JPH10510813A - 治療分子の細胞内送達のためのカチオン性両親媒性化合物およびプラスミド - Google Patents

治療分子の細胞内送達のためのカチオン性両親媒性化合物およびプラスミド

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JPH10510813A
JPH10510813A JP8519236A JP51923696A JPH10510813A JP H10510813 A JPH10510813 A JP H10510813A JP 8519236 A JP8519236 A JP 8519236A JP 51923696 A JP51923696 A JP 51923696A JP H10510813 A JPH10510813 A JP H10510813A
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リー，エドワード・アール
ハッバード，シャーリー・シー
チョン，ソン・エイチ
イーストマン，サイモン・ジェイ
マーシャル，ジョン
シュール，ロナルド・ケイ
ユー，ネルソン・エス
レイン，マシーユ・ビー
ロウ，エリック・エイ
バグリー，レベッカ・ジー
チャン，チョー−ダン
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Abstract

(57)【要約】 生物学的に活性のある（治療的）分子の細胞中への輸送を容易にする新規カチオン性両親媒性化合物が提供される。本発明両親媒性化合物は、ステロイド、モノもしくはジアルキルアミン、またはアルキルもしくはアシル基から誘導された親油性基；およびアミン、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンから誘導された生理学的ｐＨにおいてプロトン化しうるカチオン性基を含む。典型的には、１種またはそれ以上の両親媒性化合物の分散物を治療分子と接触させることにより調製される治療組成物も提供される。本発明により細胞中に送達される治療分子はＤＮＡ、ＲＮＡおよびポリペプチドを包含する。本発明治療組成物の典型的な使用は、遺伝子治療の提供、アンチセンスポリヌクレオチドまたは生物学的に活性のあるポリペプチドの細胞への送達を包含する。遺伝子治療用治療組成物に関しては、典型的には、ＤＮＡはカチオン性両親媒性化合物と複合体形成するプラスミドの形態で提供される。新規かつ非常に効果的なプラスミド構築物も開示され、それには炎症を併発した臨床的症状に対する遺伝子治療を提供することにおいて特に効果的な構築物が包含される。さらに、治療組成物の静脈内投与による遺伝子治療のための器官の標的化も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 治療分子の細胞内送達のためのカチオン性両親媒性化合物およびプラスミド 発明の背景 本発明は、生物学的に活性のある（治療）分子の細胞内送達を容易にする新規 カチオン性両親媒性化合物に関する。また本発明は、かかる両親媒性化合物を含 んでなる医薬組成物であって、治療上有効量の生物学的活性を有する分子の患者 細胞中への送達に有用な医薬組成物にも関する。本発明新規カチオン性両親媒性 化合物は、遺伝子治療において特に有用である。 多くのタイプの生物学的に活性のある分子の有効な治療的使用は行われていな い。治療上有効量のかかる物質をそれを用いる治療が有益である患者細胞中に送 達する方法がないという単純な理由からである。治療上有効量のかかる分子の細 胞中への有効な送達は、不可能でないにしても、しばしば困難であることがわか っている。なぜなら、例えば、細胞膜が選択透過性障壁を生じるからである。さ らに、生物学的に活性のある分子がうまく標的細胞に導入された場合でも、それ らは細胞質で直接分解されるか、または細胞中の構造体、例えば、分解過程を専 門に扱うライソソームコンパートメントに輸送されてしまう。よって、細胞に入 ることを許された物質の性質ならびに細胞内の標的領域（そこで治療有益性を発 揮しうるのであるが）に最終的に到達するその量のいずれもが厳しく制限されて いる。 一般的には、かかる選択性は、正しい細胞機能の維持に必要であるが、多くの 治療上価値のある物質（またはその物質の治療上有効量）が排除されてしまうと いう欠点にもなる。さらに、生物学的に活性のある分子の細胞内送達の標的であ る無傷の組織によって提供される複雑な構造、挙動および環境は、インビトロ培 養された細胞集団によって提供される場合と比較すると、しばしば、かかる送達 を実質的に妨害する。 患者組織に対して有効な標的化がなされている生物学的に活性のある分子の例 は：（１）免疫グロブリン蛋白を包含する多くの蛋白、（２）ゲノムＤＮＡ、ｃ ＤＮＡまたはｍＲＮＡのごときポリヌクレオチド、（３）アンチセンスポリヌク レオチド；および（４）ペプチドホルモンおよび抗生物質のごとき合成または天 然の多くの低分子化合物である。 医療従事者が現在直面している問題の１つは、多くの遺伝病に関連した（ある いは種々の癌を包含する疾病の危険性を有する）欠陥のある遺伝子が単離され特 徴づけられているが、患者にかかる遺伝子の正常なコピーを提供することによっ て疾病状態自体を直すための方法（遺伝子治療の方法）は実質的に不完全である ということである。したがって、その細胞内送達の改良法の開発は医学上大いに 重要である。遺伝子治療により治療されうると期待される疾病は、嚢胞性線維症 、ゴーシェ病、ファブリー病および筋ジストロフィーのごとき遺伝病を包含する 。治療されうる後天的疾病の典型例は：（１）癌に関しては−多発性ミエローマ 、白血病、メラノーマ、卵巣癌腫および小胞肺癌；（２）循環器系の症状に関し ては−進行性心臓疾患、再狭窄および血友病；（３）神経系の症状に関しては− 外傷性脳傷害である。 遺伝子治療には、患者の標的細胞へのトランスフェクションが成功することが 必要である。一般的には、トランスフェクションとは、発現可能なポリヌクレオ チド（例えば、遺伝子、ｃＤＮＡまたはそのパターンとなるｍＲＮＡ）を細胞中 に導入するプロセスであると定義される。コードしているポリヌクレオチドの発 現が成功すると、細胞中での正常蛋白の産生が起こり、異常な遺伝子に関連した 疾病状態が修正される。かかる蛋白を直接標的細胞に提供することに基づく療法 （蛋白置換療法）は、しばしば、上記理由により有効でない。 致命的でしかもありふれた遺伝子疾患である嚢胞性線維症は、遺伝子治療の標 的となる疾病の特別な例である。該疾病は、嚢胞性線維症トランスメンブランコ ンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）として知られ、肺上皮細胞を包含する 上皮細胞の細胞膜を通過するイオンの移動（それゆえ、体液の移動）を調節して いる蛋白をコードしている１つまたはそれ以上の変異の存在により引き起こされ る。気道細胞における異常なイオン輸送は異常な粘膜分泌、炎症および感染、組 織の損傷さらには最終的な死を引き起こす。 遺伝子治療は、ある種の疾病状態の長期にわたる予想可能な形態の治療を提供 するであろうと広く期待されており、多くの遺伝病に適した治療の唯一の形態で ある可能性がある。しかしながら、細胞内での治療効果に十分な濃度の機能的遺 伝子または他のかかる生物学的に活性のある治療分子の細胞中への導入を容易に し、しかもこの点に関して活性がインビボ送達に十分なものである化合物の開発 に対する大きな必要性が存在し続けている。 報告されている開発 生物学的に活性のある分子の細胞内送達を容易にするように設計された化合物 である限り、無極性環境および極性環境（例えば、細胞質膜、組織液、細胞内コ ンパートメントおよび生物学的に活性のある分子自体）のいずれとも相互作用し なければならず、典型的には、かかる化合物は極性ドメインおよび無極性ドメイ ンの両方を含むように設計される。かかる両ドメインを有する化合物は両親媒性 化合物といわれ、かかる細胞内送達における使用（インビトロ適用であってもイ ンビボ適用であっても）について開示された多くの脂質および合成脂質はこの目 的にかなう。かかる両親媒性化合物の特に重要な１のクラスはカチオン性両親媒 性化合物である。一般的には、カチオン性両親媒性化合物は、生理学的ｐＨまた はその付近において正に帯電しうる極性基を有しており、この特性は、例えば、 ＤＮＡのごとき負に帯電したポリヌクレオチドのような多くのタイプの生物学的 に活性のある（治療）分子と両親媒性化合物とがいかにして相互作用するのかを 決定することにおいて重要であると当該分野において理解されている。 極性ドメインおよび無極性ドメインの両方を有し、生物学的に活性のある分子 の細胞内送達に関して有用であると述べられているカチオン性両親媒性化合物の 例は、例えば、下記文献中に見いだされる。なお、下記文献は、（１）かかる適 用に適すると当該分野において理解されているかかる化合物の特性、および（２ ）かかる両親媒性化合物と細胞内送達を意図されている治療分子との複合体化に より形成されると当該分野において理解されている構造の性質に関する有用な議 論 も含んでいる： （１）Felgner,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413-7417(1987)には、ト ランスフェクション用の脂質／ＤＮＡ複合体の形成のためのＮ−［１（２,３− ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド （ＤＯＴＭＡ）を包含する正に帯電した合成カチオン性脂質の使用が開示されて いる。Felgner et al.,The Journal of Biological Chemistry,269(4),2550-256 1(1994)も参照。 （２）Behr et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,6982-6986(1989)には、ジオ クタデシルアミドログリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）を包含する多くの両親媒性 化合物が開示されている。 （３）Epandらに付与された米国特許第５,２８３,１８５号には、ＤＣ−コル （DC-chol）と命名された３β［Ｎ−（Ｎ1,Ｎ1−ジメチルアミノエタン）−カル バモイル］コレステロールを包含する両親媒性化合物のさらなるクラスおよび種 が記載されている。 （４）生物学的に活性のある分子の細胞中への輸送を容易にするさらなる化合 物は、Felgnerらに付与された米国特許第５,２６４,６１８号に開示されている 。後で議論されるＤＭＲＩＥ（１,２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメ チル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド）を包含するさらなる化合物の 開示についてはFelgner et al.,The Journal of Biological Chemistry,269(4), pp.2550-2561(1994)も参照。 （５）生物学的に活性のある分子の細胞内送達に適する両親媒性化合物につい ての言及は、Gebeyehuらに付与された米国特許第５,３３４,７６１号およびFelg ner et al.,Methods(Methods in Enzymology),5,67-75(1993)にも見いだされる 。 上記文献に述べられた化合物は、生物学的に活性のある分子の細胞中への導入 を容易にすることが示されているが（かかる多くの場合、インビトロのみにおい てであるが）、それによる取り込み効率は多くの治療的適用、特に、遺伝子治療 を支持するには不十分なものと考えられる。さらに、上記化合物は中庸の活性し か持たないことが理解されているので、大量に用いた場合にかかる化合物または その代謝物の毒性についての心配がある。 したがって、活性が十分でありそれを用いると治療がうまくいく「第２世代」 のカチオン性両親媒性化合物の開発が必要である。 発明の概要 本発明は、生物学的に活性のある分子の細胞中への輸送を容易にすることに特 に効果的であるカチオン性両親媒性化合物を提供する。本発明カチオン性両親媒 性化合物は、多くの両親媒性化合物が共有しているある種の構造的および機能的 特徴が見られるが、４つのグループに分けられる。 したがって、生物学的に活性のある分子の細胞中への輸送を容易にすることの できるグループＩ（図１、パネルＡ、ＢおよびＣ参照）のカチオン性両親媒性化 合物であって、構造式（Ｉ）： ［式中、Ｚはステロイド； Ｘは炭素原子または窒素原子； Ｙは短い結合基であるか、あるいはＹは不存在； Ｒ3はＨ、または飽和もしくは不飽和脂肪族基； Ｒ1は−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミン； Ｒ4はＨ、または飽和もしくは不飽和脂肪族基； Ｒ2は−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンであり； Ｒ1はＲ2と同じまたは異なるが、Ｒ1およびＲ2の両方ともが−ＮＨ−であるこ とはありえない］ を有する両親媒性化合物が提供される。 １の好ましい具体例において、ステロイド成分「Ｚ」は３−ステロール類から なる群より選択され、該ステロール分子はその３−Ｏ−基またはそれに代わるＮ −によってＹに結合している（あるいはＹが不存在の場合にはＸに直接結合）。 本発明のこの態様によれば、特に効果的な両親媒性化合物は、例えば、スペルミ ジンコレステロールカルバメート（Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメー ト、両親媒性化合物Ｎｏ.５３）およびスペルミンコレステロールカルバメート （Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメート、両親媒性化合物Ｎｏ.６７）およ びそれらにならった両親媒性化合物を包含する。 さらなる好ましい具体例において、ステロイド基は、ステロイド核の環の１７ 位から（図１および図２２参照）、または通常は多くのステロイド類の１７位か ら伸長しているアームから（図１のコレステロールの構造参照）、または該アー ムの短い形態から、Ｙに結合している（あるいはＹが不存在の場合にはＸに直接 結合）。 他の好ましい具体例において、結合基Ｙ中には約３個または４個までの原子が 含まれ、それら自体がＸとＹとの間の共有結合ブリッジを形成する。本発明の特 に好ましい具体例において、Ｙは、基の１個までの原子がＸおよびＺの両方との 結合を形成する結合基であるか、あるいはＹは不存在である。 グループＩにより提供される典型的な両親媒性化合物は以下のものを包含する： さらに、生物学的に活性のある分子の細胞中への輸送を容易にすることのでき るグループＩＩ（図５参照）のカチオン性両親媒性化合物であって、構造式（Ｉ Ｉ）： ［式中、Ｚはステロイド； Ｘは炭素原子または窒素原子； Ｙは結合基であるか、あるいはＹは不存在； Ｒ3はアミノ酸、誘導体化されたアミノ酸、Ｈまたはアルキル Ｒ1は−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミン； Ｒ4はアミノ酸、誘導体化されたアミノ酸、Ｈまたはアルキル； Ｒ2は−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミン； Ｒ1はＲ2と同じまたは異なるが、Ｒ1およびＲ2の両方ともが−ＮＨ−であるこ とはありえない］ を有する両親媒性化合物が提供される。 グループＩＩにより提供される典型的な両親媒性化合物は以下のものを包含す る： さらに、生物学的に活性のある分子の細胞中への輸送を容易にすることのでき るグループＩＩＩ（図６参照）のカチオン性両親媒性化合物であって、構造式（ ＩＩＩ）： ［式中、Ｚはアルキルアミンまたはジアルキルアミンであって、そのＮ原子によ ってＹに結合されているもの（あるいはＹが不存在の場合には直接Ｘに結合）で あ り；Ｚがジアルキルアミンである場合には、そのアルキル基は同じであっても異 なっていてもよく； Ｘは炭素原子または窒素原子； Ｙは短い結合基であるか、あるいはＹは不存在； Ｒ3はＨ、または飽和もしくは不飽和脂肪族基； Ｒ1は−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミン； Ｒ4はＨ、または飽和もしくは不飽和脂肪族基； Ｒ2は−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミン； Ｒ1はＲ2と同じまたは異なるが、Ｒ1およびＲ2の両方ともが−ＮＨ−であるこ とはありえない］ を有するカチオン性両親媒性化合物が提供される。 構造式（ＩＩＩ）により示される両親媒性化合物に関して、結合基Ｙ中に約３ 個または４個までの原子が含まれ、それら自体がＸとＺ間の共有結合ブリッジを 形成する本発明の特に好ましい具体例において、Ｙは、基の１個までの原子がＸ およびＺの両方と結合を形成する＞Ｃ＝Ｏのごとき結合基であるか、あるいはＹ は不存在である。 グループＩＩＩにより提供される典型的な両親媒性化合物は以下のものを包含 する： さらに、生物学的に活性のある分子の細胞中への輸送を容易にすることのでき るグループＩＶ（図７参照）のカチオン性両親媒性化合物であって、構造式（Ｉ Ｖ）： ［式中、ＡおよびＢは独立してＯ、ＮまたはＳ； Ｒ5およびＲ6は独立してアルキルまたはアシル基であり、飽和していてもよく あるいは不飽和部位を含んでいてもよく； Ｃは、−ＣＨ2−、＞Ｃ＝Ｏおよび＞Ｃ＝Ｓからなる群より選択され； Ｅは炭素原子または窒素原子； Ｄは−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−または−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−のごとき結合基であるか、あ るいはＤは不存在； Ｒ3はＨ、または飽和もしくは不飽和脂肪族基； Ｒ1は−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミン； Ｒ4はＨ、または飽和もしくは不飽和脂肪族基； Ｒ2は−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミン； Ｒ1はＲ2と同じまたは異なるが、Ｒ1およびＲ2の両方ともが−ＮＨ−であるこ とはありえない］ を有するカチオン性両親媒性化合物が提供される。 グループＩＶの代表的な両親媒性化合物は以下のものを包含する： また本発明は、１種またはそれ以上のカチオン性両親媒性化合物、および１種 またはそれ以上の生物学的に活性のある分子を含んでなる医薬組成物であって、 治療上有効量の生物学的に活性のある分子の患者組織中への細胞内送達を容易に する組成物を提供する。保存のために組成物を安定化し、そして／または生物学 的に活性のある分子の細胞内送達が成功することに貢献する１種またはそれ以上 のさらなる生理学的に許容される物質を含有するように本発明医薬組成物を処方 してもよい。 さらなる態様において、本発明は、生物学的に活性のある分子の細胞中への輸 送を容易にする方法であって、下記工程： 本発明カチオン性両親媒性化合物の分散物を調製し； 該分散物を生物学的に活性のある分子に接触させて該両親媒性化合物と該分子 との間に複合体を形成させ、次いで、細胞を該複合体に接触させ、そのことによ り該生物学的に活性のある分子の細胞中への輸送を容易にする を特徴とする方法を提供する。 医薬用途には、本発明カチオン性両親媒性化合物を、当業者に知られた１種ま たはそれ以上のさらなるカチオン性両親媒性化合物またはジオレオイルホスファ チジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）のごとき中性の共存脂質（co-lipid）と ともに処方して、生物学的に活性のある分子の細胞への送達を容易にしてもよい 。さらに、本発明の１種またはそれ以上のカチオン性両親媒性化合物を含んでな る組成物を用いて生物学的に活性のある分子を組織培養中の植物細胞のごとき植 物細胞中に導入することもできる。 さらに、本願は、遺伝子治療により患者を治療して適当な治療導入遺伝子の高 レベル発現を達成しうるための、本発明両親媒性化合物との複合体形成に適した 新規プラスミドも提供する。その代表例はプラスミドｐＣＭＶＨ１およびｐＣＦ １を包含する。ｐＣＦ１プラスミドはサイトメガロウイルスの即時初期遺伝子由 来のエンハンサー／プロモーター領域を含んでいる。また該プラスミドはプロモ ーターと導入遺伝子ｃＤＮＡとの間に位置するハイブリッドイントロンも含んで いる。ウシ・成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化シグナルを導入遺伝子の下流 に配置するために選択した。これらの特徴および他の特徴は、このプラスミドの 導入遺伝子発現可能性の改善に実質的に貢献する。 複製エピソームプラスミドを提供することにより、プラスミドのさらなる品質 向上を行う。標的組織中の炎症関連物質の濃度に感受性のある転写プロモーター の制御下に治療遺伝子の発現を置いたプラスミドを提供することによって、さら に治療の促進を図る。かかるプラスミドは、炎症が主要合併症である臨床的症例 について特に有用である。 本発明のさらなる具体例において、両親媒性化合物／導入遺伝子の静脈内投与 により、かかる複合体中のＤＮＡに対する両親媒性化合物の比率を調節すること により、そしてその見かけの電荷またはゼータ電位を調節することにより、特定 の器官または組織を遺伝子治療の標的としてもよい。 本発明のさらなる典型的な態様は、すぐ後の詳細な説明に記載されている。 図面の簡単な説明 図１は、典型的なグループＩのカチオン性両親媒性化合物を示す。 図２は、典型的なステロイド親油性基を示す。 図３は、典型的なステロイド親油性基を示す。 図４は、アシル基転移反応を示す。 図５は、典型的なグループＩＩのカチオン性両親媒性化合物を示す。 図６は、典型的なグループＩＩＩのカチオン性両親媒性化合物を示す。 図７は、典型的なグループＩＶのカチオン性両親媒性化合物を示す。 図８は、スペルミジンコレステロールカルバメートの合成経路を示す。 図９は、スペルミンコレステロールカルバメートの合成経路を示す。 図１０は、特定条件下の特定のカチオン性両親媒性化合物のインビボトランス フェクション効率の比較を示す。 図１１は、インビボトランスフェクション効率を特定のカチオン性両親媒性化 合物に対するＤＮＡ濃度の関数として示す。 図１２は、インビボトランスフェクション効率を特定のカチオン性両親媒性化 合物濃度の関数として示す。 図１３は、グループＩの両親媒性化合物の相対的トランスフェクション効率を 示す。 図１４は、グループＩＩの両親媒性化合物の相対的トランスフェクション効率 を示す。 図１５は、グループＩＶの両親媒性化合物の相対的トランスフェクション効率 を示す。 図１６は、ｐＣＭＶＨ１−ＣＡＴプラスミドの地図を示す。 図１７は、ｐＣＭＶＨ１−ＣＡＴのハイブリッドイントロンを示す。 図１８（パネルＡ）は、ｐＣＦ１／ＣＡＴプラスミドの地図を示す。 図１８（パネルＢ）は、ｐＣＦ２／ＣＡＴプラスミドの地図を示す。 図１９は、嚢胞性線維症患者由来の鼻ポリープ上皮細胞における修正された塩 素イオン輸送のプロットを示す。 図２０は、ｐＭｙｃ４−ＣＦＴＲプラスミドの地図を示す。 図２１は、静脈からの心臓および肺の標的化を示す。 発明の詳細な説明 本発明カチオン性両親媒性化合物の構造に関する情報 本発明は、カチオン性両親媒性化合物、およびそれらを含有する組成物を提供 し、それらは生物学的に活性のある分子の細胞中への輸送を容易にすることに有 用である。本発明両親媒性化合物は、生物学的に活性のある分子の細胞中への輸 送を容易にすることにおいて、特に、遺伝子治療の目的で患者細胞への輸送を容 易にすることにおいて有用である。 本発明によりカチオン性両親媒性化合物は新規特徴を有する。例えば、Epand に付与された米国特許第５,２８３,１８５号に開示されたようなカチオン性両親 媒性化合物（その代表的構造は「ＤＣ−コル」として広く知られる３β［Ｎ−（ Ｎ1,Ｎ1−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールである）な らびにBehr et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86,6982-6986(1989)により開示さ れている構造（その代表的構造はジオクタデシルアミドロ−グリシルスペルミン （ＤＯＧＳ）である）と比較した場合にこれらの特徴が見られる。 本発明カチオン性両親媒性化合物は以下の明確な構造的特徴を有する：（１） アミノ、アルキルアミンまたはポリアルキルアミン基を含む２個のカチオン性基 （下記参照）に直接または結合基を介して結合している親油性基の存在であって 、全体として新規な「Ｔ形」構造を生じるもの；および（２）多くの場合、当該 分野で認識されている多くの両親媒性化合物と比較すると、比較的短い結合基の 使用であって両親媒性化合物の親油性領域およびカチオン性領域を極めて近くに もってくるための使用。理論については限定されないが、これらの特徴はこれら の化合物のトランスフェクション促進能に実質的に貢献すると考えられる。この 例として、図１０は、ＤＣ−コルおよびＤＭＲＩＥ（２種のよく知られたトラン スフェクタント）との比較におけるスペルミジンコレステロールカルバメート（ 本発明の新規両親媒性化合物）の非常に大きなインビボトランスフェクション促 進能を 示す。 本発明の実施に関連して、「カチオン性」とは、生理学的ｐＨまたはその付近 において本明細書定義のＲ基が１個またはそれ以上の正電荷を有する傾向がある ことを意味する。かかるカチオン性の特性は、両親媒性化合物と、治療分子（核 酸のごとき）または細胞構造（細胞質膜の糖蛋白のごとき）との相互作用を促進 し、そのことにより治療分子の細胞中への導入が成功することに貢献し、あるい はそのサブコンパートメント（核のごとき）中でのプロセッシングに貢献する。 この点において、カチオン性両親媒性化合物のトランスフェクション促進機能に 関する当該分野の多くの理論が参照されるが、いずれも本発明の実施を限定する ものと解してはならない。 細胞中への輸送が本発明の実施により容易にされうる生物学的分子は、例えば 、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡもしくはＤＮＡ、ポ リペプチドおよび低分子薬剤もしくはホルモンを包含する。それらの典型例につ いては、本発明治療（医薬）組成物の説明に関連して後で述べる。 本発明の重要な具体例において、生物学的に活性のある分子は、代謝欠陥の修 正を導くように患者細胞中に置かれた場合に発現されるコーディングポリヌクレ オチドである。特に重要な例において、ポリヌクレオチドは、上皮細胞アニオン チャンンネル調節をする生物学的特性を有するようにヒト・嚢胞性線維症トラン スベンブランレギュレーター（ＣＦＴＲ）のアミノ酸配列を十分に重複したアミ ノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている。 上記のごとく、本発明両親媒性化合物の特性および新規特徴は、まず、２つの カチオン性アミン基を親油性基に結合している結合基が非常に短く、あるいはま ったく存在しないということ、次に、結果生じた２つのカチオン性Ｒ基の親油性 基への結合が、例えば構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ（原子 Ｅ参照））に示すように原子Ｘ（炭素原子または窒素原子）から見た場合にＴ− 形構造を形成することを包含する。 本発明カチオン性両親媒性化合物の例として、スペルミジンコレステロールカ ルバメート（Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメート）およびスペルミン コレステロールカルバメート（Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメート）は 両方とも、同量のカチオン性アルキルアミン構造を有するＴ−形でない両親媒性 化合物との比較において、インビボにおける優れたトランスフェクタントである ことが決定されている。優れた品質（実施例３も参照）は、例えば、 との比較において に関して決定されている。 さらに、優れた品質は、例えば、 および との比較において に関して決定されている。 出願人は、多くの本発明カチオン性両親媒性化合物が、スペルミンおよびスペ ルミジン（Ｎ−原子スペーシングを含む）のごとき天然のポリアミン類と共通し た構造的特徴を有することにも注目した。この点において、両親媒性化合物５３ 、６７、７８、９０および９１が典型的である。図１３、１４および１５のデー タを調べることによりわかるように、両親媒性化合物の極性ヘッド基における窒 素原子の置換は、３個ないし４個の炭素原子の１またはそれ以上の組み合わせに より窒素原子が離されるようにし、両親媒性化合物と複合体となったプラスミド 導入遺伝子のインビボトランスフェクション効率を高める。出願人は、これらの 共通の構造的特徴がＤＮＡへの両親媒性化合物の結合および細胞表面ポリアミン 受容体との相互作用に有益な効果を及ぼしうることにも注目した。癌細胞のＤＮ Ａ複製の必須事項としてポリアミン受容体の発現レベルが高くなるので、遺伝子 治療による癌細胞の治療に関して細胞のポリアミン受容体との相互作用は特に重 要である。グループＩの両親媒性化合物 本発明のグループＩの両親媒性化合物の設計に関連して、以下のことが考えら れる。これらの設計についての特徴は、グループＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶに分類 される本発明の他の両親媒性化合物に関して後で議論される。 したがって、生物学的に活性のある分子の細胞中への輸送を容易にすることの できるグループＩ（図１、パネルＡ、ＢおよびＣ参照）のカチオン性両親媒性化 合物であって、構造式（Ｉ）： ［式中、Ｚはステロイド； Ｘは炭素原子または窒素原子； Ｙは短い結合基であるか、あるいはＹは不存在； Ｒ3はＨ、または飽和もしくは不飽和脂肪族基； Ｒ1は−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミン； Ｒ4はＨ、または飽和もしくは不飽和脂肪族基； Ｒ2は−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンであり； Ｒ1はＲ2と同じまたは異なるが、Ｒ1およびＲ2の両方ともが−ＮＨ−であるこ とはありえない］ を有する両親媒性化合物が提供される。結合基 好ましくは、親油性基を２つのカチオン性Ｒ基に結合する結合基は比較的短い ものである。それ自体ＸとＺとの間の共有結合のブリッジを形成する結合基Ｙ中 に３個または４個までの原子が含まれることが好ましい。Ｙ基の例は、 −（ＣＨ2）2−；−（ＣＨ2）3−；−（ＣＨ2）−（Ｃ＝Ｏ）−； −（ＣＨ2）n−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）− ［式中、好ましくはｎは４またはそれ未満］ を包含する。本発明の実施に有用なさらなる結合基は、グリシニル、アラニル、 ベーターアラニル、セリル等のごとき小型アミノ酸にならった形の結合基である 。 上記のものに関して、その左側は原子Ｘに結合し、右側は基Ｚに結合するもの とする（構造式Ｉ参照）。 本発明の特定の好ましい具体例において、Ｙは結合基であって、この基中の１ 個までの原子はＸおよびＺの両方への結合を形成する。好ましい結合基の例は、 −ＣＨ2−、＞Ｃ＝Ｓ、および＞Ｃ＝Ｏを包含する。あるいはまた、Ｙは全く不 存在であってもよい。 上述のごとく（上記構造式Ｉを直接参照）、Ｘは両親媒性化合物において結合 ポイントを形成し、それに２つのカチオン性Ｒ基が結合する。該構造式において わかるように（図１も参照）、Ｘを表す窒素原子の置換は分子を明らかにＴ−形 にする。ステロイド親油性基 本発明によるカチオン性両親媒性化合物は、親油性基として種々の構造を含む ことができる。ステロイド類はかかる構造の好ましい基である。 本発明による親油性基としてのステロイド類の設計および方向に関して、以下 のことが考えられる。ステロイド類は、動物、微生物および植物界に広く分布し ている。それらは、典型的にはその基本骨格としてパーヒドロシクロペンテノ− フェナンスレン環システムの形態に配置された１７個の炭素原子を含む固体アル コールと定義されうる。したがって、かかる化合物は、胆汁酸、コレステロール および関連物質、ビタミンＤ、ある種の昆虫脱皮ホルモン、ある種の性ホルモン 、コルチコイドホルモン、ある種の抗生物質、ならびにさらなる環が基本構造に 付加またはそこから欠失されている上記のもののすべての誘導体を包含する［当 該分野においてステロイド類であると理解されている広いクラスの分子について のさらなる議論についてはNatural Products Chemistry,K.Nakanishi et al.,ed s.,Academic Press,Inc.,New York(1974)第１巻、第６章参照］。さらに、本発 明の目的からすると、用語ステロイドは広い意味に用いられ、ビタミンＥのごと き複数のイソプレノイド単位から誘導される関連分子を包含する。本発明の実施 において有用なステロイド類の典型例を図１、２、３および５に示す。 上記のごとく、本発明のある種の好ましい両親媒性化合物は、３−ステロール 類からなる群より選択されるステロイド成分Ｚを含み、該ステロール分子はその ３−Ｏ−基により、あるいはそれに代わるＮによりＹに結合されている（図１参 照）。かかる構造は、例えば、スペルミジンコレステロールカルバメート、スペ ルミンコレステロールカルバメート、スペルミジン７−デヒドロコレステリルカ ルバメート、リジン３−Ｎ−ジヒドロコレステリルカルバメート、スペルミジン コレスタミンウレア、およびＮ−３−アミノプロピル−Ｎ−４−アミノブチルコ レスタミンを包含する。さらに好ましい具体例において、ステロイド基は、ステ ロイド核の１７位から（図１および３参照）、または通常は多くのステロイドに おいて１７位から伸長しているアームから（図１および３参照）、または短い形 態の該アームから、Ｙに結合している。 本発明両親媒性化合物に含まれるステロイド類の選択に関して、分子が、身体 によって代謝されうる構造を有し、使用用量において無毒であることが好ましい 。実質的に無毒で、患者における安全な代謝を容易にする生物学的に通常の立体 選択性を有するコレステロールおよびエルゴステロールのごときステロイド類が 好ましい。本発明の実施に有用なさらなるステロイド類は、例えば、エルゴステ ロールＢ１、エルゴステロールＢ２、エルゴステロールＢ３、アンドロステロン 、コール酸、デスオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、なら びに例えば、図２および図３のパネルに示すそれらの種々の誘導体を包含する。 ステロイド親油性基の方向に関して、すなわち、いかにして基が両親媒性化合 物のカチオン性（アルキル）アミン基に結合（リンカーありまたはなし）するの かについて、以下のさらなる情報がある。一般的にはステロイド上の環位置また は置換基を結合ポイントとして用いることができる。しかしながら、（１）化学 合成の複雑さを最小限にする結合ポイント、（２）ステロイド分子の「端」に近 い位置、例えば環の３位に近い位置、あるいは１７位に近い位置のいずれかにあ る結合ポイントを用いることが好ましい。かかる位置は、二重層形成および／ま たはミセル形成を容易にし、そして／あるいは標的細胞中へと運搬される生物学 的に活性のある分子との相互作用を安定化する両親媒性化合物の構造の残りの位 置に関してステロイドの方向づけを行う。環の１７位から伸長したアームを介す るステロイド親油性基へのカチオン性（アルキル）アミン基の結合を示す典型的 な構造を図３（パネルＡ、Ｂ）に示す。このタイプの構造に関して、例えば、環 の３位に結合していてもよいステロイド上の極性基を除去し、あるいはキャップ し（例えば、ヒドロキシをメトキシとして）、二重層またはミセル構造の潜在的 不安定化を回避することがさらに好ましい。 ステロイド環の１７位を介してステロイド親油性基がカチオン性アルキルアミ ン基に結合している図３のカチオン性両親媒性化合物は本発明のほんの一例であ る。同様に、ステロイド環の３位を介してステロイド親油性基がカチオン性アル キルアミン基に結合している図１ないし図４のカチオン性両親媒性化合物も本発 明の例である。上記のごとく、結合ポイントとしてのいずれかのステロイド環の 位置（あるいはそこから伸長する部分または分子）の使用は本発明の範囲内であ る。 本発明によるＺ基としての使用に好ましいステロイド類は以下のものを包含す る：３−ステロール類（コレステロールから誘導される） ３−Ｎステリル基（コレステロールをパターンとする） エルゴステロールおよび誘導体 エルゴステロールをパターンとし、本発明カチオン性両親媒性化合物の構造を 決定するのに用いることのできるステロイドの典型的な種は、エルゴステロール （図示されたような二重結合）；エルゴステロールＢ１（Δ８,９；Δ１４,１５ ；Δ２２,２３）；エルゴステロールＢ１（Δ６,７；Δ８,１４；Δ２２,２３） ；エルゴステロールＢ１（Δ７,８；Δ１４,１５；Δ２２,２３）；およびルミ ステロール（エルゴステロールの９ｂ−Ｈ異性体）を包含する。コール酸および誘導体 コール酸をパターンとし、本発明カチオン性両親媒性化合物の構造を決定する のに用いることのできるステロイドの典型的な種は、ｒ1およびｒ2＝ＯＨである コール酸；ｒ1＝Ｈでｒ2＝ＯＨであるデスオキシコール酸；ｒ1＝ＯＨでｒ2＝Ｈ であるケノデスオキシコール酸；ならびにｒ1およびｒ2＝Ｈであるリトコール酸 を包含する。アンドロステロンおよびその誘導体 基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4の選択 Ｒ3およびＲ4について 本発明によれば、Ｒ3およびＲ4は独立してＨ、または飽和もしくは不飽和脂肪 族基である。脂肪族基は分枝していてもよく、また分枝してなくてもよい。典型 的な基はアルキル、アルケニルおよびシクロアルキルを包含する。Ｒ1およびＲ2について Ｒ1およびＲ2は、当該分野でアミン；アルキルアミン（１級、２級および３級 アミンを包含）、または本明細書において「ポリアルキルアミン」と称されるそ れらの伸長バージョンを包含する。本明細書定義のアルキルアミンおよびポリア ルキルアミン基はともに１つまたはそれ以上の炭素−炭素二重結合を有していて もよく、それゆえ、かかるアルキルアミンの使用は本発明の範囲内である。 典型的なアルキルアミンは、（ａ）ｚが０以外である−ＮＨ−（ＣＨ2）z−； （ｂ）ｚが０以外である−［［ＣＨ3（ＣＨ2）y］Ｎ］−（ＣＨ2）z−；および （ｃ）ｚが０以外である−［［ＣＨ3（ＣＨ2）x］［ＣＨ3（ＣＨ2）y］］Ｎ−（ ＣＨ2）z−を包含する。 Ｒ1およびＲ2の一方または両方が上記構造式（ｃ）に示されたように３級アミ ンである場合の環境に関して、Ｒ3またはＲ4のいずれかに対応する水素原子は、 適宜存在してもよく、存在しなくてもよいと理解される。なぜなら、かかる水素 原子はＮ：Ｈ（＋）構造に対応しており、そのプロトン化レベルはｐＨによって 変化するからである。 本明細書の用語「ポリアルキルアミン」とは、少なくとも２つのアルキルアミ ンが結合しているポリマー構造であると定義する。そのように結合しているアル キルアミンユニットは１級または２級であってよく、生じるポリアルキルアミン は１級、２級または３級窒素原子を含んでいてよい。アルキルアミン（サブ）ユ ニットは飽和または不飽和であってよく、それゆえ、用語「アルキルアミン」は 本発明の説明中のアルケニルアミンを包含する。 得られる典型的なポリアルキルアミンは、（ｄ）ｚが０以外でｑが２またはそ れ以上である−［ＮＨ−（ＣＨ2）(z)］q−；（ｅ）ｙおよびｚがそれぞれ０以 外でｐおよびｑがそれぞれ０以外である−［ＮＨ−（ＣＨ2）(y)］p−［ＮＨ− （ＣＨ2）(z)］q−；（ｆ）ｘ、ｙおよびｚがそれぞれ０以外でありｎ、ｐおよ びｑがそれぞれ０以外である−［ＮＨ−（ＣＨ2）(x)］n−［ＮＨ−（ＣＨ2）(y ) ］p−［ＮＨ−（ＣＨ2）(z)］q−；（ｇ）ｗ、ｘ、ｙおよびｚがそれぞれ０以 外でありｍ、ｎ、ｐおよびｑがそれぞれ０以外である−［ＮＨ−（ＣＨ2）(w)］m −［ＮＨ−（ＣＨ2）(x)］n−［ＮＨ−（ＣＨ2）(y)］p−［ＮＨ−（ＣＨ2）(z ) ］q−；（ｈ）ｘ、ｎおよびｚがそれぞれ０以外である−［ＮＨ−（ＣＨ2）(w) ］m−［ＮＨ−（ＣＨ2）(x)］n−［［ＣＨ3（ＣＨ2）y］Ｎ］−（ＣＨ2）z−； （ｉ）ｗ、ｐ、ｙ、ｚおよびｐがそれぞれ０以外である−［ＮＨ−（ＣＨ2）(w) ］p−［［ＣＨ3（ＣＨ2）x］Ｎ］−（ＣＨ2）y−［ＮＨ−（ＣＨ2）(z)］q−； および（ｊ）ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚがそれぞれ０以外でありｌ、ｍ、ｎ、ｐお よびｑがそれぞれ０以外である−［ＮＨ−（ＣＨ2）(v)］l−［ＮＨ−（ＣＨ2）(w) ］m−［ＮＨ−（ＣＨ2）(x)］n−［ＮＨ−（ＣＨ2）(y)］p−［ＮＨ−（ＣＨ2 ）(z)］q−を包含する。 上記のごとく、Ｒ1およびＲ2は独立して−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリ アルキルアミンであってよく、互いに同じであっても異なっていてもよいが、（ １）がＴ−形の化合物を示し、（２）がその安定性を示すためにはＲ1およびＲ2 の両方が−ＮＨ−であることはありえない。組み合わせにおいて、Ｒ3Ｒ1（また はＲ4Ｒ2）の組み合わされた骨格の長さは窒素原子および炭素原子４０原子未満 で あり、より好ましくは窒素原子および炭素原子３０原子未満である。 Ｒ3に隣接したＲ1（あるいはＲ4に隣接したＲ2）が３級中心を決定する末端窒 素原子を含んでいる場合において、Ｒ3が脂肪族基であるならば４級アミンが形 成され（Ｒ1の窒素原子において）、Ｒ3がＨであるならば３級アミンが残存する （Ｒ1の窒素原子において）。したがって、かかる生じるＲ3Ｒ1またはＲ4Ｒ2構 造に関する典型的な化学式は、（ｋ）ｗおよびｚが互いに０以外であるＨ−（Ｃ Ｈ2）(w)−［［ＣＨ3（ＣＨ2）x］［ＣＨ3（ＣＨ2）y］Ｎ］−（ＣＨ2）z−；お よび（１）ｚが０以外であるＨ−［［ＣＨ3（ＣＨ2）x］［ＣＨ3（ＣＨ2）y］Ｎ ］−（ＣＨ2）z−である。 本明細書記載の構造のダイヤグラムを解釈するもとに関して、Ｒ3Ｒ1−（また はＲ4Ｒ2−）構造の原子Ｘへの結合はＲ3Ｒ1−の右側で生じ（示したように）、 すなわちＣＨ2−部分を介して結合が生じる。本明細書記載の係数（すなわち、 ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚならびにｉ、ｍ、ｎ、ｐおよびｑ）は整数である。本発 明の目的からすると、「整数」とは、特に限定しないかぎり０および自然数１、 ２、３、４、５、６........を意味する。 式（ａ）から（ｌ）までにより示される両親媒性化合物を包含する本発明両親 媒性化合物に関して、上記構造式（Ｉ）により示される原子Ｘが窒素原子である か炭素原子であるかによって、かかる基の設計に関してある種の優先順位が生じ る。Ｘが窒素である場合、Ｎ原子が末端にあるＲ3−Ｒ1（またはＲ4−Ｒ2）基を 含む両親媒性化合物［すなわち、ｚが０でありｑが１である式（ｅ）；ｚが０で ある式（ｈ）］は好ましくない。なぜなら、位置Ｘを含むＮ−Ｎ結合は、不安定 であり、そして／または合成が困難でありうる両親媒性化合物を生じるからであ る。合成困難および／または不安定な構造のさらなるグループは、例えば、Ｒ配 列（Ｒ1中にあっても、あるいはブリッジ形成しているＲ1およびＲ3中にあって も）−ＮＨ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ2−により示される。したがって、本発明の実施 におけるかかる構造［すなわち、ｚが１である式（ａ）、ｙおよびｚの一方また は両方が１である式（ｅ）］の使用は好ましくない。 カチオン性両親媒性化合物中に含ませる構造（上に示したもののような）の設 計に関して、次のようなさらなる考えがある。アミンおよびアルキル部分の変更 についてのいかなる組み合わせであってもＲ構造は本発明の範囲内である。両親 媒性構造中の非常に多くのアルキルアミンのタイプまたは組み合わせによってよ り多くの構造を表すことができるが（かかる構造は本発明の範囲内である）、ポ リアルキルアミンは、例えば、上記式により表されるものであってもよい。その ようなさらなるバリエーションを調製できることは、当業者に明らかである。 非常に長いポリアルキルアミン基（または生じるＲ3Ｒ1基）は、例えば、得ら れる両親媒性化合物の溶解度を低下させ、あるいは細胞内送達用に選択された生 物学的に活性のある分子と安定に相互作用する能力を低下させうる。この点にお いて、約４０個の窒素および炭素原子あるいはそれ以上の長さの骨格を有するポ リアルキルアミン（または生じるＲ3Ｒ1基）は両親媒性化合物中に含ませること に適さないかもしれない。しかしながら、かかる提案された構造のそれぞれにつ いて、実験によってその特性を決定することができ、それにもかかわらずその使 用は本発明の範囲内である。 したがって、特定のアルキルアミンおよびポリアルキルアミンの構造は以下の ようになる： グループＩＩの両親媒性化合物 さらに、生物学的に活性のある分子の細胞中への輸送を容易にすることのでき るグループＩＩ（図５参照）のカチオン性両親媒性化合物であって、構造式（Ｉ Ｉ）： ［式中、Ｚはステロイド； Ｘは炭素原子または窒素原子； Ｙは結合基であるか、あるいはＹは不存在； Ｒ3はアミノ酸、誘導体化されたアミノ酸、Ｈまたはアルキル Ｒ1は−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミン； Ｒ4はアミノ酸、誘導体化されたアミノ酸、Ｈまたはアルキル； Ｒ2は−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミン； Ｒ1はＲ2と同じまたは異なるが、Ｒ1およびＲ2の両方ともが−ＮＨ−であるこ とはありえない］ を有する両親媒性化合物が提供される。 グループＩＩにより提供される典型的な両親媒性化合物は、両親媒性化合物８ ７、９１、９３、９５、９７、９９、１００および１０３を包含する。これらの 両親媒性化合物の構造的特徴に関して、グループＩＩの他の両親媒性化合物を考 慮すべきである。 グループＩの両親媒性化合物について上記した判断基準に従ってステロイド基 を選択することができる。したがって、好ましい両親媒性化合物は、ステロール 分子がその３−Ｏ−基またはそれに代わるＮによりＹに結合している３−ステロ ール類から選択されるものを包含する。 グループＩＩの両親媒性化合物の結合基ＹはＮ−アシルアミノ酸（またはその 誘導体）からなるか、あるいは該基の１個までの原子がＸおよびＹの両方と結合 を形成する基（例えば、＞Ｃ＝Ｏまたは＞Ｃ＝Ｓ）からなる。所望により、基Ｙ は不存在であってもよい。代表的なＮ−アシルアミノ基は、Ｎ−アシルセリン（ Ｎ０.８７）、Ｎ−アシルグリシン（Ｎｏ.９１）、およびＮ−アシルアスパラギ ン酸（Ｎｏ.１０３）を包含する。両親媒性化合物Ｎｏ.１０３におけるＮ−アシ ルアスパラギン酸の使用に関して、示されたように、ガンマカルボキシはそれ自 体さらに誘導体化されてさらなるアルキルアミン部分となる。 Ｒ1およびＲ2の選択の判断基準はグループＩの両親媒性化合物について説明し たのと同様である。Ｒ3およびＲ4はＨまたはアルキルであるか、あるいは天然ま たは人工アミノ酸であってもよく、そのいずれの誘導体も包含する。Ｒ3または Ｒ4アミノ酸基の典型例は、トリプトファン由来のもの（Ｎｏ.９７）およびアル ギニン由来のもの（Ｎｏ.９５）を包含する。グループＩＩＩの両親媒性化合物 さらに、生物学的に活性のある分子の細胞中への輸送を容易にすることのでき るグループＩＩＩ（図６参照）のカチオン性両親媒性化合物であって、構造式（ ＩＩＩ）： ［式中、Ｚはアルキルアミンまたはジアルキルアミンであって、そのＮ原子によ ってＹに結合されているもの（あるいはＹが不存在の場合には直接Ｘに結合）で あり； Ｚがジアルキルアミンである場合には、そのアルキル基は同じであっても異なっ ていてもよく； Ｘは炭素原子または窒素原子； Ｙは短い結合基であるか、あるいはＹは不存在； Ｒ3はＨ、または飽和もしくは不飽和脂肪族基； Ｒ1は−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミン； Ｒ4はＨ、または飽和もしくは不飽和脂肪族基； Ｒ2は−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミン； Ｒ1はＲ2と同じまたは異なるが、Ｒ1およびＲ2の両方ともが−ＮＨ−であるこ とはありえない］ を有するカチオン性両親媒性化合物が提供される。 アルキルアミンまたはジアルキルアミンを親油性基として含んでいる本発明の 典型的なカチオン性両親媒性化合物は、例えば、Ｎ,Ｎ−ジオクタデシルリジン アミド；Ｎ1,Ｎ1−ジオクタデシル−１,２,６−トリアミノヘキサン；Ｎ,Ｎ−ジ ドデシルリジンアミド；Ｎ,Ｎ−ジデシルリジンアミド；スペルミジン−Ｎ,Ｎ− ジオクタデシルウレア；Ｎ−ミリスチルリジンアミド；およびＮ−（ジオクチル デシルアミノエチル）−リジンアミドを包含する。典型的な両親媒性化合物を、 両親媒性化合物４３、４７、５６、６０および７３として示す（図６）。それら の両親媒性化合物およびグループＩＩＩの他の両親媒性化合物の構造的特徴に関 して、以下のことを考慮すべきである。 親油性アルキルアミンまたはジアルキルアミン基「Ｚ」の選択に関して、下表 ２に典型的な構造を示す。 本発明両親媒性化合物のＺ位置に含ませるに適したアルキルアミンまたはジア ルキルアミン基の選択に関して、基のアルキル鎖は、両親媒性化合物の溶解度を 低下させ、あるいはプラスミドＤＮＡとの相互作用能を低下させるほど短いもの であってはならない。さらに、アルキルアミンまたはジアルキルアミンのアルキ ル鎖は１またはそれ以上の不飽和ポイントを含んでいてもよい。Ｒ基であるＲ1 、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4の選択は、グループＩの両親媒性化合物に関する開示に従 うものとし、これらのＲ基を、例えば、表Ｉから選択してもよい。結合基Ｙをグ ループＩの両親媒性化合物に関するのと同様に選択してもよく、その好ましい例 は−ＣＨ2−および＞Ｃ＝Ｏを包含する。グループＩＶの両親媒性化合物 さらに、生物学的に活性のある分子の細胞中への輸送を容易にすることのでき るグループＩＶ（図７参照）のカチオン性両親媒性化合物であって、構造式（Ｉ Ｖ）： ［式中、ＡおよびＢは独立してＯ、ＮまたはＳ； Ｒ5およびＲ6は独立してアルキルまたはアシル基であり、飽和していてもよく あるいは不飽和部位を含んでいてもよく； Ｃは、−ＣＨ2−、＞Ｃ＝Ｏおよび＞Ｃ＝Ｓからなる群より選択され； Ｅ（構造式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩにおける「Ｘ」に類似）は炭素原子または窒素原 子； Ｄは−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−または−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−のごとき結合基であるか、あ るいはＤは不存在； Ｒ3はＨ、または飽和もしくは不飽和脂肪族基； Ｒ1は−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミン； Ｒ4はＨ、または飽和もしくは不飽和脂肪族基； Ｒ2は−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミン； Ｒ1はＲ2と同じまたは異なるが、Ｒ1およびＲ2の両方ともが−ＮＨ−であるこ とはありえない］ を有するカチオン性両親媒性化合物が提供される。グループＩＶの典型的な両親 媒性化合物は、Ｎｏ.６４、７６、８５、８９、９４、９８、１０２、１０５、 １１０および１１１を包含する。これらの両親媒性化合物およびグループＩＶの 他の両親媒性化合物の構造的特徴に関して、以下のことを考慮すべきである。 Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4の選択に関して、グループＩ、ＩＩおよびＩＩＩの両 親媒性化合物に関する教示が適用できる。上記のごとく、基「Ｅ」は炭素原子ま たは窒素原子である。 Ｒ5およびＲ6は独立してアルキルまたはアシル基であり、好ましくは、約８個 ないし約３０個の炭素原子を含み、かかる基は１個またはそれ以上の不飽和ポイ ントを含んでいてもよい。 基Ｄの選択に関して、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−または−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−のごときリ ンカーが好ましく、その左側は「Ｃ」に結合し、その右側は「Ｅ」に結合するも のとする。所望により、基Ｄは不存在であってもよい（両親媒性化合物Ｎｏ．９ ４）。上記グループＩ、ＩＩおよびＩＩＩに関して示した教示に基づいてさらな るリンカーを選択してもよく、インビボ試験データに基づいて誘導体化してもよ く（図１５）、リンカーＤが短いかまたは不存在であるのが好ましい。共存脂質 １種またはそれ以上のカチオン性両親媒性化合物との混合に関して本発明に有 用である典型的な共存脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ ＤＯＰＥ）、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン、リゾ−ホスファ チジルエタノールアミン類、他のホスファチジルエタノールアミン類、ホスファ チジルコリン類、リゾ−ホスファチジルコリン類およびコレステロールを包含す る。典型的には、共存脂質に対するカチオン性両親媒性化合物の好ましいモル比 は約１：１である。しかしながら、この比を変更することは本発明の範囲内であ り（下記実施例３参照）、かなりの範囲を包含する。 共存脂質（特に、中性共存脂質）との複合体としてカチオン性両親媒性化合物 を調製することは、両親媒性化合物のトランスフェクションを容易にする能力を 高めることが、一般的に当該分野において信じられている。共存脂質により高め られた品質が多くの本発明両親媒性化合物について観察されているが、本発明両 親媒性化合物は共存脂質なしでもトランスフェクタントとして活性がある。した がって、本発明は、共存脂質の細胞内送達機構への関与に関する理論により限定 されるものではなく、また共存脂質の使用を必要とするものでもない。 アシル基転移反応 以前は当該分野において認識されていなかったことであるが、同時貯蔵（co- storage）の条件下である種の共存脂質はある種のタイプのカチオン性両親媒性 化合物と化学反応し、新たな分子種が生じることもわかった。かかる新たな種の 生成は、アシル基転移のごとき機構を介して起こると考えられる。この点におい て、スペルミンコレステロールカルバメート（Ｎｏ.６７）およびＤＯＰＥを用 いるアシル基転移反応ならびに生成するリゾＰＥ種および複数の形態の個々のア シル−カチオン性両親媒性化合物（Ｎｏ.８０と命名）を示す図４参照。 かかる反応に関して、以下の考えが興味深い。両親媒性化合物Ｎｏ.６７の使 用に関して、クロロホルム溶媒中の両親媒性化合物およびＤＯＰＥの混合物はか かる反応に関与しないように思われる。しかしながら、リポソームのごとき二重 層含有構造が生じうる水溶液中での両親媒性化合物および共存脂質の調製はアシ ル基転移反応を可能にするであろう。さらに、両親媒性化合物および共存脂質を 例えばクロロホルムから乾燥させて薄層とする場合（それにより２つの種がぴっ たりと接触する）、可能な場合にはエントロピー効果の結果としてアシル基転移 反応が起こる。これらの現象は凍結乾燥した両親媒性化合物／ＤＯＰＥの調製に も応用されると考えられる。 したがって、かかる両親媒性化合物／ＤＯＰＥ調製品を非常に低温、例えば− ７０℃に維持することは非常に好ましい。一、二または三酢酸塩としての両親媒 性化合物Ｎｏ.６７の調製も遅いアシル基転移反応であることがわかっている。 治療上有効な本発明医薬組成物はかかるアシル基転移反応副産物または他の副 産物を含んでいてもよく、あるいは含んでいなくてもよく、かかる副産物の存在 はそれらを含有する組成物の使用を妨げないことが理解されている。むしろかか る組成物の使用は本発明の範囲内であり、それゆえ、かかる組成物および新規分 子種は特別に権利請求される。医薬組成物の調製およびその投与 本発明は、治療上有効量の生物学的に活性のある分子の細胞内送達を容易にす る医薬組成物を提供する。本発明医薬組成物は、胃粘膜、心臓、肺および固形腫 瘍のごとき組織および器官への生物学的に活性のある分子の侵入を容易にする。 さらに、本発明組成物は、組織培養のごときインビトロにおいて維持されている 細胞中への生物学的に活性のある分子の侵入を容易にする。本発明化合物の両親 媒性は、細胞膜脂質、他の細胞表面分子および組織表面へのそれらの化合物の結 合、およびそれらへの融合または付着を可能にする。両親媒性化合物により形成 されうる他のタイプの構造はリポソームであり、それは大小の球状二重層中に形 成される小胞であり、生物学的液体中で安定であり、細胞内送達の標的とされる 生物学的分子をトラップすることができる。細胞膜と融合することにより、かか るリポソーム組成物は生物学的に活性のある分子をそれとともに運搬し、エンド サイトーシスおよび飲作用を包含する１またはそれ以上の細胞プロセスを経る細 胞内部へのアクセスを促進する。しかしながら、治療組成物における使用を提案 されている多くのクラスの両親媒性化合物または他の脂質様分子の場合とは異な り、本発明カチオン性両親媒性化合物は、有効であるために高度に組織化された 小胞の形成を必要とせず、実際にはゆるく組織化された広範な構造であると考え られる。かかる構造は本発明医薬組成物に提供することもでき、その有効性に貢 献しうる。 本発明両親媒性化合物を用いて治療上有効量が細胞内に提供される生物学的に 活性のある分子は： （ａ）当該分野で知られた治療上有用な蛋白をコードしているゲノムＤＮＡ、ｃ ＤＮＡおよびｍＲＮＡのごときポリヌクレオチド （ｂ）リボソームＲＮＡ （ｃ）遺伝子の転写産物を不活性化することに有用であり、例えば、悪性細胞の 増殖を調節する療法として有用であるＲＮＡまたはＤＮＡアンチセンスポリヌク レオチド （ｄ）リボザイム を包含する。 一般的には、内容物の漏出可能性のため、低分子の生物学的に活性のある分子 を送達する場合には、多くのカチオン性両親媒性化合物から形成されている小胞 または他の構造は当業者に好まれない。本発明の好ましい具体例ではないが、そ れにもかかわらず、かかる低分子を細胞内送達することは本発明の範囲内である 。送達されうる低分子量の生物学的に活性のある分子の典型的なタイプはホルモ ンおよび抗生物質を包含する。 ２種またはそれ以上の本発明カチオン性両親媒性種を組み合わせて用いて生物 学的に活性のある分子の標的細胞中への、および／または細胞内コンパートメン ト中への侵入が容易となるようにそれらをを混合してもよい。かかる用途のため に本発明カチオン性両親媒性化合物を当該分野で知られている両親媒性物質と混 合することもできる。 生物学的に活性のある分子の半減期、生物学的に活性のある分子の潜在能力、 両親媒性化合物の半減期、両親媒性化合物の生じうる副作用または分解産物、投 与経路、患者の状態等によって本発明医薬組成物の用量は変化させられるであろ う。当業者によってかかるファクターは決定されうる。 種々の投与方法を用いて非常に正確な用量の本発明医薬組成物を提供すること ができる。経口的、非経口的、局所的、経粘膜的に、または患者体腔内への調合 品の注射により、または生分解性材料を含有する持続放出処方を用いることによ り、またはさらにミセル、ゲルおよびリポソームを用いる部位上への送達により かかる調合品を投与することができる。噴霧装置、動力による吸入装置およびエ アロゾル化した溶液は、かかる調合品を呼吸管に投与するのに用いてもよい典型 的な方法である。 さらに、一般的には本発明治療組成物を賦形剤（例えば、炭水化物であるラク トース、トレハロース、スクロース、マンニトール、マルトースまたはガラクト ース）とともに処方してもよく、また使用前にかかる賦形剤の存在下で凍結乾燥 してもよい（次いで、再水和される）。本発明の両親媒性化合物につての最適処 方条件は製薬分野の当業者により決定されうる。例えば、スペルミジンコレステ ロールカルバメート（両親媒性化合物Ｎｏ.５３）について、ＤＮＡ濃度が上昇 した場合の両親媒性化合物／ＤＮＡ凝集体の形成を回避するにはマンニトールよ りもスクロースが好ましいことがわかっている。かかる賦形剤の添加は、貯蔵の 間の凍結乾燥された医薬組成物の濃度を維持し、凍結乾燥状態から再水和した場 合に起こりうる凝集または不溶化のごとき困難な事態を防止する。 したがって、本発明の第１の態様は、生物学的に活性のある分子（例えば、ポ リヌクレオチド）および１種またはそれ以上のカチオン性両親媒性化合物（所望 により１種またはそれ以上の共存脂質を含んでいてもよい）を含んでなる組成物 を提供し、次いで、１種またはそれ以上の上記賦形剤の存在下に該組成物を維持 することを包含する。得られる処方は液体または固体（好ましくは凍結乾燥され ている）であり、（１）生物学的に活性のある分子の治療活性が実質的に保存さ れ；（２）両親媒性化合物（または両親媒性化合物／ＤＮＡ複合体）のトランス フェクション促進能が維持される。理論について限定されることはないが、賦形 剤は、１つまたはそれ以上の下記効果により両親媒性化合物および生物学的に活 性のある分子の相互作用（複合体）を安定化させると考えられる： （１）容器表面との相互作用を最小にすること （２）複合体の不可逆的凝集を防止すること （３）両親媒性化合物／ＤＮＡ複合体を化学的に安定な状態に維持すること、 すなわち、酸化および／または加水分解を防止すること 本発明医薬組成物中の賦形剤の存在は組成物を安定化し、その保存および取り 扱いを容易にするが、中程度の濃度の多くの賦形剤はそれらを含有する医薬処方 のトランスフェクション促進能を妨害しうることがわかっている。この点につい て、さらなる、そして貴重な本発明両親媒性化合物の特性は、当該分野で知られ ている両親媒性化合物と比較すると、本発明両親媒性化合物のインビボ活性は大 いに向上しているのでかかる潜在的副作用を最小にすることができるということ である。理論について限定されることはないが、浸透ストレス（低い全溶質濃度 における）がポリヌクレオチドの細胞中へのインビボでのトランスフェクション の成功に積極的に貢献するかもしれない。緩衝化されていない水中の医薬組成物 が標的細胞に接触する場合、かかるストレスが生じうる。それゆえ、かかる他の 好ましい組成物の使用は、嚢胞性線維症の患者の損傷を受けた肺組織のようにす でにストレスを受けている標的組織の処理には不適合であるかもしれない。した がって、例としてスクロースを用いる場合の約１５ｍＭないし約２００ｍＭの範 囲の賦形剤濃度の選択は、（１）保存すべき医薬組成物の安定化および（２）組 成物中の高濃度の溶質がトランスフェクション品質に及ぼす影響を最小にすると いう目的の折衷を提供する。 特定の処方のための特定の賦形剤の最適濃度の選択は実験の対象であるが、か かる各処方について当業者により決定されうる。 本発明のさらなる態様は、治療組成物の形成のためにプラスミドＤＮＡに接触 させる前の本発明カチオン性両親媒性化合物のプロトン化状態に関する。かかる 治療組成物を製造するための十分にプロトン化された、部分的にプロトン化され た、あるいは遊離塩基の形態の両親媒性化合物の使用は本発明の範囲内である。 両親媒性化合物Ｎｏ.６７（スペルミンコレステロールカルバメート）に関して 、トランスフェクション組成物用にこの両親媒性化合物をＤＯＰＥ（それ自体、 双性イオンとして用いられる）とともに用いる場合、導入遺伝子発現は遊離塩基 の場合に最も良好であるが、両親媒性化合物を酢酸塩として調製した場合に発現 は減少することが観察されている。一酢酸塩そして二酢酸塩と活性が段階的に低 下し、三酢酸塩は最低である。説明した状況下では、両親媒性化合物と接触する ように提供されるプラスミドＤＮＡは水中ナトリウム塩として調製された（バッ ファーなしで）。合成方法 下記方法は、本発明のある種のカチオン性両親媒性化合物の製造を説明する。 当業者は、これらの化合物を製造し、さらに本発明の他の化合物を製造するため の他の方法を認識するであろう。グループＩの両親媒性化合物 （Ａ） Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメート 図８に概説する下記手順に従ってスペルミジンコレステロールカルバメート（ 図１、Ｎｏ.５３）を合成した。Ｎ1,Ｎ8−ジＣＢＺ−Ｎ4−スペルミジンコレステロールカルバメートの合成 K.Sharma,M.J.Miller,and S.M.Payne,J.Med.Chem.,1989,32,357-367の手順に 従ってＮ1,Ｎ8−ジカルボベンゾキシスペルミジンを調製した（収率６１％、融 点１０４−１０５℃）。Ｎ1,Ｎ8−ジカルボベンゾキシスペルミジン（２５ｇ,６ ０.５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２５ｍｌ,１７８ｍｍｏｌ）を６２５ ｍｌの無水塩化メチレンに溶解し、０−４℃に冷却し、Ｎ2下で撹拌した。クロ ロギ酸コレステリル（２７.２ｇ,６０.６ｍｍｏｌ）を２５０ｍｌの塩化メチレ ンに溶解し、２０分かけて反応物に添加した。添加するとすぐに白色沈殿が生じ た。添加完了後、反応物を０−４℃で１０分間撹拌し、次いで、室温で１.５時 間撹拌した。この時点で、白色沈殿が完全に溶解した。反応物をヘキサン／酢酸 エチル ６／４を溶離液とするＴＬＣに供した（生成物Ｒｆ＝０.２５）。この 反応混合物に６２５ｍｌの塩化メチレンおよび６２５ｍｌの水を添加した。次い で、層分離させた。有機層をＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過した。濾液を減圧濃縮し て油状物質を得た。次いで、減圧乾燥を一晩行った。この粗生成物は糊様粘性を 有していた。カラムクロマトグラフィー（２ｋｇシリカゲル、溶離液−ヘキサン ／酢酸エチル ６／４）により粗生成物を精製して４６.８ｇの３−β−［Ｎ4− （Ｎ1,Ｎ8−ジカルボベンゾキシスペルミジン）カルバモイル］コレステロール （本明細書においてＮ1,Ｎ8−ジＣＢＺ−Ｎ4−スペルミジンコレステロールカル バメートとしても記載）を収率９３％で得た。スペルミジンコレステロールカルバメートの最終合成 Ｎ2下で６.０ｇの活性炭上１０％パラジウムを１リットルのエタノール中の３ ０ｇの３−β−［Ｎ4−（Ｎ1,Ｎ8−ジカルボベンゾキシスペルミジン）カルバモ イル］コレステロールの溶液に添加した（図１３参照）。反応混合物にＮ2を吹 き込み、Ｈ2下（大気圧）で１８時間撹拌した。再度混合物にＮ2を吹き込み、１ ０ｇのセライトのベッドで濾過した。フィルターケークを２リットルのエタノー ル中１０％トリエチルアミンで洗浄し、一緒にした濾液を減圧濃縮してゲル状物 質を得た。次いで、生成物を一晩減圧乾燥して粘着性固体を得た。カラムクロマ トグラフィー（２ｋｇシリカゲル、溶離液−４Ｌのクロロホルム／メタノール ９５／５、次いで、３０Ｌのクロロホルム／メタノール／イソ−プロピルアミ ン ９５／５／５、Ｒｆ＝０.２４）によりこの粗生成物を精製して１３.１ｇの 所望スペルミジンコレステロールカルバメートを収率６４％で得た。この物質の ＨＰＬＣ分析（Ｃ−１８逆相カラム、直線的グラジエント溶離−メタノール／イ ソ−プロパノール／水／トリフルオロ酢酸 ６０／２０／２０／０.１からメタ ノール／イソプロパノール／トリフルオロ酢酸 ７０／３０／０.１を経てメタ ノール／イソ−プロパノール／クロロホルム／トリフルオロ酢酸 ６０／２０／ ２０／０.１まで）により９２.２％の純度で得たが７−デヒドロコレステロール アナログが０.８％のレベルで存在していた。 この実施例およびそれ以降の実施例に関して、ホスホモリブデン酸ですべての ＴＬＣプレートを可視化した。 （Ｂ）Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメート 図９に概説する下記手順に従ってスペルミンコレステロールカルバメート（図 １、Ｎｏ.６７）を調製した。Ｎ1,Ｎ12−ジＣＢＺ−スペルミン クロロギ酸ベンジル（１.７６ｇ,１.５ｍｌ,１０.３６ｍｍｏｌ）を塩化メチ レン（５ｍｌ）に溶解し、窒素雰囲気下の３つ首フラスコに入れた。イミダゾー ル（１.４ｇ,２０.６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２０ｍｌ）に溶解し、添加漏 斗（addition funnel）に入れた。３つ首フラスコを０℃に冷却し、イミダゾー ル溶液を２０分かけて徐々に添加した。混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、 塩化メチレン（２５ｍｌ）およびクエン酸（１０％、２５ｍｌ）を添加した。層 分離させ、有機フラクションをクエン酸（１０％、２５ｍｌ）で洗浄した。有機 成分を硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。残渣を高真空、室温で１時間 乾燥した。 窒素雰囲気下で残渣にジメチルアミノピリジン（３５ｍｇ）、塩化メチレン（ ２５ｍｌ）を添加し、混合物を０℃に冷却した。添加漏斗に塩化メチレン（２５ ｍｌ）中のスペルミン（１ｇ,４.９４ｍｍｏｌ）溶液を添加した。スペルミン溶 液を１５分かけて徐々に添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、次いで、減 圧濃縮した。残渣を酢酸エチル（８０ｍｌ）に溶解し、Ｈ2Ｏ（１５ｍｌ） で３回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧濃縮して粗 白色固体を得た。フラッシュクロマトグラフィー（６５ｇシリカゲル、１００： １００：１０ ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：ＮＨ4ＯＨ、生成物Ｒｆ＝０.３３）によ りその物質を精製して、高真空で乾燥後、１.０１ｇ（２.１４６ｍｍｏｌ、収率 ４３％）の生成物を得た。Ｎ1,Ｎ12−ジＣＢＺ−Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメート クロロギ酸コレステリル（９６４ｍｇ,２.１５ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１ ０ｍｌ）に溶解し、クロロホルム（１０ｍｌ）中のＮ1,Ｎ12−ジＣＢＺスペルミ ン（１.０１ｇ,２.１５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１ｍｌ）の冷溶液（０ ℃）に滴下した。反応物を室温まで暖め、２時間撹拌した。反応溶液に水（２５ ｍｌ）およびクロロホルム（２５ｍｌ）を添加した。層分離させ、有機フラクシ ョンを硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を減圧濃縮して粗物質を得て、フラッ シュクロマトグラフィー（６８ｇシリカゲル、ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3１／４、生 成物Ｒｆ＝０.３６）により１.２３ｇ（１.３９ｍｍｏｌ、収率６５％）の生成 物を得た。Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメートの最終合成 Ｎ1,Ｎ12−ジＣＢＺ−Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメート（２６２ｍ ｇ,０.３００ｍｍｏｌ）を５ｍｌの酢酸に溶解し、４５ｍｇのＣ上１０％Ｐｄを 添加した。溶液に窒素を吹き込み、大気圧の水素下で撹拌した。加水素分解を７ 時間行った。反応混合物を濾過し、４０ｍｌの酢酸エチル／酢酸 ９／１で触媒 を洗浄し、濾液を減圧濃縮して残渣を得た。粗生成物を３５ｍｌの１Ｎ ＮａＯ Ｈに溶解し、４０ｍｌのクロロホルム／メタノール ９／１で３回抽出した。一 緒にした有機フラクションを２０ｍｌの水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した。溶 液を濾過し、減圧濃縮し、減圧乾燥して１２５ｍｇの所望生成物を収率６７％で 得た。 上記手順に関連して、触媒の毒性を最小にするためには酸性条件下で加水素分 解を行うべきであることに注意。 有機化学の当業者によく知られた一連の反応によりスペルミンまたはスペルミ ジンコレスタミンウレアのごときウレアアナログを調製することができる。例え ば、アミンを等モルのカルボニルジイミダゾールで処理し、次いで、２級アミン を添加して所望ウレアを得ることができる。（Ｃ） Ｎ,Ｎ−ビス（３−アミノプロピル）−Ｏ−コレステリル−３−カルバ メート 下記手順に従ってＮ,Ｎ−ビス（３−アミノプロピル）−Ｏ−コレステリル− ３−カルバメート（図１、Ｎｏ.６９）を調製した。 反応物質としてスペルミンのかわりにＮ−（３−アミノプロピル）１,３−プ ロパンジアミンを用いること以外はＮ1,Ｎ12−ジＣＢＺ−Ｎ4−スペルミンにつ いて上で説明した方法を用いてビス（３−ＣＢＺアミノプロピル）アミンを調製 した。溶媒としてＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／ＮＨ4ＯＨ ８０／２０／０.５を用い るシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより純粋生成物を収率３４％で単 離した。 次いで、そのようにして調製したビス（３−ＣＢＺアミノプロピル）アミンを 、Ｎ1,Ｎ8−ジＣＢＺ−Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメートの合成につ いて上で説明した方法によりクロロギ酸コレステリルと反応させた。純粋生成物 (Ｎ,Ｎビス（３−ＣＢＺアミノプロピル）−Ｏ−コレステリル−３−カルバメー ト)を収率７３％で得た。 Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメートの合成に関連して上で述べた手 順に従って、Ｎ,Ｎビス（３−ＣＢＺアミノプロピル）−Ｏ−コレステリル−３ −カルバメートからのＣＢＺ基の加水素分解によりＮ,Ｎ−ビス（３−アミノプ ロピル）−Ｏ−コレステリル−３−カルバメートの合成を行った。シリカゲルク ロマトグラフィーを行わずに収率２３％で生成物を得た。（Ｄ） Ｎ,Ｎビス（６−アミノヘキシル）−Ｏ−コレステリル−３−カルバメ ート 下記手順に従ってＮ,Ｎビス（６−アミノヘキシル）−Ｏ−コレステリル−３ −カルバメート（図１、Ｎｏ.７０）を調製した。 まず、スペルミンのかわりにビス（ヘキサメチレン）トリアミンを用いる以外 はＮ1,Ｎ12−ジＣＢＺ−スペルミンについて上で説明した方法を用いてビス（６ −ＣＢＺアミノヘキシル）アミンを調製した。トルエンからの再結晶により純粋 生成物を収率２４％で得た。 次いで、Ｎ1,Ｎ8−ジＣＢＺ−Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメートの 合成について上で説明した方法に従ってビス（６−ＣＢＺアミノヘキシル）アミ ンをクロロギ酸コレステリルと反応させた。ヘキサン／酢酸エチル ７／３を用 いるシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより生成物Ｎ,Ｎビス（６−Ｃ ＢＺアミノエチル）−Ｏ−コレステリル−３−カルバメートを収率４０％で単離 した。（Ｅ） リジン３−Ｎ−ジヒドロコレステリルカルバメート 下記手順に従ってリジン３−Ｎ−ジヒドロコレステリルカルバメート（図１、 パネルＣ）を調製した。 窒素雰囲気下、０℃で撹拌されているＴＨＦ（２０ｍｌ、Aldrich製）中のジ ヒドロコレステロール（５.０ｇ,１２.９ｍｍｏｌ、Aldrich製）、フタルアミン （２.０ｇ,１３.６ｍｍｏｌ、Aldrich製）およびトリフェニルホスフィン（３. ８ｇ,１３.６ｍｍｏｌ、Aldrich製）の溶液に、ジエチルアゾジカルボキシレー ト（２.３ｍｌ,１４.５ｍｍｏｌ、Aldrich製）を滴下した。添加完了後、反応混 合物を室温まで暖め、一晩撹拌した。反応混合物を減圧濃縮して残を得た。この 残渣を５０ｍｌのヘキサン／酢酸エチル ９５／５に溶解し、沈殿を形成させた 。混合物を濾過した。濾液を濃縮して減圧乾燥させ、２５ｍｌのヘキサン／Ｅｔ ＯＡｃ ９５／５に溶解し、２００ｇのシリカゲルでクロマトグラフィー（溶離 液 ２Ｌのヘキサン／酢酸エチル ９５／５、次いで、１Ｌのヘキサン／ＥｔＯ Ａｃ ９０／１０）を行った。所望３−フタルイミドコレスタン（５.４３ｇ） を収率７６％で得た。 ３−フタルイミドコレスタン（５.４０ｇ,９.７５ｍｍｏｌ）を６０ｍｌのメ タノールに溶解し、無水ヒドラジン（３.１ｍｌ,９９ｍｍｏｌ）を添加した。窒 素雰囲気下で反応混合物を撹拌し４時間加熱還流した。次いで、この混合物を室 温まで冷却し、３.１ｍｌの濃塩酸を添加し、得られた混合物を一晩加熱還流し た。周囲温度まで冷却し、１００ｍｌのジエチルエーテルおよび５０ｍｌの１Ｎ ＮａＯＨを添加し（最終ｐＨ １０.１）、層分離させた。水層を５０ｍｌのジ エチルエーテルで抽出し、一緒にした有機フラクションを濾過した。濾液を減圧 濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール９０ ／１０）により精製して２.２４ｇの３−アミノコレスタンを収率５９％で得た 。 Ｌ−Ｎα,Ｎε−ジＢＯＣリジンＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（２ ８６ｍｇ、０.６４４ｍｍｏｌ、Sigma製）および３−アミノコレスタン（２５０ ｍｇ,０.６４４ｍｍｏｌ）を５ｍｌの塩化メチレンに溶解し、０.１ｍｌのトリ エチルアミンを添加し、得られた溶液を窒素雰囲気下で周囲温度にて一晩撹拌し た。反応混合物に１０ｍｌの水および２５ｍｌの塩化メチレンを添加し、層分離 させた。水層を２５ｍｌの塩化メチレンで抽出し、一緒にした有機フラクション をＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過した。濾液を減圧濃縮し、２５ｇのシリカゲルによ るクロマトグラフィー（溶離液−ヘキサン／酢酸エチル ６／４、ヘキサン／Ｅ ｔＯＡｃ ９／１中に試料を適用）により残渣を精製した。精製物質を２５ｍｌ のルロロホルムに溶解し、ＨＣｌガスを溶液に２時間吹き込み、次いで、窒素を １０分間吹き込んだ。溶液を減圧濃縮して２９９ｍｇの所望生成物を二塩酸塩と して収率７９％で得た。（Ｆ） Ｎ1,Ｎ8−ビス（３−アミノプロピル）−Ｎ4−スペルミジンコレステリ ルカルバメート 下記手順に従ってＮ1,Ｎ8−ビス（３−アミノプロピル）−Ｎ4−スペルミジン コレステリルカルバメート（図１、Ｎｏ.７５）を調製した。 Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメート（１.１４ｇ,２.０４ｍｍｏｌ） をＭｅＯＨ（５ｍｌ）に溶解した。新たに蒸留したアクリロニトリル（０.２８ ｍｌ,２.０４ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温で１８時間撹拌した。溶媒を減圧 濃縮して油状物質を得た。次いで、減圧乾燥を一晩行った。カラムクロマトグラ フィーにより粗生成物を精製して１.１５ｇ（８５％）のＮ1,Ｎ8−ビス（シアノ エチル）Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメートを得た。 ラネーニッケル５０％スラリー（１.２ｇ、Aldrich製）を、９５％ ＥｔＯＨ （５０ｍｌ）中１Ｍ ＮａＯＨの入ったParr Bomb中に入れた。Ｎ1,Ｎ8−ビス（ シアノエチル）Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメートをＥｔＯＨ（３５ ｍｌ）に溶解し、bombに添加した。小室を脱気し、アルゴン下（８０−１００ｐ ｓｉ）に置くことを３回繰り返し、次いで、脱気して水素下（１００ｐｓｉ）に 置くことを３回繰り返した。室温にて水素下（１００ｐｓｉ）で反応物を７２時 間撹拌した。消失を脱気しアルゴン下に置いた。濾過により触媒を除去した。濾 液を減圧濃縮した。得られた油状物質を２：１ ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ（１００ ｍｌ）に溶解し、Ｈ2Ｏ（３５ｍｌ、次いで、２５ｍｌ）で洗浄した。有機層を Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、濾過した。濾液を減圧濃縮し、１００ｇのシリカゲルによ るクロマトグラフィー（溶離液−ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／濃ＮＨ4ＯＨ ４０／２ ５／１０、ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ ４０／２５中に試料を適用）により残渣を精 製した。精製された物質を、ｉＰｒＯＨ（３ｘ５０ｍｌ）次いで、ＣＨ2Ｃｌ2（ ３ｘ５０ｍｌ）とともに減圧濃縮し、次いで、減圧乾燥して９８６ｍｇ（８５％ ）のＮ1,Ｎ8−ビス（３−アミノプロピル）−Ｎ4−スペルミジンコレステリルカ ルバメートを得た。（Ｇ） Ｎ（Ｎ4−３−アミノプロピル−スペルミジン）コレステリルカルバメ ート 下記のごとくＮ（Ｎ4−３−アミノプロピル−スペルミジン）コレステリルカ ルバメート（図１、Ｎｏ.７８）を調製した： Ｎ1,Ｎ8−ジカルボベンゾキシスペルミジン（１.０ｇ,２.４ｍｍｏｌ）をＭｅ ＯＨ（１０ｍｌ）に溶解した。新たに蒸留したアクリロニトリル（０.３ｍｌ,４ .５ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で１８時間撹拌した。溶媒を減圧濃縮し て油状物質を得た。カラムクロマトグラフィー（１００ｇシリカゲル、溶離液− ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ １／１９）により粗生成物を精製して１.１０ｇ（９７％ ）のＮ4−２−シアノエチル−Ｎ1,Ｎ8−ジカルボベンゾキシスペルミジンを得た 。 Ｎ4−２−シアノエチル−Ｎ1,Ｎ8−ジカルボベンゾキシスペルミジン（０.５ ｇ,１.０７ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（５ｍｌ）に溶解し、ＣｏＣｌ2（２８０ｍｇ, ２.１５ｍｍｏｌ、Aldrich製）を添加した。青色溶液をアイスバスで冷却し、Ｎ ａＢＨ4（４０５ｍｇ,１０.７ｍｍｏｌ、Aldrich製）を少しずつ１５分かけて添 加した。得られた黒色溶液を室温で１時間撹拌した。この間、黒色溶液が青色溶 液に変化した。反応物にＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ ２／１（３０ｍｌ）を添加した 。黒色沈殿が生じた。これにＨ2Ｏ（２０ｍｌ）を添加し、混合物を濾過した。 生じた層を分離し、有機層をＭｇＳＯ4で乾燥した。乾燥剤を濾過し、濾液を減 圧濃縮して油状物質を得た。カラムクロマトグラフィー（５０ｇシリカゲル、溶 離液−ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／濃ＮＨ4ＯＨ １００／１００／５）により粗生成 物を精製して３０９ｍｇ（６２％）のＮ4−３−アミノプロピル−Ｎ1,Ｎ8−ジカ ルボベンゾキシスペルミジンを得た。 ＣＨ2Ｃｌ2に溶解されたＮ4−３−アミノプロピル−Ｎ1,Ｎ8−ジカルボベンゾ キシスペルミジン（３００ｍｇ,０.６６ｍｍｏｌ）に、Ｎ2下でＥｔ3Ｎを添加し た。クロロギ酸コレステリル（３２６ｍｇ,０.７２６ｍｍｏｌ、Aldrich製）を ＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、反応物に滴下した。混合物を室温で２時間撹拌した。ＣＨ2 Ｃｌ2（２５ｍｌ）およびＨ2Ｏ（１０ｍｌ）を添加後、層分離させた。有機層 をＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過した。濾液を減圧濃縮して６４０ｍｇの粗生成物を 得た。８０ｇのシリカゲルによるクロマトグラフィー（溶離液−ＣＨＣｌ3／Ｍ ｅＯＨ ９０／１０、ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ ９０／１０に試料を適用）により 残渣を精製した。精製物質を減圧濃縮し、次いで、減圧乾燥して３２９ｍｇ（５ ７％）のＮ−（Ｎ4−３−アミノプロピル−Ｎ1,Ｎ8−ジカルボベンゾキシスペル ミジン）コレステリルカルバメートを得た。 炭素上１０％Ｐｄ（６５ｍｇ、Aldrich製）に、酢酸（２５ｍｌ）中のＮ−(Ｎ4 −３−アミノプロピル−Ｎ1,Ｎ8−ジカルボベンゾキシスペルミジン)コレステ リルカルバメート（３００ｍｇ）の溶液を添加した。反応物をＨ2下に置き、室 温で一晩撹拌した。Ｎ2下に置いた後、反応物を濾過した。ＥｔＯＡｃ中１０％ 酢酸（５０ｍｌ）で触媒を洗浄した。濾液を減圧濃縮して油状物質を得た。油状 物質を２／１ ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ（３５ｍｌ）に溶解し、１Ｍ ＮａＯＨ（ １ ５ｍｌ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過した。濾液を減圧濃縮 し、減圧乾燥して１９６ｍｇ（９３％）のＮ−（Ｎ4−３−アミノプロピルスペ ルミジン）コレステリルカルバメートを得た。（Ｈ） Ｎ−［Ｎ1,Ｎ4,Ｎ8−トリス（３−アミノプロピル）スペルミジン］コ レステリルカルバメート Ｎ1,Ｎ8ビス（３−アミノプロピル）−Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバ メートの調製に関して説明したように、Ｎ−（Ｎ4−３−アミノプロピルスペル ミジン）コレステリルカルバメートをアセトニトリルを反応させ（収率９０％） 、次いで、ラネーニッケルを用いる二付加化合物の反応により（収率７５％）、 Ｎ−［Ｎ1,Ｎ4,Ｎ8−トリス（３−アミノプロピル）スペルミジン］コレステリ ルカルバメートを調製した。（Ｉ） Ｎ,Ｎ−ビス（４−アミノブチル）コレステリルカルバメート Ｎ,Ｎ−ビス（４−アミノブチル）コレステリルカルバメート（図１、Ｎｏ.８ ２）を下記のごとく調製した。 ｎ−ブタノール（５０ｍｌ）中のベンジルアミン（２.０ｇ,１８.６ｍｍｏｌ 、Aldrich製）、Ｎａ2ＣＯ3（４.４ｇ,４２ｍｍｏｌ）およびＫＩ（１.４ｇ,９. ５ｍｍｏｌ）の混合物に、窒素下において、４−クロロブチロニトリル（４.０ ｍｌ,９５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を窒素下で４８時間還流して撹拌した 。室温まで冷却後、ジエチルエーテル（５０ｍｌ）を添加し、沈殿を濾別した。 濾液を減圧濃縮して油状物質を得た。トルエン（１００ｍｌ）を添加し、溶液を 減圧濃縮した。クロロホルム（１００ｍｌ）を添加し、再度溶液を減圧濃縮し、 次いで、１８時間減圧乾燥した。得られた油状物質をクロロホルム（１００ｍｌ ）に溶解し、濾過し、次いで、減圧濃縮した。カラムクロマトグラフィー（２５ ０ｇシリカゲル、溶離液−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ ６０／４０）により粗生成物 を精製して３.７５ｇ（９７％）のＮ,Ｎ−ビス（３−シアノプロピル）ベンジル アミンを得た。 Ｎ,Ｎ−ビス（３−シアノプロピル）ベンジルアミン（３.７ｇ,１７.８ｍｍｏ ｌ）をＥｔＯＨ（１５０ｍｌ）に溶解し、酢酸（４ｍｌ）を添加した。 Ｎ2下で溶液を炭素上１０％Ｐｄに添加した。混合物をＨ2下に置き、反応物を室 温で１８時間撹拌した。反応物をＮ2下に置いた。触媒を濾別し、ＥｔＯＨ（１ ５０ｍｌ）で洗浄した。濾液を減圧濃縮し、クロロホルム（５０ｍｌ）を添加し 、再度減圧濃縮した。得られた油状物質を０.５時間減圧乾燥し、次の工程に直 接用いた。ＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）に溶解されたこの油状物質に、Ｎ2下でＥ ｔ3Ｎ（５ｍｌ,３５ｍｍｏｌ）を添加し、溶液をアイスバスで冷却した。クロロ ギ酸コレステリル（６.２ｇ,１３.８７ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ） に溶解し、この溶液を反応物に１０分かけて滴下した。冷浴を取り去り、反応物 をＮ2下で室温にて１８時間撹拌した。ＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）およびＨ2Ｏ（ １００ｍｌ）を添加し、生じた層を分離させた。有機層をＭｇＳＯ4で乾燥させ 、濾過した。濾液を減圧濃縮し、１時間減圧乾燥した。粗生成物をカラムクロマ トグラフィー（６００ｇシリカゲル、溶離液−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ６０／４０ ）により精製して１.０５ｇ（１０％）のＮ,Ｎ−ビス（３−シアノプロピル）コ レステリルカルバメートを得た。 ９５％ＥｔＯＨ（５０ｍｌ）中１Ｍ ＮａＯＨの入ったBarr Bombにラネーニッ ケル５０％スラリー（１.２ｇ）を入れた。Ｎ,Ｎ−ビス（３−シアノプロピル） コレステリルカルバメート（１.０ｇ,１.７７ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ（１００ｍ ｌ）に溶解し、bombに入れた。小室の脱気およびアルゴン置換（１００ｐｓｉ） を３回繰り返し、次いで、脱気および水素置換（１００ｐｓｉ）を３回繰り返し た。反応物を水素下（１００ｐｓｉ）、室温にて４日間撹拌した。小室を脱気し 、アルゴン下に置いた。濾過により触媒を除去した。濾液を減圧濃縮した。得ら れた油状物質を２：１ ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ（２５０ｍｌ）に溶解し、Ｈ2Ｏ （７５ｍｌおよび２５ｍｌ）で２回洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、濾 過した。濾液を減圧濃縮し、１１０ｇのシリカゲル（溶離液−ＣＨＣｌ3／Ｍｅ ＯＨ／ｉＰｒＮＨ2 ９５／５／５、試料をＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ ９５／５中に 適用）によるクロマトグラフィーにより残渣を精製した。精製物質を減圧濃縮し 、次いで、減圧乾燥して９００ｍｇ（８５％）のＮ,Ｎ−ビス（４−アミノブチ ル）コレステリルカルバメートを得た。（Ｊ） Ｎ,Ｎ−ビス（Ｎ'−３−アミノプロピル−４−アミノブチル）コレステ リルカルバメート Ｎ,Ｎ−ビス（４−アミノブチル）コレステリルカルバメートをアクリロニト リルと反応させ（収率８２％）、次いで、Ｎ1,Ｎ8−ビス（３−アミノプロピル ）−Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメートの調製について説明したよう にアクリロニトリル付加化合物をラネーニッケルと反応（収率８１％）させるこ とにより、Ｎ,Ｎ−ビス（Ｎ'−３−アミノプロピル−４−アミノブチル）コレス テリルカルバメート（図１、Ｎｏ.８３）を調製した。（ｋ） Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルボキシアミド 以下のようにしてＮ4−スペルミジンコレステリルカルボキシアミド（図１、 Ｎｏ.９０）を調製した。 ＴＨＦ（５０ｍｌ）中の塩化コレステリル（５.０ｇ,１２.３ｍｍｏｌ）の溶 液を、還流しているＴＨＦ（２５ｍｌ）中のマグネシウムリボン（３９０ｍｇ） に０.５時間かけて滴下した。最初に、インドール少々とインドメタン３滴を添 加して反応を開始した。３時間還流後、反応物を室温までれ医局した。この混合 物をドライアイス（１０ｇ）上に注ぎ、次いで、１時間撹拌した。この溶液をア イスバスで冷却し、氷冷１Ｍ Ｈ2ＳＯ4（１００ｍｌ）に添加した。５分間撹拌 後、塩化ナトリウム（１ｇ）およびジエチルエーテル（１００ｍｌ）を添加した 。層分離させ、水層をジエチルエーテル（１００ｍｌ）で抽出した。一緒にした 有機層をＨ2Ｏ（３０ｍｌ）中のチオ硫酸ナトリウム五水和物（１２０ｍｇ）の 溶液で洗浄した。有機層を減圧濃縮し、１８時間減圧乾燥した。粗固体をヘキサ ン（２５０ｍｌ）で粉砕した。濾過後、固体を氷冷ヘキサン（１０ｍｌ）で洗浄 した。固体を１時間減圧乾燥した。得られたコレステリルカルボン酸（３.０ｇ, ５９％）は純度約９０％であり、さらに精製せずに使用した。 コレステリルカルボン酸（５００ｍｇ,１.２ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシ サクシンイミド（１４０ｍｇ,１.２ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2に溶解した。この溶 液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（２７５ｍｇ,１.３２ｍｍｏｌ）を添加 し、反応物をＮ2下で２時間撹拌した。Ｎ1,Ｎ8−ジカルボベンゾキシスペルミジ ン（４７４ｍｇ,１.２ｍｍｏｌ）およびＥｔ3Ｎ（１.０ｍｌ,７.１ｍｍｏｌ）を 添加し、反応物をＮ2下で７２時間撹拌した。反応物を濾過し、沈殿をＣＨ2Ｃｌ2 （５０ｍｌ）で洗浄した。濾液をＨ2Ｏ（２５ｍｌ）で洗浄した。分離した有機 層をＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過した。濾液を減圧濃縮し、１５０ｇのシリカゲル によるクロマトグラフィー（溶離液−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ １／１）により残 渣を精製した。精製物質を減圧濃縮し、次いで、減圧乾燥して６８０ｍｇ（７０ ％）のＮ1,Ｎ8−ジカルボベンゾキシ−Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルボキ シアミドを得た。 Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメートの調製において説明したように 、Ｎ1,Ｎ8−ジカルボベンゾキシ−Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルボキシア ミドからカルボベンゾキシ基を除去した。精製生成物Ｎ4−スペルミジンコレス テリルカルボキシアミドを収率５３％で得た。グループＩＩの両親媒性化合物 （Ａ）Ｎ1,Ｎ8−ビス（アルギニンカルボキシアミド）−Ｎ4−スペルミジンコレ ステリルカルバメート 以下のようにしてＮ1,Ｎ8−ビス（アルギニンカルボキシアミド）−Ｎ4−スペ ルミジンコレステリルカルバメート（図５、Ｎｏ.９５）を調製した。 ＣＨ2Ｃｌ2（２５ｍｌ）中のＮ(a),Ｎ(e),Ｎ(e)（アルファ、エプシロン、エ プシロン）−トリカルボベンゾキシアルギニンに、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミ ド（１００ｍｇ,０.８９ｍｍｏｌ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（２ ４０ｍｇ,０.８９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＮ2下で室温で２.５時間撹拌 した。Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメート（２５０ｍｇ,０.４４８ｍ ｍｏｌ）およびＥｔ3Ｎ（０.２５ｍｌ,１.８ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をＮ2 下で室温で７２時間撹拌した。反応物を濾過し、沈殿をＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ） で洗浄した。濾液をＨ2Ｏ（２０ｍｌ）で洗浄した。分離した有機 層をＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過した。濾液を減圧濃縮し、７０ｇのシリカゲルに よるクロマトグラフィー（溶離液−ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ ９５／５）により残 渣を精製した。精製物質を減圧濃縮し、次いで、減圧乾燥して５３３ｍｇ（７１ ％）のＮ1,Ｎ8−ビス（Ｎ(a),Ｎ(e),Ｎ(e)−トリカルボベンゾキシアルギニンカ ルボキシアミド）−Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメートを得た。 Ｎ−（Ｎ4−３−アミノプロピルスペルミジン）コレステリルカルバメートの 調製について説明したようにして、Ｎ1,Ｎ8−ビス（Ｎ(a),Ｎ(e),Ｎ(e)−トリカ ルボベンゾキシアルギニンカルボキシアミド）−Ｎ4−スペルミジンコレステリ ルカルバメートからカルボベンゾキシ基を除去した。生成物Ｎ1,Ｎ8−ビス（ア ルギニンカルボキシアミド）−Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメートを 収率２７％で得た。グループＩＩＩの両親媒性化合物 （Ａ） Ｎ,Ｎ−ジオクタデシルリジンアミド 以下の手順に従ってＮ,Ｎ−ジオクタデシルリジンアミド（図６、Ｎｏ.７３） を調製した。Ｎ,Ｎ−ジオクタデシルアミン（１.３５ｇ,２.５８ｍｍｏｌ、Fluk a製）およびＬ−ｎα,Ｎε−ジＢＯＣリジンＮ−ヒドロキシサクシンイミドエス テル（１.００ｇ,２.５８ｍｍｏｌ、Sigma製）を１５ｍｌの塩化メチレン中で一 緒にし、２ｍｌのトリエチルアミンを添加した。反応混合物を短時間加熱して完 全に溶解させ、次いで、周囲温度で一晩撹拌した。水（２０ｍｌ）および塩化メ チレン（５０ｍｌ）を反応混合物に添加し、層分離させた。水性フラクションを ５０ｍｌの塩化メチレンで２回抽出した。一緒にした有機フラクションをＭｇＳ Ｏ4で乾燥し、減圧濃縮した。カラムクロマトグラフィー（１５０ｇシリカゲル 、溶離液−ヘキサン／酢酸エチル ８／２）により残渣を精製した。精製物質Ｎ ,Ｎ−ジオクタデシル−Ｎα,Ｎε−ジＢＯＣリジンアミド（１.５９ｇ）を２５ ｍｌのクロロホルムに溶解し、２時間撹拌し、その間、ＨＣｌガスを溶液に吹き 込んだ。この溶液にＮ2ガスを吹き込み、減圧濃縮した。Ｎ,Ｎ−ジオクタデシル リジンアミド（１.３４ｇ）を二塩酸塩として収率６８％で得た。（Ｂ） Ｎ1,Ｎ1−ジオクタデシル−１,２,６−トリアミノヘキサン 以下のようにしてＮ1,Ｎ1−ジオクタデシル−１,２,６−トリアミノヘキサン （図６、Ｎｏ.４７）を調製した。周囲温度で撹拌されている３０ｍｌの無水Ｔ ＨＦ中のＮ,Ｎ−ジオクタデシル−Ｎα,ｎε−ジＢＯＣリジンアミド（７６０ｍ ｇ,０.８２３ｍｍｏｌ）に、ＬｉＡｌＨ4（１８５ｍｇ,４.８７ｍｍｏｌ）を少 しずつ添加した。反応混合物をアルゴン雰囲気下で周囲温度で一晩撹拌した。２ ｍｌの水を滴下することにより反応を停止し、得られた溶液を減圧濃縮した。こ の残渣に、１０ｍｌの１Ｍ ＨＣｌ、５０ｍｌの塩化メチレン、次いで、１０ｍ ｌの１Ｍ ＮａＯＨ（最終ｐＨ １０）を順次添加した。層分離させ、水性フラ クションを５０ｍｌの塩化メチレンで２回抽出した。一緒にした有機層をＭｇＳ Ｏ4で乾燥し、濾過した。フィルターケークを５０ｍｌの塩化メチレンで洗浄し た。一緒にした濾液を減圧濃縮して７００ｍｇの粗生成物を得た。カラムクロマ トグラフィー（８０ｇシリカゲル、溶離液−ヘキサン／酢酸エチル７／３）によ り粗生成物を精製した。精製物質を含有するフラクションを一緒にし、減圧濃縮 してジＢＯＣ誘導体として保護された４９０ｍｇの生成物を得た。このジＢＯＣ 誘導体２００ｍｇに４ｍｌのクロロホルムおよび１ｍｌのＴＦＡを添加した。得 られた反応混合物を周囲温度で２時間撹拌し、減圧濃縮した。残渣を２５ｍｌの 水および２５ｍｌの塩化メチレンに溶解し、約２ｍｌの濃アンモニア水でｐＨを 約１０に合わせた。層分離させ、水層を２５ｍｌの塩化メチレンで２回抽出した 。有機フラクションを一緒にし、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧濃縮した。得られた 残渣を１０ｍｌのジエチルエーテルに溶解し、ＨＣｌガスを溶液に２分間吹き込 み、溶液を一晩４℃に冷却した。濾過により沈殿生成物を集め、冷（４℃）ジエ チルエーテルで洗浄し、減圧乾燥して１６０ｍｇの所望生成物を収率６７％で得 た。グループＩＶの両親媒性化合物 （Ａ） １−（Ｎ4−スペルミン）−２,３−ジラウリルグリセロールカルバメー ト 下記のごとく１−（Ｎ4−スペルミン）−２,３−ジラウリルグリセロールカル バメート（図７、Ｎｏ.８９）を調製した。ＴＨＦ（２０ｍｌ）中の３−ベンジ ルアキシ−１,２−プロパンジオール（１.００ｇ,５.４９ｍｍｏｌ）の溶液を、 ＴＨＦ（３０ｍｌ）中の水素化ナトリウム懸濁液（油中６０％ ｗ／ｗ、５５０ ｍｇ,１３.７２５ｍｍｏｌ）に添加し、乾燥窒素下で一晩還流した。ＴＨＦ（２ ０ｍｌ）中のドデシルメタンスルホネート（３.３９ｇ,１２.０７８ｍｍｏｌ） の溶液を添加し、反応物をさらに２日間還流した。室温まで冷却後、反応物をセ ライトのベッドで濾過し、ＴＨＦですすいだ。濾液を減圧濃縮して黄色油状物質 を得て、これをジエチルエーテル（１００ｍｌ）に再溶解した。エーテル溶液を ０.１Ｎ ＮａＯＨ（３０ｍｌ）、次いで蒸留水（２ｘ３０ｍｌ）で洗浄した。 有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧濃縮して赤褐色油状物質を得 た。３％酢酸エチル／ヘキサンで溶離するフラッシュカラムクロマトグラフィー （３００ｇシリカゲル）により粗物質を精製した。所望生成物をうす黄色油状物 質として得て、1Ｈ ＮＭＲにより３−ＯＢｎ−１,２−ジラウリルグリセロール （１.７０ｇ,６０％）であると特徴づけた。水素雰囲気下でエタノール（１００ ｍｌ）中の３−ＯＢｎ−１,２−ジラウリルグリセロール（１.７０ｇ,３.２８ｍ ｍｏｌ）を１０％Ｐｄ／Ｃ（２５０ｍｇ,１５重量％）とともに４２時間撹拌し た。反応物に窒素を吹き込み、触媒を除去するためにセライトで濾過し、エタノ ールですすいだ。濾液を減圧濃縮して固体を得た。１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン で溶離するフラッシュカラムクロマトグラフィー（１４０ｇシリカゲル）により 粗物質を精製した。所望生成物を白色固体として単離し、1Ｈ ＮＭＲにより１, ２−ジラウリルグリセロール（１.２３ｇ,８８％）であると特徴づけた。 トルエン中ホスゲンの１.９３Ｍ溶液（０.７７ｍｌ,１.４９ｍｍｏｌ）を、塩 化メチレン（１０ｍｌ）中の１,２−ジラウリルグリセロール（５８０ｍｇ,１. ３５ｍｍｏｌ）およびＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン８０.２６ｍｌ,１.４ ９ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、一晩撹拌した。６０：２５：４ クロロホルム／ メタノール／水（８０ｍｌ）中のＮ1,Ｎ12−ジ−ＣＢｚ−スペルミン・ ２ＨＣｌ（７３４ｍｇ,１.３５ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。３時間後、さらに １当量のＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０.２６ｍｌ,１.４９ｍｍｏｌ） を添加した。３時間後、さらに０.５当量のＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン （０.１３ｍｌ,０.７５ｍｍｏｌ）を添加し、窒素下で反応物を一晩室温で撹拌 した。反応物を１Ｍ ＮａＯＨ（２０ｍｌ）、次いで蒸留水（１５ｍｌ）で洗浄 した。有機層を分離し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧濃縮して白色 固体を得た。９０：１０：０.５ クロロホルム／メタノール／水酸化アンモニ ウムで溶離するフラッシュカラムクロマトグラフィー（１２５ｇシリカゲル）に より粗物質を精製した。所望生成物を油状物質として単離し、1Ｈ ＮＭＲによ り１−（Ｎ4−（Ｎ1,Ｎ12−ジ−ＣＢｚ−スペルミン））−２,３−ジラウリルグ リセロールカルバメート（１８８ｍｇ,１５％）であると特徴づけた。 １−（Ｎ4−（Ｎ1,Ｎ12−ジ−ＣＢｚ−スペルミン））−２,３−ジラウリルグ リセロールカルバメート（１８８ｍｇ,０.２０３ｍｍｏｌ）を氷酢酸（１０ｍｌ ）に溶解し水素雰囲気下で１０％Ｐｄ／Ｃ（４５ｍｇ,２４重量％）とともに５ 時間撹拌した。減圧濾過により触媒を除去し、１０％酢酸／酢酸エチル（１０ｍ ｌ）ですすいだ。ロータリーエバポレーターにより濾液を減圧濃縮して油状物質 とした。得られた油状物質を１０％メタノール／クロロホルム（８５％）に溶解 し、１Ｍ ＮａＯＨ（１５ｍｌ）、次いで蒸留水（１０ｍｌ）で洗浄した。有機 層を分離し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧濃縮して油状物質を得た 。1Ｈ ＮＭＲにより生成物を１−（Ｎ4−スペルミン）−２,３−ジラウリルグ リセロールカルバメート（１２５ｍｇ,９４％）であると特徴づけた。 当業者の知識の範囲内の手順に従って本発明の他の両親媒性化合物を調製する ことができる。 実施例 下記実施例は本発明の典型例である。実施例１−細胞トランスフェクションアッセイ ３.３５μモルのスペルミジンコレステロールカルバメート（両親媒性化合物 Ｎｏ.５３）の試料および中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミ ン（ＤＯＰＥ）を別々に、それぞれクロロホルム中に溶解してストック標品とし た。溶液を混合後、減圧蒸発（２０ｍｍＨｇ）により混合物からクロロホルムを 除去することにより薄層を得た。薄層をさらに２４時間減圧乾燥（１ｍｍＨｇ） した。上記のごとく、本発明のいくつかの両親媒性化合物は、ＤＯＰＥのごとき 共存脂質とともにアシル基転移反応に関与し、あるいはそれ自体の分解を引き起 こしうる他の反応をこうむる。したがって、両親媒性化合物／共存脂質組成物を 、使用まで、−７０℃のごとき低温にて保存することが好ましい。 分散懸濁液を得るために、薄層を滅菌脱イオン水（１ｍｌ）にて１０分間水和 し、次いで、１分間ボルテックス撹拌した（水浴式ソニケーターで１０ないし２ ０分ソニケーションしてもよく、ＣＤ−コルのごとき他の両親媒性化合物につい てはソニケーションが有用であることがわかった）。次いで、得られた懸濁液を ４ｍｌの水で希釈して、６７０μＭカチオン性両親媒性化合物および６７０μＭ 中性共存脂質の溶液を得た。 スペルミンコレステロールカルバメート（両親媒性化合物Ｎｏ.６７）および 本発明の他の両親媒性化合物を用いてさらに実験を行った。スペルミンコレステ ロールカルバメートに関しては、試験条件下におけるＤＯＰＥに対する両親媒性 化合物の最適モル比は１：２であると決定され、１：１ではなかった。本発明の 多くの両親媒性化合物に関する最適比を図１３、１４および１５に示すが、それ らは当業者により容易に決定される。 トランスフェクション溶液の調製のために、β−ガラクトシダーゼをコードし ているＤＮＡ（ｐＣＭＶβ ClonTech,Palo Alto,CA）をＯｐｔｉＭＥＭ培地（G ibco/BRL No.31885-013）に溶解した。得られた溶液はＤＮＡ濃度が９６０μＭ であった（コードしているＤＮＡ中のヌクレオチドの平均分子量を３３０ダルト ンとして）。 下記手順を用いて、ＤＯＰＥと組み合わされたカチオン性両親媒性スペルミジ ンコレステロールカルバメートの１：１モル比の混合物を試験した。共存脂質（ ６ ７０μＭ）を含有する１６５μｌのスペルミジンコレステロールカルバメート（ ７６０μＭ）を、各ウェルにＯｐｔｉＭＥＭ（１６５μｌ）を入れた９６ウェル プレート中の８個の別個のウェルにピペットで入れた。次いで、得られた３３５ μｌの溶液を７回逐次希釈して、それぞれ体積１６５μｌの３３５μＭから２. ６３μＭまでの濃度の８種の個々の両親媒性化合物含有溶液を得た。かくして、 全部で６４種の溶液を調製し、８種の異なる濃度の両親媒性化合物／ＤＯＰＥに つきそれぞれ８つのウェルが得られた。 これとは別に、ＤＮＡ溶液（１６５μｌ,９６０μＭ）をＯｐｔｉＭＥＭ（１ ６５μｌ）の入った８つのウェルにピペットで入れ、次いで、得られた４８０μ Ｍ溶液を７回逐次希釈して、ウェル中に４８０μＭから３.７５μＭまでの範囲 の８種のＤＮＡ濃度である１６５μｌの各溶液を得た。 次いで、６４個の試験溶液（カチオン性両親媒性化合物：中性脂質）を６４個 のＤＮＡ溶液と混合して６４個のウェル中に個々の混合物を調製した。それぞれ は体積３３０μｌであり、一方の軸に沿ってＤＮＡ濃度は２４０μＭから１.８ ７５μＭまでの範囲であり、もう一方の軸に沿って脂質濃度は１６７μＭから１ .３２μＭの範囲であった。かくして、それぞれが異なる両親媒性化合物：ＤＮ Ａ比および／または濃度を有する全部で６４個の溶液を調製した。それらのＤＮ Ａと両親媒性化合物との溶液を１５ないし３０分放置して複合体を形成させた。 University of Noeth Carolina,Chapel HillのJames Yankaskas博士から提供 されたＣＦＴ−１細胞系（乳頭腫ウイルスで不死化されたヒト・嚢胞性線維症気 管支上皮細胞）をインビトロアッセイに使用した。細胞は、嚢胞性線維症トラン スメンブランコンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）蛋白をコードしている 遺伝子の変異対立遺伝子（位置５０８におけるフェニルアラニンの欠失、以後Δ ５０８という）に関してホモ接合体であった。ＣＦＴＲはｃＡＭＰにより調節さ れるクロライド（Ｃｌ-）チャンネル蛋白である。典型的には、ＣＦＴＲ遺伝子 の変異は、例えば、感染した上皮組織の細胞膜を通してのＣｌ-チャンネル活性 の完全な消失を引き起こす。 Δ５０８変異は嚢胞性線維症に関連した最もありふれた変異である。Δ５０８ 変異の特性および嚢胞性線維症の遺伝学に関する議論については、特にCheng et al.,Cell,63,827-834(1990)参照さらにRiordan et al.,Science,245,1066-1073 (1989)；Gregory et al.の公開された欧州特許出願第９１３０１８１９.８号（ 公開番号第０４４６０１７）；およびGregory et al.,Nature,347,382-385(1990 )参照。 ２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ Irvine Scientific,No.3000）および７種のさら なる補足成分を補足したHams F12栄養培地（Gibco/BRL No.31765-027）にて細胞 を培養した。次いで、細胞を約７５００個／ウェルの密度で９６ウェル組織培養 プレート中に撒いた。アッセイに用いる前に、集密パターンが達成されるまで細 胞を５ないし７日間増殖させた。 割り当てられた時間経過後、ＣＦＴ−１細胞の入った９６ウェルプレートを吸 引して増殖培地を除去した。種々の濃度のＤＮＡ脂質複合体（１００μｌ）を、 細胞と接触したＤＮＡ−脂質複合体の入った３枚の９６ウェルプレートのそれぞ れに移した。３枚のプレートのうちの１枚にＤＮＡのみ／細胞および脂質のみ／ 細胞の対象ウェルも調製した。 ＤＮＡ−脂質複合体の１００μｌの溶液を細胞上に６時間維持し、その後、５ ０μｌの３０％ＦＢＳ（ＯｐｔｉＭＥＭ）を各ウェルに添加した。さらに２０時 間のインキュベーション時間後、さらに１００μｌのＯｐｔｉＭＥＭ中１０％Ｐ ＢＳを添加した。さらに２４時間のインキュベーション時間後、蛋白およびβ− ガラクトシダーゼの発現に関して細胞をアッセイした。 アッセイのために、得られた培地を培地から除去し、細胞をリン酸緩衝化セイ ラインで洗浄した。次いで、溶解バッファー（５０μｌ,２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ,ｐＨ８.０,０.１５％ Triton X-100）を添加し、細胞を３０分溶解し た。９６ウェルプレートを１０秒間注意深くボルテックス撹拌して細胞および細 白アッセイ試薬（Pierce Company,No.23236）の入ったプレートに移した。各ア ッセイに蛋白標準曲線をつけて、５９５ｎｍのフィルターを装備したBio-Radの ４５０型プレートリーダーにより蛋白アッセイプレートを読んだ。リン酸緩衝化 セイライン（５０μｌ）を残存溶解物に添加し、次いで、クロロフェノールレッ ドガラクトピラノシド（１００μｌ、１ｍｌあたり１ｍｇ、Calbiochem No.2205 88）、６０ｍＭリン酸水素化二ナトリウム（ｐＨ８.０）、１ｍＭ硫酸マグネシ ウム、１０ｍＭ塩化カリウムおよび５０ｍＭ２−メルカプトエタノールからなる バッファー溶液を添加することにより各ウェルのβ−ガラクトシダーゼ活性のレ ベルを測定した。クロロフェノールレッドガラクトピラノシド、次いで、酵素的 加水分解（β−ガラクトシダーゼ）により、５７０ｎｍのフィルターを装備した プレートリーダーにより検出される赤色が生じた。β−ガラクトシダーゼ（Sigm a No.G6512）標準曲線を各アッセイのキャリブレーションに用いた。 バックグラウンド値を差し引いた後、プレートリーダーにより測定された光学 的データによりβ−ガラクトシダーゼ活性および蛋白濃度を決定した。既知トラ ンスフェクタント、例えば、ＤＭＲＩＥ（１,２−ジミリストイルオキシプロピ ル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）により発現される β−ガラクトシダーゼ量との比較において、本発明化合物は、気道上皮細胞への トランスフェクションおよびその中でのβ−ガラクトシダーゼ発現において特に 効果的である。ＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥ（１：１）と比較して、スペルミジンコレ ステロールカルバメート：ＤＯＰＥ混合物（これも１：１）は約５倍に向上した トランスフェクション効率を示した（例えば、図１３、１４および１５）。実施例２−ヒト・嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレータ −蛋白をコードしている遺伝子のトランスフェクション 細胞をトランスフェクションし、その中で生化学的修正を誘導する本発明カチ オン性両親媒性化合物の能力を、個別インビトロアッセイを用いて測定した。不 死化ヒト・嚢胞性線維症気道細胞（上記ＣＦＴ−１）を用いた。 アッセイのための調製において、約６０％集密となるまで細胞をガラス製スラ イドグラス上で増殖させた。次いで、スペルミジンコレステロールカルバメート ：ＤＯＰＥ（１：１）および野生型ヒト・ＣＦＴＲをコードしているプラスミド （ｐＣＭＶ−ＣＦＴＲ）の複合体を用いて細胞をトランスフェクションｐＣＭＶ −ＣＦＴＲプラスミドは、ＣＦＴＲをコードしている配列およびそれに続く調節 エレメント、ＣＭＶプロモーターおよびエンハンサー、ならびにＳＶ４０ポリア デニレーションシグナルを含む構築物である。この実施例の実施に適するさらな る構築物はｐＭＴ−ＣＦＴＲ（Cheng,et al.,Cell,63,827-834(1990)）である。 使用複合体は、１０.５μＭのスペルミジンコレステロールカルバメート（さら にＤＯＰＥも）およびヌクレオチドとして３０μＭのｐＣＭＶ−ＣＦＴＲであっ た。 両親媒性化合物により媒介されるトランスフェクションから４８時間後、６− メトキシ−Ｎ−（３−スルホプロピル）キノリニウム（ＳＰＱ）アッセイを用い て、ｃＡＭＰにより刺激されるＣｌ-チャンネル活性について細胞を試験した。 アッセイの方法論に関するさらなる情報についてはS.Cheng et al.,Cell,66,102 7-1036(1991)参照。アッセイにおいて、ハロゲン化物感受性蛍光発色物質ＳＰＱ （Molecular Probes,Eugene,Oregonから得た）ｃＡＭＰ依存性Ｃｌ-チャンネル 活性を評価した。ハロゲン化物透過性の増加はより迅速なＳＰＱ蛍光の増加を引 き起こし、Ｃｌ-透過性を評価することにおいては変化速度（蛍光の絶対的な変 化よりもむしろ）が重要な変数である。背景となる情報についてはRich et al., Nature,347,358-363(1990)も参照。 倒立顕微鏡（Nikon製）、Universal Imaging製のデジタルイメージングシステ ムおよびＩＣＣＤカメラ（Hamamatsu,Inc.製）を用いて個々の細胞におけるＳＰ Ｑ分子の蛍光を測定した。予想される蛍光特性の変化速度についての前知識なし に細胞を分析用に選択した。 各実験において、９０ないし１００個の細胞のある５つの顕微鏡視野を決めら れた日に試験し、異なる３日において各条件下での研究が報告された。ＣＦＴＲ の発現がヘテロ接合性（すなわち、細胞は同量のＣＦＴＲを産生しない）なので 、示したデータは、最も大きな応答を示す各視野中の２０％の細胞についてのも のである。 予想したように、疑似トランスフェクションされた細胞はｃＡＭＰにより刺激 される測定可能なハロゲン化物蛍光を示さなかった。対照的に、野生型ＣＦＴＲ ｃＤＮＡでトランスフェクションされた細胞は、ｃＡＭＰアゴニストでの刺激後 ＳＰＱ蛍光の迅速な増加を示し、アニオンに対する透過性の増加が示された。ア ッセイした細胞の約６０％が測定可能なｃＡＭＰにより刺激されたＣｌ-チャン ネル活性を示した。したがって、同様に試験された本発明のスペルミジンコレス テロールカルバメートおよび他のカチオン性両親媒性化合物は、ＣＦＴＲをコー ドしているプラスミドを不死化ＣＦ気道細胞中に移すことにおいて効果的である 。実施例３−ＣＡＴアッセイ パートＡ このアッセイを用いて、インビボで生標本由来の細胞をトランスフェクション する本発明カチオン性両親媒性化合物の能力を評価した。アッセイにおいて、１ ００μｌのカチオン性両親媒性化合物：ＤＮＡ複合体をｂａｌｂ／ｃマウスの肺 に鼻腔内から滴下したが（気管からもこれを行うことができる）、下記手順に従 って滴下投与する前に１５分間置いた。両親媒性化合物（共存脂質と前以て混合 されている、下記参照）を水で１０分間水和し、それは必要な最終濃度の２倍濃 度の懸濁液が得られるに十分な時間であった。これを２分間ボルテックス撹拌し 、分取して５５μｌを滴下すべき各マウス用とした。同様に、レポーター（ＣＡ Ｔ）遺伝子をコードしているＤＮＡを水で希釈して所望最終濃度の２倍とし、次 いで、分取して５５μｌを滴下すべき各マウス用とした。脂質をＤＮＡとおだや かに混合し（ポリスチレン試験管中で）、マウスに滴下する前に複合体を１５分 放置した。 使用プラスミド（ｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴ、実施例４参照）はクロラムフェニコ ールトランスフェラーゼ酵素をコードしているＤＮＡを提供する。両親媒性化合 物：ＤＮＡ複合体の詳細を以下に述べる。トランスフェクションから２日後、マ ウスを屠殺し、肺および気管を取り、秤量し、バッファー溶液（２５０ｍＭＴｒ ｉｓ,ｐＨ７.８,５ｍＭ ＥＤＴＡ）中でホモジナイズした。遠心分離によりホ モジナイズ物を清澄化し、７０℃１０分の熱処理によりその中のデアセチラ ーゼを不活性化した。アセチルコエンザイムＡおよびＣ14−クロラムフェニコー ルとともに溶解物を一晩インキュベーションした。次いで、酢酸エチル抽出に続 く薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によりＣＡＴ酵素活性を可視化した。 ＣＡＴ標準曲線との比較により酵素活性を定量した。 酵素ＣＡＴの存在は、アセチル基をアセチルコエンザイムＡからＣ14−クロラ ムフェニコールへと転移させるであろう。アセチル化／放射性標識クロラムフェ ニコールはＴＬＣ上でより早く移動し、よって、その存在を検出できる。決めら れた量のアセチル化クロラムフェニコールを生成するに必要なＣＡＴ量を標準か ら計算する。 スペルミジンコレステロールカルバメート（両親媒性化合物Ｎｏ.５３）の活 性を、認識されているトランスフェクション試薬ＤＭＲＩＥおよびＤＣ−コルに 関連したＣＡＴアッセイにおいて測定した。図１０は、劇的に上昇したスペルミ ジンコレステロールカルバメート（両親媒性化合物Ｎｏ.５３）のインビボでの 細胞トランスフェクション能（１００ｍｇの組織につきｎｇのＣＡＴ活性）を示 すものであり、このアッセイにおいて、その上昇は約２０倍またはそれ以上であ る。アッセイにおいて、１００ｍｇの肺組織につきＣＡＴ酵素ｎｇとして測定し た。比較として、よく知られたトランスフェクタントであるＤＭＲＩＥは、ＤＯ ＰＥと１：１混合物として調製され、プラスミドＤＮＡ（１.７ｍＭＤＭＲＩＥ 、１.７ｍＭ ＤＯＰＥ、１.２ｍＭ プラスミドＤＮＡ（ヌクレオチドとして測 定））と複合体化された場合、このアッセイにおいて１００ｍｇの肺組織につき 約１ないし２ｎｇの活性を生じることが一般的に観察される。 図１０により示された比較に関して、以下の条件が注目される。スペルミジン コレステロールカルバメートについてのトランスフェクション溶液は濃度６ｍＭ のＤＮＡ（ヌクレオチドとして測定）および１.５ｍＭのカチオン性両親媒性化 合物を含んでいた。一般的に実施例１の手順に従って、各両親媒性化合物もＤＯ ＰＥと前以て混合され、この場合１：１の比であった。ＤＣ−コルでのトランス フェクションに関しては、ＤＯＰＥに対するＤＣ−コルのモル比は３：２であり 、カチオン性両親媒性化合物およびＤＮＡ（ヌクレオチドとして）の濃度は それぞれ１.３ｍＭおよび０.９ｍＭであった。ＤＭＲＩＥでのトランスフェクシ ョンに関しては、ＤＯＰＥに対するＤＭＲＩＥのモル比は１：１であり、カチオ ン性両親媒性化合物およびＤＮＡの濃度はそれぞれ１.７ｍＭおよび１.２ｍＭで あった。それぞれの両親媒性化合物のトランスフェクションについて最適となる ように各両親媒性化合物および共存脂質およびＤＮＡに関してこれらの濃度（お よび濃度比）を決定した。 スペルミジンコレステロールカルバメート（両親媒性化合物Ｎｏ.５３）に関 してはさらに最適化実験を行って、個々の両親媒性化合物濃度に対する好ましい プラスミド濃度を決定し（図１１参照）、さらに個々のプラスミド濃度に対する 当該両親媒性化合物の好ましい濃度を決定した（図１２参照）。トランスフェク ション効率は、両親媒性化合物濃度１.５ｍＭ（ＤＯＰＥも１.５ｍＭで存在）お よびプラスミド約６ｍＭ（ヌクレオチドとして）、あるいは約１：４の比におい て最適であった。しかしながら、両親媒性化合物約０.７５ｍＭおよびプラスミ ド３.０ｍＭの濃度は標的細胞に対してより毒性が低いことが注目された。 カチオン性両親媒性化合物としてスペルミジンコレステロールカルバメートを 用い、コレステロールを共存脂質として用いてｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴベクターで の鼻腔内トランスフェクションも行った。この実験において、試験したスペルミ ジンコレステロールカルバメート濃度は１.０ないし１.５ｍＭの間であった（各 場合にコレステロールを１：１のモル比とし、上記のごとく両親媒性化合物と共 存脂質とを混合した）。ＤＮＡ濃度（ヌクレオチド濃度として測定）は４.０な いし６.０ｍＭの間であった。トランスフェクション効率（ｎｇＣＡＴ／組織１ ００ｍｇとして測定）はＤＯＰＥを共存脂質として用いた場合よりも効果的でな かったが、トランスフェクションはＤＣ−コル／ＤＯＰＥを用いて行ったものよ りも実質的には効果的であった。パートＢ 図１、５および７に示すカチオン性両親媒性化合物のトランスフェクション効 率をインビボで比較するためにさらなる実験を行った。その結果をそれぞれ 図１３、１４および１５に示す。１つの化合物につき１２ないし１５匹のマウス を用いて化合物を鼻腔内投与した。上記パートＡと同様に、１００ｍｇの組織に つきｎｇＣＡＴ活性を測定した。しかしながら、改良されたベクター（ｐＣＦ１ ／ＣＡ１およびそれに近い同等物ｐＣＦ２／ＣＡＴ）を用いた。一部には改良さ れたベクターの品質によるのであるが、アセチルコエンザイムＡおよびＣ14−ク ロラムフェニコールと溶解物とのインキュベーションをわずか３０分しか行わな かった。ｐＣＦ１／ＣＡＴおよびｐＣＦ２／ＣＡＴの構築を下記実施例４で説明 する。 図１３、１４および１５に示されたインビボでのデータを一般的には次のよう にして収集した。上記のように、図１０および１１は、両親媒性化合物Ｎｏ.５ ３の完全インビボ最適化から得られたデータを示す。両親媒性化合物Ｎｏ.６７ を同様な部分的最適化に供した。報告した他のすべてのカチオン性両親媒性化合 物に関して、そして多くの構造的類似性を利用して、インビボ試験用の最適化さ れた組成物をインビトロでの結果から予想した。このことにより多数の両親媒性 化合物のスクリーニングが容易となり、正確でないとしても、比較可能なデータ を大まかに得ることができた。Ｎｏ.５３および６７以外のすべての両親媒性化 合物について、インビボ試験でのＤＯＰＥ濃度に対する両親媒性化合物濃度はイ ンビトロ実験から採用されたものであり、ＤＮＡ濃度に対する両親媒性化合物濃 度の最適化された比率も同様であった（実施例１参照）。したがって、かかる両 親媒性化合物については、インビボ試験濃度を１ｍＭに固定し、そのことにより 、共存脂質濃度も固定した［大まかには、共存脂質ＤＯＰＥに対する両親媒性化 合物のモル比は１：２（例えば、スペルミンコレステロールカルバメートＮｏ. ６７）ないし１：１（例えば、スペルミジンコレステロールカルバメートＮｏ. ５３）ないし２：１（例えば、両親媒性化合物Ｎｏ.７５）の範囲であった］。 試験した各両親媒性化合物種に対してプラスミドＤＮＡ濃度を変化させてインビ トロで決定された最適化両親媒性化合物／ＤＮＡ比を再現した。パートＣ 本発明は当該分野において重要な貢献をすることは、それらの品質−すなわち インビボでのトランスフェクションの促進−を、新規Ｔ−型を欠く密接に関連し たカチオン性両親媒性化合物の品質と比較することによって容易に理解される。 スペルミジンコレステロールカルバメートは、直鎖状であるが「Ｔ−型」でない カチオン性アルキルアミン成分中に同数の炭素原子および窒素原子を含むＮ1− スペルミジンコレステリルカルバメートよりもずっと高レベルの促進を行うこと がわかった。一般的には実施例３、パートＢの手順に従って、そしてそれぞれ６ ｍＭ（ヌクレオチドとして）、１.５ｍＭ、および１.５ｍＭの濃度のＤＮＡ、両 親媒性化合物、および共存脂質を用いて、スペルミジンコレステロールカルバメ ート（両親媒性化合物Ｎｏ.５３）により示されるトランスフェクション促進を 、Ｎ1−スペルミジンコレステリルカルバメートと比較して決定したところ、約 ３０倍であった。 さらに実施例３、パートＢの手順に従って、そしてそれぞれ４ｍＭ（ヌクレオ チドとして）、１ｍＭ、および２ｍＭの濃度のＤＮＡ、両親媒性化合物および共 存脂質を用いて、スペルミンコレステロールカルバメート（両親媒性化合物Ｎｏ .６７）により示されるトランスフェクション促進を、スペルミンコレステロー ルカルバメートとの類似関連を有するＮ1−サーモスペルミンコレステリルカル バメートおよびＮ1−スペルミンコレステリルカルバメートと比較して決定した ところ、少なくとも約３０倍である。実施例４−ベクターの構築 上記のごとく、多くのタイプの生物学的に活性のある分子は、１種またはそれ 以上の本発明カチオン性両親媒性化合物を含んでなる治療組成物中に入れられて 、細胞中へと輸送されうる。本発明の重要な実施例において、生物学的に活性の ある分子はコーディングＤＮＡである。かかるコーディングＤＮＡの標的細胞で の発現を容易にするために好ましい新規ベクター（プラスミド）について記載す る。パートＡ−ｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴ ｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴは、本発明の実施に有用なプラスミド構築物の典型例で ある。該プラスミドはレポーター遺伝子を担持する形態で提供されるが（実施例 ３参照）、治療上の有用性を有する導入遺伝子をその中に含ませることも可能で ある。 ｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴベクターは市販ベクターｐＣＭＶβ（Clontech製）に基 づくものである。ｐＣＭＶβ構築物はｐＵＣ１９骨格を有しており（J.Viera et al.,Gene,19,259-268,1982）、ｐＢＲ３２２由来の原核生物の複製開始点を含 んでいる。ｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴプラスミド（ＣＡＴをコードするヌクレオチド 配列を含むように構築されている）の基本的特徴は以下のごとし。時計回りに− ヒト・サイトメガロウイルス即時初期遺伝子プロモーターおよびエンハンサー、 アデノウイルスおよびハイブリッドイントロン由来の融合した三分節リーダー、 リンカー配列、ＣＡＴ ｃＤＮＡ、さらなるリンカー配列、後期ＳＶ４０ポリア デニレーションシグナル、およびｐＵＣの複製開始点およびアンピシリン耐性遺 伝子を含む骨格の順である。 ヒト・サイトメガロウイルス即時初期遺伝子プロモーターおよびエンハンサー はヌクレオチド１から６３９までの領域に及ぶ。これは、転写開始部位（＋１） に対して−５２２から＋７２までの領域に対応し、元々Boshart et al.,Cell 41 :521-530,1985により定義された−５２４から−１１８までのエンハンサー領域 のほとんど全体を含んでいる。ＣＡＡＴボックスはｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴのヌク レオチド４８７−４９１に存在し、ＴＡＴＡボックスはｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴの ヌクレオチド５２２−５２６にある。ＣＡＴ転写産物はヌクレオチド５４９から 開始すると予想され、それはＣＭＶプロモーターの転写開始部位である。三分節 リーダーハイブリッドイントロンは、５'スプライスドナーシグナルを含むアデ ノウイルス由来の融合三分節リーダー、およびＩｇＧ遺伝子由来の３'スプライ スアクセプターシグナルから構成されている。イントロン中のエレメントは次の とおり：第１リーダー、第２リーダー、第３リーダーの一部、スプライスドナー 配列および第１リーダー由来のイントロン領域、ならびにマウス・免疫グロブリ ン遺伝子スプライスドナー配列。イントロンの長さは２３０ヌクレオチドである 。 ＣＡＴコーディング領域はヌクレオチド１２５７−１９１３を含む。ＳＶ４０ポ リＡシグナルはヌクレオチド２０２０から２２４９まで伸長している。 したがって、ｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴプラスミドの構築を以下のように行った。 ベクターｐＣＭＶβ（Clontech,Palo Alto,CA）をＮｏｔＩで消化してβ−カラ クトシダーゼ遺伝子を切除した。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を欠くベクターフ ラグメントを単離し、連結してｐＣＭＶを得た。 プラスミドｐＡＤβ（Clontech）からハイブリッドイントロン（図１７）を得 た。ハイブリッドイントロンはｐ９１０２３（Ｂ）の６９５塩基対のＸｈｏＩ− ＥｃｏＲＩフラグメントから単離された（Wong et al.,Science,228,810-815(19 85)参照）。ハイブリッドイントロンはアデノウイルス由来の融合三分節リーダ ー、該三分節リーダーの第１セグメント由来のドナー部位、およびＩｇＧ遺伝子 由来のアクセプター部位を含み、長さ２３０ｂｐである。 ｐＡＤβをＰｍＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、〜５００塩基対（ｂｐ）のフラ グメントを単離し、次いで、pBluescriptII KS(-)（Stratagene,La Jolla,CA） のＮｏｔＩ部位中に連結してｐＢｌｕｅＩＩ−ＨＩを得た。 ｐＢｌｕｅＩＩ−ＨＩをＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化してハイブリッドイン トロンフラグメントを取り出した。このフラグメントをｐＣＭＶのＸｈｏＩおよ びＮｏｔＩ部位中に連結し、ＳＶ４０イントロンを置換してｐＣＭＶＨＩを得た 。 ＣＡＴ遺伝子をChloramphenicol Acetyltransferase GenBlock（Pharmacia,Pi scataway,NJ）から得た。７９２ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをＤＮＡポ リメラーゼＩのクレノウフラグメントで平滑末端化し、次いで、ＮｏｔＩリンカ ー（New England Biolabs）を各末端に連結した。ＮｏｔＩで消化してＮｏｔＩ 粘着末端を露出させた後、フラグメントをｐＣＭＶのＮｏｔＩ部位中にサブクロ ーンしてｐＣＭＶ−ＣＡＴを得た。ｐＣＭＶ−ＣＡＴをＮｏｔＩで消化してＣＡ Ｔフラグメントを取り出した。ＣＡＴフラグメントをｐＣＭＶＨＩ中に連結して 図１６に示すｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴを得た。パートＢ −ｐＣＦ１およびｐＣＦ２ ｐＣＭＶＨＩは治療的トランスフェクションに適するが、ｐＣＦ１およびｐＣ Ｆ２プラスミドによってさらなる品質向上（導入遺伝子の発現増大を含む）を行 う。ｐＣＦ１／ＣＡＴの地図を図１８、パネルＡに示し、ｐＣＦ２／ＣＡＴの地 図をパネルＢに示す。 簡単に説明すると、ｐＣＦ１は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の即時初期 遺伝子由来のエンハンサー／プロモーター領域を含む。ハイブリッドイントロン はプロモーターおよび導入遺伝子ｃＤＮＡの間にある。ウシ・成長ホルモン遺伝 子のポリアデニレーションシグナルを導入遺伝子下流の置換用に選択した。該ベ クターは、アミノグリコシダーゼ３'−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（トラ ンスポゾンＴｎ９０３由来、A.Oka et al.,Journal of Molecular Biology,147, 217-226,1981）をコードしている薬剤耐性マーカーも含んでおり、そのことによ りカナマイシン耐性が付与されている。嚢胞性線維症トランスメンブランコンダ クタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）蛋白をコードしているｃＤＮＡ配列の配置 に関する説明も含めてｐＣＦ１構造のさらなる詳細をすぐ下に示す。 ｐＣＦ１ベクターは市販ベクターｐＣＭＶβ（Clontech）に基づく。 ｐＣＭＶβ構築物は、ｐＢＲ３２２由来の原核生物の複製開始点を含んでいるｐ ＵＣ１９骨格を有する（J.Viera,et al.,Gene,19,259-268,1982） ｐＣＦ１−プラスミド（ＣＦＴＲをコードしているヌクレオチド配列を含むよ うに構築されている）の基本的特徴は次のとおり。時計回りに−ヒト・サイトメ ガロウイルス即時初期遺伝子プロモーターおよびエンハンサー、アデノウイルス およびハイブリッドイントトン由来の融合三分節リーダーリンカー配列、ＣＦＴ Ｒ ｃＤＮＡ、さらなるリンカー配列、ウシ・成長ホルモンポリアデニレーショ ンシグナル、ｐＵＣの複製開始点および骨格、ならびにカナマイシン耐性遺伝子 の順である。ｐＣＦ１−ＣＦＴＲプラスミドは両鎖とも完全に配列決定されてい る。 ヒト・サイトメガロウイルス即時初期プロモーターおよびエンハンサーはヌク レオチド１から６３９までに及ぶ。これは、転写開始部位（＋１）に対して−５ ２２から＋７２までに対応し、元々Boshart et al.,Cell 41:521-530,1985 により定義された−５２４から−１１８までのエンハンサー領域のほとんど全体 を含んでいる。ＣＡＡＴボックスはｐＣＦ１／ＣＦＴＲのヌクレオチド４８６− ４９０に存在し、ＴＡＴＡボックスはｐＣＦ１／ＣＦＴＲのヌクレオチド５２１ −５２５にある。ＣＡＴ転写産物はヌクレオチド５４９から開始すると予想され 、それはＣＭＶプロモーターの転写開始部位である。 ハイブリッドイントロンは、５'スプライスドナーシグナルを含むアデノウイ ルス由来の融合三分節リーダー、およびＩｇＧ遺伝子由来の３'スプライスアク セプターシグナルから構成されている。イントロン中のエレメントは次のとおり ：第１リーダー（ヌクレオチド７０５−７４５）、第２リーダー（ヌクレオチド ７４６−８１６）、第３リーダー（部分、ヌクレオチド８１７−８７７）、スプ ライスドナー配列および第１リーダー由来のイントロン領域（ヌクレオチド８７ ８−１０４２）、ならびにマウス・免疫グロブリン遺伝子スプライスドナー配列 （ヌクレオチド１０４３−１１３８）。ドナー部位（Ｇ｜ＧＴ）はヌクレオチド ８８７−８８８であり、アクセプター部位（ＡＧ｜Ｇ）はヌクレオチド１１２８ −１１２９であり、イントロンの長さは２３０ヌクレオチドである。ＣＦＴＲコ ーディング領域はヌクレオチド１１８３−５６２２を含む。 ｐＣＦ１−ＣＦＴＲのＣＦＴＲをコードしていｃＤＮＡ中に、元々公表されて いる予想ｃＤＮＡ配列（J.Riordan et al.,Science,245,1066-1073,1989）とは ２つの相違がある；（１）元々公表されている配列の誤りを正すものである、Ｃ ＦＴＲ ｃＤＮＡの位置１９９０におけるＡのＣへの変化、および（２）位置９ ３６におけるＴのＣへの変化。位置９３６における変化は部位特異的突然変異法 により導入されたものであり、サイレントであるが、細菌プラスミド中で増幅さ れる場合に当該ｃＤＮＡの安定性を飛躍的に向上させる（R.J.Gregory et al.,N ature,347,382-386,1990）。予想ＣＦＴＲ転写産物の３'非翻訳領域は、ＣＦＴ Ｒ ｃＤＮＡの３'非翻訳領域の５１個のヌクレオチド、リンカー配列の２１個 のヌクレオチドおよびウシ・成長ホルモン（ＢＧＨ）のポリＡシグナルの１１４ 個のヌクレオチド を含む。 ＢＧＨポリＡシグナルは、保存されているＡＡＵＡＡＡに対する５'側の隣接 配列（flanking sequence）の９０個のヌクレオチドおよびＡＡＵＡＡＡモチー フに対する３'側の隣接配列の１２９個のヌクレオチドを含む。１次ＣＦＴＲ転 写産物はＢＧＨポリアデニレーションシグナルの下流ヌクレオチド５８０８にお いて開裂されると予想される。 ｐＣＦ１−ＣＦＴＲ中の開裂部位に対する位置＋４６において欠失があるが、 E.C.Goodwin et al.,J.Biol.Chem.,267,16330-16334(1992)の研究に基づけば、 その欠失はポリアデニレーション効率または開裂部位の正確さのいずれにも影響 しないと予想される。ポリＡテイルの付加後、生じる転写産物のサイズは約５. １ｋｂである。 図１８（Ｂ）のｐＣＦ２プラスミドは、第１ＣＭＶエンハンサーと並んだ第２ ＣＭＶエンハンサーを含む。ｐＣＦ１またはｐＣＦ２からの導入遺伝子の発現促 進は、強力なプロモーターの組み合わせ、非常に効率的なポリアデニレーション シグナルの存在、翻訳を促進するリーダー配列、およびメッセージの安定性を向 上させるイントロンにより得られるものである。実施例５−カチオン性両親媒性化合物により媒介される遺伝子の導入による嚢胞 性線維症患者の鼻ポリープ上皮細胞におけるクロライドイオン輸送の欠陥の修正 成人男性嚢胞性線維症患者由来の初期（不死化されていない）鼻ポリープ細胞 （Δ５０８変異に関してホモ接合）をコラーゲン被覆透過性フィルター支持体（ Millicells製）上で増殖させて分極し集密となった上皮細胞単層を得た。単層を 電気的に硬化させてから（撒種後約５ないし７日、細胞シートの抵抗増加により 示される）、先端表面をカチオン性両親媒性化合物：ＤＮＡ複合体に曝露するこ とができる。 この場合、両親媒性化合物（スペルミジンコレステロールカルバメート）をＤ ＯＰＥとの１：１混合物（モル比）として提供し、次いで、この混合物をｐＣＭ Ｖ−ＣＦＴＲプラスミドベクター（野生型ヒト・嚢胞性線維症トランスメンブラ ンコンダクタンスレギュレーター蛋白をコードしている構築物、上記参照） と複合体化させた。最終混合物中の濃度は、スペルミジンコレステロールカルバ メート（ＤＯＰＥも）４２マイクロモラー、プラスミド発現ベクター６０マイク ロモラー（ヌクレオチドのモル濃度による）であった。 改変されたUssingチャンバー(Zabner et al.,Nature Genetics,6,75-83(1984) )を用いて、ｃＡＭＰにより刺激される経上皮クロライド分泌を測定することに よりＣＦＴＲの発現を決定した。９５％Ｏ2および５％ＣＯ2を吹き込んだリンゲ ルの重炭酸溶液に上皮の粘膜側を浸した。グルコン酸ナトリウムが塩化ナトリウ ムに代わること以外は、粘膜下溶液の組成は粘膜溶液と同様であった。経上皮電 位差を０ｍＶとし、短絡回路電流を記録した。アミロライド（１０μＭ）を先端 バス（apical bath）に適用し、次いで、フォルスコリンおよびＩＢＭＸ（各１ ００μＭ）を粘膜に添加した。次いで、ＣＦＴＲクロライドチャンネル阻害剤で ある５−ニトロ−２−（３−フェニルプロピルアミノ）安息香酸（ＮＰＰＢ）を 粘膜溶液に１０μＭおよび３０μＭとして添加した。 クロライド分泌（すなわち、上皮細胞から粘膜溶液へのクロライドの移動）は 上方偏向として示される（図１９参照）。同じプラスミドベクターであるが、レ ポーター遺伝子を含むものを負の対照として用いた。野生型ＣＦＴＲ遺伝子でト ランスフェクションされた単層においてｃＡＭＰにより刺激される電流（０.５ ないし２.５マイクロアンペア／ｃｍ2）が観察された。ｐＣＭＶβ−ガラクトシ ダーゼ対照については電流は検出されなかった。実施例６−カチオン性両親媒性化合物により媒介される遺伝子の導入による嚢胞 性線維症患者の気道上皮細胞におけるクロライドイオン輸送の欠陥の修正 ヒト患者における気道嚢胞性線維症の治療のための本発明医薬組成物の処方お よび使用のための推奨手順は以下のとおり。 一般的には実施例１記載の手順に従って、スペルミンコレステロールカルバメ ート（両親媒性化合物Ｎｏ.６７）およびＤＯＰＥが１：２のモル比で存在する 薄層（クロロホルム蒸発による）を作成した。両親媒性化合物含有薄層を注射用 水中でゆるやかにボルテックス撹拌して再水和し、得られた両親媒性化合物濃度 は約３ｍＭであった。しかしながら、エアロゾルによって均一相として安定に送 達されうる両親媒性化合物／ＤＮＡ複合体の量を増加させるためには（例えば、 Lenexa Medical Division,Lenexa,KSから販売されているPuritan Bennett Raind rop噴霧器、またはPARI Respiratory Equipment、Inc.,Richmond,VAから販売さ れているPARI LC JetTM噴霧器を用いる）、最終両親媒性化合物／ＤＮＡ組成物 を安定化する作用のある１種またはそれ以上のさらなる成分を含有するように両 親媒性化合物含有薄層を調製することが有利であるかもしれない。したがって、 両親媒性化合物含有薄層を、両親媒性化合物Ｎｏ.６７、ＤＯＰＥ、およびＰＥ Ｇ（５０００）−ＤＭＰＥの比率を１：２：０.０５として調製することが目下 好ましい［ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、すなわちポリエチレングリコール５０００−ジミ リストイルホスファチジルエタノールアミンの適当なソースはAvanti Polar Lip ids,Alabaster,ALのカタログ番号８８０２１０である］。 理論に限定されずに、ＰＥＧ（５０００）−ＤＭＰＥは、生成した両親媒性化 合物／ＤＮＡ複合体のさらなる凝集を防止することにより、治療組成物を安定化 すると考えられている。さらに、ＰＥＧ（２０００）−ＤＭＰＥは本発明におい てあまり効果的でなかったことにも注意。 ｐＣＦ１−ＣＦＴＲプラスミド（ヒト・嚢胞性線維症タランスメンブランコン ダクタンスレギュレーターをコードしている配列を含有、実施例４参照）を、ヌ クレオチドとして測定される濃度で４ｍＭとして注射用水中に入れる。次いで、 ２つの溶液を１０分間ゆるやかに接触させることによりプラスミドおよび両親媒 性化合物の複合体化を行う。 エアロゾル化したＤＮＡを、約２ないし約１２ｍＭの間の濃度（ヌクレオチド として）で、肺に送達することが目下好ましい。一般的には、ＣＦＴＲをコード している遺伝子のΔ５０８変異に関してホモ接合である成人患者の肺への１回の エアロゾル投与には約１０ないし約４０ｍｌの試料で十分である。 この手順（新たに調製された両親媒性化合物／ＤＮＡ試料を用いる）は一定間 隔をおいて２週間繰り返すことは必要であるが、患者の応答、トランスフェクシ ョンＤＮＡからの発現持続時間、および炎症のごとき生じうる副作用の発生にか な り左右されるであろうし、それらはすべて個々の患者について決定でき、医師に より考慮されうるものである。 本発明カチオン性両親媒性化合物の１の重要な利点は、現在利用できる他の両 親媒性化合物よりもインビボにおいて実質的に効果的であり、よって、既知カチ オン性両親媒性化合物よりも実質的に低濃度で使用することができるということ である。遺伝子治療の成功に悪影響を及ぼす副作用（両親媒性化合物の毒性、炎 症応答のごとき）を実質的に最小限にする機会が与えられる。本発明の多くの両 親媒性化合物の使用に関するさらに特別な利点を述べるべきである。本発明の多 くの両親媒性化合物は、その代謝が急速に進行して比較的無害な生物学的に許容 される化合物になるように設計された。この点において、非常に活性のある両親 媒性化合物５３、６７および７５は特に注目に値する。実施例７−遺伝子治療のためのプラスミド設計におけるさらなる改良：複製する エピソームプラスミド 上記の設計特性は実質的に利用されるプラスミドの品質を向上させるが、かか るプラスミドおよびカチオン性両親媒性化合物を含んでなる治療組成物が遺伝子 治療に最適な品質を有するためにはさらなる修飾が望ましい。 プラスミドの継続的存在は長時間にわたって遺伝学的欠陥（嚢胞性線維症の場 合、肺上皮細胞または他の細胞の細胞膜における機能を果たすＣＦＴＲ蛋白の欠 乏）の修正を行うことになるので、遺伝子治療用プラスミドが患者細胞中におい ても複製可能であることが望ましい。現在の技術による代表的なプラスミド（す なわち、患者の標的細胞において複製できない）は、ほんの短時間患者体内に維 持された後分解されうるので、過度の繰り返し投与が必要である。 おそらく、患者の標的細胞中の染色体中に組み込まれるように設計されたベク ター（例えば、レトロウイルスを原型としたベクター）を用いると長時間の修正 を行うことができよう。しかしながら、かかる戦略は下記の危険性を伴う。（１ ）ベクターが染色体の必須領域中に組み込まれる、あるいは（２）ベクターが腫 瘍遺伝子に隣接して組み込まれるか、またはそれを活性化する。 したがって、他の手段によって標的細胞中で継続して遺伝子治療を維持するベ クター（プラスミド）を提供することが望ましいであろう。１のかかる戦略は、 標的細胞の核中に単独に維持され、そこで複製可能なプラスミド（すなわち、エ ピソーム）を構築することである。 本発明のこの態様により提供されるプラスミドを以下のようにして構築するこ とができる。ヒト・ｃ−ｍｙｃ遺伝子のエキソン１の５'側に直接に接して存在 する２.４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントは複製開始点を含んで いることがわかった（C.McWhinney et al.,Nucleic Acids Research,18,1233-12 42,1990）。次いで、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクションされた場合にＨｅＬ ａ細胞中で薬剤セレクション下で３００世代以上にわたり維持されることが示さ れているプラスミド中にそのフラグメントがクローンされた。それらの実験にお いて薬剤セレクションがない場合、細胞１世代あたりプラスミド集団の約５％が 失われるが、それにもかかわらずこの結果は、実質的な安定化は遺伝子治療用治 療プラスミドの設計に関して有益であろうということを示すものである。したが って、複製エピソームベクターの１の実施例において、２.４ｋｂのＨｉｎｄＩ ＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントのコピーがｐＣＦ１骨格のＣＭＶエンハンサー／プ ロモーター領域の５'側にちょうど接して配置されているｐＣＦ１−ＣＦＴＲ（ またはｐＣＦ１−ＣＡＴ）の変種を構築することができる。別法として、２.４ ｋｂのフラグメントの２ないし約４個の並んだコピーを同様に配置してもよい。 ２.４ｋｂのフラグメント（またはその複数のコピー）の挿入により生じるプラ スミドサイズの増加は、さらなる有益性を示す、すなわち、プラスミドの巻き戻 しを容易にし、かくしてＤＮＡポリメラーゼの活性発揮を容易にすると予想され る。 この複製開始点またはその複数のコピーの使用により、得られたプラスミドが ヒト細胞において効率的に複製することが可能となる。他の複製開始点を含む他 のＤＮＡ配列を用いてもよい（例えば、ヒト・β−グロビン遺伝子またはマウス ・ＤＨＦＲ遺伝子中に見いだされるようなもの）。 本発明のこの態様により構築されうるプラスミドであって、サイトメガロウイ ルスのプロモーターおよびエンハンサー、イントロン、ＣＦＴＲ ｃＤＮＡ、ウ シ・成長ホルモンのポリアデニレーションシグナル、カナマイシン耐性トランス ポゾンＴｎ９０３、ならびに４コピーのヒト・ｃ−ｍｙｃ遺伝子の２.４ｋｂの ５'隣接領域（flanking region）を含むプラスミドを図２０に示す。実施例８−遺伝子治療のためのプラスミド設計におけるさらなる改良 遺伝子治療における導入遺伝子の発現を転調させるサイトカインプロモーターの 使用 慢性的炎症は、遺伝子治療により治療されうる多くの疾病状態に関連している 。かかる疾病状態の代表例は、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲを使用）、気管支炎、成 人の呼吸困難症候群（アルファ−１アンチトリプシンを使用）、および転移性の 癌（ｐ５３、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２のアップレギュレーションによる ）である。典型的には、炎症性症状は多くの相互関連のあるプロセス（例えば、 多くのタイプの免疫系細胞および肝臓蛋白が関与）を包含しそれにより身体は損 傷または感染を受けた組織を治癒しようとする。しかしながら、寛解しない症状 の結果として維持される慢性的炎症は、嚢胞性線維症ならびに関連肺感染および 寛解しない肺感染におかされた肺組織の場合のように、永久的な組織の損傷を引 き起こすかもしれない。実際、嚢胞性線維症患者の肺組織に対する永久的な損傷 は患者の死亡を引き起こす主要原因である。標的疾病状態に関連した炎症症状を 治療するようなやり方で遺伝子治療を行うことが望ましいであろう。 したがって、本発明のもう１つの態様は、例えば、インターロイキン２、イン ターロイキン８、インターロイキン１、インターロイキン１１、インターロイキ ン６、エンドセリン−１、単球化学誘引蛋白−１、ＩＬ−１ｒａ（受容体アゴニ スト）、またはＧＭ−ＣＳＦのごときサイトカインの遺伝子（または別の類似調 節蛋白をコードしている遺伝子）由来のＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御 下に治療導入遺伝子が置かれている遺伝子治療ベクターの構築を包含する。 サイトカインは、細胞増殖、分化、ならびに造血およびリンパ生成のごとき機 能の調節に関与しているホルモン様細胞間シグナル蛋白であると定義されている 。 インターロイキンは、本発明の実施において有用なプロモーターを有するサイト カインの特別なグループである。インターロイキンは、典型的には無関係な起源 の蛋白であり、免疫反応性細胞間の反応を媒介する細胞間シグナルとして作用す る。しかしながら、多くの「インターロイキン」は、内皮細胞、上皮細胞、およ び線維芽細胞を包含するさらなる細胞タイプに対する効果を有することが理解さ れている。 存在する炎症のレベルに応答して、冒されている部位において多くのサイトカ インの濃度がアップレギュレートされるので、発現される治療導入遺伝子のレベ ルが一部には存在する炎症のレベルにより決定されるように遺伝子治療ベクター を設計することができる。以下に、一例として、主としてインターロイキン８の 遺伝子の特性を利用したベクターをいかにして設計するのかを説明する。 炎症症状の重篤性に伴って濃度が上昇する多くの生物学的に活性のある分子が 組織に存在することがわかっている（例えば、腫瘍壊死因子「ＴＮＦ」、および 潜在的にはＮＦ−ｋＢ、ＡＰ−１、ＮＦ−ＩＬ６および８量体結合蛋白のごとき 転写因子）。 分子量８５００のポリペプチドであるインターロイキン８は炎症によりアップ レギュレーションされ、それら自身炎症応答にかかわっているＴリンパ球および 好中球に対する有力な化学誘引物質として作用することもわかっている。インタ ーロイキン８遺伝子は主として転写レベルにおいて調節されており、ＴＮＦが気 管支上皮細胞においてインビトロでインターロイキン８転写を３０倍以上促進し うることもわかっている（H.Nakamura et al.,Journal of Biolgical Chemistry ,266,19611-19617,1991）。したがって、上記のことを利用する遺伝子治療ベク ターの説明を次に行う。 実質的にｐＣＦ１類似の、すなわち、細菌由来の複製開始点およびカナマイシ ン耐性を付与する遺伝子を含むｐＵＣプラスミド由来のプラスミドを構築するこ とができる。得られるプラスミドは、配列中にＣＭＶエンハンサー、プロモータ ー、ハイブリッドイントロン、ＣＦＴＲをコードしているｃＤＮＡ配列、ならび にウシ・成長ホルモンポリアデニレーションシグナルをも含む。ＲＮＡポリメラ ーゼプロモーターとしてインターロイキン８プロモーターの−３３５から＋５４ までの領域を選択する。この領域は、ＴＮＦ存在ないしはＴＮＦ不存在の場合に プロモーター活性に関して最高の割合を与える（Nakamura,1991）。 かかるプラスミドは特に価値のある品質属性を有する。嚢胞性線維症に冒され た肺において炎症が増大するにつれ（それゆえ、遺伝子治療により肺を治療する ことも必要である）、種々の炎症関連分子（ＴＮＦのごとき）の濃度が上昇する であろう。治療プラスミドのＣＦＴＲをコードしているｃＤＮＡを、それ自体細 胞と接触している炎症関連物質の濃度に感受性のある転写プロモーター（例えば 、インターロイキン８のもの）の制御下に置くことによって、そのプロモーター は天然の遺伝子スイッチとして作用して有益なＣＦＴＲ量が炎症量に適合したも のとなるであろう。上記のごとく、他の上記遺伝子由来のＲＮＡポリメラーゼプ ロモーター配列も本発明の実施において有用である。実施例９ 導入遺伝子の動脈内送達 嚢胞性線維症のごときいくつかの疾病状態に関して、導入遺伝子を肺に送達す ることが望ましい。エアロゾルによる送達は、この目的を達成するための最も直 接的なアプローチである。しかしながら、肺以外の器官（例えば、嚢胞性線維症 の膵臓）を標的とする潜在的必要性とともにエアロゾルによる送達に固有の一定 の困難性があり、非エアロゾル送達フォーマットを用いる肺への送達の可能性に ついて評価することが重要である。したがって、マウスのモデルを用いてレポー ター導入遺伝子の静脈内送達を行い、静脈内からの器官標的化の可能性を評価し た。肺および心臓への送達の可能性を比較した。 レポータープラスミドｐＣＦ−１ ＣＡＴ（実施例４）を用い、これを精製し てエンドトキシンを最少とし（＜１ＥＵ／ｍｇ ｐＤＮＡ）、さらに染色体ＤＮ Ａの混入も最少とした（＜２％）。実施例３の手順に従って両親媒性化合物Ｎｏ .５３（ＤＯＰＥとの１：１混合物）／ＤＮＡ複合体を調製した。両親媒性化合 物を遊離塩基として用意し、プラスミドを水中ナトリウム塩として調製し、ＤＯ ＰＥを双性オイン形態として用意した。 動物モデルはＢＡＬＢ／ｃマウスであった。１グループにつき５匹を用いて、 メスの６−８週齢の体重１６−１８ｇのマウスに、尾の静脈を用いて静脈注射し た。特記しないかぎり、複合体投与４８時間後にマウスを屠殺した。即座に器官 をドライアイスで凍結し、以後の分析用に保存した。 ＣＡＴ酵素活性のための放射線化学的アッセイを用いてクロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の発現を定量した。器官を秤量し、氷上 にてプロテアーゼ阻害剤を含有する溶解バッファー中でホモジナイズした。溶解 物を３回凍結−融解し、遠心分離し、14Ｃ−クロラムフェニコール含有反応混合 物に添加する前に６５℃まで加熱してデアセチラーゼを不活性化した。３７℃で インキュベーション後、混合物を酢酸エチルで抽出し、濃縮し、ＴＬＣプレート にスポットし、ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨで溶離した。アシル化された反応生成物に 対応するスポットを定量し（Betagen）、オーセンティックＣＡＴ標準を用いて ｎｇＣＡＴ活性に変換した。 驚くべきことに、治療組成物中の両親媒性化合物／ＤＮＡのモル比（ＤＮＡ濃 度（ヌクレオチドとして測定）を０.９ｍＭ一定として）を変更することにより 、心臓の標的化が実質的に改善されうることがわかった。この情報は、冠状動脈 疾患のごとき心臓疾患の遺伝子治療に関連し価値がある。しかしながら、肺の標 的化については、ＤＮＡ濃度をすべて一定とした場合、両親媒性化合物／ＤＮＡ 比の全範囲において比較的一定のままであった（図２１）。 約０.５未満のモル比においては、器官への分配は主として肺に向かうことが わかった。このモル比においては、一部には両親媒性化合物に対するＤＮＡから の過剰の負の電荷のため、複合体のゼータ電位は負（約−３０ｍＶ）である。し かしながら、両親媒性化合物／ＤＮＡ比が１.２５の場合には、複合体は正のゼ ータ電位（約＋３０ｍＶ）を有し、器官への分配は著しく変化し、実質的な発現 は心臓において見られた（図２１）。 Malvern Zetasizer 4（Malvern Instruments,Southborough,MA）およびゼータ セル（ＡＺ−１０４セル,Malvern Instruments）を用いて、試料のゼータ電位を 測定することができる（典型的には試料１つにつき５つの測定値を用いる）。カ チオン性脂質およびＤＯＰＥを含有する乾燥脂質薄層を蒸留水（ｄＨ2Ｏ）中で 水和させる。典型的には、ＤＮＡを希釈してｄＨ2Ｏ中約３００μＭの濃度とす べきである。次いで、ＤＮＡ溶液（１.５ｍｌ）を同体積のカチオン性脂質小胞 に添加し、室温で１０分間インキュベーションすることができる。十分なＮａＣ ｌ（例えば、４ｍＭストック溶液）を添加して最終濃度１ｍＭ ＮａＣｌとして もよい。必要ならば、１ｍＭ ＮａＣｌで試料をさらに希釈し（光電子倍増管ノ シグナルを１秒間に４０００カウント未満に維持するために）、ＮａＣｌ溶液の かわりに蒸留水を用いることもできる。 本発明のこの態様によれば、両親媒性化合物Ｎｏ.５３およびＮｏ.６７は、グ ループＩおよびＩＩから選択された他の多くの両親媒性化合物と同様に、静脈か らの心臓の標的化における使用に好ましい両親媒性化合物に属する。実施例１０−さらなる実験手順 （Ａ）Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメート、両親媒性化合物Ｎｏ.６７の もう１つの合成手順 （Ｎ1,Ｎ12−ジＣｂｚ−スペルミン二塩酸塩の合成） クロロギ酸ベンジル（１５ｍｌ,１０５ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（３３５ｍ ｌ）に溶解し、窒素雰囲気下の３つ首フラスコに入れた。イミダゾール（１４ｇ ,２０６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２００ｍｌ）に溶解した。氷冷水浴を用い て３つ首フラスコを０−２℃に冷却し、イミダゾール溶液を３０分かけて徐々に 添加した。冷浴をはずし、混合物を室温で１時間撹拌した。塩化メチレン（２５ ０ｍｌ）およびクエン酸水溶液（１０％,２５０ｍｌ）を混合物に添加した。層 分離させ、有機層をクエン酸水溶液（１０％,２５０ｍｌ）で洗浄した。有機フ ラクションを硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。得られた油状物質を周 囲温度で２時間減圧乾燥した。油状物質にジメチルアミノピリジン（５３０ｍｇ ,４.３ｍｍｏｌ）および塩化メチレン（２５０ｍｌ）を添加した。混合物を０− ２℃に冷却し、窒素雰囲気下に保った。反応温度を０−２℃に保ち ながら塩化メチレン（２５０ｍｌ）中のスペルミン（１０ｇ,４９ｍｍｏｌ）溶 液を１５分かけて徐々に添加した。反応混合物を周囲温度で一晩撹拌し、次いで 、減圧濃縮した。得られた物質に１Ｎ塩酸（６７ｍｌ）およびメタノール（４０ ０ｍｌ）を添加した。溶液を一晩４℃で冷却し、白色沈殿を得た。Whatman＃１ 濾紙を用いる減圧濾過により沈殿を単離した。かくして得られたＮ1,Ｎ12−ジＣ ｂｚ−スペルミン二塩酸塩（１３.３８ｇ,２４.７ｍｍｏｌ,収率５０％）を周囲 温度で１７時間減圧乾燥した。 （Ｎ1,Ｎ12−ジＣｂｚ−Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメートの合成） Ｎ1,Ｎ12−ジＣｂｚ−スペルミン二ＨＣｌ塩（１３.３８ｇ,２４.７ｍｍｏｌ ）をクロロホルム、メタノールおよび水の混合物（６５：２５：４）（９４０ｍ ｌ）に溶解した。溶液を室温で撹拌し、クロロギ酸コレステリル（１１ｇ,２４. ５ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を周囲温度で１.５時間撹拌し、次いで、１Ｍ水 酸化ナトリウム溶液（１６５ｍｌ）で希釈した。有機層および水層を分離させ、 生成物を含む有機層を水（１１０ｍｌ）で洗浄した。有機フラクションを硫酸ナ トリウムで乾燥し、減圧濃縮し、次いで、減圧乾燥した。シリカゲル（６０オン グストローム,１ｋｇ）を用いるクロマトグラフィーにより粗油状物質を精製し た。シリカゲルを１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3中で充填し、２５％ＭｅＯＨ／Ｃ ＨＣｌ3でカラムを溶離した。９００ｍｌのフラクションを集め、薄層クロマト グラフィーにより分析した。生成物（２０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3中でＲｆ＝０. ５）を含有するフラクションを集め、減圧濃縮した。得られた油状物質を１７時 間減圧乾燥して８.５ｇ（９.６７ｍｍｏｌ,収率３９％）の生成物を得た。 （Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメートの合成） Ｎ1,Ｎ12−ジＣｂｚ−Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメート（８.５ｇ, ９.６７ｍｍｏｌ）を２００ｍｌの酢酸に溶解し、１.６６ｇの炭素上１０％Ｐｄ を添加した。溶液に窒素を吹き込み、大気圧の水素下で撹拌した。水素ガスを満 たしたバルーンを用いて水素を反応フラスコに供給した。加水素分解を３時間継 続した。反応混合物をWhatman＃１濾紙で濾過し、触媒を２５０ｍｌの酢酸エチ ル中１０％酢酸で洗浄した。濾液を減圧濃縮して残渣を得て、クロロホルムとの 共沸により酢酸の除去を促進した。粗生成物に１Ｍ水酸化ナトリウム溶液（４０ ０ｍｌ）を添加し、溶液を１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3（７００ｍｌ）で３回抽 出した。一緒にした有機フラクションを水（６００ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリ ウムで乾燥した。溶液を濾過し、減圧濃縮し、次いで、周囲温度で４８時間減圧 乾燥した。粗物質をシリカゲル（５００ｇ）でのクロマトグラフィーにより精製 した。カラムを４０：２５ ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ3中で充填し、４０：２５ Ｍ ｅＯＨ：ＣＨＣｌ3、次いで、４０：２５：１０ ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ3：ＮＨ4 ＯＨで溶離した。集めたフラクションを薄層クロマトグラフィーにより分析し、 生成物含有フラクションを一緒にし、減圧濃縮した（残存している水を共沸させ るためにイソ−プロパノールの添加により蒸発を促進した）。得られた物質を周 囲温度で４８時間減圧乾燥してＮ4−スペルミンコレステリルカルバメート（４ ｇ,６.５ｍｍｏｌ,収率６７％）を得た。（Ｂ）Ｎ4−（Ｎ'−コレステリルカルバメートグリシンアミド）−スペルミン（ 両親媒性化合物Ｎｏ.９１） Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−グリシン−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（０.５ ｇ,１.８３ｍｍｏｌ）を、６５／２５／４ クロロホルム／メタノール／水（５ ０ｍｌ）中のジＣｂｚ−スペルミン２ＨＣｌ（１.０ｇ,１.９４ｍｍｏｌ）およ びＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０.３ｍｌ,１.７２ｍｍｏｌ）の溶液に 添加した。溶液を室温で一晩撹拌した。ＴＬＣ（２０％メタノール／クロロホル ム）による反応の分析により新たなスポットの存在が示された。反応物を、まず １Ｍ ＮａＯＨ（１０ｍｌ）で、次いでＨ2Ｏ（１０ｍｌ）で洗浄した。有機層 を分離し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧濾過し、減圧濃縮して油状物質を得た。２ ０％メタノール／クロロホルムで溶離するフラッシュカラムクロマトグラフィー （８５ｇシリカゲル）により粗物質を精製した。所望生成物を単離し、1ＨＮＭ ＲによりＮ1,Ｎ12−ジＣｂｚ−Ｎ4−（Ｎ'−ｔ−ＢＯＣ−グリシンアミド） −スペルミン（４０２ｍｇ,０.６５ｍｍｏｌ,３５％）であると特徴づけた。 クロロギ酸ベンジル８１００ｍｇ,０.５８ｍｍｏｌ）を、塩化メチレン（２０ ｍｌ）中のＮ1,Ｎ12−ジＣｂｚ−Ｎ4−（Ｎ'−ｔ−ＢＯＣ−グリシンアミド）− スペルミン（２２０ｍｇ,０.３５４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４滴） の溶液に添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。ＴＬＣ（２０％メタノール／ クロロホルム）による反応の分析により、新しく移動度が高いスポットの存在が 示された。１Ｍ ＨＣｌ（５ｍｌ）で反応を不活性化し、硫酸ナトリウムで乾燥 し、濾過し、減圧濃縮した。 得られた粗物質をクロロホルム（３０ｍｌ）に溶解し、無水ＨＣｌガスを溶液 に２時間吹き込んだ。ＴＬＣ（１０％メタノール／クロロホルム）による反応の 分析により、出発物質の完全な消失が示された。反応物に乾窒素を吹き込み、１ Ｍ ＮａＯＨ（２ｘ１０ｍｌ）、次いでｄＨ2Ｏ（１０ｍｌ）で洗浄した。有機 層を単離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧濃縮してＮ1,Ｎ9,Ｎ12−ト リＣｂｚ−Ｎ4−グリシンアミド−スペルミン（２１９ｍｇ,０.３３ｍｍｏｌ,２ 工程の収率９３％）を得た。クロロギ酸コレステリル（１４８ｍｇ.０.３３ｍｍ ｏｌ）を、塩化メチレン（３０ｍｌ）中のＮ1,Ｎ9,Ｎ12−トリＣｂｚ−Ｎ4−グ リシンアミド−スペルミン（２１９ｍｇ,０.３３ｍｍｏｌ）およびトリエチルア ミン（０.３ｍｌ,２.１５ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応物を室温で３時間 撹拌した。反応物をＨ2Ｏ（１０ｍｌ）で洗浄した。有機層を分離し、Ｎａ2ＳＯ2 で乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。６５％酢酸エチル／ヘキサンで溶離するフ ラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ）により粗物質を精製し た。所望生成物を単離し、1Ｈ ＮＭＲによりＮ1,Ｎ9,Ｎ12−トリＣｂｚ−Ｎ4− （Ｎ'−コレステリルカルバメートグリシンアミド）−スペルミン（２２１ｍｇ, ０.２ｍｍｏｌ,収率６２％）であると特徴づけた。 Ｎ1,Ｎ9,Ｎ12−トリＣｂｚ−Ｎ4−（Ｎ'−コレステリルカルバメートグリシン アミド）−スペルミン（２２１ｍｇ,０.２ｍｍｏｌ）を１０％Ｐｄ／Ｃ（５０ｍ ｇ）とともに氷酢酸（１０ｍｌ）中、水素雰囲気下で２.５時間撹拌した。ＴＬ Ｃ（６５％酢酸エチル／ヘキサン）による反応の分析により出発物質の完全 な消失が示された。フラスコに窒素を吹き込み、触媒濾紙を用いて減圧濾過し、 濾紙を１０％酢酸／酢酸エチル（２０ｍｌ）ですすいだ。濾液を減圧濃縮して油 状物質を得て、これを１０％メタノール／クロロホルム（１００ｍｌ）に溶解し 、１Ｍ ＮａＯＨ（２０ｍｌ）、次いで、Ｈ2Ｏ（１５ｍｌ）で洗浄した。有機 層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。単離生成物を1 Ｈ ＮＭＲによりＮ4−（Ｎ'−コレステリルカルバメートグリシンアミド）−ス ペルミン（１２８ｍｇ,０.１９ｍｍｏｌ,収率９５％）であると特徴づけた。（Ｃ）Ｎ4−スペルミジン−２,３−ジラウリルオキシプロピルアミン,両親媒性 化合物９４の合成 ２,３−ジミリストイルグリセロール（６００ｍｇ,１.４ｍｍｏｌ）をピリジ ンに溶解し、溶液を０℃に冷却した。溶液を窒素雰囲気下で撹拌し、塩化ｐ−ト ルエンスルホニル（３００ｍｇ,１.５７ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を放置して 室温まで暖め、次いで、周囲温度で一晩撹拌した。溶液に塩酸（２.５Ｍ,２０ｍ ｌ）を添加し、溶液を塩化メチレン（２５ｍｌ）で３回抽出した。一緒にした有 機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧濃縮して粗油状物質を得た。 ５％酢酸エチル／ヘキサンで溶離するフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲ ル５０ｇ、６０オングストローム）により油状物質を精製した。フラッシュクロ マトグラフィーにより得られた油状物質を高真空下、周囲温度で乾燥して２,３ −ジミリストイルグリセロール−トシレート（６３０ｍｇ,収率７７％）を得た 。 ２,３−ジミリストイルグリセロール−トシレート（３００ｍｇ,０,５１ｍｍ ｏｌ）およびＮ1,Ｎ8−ジＣｂｚ−スペルミジン（１.５ｇ,３.６ｍｍｏｌ）をト ルエン（１５ｍｌ）に溶解した。溶液を窒素雰囲気下で撹拌し、加熱還流（１１ ０℃）した。反応物を５日間還流温度に置いた。反応物を室温まで冷却し、次い で、Whatman＃１濾紙で濾過した。濾液を減圧濃縮した。残渣をクロロホルム（ ５０ｍｌ）に溶解し、水酸化ナトリウム溶液（１ｍ,１０ｍｌ）、次いで、水（ １０ｍｌ）で洗浄した。有機フラクションを硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、 減圧濃縮した。５％メタノール／クロロホルムで溶離するフラッシュクロマトグ ラフィー（シリカゲル３０ｇ、６０オングストローム）により粗物質を精製した 。生成物含有フラクションを減圧濃縮した。得られた物質を、５０％酢酸エチル ／ヘキサンで溶離する２回目のフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル２０ ｇ、６０オングストローム）により精製した。クロマトグラフィーし、周囲温度 で高真空下で乾燥した後、Ｎ4−（Ｎ1,Ｎ8）−ジＣｂｚ−スペルミジン−２,３ −ジラウリルオキシプロピルアミンを油状物質として得た（１４２ｍｇ,収率３ ５％）。 氷酢酸（５ｍｌ）中のＮ4−（Ｎ1,Ｎ8）−ジＣｂｚ−スペルミジン−２,３− ジラウリルオキシプロピルアミン（１４２ｍｇ,０.１８ｍｍｏｌ）を１０％Ｐｄ ／Ｃ（５０ｍｇ）とともに水素雰囲気下で２時間撹拌した。Whatman＃１濾紙を 用いる減圧濾過により触媒を除去した。触媒を酢酸エチル／ヘキサン（１０％、 １０ｍｌ）で洗浄した。濾液を減圧濃縮し、高真空下で２時間乾燥した。残渣に 水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ,８ｍｌ）を添加し、溶液をメタノール／クロロホ ルム（１０％,２０ｍｌ）で３回抽出した。一緒にした有機抽出物を硫酸ナトリ ウムで乾燥し、濾過し、減圧濃縮して、高真空下で乾燥後、Ｎ4−スペルミジン −２,３−ジラウリルオキシプロピルアミン（５２ｍｇ,収率５２％）を得た。（Ｄ）Ｎ4−スペルミン−２,３−ジラウリルオキシプロピルアミン,両親媒性化 合物Ｎｏ.１０２の合成 Ｎ1,Ｎ12−ジＣｂｚ−スペルミン（０.８７ｇ,１.８５ｍｍｏｌ）および２,３ −ジミリストイルグリセロール−トシレート（２８０ｍｇ,０.４８ｍｍｏｌ）を トルエン（２５ｍｌ）に溶解し、還流温度（１１０℃）にて３日間加熱した。溶 液を減圧濃縮し、得られた物質を、１０％メタノール／クロロホルムで溶離する フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、６０オングストローム）に より精製した。単離した物質をメタノール／クロロホルム（１０％,８５ｍｌ） に溶解し、水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ,１５ｍｌ）、次いで水（１０ｍｌ）で 洗浄した。有機フラクションをＮａ2ＳＯ4で乾燥し、濾過し、減 圧濃縮した。得られた物質を高真空下、周囲温度で乾燥してＮ4−（Ｎ1,Ｎ12− ジＣｂｚ−スペルミン）−２,３−ジラウリルオキシプロピルアミン（１８０ｍ ｇ,収率４３％）を得た。 氷酢酸（１０ｍｌ）中のＮ4−（Ｎ1,Ｎ12−ジＣｂｚ−スペルミン）−２,３− ジラウリルオキシプロピルアミン（１８０ｍｇ,０.２ｍｍｏｌ）を、１０％Ｐｄ ／Ｃ（５０ｍｇ）とともに水素雰囲気下で３時間撹拌した。Whatman＃１濾紙を 用いる高真空濾過により触媒を除去した。触媒をＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１０％ 、３０ｍｌ）で洗浄した。濾液を減圧濃縮し、高真空下で２時間乾燥した。残渣 にメタノール／クロロホルム（１０％,８５ｍｌ）を添加し、有機層を水酸化ナ トリウム溶液（１Ｍ,１５ｍｌ）で２回洗浄し、次いで水（１０ｍｌ）で洗浄し た。有機フラクションをＮａ2ＳＯ4で乾燥し、濾過し、減圧濃縮して、高真空乾 燥後、Ｎ4−スペルミン−２,３−ジラウリルオキシプロピルアミン（５０ｍｇ, 収率４０％）を得た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｃ 271/34 Ｃ０７Ｃ 271/34 279/12 279/12 Ｃ０７Ｊ 41/00 Ｃ０７Ｊ 41/00 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (31)優先権主張番号 ６０／００４，３９９ (32)優先日 1995年９月27日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／５４０，８６７ (32)優先日 1995年10月11日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／５４５，４７３ (32)優先日 1995年10月19日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 リー，エドワード・アール アメリカ合衆国02169マサチューセッツ州 クインシー、リンカーン・ハイツ、セン ター・ストリート175−ジェイ番 (72)発明者 ハッバード，シャーリー・シー アメリカ合衆国02178マサチューセッツ州 ベルモント、ワイリー・ロード26番 (72)発明者 チョン，ソン・エイチ アメリカ合衆国02181マサチューセッツ州 ウェルズリー、ウォール・ストリート 550番 (72)発明者 イーストマン，サイモン・ジェイ アメリカ合衆国01752マサチューセッツ州 マールボロ、ロイヤル・クレスト・ドラ イブ13番 (72)発明者 マーシャル，ジョン アメリカ合衆国01757マサチューセッツ州 ミルフォード、ウエスト・ウォールナッ ト・ストリート45番 (72)発明者 シュール，ロナルド・ケイ アメリカ合衆国01748マサチューセッツ州 ホプキントン、イースト・ストリート26 番 (72)発明者 ユー，ネルソン・エス アメリカ合衆国01568マサチューセッツ州 ウエスト・アップトン、ロックデイル・ ヒル・サークル25番 (72)発明者 レイン，マシーユ・ビー アメリカ合衆国02138マサチューセッツ州 ケンブリッジ、サクラメント・ストリー ト55番 (72)発明者 ロウ，エリック・エイ アメリカ合衆国02148マサチューセッツ州 モールデン、シルバン・ストリート196 番 (72)発明者 バグリー，レベッカ・ジー アメリカ合衆国01760マサチューセッツ州 ナティック、ウォールドン・ドライブ・ ナンバー17、28番 (72)発明者 チャン，チョー−ダン アメリカ合衆国02173マサチューセッツ州 レキシントン、ミドルビー・ロード７番

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．下記一般式： ［式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立して−Ｎ（Ｈ）−、アルキルアミンまたは ポリアルキルアミンであるが、両方ともが−Ｎ（Ｈ）−であることはなく； Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立してＨ、所望により誘導体化されているアミノ酸 または飽和もしくは不飽和脂肪族基； ＸはＣまたはＮであり； Ｙは、存在する場合には結合基； Ｑは−Ｚまたは （式中、Ｚはアルキルアミン、異なるアルキル基を有していてもよいジアルキル アミン、またはステロイド； ＡおよびＢはそれぞれ独立してＯ、ＮまたはＳ； Ｃは−Ｃ（Ｈ2）−、−Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｓ）−であり； Ｒ5およびＲ6はそれぞれ独立して飽和もしくは不飽和のアルキルまたはアシル 基を意味する）］ に対応することを特徴とするカチオン性両親媒性化合物。 ２．下記一般式： ［式中、Ｚはステロイド； ＸはＣまたはＮ； Ｙは短い結合基であるかまたは不存在； Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立して−Ｎ（Ｈ）−、アルキルアミンまたはポリア ルキルアミンであるが、両方ともが−Ｎ（Ｈ）−であることはなく； Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立してＨまたは飽和もしくは不飽和脂肪族基を意味 する］； あるいは ［式中、Ｚ、Ｘ、Ｒ1およびＲ2は一般式（Ｉ）に関して上で定義したのと同じで あり； Ｙは結合基であるかまたは不存在； Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して所望により誘導体化されていてもよいアミノ 酸、Ｈまたはアルキルを意味する］； あるいは ［式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は一般式（Ｉ）に関して上で定義した のと同じであり； Ｚはアルキルアミンまたは異なるアルキル基を有していてもよいジアルキルア ミンを意味する］； あるいは ［式中、Ｘ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は一般式（Ｉ）に関して上で定義したのと 同じであり； ＡおよびＢはそれぞれ独立してＯ、ＮまたはＳ； Ｃは−Ｃ（Ｈ2）−、−Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｓ）−； Ｙは、存在する場合には−（Ｈ）Ｎ（Ｃ（Ｏ））−または−Ｏ（Ｃ（Ｏ））− ； Ｒ5およびＲ6はそれぞれ独立して飽和もしくは不飽和のアルキルまたはアシル 基を意味する］ のうちの１つに対応する請求項１記載の化合物。 ３．Ｚが、その３−Ｏ−基を介して、あるいはそれに代わるＮを介して結合さ れている３−ステロールである一般式（Ｉ）； あるいはＺ−Ｙ−が または または に結合していて、各（ポリ）アルキルアミン基中の窒素原子および炭素原子の総 数が約３０未満であり、ｘ、ｘ'、ｙ、ｙ'、ｚおよびｚ'のそれぞれが１よりも 大きい整数である一般式（Ｉ）； あるいは下記一般式 または または または または または または または または または または または または または または または のうちの１つに対応する一般式（Ｉ）であって、各（ポリ）アルキルアミン基中 の窒素原子および炭素原子の総数が約３０未満であり、ｘ、ｘ'、ｙおよびｙ'の それそれが１よりも大きい整数であり、好ましくは少なくとも１つが３であり、 少なくとも１つが４であるが、例外として、最後の式においてはｘ'は１であっ てもよく；所望によりステロイド環のＣ５および／またはＣ７における二重結合 が水素化されていてもよく、ｎが１ないし４の整数である一般式（Ｉ）； あるいは本明細書における番号が５３、６１、６５、６７、６９、７０、７１ 、７２、７５、７８、７９、８１、８２、８３、８４、８６、８８、９０、９２ 、９６、１０１、１０４、１０６または１０７である一般式（Ｉ） で示される請求項１または２に記載の化合物。 ４．前記結合基Ｙの１個までの原子がＸおよびＺの両方との結合を形成し、好 ましくはＹがカルボニルである一般式（ＩＩ）； あるいは前記結合基Ｙがアシル化されたアミノ酸であり、アミノ酸由来のカル ボニルがＸに結合しており、Ｎ−アシル部分由来のカルボニルがステロイドＺの 酸素または窒素に結合しており、好ましくはＹがＮ−アシルグリシンまたはＮ− アシルセリンである一般式（ＩＩ）； あるいはＺが、その３−Ｏ−基を介して、あるいはそれに代わるＮを介して結 合されている３−Ｏ−ステロールであり、好ましくはＺがコレステロールである 一般式（ＩＩ）； あるいはＲ1および／またはＲ2で示される（ポリ）アルキルアミン基中の２個 またはそれ以上の窒素が３個および４個の炭素の１またはそれ以上の組み合わせ により離されている一般式（ＩＩ）； あるいは本明細書における番号が８７、９１、９３、９５、９７、９９、１０ ０または１０３である一般式（ＩＩ） で示される請求項１または２に記載の化合物。 ５．Ｚがジアルキルアミンであり； Ｙが結合基、好ましくはカルボニルまたはメチレンであり、その１個までの原子 がＸおよびＺの両方と結合を形成するものであり； Ｘが炭素であり； Ｒ3およびＲ4が水素であり、 Ｒ1がアルキルアミンであり； Ｒ2が−Ｎ（Ｈ）−である一般式（ＩＩＩ）； あるいはＮ,Ｎ−ジオクタデシルリジンアミド、Ｎ,Ｎ−ジデシルリジンアミド 、Ｎ,Ｎ−ジドデシルリジンアミドまたはＮ1，Ｎ1−ジオクタデシル−１,２,６ −トリアミノヘキサンである一般式（ＩＩＩ）； あるいはＺがアルキルアミンまたはジアルキルアミンであり； Ｙが結合基、好ましくはカルボニルまたはメチレンであり、その１個までの原子 がＸおよびＺの両方と結合を形成するものであり； Ｘが炭素であり； Ｒ3およびＲ4が水素であり； Ｒ1がポリアルキルアミン、好ましくは２個またはそれ以上の窒素が、３個およ び４個の炭素の１またはそれ以上の組み合わせにより離されているポリアルキル アミンであり； Ｒ2が−Ｎ（Ｈ）−である一般式（ＩＩＩ）； あるいはＺがアルキルアミンまたはジアルキルアミン； Ｙが結合基、好ましくはカルボニルまたはメチレンであり、その１個までの原子 がＸおよびＺの両方と結合を形成するものであり； Ｘが炭素または窒素であり； Ｒ3およびＲ4が水素であり； Ｒ1およびＲ2がそれぞれ独立してアルキルアミンまたはポリアルキルアミン、好 ましくは２個またはそれ以上の窒素が、３個および４個の炭素の１またはそれ以 上の組み合わせにより離されているアルキルアミンまたはポリアルキルアミンで ある一般式（ＩＩＩ）； あるいは下記一般式： または または または または または または のうちの１つに対応する一般式（ＩＩＩ） で示される請求項１または２記載の化合物。 ６． が または または であり、各（ポリ）アルキルアミン基中の窒素原子および炭素原子の総数が約３ ０未満であり、ｘ、ｘ'、ｙ、ｙ'、ｚおよびｚ'のそれぞれが１よりも大きい整 数である一般式（ＩＶ）； あるいは下記一般式： または または または または または または または または のうちの１つに対応し、各（ポリ）アルキルアミン基中の窒素原子および炭素原 子の総数が約３０未満であり、ｘ、ｘ'、ｙおよびｙ'のそれぞれが１よりも大き い整数、好ましくは少なくとも１つが３であり、少なくとも１つが４であり、ｍ およびｎがそれぞれ約７ないし約２９の間である一般式（ＩＶ）； あるいは本明細書における番号が６４、７６、８５、８９、９４、９８、１０ ２、１０５、１１０または１１１である一般式（ＩＶ） で示される請求項１または２に記載の化合物。 ７．（１）請求項１ないし６のいずれか１つに記載のカチオン性両親媒性化合 物； （２）リボソームＲＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド 、リボザイムおよび治療上有用な蛋白をコードしているゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ またはｍＲＮＡのポリヌクレオチドから選択される生物学的に活性のある分子； ならびに所望により （３）共存脂質 を含んでなる複合体、 さらに所望によりラクトース、スクロース、マンニトール、マルトースおよびガ ラクトースから選択される賦形剤 を含んでなることを特徴とする医薬組成物であって、凍結乾燥形態であってもよ い医薬組成物。 ８．生物学的に活性のある分子（２）が、 （ｉ）治療上有用なポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、および（ ｉｉ）コーディング配列の患者細胞における発現、好ましくは上皮細胞アニオン チャンネル調節の生物学的特性を有することを可能にするためのＣＦＴＲのアミ ノ酸 配列に十分に重複したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているヌク レオチド配列の患者細胞における発現を容易にすることのできる１個またはそれ 以上の調節エレメント を含んでなるＤＮＡである請求項７記載の組成物。 ９．疾病状態となっている組織の細胞に侵入することができ、 （１）疾病状態の治療を提供することのできる導入遺伝子であって、好ましくは ＣＦＴＲ、ｐ５３、アルファ−１アンチトリプシン、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭ Ｐ−２の導入遺伝子、およびその上流、 （２）発現が炎症によって転写レベルでアップレギュレートされるサイトカイン の遺伝子、好ましくはインターロイキン２、インターロイキン８、インターロイ キン１、インターロイキン１１、インターロイキン６、エンドセリン−１、単球 化学誘引性蛋白−１、ＩＬ−１ｒａおよびＧＭ−ＣＳＦから選択されるサイトカ インの遺伝子に対するＲＮＡポリメラーゼプロモーターのヌクレオチド配列に対 応するヌクレオチド配列 を含んでなるＤＮＡ分子を含んでなることを特徴とする、炎症に関連した疾病状 態に対する遺伝子治療組成物であって、好ましくは導入遺伝子の発現が腫瘍壊死 因子によってアップレギュレートされ、ＤＮＡ分子が請求項１ないし６のいずれ か１つに記載のカチオン性両親媒性化合物、好ましくは一般式（Ｉ）に対応する 化合物、より好ましくは本明細書における番号が５３、６７、７５、７８または ９０である化合物と複合体となっていてもよい組成物。 １０．（１）治療蛋白をコードしている配列を含むＤＮＡ分子；および （２）請求項１ないし６のいずれか１つに記載のカチオン性両親媒性化合物、好 ましくは一般式（Ｉ）または（ＩＩ）に対応する化合物、より好ましくは本明細 書における番号が５３、６７、７５、７８または９０である化合物 を含んでなることを特徴とする、静脈からの患者の心臓の治療のための遺伝子治 療組成物であって、カチオン性両親媒性化合物：ＤＮＡ（ヌクレオチドのモル濃 度として測定）のモル比が溶液中のカチオン性両親媒性化合物／ＤＮＡ複合体に 正のゼータ電位を持たせるように、好ましくは約＋３０ｍＶのゼータ電位を持た せるようにする処方として提供される組成物。 １１．カチオン性両親媒性化合物がＮ4−スペルミジンコレステリルカルバメ ート（５３）であり、カチオン性両親媒性化合物：ＤＮＡのモル比が約１.２５ ：１である請求項１０記載の組成物であって、好ましくは、 （１）プロトン化されていない遊離塩基形態のＮ4−スペルミジンコレステリル カルバメート、双性イオン性ＤＯＰＥ、および水からなり、カチオン性両親媒性 化合物：ＤＯＰＥのモル比が１：１である第１の溶液、および （２）水中のＤＮＡナトリウム塩からなる第２の溶液 を混合することにより処方される組成物。 １２．ヒト・細胞の核において維持され複製されることができることを特徴と し、さらにヒト・ＤＮＡポリメラーゼにより認識されることができ、ポリメラー ゼとプラスミドとの相互作用を容易にする１よりも多い複製開始点を含むポリデ オキシリボヌクレオチドを含んでなることを特徴とし、好ましくは複製開始点を 画定しているヌクレオチド配列が長さ４.８ｋｂないし９.６ｋｂの間の連続した 配列であり、好ましくは１の複製開始点がヒト・β−グロビン遺伝子またはマウ ス・ＤＨＦＲ遺伝子中に見いだされるものであり、より好ましくはヒト・ｃ−ｍ ｙｃ遺伝子のエキソン１の５'側に直接に接して存在する２．４ｋｂのＨｉｎｄ ＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメント中に見いだされるものであるエピソームプラスミ ドであって、好ましくは約１８ｋｂのサイズであり好ましくはｐＭｙｃ４−ＣＦ ＴＲの特性を有するエピソームプラスミド。 １３．ｐＣＦ１またはｐＣＦ２、および導入遺伝子を必須としてなることを特 徴とする治療用トランスフェクションプラスミド。 １４．請求項１２記載のプラスミドを含んでなる治療組成物を用いて患者を治 療することを特徴とする、投与回数を最小にする患者に対する遺伝子治療のプロ グラムの提供方法であって、該プラスミドが疾病状態の治療を行うことのできる 導入遺伝子を含んでなるものであり、好ましくは該プラスミドが導入遺伝子とし てヒト・嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーターをコー ドしている配列を含むものであり、嚢胞性線維症患者の肺の治療に適するもので あり、該プラスミドの品質がサイトメガロウイルスプロモーター、サイトメガロ ウイルスエンハンサー、ＣＦＴＲをコードしている配列の上流に置かれたイント ロン、ウシ・成長ホルモンポリアデニレーションシグナルおよびカナマイシン耐 性トランスポゾンＴｎ９０３から選択される１個またはそれ以上のものを含むこ とによって向上するものである方法。 １５．組織の細胞に侵入できるＤＮＡ分子を含んでなる治療組成物に疾病にか かっている組織を接触させることを特徴とする、炎症性症状を包含する疾病状態 となっている患者に対して遺伝子治療を提供する方法であって、ＤＮＡ分子が疾 病状態に対する治療を提供することのできる導入遺伝子をコードしている配列を 含むものであり、さらにＤＮＡ分子がヌクレオチド配列の改良を含むものであり 、それ自体、炎症によりアップレギュレートされるサイトカインに対する遺伝子 に由来するＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含んでなるものであり、該プロモ ーターがＤＮＡ分子中に適当に配置されていて導入遺伝子の発現が該プロモータ ーの調節下に置かれるようになっており、好ましくはサイトカインのＲＮＡポリ メラーゼプロモーターがインターロイキン２、インターロイキン８、インターロ イキン１、インターロイキン１１、インターロイキン６、エンドセリン−１、単 球化学誘引性蛋白−１、ＩＬ−１ｒａおよびＧＭ−ＣＳＦから選択されるサイト カイン由来のＤＮＡ分子中に含まれているものである方法。 １６．請求項１０記載の治療組成物の静脈内投与を特徴とする、患者の心臓に 対して遺伝子治療を提供する方法。
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