヘルパー脂質及び／又は短鎖リン脂質は、リポソー
ム、混合ミセル、有機溶液、又は水性分散液の形態であ
るのが適当である。
【００１５】トランスフェクションのコンピテント分子
の例としては、J.B. Behr がBioconjugate Chem. 5:382
-389 (1994) に、そしてX. Gao及びL. HuangがGene The
r. 2:710-722 (1995) に記載しているようなカチオン性
脂質；A.V. Kabanov及びV.A.KabanovがBioconjugate Ch
em. 6:7-20 (1995)に記載しているようなポリカチオ
ン；F.D. Ledley がHuman Gene Therapy 6:1129-1144
(1995) に記載しているようなペプチド及びポリマー並
びにその他の非ウイルス性遺伝子送達システムが挙げら
れる。
の例としては、J.B. Behr がBioconjugate Chem. 5:382
-389 (1994) に、そしてX. Gao及びL. HuangがGene The
r. 2:710-722 (1995) に記載しているようなカチオン性
脂質；A.V. Kabanov及びV.A.KabanovがBioconjugate Ch
em. 6:7-20 (1995)に記載しているようなポリカチオ
ン；F.D. Ledley がHuman Gene Therapy 6:1129-1144
(1995) に記載しているようなペプチド及びポリマー並
びにその他の非ウイルス性遺伝子送達システムが挙げら
れる。
【００１６】本発明は、別の面においては、少なくとも
１個の上記で定義した式（Ｉ）の化合物、ポリヌクレオ
チド又はその他のアニオン性巨大分子、そして場合によ
り上記で定義したヘルパー脂質及び／又は短鎖リン脂質
及び／又はその他の公知のトランスフェクションコンピ
テント分子を含む組成物に関する。また別の面において
は、本発明は、上記で定義した式（Ｉ）の化合物、並び
にヘルパー脂質及び／又は短鎖リン脂質を含む組成物、
更には式（Ｉ）の化合物及びヘルパー脂質を含む組成物
に関する。ここで用いるヘルパー脂質の例としては、ホ
スファチジルコリン又はホスファチジルエタノールアミ
ンが挙げられる。
１個の上記で定義した式（Ｉ）の化合物、ポリヌクレオ
チド又はその他のアニオン性巨大分子、そして場合によ
り上記で定義したヘルパー脂質及び／又は短鎖リン脂質
及び／又はその他の公知のトランスフェクションコンピ
テント分子を含む組成物に関する。また別の面において
は、本発明は、上記で定義した式（Ｉ）の化合物、並び
にヘルパー脂質及び／又は短鎖リン脂質を含む組成物、
更には式（Ｉ）の化合物及びヘルパー脂質を含む組成物
に関する。ここで用いるヘルパー脂質の例としては、ホ
スファチジルコリン又はホスファチジルエタノールアミ
ンが挙げられる。
【００１７】本発明を実施するに当たり、適量の式
（Ｉ）の化合物を、適当には水溶液中、トランスフェク
ションする分子（例えば、プラスミドＤＮＡ）に加え
る。次に、ヘルパー脂質、そして所望であれば、短鎖リ
ン脂質及び／又はその他の公知のトランスフェクション
コンピテント分子を、リポソーム、混合ミセル、又は有
機溶液もしくは水性分散液のいずれかの形で加える。あ
るいは、トランスフェクションする分子を、式（Ｉ）の
化合物、ヘルパー脂質、そして所望であれば、短鎖リン
脂質及び／又はその他の公知のトランスフェクションコ
ンピテント分子を含む組成物に加えてもよい。本組成物
は、固体、液体、半固体、又はエーロゾルの形であるこ
とができ、適当には、リポソーム、混合ミセル、又は有
機溶液もしくは水性分散液の形であることができる。
（Ｉ）の化合物を、適当には水溶液中、トランスフェク
ションする分子（例えば、プラスミドＤＮＡ）に加え
る。次に、ヘルパー脂質、そして所望であれば、短鎖リ
ン脂質及び／又はその他の公知のトランスフェクション
コンピテント分子を、リポソーム、混合ミセル、又は有
機溶液もしくは水性分散液のいずれかの形で加える。あ
るいは、トランスフェクションする分子を、式（Ｉ）の
化合物、ヘルパー脂質、そして所望であれば、短鎖リン
脂質及び／又はその他の公知のトランスフェクションコ
ンピテント分子を含む組成物に加えてもよい。本組成物
は、固体、液体、半固体、又はエーロゾルの形であるこ
とができ、適当には、リポソーム、混合ミセル、又は有
機溶液もしくは水性分散液の形であることができる。
【００１８】成分、つまり式（Ｉ）の化合物、トランス
フェクションする分子、そして場合により付加する成分
の間の最適比率は、トランスフェクションされる細胞に
よって異なる。式（Ｉ）の化合物及びトランスフェクシ
ョンする分子の間の最適＋／−電荷比は、０．１〜１
０、好ましくは０．５〜５の間で変化させることができ
る。式（Ｉ）の化合物及びヘルパー脂質の間の最適モル
比は、０．１〜５０、好ましくは１〜１０である。ヘル
パー脂質及び短鎖リン脂質の間の最適モル比は、２〜２
０である。式（Ｉ）の化合物及び付加的トランスフェク
ションコンピテント分子の間の最適モル比は、０．１〜
１０である。
フェクションする分子、そして場合により付加する成分
の間の最適比率は、トランスフェクションされる細胞に
よって異なる。式（Ｉ）の化合物及びトランスフェクシ
ョンする分子の間の最適＋／−電荷比は、０．１〜１
０、好ましくは０．５〜５の間で変化させることができ
る。式（Ｉ）の化合物及びヘルパー脂質の間の最適モル
比は、０．１〜５０、好ましくは１〜１０である。ヘル
パー脂質及び短鎖リン脂質の間の最適モル比は、２〜２
０である。式（Ｉ）の化合物及び付加的トランスフェク
ションコンピテント分子の間の最適モル比は、０．１〜
１０である。
【００１９】トランスフェクションのためには、上記で
定義した式（Ｉ）の化合物、ポリヌクレオチド又はその
他のアニオン性巨大分子、そして場合により上記で定義
したヘルパー脂質及び／又は短鎖リン脂質及び／又はそ
の他の公知のトランスフェクションコンピテント分子を
含む組成物を、細胞に加える。動物又はヒト患者の細胞
をトランスフェクションするには、本組成物を、経口、
非経口（静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮膚内投
与、腹腔内投与）、経皮、肺内、鼻腔内、直腸内、眼
内、心室内、血管内（カテーテル）、又は腫瘍内経路に
より投与することができる。更に、本組成物は、皮膚表
面に高速埋伏(impaction) 投与することもできる。
定義した式（Ｉ）の化合物、ポリヌクレオチド又はその
他のアニオン性巨大分子、そして場合により上記で定義
したヘルパー脂質及び／又は短鎖リン脂質及び／又はそ
の他の公知のトランスフェクションコンピテント分子を
含む組成物を、細胞に加える。動物又はヒト患者の細胞
をトランスフェクションするには、本組成物を、経口、
非経口（静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮膚内投
与、腹腔内投与）、経皮、肺内、鼻腔内、直腸内、眼
内、心室内、血管内（カテーテル）、又は腫瘍内経路に
より投与することができる。更に、本組成物は、皮膚表
面に高速埋伏(impaction) 投与することもできる。
【００２０】トランスフェクションの進行は、当業者に
公知のプロトコールを適宜試験することによって測定す
ることができる。
公知のプロトコールを適宜試験することによって測定す
ることができる。
【００２１】
【実施例】以下に記載する実施例は、本発明を説明する
ものであるが、本発明を限定するものではない。 実施例１ ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰ
Ｅ、Avanti Polar Lipids Inc.）のクロロホルム溶液を
真空下で乾燥し、そしてこの脂質膜を３０mM Tris Cl
（pH８．５）で再水和することによって、ジオレオイル
ホスファチジルエタノールアミンのリポソームを調製し
た。脂質の最終濃度は、２mMであった。次に、脂質分散
液を超音波処理浴(sonicator bath, Elgasonic, ５０kH
z)中、１０〜１５分間超音波処理した。
ものであるが、本発明を限定するものではない。 実施例１ ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰ
Ｅ、Avanti Polar Lipids Inc.）のクロロホルム溶液を
真空下で乾燥し、そしてこの脂質膜を３０mM Tris Cl
（pH８．５）で再水和することによって、ジオレオイル
ホスファチジルエタノールアミンのリポソームを調製し
た。脂質の最終濃度は、２mMであった。次に、脂質分散
液を超音波処理浴(sonicator bath, Elgasonic, ５０kH
z)中、１０〜１５分間超音波処理した。
【００２２】プラスミドＤＮＡ２０μg を、ポリスチレ
ン製滅菌チューブ中、蒸留滅菌水２６０μl で希釈し
た。次に、Ｎγ−パルミトイル−Ｄ−（α，γ−ジアミ
ノブチリル）−Ｌ−（α，γ−ジアミノ酪酸）ヒドラジ
ド５６nmol（３５．２μg)を加えて、Ｎγ−パルミトイ
ル−Ｄ−（α，γ−ジアミノブチリル）−Ｌ−（α，γ
−ジアミノ酪酸）ヒドラジドとＤＮＡとの＋／−電荷比
を２：１とした。ＤＯＰＥリポソーム１４０μl を１滴
づつ徐々に加えて、ＤＯＰＥとＮγ−パルミトイル−Ｄ
−（α，γ−ジアミノブチリル）−Ｌ−（α，γ−ジア
ミノ酪酸）ヒドラジドのモル比を５：１とした。得られ
た複合体を慎重に混合した。調製物を室温で約５分間放
置し、次に９６ウエルプレート内で増殖中のＣＯＳ−１
細胞に加えた。
ン製滅菌チューブ中、蒸留滅菌水２６０μl で希釈し
た。次に、Ｎγ−パルミトイル−Ｄ−（α，γ−ジアミ
ノブチリル）−Ｌ−（α，γ−ジアミノ酪酸）ヒドラジ
ド５６nmol（３５．２μg)を加えて、Ｎγ−パルミトイ
ル−Ｄ−（α，γ−ジアミノブチリル）−Ｌ−（α，γ
−ジアミノ酪酸）ヒドラジドとＤＮＡとの＋／−電荷比
を２：１とした。ＤＯＰＥリポソーム１４０μl を１滴
づつ徐々に加えて、ＤＯＰＥとＮγ−パルミトイル−Ｄ
−（α，γ−ジアミノブチリル）−Ｌ−（α，γ−ジア
ミノ酪酸）ヒドラジドのモル比を５：１とした。得られ
た複合体を慎重に混合した。調製物を室温で約５分間放
置し、次に９６ウエルプレート内で増殖中のＣＯＳ−１
細胞に加えた。
【００２３】式（Ｉ）の他の化合物についても、同様の
調製操作を行った。
調製操作を行った。
【００２４】各種化合物のトランスフェクション効率を
第１表に示す。
第１表に示す。
【００２５】細胞を、β−ガラクトシダーゼをコードす
るプラスミドでトランスフェクションし、トランスフェ
クションの４８時間後、β−ガラクトシダーゼ活性を測
定した。結果を、トランスフェクションウエル当たりの
β−ガラクトシダーゼのμ単位で表示した。
るプラスミドでトランスフェクションし、トランスフェ
クションの４８時間後、β−ガラクトシダーゼ活性を測
定した。結果を、トランスフェクションウエル当たりの
β−ガラクトシダーゼのμ単位で表示した。
【００２６】実施例１に記載のように配合した式（Ｉ）
の化合物のＣＯＳ−１細胞におけるトランスフェクショ
ンの効率
の化合物のＣＯＳ−１細胞におけるトランスフェクショ
ンの効率
【００２７】
【表１】
【００２８】
【表２】
【００２９】実施例２ ＤＯＰＥ（２μmol)及びジカプロイルホスファチジルコ
リン（１５μmol)を真空下で乾燥し、次にこの脂質膜
を、３０mM Tris Cl緩衝液（pH８．５）１mlで再水和す
ることによって、これらの脂質の混合ミセルを調製し
た。プラスミドｐＣＨ１１０ ２０μg をポリスチレン
製滅菌チューブ中、蒸留水２６０μl で希釈した。次
に、Ｎγ−パルミトイル−Ｄ−（α，γ−ジアミノブチ
リル）−Ｌ−（α，γ−ジアミノ酪酸）ヒドラジド５６
nmol（３５．２μg)を加えて、Ｎγ−パルミトイル−Ｄ
−（α，γ−ジアミノブチリル）−Ｌ−（α，γ−ジア
ミノ酪酸）ヒドラジドとＤＮＡとの間の＋／−電荷比を
２：１とした。ＤＯＰＥ／ジカプロイルホスファチジル
コリン混合ミセル１４０μl を徐々に加えて、ＤＯＰＥ
とＮγ−パルミトイル−Ｄ−（α，γ−ジアミノブチリ
ル）−Ｌ−（α，γ−ジアミノ酪酸）ヒドラジドとの間
のモル比を５：１とした。得られた複合体を慎重に混合
した。調製物を室温で約５分間放置し、次に９６ウエル
プレート中で増殖中のＣＯＳ−１細胞に加えた。
リン（１５μmol)を真空下で乾燥し、次にこの脂質膜
を、３０mM Tris Cl緩衝液（pH８．５）１mlで再水和す
ることによって、これらの脂質の混合ミセルを調製し
た。プラスミドｐＣＨ１１０ ２０μg をポリスチレン
製滅菌チューブ中、蒸留水２６０μl で希釈した。次
に、Ｎγ−パルミトイル−Ｄ−（α，γ−ジアミノブチ
リル）−Ｌ−（α，γ−ジアミノ酪酸）ヒドラジド５６
nmol（３５．２μg)を加えて、Ｎγ−パルミトイル−Ｄ
−（α，γ−ジアミノブチリル）−Ｌ−（α，γ−ジア
ミノ酪酸）ヒドラジドとＤＮＡとの間の＋／−電荷比を
２：１とした。ＤＯＰＥ／ジカプロイルホスファチジル
コリン混合ミセル１４０μl を徐々に加えて、ＤＯＰＥ
とＮγ−パルミトイル−Ｄ−（α，γ−ジアミノブチリ
ル）−Ｌ−（α，γ−ジアミノ酪酸）ヒドラジドとの間
のモル比を５：１とした。得られた複合体を慎重に混合
した。調製物を室温で約５分間放置し、次に９６ウエル
プレート中で増殖中のＣＯＳ−１細胞に加えた。
【００３０】β−ガラクトシダーゼ活性として示され
た、ＣＯＳ−１細胞のトランスフェクションの効率は、
ウエル当たりのＤＮＡ０．２μg 及び１μg について、
ウエル当たりそれぞれ７，２８０及び６，３７５μ単位
であった。
た、ＣＯＳ−１細胞のトランスフェクションの効率は、
ウエル当たりのＤＮＡ０．２μg 及び１μg について、
ウエル当たりそれぞれ７，２８０及び６，３７５μ単位
であった。
【００３１】実施例３ Ｎγ−パルミトイル−Ｄ−（α，γ−ジアミノブチリ
ル）−Ｌ−（α，γ−ジアミノ酪酸）ヒドラジド５６nm
ol（３５．２μg)を、実施例１で調製したＤＯＰＥリポ
ソームの５倍モル量（２８０nmol）と混合した。混合物
を、蒸留水２６０μl 中、プラスミドＤＮＡ２０μg に
加えて、Ｎγ−パルミトイル−Ｄ−（α，γ−ジアミノ
ブチリル）−Ｌ−（α，γ−ジアミノ酪酸）ヒドラジド
とプラスミドＤＮＡとの間の＋／−電荷比を２：１とし
た。得られた複合体を慎重に混合した。調製物を室温で
約５分間放置し、次に９６ウエルプレート中で増殖中の
ＣＯＳ−１細胞に加えた。
ル）−Ｌ−（α，γ−ジアミノ酪酸）ヒドラジド５６nm
ol（３５．２μg)を、実施例１で調製したＤＯＰＥリポ
ソームの５倍モル量（２８０nmol）と混合した。混合物
を、蒸留水２６０μl 中、プラスミドＤＮＡ２０μg に
加えて、Ｎγ−パルミトイル−Ｄ−（α，γ−ジアミノ
ブチリル）−Ｌ−（α，γ−ジアミノ酪酸）ヒドラジド
とプラスミドＤＮＡとの間の＋／−電荷比を２：１とし
た。得られた複合体を慎重に混合した。調製物を室温で
約５分間放置し、次に９６ウエルプレート中で増殖中の
ＣＯＳ−１細胞に加えた。
【００３２】β−ガラクトシダーゼ活性として示され
た、ＣＯＳ−１細胞のトランスフェクション効率は、ウ
エル当たりのＤＮＡ０．２μg 及び１μg について、ウ
エル当たりそれぞれ４，２０５及び７，８８０μ単位で
あった。
た、ＣＯＳ−１細胞のトランスフェクション効率は、ウ
エル当たりのＤＮＡ０．２μg 及び１μg について、ウ
エル当たりそれぞれ４，２０５及び７，８８０μ単位で
あった。
【００３３】実施例４ 実施例１に記載したように、Ｎγ−パルミトイル−Ｄ−
（α，γ−ジアミノブチリル）−Ｌ−（α，γ−ジアミ
ノ酪酸）ヒドラジド（化合物Ａ）によるトランスフェク
ション複合体を調製した。また、製造業者の指示に従っ
て、リポフェクタミン複合体を調製した。両方のシステ
ムのトランスフェクション効率を、ルシフェラーゼをコ
ードするベクターを用いて、各種細胞株で比較した。結
果を第２表に示す。
（α，γ−ジアミノブチリル）−Ｌ−（α，γ−ジアミ
ノ酪酸）ヒドラジド（化合物Ａ）によるトランスフェク
ション複合体を調製した。また、製造業者の指示に従っ
て、リポフェクタミン複合体を調製した。両方のシステ
ムのトランスフェクション効率を、ルシフェラーゼをコ
ードするベクターを用いて、各種細胞株で比較した。結
果を第２表に示す。
【００３４】細胞を、ルシフェラーゼをコードするプラ
スミドでトランスフェクションし、トランスフェクショ
ンの４８時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。結
果は、相対的光単位で表示した。
スミドでトランスフェクションし、トランスフェクショ
ンの４８時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。結
果は、相対的光単位で表示した。
【００３５】
【表３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アンドレアス・ズーペルザクソ スイス国、ツェーハー−4052 バーゼル、 ゲレルトシュトラーセ 32 (72)発明者 アーノルド・トルツェチアク ドイツ連邦共和国、デー−79650 ショッ プフハイム、タルシュトラーセ 54
Claims (4)
- 【請求項１】 式（Ｉ）： Ｒ1 −ＮＨ−Ａ （式中、Ｒ1 は、Ｃ10-42 の脂肪族アシル基であり、Ｎ
Ｈ−Ａは、オリゴペプチド残基である）で示される化合
物又はその誘導体を含む、ポリヌクレオチド又はその他
のアニオン性巨大分子により細胞をトランスフェクショ
ンするための担体。 - 【請求項２】 更にヘルパー脂質の存在下で、トランス
フェクションを行う、請求項１記載の担体。 - 【請求項３】 少なくとも１つの請求項１記載の式
（Ｉ）の化合物、ポリヌクレオチド又はその他のアニオ
ン性巨大分子、並びに場合によりヘルパー脂質及び／又
は短鎖リン脂質を含む組成物。 - 【請求項４】 請求項１記載の式（Ｉ）の化合物及びヘ
ルパー脂質を含む組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP95118338 | 1995-11-22 | ||
| CH95118338.3 | 1995-11-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09173067A true JPH09173067A (ja) | 1997-07-08 |
Family
ID=8219828
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8307745A Pending JPH09173067A (ja) | 1995-11-22 | 1996-11-19 | 細胞のトランスフェクション |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5759827A (ja) |
| EP (1) | EP0775751A3 (ja) |
| JP (1) | JPH09173067A (ja) |
| CN (1) | CN1158898A (ja) |
| AR (1) | AR004727A1 (ja) |
| CA (1) | CA2190706A1 (ja) |
| MX (1) | MX9605737A (ja) |
| TR (1) | TR199600902A2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999033787A1 (fr) * | 1997-12-26 | 1999-07-08 | Kureha Chemical Industry Co., Ltd. | Derives d'acides amines |
| JP2011509074A (ja) * | 2007-12-19 | 2011-03-24 | オズ ビオスイヤーンス | 活性剤を細胞内に輸送するためのカチオン性脂質の新規なクラス |
| US8853167B2 (en) | 2010-02-23 | 2014-10-07 | Nanocarrier Co., Ltd. | Short-chain cationic polyamino acid and use thereof |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6093816A (en) * | 1996-06-27 | 2000-07-25 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Cationic lipids |
| EP0834572A3 (en) * | 1996-10-02 | 1999-08-25 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Alpha, gamma-diaminobutyric acid (DAB) containing oligopeptide derivatives |
| TWI242014B (en) * | 1998-11-18 | 2005-10-21 | Hisamitsu Pharmaceutical Co | Nucleic acid carriers and pharmaceutical compositions for gene therapy |
| US20030148929A1 (en) * | 1998-11-18 | 2003-08-07 | Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. | Nucleic acid carriers and pharmaceutical compositions for gene therapy |
| US20010048940A1 (en) * | 1999-06-18 | 2001-12-06 | Jennifer D. Tousignant | Cationic amphiphile micellar complexes |
| JP2001323059A (ja) * | 2000-05-18 | 2001-11-20 | Hisamitsu Pharmaceut Co Inc | ポリペプチド誘導体および核酸運搬体 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU681192B2 (en) * | 1993-09-28 | 1997-08-21 | Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. | Polyamino acid oligonucleotide carrier |
| FR2719316B1 (fr) * | 1994-04-28 | 1996-05-31 | Idm | Nouveaux complexes d'acide nucléique et de polymère, leur procédé de préparation et leur utilisation pour la transfection de cellules. |
| AUPM747694A0 (en) * | 1994-08-16 | 1994-09-08 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Delivery of nucleic acids and peptides |
-
1996
- 1996-11-13 EP EP96118180A patent/EP0775751A3/en not_active Withdrawn
- 1996-11-14 TR TR96/00902A patent/TR199600902A2/xx unknown
- 1996-11-19 CA CA002190706A patent/CA2190706A1/en not_active Abandoned
- 1996-11-19 JP JP8307745A patent/JPH09173067A/ja active Pending
- 1996-11-20 AR ARP960105265A patent/AR004727A1/es unknown
- 1996-11-20 CN CN96121733.2A patent/CN1158898A/zh active Pending
- 1996-11-20 US US08/752,129 patent/US5759827A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-21 MX MX9605737A patent/MX9605737A/es unknown
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999033787A1 (fr) * | 1997-12-26 | 1999-07-08 | Kureha Chemical Industry Co., Ltd. | Derives d'acides amines |
| JP2011509074A (ja) * | 2007-12-19 | 2011-03-24 | オズ ビオスイヤーンス | 活性剤を細胞内に輸送するためのカチオン性脂質の新規なクラス |
| US8853167B2 (en) | 2010-02-23 | 2014-10-07 | Nanocarrier Co., Ltd. | Short-chain cationic polyamino acid and use thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2190706A1 (en) | 1997-05-23 |
| MX9605737A (es) | 1997-05-31 |
| CN1158898A (zh) | 1997-09-10 |
| TR199600902A2 (tr) | 1997-06-21 |
| EP0775751A2 (en) | 1997-05-28 |
| AR004727A1 (es) | 1999-03-10 |
| US5759827A (en) | 1998-06-02 |
| EP0775751A3 (en) | 1998-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6271208B1 (en) | Process of making cationic lipid-nucleic acid complexes | |
| US6110745A (en) | Preparation of lipid-nucleic acid particles using a solvent extraction and direct hydration method | |
| US5945400A (en) | Nucleic acid-containing composition, preparation and use thereof | |
| CA2200952C (en) | Novel compositions comprising quaternary ammonium compounds and neutral lipids for the introduction of polyanionic materials into cells | |
| KR100447517B1 (ko) | 형질감염제로서리포폴리아민및이의약학적용도 | |
| EP0783296B1 (en) | Novel compositions for the introduction of polyanionic materials into cells | |
| AU727204B2 (en) | Glycerolipid compounds useful for the transfer of an active substance into a target cell | |
| WO2000030444A1 (en) | Cationic liposomes for gene transfer | |
| AU731503B2 (en) | Cationic amphiphile compositions for intracellular delivery of therapeutic molecules | |
| EP0784984B1 (en) | Transfection competent molecules | |
| JPH09173067A (ja) | 細胞のトランスフェクション | |
| EP1938843A1 (en) | Lipids and lipid assemblies comrising transfection enhancer elements | |
| US6521252B1 (en) | Transfecting compounds which are sensitive to reducing conditions, pharmaceutical compositions containing them and their applications | |
| JP3961601B2 (ja) | トランスフェクション能を有する分子 | |
| JP2002510706A (ja) | Ｄｎａトランスフェクションのための新規化合物 | |
| Kisoon et al. | A novel cationic cholesterol derivative, its formulation into liposomes, and the efficient transfection of the transformed human cell lines HepG2 and HeLa | |
| JP2004159504A (ja) | ポリアミドアミンデンドロンを含む遺伝子導入剤組成物 | |
| Legendre et al. | N-Acyl-(α, γ diaminobutyric acid) n hydrazide as an efficient gene transfer vector in mammalian cells in culture | |
| US20020193331A1 (en) | Non-naturally occurring nucleic acid compositions, their use for the preparation of formulations useful for transfecting a nucleic acid into cells and applications | |
| EP0834572A2 (en) | Alpha, gamma-diaminobutyric acid (DAB) containing oligopeptide derivatives | |
| MXPA97000387A (es) | Moleculas competentes para transfeccion | |
| EP1141365A1 (en) | Method for preparing suspension of stable posiplexes | |
| JPH10147595A (ja) | オリゴペプチド誘導体 |