KR20000075788A - 유전자 치료에 의한 염증 세포의 자가-조절된 아포토시스 - Google Patents

유전자 치료에 의한 염증 세포의 자가-조절된 아포토시스 Download PDF

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Abstract

본 발명은 염증 세포에서 활성화되는 유도성 유전자의 프로모터에 의해 유도되는 아포토시스-유도 유전자(AIG) 및 프로모터 인핸서를 함유하는 키메라 유전자를 활성화된 염증 세포 또는 염증 부위에 있는 세포에 도입하여 염증 세포를 표적화함으로써 상기 세포에서 아포토시스를 치료학적으로 유도하는 방법을 제공한다. 한가지 양태에 있어서, 키메라 유전자는 최소 TNFα 프로모터의 작용성 카피에 부착되어 있고 또한 TNFα 프로모터에 의해 발현이 유도되는 아포토시스-유도 유전자의 하나 이상의 카피에 추가로 부착되어 있는 하나 이상의 TNFα 프로모터 인핸서를 포함한다. 부착은 직접적인 부착, 거리를 둔 부착, 인접한 부착 또는 이의 조합 방식일 수 있다. 아포토시스-유도 유전자의 예에는 캐스패스 3, 캐스패스 4, 캐스패스 5, 그랜자임 B가 포함된다. 유리하게는, TNFp-AIG 키메라 유전자는 염증 사이토킨 TNFα를 생산하는 세포에서만 발현된다. 또한, TNFp-AIG 키메라 유전자는 유도성 TNFp 전사 인자를 격리시켜 TNFα의 내인성 생산을 감소시킨다. 또한, 본 발명은 자가-조절된 아포토시스 키메라 유전자를 제조 및 사용하는 방법 및 이를 포함하는 염증 질환 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

유전자 치료에 의한 염증 세포의 자가-조절된 아포토시스{Self-regulated apoptosis of inflammatory cells by gene therapy}
관련된 출원 자료
본 출원은 1997년 2월 28일자로 제출된, 공동 계류중인 미국 가출원 제60/039,266호의 우선권을 청구한다.
다양한 염증 질환에 있어서, IL-1, IL-10, GM-CSF 및 TNFα와 같은 사이토킨은 염증 세포의 덩어리 응집과 축적에 기인하여 과다하게 생성된다[참조: Brennan F.M. et al., British Medical Bulletin 1995, 51/2, 368-384]. 염증 조직에서 사이토킨의 과조절 및/또는 비조절은 만성 염증 질환의 악화에 직접 또는 간접적으로 관여할 수 있다. 예를 들면, 류마티스성 관절염(PA)에서 가장 두드러진 병변은 염증의 국소 부위에서 나타난다(즉, 활막 관절). 따라서, RA 환자의 활막 관절에서 생산된 사이토킨은 질환 과정에 중요한 역할을 담당하는 것 같다. 이들 사이토킨중에서, IL-1과 TNFα는 RA를 특성화하는 연골 파괴와 골 미란(erosion)을 황폐화시키는데 관여하는 것으로 생각된다[참조: Dayer J.M. et al., J. Exp. Med., 1985, 162, 1208-1215; Gowen M. et al., Nature, 1983, 306, 378-380]. 활막 관절내에 과다한 양의 IL-1과 TNFα가 존재하면, 설치류에서 콜라겐-유도된 관절염의 진행이 가속화되는 것으로 밝혀졌다[참조: Brennan F.M., et al., Clin. Expt. Immunol., 1994, 97/1, 1-3]. 과다한 양의 TNFα와 IL-1은 마크로파지계 세포, 마크로파지-유사 활막세포, 활성화된 T-세포 및 가능하게는 섬유아세포-유사 활막세포를 포함하여 연골-판누스 경계에 있는 다양한 세포형에 의해 활막 조직에서 생산된다[참조: Chu C.Q. et al., Arthritis ＆ Rheumatism, 1991, 34, 1125-1132; Deleuran B.W., et al., Arthritis ＆ Rheumatism, 1992, 35, 1170-1178].
상술된 염증 효과 이외에, TNFα는 단핵구에서 IL-1 활성의 유도와 같은 다양한 프로-염증 사상에서 편재성 및 중요한 역할을 담당한다. 실제로, 항-TNFα 중화 항체는 전체 IL-1 생산을 감소시키는 것으로 밝혀졌다[참조: Portillo, et al., Immunol., 1989, 66, 170-175; Brennan F.M., et al., British Medical Bulletin 1995, 51/2, 368-384]. 따라서, 염증 사이토킨 TNFα의 효과를 차단하는 것에 대한 또다른 잇점은 동등한 파괴성 프로-염증 중재자인 IL-1의 생산을 감소시키는데 있다. 더욱이, TNFα는 다른 염증-관련된 유전자의 전사 활성화인자로서 공지되어 있다. 예를 들어, TNFα의 존재는 HLA 부류 II 항원과 부착 분자를 포함하는 다른 사이토킨(예: GM-CSF)과 세포 표면 수용체의 생산을 자극[참조: Alvaro-Garcia J.M., et al., J. Exp. Med., 1989, 146, 865-875]하여 활성화된 T 세포 및 호중구를 연속적으로 회복시킴으로써 활막 염증과 과형성을 유발하고 궁극적으로는 연골 및 골의 파괴를 증가시킨다[참조: Allen J.B., J. Exp. Med., 1990, 171, 231].
염증 질환에 대한 통상적인 치료법은 징후성 염증에 대해 전형적으로 지시된다. 이러한 치료법은 질환의 진행을 현저히 지연시키지 않으면서 단지 일시적으로 완화시킨다. 대조적으로, 염증 과정에서 유도된 TNFα 및 다른 인자를 표적화하는 치료법이 보다 유망한 것 같다. 예를 들면, 콜라겐-유도된 관절염의 동물 모델에 있어서 항-TNFα 항체 및 가용성 TNFα 수용체-IgG 키메라는 발 팽윤, 관절 병발 및 연골과 골의 파괴를 효과적으로 감소시킨다[참조: Williams R. O. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1992, 89, 9784-9788]. 사람화된 항-TNFα 항체와 TNFα 수용체-IgG 키메라 분자를 사용한 사람 시도는 현저한 결과를 나타냈다[참조: Elliott M.J., et al., Arthritis and Rheumatism, 1993, 36, 1681-1690; Elliott M.J., et al., Lancet, 343, 1105-1110]. 이러한 TNFα 길항제를 사용한 치료법은 내성이 우수한 것으로 보일지라도, 이는 또한 재조합체 단백질에 대한 항체를 생산한다. 따라서, 이들 치료법은 장기간의 치료에 적합하지 않을 것이고, 질환을 실질적으로 경감시키지 못한다. 질환의 진행을 실질적으로 조절하기 위해, TNFα는 TNFα-특이적 치료법을 사용하여 연속적으로 표적화되어야 한다. 이러한 치료학적 프로토콜은 이들 생물학적 약제를 실시할 수 없게 하고, 장기간의 투여를 어렵게 할 것이다.
대안의 치료학적 선택사항에 있어서, 염증 활막은 외과적[참조: Herold N. and Schroder H.A., Acta Orthop. Scand., 1995, 66, 252-254; Ogilvie-Harris D.J. and Weisleder L., Arthroscopy, 1995, 11, 91-95], 화학적[참조: Cruz-Esteban C. and Wilke W.S., Bailliere's Clinical Rheumatol., 1995, 9, 787-801] 또는 방사선-유도된 활막절제술[참조: Cruz-Esteban C. and Wilke W.S., Bailliere's Clinical Rheumatol., 1995, 9, 787-801]을 사용하여 제거할 수 있다. 관절경 외과적 활막절제술에 따른 결과는 우수한데, 이는 수술후 상태가 수술전 상태보다 개선되었음을 보여준다. 비-외과적 활막절제술은 각종 화학 약품(예: 오스민산), 알킬화제(예: 질소 머스타드 및 티오테파), 메토트렉세이트를 사용하여 수행한다. 불운하게도, 비-외과적 활막절제술(화학적 및 방사선-유도된 것을 포함)이 점차적으로 고려되고 있으며, 이는 단지 단기간의 완화만을 제공하고 활막 과형성의 불연속적 감소만을 나타낸다. 더욱기, 대부분의 비-외과적 대안들은 잠재적인 기형발생요인이다. 또한, 외과적으로 유도된 조직 손상뿐만 아니라 비-외과적 활막절제술에서 발병 조직에 대한 화학적 손상은 종종 염증 반응을 유발한다. 마지막으로, 이러한 방법은 입원 및 갱생 비용과 불편함을 포함하여 통상의 약제학적 치료 및 침입성 외과적 수술과 일반적으로 관련되는 위험 및 부작용을 감수해야 한다는 것에 주목해야 한다.
따라서, 일반적으로 염증 질환 및 특히 RA를 치료하기 위한 효과적인 치료 방법이 여전히 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명은 새로운 치료 방법을 제공함으로써 염증 질환을 치료하기 위한 선행 방법과 관련된 과제를 해결한다. 본 발명의 한가지 양태에 따르면, 아포토시스는 관련된 염증 반응의 부재하에 염증 세포를 파괴하는 TNFα-생산 염증 세포에서 선택적으로 유도된다.
본 발명의 목적은 자가-조절 아포토시스-유도 유전자(apotosis-inducing gene; AIG)를 함유하는 키메라 유전자를 포유동물의 염증 세포 또는 염증 부위에 있는 세포내로 도입하는 단계를 포함하는 치료 방법을 제공하는 것이다. AIG는 TNFα 프로모터(TNFp; 도 1 및 2 참조)와 같은 프로모터 및 바람직하게는 프로모터 인핸서에 의해 유도된다. 따라서, 이것은 모든 세포 및 TNFα를 생산할 수 있는 세포에서만 발현된다.
본 발명의 또다른 목적은 TNFp-AIG 및 유사한 키메라 유전자 작제물, 이의 제조 방법, 이의 사용 방법 및 이를 함유하는 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 TNFp-AIG 키메라 유전자로 형질감염된 세포에서 아포토시스를 유도하는 방법, 모집단에서 TNFα 비-생산자 체세포 변이체를 시험관내에서 선별하는 방법, TNFα 비-생산 모집단의 발생에 관여하는 우성/네가티브 유전자를 확인하는 방법 및 TNFα 생산의 조절에 관여하는 생성물을 확인하는 방법(도 10)을 제공하는 것이다.
이러한 목적 및 기타 목적은 하기 발명의 상세한 설명에 기초하여 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
본 발명은 염증 세포내에서 아포토시스(apoptosis)(계획된 세포 사멸 또는 비-괴사성 세포 사멸)을 유도하는 유전자를 염증 세포에 도입함으로써 염증 세포에서 아포토시스를 치료학적으로 유도하는 방법에 관한 것이다. 아포토시스-유도 유전자(이는 종종 AIG로서 본원에서 언급될 수 있다)는 TNFα 프로모터(TNFp) 또는 염증 세포내에서 활성화된 기타 유도성 유전자에 의해 유도된다. 한가지 양태에서, 아포토시스는 TNFα를 생산할 수 있는 세포에서 선택적으로 유도된다. TNFp-AIG 또는 기타 키메라 유전자는 통상의 유전자 치료 기술을 이용하여 생체내에 편리하게 도입될 수 있다. 유리하게는, 키메라 유전자가 TNFp-AIG인 양태에 있어서, 이것은 단지 염증 사이토킨, TNFα를 생산할 수 있는 세포에서만 발현된다. 또한, TNFp-AIG 키메라 유전자가 TNFα 프로모터 구성원을 포함하기 때문에, 이는 또한 유도성 TNFp-선택성 전사 인자를 격리시킨다. 이러한 격리는 TNFα의 내인성 생성을 감소시킨다. 본 발명은 특히 TNFp-AIG 및 유사한 유전자 작제물, 키메라 유전자를 함유하는 세포, 키메라 유전자로 형질감염된 세포에서 아포토시스의 유도 방법, 키메라 유전자를 함유하는 약제학적 조성물, TNFα 생산 세포 모집단 내에서 TNFα 비-생산자 체세포 변이체를 시험관내 선별하는 방법, TNFα 생산을 억제하는데 관여하는 우성 네가티브/우성 억제 유전자를 확인하는 방법 및 키메라 유전자를 사용한 치료 방법에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 TNFp-AIG 키메라 유전자의 대표적인 개략도이다. 아포토시스-유도 유전자(AIG)는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 수록된 유전자, 즉, 캐스패스(Caspases) 1 내지 10, 그랜자임(Granzyme) B, FasLigand 등의 어느 하나일 수 있다.
도 2는 본 발명의 TNFp-AIG 키메라 유전자를 사용한 유전자 치료 결과를 도시하는 개략도이다.
도 3은 리포터 시스템으로서 루시퍼라제 유전자(Luc) 발현을 이용하여 TNFα 프로모터의 유도성 cis 구성원의 확인에 사용된 결실 작제물을 요약한 것이다.
도 4(a 및 b)는 도 3에 기재된 작제물을 사용하여 수득한 결과를 요약한 것이다. 작제물의 일시적 발현은 2개의 상이한 TNFα-생산 세포주, 즉, Jurkat(도 4a) 및 THP-1(도 4b)에서 평가한다. 각각의 도면에서 막대그래프는 개개의 실험에 대해 측정한 PMA(도 4a) 또는 LPS(도 4b)와 같은 활성화제에 의한 유도능의 자극 지수를 나타낸다. 각 도면 위에 있는 선은 4회 내지 6회의 실험으로부터 평균한 평균 유도능을 나타낸다.
도 5는 TNFα 프로모터 및 프로도메인-결실된 AIG(사용된 AIG는 캐스패스 및 캐스패스 4/5이다)의 선택된 천연 구성원을 사용하여 TNFp AIG를 제조하는 흐름도이다.
도 6(a, b 및 c)은 키메라 TNFp AIG의 발현을 보여주기 위해 수행된 대표적인 실험의 요약 결과를 제공한다. 일시적으로 형질감염된 Jurkat 세포(도 6a 및 6b) 및 THP-1(도 6c) 세포에서의 아포토시스는 세포 사멸 엘리사(Cell Death Elisa; CDE 분석)를 이용하여 평가한다. 3개의 모든 도면에서, 성긴 실선이 있는 막대그래프는 형질감염 대조군을 나타내는데, 여기서 세포는 DNA의 부재하에 형질감염제로 처리된다. 조밀한 실선이 있는 막대그래프는 루시퍼라제 유전자의 발현을 유도하는 TNFp 구성원을 나타내고, 실선이 없는 막대그래프는 AIG.1 또는 AIG.2의 발현을 유도하는 동일한 TNFp 구성원을 나타낸다. 실선이 없는 막대그래프 위에 있는 괄호안의 수는 풍부 인자(TNFpLuc 대조군 벡터에 대한 TNFpAIG에 의해 유도된 아포토시스의 비율)을 나타낸다.
도 7(a 및 b)은 AIG의 발현을 차례로 유도하는 TNFα 프로모터의 유도성 cis 구성원의 다수 카피를 포함하는, 본 발명의 TNFp AIG 키메라 유전자의 대표적인 개략도이다(도 7a). TNFα 유전자의 3' 비해독된 영역(TNF3'UTR)이 하부에 있는 AIG의 발현을 유도하는 TNFα 프로모터의 유도성 cis 구성원의 다수 카피를 포함하는 TNFp AIG 키메라 유전자의 대표적인 개략도(도 7b). TNFα 유전자의 3'UTR은 TNFα의 유도성 발현의 조절에 관여한다[참조: Han, J., et al., J. Immunology, 1991, 146, 1843-1843, Crawford, E.K., et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 21120-21137, 및 도 9].
도 8(a 및 b)은 TNFα 수퍼프로모터-AIG 키메라 작제물을 제조하는 흐름도이다.
도 9는 루시퍼라제 리포터 유전자의 유도성 발현에 미치는 TNF3'UTR의 조절 효과를 나타내기 위한 2회의 실험 결과를 요약한 것이다. 일시적인 형질감염은 섬유아세포 세포주에서 수행되었다. 점이 있는 막대그래프는 TNF3'UTR의 부재하에 TNFpLuc의 유도능을 나타내고, 점이 없는 막대그래프는 TNF3'UTR의 존재하에 TNFpLuc의 유도능을 나타낸다. 유사한 결과가 Jurkat 세포에서 수득된다.
도 10은 TNFα-생산 세포 모집단내에서 TNFα 비-생산자 체세포 변이체의 선별 및 TNF-α 생성을 억제하는데 관여하는 우성 네가티브 억제 유전자의 확인을 위한 대표적인 개략도이다.
본 발명은 특정한 염증 질환에서 염증 세포의 아포토시스가 치료학적으로 유익하다는 증거에 토대를 두고 있다. 본 발명은 구체적으로 유전자 치료에 의한 자가-조절된 아포토시스에 관한 것이다. 대체로 말하면, 본 발명의 실시에 있어서, 염증 세포 또는 염증 부위에 있는 세포내에서 활성화된 유전자 또는 유전자의 배합물인 최소 프로모터의 하나 이상의 작용성 카피에 부착된 하나 이상의 프로모터 인핸서를 포함하는 키메라 유전자가 아포토시스-유도 유전자(AIG)의 하나 이상의 카피에 부착되어, 아포토시스-유도 유전자의 발현을 상기 프로모터에 의해 유도함으로써 염증 세포를 표적화한다. 염증 세포내에서 활성화된 유도성 유전자의 예시적인 프로모터에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 인터류킨 및 이의 수용체, 세포 부착 분자 및 이의 리간드, 케모킨 및 이의 수용체, 프로-염증 효소 등이 포함된다. 본 발명에 따른 키메라 유전자는 직접, 거리를 두고 부착되어 있거나 인접하여 부착되어 있는 인핸서, 프로모터, 및 AIG 구성원 및 이의 배합물을 포함한다. 상기 언급되어 있고 이하에 보다 상세히 언급되는 바와 같이, 몇몇 양태에 있어서 인핸서, 프로모터, 및/또는 AIG의 다수 카피가 최대 효능을 위해 사용된다.
본원에 기술된 본 발명을 보다 충분히 이해할 수 있도록 하기 위해, 하기 상세한 설명이 단지 설명을 위해 기술되어 있으며, 여기서 키메라 유전자는 최소 TNFα 프로모터의 하나 이상의 작용성 카피에 부착되어 있고 또한 AIG의 하나 이상의 카피에 부착되어 있는 하나 이상의 TNFα 프로모터 인핸서를 포함한다. 하기 실시예는 또한 이러한 이들 유형의 구성을 이용할지라도, 이는 본 기술분야의 연구자들에게 자명한 바와 같이 본원에 기술된 기본적인 작제물을 변형시켜, 감염 부위에서 표적 세포로 사용될 수 있는 유사한 작용을 나타내는 상술된 형태와 같은 염증 세포내에서 활성화된 유도성 유전자를 포함하는 다른 프로모터를 사용하여 본 발명의 생성물, 공정, 방법 및 조성물을 이용하는 다른 양태를 제공할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 키메라 유전자의 작제에 프로모터로서 유용한 사이토킨 및 인터류킨에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, TNF-α, TNF-β, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-9, GM-CSF, 인터페론γ 등, 및 이의 작용성 단편 및 혼합물이 포함된다. 세포 부착 분자 및 이의 리간드에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 셀렉틴, 인테그린, 및 다수의 면역글로불린 상과(ICAM-1, V-CAM 등) 및 이의 작용성 단편 및 변이체 및 혼합물이 포함된다. 케모킨 및 이의 수용체에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, C-X-C 및 C-C 부류 구성원, 예를 들어 MIP-1α, MIP-1β, MCP1-4, RANTES, Mig, NAP2, IP10, Gro α-γ 등, 및 이의 작용성 단편 및 변이체 및 혼합물이 포함된다. 프로-염증 효소에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, COX-2, iNOS, 포스포리파제, 프로테아제(매트릭스 메탈로프로테아제 포함) 등, 및 이의 작용성 단편 및 혼합물이 포함된다.
본 발명의 예시적인 TNFp-AIG 키메라 유전자에 대한 하기 논의를 명료히 하기 위하여, 하기 서열을 설명한다:
서열 1은 문헌[참조: Takashiba S., et al., Gene, 1993, 131, 307-308]에 공개된 바와 같은 전체 길이의 관련된 사람 TNFα 프로모터 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열이다. 본원에 사용된 뉴클레오타이드 번호는 이 서열의 번호를 의미한다.
서열 2는 본 발명에 사용된 유전자의 천연 TNFα 프로모터 서열이다(전사 개시 부위, TSS로부터 -1077 뉴클레오타이드). 서열 1과 서열 2의 TNFp 서열에는 약간의 차이가 있다. TNFα 프로모터의 뉴클레오타이드내의 이러한 차이는 보고되어 있다[참조: Takashiba S., et al., Gene, 1993, 131, 307-308].
서열 3은 하나 이상의 인핸서 구성원을 포함하는 천연 최소 TNFα 프로모터 서열(뉴클레오타이드 -120 내지 -TSS)이다[참조: k1 부위; Pauli, U., Crit. Rev. in Eucaryotic Gene Expression, 1994, 4, 323-344; Rhoades K.L., et al., J. Biol. Chem., 1992, 267, 22102-22107; and Takashiba S., et al., Gene, 131, 307-108].
서열 4는 키메라 유전자 TNFp120 AIG.1(CPP32 유전자의 프로도메인-결실된 변이체의 발현을 유도하는 -120 TNFp를 함유한다)이다[캐스패스 3, Tewari M. et al., Cell, 1995, 81(5), 801-809에 공개됨, 변이는 V239A이다].
서열 5는 키메라 유전자 TNFp706 AIG.1(프로도메인-결실된 CPP 32 유전자의 발현을 유도하는 -706TNFp를 함유한다)이다.
서열 6은 TNFp1005 AIG.1(프로도메인-결실된 CPP 32 유전자의 발현을 유도하는 -1005 TNFp를 함유한다)이다.
서열 7은 키메라 유전자 TNFp120 AIG.2(프로도메인-결실된 Ty/x 유전자의 발현을 유도하는 -120 TNFp를 함유한다)이다[Ty(캐스패스 5) 및 Tx(캐스패스 4)의 서열은 문헌(참조: Faucheu, C., et al., Eur. J Biochem., 236, 207-213, 1996; Faucheu, C., et al. EMBO J., 14, 1914-1922, 1995)에 공개되어 있다].
서열 8은 키메라 유전자 TNFp706 AIG.2(프로도메인-결실된 Ty/x 유전자의 발현을 유도하는 -706TNFp를 함유한다)이다.
서열 9는 TNFp1005 AIG.1(프로도메인-결실된 Ty/x 유전자의 발현을 유도하는 -1005 TNFp를 함유한다)이다.
서열 10은 뉴클레오타이드 -1005 내지 -905를 포함하는 TNFα 프로모터의 인핸서 영역 1(ER1)이다.
서열 11은 뉴클레오타이드 -706 내지 -517을 포함하는 TNFα 프로모터의 인핸서 영역 2(ER2)이다.
서열 12는 -120pGL3 작제물에서 -120 최소 TNFα 프로모터의 상부에서 유전공학적으로 조작된 또다른 다수 클로닝 부위(MCS)이다.
서열 13은 TNFα 유전자의 3' 비해독된 영역(3'UTR)이다[참조: Nedwin, G.E., et al., Nucleic Acid Research, 1985, 13, 6361-6373].
본 발명에 따른 키메라 유전자 작제물의 제조를 위한 TNFα 프로모터의 구성원은 TNFα 프로모터에 의해 유도된 치료 유전자의 발현을 유도할 수 있는 구성원으로부터 선택된다. 이들 프로모터 구성원은 TNFα 프로모터의 "유도성 cis 구성원", "cis-유도성 구성원" 또는 "인핸서 구성원"으로서 본원에서 언급될 것이다.
인핸서 구성원은 최소 프로모터 서열에 물리적으로 연결되거나, 하나의 제한 부위를 갖거나 갖지 않는 링커 서열에 의해 최소 프로모터로부터 분리될 수 있다. 따라서, 상기 요약된 바와 같이, 인핸서 구성원은 본 발명의 키메라 유전자에 직접, 간격을 두고서, 인접하여 또는 이의 모든 조합 방식으로 부착될 수 있다. 이들은 전형적으로 프로모터의 상부에서 작제된다. 예시적인 TNFα 인핸서 구성원은 서열 10 및 서열 11에 기재되어 있으며, 이의 작용성 단편 또는 변이체 및 배합물을 사용할 수도 있다. 본 발명에 따른 몇몇 바람직한 유전자 작제물은 인핸서 구성원의 다수 카피, 즉 2개 이상의 카피를 갖는 것들을 포함한다. 일부 양태는 약 2 내지 25개, 보다 좁게는 2 내지 10개, 및 더욱 더 좁게는 2 내지 5개의 카피를 포함한다.
용어 "TNF 프로모터", "TNFα 프로모터" 및 "TNFp"는 본원에서 교대로 사용된다. 달리 언급되지 않는한, 이들 용어는 하나 이상의 상부 인핸서 구성원에 부착된 천연 TNFα 최소 프로모터 서열에 상응하는 전체 뉴클레오타이드 서열을 의미한다(자연적으로, 즉 천연에 존재하거나, 실험실에서 유전공학적으로 작제된다). 이의 예에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 서열 1, 서열 2 및 서열 3, 및 이의 작용성 단편, 변이체, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 이들 TNFα 서열의 많은 작용성 단편 및 변이체, 및 본원에 기술된 다른 것들은 이들의 천연 및 유전공학적으로 작제된 카운터파트에 대해 약 80% 이상, 및 몇몇 경우에는 90% 이상의 서열 상동성을 공유하지만, 이들은 당업자에게 공지되어 있고 본원에 인용된 참조 문헌에 정의되어 있다.
모든 아포토시스-유도 유전자는 본원에 기술된 키메라 유전자 및 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 키메라 치료 유전자에 사용된 아포토시스-유도 유전자는 TNF-α-생산 염증 세포의 천연 서열에 존재하는 아포토시스-유도 유전자의 형태와 동일하거나 상이할 수 있다(이들 세포가 아포토시스 유전자를 자연적으로 함유한다면). 바람직한 AIG에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, ICE/CED3 부류의 아포토시스-유도 프로테아제의 구성원[예: 캐스패스-1(ICE), hICE, ICE-LAP45, Mch2α, 캐스패스-2(ICH1), 캐스패스-3(CPP32, 야마, 아포파인), 캐스패스-4(TX, ICH2, ICE rel II), 캐스패스-5(ICE rel III, TY), 캐스패스-6(Mch-2), 캐스패스-7(Mch-3, ICE-LAP3, CMH-1), 캐스패스-8(MACH, FLICE, Mch-5), 캐스패스-9(ICE-LAP6, Mch6) 및 캐스패스-10(Mch4)], 그랜자임 부류의 구성원[예: 그랜자임 A 및 그랜자임 B], Fas 리간드(FasL), 및 이의 작용성 단편, 변이체, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 일부 양태는 캐스패스 3, 캐스패스 4, 캐스패스 5, 그랜자임 B, 및 이의 단편 및 변이체 및 이들의 혼합물을 사용한다. 형질감염후 과발현되는 경우, FasL을 제외한 이들 유전자는 형질감염된 세포에서 아포토시스를 유도한다[참조: Miura M., et al., Cell, 1993, 75. 653-660; Chinnayan A.M., et al., Cell, 1995, 81, 505-512; Los, et al., Nature, 1995, 375, 81; Muzio, et al., Cell, 1996, 85, 817-827].
FasL의 경우, 아포토시스는 Fas를 발현하는 세포에서만 유도된다(오토크린 또는 파라크린 방식으로). 따라서, TNFp-FasL 키메라 유전자 작제물은 제2 수준의 선택성을 제공한다. TNFp-FasL 키메라 유전자의 또다른 잇점은 TNFα를 발현(이에 의해 아포토시스-유도 유전자의 발현을 유도하지 못한다)하지는 않지만 표면상에서 Fas를 발현하는 활막에서 이들 질환-생산 세포를 선택적으로 표적화시킨다는 것이다. 이러한 경우, FasL은 활성화된 마크로파지 및 T 세포와 같이 TNFα를 생산할 수 있는 세포에 의해 발현될 것이다. 이어서, 이들 세포는 독성의 활성화 T 세포 및 Fas-발현 활막세포와 같은 Fas-발현 세포에서 아포토시스를 유도할 것이다.
본 발명은 TNFα 프로모터(TNFp)에 의해 유도된 아포토시스-유도 유전자(AIG)를 포함하는 키메라 유전자를 포유동물의 세포내로 도입하는 단계를 포함하는 신규한 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 키메라 유전자의 예는 서열 4, 5, 6, 7, 8 및 9에 기재되어 있으며; 이의 작용성 단편 또는 변이체를 사용할 수도 있다. 이론에 국한시키고자 하는 것은 아니지만, TNFp에 의한 조절로 인하여, AIG는 염증 사이토킨인 TNFα를 생산하는 세포에서만 발현된다. 따라서, TNFα를 발현하는 모든 세포가 자가-파괴되는 반면, TNF-α를 발현하지 않는 세포는 영향을 받지 않을 것이다. 유리하게는, 이 방법은 세포 유형과 무관하게 모든 TNFα-생산 세포(예: 활성화된 마크로파지, 활성화된 T-세포 및 마크로파지-유사 및 가능하게는 섬유아세포-유사 활막세포)를 표적화할 것이다. 실제로, 표적화된 TNF-α 생산 세포는 이의 천연의 비변화된 형태로 아포토시스 유전자를 정상적으로 포함하거나 발현하는 세포 또는 당해 유전자를 포함하거나 발현하지 않는 세포일 것이다. 따라서, 본 발명의 키메라 유전자 및 방법을 사용하여 TNFα의 세포 공급원을 고도의 선택적 방식으로 파괴시킬 수 있다.
본 발명의 TNFp-AIG 키메라 유전자의 또다른 잇점은 TNFp가 내인성 TNFp에 의해 요구되는 전사 인자를 격리시킴으로써 내인성 TNFα 생성을 감소시킨다는 것이다. 한가지 바람직한 양태에 있어서, TNFp는 치료학적으로 표적화된 세포내에 광범위하게 존재한다. 이는 세포내로 형질감염 유전자의 다수 카피를 도입함으로써 달성된다. 한편, 본 발명에 따른 TNFp-AIG 키메라 유전자는 TNFα 프로모터의 유도성 cis 구성원의 다수 카피를 함유할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, TNFp의 "유도성 인핸서 구성원"의 다수 카피는 본 발명의 TNFp-AIG 키메라 유전자의 몇몇 양태에 존재한다. TNFp 작제물의 유도성 cis 구성원의 다수 카피를 포함함으로써, TNFα의 생산을 위해 형질감염된 세포가 요구하는 전사 인자는 외래 도입된 서열에 의해 격리된다. 이러한 바람직한 키메라 TNFp-AIG 작제물의 특징은 TNFp에 연결된 단일 인핸서 구성원만을 함유하는 본 발명의 키메라 유전자와 비교하여 TNFp-특이적 전사 인자에 대한 경쟁 효과를 증가시킨다는 것이다. 이러한 방식으로 작제된 "유도성 수퍼프로모터"는 (1) TNFα 특이적 유도성 전사 인자에 대해 보다 효과적으로 경쟁할 수 있고, (2) 다수의 인핸서 구성원과 관련하여 증가된 방식으로 아포토시스-유도 유전자의 발현을 유도할 수 있다.
예를 들면, 류마티스성 관절염 환자의 경우, 활막절제술(즉, 활막 조직의 제거)은 임상적으로 유익한 것으로 밝혀졌다. 통상적인 및 외과적인 활막절제술 과정과는 달리, 본원에 기술된 세포-표적화된 치료 방법은 TNFα를 생산하는 세포만을 표적화한다. 따라서, 유리하게는, TNFp-AIG 키메라 유전자의 도입과 발현, 및 후속적인 아포토시스의 유도는 염증 반응을 유도하지 않는다. 따라서, 본 발명의 방법은 비교적 선택적이며, 조직 손상을 최소화시키고 염증을 감소시킨다.
본원에 기술된 생성물 및 방법은 또한 다른 염증 질환의 치료에도 유용하다. 이러한 염증 질환에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 다발성 경화증, 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염, 건선, 숙주 이식거부 질환, 홍반성 낭창, 인슐린-의존성 진성당뇨병, 관절염성 건선, 유육종증, 과민성 폐염, 강직성 척추염 및 관련된 강직성 척추관절염, 라이터 증후군(Reiter's syndrome) 및 전신성 경화증이 포함된다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 키메라 유전자를 세포내로 도입하여 염증 세포 또는 환자의 염증 부위에 있는 세포내에서 아포토시스를 유도함으로써 환자의 염증 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 이것은 전형적으로 하나 이상의 본 발명의 키메라 유전자 및 전형적으로 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물을 제조하고 표준 수단을 사용하여 환자에게 상기 조성물을 투여함으로써 달성된다. 몇몇 양태에 있어서, 약제학적 조성물은 국소, 정맥내, 복강내 및 유사한 방법을 사용하여 염증 부위로 직접 전달된다. 추가의 방법론은 하기에 논의된다.
치료학적 용도 이외에, 본 발명에 따른 유전자 및 세포는 각종 유용한 스크리닝 및 선별 방법에 사용될 수 있다. 이와 같은 한가지 방법에 있어서, TNFα 생산 세포 모집단내의 TNFα 비-생산자 체세포 변이체는 TNFα 생산 세포 모집단내로 TNFp-AIG 키메라 유전자를 도입함으로써 시험관내에서 선별할 수 있다. TNFα를 생산하는 세포는 아포토시스할 것이다. TNFα를 생산하지 않는 세포는 생존할 것이다. 생존 표현형을 보유하는 이들 세포 변이체의 선별은 TNFα 비-생산자 세포를 확인하기 위한 용이한 방법이다. 이러한 선별 방법을 사용함으로써, TNFα 프로모터의 활성을 조절하여 TNF-α 생성을 감소시키도록 자동적으로 상호작용하는 유전자의 발현을 측정할 수 있다. 이러한 유전자는 다른 시스템내에서 우성 네가티브(DN)/우성 억제 유전자로서 특성화된다[참조: Behrends S., et al., J. Biol. Chem. 1995, 270, 21109-21113; Zhang S., et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 23934-23936; Watowich S.S., et al., Mol. Cell Biol., 1994, 14/6, 3535-3549].
추가의 시험관내 방법에 있어서, 본 발명에 따른 TNFp-AIG 키메라 유전자를 사용하여 TNFα 비-생산 세포 모집단의 발생에 관여하는 우성 네가티브 유전자를 확인할 수 있다. 이 방법에 따르면, 본 발명에 따른 TNFp-AIG 키메라 유전자는 TNFα를 생산하는 세포내로 도입된다. 우성 네가티브 유전자의 존재를 차단하는 경우, 이들 세포는 활성화에 의해 아포토시스를 감수해야 한다. 따라서, 생존 변이체는 TNFα 생산을 하향-조절할 수 있는 우성 네가티브 유전자를 보유하는 것으로 추정할 수 있다. 우성 네가티브 유전자는 cDNA 라이브러리를 제조하여 세포주(예: Jurkat 및 THP-1)를 형질감염시킴으로써 용이하게 확인할 수 있다. 이들 세포는 유도성 TNFp-AIG 키메라 유전자 또는 TNFp-루시퍼라제 유전자의 안정한 형질감염체이며, TNFp-AIG 형질감염된 세포는 시험관내에서 활성화시킨 후, DN 유전자의 효과를 나타내는 생존 표현형에 대해 선별한다. TNFp-루시퍼라제 유전자로 형질감염된 세포에 있어서, 루시퍼라제 활성의 감소는 DN 유전자의 효과를 나타낼 것이다. 이 프로토콜을 사용하여 확인된 우성 네가티브 유전자는 장차 치료제 자체로서 이용될 수 있다. 이러한 유전자는 TNFα 생성을 감소시키기 위한 유전자 치료에 대한 후보물일 것이다.
유전자 전달을 위해 사용된 방법은 2가지의 광범위한 범주로 나누어진다:
1. 직접적인 방법: 치료 유전자에 대한 캐리어로서 적합한 벡터를 사용하여 활막세포와 같은 표적 세포내로 치료 유전자의 인 시튜(In situ) 형질전환. 치료 유전자를 함유하는 벡터를 발병 부분(예: 관절)에 직접 주사한다.
2. 간접적인 방법: 활막세포와 같은 표적 세포내로 치료 유전자의 생체외 형질감염. 이 방법에 있어서, 활막을 관절로부터 제거하고, 활막세포를 분리하여 시험관내에서 배양한다. 시험관내에서 배양된 세포를 치료 유전자로 형질감염시키고, 유전공학적으로 변형된 활막세포를 활막에 역이식한다.
생체내 전달을 위해, 몇가지의 벡터가 이들의 유전자 전달 효능에 대해 평가되었다[참조: Nita, et al., Arthritis ＆ Rheumatism, 1996, 39/5, 820-828]. 유전자 치료에 사용된 벡터 가운데, 레트로바이러스로부터 유도된 벡터가 지금까지 가장 많이 개발되어 있다. 이들은 숙주 게놈내에 유전자 물질을 삽입하여 안정한 형질전환체를 생산할 수 있다. 그러나, 이들 벡터는 이들이 숙주 게놈내에 삽입되어 삽입 돌연변이유발 가능성을 배제할 수 없기 때문에 비-분화 세포를 감염시킬 수 없다. 대조적으로, 아데노바이러스로부터 유래된 벡터는 비-분화 세포뿐만 아니라 분화 세포를 감염시키고, DNA를 에피좀에 의해 전달한다. 아데노바이러스를 기본으로 하는 벡터의 잇점은 이들 벡터가 이들을 잠재적으로 항원성으로 되게 하는 감염된 세포에서 바이러스 단백질을 계속 생산한다는 것이다. 바이러스를 기본으로 하는 벡터의 세번째 유형은 비-분화세포 뿐만 아니라 분화 세포를 또한 감염시킬 수 있는 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus; HSV)로부터 유도된다.
비-바이러스 벡터 시스템 가운데, 양이온성 리포좀 및 나상(naked) 플라스미드 DNA가 평가되었다. 리포좀은 대부분의 진행된 성장 단계에서 존재하지만, 평활근 및 표피 세포와 같은 특정 유형의 세포는 나상 플라스미드 DNA를 취하여 보유하고 이를 발현시킨다.
또한, 입자-매개된 유전자-전달 시스템도 가능[참조: Rakhmilevich, et al., PNAS, 1996, 93, 6291]하고, 유망한 방법이다.
하기 "시험관내" 유전자 전달 프로토콜을 본 발명의 키메라 유전자의 전달에 사용할 수 있다:
(1) Nita et al., Arthritis and Rheumatism, 1996, 39, 820-823
래빗의 생체내 시험:
각각의 벡터를 하나의 무릎 관절내로 관절내 주사한다. 바이러스 벡터의 경우, 평형 염 용액 0.5ml에 현탁된 108내지 109개의 입자를 무릎당 주사한다.
평형 염 용액 1ml중의 리포좀-DNA 복합체(DC-Chol 200nmol이 DNA 20㎍/ml와 복합체화된다)를 무릎당 주사한다.
(2) Methods in Molecular Medicine: Gene Therapy Protocols, Paul Robbins, ed., 1997, Barr et al., pages 205-212
간담낭으로 아데노바이러스계 벡터 전달: 100g의 동물중 랫트 간담낭 1×1011PFU
개(12 내지 17kg)의 경우, 문맥에 약 1.5×1011PFU/kg을 관류하고, 숙주 DNA의 이배체 카피당 1개의 아데노바이러스 게놈 카피를 제공한다.
래빗(2 내지 4kg)의 경우, 1.5×1013바이러스 입자(약 1.5×1011PFU)가 100%의 간담낭 형질전환을 제공하고, 4×1012바이러스 입자가 50 내지 75%의 형질전환을 제공한다.
Yang N-S, et al., 281-296
금 입자-매개된 유전자 전달: 포유동물 표피 조직의 형질감염 - 0.1, 0.5, 1.0 및 2.5㎍의 DNA/입자 mg이 트랜스유전자 발현 수준과 직선의 상관관계를 제공한다.
Nabel, et al., 297-305
사람의 리포좀-매개된 유전자 전달:
프로토콜 1: 15nmol DC-Chol/농후액 리포좀을 0.7ml중의 1㎍ DNA와 배합한다. 상기 혼합물 0.2ml를 환자의 흑색종 소결절내로 주사한다. 카테터 전달의 경우, 용액 0.6ml를 동맥내로 전달한다.
프로토콜 2: 15nmol DMRIE/농후액 리포좀을 0.1ml중의 5㎍ DNA와 배합한다.
직접적인 종양내 주사의 경우, DNA 농도는 3㎍(4.5nM DMRIE/농후액으로 복합체화됨) 내지 300㎍(450nM DMRIE/농후액으로 복합체화됨)의 범위이다.
(3) Roessler, et al. 369-374
활막으로의 유전자 전달:
109내지 1012아데노바이러스 입자를 함유하는 치료 유전자/관절의 용량 범위를 사용한다. 그러나, 특정한 실험 순서에 대한 최적 용량은 경험적으로 결정되어야 하며, 발현되는 트랜스유전자 뿐만 아니라 사용되는 재조합 아데노바이러스 게놈 골격의 특성 모두에 따라 달라진다.
간접적인 방법의 경우, 양이온성 지질 또는 양이온성 중합체-기본 형질감염 및 전기천공의 사용을 포함하는 각종 방법이 잘 확립되어 있다.
상기 참조된 모든 기술은 당업자의 특정한 요구에 부합되도록 변화시킬 수 있다. 이러한 변형은 통상의 숙련인이 갖고 있는 기술 수준내에 있으며, 특정한 실험을 요구하지 않는다. 이들 명백한 변형은 본 발명의 범위내에 포함된다.
본 발명이 보다 충분히 이해되도록 하기 위해, 하기 실시예를 기재한다. 이들 실시예는 본 발명의 몇몇 바람직한 양태를 설명하기 위한 것이며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
TNFp-AIG 작제물의 제조
TNF 프로모터의 인핸서 cis 구성원에 의해 유도된 키메라 AIG를 작제하기 위해, 동일한 영역 또는 상이한 영역의 단일 카피 또는 다수 카피에서 리포터 유전자의 유도성 최적 발현에 관여하는 목적하는 영역을 확인한다.
키메라 유전자를 작제하기 위한 TNF-α 프로모터 구성원의 선별
TNF-α 프로모터의 영역은 TNF-α 프로모터의 각종 결실 작제물을 포함하는 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시킨다(도 3). 상이한 기타 세포 시스템에서 다른 연구자가 확인한 영역을 참조로서 사용한다[참조: Rhoades, et al., J. Biol. Chem., 1992, 267, 22102-22107; Leitman, et al., Mol. Cell Biol., 1992, 12, 1352-1356; Pauli U., Crit. Reviews Eukaryotic Gene Expression, 1994, 4, 323-344]. 이어서, PCR-증폭된 유전자를 상업상 입수가능한 프로모터 비함유 벡터내의 리포터 유전자(예: 루시퍼라제)의 상부에 클로닝시킨다. 이들 작제물을 Jurkat(T 임파아구), U973(골수성단구), THP-1(단구), 섬유아세포 및 시험관내에서 배양된 사람 활막세포와 같은 여러가지 세포주에서 이들의 구조적 및 유도성 발현에 대해 시험한다. 리포터 유전자의 유도성 발현에 관여하는 영역의 확인은 주로 2개의 TNFα-생산 세포주, 즉 Jurkat(PMA로 작극한 후) 및 THP-1(LPS로 자극한 후)를 사용하여 수득한 결과를 토대로 한다(도 4a 및 b). 이들 세포는 잘 확립된 방법 및 상업상 입수가능한 시약(예: DEAE 덱스트란 및 수퍼펙트)을 사용하여 일시적으로 형질감염시킨다. 이어서, 리포터 유전자의 유도성 발현에 관여하는 TNFα 프로모터의 cis-구성원을 TNFp-AIG 키메라 유전자의 작제에 사용한다.
TNFp-AIG 키메라 유전자의 작제
본원에 기술된 아포토시스-유도 유전자 중에서, 하기 유전자가 바람직하다:
i) 시스테인 프로테아제-CPP32(또한 야마, 아포파인 또는 캐스패스 3으로서 공지되어 있음) 및
ii) 시스테인 프로테아제-Tx/Ty(캐스패스 4/캐스패스 5)
AIG는 캐스패스의 자가촉매를 잠재적으로 증가시키기 위해 "프로도메인-결실된" 절단물로서 사용된다. 이것은 불활성 캐스패스를 활성 형태로 전환시키는데 필수적이다.
프로도메인-결실된 CPP32는 코돈 29번 내지 36번 및 271번 내지 278번(278번은 정지 코돈이다)에 상응하는 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 절단된 형태의 CPP32는 본원에서 "αCPP32" 또는 "AIG.1"로서 명명된다.
프로도메인-결실된 Ty를 PCR 증폭시키기 위해, Ty 유전자내의 서열에 상응하는 프라이머가 합성된다. 지금까지 발견된 모든 캐스패스는 캐스패스 부류의 다른 구성원과 상동성이다. 코돈 359번 내지 365번(코돈 365번은 정지 코돈이다)에 상응하는 3' 프라이머는 Tx 유전자내의 코돈 372번 내지 378번(코돈 378번은 정지 코돈이다)과 100%의 서열 상동성을 공유한다. 그러나, Ty 유전자내의 코돈 81번 내지 87번에 상응하는 5' 프라이머는 Tx 유전자내의 상응하는 영역(Tx 코돈 94번 내지 100번)과 100%의 상동성을 공유하지 않는다. Ty 유전자내의 잔기 87번(알라닌)은 Tx 유전자내의 잔기 100번(글리신)과 상이하다. 활성화된 사람 말초혈 림파구로부터 제조된 cDNA로부터 생성된 PCR 증폭된 생성물은 Tx 전사물의 명백한 풍부함에 기인하여 Tx 서열을 포함한다. 따라서, Ty내의 서열에 상응하는 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 생성한 절단된 형태의 AIG는, 프라이머의 Ty 서열에 의해 플랭킹되어 있으나, 사실상 Tx내의 서열과 매치한다. 또한, 사용된 프라이머의 Ty 서열은 하나의 코돈을 제외하고는 Tx 서열과 매치한다. 따라서, 본 발명에 사용된 유전자는 잔기 G100이 A로 변화된 절단된 Tx 유전자와 매치한다. 이 유전자를 본원에서 "△Ty/x" 또는 "AIG.2"로서 명명한다.
AIG.1 및 AIG.2는 TNFα 프로모터의 결실 작제물(-120, -706 및 -1005)에서 루시퍼라제 리포터 유전자를 대체함으로써 TNFα 프로모터의 하부에 삽입된다(도 5). 이들 작제물은 일시적으로 감염된 Jurkat 및 THP-1 세포를 자극시킨 후 아포토시스의 유도에 대해 시험한다(도 6a, b 및 c).
TNFα 수퍼프로모터-AIG 키메라 유전자의 작제
대체로 바람직한 2개의 영역, 즉 상술된 리포터 유전자의 유도성 발현에 관여하는 구성원을 함유하는 TNFα 프로모터의 ER1(-1005 내지 -905)(서열 10) 및 ER2(-706 내지 -517)(서열 11)(도 4a 및 4b)를 PCR 증폭시키고, 단일 카피 또는 다수 카피로서 최소 천연 프로모터(-120 내지 TSS, 서열 3)의 상부에 연결시킨다. 또한, TNFα 프로모터의 2개의 또다른 영역(-234 내지 -120) 및 (-234 내지 -65)가 각각 잠재적인 인핸서 영역 3(ER3) 및 인핸서 영역 4(ER4)로서 확인되는데, 이는 하기 서술되는 방법을 사용하여 키메라 작제물에서 사용할 수 있다. 수퍼 프로모터는 유도성 프로모터 구성원을 함유하는 상술된 영역의 다수(2 내지 10개) 카셋트를 함유한다(도 7). 이것은 프라이머의 각 5' 말단에 삽입된 제한 부위를 사용하여 합성된 프라이머를 사용하여 목적하는 영역을 PCR 증폭시킴으로써 이루어진다. 이들 독특한 제한 부위는 목적하는 증폭 유전자 생성물과 플랭킹되어 있다. 바람직하게는, PCR 증폭된 AIG는, 천연 TNFα 프로모터에 대해 기술(도 5)된 바와 같은 최초 작제물내의 루시퍼라제 리포터 유전자를 대체하는, TNF-수퍼 프로모터의 하부에 클로닝된다.
효율적인 방향으로의 삽입을 위해 독특한 제한 부위(이들 제한 부위는 당해 TNF-α 프로모터 및 AIG의 선택된 구성원내에 부재한다)를 나타내는 TNFα 수퍼프로모터 및 링커 서열을 작제하는 도식은 하기에 요약되어 있고 도 8에 제시되어 있다.
도식 1:
단계 1: pGL3 기본(프로모터 부재) 루시퍼라제 벡터(Promega)내로 TNF-α 최소 프로모터(-120 내지 TSS)의 삽입:
키메라 유전자 TNFp-AIG의 작제에 사용된 pGL3 기본 벡터의 구성원은 하기에 제시된다.
KpnI.SacI.MluI.NheI.SmaI.XhoI.BglII.HindIII.[루시퍼라제].XbaI
최소 프로모터는, XhoI이 증폭된 생성물의 5' 말단에 위치하고 BglII.HindIII 부위가 3' 말단에 위치하도록, XhoI 및 BglII.HindIII 부위를 함유하는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시킨다. 이 단편을, 이들 동일한 제한 부위를 사용하여 pGL3 기본 벡터의 폴리링커에 삽입한다. 상기 작제물을 "작제물 A1"으로서 명명하며, 이는 다음과 같다:
KpnI.SacI.MluI.NheISmaIXhoI.(-120 내지 TSSBglII).HindIII.[루시퍼라제].XbaI
단계 2: 인핸서 단편(ER1 또는 ER2)은 몇개의 제한 부위를 함유하는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시킨다. 생성된 단편은 다음과 같이 5' 말단에 제한 부위 KpnI.AatII.BssHII를 가지고 3' 말단에 NsiI.SpeI.MluI을 가질 것이다: 5'KpnI.AatII.BssHII.(ER1 또는 ER2).NsiI.SpeI.MluI 3". 이 단편은 KpnI 및 MluI 제한 부위를 사용하여 단계 1에서 생성된 "작제물 A1"내로 삽입된다. 이 작제물을 "작제물 B1"으로 명명하며, 이는 다음과 같다:
KpnI.AatII.BssHII.(ER1 또는 ER2).NsiI.SpeI.MluI.NheI.SmaI.XhoI(-120 내지 TSS BglII).HindIII.[루시퍼라제].XbaI
단계 3: TNFα 인핸서 단편(ER1 또는 ER2)는 제한 부위 AatII 및 BssHII를 함유하는 프라이머를 사용하여 증폭시킴으로써 다음과 같은 PCR 생성물을 수득한다:
5'AatII.(ER1 또는 ER2).BssHII3'. 이 단편은 동일한 제한 부위를 사용하여 "작제물 B1"내로 클로닝한다. 이 작제물을 "작제물 C1"으로 명명하며, 이는 다음과 같다:
KpnI.AatII.(ER1 또는 ER2).BssHII.(ER1 또는 ER2).NsiI.SpeI. MluI.NheI.SmaI.XhoI(-120 내지 TSS BglII).HindIII.[루시퍼라제].XbaI
단계 4: TNFα 인핸서 단편(ER1 또는 ER2)는 제한 부위 NsiI 및 SpeI을 함유하는 프라이머를 사용하여 증폭시킴으로써 다음과 같은 PCR 생성물을 생성한다:
5'NsiI.(ER1 또는 ER2).SpeI3'. 이 단편은 동일한 제한 부위를 사용하여 "작제물 C1"내로 클로닝시킨다. 이 작제물을 "작제물 D1"으로 명명하며, 이는 다음과 같다:
KpnI.AatII.(ER1 또는 ER2).BssHII.(ER1 또는 ER2).NsiI.(ER1 또는 ER2).SpeI.MluI.NheI SmaI.XhoI(-120 내지 TSSBglII).HindIII.[루시퍼라제].XbaI
단계 5: AIG.1 또는 AIG.2(AIG.1 및 AIG.2로서 제한되는 것은 아니지만, 목록으로부터의 특정한 AIG를 사용하는 것이 바람직할 것이다) 암호화 영역은 BglII 및 XbaI 제한 부위를 함유하는 프라이머로 PCR-증폭시켜 다음과 같은 단편을 생성한다: 5'BglII.(AIG.1 또는 AIG.2).XbaI3". 이 단편을 동일한 제한 부위를 사용하여 "작제물 D1"내로 삽입한다. 생성된 작제물을 "작제물 E1"으로 명명하고, 이는 다음과 같다:
KpnI.AatII.(ER1 또는 ER2).BssHII.(ER1 또는 ER2).NsiI.(ER1 또는 ER2).SpeI.MluI.NheI.SmaI.XhoI(-120 내지 TSS.BglII)[AIG.1 또는 AIG.2].XbaI
또다른 도식 2는 다음과 같다:
도식 2:
단계 1: "작제물 A1"을 생성하기 위해 제공되는 도식 I과 동일하며, 이는 다음과 같다:
KpnI.SacI.MluI.NheI.SmaI.XhoI.(-120 내지 TSS BglII). HindIII.[루시퍼라제].XbaI
단계 2: 추가의 MCS의 삽입.
NheI.SacII.EcorV.AflII.AatII.AvrII.SpeI.PvuII.XhoI 를 제공하는 2개의 상보성 올리고뉴클레오타이드(5' 포스포릴화됨)을 시판되는 공급원을 이용하여 합성한다. 이들 올리고뉴클레오타이드를 어닐링한 후, "작제물 A1"의 NheI 및 XhoI 부위내로 클로닝시킨다. 생성된 작제물을 "작제물 B2"로 명명하며, 이는 다음과 같다:
KpnI.SacI.MluI.NheI.SacII.EcorV.AflII.AatII.AvrII.SpeI.PvuII.XhoI.(-120 내지 TSS BglII).HindIII.[루시퍼라제].XbaI
단계 3: 5' 말단에 제한 부위 SpeI.PvuII를 함유하고 3' 말단에 XhoI을 함유하는 프라이머를 사용하여 TNF-α 인핸서 단편(ER1 또는 ER2)를 증폭시킴으로써 다음과 같은 PCR 생성물을 생성한다: 5'SpeI.PvuII.(ER1 또는 ER2).XhoI3'. 이 단편은 SpeI 및 XhoI 제한 부위를 사용하여 "작제물 B2"내로 클로닝시킨다. 이 작제물을 "작제물 C2"로서 명명하며, 이는 다음과 같다:
KpnI.SacI.MluI.NheI.SacII.EcorV.AflII.AatII.AvrII.SpeI.PvuII.(ER1 또는 ER2)XhoI.(-120 내지 TSS BglII).HindIII.[루시퍼라제].XbaI
단계 4: 5' 말단에 제한 부위 AvrII.SpeI을 함유하고 3' 말단에 PvuII를 함유하는 프라이머를 사용하여 TNFα 인핸서 단편(ER1 또는 ER2)을 증폭시킴으로써 다음과 같은 PCR 생성물을 생성한다: 5' AvrII.SpeI.(ER1 또는 ER2).PvuII 3'. 이 단편을 AvrII 및 PvuII 제한 부위를 사용하여 "작제물 C2"내로 클로닝시킨다. 이 단편을 "작제물 D2"로 명명하며, 이는 다음과 같다:
KpnI.SacI.MluI.NheI.SacII.EcorV.AflII.AatII.AvrII.SpeI.(ER1 또는 ER2)PvuII.(ER1 또는 ER2)XhoI.(-120 내지 TSS BglII).HindIII.[루시퍼라제].XbaI
따라서, 이 방법을 사용하는 경우, 인핸서 영역(각각 ER1, ER2 또는 ER3, 또는 배합하여)의 7개 이상의 카피는 선택된 인핸서 영역의 PCR 증폭시 선행 부위의 상부에 하나 이상의 제한 부위를 사용함으로써 동시에 부가할 수 있다.
인핸서 영역의 목적하는 카피수가 부가되면, 도식 1의 단계 5에 기술된 바와 같이 수퍼프로모터의 하부에 AIG를 삽입한다.
키메라 TNFp-AIG 유전자의 유도성 발현은 상술된 세포주를 일시적으로 형질감염시켜 시험한다. TNFp-AIG 유전자의 발현은 형질감염된 세포의 아포토시스를 검출하고, 상업상 입수가능한 항체를 사용한 웨스턴 블롯으로 AIG 발현된 단백질을 평가하며, 상업상 입수가능하고 잘 확립된 특이적 합성 테트라펩타이드 기질을 사용하여 프로테아제 활성을 평가함으로써 측정한다.
키메라 TNFp-FasL 유전자의 유도성 발현은 동일한 세포주를 일시적으로 형질감염시켜 시험한다. 형질감염된 세포에 의한 FasL의 세포 표면 발현은 간접적인 면역형광에 의해 검출된 바와 같은 항-FasL 항체 결합을 사용하고 Fas 포지티브 세포의 아포토시스의 유도를 측정함으로써 정량한다.
리포터 유전자의 TNFp-유도된 발현의 조절
TNFα 유전자의 3' 비해독된 영역은 TNFα 생합성의 조절에 중요한 역할을 담당한다. 이는 정상의 불활성화된 상태로 TNFα 유전자의 해독 발현에 관여한다. 중요하게는, 이들 구성원은, TNFα-생산 세포가 외부 자극에 의해 활성화되는 경우, 활성화가 발생하게 한다[참조: Han, J., et al., J. Immunology, 1991, 146, 1843-1848; Crawford, F.K., et al., J. Biol. Chem., 1996, 271, 22383-22390].
전체 3' 비해독된 영역(서열 13)이 결실 단편, 즉 TNFα 프로모터의 -120, -706 및 -1005에 의해 유도된 루시퍼라제 유전자의 하부에 삽입되어 있는 유전자 작제물이 제조된다. 이 작제물의 일시적 발현 결과는 도 9에 요약되어 있다.
실시예 2
시험 프로토콜
시험관내 방법:
루시퍼라제 검정: 루시퍼라제 활성은 상업상 입수가능한 시약(Promega)를 사용하여 측정한다.
AIG.1 및 AIG.2 유전자 발현:
a) 형질감염된 세포 용균액의 웨스턴 블롯은 항-PRAP 항체 뿐만 아니라 항-CPP32 항체를 이용하여 나타낸다. 항-PRAP 항체는 CPP32의 효소적 작용으로 PRAP의 비-가수분해된 생성물 뿐만 아니라 가수분해된 생성물 모두를 검출한다.
b) CPP32 효소 검정: 본 검정은 CPP32의 효소 반응 및 비색성 또는 형광성 기질의 절단을 검출한다. 본 검정에는 상업상 입수가능한(Clonotech, Pharmingen) 키트를 사용한다.
c) 형질감염된 세포의 아포토시스: AIG.1 및 AIG.2에 기인하는 형질감염된 세포의 아포토시스는 프로피디움 요오다이드[참조: Krishan, A., J. Cell Biol., 66, 1994, 188-193] 및 상업상 입수가능한 세포 사멸 엘리사 키트(Boehringer Mannheim)에 의해 핵을 염색하여 측정한다.
동물 모델
IL-1-유도된 관절염의 래빗 모델[참조: Pettipher E.R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1986, 83, 8749-8753]: IL-1을 뉴질랜드 화이트 래빗(New Zealand White rabbit)의 무릎 관절내로 주사한다. IL-1의 관절내 주사는 백혈구를 관절 공간내로 용량-의존성 침투시키고 관절 연골로부터 프로테오글리칸을 소실시킨다.
항원-유도된 관절염: 무릎 관절내로 항원(난알부민)의 관절내 주사는 사람의 류마티스성 관절염과 매우 유사한 백혈구 축적 및 연골 분해를 유도한다. 주사후의 관절 팽윤은 14일 동안 지속된다.
시드(Scid) 마우스-사람 활막세포 모델[참조: Houri J.M., et al. Current Opinions in Rheumatol., 1995, 7, 201-205; Sack U., et al., J. Autoimmunity, 1995, 9, 51-58; Geiler T., et al. Arthritis ＆ Rheumatism, 1994, 37, 1664-1671]: 이들은 RA 환자의 새로운 활막 조직이 신장 캡슐[참조: Geiler T., et al., Arthritis ＆ Rheumatism, 1994, 37, 1664-1671]하에 시드 마우스에게 피하로 또는 무릎 연골[참조: Sack U., et al., J. Autoimmunity, 1995, 9, 51-58]내로 정상 사람 연골과 함께 이식되는 최근에 개발된 관절염 모델이다. 세포 밀도가 높은 판누스 조직의 형성, 골 및 연골 미란, 다핵 거대 세포의 생성, 및 활막 섬유아세포에 의한 연골의 침입을 포함하는 관절염-유사 특징을 갖는 이식체가 성장한다.
간접적인 방법: 활막세포를 치료 유전자로 시험관내에서 형질감염시키고, 래빗에게 역이식한다. IL-1을 주사하여 이들 래빗에서 관절염을 유도하고, 활성화시킨 후 치료 유전자의 발현을 평가한다. 키메라 유전자의 활성화-유도된 발현은 이식된 세포에서 아포토시스를 유도한다.
직접적인 방법: 키메라 유전자의 관절내 주사. 나상 플라스미드 DNA를 포함하여 상술된 유전자 전달 방법 및 양이온성 리포좀-매개된 전달의 어느 것도 사용할 수 있다. 바이러스 벡터-기본된 전달을 사용하기 위해, 키메라 유전자를 적합한 벡터내로 클로닝한다. 이어서, 이들 벡터내에 존재하는 진핵 프로모터를 결실시켜 상기 벡터를 변형시킨다. 이어서, 적절한 벡터내로 삽입된 치료 유전자의 관절내 주사를 수행하여 예방 효능 뿐만 아니라 치료 효능을 평가할 수 있다.
실시예 3
TNF-α 비-생산자 체세포 변이체의 선별
세포(THP-1, Jurkat)을 TNFp-AIG 키메라 유전자로 시험관내에서 안정하게 형질감염시킨다. TNFp-AIG 유전자를 발현하는 세포에서 아포토시스를 유도하는 자극을 몇 주기 수행한 후, 생존 세포를 수거한다. 이들 세포의 cDNA 라이브러리를 작제하여 작용성 클로닝에 사용한다[참조: Legerski R and Peterson C., Nature, 1992, 359, 70-73; Jaattela M., et al., Oncogene, 1995, 10, 2297-2305].
실시예 4
우성 네가티브(DN) 유전자의 확인 및 특성화
TNFp-AIG로 안정하게 형질감염시킨 THP-1 및 Jurkat 세포를 몇 주기 반복하여 자극시켜 TNFp-AIG의 발현을 활성화시킨다. 네가티브 조절 유전자를 발현하지 않는 세포는 아포토시스되는 반면, 우성 네가티브 유전자를 발현하는 세포는 생존한다. 이들 생존 세포에 있어서, DN 유전자 생성물은 TNFα 프로모터와 자동적으로 작용하고, 이에 의해 활성화를 억제하여 AIG를 전사함으로써 궁극적으로는 생존 표현형을 나타낸다. cDNA 라이브러리는 이들 세포의 폴리아데닐화된 mRNA를 사용하여 작제한다. 아포토시스로부터 TNFp-AIG-형질감염된 THP-1 또는 Jurkat 세포를 보호하는 DN 유전자는 다른 유전자에 대해 기술된 바와 같이 작용성 클로닝에 의해 확인된다[참조: Legerski R. and Peterson C., Nature, 1992, 359, 70-73; Jaattela M., et al., Oncogene, 1995, 10, 2297-2305].
상기 본 발명의 상세한 설명은 본 발명의 실시 방법을 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 교시하기 위한 것이며, 본 발명의 상세한 설명을 읽음으로써 당업자에게 명백해질 수 있는 이의 명백한 변형 및 변화 모두를 설명하고자 하는 것은 아니다. 그러나, 이러한 모든 명백한 변형 및 변화는 본 발명의 범위내에 포함되는 것으로 간주되며, 이는 하기 청구의 범위에 의해 정의된다. 청구의 범위는, 본 명세서가 달리 구체적으로 명시하지 않는한, 의도된 목적에 부합하는데 효과적인 어떠한 순서의 청구된 성분 및 단계를 포함시키고자 한다.
본원에 인용된 문헌은 특히 문헌 전체가 참조로서 인용된다.
〈110〉 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc.
〈120〉 Self-regulated apoptosis of inflammatory cells by gene therapy
〈130〉 519980671408
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ggggaagcaa aggagaagct gagaagatga aggaaaagtc agggtctgga ggggcggggg 60
tcagggagct cctgggagat atggccacat gtagcggctc tgaggaatgg gttacaggag 120
acctctgggg agatgtgacc acagcaatgg gtaggagaat gtccagggct atggaagtcg 180
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agccaagact gaaaccagca ttatgagtct ccgggtcaga atgaaagaag aaggcctgcc 420
ccagtggtct gtgaattccc gggggtgatt tcactccccg ggctgtccca ggcttgtccc 480
tgctaccccc acccagcctt tcctgaggcc tcaagctgcc accaagcccc cagctccttc 540
tccccgcaga cccaaacaca ggcctcagga ctcaacacag cttttccctc caaccccgtt 600
ttctctccct caaggactca gctttctgaa gcccctccca gttctagttc tatctttttc 660
ctgcatcctg tctggaagtt agaaggaaac agaccacaga cctggtcccc aaaagaaatg 720
gaggcaatag gttttgaggg gcatggggac ggggttcagc ctccagggtc ctacacacaa 780
atcagtcagt ggcccagaag acccccctcg gaatcggagc agggaggatg gggagtgtga 840
ggggtatcct tgatgcttgt gtgtccccaa ctttccaaat ncccgccccc gcgatggaga 900
agaaaccgag acagaaggtg cagggcccac taccgcttcc tccagatgag cttatgggtt 960
tctccaccaa ggaagttttc cgctggttga atgattcttt ccccgccctc ctctcgcccc 1020
agggacatat aaaggcagtt gttggcacac ccagccagca gacgctccct cagcaaggac 1080
agcagaggac cagctaagag ggagagaagc aactgcagac cccccctgaa aacaaccctc 1140
agacgccaca tcccctgaca agctgccagg caggttct 1178
〈210〉 2
〈211〉 1096
〈212〉 DNA
〈213〉 Unknown
〈220〉
〈223〉 single, linear, NAME/KEY: human TNFa promoter gene;
PUBLICATION INFORMATION: Takashiba, S., et al., Gene, 131, p307-308
〈400〉 2
gaggccgcca gactgctgca ggggaagcaa aggagaagct gagaagatga aggaaaagtc 60
agggtctgga ggggcggggg tcagggagct cctgggagat atggccacat gtagcggctc 120
tgaggaatgg gttacaggag acctctgggg agatgtgacc acagcaatgg gtaggagaat 180
gtccagggct atggaagtcg agtatgggga ccccccctta acgaagacag ggccatgtag 240
agggccccag ggagtgaaag agcctccagg acctccaggt atggaataca ggggacgttt 300
aagaagatat ggccacacac tggggccctg agaagtgaga gcttcatgaa aaaaatcagg 360
gaccccagag ttccttggaa gccaagactg aaaccagcat tatgagtctc cgggtcagaa 420
tgaaagaaga aggcctgccc cagtggggtc tgtgaattcc cgggggtgat ttcactcccc 480
ggggctgtcc caggcttgtc cctgctaccc ccacccagcc tttcctgagg cctcaagcct 540
gccaccaagc ccccagctcc ttctccccgc agggacccaa acacaggcct caggactcaa 600
cacagctttt ccctccaacc ccgttttctc tccctcaagg actcagcttt ctgaagcccc 660
tcccagttct agttctatct ttttcctgca tcctgtctgg aagttagaag gaaacagacc 720
acagacctgg tccccaaaag aaatggaggc aataggtttt gaggggcatg gggacggggt 780
tcagcctcca gggtcctaca cacaaatcag tcagtggccc agaagacccc cctcggaatc 840
ggagcaggga ggatggggag tgtgaggggt atccttgatg cttgtgtgtc cccaactttc 900
caaatccccg cccccgcgat ggagaagaaa ccgagacaga aggtgcaggg cccactaccg 960
cttcctccag atgagctcat gggtttctcc accaaggaag ttttccgctg gttgaatgat 1020
tctttccccg ccctcctctc gccccaggga catataaagg cagttgttgg cacacccagc 1080
cagcagacgc tccctc 1096
〈210〉 3
〈211〉 139
〈212〉 DNA
〈213〉 Unknown
〈220〉
〈223〉 single, linear, NAME/KEY: native minimal TNFa promo
ter
〈400〉 3
ccgcttcctc cagatgagct catgggtttc tccaccaagg aagttttccg ctggttgaat 60
gattctttcc ccgccctcct ctcgccccag ggacatataa aggcagttgt atggcacacc 120
cgccagcaga cgctccctc 139
〈210〉 4
〈211〉 904
〈212〉 DNA
〈213〉 Unknown
〈220〉
〈223〉 single, linear; NAME/KEY: chimeric gene TNFp120 AIG
.1; OTHER INFORMATION: residues 1 to 139 comprise the
promoter sequence; residues 140 to 151, the linker sequence, a
nd the remaining residues comprise the AIG.1 sequence
〈400〉 4
ccgcttcctc cagatgagct catgggtttc tccaccaagg aagttttccg ctggttgaat 60
gattctttcc ccgccctcct ctcgccccag ggacatataa aggcagttgt tggcacaccc 120
agccagcaga cgctccctca gcagatccac catgtctgga atatccctgg acaacagtta 180
taaaatggat tatcctgaga tgggtttatg tataataatt aataataaga attttcataa 240
aagcactgga atgacatctc ggtctggtac agatgtcgat gcagcaaacc tcagggaaac 300
attcagaaac ttgaaatatg aagtcaggaa taaaaatgat cttacacgtg aagaaattgt 360
ggaattgatg cgtgatgttt ctaaagaaga tcacagcaaa aggagcagtt ttgtttgtgt 420
gcttctgagc catggtgaag aaggaataat ttttggaaca aatggacctg ttgacctgaa 480
aaaaataaca aactttttca gaggggatcg ttgtagaagt ctaactggaa aacccaaact 540
tttcattatt caggcctgcc gtggtacaga actggactgt ggcattgaga cagacagtgg 600
tgttgatgat gacatggcgt gtcataaaat accagtggag gccgacttct tgtatgcata 660
ctccacagca cctggttatt attcttggcg aaattcaaag gatggctcct ggttcatcca 720
gtcgctttgt gccatgctga aacagtatgc cgacaagctt gaatttatgc acattcttac 780
ccgggctaac cgaaaggtgg caacagaatt tgagtccttt tcctttgacg ctacttttca 840
tgcaaagaaa cagattccat gtattgtttc catgctcaca aaagaactct atttttatca 900
ctaa 904
〈210〉 5
〈211〉 1490
〈212〉 DNA
〈213〉 Unknown
〈220〉
〈223〉 single, linear; NAME/KEY: chimeric gene TNFp706 AIG
.1; OTHER INFORMATION: residues 1 to 724 comprise the promoter se
quence; residues 725 to 736, the linker sequence, and the remaini
ng residues comprise the AIG.1 sequence
〈400〉 5
tccttggaag ccaagactga aaccagcatt atgagtctcc gggtcagaat gaaagaagaa 60
ggcctgcccc agtggggtct gtgaattccc gggggtgatt tcactccccg gggctgtccc 120
aggcttgtcc ctgctacccc cacccagcct ttcctgaggc tcaagcctgc caccaagccc 180
ccagctcctt ctccccgcag ggacccaaac acaggcctca ggactcaaca cagcttttcc 240
ctccaacccc gttttctctc cctcaaggac tcagctttct gaagcccctc ccagttctag 300
ttctatcttt ttcctgcatc ctgtctggaa gttagaagga aacagaccac agacctggtc 360
cccaaaagaa atggaggcaa taggttttga ggggcatggg gacggggttc agcctccagg 420
gtcctacaca caaatcagtc agtggcccag aagacccccc tcggaatcgg agcagggagg 480
atggggagtg tgaggggtat ccttgatgct tgtgtgtccc caactttcca aatccccgcc 540
cccgcgatgg agaagaaacc gagacagaag gtgcagggcc cactaccgct tcctccagat 600
gagctcatgg gtttctccac caaggaagtt ttccgctggt tgaatgattc tttccccgcc 660
ctcctctcgc cccagggaca tataaaggca gttgttggca cacccagcca gcagacgctc 720
cctcagcaga tccaccatgt ctggaatatc cctggacaac agttataaaa tggattatcc 780
tgagatgggt ttatgtataa taattaataa taagaatttt cataaaagca ctggaatgac 840
atctcggtct ggtacagatg tcgatgcagc aaacctcagg gaaacattca gaaacttgaa 900
atatgaagtc aggaataaaa atgatcttac acgtgaagaa attgtggaat tgatgcgtga 960
tgtttctaaa gaagatcaca gcaaaaggag cagttttgtt tgtgtgcttc tgagccatgg 1020
tgaagaagga ataatttttg gaacaaatgg acctgttgac ctgaaaaaaa taacaaactt 1080
tttcagaggg gatcgttgta gaagtctaac tggaaaaccc aaacttttca ttattcaggc 1140
ctgccgtggt acagaactgg actgtggcat tgagacagac agtggtgttg atgatgacat 1200
ggcgtgtcat aaaataccag tggaggccga cttcttgtat gcatactcca cagcacctgg 1260
ttattattct tggcgaaatt caaaggatgg ctcctggttc atccagtcgc tttgtgccat 1320
tgctgaaaca gtatgccgac aagcttgaat ttatgcacat tcttacccgg gctaaccgaa 1380
aggtggcaac agaatttgag tccttttcct ttgacgctac ttttcatgca aagaaacaga 1440
ttccatgtat tgtttccatg ctcacaaaag aactctattt ttatcactaa 1490
〈210〉 6
〈211〉 1789
〈212〉 DNA
〈213〉 Unknown
〈220〉
〈223〉 single, linear; NAME/KEY: chimeric gene TNFp1005 AI
G.1; OTHER INFORMATION: residues 1 to 1023 comprise the
promoter sequence; residues 1024 to 1036, the linker sequenc
e, and the remaining residues comprise the AIG.1 sequence
〈400〉 6
ggcgggggtc agggagctcc tgggagatat ggccacatgt agcggctctg aggaatgggt 60
tacaggagac ctctggggag atgtgaccac agcaatgggt aggagaatgt ccagggctat 120
ggaagtcgag tatggggacc cccccttaac gaagacaggg ccatgtagag ggccccaggg 180
agtgaaagag cctccaggac ctccaggtat ggaatacagg ggacgtttaa gaagatatgg 240
ccacacactg gggccctgag aagtgagagc ttcatgaaaa aaatcaggga ccccagagtt 300
ccttggaagc caagactgaa accagcatta tgagtctccg ggtcagaatg aaagaagaag 360
gcctgcccca gtggggtctg tgaattcccg ggggtgattt cactccccgg ggctgtccca 420
ggcttgtccc tgctaccccc acccagcctt tcctgaggcc tcaagcctgc caccaagccc 480
ccagctcctt ctccccgcag ggacccaaac acaggcctca ggactcaaca cagcttttcc 540
ctccaacccc gttttctctc cctcaaggac tcagctttct gaagcccctc ccagttctag 600
ttctatcttt ttcctgcatc ctgtctggaa gttagaagga aacagaccac agacctggtc 660
cccaaaagaa atggaggcaa taggttttga ggggcatggg gacggggttc agcctccagg 720
gtcctacaca caaatcagtc agtggcccag aagacccccc tcggaatcgg agcagggagg 780
atggggagtg tgaggggtat ccttgatgct tgtgtgtccc caactttcca aatccccgcc 840
cccgcgatgg agaagaaacc gagacagaag gtgcagggcc cactaccgct tcctccagat 900
gagctcatgg gtttctccac caaggaagtt ttccgctggt tgaatgattc tttccccgcc 960
ctcctctcgc cccagggaca tataaaggca gttgttggca cacccagcca gcagacgctc 1020
cctcagcaga tccaccatgt ctggaatatc cctggacaac agttataaaa tggattatcc 1080
tgagatgggt ttatgtataa taattaataa taagaatttt cataaaagca ctggaatgac 1140
atctcggtct ggtacagatg tcgatgcagc aaacctcagg gaaacattca gaaacttgaa 1200
atatgaagtc aggaataaaa atgatcttac acgtgaagaa attgtggaat tgatgcgtga 1260
tgtttctaaa gaagatcaca gcaaaaggag cagttttgtt tgtgtgcttc tgagccatgg 1320
tgaagaagga ataatttttg gaacaaatgg acctgttgac ctgaaaaaaa taacaaactt 1380
tttcagaggg gatcgttgta gaagtctaac tggaaaaccc aaacttttca ttattcaggc 1440
ctgccgtggt acagaactgg actgtggcat tgagacagac agtggtgttg atgatgacat 1500
ggcgtgtcat aaaataccag tggaggccga cttcttgtat gcatactcca cagcacctgg 1560
ttattattct tggcgaaatt caaaggatgg ctcctggttc atccagtcgc tttgtgccat 1620
gctgaaacag tatgccgaca agcttgaatt tatgcacatt cttacccggg ctaaccgaaa 1680
ggtggcaaca gaatttgagt ccttttcctt tgacgctact tttcatgcaa agaaacagat 1740
tccatgtatt gtttccatgc tcacaaaaga actctatttt tatcactaa 1789
〈210〉 7
〈211〉 1008
〈212〉 DNA
〈213〉 Unknown
〈220〉
〈223〉 single, linear; NAME/KEY: chimeric gene TNFp120 AIG
.2; OTHER INFORMATION: residues 1 to 138 comprise the promoter se
quence; residues 139 to 150, the linker sequence, and the remaini
ng residues comprise the AIG.2 sequence
〈400〉 7
ccgcttcctc cagatgagct catgggtttc tccaccaagg aagttttccg ctggttgaat 60
gattctttcc ccgccctcct ctcgccccag ggacatataa aggcagttgt tggcacaccc 120
agccagcaga gctccctcag cagatccacc atggctggac cacctgagtc agcagaatct 180
acagatgccc tcaagctttg tcctcatgaa gaattcctga gactatgtaa agaaagagct 240
gaagagatct acccaataaa ggagagaaac aaccgcacac gcctggctct catcatatgc 300
aatacagagt ttgaccatct gcctccgagg aatggagctg actttgacat cacagggatg 360
aaggagctac ttgagggtct ggactatagt gtagatgtag aagagaatct gacagccagg 420
gatatggagt cagcgctgag ggcatttgct accagaccag agcacaagtc ctctgacagc 480
acattcttgg tactcatgtc tcatggcatc ctggagggaa tctgcggaac tgtgcatgat 540
gagaaaaaac cagatgtgct gctttatgac accatcttcc agatattcaa caaccgcaac 600
tgcctcagtc tgaaggacaa acccaaggtc atcattgtcc aggcctgcag aggtgcaaac 660
cgtggggaac tgtgggtcag agactctcca gcatccttgg aagtggcctc ttcacagtca 720
tctgagaacc tggaggaaga tgctgtttac aagacccacg tggagaagga cttcattgct 780
ttctgctctt caacgccaca caacgtgtcc tggagagaca gcacaatggg ctctatcttc 840
atcacacaac tcatcacatg cttccagaaa tattcttggt gctgccacct agaggaagta 900
tttcggaagg tacagcaatc atttgaaact ccaagggcca aagctcaaat gcccaccata 960
gaacgactgt ccatgacaag atatttctac ctctttcctg gcaattga 1008
〈210〉 8
〈211〉 1587
〈212〉 DNA
〈213〉 Unknown
〈220〉
〈223〉 single, linear; NAME/KEY: chimeric gene TNFp706 AIG
.2; OTHER INFORMATION: residues 1 to 724 comprise the promoter se
quence; residues 725 to 736, the linker sequence, and the remaini
ng residues comprise the AIG.2 sequence
〈400〉 8
tccttggaag ccaagactga aaccagcatt atgagtctcc gggtcagaat gaaagaagaa 60
ggcctgcccc agtggggtct gtgaattccc gggggtgatt tcactccccg gggctgtccc 120
aggcttgtcc ctgctacccc cacccagcct ttcctgaggc ctcaagcctg ccaccaagcc 180
cccagctcct tctccccgca gggacccaaa cacaggcctc aggactcaac acagcttttc 240
cctccaaccc cgttttctct ccctcaagga ctcagctttc tgaagcccct cccagttcta 300
gttctatctt tttcctgcat cctgtctgga agttagaagg aaacagacca cagacctggt 360
ccccaaaaga aatggaggca ataggttttg aggggcatgg ggacggggtt cagcctccag 420
ggtcctacac acaaatcagt cagtggccca aagacccccc tcggaatcgg agcagggagg 480
atggggagtg tgaggggtat ccttgatgct tgtgtgtccc caactttcca aatccccgcc 540
cccgcgatgg agaagaaacc gagacagaag gtgcagggcc cactaccgct tcctccagat 600
gagctcatgg gtttctccac caaggaagtt ttccgctggt tgaatgattc tttccccgcc 660
ctcctctcgc cccagggaca tataaaggca gttgttggca cacccagcca gcagacgctc 720
cctcagcaga tccaccatgg ctggaccacc tgagtcagca gaatctacag atgccctcaa 780
gctttgtcct catgaagaat tcctgagact atgtaaagaa agagctgaag agatctaccc 840
aataaaggag agaaacaacc gcacacgcct ggctctcatc atatgcaata cagagtttga 900
ccatctgcct ccgaggaatg gagctgactt gacatcacag gatgaaggag tacttgaggg 960
tctggactat gtgtagatgt gaagagaatc gacagccagg atatggagtc agcgctgagg 1020
gcatttgcta ccagaccaga gcacaagtcc tctgacagca cattcttggt actcatgtct 1080
catggcatcc tggagggaat ctgcggaact gtgcatgatg agaaaaaacc agatgtgctg 1140
ctttatgaca ccatcttcca gatattcaac aaccgcaact gcctcagtct gaaggacaaa 1200
cccaaggtca tcattgtcca ggcctgcaga ggtgcaaacc gtggggaact gtgggtcaga 1260
gactctccag catccttgga agtggcctct tcacagtcat ctgagaacct ggaggaagat 1320
gctgtttaca agacccacgt ggagaaggac ttcattgctt tctgctcttc aacgccacac 1380
aacgtgtcct ggagagacag cacaatgggc tctatcttca tcacacaact catcacatgc 1440
ttccagaaat attcttggtg ctgccaccta gaggaagtat ttcggaaggt acagcaatca 1500
tttgaaactc caagggccaa agctcaaatg cccaccatag aacgactgtc catgacaaga 1560
tatttctacc tctttcctgg caattga 1587
〈210〉 9
〈211〉 1894
〈212〉 DNA
〈213〉 Unknown
〈220〉
〈223〉 single, linear; NAME/KEY: chimeric gene TNFp1005 AI
G.2; OTHER INFORMATION: residues 1 to 1024 comprise the promoter
sequence; residues 1025 to 1036, the linker sequence, and the rem
aining residues comprise the AIG.2 sequence
〈400〉 9
ggcgggggtc agggagctcc tgggagatat ggccacatgt agcggctctg aggaatgggt 60
tacaggagac ctctggggag atgtgaccac agcaatgggt aggagaatgt ccagggctat 120
ggaagtcgag tatggggacc cccccttaac gaagacaggg ccatgtagag ggccccaggg 180
agtgaaagag cctccaggac ctccaggtat ggaatacagg ggacgtttaa gaagatatgg 240
ccacacactg gggccctgag aagtgagagc ttcatgaaaa aaatcaggga ccccagagtt 300
ccttggaagc caagactgaa accagcatta tgagtctccg ggtcagaatg aaagaagaag 360
gcctgcccca gtggggtctg tgaattcccg ggggtgattt cactccccgg ggctgtccca 420
ggcttgtccc tgctaccccc acccagcctt tcctgaggcc tcaagcctgc caccaagccc 480
ccagctcctt ctccccgcag ggacccaaac acaggcctca ggactcaaca cagcttttcc 540
ctccaacccc gttttctctc cctcaaggac tcagctttct gaagcccctc ccagttctag 600
ttctatcttt ttcctgcatc ctgtctggaa gttagaagga aacagaccac agacctggtc 660
cccaaaagaa atggaggcaa taggttttga ggggcatggg gacggggttc agcctccagg 720
gtcctacaca caaatcagtc agtggcccag aagacccccc tcggaatcgg agcagggagg 780
atggggagtg tgaggggtat ccttgatgct tgtgtgtccc caactttcca aatccccgcc 840
cccgcgatgg agaagaaacc gagacagaag gtgcagggcc cactaccgct tcctccagat 900
gagctcatgg gtttctccac caaggaagtt ttccgctggt tgaatgattc tttccccgcc 960
ctcctctcgc cccagggaca tataaaggca gttgttggca cacccagcca gcagacgctc 1020
cctcagcaga tccaccatgg ctggaccacc tgagtcagca gaatctacag atgccctcaa 1080
gctttgtcct catgaagaat tcctgagact atgtaaagaa agagctgaag agatctaccc 1140
aataaaggag agaaacaacc gcacacgcct ggctctcatc atatgcaata cagagtttga 1200
ccatctgcct ccgaggaatg gagctgactt tgacatcaca gggatgaagg agctacttga 1260
gggtctggac tatagtgtag atgtagaaga gaatctgaca gccagggata tggagtcagc 1320
gctgagggca tttgctacca gaccagagca caagtcctct gacagcacat tcttggtact 1380
catgtctcat ggcatcctgg agggaatctg cggaactgtg catgatgaga aaaaaccaga 1440
tgtgctgctt tatgacacca tcttccagat attcaacaac cgcaactgcc tcagtctgaa 1500
ggacaaaccc aaggtcatca ttgtccaggc ctgcagaggt gcaaaccgtg gggaactgtg 1560
ggtcagagac tctccagcat ccttggaagt ggcctcttca cagtcatctg agaacctgga 1620
ggaagatgct gtttacaaga cccacgtgga gaaggacttc attgctttct gctcttcaac 1680
gccacacaac gtgtcctgga gagacagcac aatgggctct atcttcatca cacaactcat 1740
cacatgcttc cagaaatatt cttggtgctg ccacctagag gaagtatttc ggaaggtaca 1800
gcaatcattt gaaactccaa gggccaaagc tcaaatgccc accatagaac gactgtccat 1860
gacaagatat ttctacctct ttcctggcaa ttga 1894
〈210〉 10
〈211〉 123
〈212〉 DNA
〈213〉 Unknown
〈220〉
〈223〉 single, linear; NAME/KEY: TNFa promoter enhancer re
gion 1(ER1)
〈400〉 10
ggggcggggg tcagggagct cctgggagat atggccacat gtagcggctc tgaggaatgg 60
gttacaggag acctctgggg agatgtgacc acagcaatgg gtaggagaat gtccagggct 120
atg 123
〈210〉 11
〈211〉 190
〈212〉 DNA
〈213〉 Unknown
〈220〉
〈223〉 single, linear; NAME/KEY: TNFa promoter enhancer re
gion 2 (ER2)
〈400〉 11
tccttggaag ccaagactga aaccagcatt atgagtctcc gggtcagaat gaaagaagaa 60
ggcctgcccc agtggggtct gtgaattccc gggggtgatt tcactccccg gggctgtccc 120
aggcttgtcc ctgctacccc cacccagcct ttcctgaggc ctcaagcctg ccaccaagcc 180
cccagctcct 190
〈210〉 12
〈211〉 223
〈212〉 DNA
〈213〉 Unknown
〈220〉
〈223〉 single, linear; NAME/KEY: multiple conling sites; O
THER INFORMATION: genetically engineered multiple cloning sites g
enetically engineered upstream of the minimal TNFa promoter in th
e -120pGL3 construct
〈400〉 12
ggtaccgagc tcttacgcgt gctagccgcg gatatcttaa gacgtcctag gactagtcag 60
ctgctcgagc cgcttcctcc agatgagctc atgggtttct ccaccaagga agttttccgc 120
tggttgaatg attctttccc cgccctcctc tcgccccagg gacatataaa ggcagttgtt 180
ggcacaccca gccagcagac gctccctcag cagatctaag ctt 223
〈210〉 13
〈211〉 787
〈212〉 DNA
〈213〉 Unknown
〈220〉
〈223〉 single, linear; NAME/KEY: TNFa intranslated region
〈400〉 13
tctagaggag gacgaacatc caaccttccc aaacgcctcc cctgccccaa tccctttatt 60
accccctcct tcagacaccc tcaacctctt ctggctcaaa aagagaattg ggggcttagg 120
gtcggaaccc aagcttagaa ctttaagcaa caagaccacc acttcgaaac ctgggattca 180
ggaatgtgtg gcctgcacag tgaagtgctg gcaaccacta agaattcaaa ctggggcctc 240
cagaactcac tggggcctac agctttgatc cctgacatct ggaatctgga gaccagggag 300
cctttggttc tggccagaat gctgcaggac ttgagaagac ctcacctaga aattgacaca 360
agtggacctt aggccttcct ctctccagat gtttccagac ttccttgaga cacggagccc 420
agccctcccc atggagccag ctccctctat ttatgtttgc acttgtgatt atttattatt 480
tatttattat ttatttattt acagatgaat gtatttattt gggagaccgg ggtatcctgg 540
gggacccaat gtaggagctg ccttggctca gacatgtttt ccgtgaaaac ggagctgaac 600
aataggctgt tcccatgtag ccccctggcc tctgtgcctt cttttgatta tgttttttaa 660
aatatttatc tgattaagtt gtctaaacaa tgctgatttg gtgaccaact gtcactcatt 720
gctgagcctc tgctccccag gggagttgtg tctgtaatcg ccctactatt cagtggcgag 780
atctaga 787

Claims (35)

  1. 최소 TNFα 프로모터의 작용성 카피에 부착되어 있고 TNFα 프로모터에 의해 발현이 유도되는 아포토시스(apoptosis)-유도 유전자의 하나 이상의 카피에 추가로 부착되어 있는 하나 이상의 TNFα 프로모터 인핸서를 포함하는 키메라 유전자.
  2. 제1항에 있어서, 프로모터에 대한 인핸서의 부착 및 아포토시스-유도 유전자에 대한 프로모터의 부착이 직접적인 부착, 거리를 둔 부착, 인접한 부착 및 이의 조합 방식으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 유전자.
  3. 제1항에 있어서, TNFα 프로모터 인핸서의 2개 이상의 카피를 포함하는 유전자.
  4. 제1항에 있어서, TNFα 프로모터 인핸서가 서열 10 또는 서열 11, 또는 이의 작용성 단편 또는 변이체인 유전자.
  5. 제1항에 있어서, TNFα 프로모터가 서열 1, 서열 2, 서열 3 및 이의 작용성 단편 또는 변이체로 이루어진 그룹중에서 선택되는 유전자.
  6. 제1항에 있어서, 아포토시스-유도 유전자가 캐스패스-1, 캐스패스-2, 캐스패스-3, 캐스패스-4, 캐스패스-5, 캐스패스-6, 캐스패스-7, 캐스패스-8, 캐스패스-9, 캐스패스-10, 그랜자임 A, 그랜자임 B, Fas 리간드, 및 이의 작용성 단편, 변이체 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹중에서 선택되는 유전자.
  7. 제6항에 있어서, 아포토시스-유도 유전자가 캐스패스 3, 캐스패스 4, 캐스패스 5, 그랜자임 B, 및 이의 작용성 단편, 변이체 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹중에서 선택되는 유전자.
  8. 제1항에 있어서, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 및 이의 작용성 단편 또는 변이체로 이루어진 그룹중에서 선택되는 유전자.
  9. 제1항에 있어서, TNFα 유전자의 3'UTR이 아포토시스-유도 유전자의 하부에 연결되는, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 및 이의 작용성 단편 또는 변이체로 이루어진 그룹중에서 선택되는 유전자.
  10. 제1항에 따른 유전자를 포함하는 약제학적 조성물.
  11. 제9항에 따른 유전자를 포함하는 약제학적 조성물.
  12. 제1항에 따른 키메라 유전자를 세포내로 도입시켜 염증 세포 또는 염증 부위에 있는 세포에서 아포토시스를 유도하는 단계를 포함하는, 환자의 염증 질환을 치료하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 아포토시스의 유도가 환자에서 염증 반응을 유도하지 않는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 염증 세포가 TNFα 생산 세포인 방법.
  15. 제12항에 있어서, 염증 질환이 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 길랑-바르 증후군(Guillain-Barre syndrome), 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염, 건선, 숙주 이식 거부 질환, 홍반성 낭창, 인슐린-의존성 진성당뇨병, 관절염성 건선, 유육종증, 과민성 폐염, 강직성 척추염, 라이터 증후군(Reiter's syndrome) 및 전신성 경화증으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 염증 질환이 류마티스성 관절염인 방법.
  17. 최소 TNFα 프로모터의 하나 이상의 카피; 및 캐스패스 3, 캐스패스 4, 캐스패스 5, 그랜자임 B 및 이의 작용성 단편, 변이체 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹중에서 선택되고 TNF 프로모터에 의해 발현이 유도되는 아포토시스-유도 유전자의 하나 이상의 카피에 부착되어 있는 TNFα 프로모터 인핸서의 2개 내지 10개의 카셋트를 포함하는 키메라 유전자.
  18. 제17항에 따른 유전자를 포함하는 약제학적 조성물.
  19. 제17항에 따른 키메라 유전자를 세포내로 도입하여 TNFα-생산 염증 세포에서 아포토시스를 유도하는 방법.
  20. 환자에게 염증 반응을 유도하지 않으면서 제17항에 따른 키메라 유전자를 세포내로 도입시켜 염증 세포 또는 염증 부위에 있는 세포에서 아포토시스를 유도함을 포함하여, 환자의 염증 질환을 치료하는 방법.
  21. (a) TNFα 프로모터의 결실 작제물을 포함하는 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 TNFα 프로모터를 증폭시키는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 수득한 PCR-증폭된 유전자를 리포터 유전자의 상부에 클로닝시키는 단계;
    (c) 단계 (b)에서 수득한 작제물을 하나 이상의 TNFα-생산 세포주에서 이들의 구성적 및 유도성 발현에 대해 시험하는 단계;
    (d) 세포주에서 리포터의 유도성 발현에 관여하는 TNFα 프로모터를 선별하는 단계; 및
    (e) 리포터의 발현을 증강시키는 TNFα 프로모터 영역을 PCR-증폭시켜 인핸서를 수득하고 인핸서의 하나 이상의 카피를 프로모터의 상부에 연결시키는 단계, 또는
    (f) 리포터 유전자를 아포토시스-유도 유전자 결실 작제물로 대체하여 프로도메인-결실된 아포토시스-유도 유전자의 하나 이상의 카피를 TNFα 프로모터의 하부에 삽입함으로써 키메라 유전자를 수득하는 단계, 또는
    (g) TNFα-3'UTR을 PCR-증폭시키고 리포터 유전자의 하부에 연결시키는 단계, 또는 이들 공정의 조합 단계를 포함하여, 최소 TNFα 프로모터의 작용성 카피에 부착되어 있고 TNFα 프로모터에 의해 발현이 유도되는 아포토시스-유도 유전자의 하나 이상의 카피에 추가로 부착되어 있는 하나 이상의 TNFα 프로모터 인핸서를 포함하는 키메라 유전자를 작제하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 인핸서의 2개 이상의 카피가 프로모터의 상부에 삽입되는 방법.
  23. 제21항에 있어서, 리포터 유전자가 루시퍼라제인 방법.
  24. 제21항에 있어서, 인핸서가 서열 10 또는 서열 11을 포함하는 방법.
  25. 제21항에 있어서, 프로도메인-결실된 아포토시스-유도 유전자가 캐스패스 3, 캐스패스 4, 캐스패스 5, 그랜자임 B, 및 이의 작용성 단편 및 변이체로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
  26. 내용 없음
  27. 제21항에 있어서, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 및 이의 작용성 단편 및 변이체로 이루어진 그룹중에서 선택된 유전자를 생산하는 방법.
  28. 제21항에 있어서, 작제물을 시험하기 위한 세포주가 T 임파아구, 골수성단구, 단구, 섬유아세포 및 배양된 사람 활막세포로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
  29. (a) 최소 프로모터의 작용성 카피에 부착되어 있고(단, 프로모터는 염증 세포 또는 염증 부위에 있는 세포에서 활성화된 유전자 또는 유전자 배합물이다)
    (b) 사이토킨, 인터류킨 및 이의 수용체, 세포 부착 분자 및 이의 리간드, 케모킨 및 이의 수용체, 프로-염증 효소, 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 프로모터에 의해 발현이 유도되는 아포토시스-유도 유전자의 하나 이상의 카피에 추가로 부착되어 있는 하나 이상의 프로모터 인핸서를 포함하는 키메라 유전자.
  30. 내용 없음
  31. 제29항에 있어서, 프로모터가 TNFβ, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, GM-CSF, 인터페론γ, 이의 작용성 단편 및 변이체, 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹중에서 선택되는 유전자.
  32. 제29항에 있어서, 프로모터가 셀렉틴, 인테그린, ICAM-1, V-CAM, 이의 작용성 단편 및 변이체, 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹중에서 선택되는 유전자.
  33. 제29항에 있어서, 프로모터가 MIP-1α, MIP-1β, MCP1-4, RANTES, Mig, NAP2, IP10, Gro α-γ, 이의 작용성 단편 및 변이체, 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹중에서 선택되는 유전자.
  34. 제29항에 있어서, 프로모터가 COX-2, iNOS, 포스포리파제, 프로테아제, 이의 작용성 단편 및 변이체, 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹중에서 선택되는 유전자.
  35. 제29항에 있어서, 프로모터에 대한 인핸서의 부착 및 아포토시스-유도 유전자에 대한 프로모터의 부착이 직접적인 부착, 거리를 둔 부착, 인접한 부착 및 이의 조합 방식으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 유전자.
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