CZ20003111A3 - Samoregulovatelná apoptóza zánětlivých buněk genovou terapií - Google Patents

Abstract

Popisují se chimerové nukleové kyseliny a terapeutická indukce apoptózy v aktivovaných zánětlivých buňkách nebo v buňkách v místě zánětu tím, že se do těchto buněk zavede chimerová nukleová kyselina. Chimerová nukleová kyselina má alespoň jeden zesilovač promotoru TNFa připojený k fttnkční kopii promotoru TNFa a dále připojený alespoň k jedné kopii genu indukujícího apoptózu, který je dále připojen k 3'UTR. Gen vyvolávající apoptózu je granzym B. Řešení se dále vztahuje k metodám přípravy a použití chimerových nukleových kyselin vhodných pro samoregulaci apoptózy a farmaceutických kompozic, které obsahují uvedené chimerové kyseliny za účelem léčby zánětlivého onemocnění.

Description

Samoregulovatelná apoptóza zánětlivých buněk genovou terapií

Oblast techniky

Vynález se týká oboru molekulární biologie a imunologie. Vynález popisuje vyvolání apoptózy v zánětlivých buňkách tak, že se do těchto buněk zavede gen, který v uvedených buňkách vyvolává apoptózu (programované odumíráni buněk nebo odumírání buněk které není nekrotického původu).

Dosavadní stav techniky

V mnoha případech zánětů se produkují ve velkém množství cytokiny, jako jsou IL-Ιβ, IL-10, GM-CSF a TNFa, jako výsledek masové agregace a akumulace zánětlivých buněk (Brennan F.M. et al., British Medical Bulletin 1995, 51/2, 368-384). Pozitivní a nebo negativní regulace cytokinů v zánětlivé tkáni může být přímo nebo nepřímo odpovědná za zhoršení chronického zánětlivého onemocnění. Například nej významnějším patologickým jevem v případě revmatoidní artritidy (RA) je lokální zánětlivé místo (to znamená synoviální klouby). Proto je pravděpodobné, že cytokiny produkované synoviálními klouby pacientů trpícími RA mají důležitou úlohu v procesu onemocnění. Věří se, že cytokiny IL-Ιβ a TNFa jsou zodpovědné za poškození chrupavky a kosti, které je pro toto onemocnění charakteristické (popisuje se v publikaci Dayer J. M. et. al., J. Exp. Med. 1985, 162, 1208-1215, Gowen M. et al., Nátuře 1983, 306, 378.380). Ukázalo se, že přítomnost velkého množství IL-Ιβ a TNFa v synoviálních kloubech urychluje u hlodavců vývoj artritidy vyvolané kolagenem (popisuje se v publikaci Brennan F. M. et al., Ciin. Expt. Immunnol., 1994, 97/1, 1-3).

• · • · • · al., Cell, přirozeného

1994, 76, procesu

Apoptóza je základní fyziologický proces při embryonálním vývoji a při udržování homeostázy tkáně (popisuje se v publikaci Raff, M. C. Nátuře, 1992, 356, 397, Vaux, D. L. et

777). Neúplnost tohoto nekrotického se projeví řadou neoplastických, neurodegenerativních a autoimunitních onemocní (popisuje se v publikaci Thompson, C.B., Science, 1995, 267, 1456).

Biochemické znaky zahrnující kaskádu signální transdukce jsou relativně komplexní a nejsou zcela jasné. Různé stimuli zahrnující aktivaci specifických receptorů, jako je vývojový konzervativní exekuční mechanizmus zpuštěný TNFRl nebo Fas, vyvolává odumírání buněk (popisuje se v publikaci Ahkenazi, A. a Dixit, V. Μ., Science, 1998, 181, 1305).

Granzym B je serinová proteáza, která se primárně nachází v cytoplazmatických granulích cytotoxických lymfocytů T a v přirozených buňkách K. Granzym B má důležitou úlohu při vyvolání apoptických změn v cílových buňkách pomocí odumírání zprostředkovaným cytotoxickými buňkami (popisuje se v publikaci Huesel J.W. et al., Cell, 76, 977-987, 1994, Shi,

L. et al., J. Exp. Med. 176, 1521- 1529, 1992) částečně katalýzou štěpení a aktivací .několika kaspáz (popisuje se v publikaci Salvesen, G. S. and Dixit, V. Μ. , Cell, 91, 443446, 1997) a dráhou, která není závislá na kaspázách (Andrade, F. et al., Immunity 8, 451-460, 1998;

jako polypeptid obsahující deaktivujícím dipeptidem (Gly-Glu) od aktivního polypeptidu granzymu B. Podobně jako kaspázy, granzym B rozeznává substráty pro štěpení specificky v kyselině aspartové.

Granzym B se produkuje vedoucí peptid oddělený

TNFa je cytokin, který hlavně syntetizují monocyty, makrofágy a lymfocyty jako odezvu na aktivaci. Klasické elementy řídící jejich expresi se nacházejí v blízké nebo ve vzdálené promotorové oblasti (popisuje se v publikaci Pauli, U. Critical Rev. Eukaryotic Gene Expression, 1994, 4, 323• ·

344) . Dále v textu se uvádí oblasti, které hrají důležitou úlohu při aktivitě promotoru TNFct:

a) ukázalo se, že elementy TNFcc-responsivní se nacházejí mezí páry baží -100 až -125. Oblast -108 až -101 bp obsahují palindrom TGAGCTCA, který je podobný sekvenci AP-1, která obsahuje PMA-responsivní elementy. Více kopií -125 až -85 bp potvrzují sedminásobnou až jedenáctinásobnou indukci exprese reportniho genu (popisuje se v publikaci Leitman, D. et al., J. Biol. Chem. 266, 9343,1991),

b) ukázalo se, že PMA-responzivní elementy jsou přítomny mezi -101 až -286 páry baží (popisuje se v publikaci Hensel, G et al., Lymphokine Res. 8, 347, 1989),

c) ukázalo se, že responzivní element vyvolávající protilátky proti CD3 (stejně jako protilátky indukované Ca-inoforem) leží mezi páry baží -118 až 80. Sekvence KappaB3 (GGGTTTCTCC) v této oblasti je velmi důležitá pro aktivaci promotoru TNFa pomocí Cainoforu citlivou na CsA. Ukazuje se, že tyto elementy optimálně fungují v kontextu se svým vlastním promotorem (Goldfield, et al., J. Exp. Med. 178, 1356, 1993),

d) v buňkách U937 se PMA-responzivní element nachází mezi páry baží -95 až -36 a cAMP-responzivní element (CRE) se nachází v poloze -107 až -99 párů baží. Tato oblast neodpovídá PMA (popisuje se v publikaci Economou, J. S., et al., J. Exp. Med. 170, 321, 1989).

e) všechny tři místa kappaB (kappaBl (-587 až -577), kappaB2 (-210 až -202) a kappaB3 (-98 až -87) ) váží protein indukovatelný viry, ačkoli delece těchto míst neovlivňuje indukovatelnost virem (Goldfield, A, et al., PNAS, 87, 9769, 1990). Deleční mutanti míst kappaB ukazují, že nejsou primárními cíly v případě • · : :: : · : :·:::· ·· ·· ...... .. ..

stimulace PMA lidského genu TNFa (Goldfield, A. et al., J. Exp. Med. 174, 73, 1991),.

f) v myším systému jsou konstrukce promotoru TNFa -1059, -695 a -655 bp silně . indukovatelné LPS. Tato indukovatelnost LPS se velmi omezila v konstrukci -451 a dále mezi -301 a 241 bp. Fragment promotoru TNFa nebyl v makrofágách exprimován a silně se exprimoval po stimulaci LPS. Největší pokles aktivace byl v poloze -659 až -655 bp, kde se v promotoru TNFa

nachází element kappaB	(Shakhov,	A. N.	et al. , J. Exp.
Med., 1990, 171, 35,	Drouet,	C. et	al. , lmmunol.,
1991., 147, 1694).
Elementy v 3nepřekládané	oblasti	(3'UTR)	genu TNFa jsou
dobře známy tím, že jsou	důležité	při post-transkripční
regulaci. V myším systému se provedla analýza	vlivu 3UTR, kde

ve spojení s homologním promotorem indukovatelnost LPS byla velmi silná. Za použití promotorového systému myšího TNFa se ukázalo, že 3UTR účinně inhibuje aktivitu CAT ve třech buněčných linií, které nejsou makrofágy. Jsou to HeLa, NIH3T3 a L929. V 3UTR se několikrát opakovala sekvence TTATTTAT a ukazuje se, že tato sekvence se podílí na regulaci (Han, J., et al., J. Immunology, 1991°, 146, 1843-1848, Crawford, F. K. et al., J. Biol. Chem., 1996, 271, 22383-22390).

Různé buňky, jako jsou aktivované makrofágy, aktivované T buňky, synoviocyty podobné makrofágům stejně jako synoviocyty podobné fibroblastům a transformované synoviocyty podobné makrofágům (také se nazývají panocyty) se nacházejí v zánětlivých kloubech. Invazivní struktura nazývaná, panus se odvodila z hyperplastické podstaty synoviocytů a panocytů. Panus může vzniknout rozsáhlou proliferací buněk a/nebo odbouráním apoptózy v těchto buňkách. Proliferační index v těchto buňkách je relativně nízký. Proto hyperplázie u synoviocytů je způsobena abnormalitami při apoptóze • · • · synoviálního spojení. V synoviu je frekvence buněk v konečném stádiu apoptózy nízká. V synoviálních fibroblastech RA se mohou vyskytovat abnormality p53 mutací, které mohou vést k rezistenci na apoptózu. Navíc v synoviální tkání vzniká velké množství pro-zánětlivých cytokinů, jako jsou TNFa a ILΙβ. Vznikají v různých typech buněk ve spojení chrupávka-panus, které zahrnuje buňky linie makrofágů, synoviocytů podobných makrofágům, aktivovaných T-buněk a pravděpodobně synoviocytů podobných fibroblastům (popisuje se v publikaci Chu C. Q. et al., Arthritis and Rheumatism, 1991, 34, 1125-1132, Deleuran

B. W., et al., Arthritis and Rheumatism, 1992, 35, 1170-1178). To pokračuje Infiltrací zánětlivých buněk a produkcí a produkcí více pro-zánětlivých cytokinů a faktorů, které jsou zodpovědné za proliferaci synoviálních buněk. Vedle 'popsaných zánětlivých účinků TNFa má důležitou TNFa úlohu při různých pro-zánětlivých jevech.

TNFa vyvolává aktivitu IL-Ιβ v monocytech. Vedle toho se ukázalo, že anti-TNFa neutralizující protilátky snižují celou produkci IL-Ιβ (Portillo et al., Immunol., 1989, 66, 170-175,

Brennan F. Μ. , et al., Britisch Medical Bulletin 1995, 51/2,

368-384) . Tak další výhodou při blokování účinku zánětlivého cytokinů TNFa byla redukce při produkci stejně destruktivního pro-zánětlivého mediátoru IL-Ιβ. Je dobře známo, že TNFa je aktivátor transkripce jiných genů spojených se zánětem. Například přítomnost TNFa stimuluje produkci jiných cytokinů (jako je GM-CSF) a buněčných povrchových receptorů, které zahrnují antigeny HLA třídy II a adhezivní molekuly (popisuje se v publikaci Alvaro-Garcia J. M., et al., J. Exp. Med., 1989, 146, 865-875), které podporují vznik aktivovaných buněk

T a neutrofilů, což vede k synoviálnímu zánětu a hyperplázii a také k masivnímu poškození chrupavek a kostí (popisuje se v publikaci Allen J. B., J. Exp. Med., 1990, 171, 231).

• ·

Běžná terapie proti zánětlivým poruchám je v typickém případě řízena proti příznakům zánětu. Taková terapie poskytuje pouze dočasnou úlevu, aniž dojde podstatnému oddálení progrese onemocnění. Naopak terapie, jejímž cílem je TNFa a jiné faktory vyvolané zánětlivým procesem jsou pravděpodobně více slibné. Například u zvířecího modelu artritidy vyvolané kolagenem protilátky proti TNFa a rozpustná chiméra receptoru TNFa-IgG účinně redukuje otok tlapek, postižení kloubů a poškození kostí (popisuje se v publikaci Williams R. 0. et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 1992, 89, 97849788) . Testy na člověku za použití protilátek proti TNFa a chimérových molekul receptor TNFa-IgG dávají dramatické výsledky (Elliot M. J. , et al., Arthritis and Rheumatism, 1993, 36, 1681- 1690, Elliott M. J., et al., Lancet, 343, 1105-1110). Ačkoli se zdá, že léčba těmito antagonisty TNFa je velmi dobře snášena, vede také k produkci protilátek proti rekombinantním proteinům. Tyto terapie pak mohou být vhodné pro dlouhodobou léčbu a nezpůsobují opravdové zastavení nemoci.

Dokument WO 97/07828 popisuje metody léčby genovou terapií pacienta s akumulací buněk nebo s chronickým zánětlivým onemocněním, které je výsledkem genu regulujícího defektní apoptózu specificky p53. Léčba upravuje defekt genu divokého typu spojeného s promotorem, který řídí . expresi genu regulujícího apoptózu.

Za účelem aktuálně upravit progresi onemocnění, TNFa musí být cílem terapie, která je specifická pro TNFa. Takovou nepřerušovanou léčbu není možné praktikovat s těmito biologickými činidly a bude obtížné je aplikovat po dlouhou dobu.

• 0 ·

·♦ 00 » ♦ 0 • 0 00 > · 0 « • 0 · ·· 00

Při alternativním způsobu léčby zánětlivé synovium se může odstranit za použití metody chirurgické (Herold N. and Schroder H. A., Acta Orthop. Scand., 1995, 66, 252-254, Ogilvie-Harris D. J. and Weisleder L., Arthroscopy, 1995, 11, 91 - 95), chemické (Cruz-Esteban C. and Wilke W. S., Bailliere's Clinical Rheumatol., 1995, 9, 787-801) nebo zářením vyvolané synovektomie (popisuje se v publikaci CruzEsteban C. and Wilke W. S., Bailliere^s Clinical Rheumatol., 1995, 9, 787-801). Po artroskopickém odstranění se získaly hraniční až dobré výsledky. Synovektomie, která se neprovedla chirurgickým zásahem se uskutečnila za použití různých chemických činidel, jako je kyselina osmičelá, alkylační činidla, jako je dusíkatý yperit a tepa a metotrexát. Bohužel synovektomie, které se neprovádí chirurgickou cestou (zahrnující chemickou a zářením indukovanou synovektomii) mají komplikovaný postup, poskytují pouze krátkodobé zlepšení a vykazují pouze malé omezení synoviální hyperplázie. Navíc většina nechirurgických alternativ jsou potenciálními teratogeny. Přirozená žánětlivá odezva souhlasí s poškozením tkáně, které vzniká chemickým nebo chirurgickým zásahem. Nakonec je nutné poznamenat, že tyto přístupy jsou nevýhodné tím,, že existuje riziko a vedlejší účinky běžně spojené s běžnou léčbou farmaky a invazivních chirurgických metod, které zahrnují nákladnou a nepříjemnou hospitalizaci a rehabilitaci.

Stále je nutné vytvořit účinný terapeutický přístup pro léčbu zánětlivých poruch zvláště pak RA.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje způsoby a kompozice vztahující se k poškození buněk, které produkují TNFcc, vyvolané apoptózou. Vynález popisuje chimérové molekuly nukleových kyselin, které • fr • fr fr fr·· • · frfr • · fr mají alespoň jednu oblast zesilující promotor TNFa (obsahující nukleovou kyselinu se sekvencí SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 nebo konzervativní substituci a nebo její alelické varianty) spojenou s promotorem TNFa. Promotor TNFa se dále připojil na sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje protein granzymu B nebo konzervativní substituci nebo její alelické varianty, které naopak jsou dále připojeny na sekvenci nukleové kyseliny 3'UTR.

Vynález dále popisuje TNFp-AIG a podobné chimérové konstrukce nukleové kyseliny, způsoby jejich přípravy a způsoby jejich použití a přípravky, které je obsahují.

Dále vynález popisuje způsob léčby, zánětlivých stavů, aplikací pacientovi, který tuto léčbu potřebuje, farmaceuticky účinného množství prostředku, který obsahuje chimérovou molekulu nukleové kyseliny.

Dále vynález popisuje způsob vyvolání apoptózy v buňkách transfekovaných chimérovou nukleovou kyselinou TNFp-AIG, dále způsob pro in vitro selekci variant somatických buněk, které neprodukují TNFa, v populaci buněk, způsob identifikace dominant/negativních genů odpovědných za vznik populace, která neprodukuje TNFa, a způsob identifikace produktů odpovědných za regulaci produkce TNFa.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje nové chimérové molekuly nukleových kyselin vhodné pro použití v terapeutických kompozicích a v metodách, které používají takové kompozice. Kompozice jsou řízeny na selektivně indukovanou apoptózu v buňkách produkujících TNFa, což způsobuje poškození těchto buněk.

Zkratka 3'UTR znamená 3'nepřekládanou oblast.

·♦ 99 · 9 9

9 9 9

Zkratka „AIG znamená gen vyvolávající apoptózu. IAG zahrnuje granzym B.

Zkratka „CsA znamená cyklosporin A, což je biologicky aktivní metabolit hub, který vykazuje imunosupresivní vlastnosti.

Zkratka „DN znamená dominantní/negativní genové produkty, které mají negativní účinek na expresi nebo funkci jiných genů nebo genových produktů.

Zkratka „ER znamená oblast zesilovače, přičemž ER1 má sekvenci SEQ ID NO: 4, ER2 má sekvenci SEQ ID NO: 5, ER3 má sekvenci SEQ ID NO: 11 a ER4 má sekvenci SEQ ID NO: 12.

Zkratka „GB znamená granzym B.

Zkratka „PMA znamená forbolmyristatacetát.

Zkratka „RA znamená revmatoidní artritidu.

Zkratka „TNFa znamená faktor nekrózy nádoru alfa.

Termíny „promotor TNF, „promotor TNFa a „TNFp jsou zde zaměnitelné. Není-li uvedeno jinak, tyto termíny se vztahují k celé nukleotidové sekvenci odpovídající přirozené minimální sekvenci promotoru TNFa připojené na jeden nebo více elementů zesilovače, které leží proti směru exprese.

Termín „substituce aminokyselin znamená nahrazení jedné nebo více aminokyselin. Jsou v podstatě konzervativní, když substituovaná aminokyselina má podobnou strukturu a/nebo chemické vlastnosti. Příklady konzervativního nahrazení jsou substituce leucinu izoleucinem nebo valinem, aspartátu glutamátem nebo threoninu serinem.

varianty znamenají substituce • tt tt· tt · • ··· • · · · • tt · • tt ··

Termín aminokyselin „konzervativní v polypeptidu.

Termín „alelické varianty znamená varianty na úrovni nukleové kyseliny a proteinu, které působí konzervativní nebo nekonzervativní substituce, přičemž vzniká alternativní forma stejného genu.

Termín „reportní molekuly znamená chemické části, které se používají pro značení sekvence nukleové kyseliny nebo aminokyseliny. Reportní molekuly zahrnují, ale nejsou omezeny na radionuklidy, enzymy, nebo chromogenní činidla.

fluorescenční, chemiluminiscenční Reportní molekuly jsou spojovány s určitou aminokyselinovou sekvencí nebo s určitou sekvencí nukleových kyselin, stanovují jejich přítomnost a umožňují jejich kvantifikaci.

Termín „ reportní geny znamená nukleové kyseliny a jejich fragmenty, které kódují funkční protein, jako je luciferáza, jenž je možné použít při hodnocení aktivity heterologních promotorů.

Termín „funkční fragmenty polynukleotidu a nukleové kyseliny obsahují celou nebo libovolnou část nukleotidové sekvence, která má několik nukleotidů. Tyto fragmenty se mohou použít jako dostatečný genetický materiál pro iniciaci transkripce genu nebo kódování funkční podjednotky polypeptidu.

Tento vynález je založen na důkazu, že apoptóza zánětlivých buněk u jistých zánětlivých onemocnění je výhodná. Vynález se zvláště popisuje samoregulovatelnou apoptózu genovou terapií. Vynález dále popisuje chimerovou nukleovou kyselinu obsahující alespoň jeden zesilovač promotoru připojený alespoň k jedné funkční kopii minimálního promotoru. Promotor je gen nebo kombinace genů aktivovaných v zánětlivých ·· ·· • · · • · ··# • · · · • · · · •9 99

94

4 4 · » • · ·

9 4

44 buňkách nebo v buňkách v místě zánětu. Tato chimerová nukleová kyselina je spojena alespoň s jednou kopií genu vyvolávajícího apoptózu (AIG) tak, že exprese AIG se řídí promotorem, přičemž cílem jsou zánětlivá buňky. Promotory indukovatelných genů, které se aktivují při zánětu, zahrnují sekvenci nukleové kyseliny promotoru TNFa a konzervativní substituci nebo jejich alelické varianty. Chimerové nukleové kyseliny podle vynálezu obsahují zesilovač, promotor a elementy AIG přímo spojené nebo vzdálené nebo blízko u sebe a jejich kombinace. Jak se uvádí shora v textu a popisuje se detailněji dále v textu v některých provedeních se použije v případě dosažení maximální účinnosti více kopií zesilovače, promotoru a/nebo AIG.

Vynález klade důraz na chimerové nukleové kyseliny obsahující alespoň jeden zesilovač promotoru TNFa spojený alespoň s jednou kopií minimálního promotoru TNFa a dále spojený, pouze z důvodů ilustrace, alespoň s jednou kopií AIG. Příklady provedení vynálezu obsahují tyto typy základních konstrukcí.

Gen vyvolávající apoptózu (který se nazývá AIG) je řízen promotorem TNFa (TNFp) nebo jiným indukovatelným genem, který se aktivuje při zánětu. V jednom provedení podle vynálezu se apoptoza selektivně indukovala v těch buňkách, které jsou schopny produkovat TNFa. TNFp-AIG nebo jiná chimerová nukleová kyselina může být vhodná pro zavedení in vivo za použití běžných metod genové terapie. Je výhodné v určitém provedení vynálezu, kde chimerová nukleová kyselina je TNFp-AIG, aby se exprimovala pouze v těch buňkách, které produkují zánětlivé cytokiny TNFa. Vedle toho, protože chimerová nukleová kyselina obsahuje elementy promotoru TNFa, také odděluje indukovatelné TNFp-selektivní transkripční faktory. To vede k omezení endogenní produkce TNFa. Vynález popisuje specificky TNFp-AIG • ·

4· • · • ··· • · · · • · ·

Μ »·· ·· »· • ♦ · 4 · · · • · · <

• · · 4 ·· 44 a podobné genové konstrukce, buňky obsahující chimerové nukleové kyseliny, způsoby vyvolání apoptózy v buňkách transfekovanými chimerovými nukleovými kyselinami, farmaceutické kompozice obsahující chimerové nukleové kyseliny, způsoby vhodné pro in vitro selekci variant somatických buněk, které neprodukují TNFa, v populaci buněk produkujících TNFa a podobně, způsob identifikace dominantních negativních/dominanntích supresivních genů odpovědných za inhibici produkce TNFa a terapeutických metod za použití chimerové nukleové kyseliny.

Aby byla jasná diskuse dále v textu, uvádí chimerové nukleové kyseliny podle vynálezu:

se sekvence

SEQ ID NO: 1 je nukleotidové sekvence odpovídající referenční promotorové sekvenci plné délky lidského TNFa, jak se popisuje v publikaci Takashiba S., et al., Gene, 1993, 131, 307-308). Čísla nukleotidů odpovídají číslování této sekvence.

SEQ ID NO: 2 je přirozená sekvence promotoru TNFa genu, který se používá TNFapodle vynálezu (-1077 nukleotidů od místa počátku transkripce, TSS). V nukleotidové sekvenci TNFp SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2 existuje několik rozdílů. Takové rozdíly v nukleotidových sekvencích promotoru TNFa se uvádějí v publikaci Takashiba S., et al., Gene, 1993, 131, 307-308).

SEQ ID NO: 3 je přirozená minimální sekvence promotoru TNFa (nukleotid -120 až -TSS), která zahrnuje alespoň jeden element zesilovače (místo k3) . Popisuje se v publikaci Pauli, U., Crit. Rev. in Eucaryotic Gene Expression, 1994,- 4, 323344, Rhoades K.L. et al., J. Biol. Chem., 1992, 267, 2210222107 a Takashiba S., et al., Gene, 131, 307-108).

SEQ ID NO: 4 je oblast zesilovače 1 (ERl) promotoru TNFa obsahující nukleotidy -1005 až -905.

φφ

ΦΦ • φ • φφφ φ φ φ • · φ φφ φφ φ φ φ φ • · φ φ φ φ · · φ φ φφ

SEQ ID ΝΟ: 5 je oblast zesilovače 2 (ER2) promotoru TNFa obsahující nukleotidy -706 až 517.

SEQ ID NO: 6 je další vícenásobné klonovací místa /MCS), které se zavedly proti směru exprese -120 minimálního promotoru TNFav konstrukci -120pGL3.

SEQ ID NO: 7 je 3' nepřekládaná oblast (3'UTR) genu TNFa (popisuje se v publikaci Nedwin, G. E., et al., Nucleic Acid Research, 1985, 13, 6361-6373).

SEQ ID NO: 8 se granzym B v plné délce.

SEQ ID NO: 9 zkrácená forma granzymu B, který postrádá nukleotidy kódující vedoucí peptid a deaktivující dipeptid.

SEQ ID NO: 10 je granzym B v plné délce, který obsahuje nukleotidy kódující vedoucí peptid, ale postrádá nukleotidy kódující deaktivující dipeptid.

SEQ ID NO: 11 je oblast zesilovače 3 (ER3) promotoru TNFa, která obsahuje nukleotidy -234 až -120.

SEQ ID NO: 12 je zesilují oblast 4 (ER4) promotoru TNFa, která obsahuje nukleotidy -243 až -65.

SEQ ID NO:	13 .	je	chimerová	nukleová	kyselina
*	706TNFpGB3'UTR.
	SEQ ID NO: 1005THFpGB3'UTR.	14	je	chimerová	nukleová	kyselina

Elementy promotoru TNFa vhodné pro přípravu konstrukcí chimerové kyseliny podle vynálezu se vybraly z elementů, které jsou schopné vyvolat expresi terapeutického genu, kterou řídí promotor TNFa. Tyto promotorové elementy se zde nazývají jako * * 44

4 4 4 ♦ 4 4 4

4 44 „vyvolatelné cis elementy, „cis-vyvolatelné elementy nebo „elementy zesilovače promotoru TNFa.

Elementy zesilovače se mohou fyzikálně spojit s minimální promotorovou sekvencí nebo se mohou oddělit od minimální promotorové sekvence sekvencí linkeru, která může obsahovat ale nemusí jedinečné restrikční místo. Jak se uvádí shora v textu elementy zesilovače se mohou připojit přímo , mohou být vzdáleny nebo blízko od chimerové nukleové kyseliny podle vynálezu nebo v jejich kombinaci. Ty se v typickém případě v konstrukci nachází proti směru exprese od promotoru. Příklad elementů zesilovače promotoru TNFa jsou uvedeny v sekvenci SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 12. Mohou se také použít jejich funkční fragmenty nebo variace a jejich kombinace. Některé preferované genové konstrukce podle vynálezu zahrnují ty, které mají velké množství kopií elementů zesilovače. To znamená dvě nebo více kopií. Některá provedení vynálezu mají přibližně 2 až 25, přednostně 2 až 10 a dokonce více se upřednostňuje 2 až 5 kopií.

Zde se používá termín „promotor TNF, „promotor TNFa a „TNFp. Tyto termíny je možné zaměnit. Není-li uvedeno jinak, tyto termíny odpovídají celé nukleotidové sekvenci odpovídající přirozené minimální sekvenci promotoru TNFa, která je připojena k jedné nebo více elementům zesilovače proti směru exprese (buď se vyskytují přirozeně nebo se geneticky manipulují v laboratoři). Příklady zahrnují, ale nejsou omezeny na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 3 a jejich funkční fragmenty, varianty a směsi. Řada funkčních fragmentů a variant sekvencí TNFa a dalších zde popsaných faktorů sdílí alespoň 80 % sekvenční homologii a v některém případě 90 % s jejich přirozenými a geneticky manipulovanými částmi. Ty jsou dobře známy v oboru.

φ · φ φ φ φ • · φ φ φ φ φ

ΦΦ ·· • · φ » · φφφ » · · · » φ φ φ φφ φφ

Vynález popisuje novou terapeutickou metodu zahrnující zavedení savčí chimerové nukleové kyseliny do buněk, přičemž uvedená nukleové kyselina obsahuje gen vyvolávající apoptózu (IGA) řízený promotorem TNFa (TNFp). Příklady chimerových nukleových kyselin podle vynálezu jsou uvedeny v SEQ ID NO: 13 a 14. Mohou se také použít jejich funkční fragmenty nebo varianty. Výsledek se kontroloval pomocí TNFp a AIG se exprimoval pouze v těch buňkách, které produkují zánětlivý cytokin TNFa. Proto libovolné buňky exprimující TNFa podléhají samodestrukci, zatímco buňky, které exprimuji TNFa, nejsou ovlivněny. Je výhodné, že tato metodologie se může cílit na libovolné buňky produkující. TNFa, jako jsou aktivované makrofágy, aktivované buňky T, synoviocyty podobné makrofágům a fíbroblastům a primární buňky, které se nacházejí v RA kloubech. Cílená buňka produkující TNFa je ta buňka, která v normálním případě nese nebo nenese nebo exprimuje apoptózový gen v jeho přirozené nezměněné formě. Proto za použití chimerových nukleových kyselin a metod podle vynálezu se mohou buněčné zdroje TNFa poškodit vysoce selektivním způsobem.

Jinou výhodou použití chimerové nukleové kyseliny podle vynálezu je, že TNFp odděluje transkripční faktory, které jsou nutné pro endogenní TNFp, přičemž se sníží endogenní produkce TNFa. V jednom příkladu se TNFp nachází v terapeuticky cílených buňkách ve velkém přebytku. Toho je možné dosáhnout zavedením více kopií transfekovaného genu do buňky. V jiném případě chimerové nukleové kyselina podle vynálezu může obsahovat více kopií indukovatelných cis elementů promotoru TNFa. Jak se uvádí shora v textu více kopií „indukovatelných elementů zesilovačů TNFp je přítomno v některých provedeních chimerové nukleové kyseliny TNFp-AIG podle vynálezu. Tím, že obsahují více kopií indukovatelných cis elementů konstrukce TNFp, transkripční faktory potřebné transfekovanou buňkou za φφ φφ * φ φ φ φ φ φφ φ φφφ φ φ φ φ φφ φφ φφ účelem produkce TNFa se oddělily exogenně zavedenou sekvencí.Tato preferovaná chimerová konstrukce TNFp-AIG se účinností v soutěžení o TNFpcharakterizovala zvýšenou specifické transkripční se porovnává faktory, což s chimerovými nukleovými kyselinami podle vynálezu, které obsahují pouze jediný zesilovací element spojený s TNFp. „Indukovatelný super promotor se zkonstruoval tímto způsobem je schopný 1) účinněji soutěžit o TNFa specifiké indukovatelné transkripční faktory a 2) řídit expresi genu vyvolávajícího apoptózu tak, aby došlo k její zesílení, k čemuž napomáhá více zesilovacích elementů.

U pacientů s revmatoidní artritidou se ukázalo, že synovektomie, to znamená odstranění synoviální tkáně, je výhodné. Na rozdíl od běžných a chirurgických způsobů synovektomie, zde popsaná terapeutická metoda cílená na buňky postihuje pouze buňky produkující TNFa. Tak je výhodné zavést a exprimovat chimerový gen TNFp-AIG a následným vyvoláním apoptózy předejít zánětlivé odezvě. Metody podle vynálezu jsou srovnatelně selektivní a výsledek je minimální poškození tkáně a omezení zánětu.

Zde popsané produkty a metody se mohou použít při léčbě jiných zánětlivých onemocnění. Takové zánětlivé poruchy zahrnují, ale nejsou omezeny na roztroušenou sklerózu, Guillain-Barrův syndrom, Crohnovu nemoc, ulcerativní kolitidu, lupénku, lupus erythematodes, odmítnutí štěpů, cukrovku s nutností aplikovat inzulín, psoriatickou artritidu, sarkoidózu, hypercítlivou pneumonitidu, ankylozující spondylitidu a příbuznou spoldyloarthropatii, Reiterův syndrom a generalizovanou sklerózu. Vynález zdůrazňuje způsoby léčby zánětlivých poruch u pacienta aplikací pacientovi, který tuto léčbu potřebuje, farmaceuticky účinné množství farmaceutické kompozice, která obsahuje chimerovou nukleovou kyselinu podle

0 »· 00 • 0 0

8 9 88

9 8 • 0 0

0· 00 •0 00 «0 0

0 0

0 0

0 0

00 vynálezu. Apoptóza se vyvolala v zánětlivých buňkách nebo v buňkách, které se nacházejí u pacienta na místě zánětu, zavedením alespoň jedné chimérové kyseliny podle vynálezu do místa zánětu. To se v typickém případě provede tak, že se připraví farmaceutická kompozice, která obsahuje alespoň jednu chimerovou nukleovou kyselinu podle vynálezu a v typickém případě farmaceuticky přijatelný nosič a kompozice se aplikuje pacientovi za použití standardních způsobů, které jsou dobře známy v oboru. Farmaceutická kompozice se může zavést přímo do místa zánětu za použití místní povrchové, intravenózní, intraperitoneální a podobné metody. Další způsoby se popisují dále v textu.

Vedle terapeutických indikací, chimérové nukleové kyseliny podle vynálezu se mohou použít při různých testovacích a selekčních metodách. Při jedné takové metodě se mohou varianty somatických buněk, které neprodukují TNFa v populaci buněk produkujících TNFa, vybrat in vitro zavedením chimérové nukleové kyseliny TNFp-AIG do populace buněk produkujících TNFa. Buňky produkující TNFa vykazují apoptózu. Buňky, které neprodukují TNFa přežijí. Výběr těchto buněčných variant, které vykazují fenotyp buněk, které přežily, je jednoduchý způsob identifikace buněk, které TNFa neprodukují. Takový selekční způsob se může použít při stanovení exprese genů, které působí trans způsobem, aby regulovaly aktivitu promotoru TNFa, přičemž se redukuje produkce TNFa. Takové geny se charakterizovaly jako dominantní negativní(DN)/dominantní supresivní geny v jiných systémech (popisuje se v publikaci Behrends S., et al., J. Biol. Chem. 1995, 270, 21109-21113,

Zhang S., etal., J. Biol. Chem., 1995, 270, 23934-23936, Watowich S.S., et al., Mol. Cell Biol., 1994, 14/6, 35353549) .

Dále při způsobu in vitro se chimerová nukleová kyselina TNFp-AIG podle vynálezu může použit k identifikaci dominantního negativního genu odpovědného za vývoj populace buněk, které neprodukují TNFa. Podle této metody chimerová nukleové kyselina TNFp-AIG se zavedla do buněk, které produkují TNFa. Blokováním přítomnosti dominantního negativního genu tyto buňky po aktivaci podléhají apoptóze. Proto je možné dedukovat, že varianty, které přežijí, nesou dominantní negativní gen schopný negativně regulovat produkci TNFa. Dominantní negativní gen je možné snadno identifikovat produkcí knihovny cDNA a transfekci buněčných linií (například Jukartovi buňky a THP-1). Tyto buňky jsou buď stabilní transfektanty 'indukovatelné chimerové nukleové kyseliny nebo buňky transfekované TNFp-luciferázovým genem TNFp-AIG. Tyto buňky se vybraly pro aktivaci in vitro na základě fenotypu přeživších buněk. Fenotyp přeživších buněk se indikovala podle účinku genů DN. V buňkách transfekovaných genem TNFpluciferázy se redukce aktivity luciferázy indikuje účinkem genu DN. Dominantní negativní geny identifikované za použiti tohoto protokolu se mohou použít samotné jako terapeutická činidla. Takové geny jsou kandidáty genové terapie za účelem redukovat produkci TNFa.

Způsoby, které se využívají pro transfer genu se rozdělily do dvou kategorií:

1. Přímý přístup: In šitu transdukce terapeutického genu do cílových buněk, jako jsou synoviocyty za použití vhodného vektoru jako nosiče terapeutického genu. Vektor obsahující terapeutický gen, který se injekcí zavedl přímo do oblasti, kde má působit (například artritický kloub).

2. Nepřímý přístup: Εκ-vivo transfekce terapeutického genu do cílových buněk, jako jsou synoviocyty. Při tomto přístupu se synovíum odstranilo z kloubů, ·«· • · *·· • « • · φ

«· • · • ·«· • · • · ** ·· «· ·« · *· *e izolovaly se synoviocyty a kultivovaly se in vitro. In vitro kultivované buňky se transfekovaly terapeutickým genem a geneticky upravené synoviocyty se transplantovaly zpátky do synovia.

V případě in vivo transferu se u několika vektorů zhodnotila účinnost při zavedení genu (popisuje se v publikaci Nita et al., Arthritis and Rheumatism, 1996, 39/5, 820-828).

Mezi vektory používanými pro genovou terapii jsou vektory získané z retrovirů, které jsou z daleka nejlépe vyvinuty. Tyto vektory byly schopny začlenit genetický materiál do hostitelského genomu a tak produkovat stabilní transfektanty. Tyto vektory však nebyly schopny infikovat buňky, které se nedělí, a protože se začlenily do genomu nemůže dojít k inzerční mutagenezi. Vektory získané z adenovirů infikují buňky, které se dělí i které se nedělí a DNA zůstává epizomální. Nevýhodou vektorů založených na adenovirech je, že tyto vektory pokračují v produkci virových proteinů v infikovaných buňkách a tvoří je potencionálně antigenní. Třetí typ. vektorů založených na viru se získal z virů Herpes simplex (HSV), které byly schopny infikovat buňky, které se dělí i buňky, které se nedělí.

Mezi nevirovými vektorovými systémy se hodnotily kationové liposomy a samotná plazmidová DNA. Liposomy jsou nejvýhodnější ve většině stádiích vývoje, ačkoli jisté typy buněk, jako jsou buňky kůže a svalů pohlcují a exprimují i samotnou plazmidovou DNA.

Zaváděcí systém genů zprostředkovaný částicemi je také možný (popisuje se v publikaci Rakhmilevich, et al., PNAS, 1996, 93, 6291) a zdá se to být vhodný přístup.

Pro zavedení chimerových nukleových kyselin je možné použít následující protokoly pro zavádění genů „in vivo:

1) Nita et al., Arthritis and Rheumatism, 1996, 39, 820-823 • ·

In vivo experiment u králíků:

Každý vektor je možné zavést dovnitř kloubu. V případě několika virových vektorů se do kolene zavedlo 10⁸ a 10⁹ částic suspendovaných v 0,5 ml rovnovážného solného roztoku.

Do kolona se zavedly komplexy lipozom-DNA (200 molů DCChol v komplexu s 20 μς DNA v mililitru ) v 1 ml rovnovážného solného roztoku.

2) Methods in molecular medicine: Gene Therapy Protocols, Paul Robbins, ed., 1997, Barr et al., str. 205-212.

Zavedení vektoru založeného na adenoviru do hepatocytů se provádí následujícím způsobem: krysí hepatocyty lxlO¹¹ PFU na 100 g tělesné hmotnosti zvířete.

U psů (12 až 17 kg) se portální žíla předem fúzovala s přibližně Ι,δχΙΟ¹¹ PFU/kg za vzniku jedné kopie genomu adenoviru na diploidní kopii hostitelské DNA.

V případě králíků (2 až 4 kg) se 100% transdukce hepatocytů dosáhlo l,5xl0³ virovými částicemi (přibližně 1,5x1ο¹¹ PFU), 50 až 75 % transdukce se dosáhlo 4 x 10¹² virovými částicemi.

Yang N-S, et al., 281-296

Zavedení genu zprostředkované zlatými částicemi: Transfekce savčí kožní tkáně 0,1, 0,5, 1,0 a 2,5 μμ DNA/mg částice vykazuje lineární vztah exprese transgenu.

Nabel et al., 297-305 zavádění genů zprostředkované lipozomy v případě lidí:

Protokol'1: 15 nmol lipozomů DC-Chol/Dope kombinovaných s μρ DNA v 0,7 ml. 0,2 ml shora popsané směsi se zavedlo injekcí do pacienta s melanomem uzlin. V případě zavedení katetrem se do arterie zavedlo 0,6 ml roztoku.

Protokol2: 15 nmol lipozomů DMRIE/Dope se kombinovalo s 5 μς DNA v 1,0 ml.

• ·

V případě injekce přímo do nádoru se koncentrace DNA pohybovala v rozmezí 3 gg s 4,5 nM DMRIE/Dope až 300 gg v komplexu s 450 nM DMRIE/Dope.

3) Roessler, et al., 369-374 Transfer genu do synovia:

K terapii kloubu se použilo rozmezí dávky 10⁹ až 10¹² adenovirových částic na kloub. Optimální dávku v případě určité série pokusů je nutné stanovit empiricky a je závislá na vlastnostech rekombinantního adenovirového genomu a transgenu, který se exprimuje.

V případě nepřímého přístupu se zavedly různé metody zahrnující využití kationických lipidů nebo transfekce založené na kationickém polymeru a elektroporaci.

Přehled obrázků na výkrese

Na obrázku č. 1 je schématické znázornění chimerové nukleové kyseliny TNFp-AIG podle vynálezu. Gen indukující apoptózu (AIG) je granzym B.

Obrázek č. 2 znázorňuje výsledky genové terapie za použití TNFp-AIG chimérových nukleových kyselin podle vynálezu.

Obrázek č. 3 znázorňuje souhrn delečních konstrukcí, které se používají k identifikaci indukovatelných cis elementů promotoru TNFa, kde se jako reportní systém používá exprese genu luciferázy (Luc).

Obrázek č. 4 (a) ukazuje výsledky reprezentativního experimentu uskutečněného za účelem hodnocení exprese genu luciferázy řízené delečními konstrukcemi promotoru TNFct v dočasně transfekovaných Jurkatových buňkách. Histogramy reprezentují stimulační index jako míru indukovatelnosti • · • · aktivačního činidla PMA. Jurkatovi buňky po stimulaci PMA produkují TNFa.

Obrázek č. 4 (b) znázorňuje výsledky reprezentativního experimentu, který se uskutečnil na základě hodnocení exprese genu luciferázy řízené delečními konstrukcemi promotoru TNFa v dočasně transfekovaných buňkách THP-1. Histogramy reprezentují stimulační index, jako míru indukovatelnosti aktivačního činidla LPS. Buňky THP-1 po stimulaci LPS produkují TNFa.

Na obrázku č. 5 je blokové schéma pro přípravu TNFpGB za použití vybraných přirozených elementů promotoru TNFa a granzymu B.

Na obrázku č. 6 (a a b) jsou znázorněny souhrny výsledků reprezentativních experimentů, které se provedly za účelem exprese chimérového TNFp-granzymu B (TNFpGB). Exprese různých klonů konstrukcí TNFpGB se exprimovaly v dočasně transfekovaných Jurkatových buňkách (obrázek č. 6a). Exprese granzymu B se hodnotila analýzou westernovým přenosem za použití protilátek proti granzymu B. Pruhy zobrazující granzym B v transfekovaných buňkách se označily šipkami. Indukce apoptózy expresí chimérových nukleových kyselin TNFpGB se hodnotily dočasnou transfekcí v Jurkatových buňkách (obrázek č. 6b). Apoptóza se hodnotila testem ELISA, který zjišťuje neživé buňky. V obou experimentech histogramy s rozptýlenými body reprezentují nestimulovanou kontrolu, kde buňky se tranfekovaly chimérovou nukleovou kyselinou a transfekované buňky nebyly stimulovány PMA. Pevné histogramy reprezentují vyvolání apoptózy po stimulaci s PMA buď při řízené transfekci (transfekce

-1005Luc3'UTR) nebo chímérovými nukleovými kyselinami, které exprimují granzym B.

> ♦· • · • · · ·

Na obrázku č. 7 (a a b) je digram chimérové nukleové kyseliny TNFp-AIG podle vynálezu, která obsahuje více kopií indukovatelných cis elementů promotoru TNFa, které naopak řídí expresi AIG (obrázek č. 7a) . Diagram chimérové nukleové kyseliny TNFpAIG obsahující více kopií indukovatelných cis elementů promotoru TNFa, který řídí expresi AIG, přičemž po směru exprese se nachází 3nepřekládaná oblast genu TNFa (TNF3'UTR) (Obrázek č. 7b). 3'UTR genu TNFa se implikoval při regulaci vyvolané exprese TNFa (popisuje se v publikaci Han,

J. , et al., J. Immunology, 1991, 146, 1843-1843, Crawford, E.

K. , et al. , J. Biol. Chem., 1997, 272, 21120-21137 a obrázek č. 9) .

Obrázek č. 8 (a a b) jsou bloková schémata pro přípravu chimerových konstrukcí super-promotor TNFa - granzym B.

Obrázek č. 9 znázorňuje souhrn výsledků dvou experimentů, aby znázornily regulační účinek TNF3'UTR na indukovatelnou expresi reportního genu luciferázy. Dočasná transfekce se provedla v buněčné linii fibroblastů. Tečkované histogramy reprezentují indukovatelnost TNFpLuc za nepřítomnosti TNF3'UTR a pevné histogramy reprezentují indukovatelnost TNFpLuc v přítomnosti TNF3'UTR. Podobné výsledky se také získaly v Jurkatových buňkách.

Obrázek č. 10 je diagram reprezentující selekci variant somatických buněk, které neprodukují TNFa v populaci buněk produkujících TNFa a identifikují dominantní negativní supresorové geny odpovědné za inhibici produkce TNFa.

Obrázek č. 11(a) znázorňuje diagram reprezentující identifikované oblasti zesilovače (ER) ER1 (SEQ ID NO: 4), ER2 (SEQ ID NO: 5), ER3 (SEQ ID NO: 11) a ER4 (SEQ ID NO: 12) • · r\ λ ····· ···

Z 4 ······ · · · • · · · · · · •· · · ··· ··· · promotoru TNFa a začlenění dvou kopií uvedeného ER proti směru exprese od přirozeného promotoru -120 TNFa.

Obrázek č. 11(b) znázorňuje výsledky experimentů, které se provedly, aby se hodnotila exprese genu luciferázy řízená přirozeným promotorem -120 TNFa, na jehož 5' konec se připojily dvě ko.pie zesilovacích oblastí ER1, ER2, ER3 a ER4 . Konstrukce řídící expresi genu luciferázy se dočasně transfekovaly do Jurkatových buněk. Histogramy reprezentují stimulační index jako míru indukovatelnosti aktivačním činidlem PMA. Po stimulaci PMA Jurkatovi buňky produkují TNFa.

Obrázek č. 11(c) ukazuje výsledky experimentů, které se uskutečnily za účelem zhodnocení exprese genu luciferázy řízené přirozeným promotorem -120 TNFa, na jehož 5' konec se připojily dvě kopie oblastí zesilovačů ER1, ER2, ER3 a ER4.

Konstrukce řídící transfekovaly do stimulační index expresi genu luciferázy se dočasně buněk THP-1. Histogramy reprezentují jako míru indukovatelnosti aktivačním činidlem LPS. Buňky THP-1 po stimulaci LPS produkují TNFa.

Obrázek č. 12 je grafická reprezentace sekvence chimérové nukleové kyseliny -706TNFpGB3'UTR, kde sekvence fragmentu promotoru je označena malými písmeny, sekvence linkerového fragmentu je označena velkými písmeny italikou, sekvence fragmentu granzymu B je označena velkými písmeny a sekvence fragmentu TNFa3'UTR je označena malými podtrženými písmeny.

Obrázek č. 13 je grafická reprezentace sekvence chimérové nukleové kyseliny -1005TNFpGB3' UTR, kde sekvence ..fragmentu promotoru je označena malými písmeny, sekvence linkerového fragmentu je označena velkými písmeny italikou, sekvence fragmentu granzymu B je označena velkými písmeny a sekvence fragmentu TNFa3'UTR je označena malými podtrženými písmeny.

• · ♦ 9

9 9 99

9 9

9 9 9

9 9 9

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Produkce konstrukcí TNFp-granzym B

Za účelem zkonstruovat chimerový granzym B řízený zesilovacím elementem cis promotoru TNF buď v jedné nebo více kopiích stejné oblasti nebo různých oblastí se provedla identifikace oblastí odpovědných za optimální indukovatelnou expresi reportního genu.

Výběr elementů promotoru TNFa pro konstrukci chimerové nukleové kyseliny.

Oblasti promotoru TNFa se amplifikovaly polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) za použití primerů, které dávají vznik různým delečním konstrukcím promotoru TNFa (obrázek č. 3) . Oblasti se identifikovaly dalším zkoumáním v různých dalších buněčných systémech (Rhoades, et al·., J. Biol. Chem., 1992, 267, 22102-22107, Leitman, et al., Mol. Cell Biol., 1992, 12,

1352-1356, Pauli U., Crit. Review Eukaryotic Gene Expression, 1994, 4, 323-344).. PCR amplif ikované geny se pak klonovaly proti směru exprese od reportního genu, jako je luciferáza, v běžném vektoru, který neobsahuje promotor. U těchto konstrukcí se testovala jejich konstitutivní a indukovatelná exprese v různých buněčných liniích, jako jsou Jurkatovy buňky (T lymfoblastoidy), U973 (myelomonocyty) , THP-1 (monocyty) , fibroblasty a in vitro kultivované lidské synoviocyty. Identifikace oblastí odpovědných za vyvolanou expresi reportního genu je primárně založená na výsledcích získaných za použití dvou buněčných linií, které produkují TNFa, (viz. Jurkatovi buňky; následuje po stimulaci PMA) a THP-1 (následuje po stimulaci s LPS) (obrázek č. 4 a a b) . Tyto buňky se dočasně transfekovaly za použití dobře zavedených metod a běžně dostupných činidel, například dextran DEAE a superfekt. Cis-elementy promotoru TNFa, které jsou odpovědné za vyvolanou expresi reportního genu se pak použily ke konstrukci chimerových nukleových kyselin TNFp-granzym B.

Konstrukce chimerových nukleových kyselin TNFp-granzym B získala se aktivovaných

Kódující oblast granzymu B se amplifikovala za použití cDNA svázané s oligo-dT, která se použije jako templát a z periferních lidských krevních lymfocytů PHA/anti-CD3, které se udržovaly v médiu obsahujícím IL-2. Při amplifikaci zkrácené formy (SEQ ID NO: 9) granzymu B a její plné délky (SEQ ID NO: 8) se použily primery odpovídající kodonům 1 až 7 a 21 až 27. Antisense primer byl stejný v obou amplifikacích a vznikl produkt, který odpovídá terminálnímu kodonu, to je zbytek 248. Dipeptidové deletované konstrukce granzymu B (SEQ ID NO: 10) se připravily za použití granzymu B v plné délce (SEQ ID NO: 8), jenž slouží jako templát. Mutagenní sense a antisense komplementární primery, které lemují na každé straně 15 nukleotidů, ale nezahrnují 6 nukleotidů odpovídající kodonům 19 a 20 dipeptid) se použily k vytvoření delece. vytvořily za použití kitu pro mutagenezi

QuickChange (Stratagene). Fragmenty nukleové kyseliny kódující granzym B s deletovaným dipeptidem se subklonoval po směru exprese od promotoru TNFa tím, že se nahradil gen luciferázy v delečních konstrukcích -706 a -1005 promotorů TNFa (obrázek č. 5) . Celá 3'nepřekládaná oblast genu TNFa (SEQ ID NO: 7) se amplifikovala PCR a začlenila se po směru exprese fragmentu nukleové kyseliny kódující granzym B s deletovaným dipeptidem řízeným delečními fragmenty -706 a -1005 promotoru TNFa. Celá sekvence chimerové nukleové kyseliny je uvedená v SEQ ID NO: 13 a 14.

(deaktivuj ící Konstrukce se

Konstrukce chimerové nukleové kyseliny super promotoru TNFa granzymu B ·· • · • · ·«

Dvě široce preferované oblasti, viz ERl(-1005 až -905) (SEQ ID NO: 4) odpovědné za indukovatelnou expresi shora popsaného reportního genu (obrázek č. 4a a b) se amplifikovaly PCR a ligovaly se proti směru exprese minimálního přirozeného promotoru (-120 až TSS, SEQ ID NO: 3), buď jako jedna kopie nebo více kopií. Dvě další oblasti ER3(-234 až -120) (SEQ ID NO: 11) a ER4 (-234 až -65 (SEQ ID NO: 12) promotoru TNFa se také identifikovaly jaké zesilující oblasti, které se použily při chimérických konstrukcích za použití dále v textu popsané strategie. Super promotor obsahuje více (2 až 10) kazet shora popsaných oblastí obsahujících indukovatelné elementy (obrázek č. 7) . Toho se dosáhlo zajímavých oblastí za použití primerů syntetizovaných s restrikčními místy začleněnými na 5'konec každého z primerů. Produkt amplifikovaného genu lemuje z každé strany jediné restrikční místo. Upřednostňuje se, že AIG amplifikovaný PCR se klonoval po směru exprese super promotoru TNFa tak, že se lucifarázový reportní gen nahradil původní konstrukcí, jak se popisuje v případě přirozeného promotoru TNFa (obrázek č. 5).

promotorové amplifikací

Schéma pro konstrukce super promotoru TNFa a linkerových sekvencí, které reprezentují jedinečná restrikční místa (tyto restrikční místa nejsou přítomna ve vybraných elementech promotoru TNFa a granzymu Β) , která umožňují účinnou řízenou inzercí, jsou uvedena dále v textu na obrázku č. 8:

Schéma 1:

Krok 1: Začlenění minimálního promotoru TNFa (-120 až TSS) do pGL3 základního luciferázového vektoru (bez promotoru) (Promega) :

Elementy základních vektorů pGL3, které se použily při konstrukci chimerové nukleové kyseliny TNFp-AIG jsou uvedeny dále v textu.

• · ·* _KpnI. Sací.MluI.Nhel.Smal.Xhol.BglII.HindlII. (luciferáza).X bal_

Minimální promotor se amplifikoval PCR za použití primerů, které obsahují restrikční místa Xhol a BglII.HindlII tak, že restrikční místo Xhol bylo na 5'konci a restrikční místa BglII.HindlII byly na 3' konci amplifikovaného produktu. Tento fragment se začlenil do polylinkeru základního vektoru pGL3 za použití stejných restrikčních míst. Konstrukce se označila jako „konstrukce Al a byla následující:

_KpnI.Sací.Mlul.NheISmalXhol.(-120 až TSS BglII).HindlI.

(luciferáza).Xbal_

Krok 2: Zesilovací fragment (ER1, ER2, ER3 nebo ER4) se amplifikoval PCR za použití primeru, který obsahuje několik restrikčních míst. Výsledný fragment zahrnuje restrikční místa KpnI.AatlI.BssHII na 5'konci a na 3'konci Nsil.Spěl.Mlul, jak se uvádí dále v textu:

5'KpnI.AatlI.BssHII.(ERl, ER2, ER3 nebo ER4).Nsil.Spěl. MluI3''. Fragment se začlenil do „konstrukce Al, který se vytvořil v kroku 1 za použití restrikčních míst KpnI a Mlul. Tato konstrukce se nazývá jako konstrukce Bl a uvádí se dále v textu:

_KpnI.AatlI.BssHII.(ER1, ER2, ER3 nebo ER4).Nsil.Spěl.Mlul.

Nhel.Smál.Xhol(-120 až TSSBglII).HindlII. (luciferáza).Xbal_

Krok 3: Zesilovací fragment TNFa (ER1, ER2, ER3 nebo ER4) se amplifikoval za použití primerů, které obsahují restrikční místa AatlI a BssHII za vzniku produktu PCR:

5'AatII. (ER1, ER2, ER3 nebo ER4) . BssHII3' . Tento fragment se klonoval do „konstrukce Bl za použití stejných restrikčních míst. tato konstrukce se označila jako „konstrukce Cl a je následuj ící:

_KpnI.AatlI.BssHII. (ER1 nebo ER2).Nsil.Spěl.Mlul.Nhel.

Smál.Xhol(-120 až TSSBglII).HindlII. (luciferáza).Xbal_ « · • · · ♦·

• · · » · ··· ·· φ·

Krok 4: Zesilovací fragment TNFa (ER1, ER2, ER3 nebo ER4) se amplifikoval za použití primerů, které obsahují restrikční místa Nsil a Spěl za vzniku produktu PCR:

5'NsiI.(ERl, ER2, ER3 nebo ER4).SpeI3'. Tento fragment se klonoval do „konstrukce Cl za použití stejných restrikčních míst. tato konstrukce se označila jako „konstrukce Dl a je následující:

_KpnI.AatlI.(ER1, ER2, ER3 nebo ER4).BssHII.(ER1. ER2, ER3 nebo ER2).NsiI. (ER1, ER2, ER3 nebo ER4)SpeI. MluI.Nhel.Smal.Xhol(-120 až TSSBglII).HindlII. (luciferáza).

Xbal_

Krok .5: Oblasti kódující granzym B se amplifikovala PCR za použití primerů, které obsahují restrikční místa BglII a Xbal, které tvoří fragment popsaný dále v textu:

5'EcoRI.BglII.(granzym B).Xba3. Tento fragment se začlenil do „konstrukce Dl za použití restrikčních míst BglII a Xbal. Výsledná konstrukce se označila jako „konstrukce El a je následující:

_KpnI.AatlI. (ER1, ER2, ER3 nebo ER4). BssHII. (ER1. ER2, ER3 nebo ER2).NsiI. (ER1, ER2, ER3 nebo ER4).SpeI. MluI.Nhel.Smal.Xhol(-120 až TSSBglII).HindlII.

(luciferáza).EcoRI Xbal_

Alternativní schéma 2 je následující:

Schéma 2:

Krok 1: Stejný jako na schématu 1, přičemž vzniká „konstrukce Al, která je následující:

KpnI.Sací.Mlul.Nhel.Srna!.Xhol(-120 až TSS BglII).HindlII.

(luciferáza).Xbal ·· *· · « 00 00 • · · · · « · « » « « • 0 · ·· 0 0 0 0 0 0 ••000 · 000000 • 0 0 0 0 0 · 0 * · ·· ·· 000 000 00 00

Krok 2: Začlenění dalších vícenásobných klonovacích míst (SEQ ID NO: 6) . Dva komplementární oligonukleotidy (5' fosforylované), které poskytují _Nhel. SacII. EcoRV. AflII .AatlI .AvrlI. Spěl. PvuII .Xhol_, se syntetizovaly za použití komerčních zdrojů. Tyto oligonukleotidy se spojily a pak se klonovaly do restrikčních míst Nhel a Xhol „konstrukce Al . Výsledná konstrukce se označila jako „konstrukce B2 a je následující:

_KpnI. Sací. Mlul. Nhel. Sací. EcorV. AflII. AatlI .AvrlI. Spěl. PvuII .Xhol. (-120 až TSS BglII).Hindlll.(luciferáza).Xbal_

Krok 3: Zesilovací fragment TNFa (ER1, ER2, ER3 nebo ER4) se amplifikoval za použití primerů, které obsahují restrikční místa Spěl. PvuII na 5 konci a Xhol na 3' konci za vzniku PCR produktu 5'Spěl.PvuII.(ERl, ER2, ER3 nebo ER4).XhoI3'. Tento fragment se klonoval do „konstrukce B2 za použití restrikčních míst Spěl a Xhol. Tato konstrukce se označila jako „konstrukce C2:

_KpnI.Sací.Mlul.Nhel.Sací.EcorV.AflII.AatlI.AvrlI.Spěl. PvuII . (ER1, ER2, ER3 nebo ER4) .Xhol. (-120 až TSS BglII). Hindlll.(luciferáza).Xbal_

Krok 4: Zesilovací fragment (ER1, ER2, ER3 nebo ER4) se amplifikoval za použití primerů, které obsahují restrikční místa AvrlI. Spěl na 5' konci a PvuII na 3 konci za vzniku PCR produktu: 5'AvrlI.Spěl. (ERl, ER2, ER3 nebo ER4) .Pvull3'. Tento fragment se klonoval do „konstrukce C2 za použití restrikčních míst AvrlI a PvuII. Tato konstrukce se označila jako „konstrukce D2:

_KpnI.Sací.Mlul.Nhel.Sací.EcorV.AflII .AatlI.AvrlI.Spěl.

.(ERl, ER2, ER3 nebo ER4) .PvuII. (ERl, ER2, ER3 nebo ER4) .Xhol. (-120 až TSS BglII). Hindlll. (luciferáza) .Xbal_

Za použití strategie alespoň sedmi kopií zesilovacích oblastí (ERl, ER2 ER3 nebo ER4 jednotlivě nebo v kombinaci) se • · • fcfc fcfc • · · · • fc fcfc mohou jednou přidat za použití dalšího restrikčního místa proti směru exprese dřívějšího při amplifikaci PCR zvolených zesilovacích oblastí. Když se přidá požadovaný počet kopií zesilovacích oblastí, AIG se začlení po směru exprese od super promotoru, jak se popisuje v kroku 5 schématu 1.

Indukovatelná exprese chimerového genu TNFp-granzym B se testovala dočasnou transfekcí shora zmiňovaných buněčných linií. Exprese nukleové kyseliny TNFp-granzym B se měřila detekcí apoptózy transfekovaných buněk, přičemž se odhadly exprimované proteiny AIG v testu westernův přenos za použití běžně dostupných protilátek a odhadu proteázové aktivity za použití běžně dostupných dobře zdokumentovaných specifikých syntetických tetrapeptidových substrátů.

Regulace exprese reportniho genu řízená TNFp

3'nepřekládaná oblast genu TNFa má důležitou úlohu při regulaci biosyntézy TNFa. To se zahrnuje do translační exprese genu TNFa v normálním neaktivovaném stádiu. Je důležité, že tyto elementy umožňují de-represi, která se objevuje, když se aktivují buňky externími podněty (popisuje se v publikaci Han,

J. et al., J. Immunology, 1991, 146, 1843-1848, Crawford, F.

K. , et al., J. Biol. Chem., 1996, 271, 22383-22390).

Připravily se genetické konstrukce, ve kterých se celá 3'nepřekládaná oblast (SEQ ID NO: 13) začlenila po směru exprese genu luciferázy řízeného delečními fragmenty , viz. 120, -706 a -1005 promotoru TNFa. Výsledky dočasné exprese těchto konstrukcí se shrnuly na obrázku č. 9. Při použití shora popsané strategie se 3'UTR také začlenila ·po směru exprese od granzymu B chimerové konstrukce TNFpGB (Obrázky č. 6(a), 12 a 13) .

Příklad 2: Testovací protokoly * · ¹

4 4 4 4 4 • 4 4 · 4

4* 44 4444

4

Metody in vitro:

Luciferázový test: luciferázová aktivita se stanovila za použití běžně dostupných činidel (Promega).

Exprese genu granzym B:

a) westernový přenosy lyzátu transfekovaných buněk se vyvinuly za použití protilátek proti granzymu B.

b) apoptóza transfekovaných buněk: apoptóza transfekovaných buněk způsobená granzymem B se stanovila barvením jádra propidium jodidem (popisuje se v publikaci Krishan, A., J. Cell Biol., 66, 1994, 188-193) a běžně dostupným kitem Cell Death ELISA (Boehringer Mannheim).

Zvířecí modely

Králičí model artritidy indukované IL-Ιβ (Pettipher E. R., et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 1986, 83, 8749-8753): IL-Ιβ se zavedlo injekcí do kolenního kloubu do novozélandských bílých králíků. Nitrokloubní injekce IL-Ιβ způsobuje infiltraci leukocytů závislou na dávce do kloubního prostoru a ztrátu proteoglykanu z kloubní chrupavky.

Artritida vyvolaná antigenem: Nitrokloubní injekce antigenu (ovalbumin) do kolenních kloubů vyvolává akummulaci leukocytů a degradaci chrupavky, která vede u lidí k revmatoidní artritidě. Po aplikaci injekce koleno oteklo a otok přetrvává 14 dní.

Model lidských-scid myších synoviocytů (popisuje se v publikaci Houri J. M., et al., Current Opinions in Rheumatol., 1995, 7, 201-205, Sack U., et al., J. Autoimmunity, 1995, 9, 51-58, Geiler T., et al., Arthritis and Rheumatism, 1994, 37, 1664-1671): Jde o v současné době vyvinuté modely artritidy, ve kterých čerstvá synoviální tkáň

9 99 99

9 99 · · « · • · · · · · • «····· • · 9 9 · 9

999 999 99 99 z pacientů, kteří vykazují onemocnění RA, se implantovala spolu s normální lidskou chrupavkou do scid myší buď podkožně pod renální kapsuli (Geiler - T, et al., Arthitis and Rheumatism, 1994, 37, 1664-1671) nebo do koleních kloubů (Sack U., et al., J. Autoimmunity, 1995, 9, 51-58). Implantáty rostou s charakteristikami podobnými artritidě, což zahrnuje tvorbu tkáně panusu s vysokou hustotou buněk, eroze kostí a chrupavek, vývoj obřích buněk s více jádry a invazi chrupavky se synoviálními fibroblasty.

Nepřímá metoda: Synoviocyty se transfekovaly in vitro terapeutickým genem a zavedly se do zad králíků. Artritida se vyvolala u těchto králíků injekcí terapeutického genu, pak se hodnotila vyvolaná aktivací chimerové nukleové v transplantovaných buňkách apoptózu.

IL-Ιβ a aktivace.

kyseliny expresi

Exprese vyvolá

Přímá metoda: nitrokloubní . injekce chimérových nukleových kyselin.

Může se použít libovolná popsaná metoda pro zavádění genů zahrnující zavedení samotné plazmidové DNA zprostředkované lipozomy. Při použití metody založeném na virovém vektoru se chimerové nukleové kyseliny klonovaly do vhodných vektorů. Vektory se pak upravily delecí eukaryontního promotoru, který je přítomen v těchto vektorech. Nitrokloubní injekce terapeutických genů začleněných do vhodných vektorů se pak použije k odhadu terapeutické stejně jako profylaktické účinnosti.

Příklad 3: Výběr variant somatických buněk, které neprodukují TNFa

Buňky (THP-1, Jurkatovi buňky) se stabilně transfekovaly in vitro chimerovou nukleovou kyselinou. Po několika cyklech stimulace, která vyvolává v buňkách exprimující gen TNFp-AIG apoptózu, se shromáždily živé buňky. Z těchto buněk se • · zkonstruovala cDNA knihovna, která se použila v případě funkčního klonování (Legerski R and Peterson C., Nátuře, 1992, 359, 70-73, Jaattela Μ. , et al., Oncogene, 1995, 10, 22972305).

Příklad 4: Identifikace a charakterizace dominantních negativních (DN) genů

THP-1 a Jurkatovi buňky se stabilně transfekovaly TNFp-AIG se vystavily opakovaným cyklům stimulace, přičemž došlo k aktivaci exprese TNFp-AIG. Buňky, které neexprimují negativní regulační geny, podléhají apoptóze, zatímco tyto, co exprimují dominantní negativní geny přežívají. V těchto buňkách, které přežily, produkty genu DN působí in trans s promotorem TNFa, čímž inhibují své aktivace traskribce AIG, což vede k fenotypu buněk, které přežívají. Knihovna cDNA se zkonstruovala za použití polyadenylační mRNA z těchto buněk. Geny DN, které zachrání buňky. THP-1 nebo Jurkatovi buňky transfekované TNFp-AIG před apoptózou se identifikovaly funkčním klonováním, jak se popisuje v případě ostatních genů (Legerski R. and Peterson C., Nátuře, 1992, 359, 70-73, Jaattela M., et al., Oncogene, 1995, 10, 2297-2305).

í -Ρ’ΚΡ • · • · ·· • · fr· • frfr · • frfr · • frfr · • · · · • fr ··

Seznam sekvencí (2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1 178 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: DNA, lidský promotor TNF-alfa (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

□ ggggaagcaa aggagaagct gagaagatga aggaaaagtc agggtctgga ggggcggggg 60 □ tcagggagct cctgggagat atggccacat gtagcggctc tgaggaatgg gttacaggag 120 □ · ' acctctgggg agatgtgacc acagcaatgg gtaggagaat gtccagggct atggaagtcg 180 □ agtatcgggg accccccctt aacgaagaca gggccatgta gagggcccca gggagtgaaa 240 □ gagcctccag gacctccagg tatggaatac aggggacgtt taagaagata tggccacaca 300 □ ctggggccct gagaagtgag agcttcatga aaaaaatcag ggaccccaga gttccttgga 360 □ agccaagact gaaaccagca ttatgagtct ccgggtcaga atgaaagaag aaggcctgcc 420 D ' ccagtggtct gtgaattccc gggggtgatt tcactccccg ggctgtccca ggcttgtccc 480 r-1, tgctaccccc acccagcctt tcctgaggcc tcaagctgcc accaagcccc cagctccttc 540 □ tccccgcaga cccaaacaca ggcctcagga ctcaacacag cttttccctc caaccccgtt 600 □ ttctctccct caaggactca gctttctgaa gcccctccca gttctagttc tatctttttc 660 □ ctgcatcctg tctggaagtt agaaggaaac agaccacaga cctggtcccc aaaagaaatg 720 □ gaggcaatag gttttgaggg gcatggggac ggggttcagc ctccagggtc ctacacacaa 780 □ atcagtcagt ggcccagaag acccccctcg gaatcggagc agggaggatg gggagtgtga 840 C ggggtatcct tgatgcttgt gtgtccccaa ctttccaaat ncccgccccc gcgatggaga 900 □ agaaaccgag acagaaggtg cagggcccac taccgcttcc tccagatgag cttatgggtt 960 □ tctccaccaa ggaagttttc cgctggttga atgattcttt ccccgccctc ctctcgcccc 1020 □

	36	·« • • Φ •	·· · • · ·· • ··♦ · • · · · · • · · · ·· ···	• »· • * · • • · ·
agggacatat rj	aaaggcagtt	gttggcacac	ccagccagca	gacgctccct	cagcaaggac	1080
agcagaggac r~,	cagctaagag	ggagagaagc	aactgcagac	cccccctgaa	aacaaccctc	1140
agacgccaca 0	tcccctgaca	agctgccagg	caggttct			1178

(2) Informace o SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1 096 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) (vi) (xi)	DRUH MOLEKULY: DNA, lidský promotor TNF-alfa PŮVODNÍ ZDROJ: (A) ORGANIZMUS: Homo sapiéns
Popis sekvence: SEQ ID NO:	2:
gaggccgcca π	gactgctgca	ggggaagcaa	aggagaagct	gagaagatga	aggaaaagtc	60
u agggtctgga □ tgaggaatgg π	ggggcggggg	tcagggagct	cctgggagat	atggccacat	gtagcggctc	120
gttacaggag	acctctgggg	agatgtgacc	acagcaatgg	gtaggagaat	180
(J gtccagggct D agggccccag (—>	atggaagtcg	agtatgggga	ccccccctta	acgaagacag	ggccatgtag	240
ggagtgaaag	agcctccagg	acctccaggt	atggaataca	ggggacgttt	300
Lj aagaagatat □ gaccccagag	ggccacacac	tggggccctg	agaagtgaga	gcttcatgaa	aaaaatcagg	360
ttccttggaa	gccaagactg	aaaccagcat	tatgagtctc	cgggtcagaa	420
J tgaaagaaga 7”i	aggcctgccc	cagtggggtc	tgtgaattcc	cgggggtgat	ttcactcccc	480
ggggctgtcc	caggcttgtc	cctgctaccc	ccacccagcc	tttcctgagg	cctcaagcct	540
LJ gccaccaagc Γ-	ccccagctcc	ttctccccgc	agggacccaa	acacaggcct	caggactcaa	600
u! cacagctttt	ccctccaacc	ccgttttctc	tccctcaagg	actcagcttt	ctgaagcccc	660
tcccagttct C acagacctgg π	agttctatct	ttttcctgca	tcctgtctgg	aagttagaag	gaaacagacc	720
tcCccaaaag	aaatggaggc	aataggtttt	gaggggcatg	gggacggggt	780
tcagcctcca	gggtcctaca	cacaaatcag	tcagtggccc	agaagacccc	cctcggaatc	840
-J ggagcaggga π	ggatggggag	tgtgaggggt	atccttgatg	cttgtgtgtc	cccaactttc	900
caaatcčccg	cccccgcgat	ggagaagaaa	ccgagacaga	aggtgcaggg	cccactaccg	960

□ • φ • φφ« • φ cttcctccag atgagctcat gggtttctcc accaaggaag ttttccgctg gttgaatgat 1020 L2 tctttccccg ccctcctctc gccccaggga catataaagg cagttgttgg cacacccagc 1080 n cagcagacgc tccctc

1096 (2) Informace o SEQ ID NO: 3:' (i)

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 139 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA, přirozený
	TNF-	•alfa
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A)	ORGANIZMUS: Homo sapiens

(xi)

Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

I » φ 4 > Φ Φ 1 » φ Φ 1 ► Φ Φ 4

ΦΦ ΦΦ ccgcttcctc cagatgagct cátgggtttc tccaccaagg aagttttccg ctggttgaat 60 □ gattctttcc ccgccctcct ctcgccccag ggacatataa aggcagttgt atggcacacc 120 □ cgccagcaga cgctccctc 139 □ · (2) Informace o SEQ ID NO: 4:

(i)

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) (B) (C) (D) (ii) (vi) (xi)

DÉLKA: 123 párů bázi TYP: nukleová kyselina DRUH ŘETĚZCE:

TOPOLOGIE:

DRUH MOLEKULY: DNA, oblast 1 zesilovače promotoru

TNF-alfa (ER1)

PŮVODNÍ ZDROJ:

(^) ORGANIZMUS: Homo sapiens Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

ggggcggggg tcagggagct cctgggagat atggccacat gtagcggctc tgaggaatgg 60 □ gttacaggag acctctgggg agatgtgacc acagcaatgg gtaggagaat gtccagggct 120 atg □

123 • 4 «· ·· • · ·

4 ·»· • · · 4 4

4 4 · • 44 •

• 4 t 4

4 (2) Informace o SEQ ID NO: 5:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 190 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA, oblast 2
	TNF-	•alfa (ER2)
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A)	ORGANIZMUS: Homo sapiens

zesilovače (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

promotor tccttggaag cóaagactga aaccagcatt atgagtctcc gggtcagaat gaaagaagaa 60 □ ggcctgcccc agtggggtct gtgaattccc gggggtgatt tcactccccg gggctgtccc 120 □ aggcttgtcc' ctgctacccc cacccagcct ttcctgaggc ctcaagcctg ccaccaagcc 180 □ cccagctcct 190

D (2) Informace o SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 223 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: DNA, vícenásobná klonovací místa se zavedla proti směru exprese od minimálního promotoru TNF-alfa v konstrukci -120pGL3 (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

ggtaccgagc tcttacgcgt gctagccgcg gatatcttaa gacgtcctag gactagtcag 60

Γ“>

ctgctcgagc cgcttcctcc agatgagctc atgggtttct ccaccaagga agttttccgc 120 tggttgaatg attctttccc cgccctcctc tcgccccagg gacatataaa ggcagttgtt 180 □ ggcacaccca gccagcagac gctccctcag cagatctaag ctt

223 « · · • · ··· • · · · 9 • · · · *» 99

9 ··· ·♦ • · 9 * · · • · » • · 9 ·· »9 (2) Informace o SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 787 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(n) DRUH MOLEKULY: DNA, nepřekládaná oblast TNF-alfa (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

tctagagaag gacgaacatc caaccttccc aaacgcctcc cctgccccaa tccctttatt 60 □ accccctcct tcagacaccc tcaacctctt ctggctcaaa aagagaattg ggggcttagg 120 DL .

gťcggaaccc aagcttagaa ctttaagcáa caagaccacc ačttcgaaac ctgggattca 130 .

□ ··' - . - ..· -··- - * ggaatgtgtg gcctgcacag tgaagtgctg gcaaccacta agaattcaaa ctggggcctc 240 □ cagaactcae tggggcctac agctttgatc cctgacatct ggaatctgga gaccagggag 300 □ cctttggttc tggccaaaat gctgcaggac ttgagaagac ctcacctaga aattgacaca 360 □ agtggacctt aggccttcct ctctccagat gtttccagac ttccttgaga cacggagccc 420 □ agccctcccc atggagccag ctccctctat ttatgtttgc acttgtgatt atttattatt 480 □ tatttattat ttatttattt acagatgaat gtatttattt gggagaccgg ggtatcctgg 540 □ gggacccaat gtaggagctg ccttggctca gacatgtttt ccgtgaaaac ggagctgaac 600 □ aataggctgt tcccatgtag ccccctggcc tctgtgcctt cttttgatta tgttttttaa 660 □ aatatttatc tgattaagtt gtctaaacaa tgctgaťttg gtgaccaact gtcactcatt 720 □ gctgagcctc tgctccccag gggagttgtg tctgtaatcg ccctactatt cagtggcgag 780 □ atctaga □

787 • · • · • · (2) Informace o SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 839 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: DNA, granzym B v plné délce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

atgcaaccaa tcctgctťct gčtggccttc ctcctgctgc ccagggcaga tgcaggggag 60 □ atcatcgggg gacatgaggc caagccccac tcccgcccct acatggctta tcttatgatc 120 □ tgggatcaga agtctctgaa gaggtgcggt ggcttcctga tacaagacga cttcgtgctg 180 □ acagctgctc actgttgggg aagctccata aatgtcacct tgggggccca caatatcaag 240 □ gaacaggagc cgacccagca gtttatccct gtgaaaagag ccatccccca tccagcctat 300 π aatcctaaga acttctccaa tgacatcatg ctactgcagc tggagagaaa ggccaagcgg 360 □ accagagctg tgcagcccct caggctacct agcaacaagg cccaggtgaa gccagggcag 420 □ acatgcagtg tggccggctg ggggcagacg gcccccctgg gaaaacactc acacacacta 480 □ caagaggtga agatgacagt gcaggaagat cgaaagtgcg aatctgactt acgccattat 540 □ tacgacagta ccattgagtt gtgcgtgggg gacccagaga ttaaaaagac ttcctttaag 600 ggggactctg gaggccctct tgtgtgtaac aaggtggccc agggcattgt ctcctatgga 660 cgaaacaatg gcatgcctcc acgagcctgc accaaagtct caagctttgt acactggata 720 C aagaagacca tgaaacgcta ctaactacag gaagcaaact aagcccccgc tgtaatgaaa 780 □ caccttctct ggagccaagt ccagatttac actgggagag gtgccagcaa ctgaataaa 839 G .

~ '03 - i • · • · (2) Informace o SEQ ID NO: 9:

(i)

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(ii) (ví;

(xi)

(A)	DÉLKA: 782 párů	baží
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
DRUH	MOLEKULY: DNA,	zkrácená

forma granzymu (chybí vedoucí peptid a deaktivující dipeptid) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

atgatcatcg □

atctgggatc □

ctgacagctg aaggaacagg

G tataatccta cggaccagag □

cagacatgca □

ctacaagagg □

tattacgaca

O aagggggact ρ

ggacgaaaca n

ataaagaaaa p

aaacaccttc

ggggacatga	ggccaagccc	cactcccgcc	cctacatggc	ttatcttatg	60
agaagtctct	gaagaggtgc	ggtggcttcc	tgatacaaga	cgacttcgtg	120
ctcactgttg	gggaagctcc	ataaatgtca	ccttgggggc	ccacaatatc	180
agccgaccca	gcagtttatc	cctgtgaaaa	gagccatccc	ccatccagcc	240
•agaacttctc	caatgacatc	atgctactgc	agctggagag	aaaggccaag	300
ctgtgcagcc	cctcaggcta	cctagcaaca	aggcccaggt	gaagccaggg	360
gtgtggccgg	ctgggggcag	acggcccccc	tgggaaaaca	ctcacacaca	420
tgaagatgac	agtgcaggaa	gatcgaaagt	gcgaatctga	cttacgccat	480
gtaccattga	gttgtgcgtg	ggggacccag	agattaaaaa	gacttccttt	540
ctggaggccc	tcttgtgtgt	aacaaggtgg	cccagggcat	tgtctcctat	600
atggcatgcc	tccacgagcc	tgcaccaaag	tctcaagctt	tgtacactgg	660
ccatgaaacg	ctactaacta	caggaagcaa	actaagcccc	cgctgtaatg	720
tctggagcca	agtccagatt	tacactggga	gaggtgccag	caactgaata	780

aa π

782

• · (2) Informace o SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(E)	DÉLKA: 1 725 párů baží
	(F)	TYP: nukleová kyselina
	(G)	DRUH ŘETĚZCE:
	(H)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA, granzym

s deletovaným deaktivujícím dipeptidem (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

atgcaaccaa	tcctgcttct	gctggccttc	ctcctgctgc	ccagggcaga
gggggacatg	aggccaagcc	ccactcccgc	ccctacatgg	cttatcttat
cagaagtctc Γ“	tgaagaggtg	cggtggcttc	ctgatacaag	acgacttcgt
gctcactgtt π	ggggaagctc	cataaatgtc	accttggggg	cccacaatat
gagccgaccc π	agcagtttat	ccctgtgaaa	agagccatcc	cccatccagc
u aagaacttct ή	ccaatgacat	catgctactg	cagctggaga	gaaaggccaa
gctgtgcagc —n	ccctcaggct	acctagcaac	aaggcccagg	tgaagccagg
!_) agtgtggccg □ gtgaagatga ΓΊ	gctgggggca	gacggccccc	ctgggaaaac	actcacacac
cagtgcagga	agatcgaaag	tgcgaatctg	acttacgcca
agtaccattg π	agttgtgcgt	.gggggaccca	gagattaaaa	agacttcctt
tctggaggcc	cťcttgtgtg	taacaaggtg	gcccagggca	ttgtctccta
aatggcatgc n	ctccacgagc	ctgcaccaaa	gtctcaagct	ttgtacactg
accatgaaac 0 ctctggagcc	gctactaact	acaggaagca	aactaagccc	ccgctgtaat
aagtccagat	ttacactggg	agaggtgcca	gcaactgaat

tgcaatcatc 60 gatctgggat 120 gctgacagct 180 caaggaacag 240 ctataatcct 300 gcggaccaga 360 gcagacatgc 420 actacaagag 480 ttatťacgac 540 taagggggac 600 tggacgaaac 660 gataaagaaa 720 gaaacacctt 780 aaa

833 • ·

4 4 4 • 4 4 4 4 • 4 4 4 4 • 4 4 4

4 4 4 4 · · 4

4 4 4

4 4 4 4

4 4 4 (2) Informace o SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 114 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(íí) DRUH MOLEKULY: DNA, zesilovací oblast 3: -234 až 120 promotoru TNF-alfa (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

gcagggagga tggggagtgt gaggggtatc cttgatgctt gtgtgtcccc aactttccaa 60 □ atccccgccc ccgcgatgga gaagaaaccg agacagaagg tgcagggccc acta 114 □

(2) Informace o SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 169 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: DNA, zesilovací oblast 4: -234 až 65 promotoru TNF-alfa (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

gcagggagga tggggagtgt gaggggtatc cttgatgctt gtgtgtcccc aactttccaa 60 atccccgccc ccgcgatgga gaagaaaccg agacagaagg tgcagggccc actaccgctt 120 □ cctccagatg agctcatggg tttctccacc aaggaagttt tccgctggt □

169 • · ·· (2) Informace o SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2 270 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: DNA, chimerový gen: -706TNFpGB3'UTR (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

ctcgagtcct tggaagccaa gactgaaacc agcattatga gtctccgggt cagaatgaaa 60 0 gaagaaggcc tgccccagtg gggtctgtga attcccgggg gtgatttcac tccccggggc 120 O

tgtcccaggc C aagcccccag □ ttttccctcc □ ttctagttct □ ctggtcccca Γ!	ttgtccctgc	tacccccacc	cagcctttcc	tgaggctcaa	gcctgccacc	180
ctccttctcc	ccgcagggac	ccaaacacag	gcctcaggac	tcaacacagc	240
aaccccgttt	tctctccctc	aaggactcag.	ctttctgaag	cccctcccag	300
atctttttcc	tgcatcctgt	ctggaagtta	gaaggaaaca	gaccacagac	360
aaagaaatgg	aggcaatagg	ttttgagggg	catggggacg	gggttcagcc	420
tccagggtcc □ gggaggatgg □ cccgcccccg· π	tacacacaaa	tcagtcagtg	gcccagaaga	cccccctcgg	aatcggagca	480
ggagtgtgag	gggtatcctt	gatgcttgtg	tgtccccaac	tttccaaatc	540
cgatggagaa	gaaaccgaga	cagaaggtgc	agggcccact	accgcttcct	600
u. ccagatgagc p	tcatgggttt	ctccaccaag	gaagttttcc	gctggttgaa	tgattctttc	660
cccgccctcc n	tctcgcccca	gggacatata	aaggcagttg	ttggcacacc	cagccagcag	720
acgctccctc n	agcagatcta	tgcaaccaat	cctgcttctg	ctggccttcc	tcctgctgcc	780
cagggcagat □	gcaatcatcg	ggggacatga	ggccaagccc	cactcccgcc	cctacatggc	840

• · ttatcttatg atctgggatc agaagtctct gaagaggtgc ggtggcttcc tgatacaaga 900 □ cgacttcgtg ctgacagctg ctcactgttg gggaagctcc ataaatgtca ccttgggggc 960 □ ccacaatatc aaagaacagg agccgaccca gcagtttatc cctgtgaaaa gacccatccc 1020 □ ccatccagcc tataatccta agaacttctc caacgacatc atgctactgc agctggagag 1080 □ aaaggccaag cggaccagag ctgtgcagcc cctcaggcta cctagcaaca aggcccaggt 1140 □ gaagccaggg cagacatgca gtgtggccgg ctgggggcag acggcccccc tgggaaaaca 1200 □ ctcacacaca ctacaagagg tgaagatgac agtgcaggaa gatcgaaagt gcgaatctga 1260 □ cttacgccat-tattacgaca gtaccattga gttgtgcgtg ggggacccag agattaaaaa 1320 í

gacttccttt aagggggact ctggaggccc tcttgtgtgt aacaaggtgg cccagggcat 1380 □ tgtctcctat ggacgaaaca atggcatgcc tccacgagcc tgcaccaaag tctcaagctt 1440 □ tgtacactgg ataaagaaaa ccatgaaacg ctactaagaa ttctctagag gaggacgaac 1500 □ atccaacctt cccaaacgcc tcccctgcce caatcccttt attaccccct ccttcagaca 1560 Π ccctcaacct cttctggctc aaaaagagaa ttgggggctt agggtcggaa cccaagctta 1620 □ gaactttaag caacaagacc accacttcga aacctgggat tcaggaatgt gtggcctgca 1680 □ cagtgaagtg ctggcaacca ctaagaattc aaactggggc ctccagaact cactggggcc 1740 □ tacagctttg atccctgaca tctggaatct ggagaccagg gagcctttgg ttctggccag 1800 □ aatgctgcag gacttgagaa gacctcacct agaaattgac acaagtggac cttaggcctt 1860 □ cctctctcca gatgtttcca gacttccttg agacacggag cccagccctc cccatggagc 1920 □

cagctccctc p	tatttatgtt	tgcacttgtg	attatttatt	atttatttat	tatttattta	1980
L tttacagatg p	aatgtattta	tttgggagac	cggggtatcc	tgggggaccc	aatgtaggag	2040
Li ctgccttggc p	tcagacatgt	tttccgtgaa	aacggagctg	aacaataggc	tgttcccatg	2100
L tagccccctg p	gcctctgtgc	cttcttttga	ttatgttttt	taaaatattt	atctgattaa	2160
L gttgtctaaa □ caggggagtt	caatgctgat	ttggtgacca	actgtcactc	attgctgagc	ctctgctccc	2220
gtgtctgtaa	tcgccctact	attcagtggc	gagatctaga		2270

□ • · (2) Informace o SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2 570 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: DNA, -1005TNFpGB3'UTR (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:

ctcgagggcg π	ggggtcaggg	agctcctggg	agatatggcc	acatgtagcg	gctctgagga	60
LJ atgggttaca π	ggagacctct	ggggagatgt	gaccacagca	atgggtagga	gaatgtccag	120
u ggctatggaa	gtcgagtatg	gggacccccc	cttaacgaag	acagggccat	gtagagggcc	180
ccagggagtg ΓΊ	aaagagcctc	caggacctcc	aggtatggaa	tacaggggac	gtttaagaag	240
t_! atatggccac π	acactggggc	cctgagaagt	gagagcttca	tgaaaaaaat	cagggacccc	300
LJ agagttcctt π	ggaagccaag	actgaaacca	gcattatgag	tctccgggtc	agaatgaaag	360
LJ aagaaggcct □ gtcccaggct π	gccccagtgg	ggtctgtgaa	ttcccggggg	tgatttcact	ccccggggct	420
tgtccctgct	acccccaccc	agcctttcct	gaggcctcaa	gcctgccacc	480
u aagcccccag π	ctccttctcc	ccgcagggac	ccaaacacag	gcctcaggac	tcaacacagc	540
LJ ttttccctcc π	aaccccgttt	tctctccctc	aaggactcag	ctttctgaag	cccctcccag	600
Li ttctagttct π	atctttttcc	tgcatcctgt	ctggaagtta	gaaggaaaca	gaccacagac	660
u ctggtcccca □ tccagggtcc H	aaagaaatgg	aggcaatagg	ttttgagggg	catggggacg	gggttcagcc	720
tacacacaaa	tcagtcagtg	gcccagaaga	cccccctcgg	aatcggagca	780
U gggaggatgg Π	ggagtgtgag	gggtatcctt	gatgcttgtg	tgtccccaac	tttccaaatc	840

S}'jj

9 • 0

0

0 • ·

cccgcccccg	cgatggagaa	gaaaccgaga	cagaaggtgc	agggcccact	accgcttcct
ccagatgagc Π	tcatgggttt	ctccaccaag	gaagttttcc	gctggttgaa	tgattctttc
u.1 cccgccctcc Π	tctcgcccca	gggacatata	aaggcagttg	ttggcacacc	cagccagcag
Ua acgctccctc Π	agcagatcta	tgcaaccaat	cctgcttctg	ctggccttcc	tcctgctgcc
cagggcagat	gcaatcatcg	ggggacatga	ggccaagccc	cactcccgcc	cctacatggc
ttatcttatg Π	atctgggatc	agaagtctct	gaagaggtgc	ggtggcttcc	tgatacaaga
cgacttčgtg r~	ctgacagctg	ctcactgttg	gggaagctcc	ataaatgtca	ccttgggggc
L_ ccacaafcatc	aaagaacagg	agccgaccca	gcagtttatc	cctgtgaaaa	gacccatccc
L_i ccatccagcc	tataatccta	agaacttctc	caacgacatc	atgctactgc	agctggagag
L_' aaaggccaag	cggaccagag	ctgtgcagcc	cctcaggcta	cctagcaaca	aggcccaggt
gaagccaggg	cagacatgca	gtgtggccgg	ctgggggcag	acggcccccc	tgggaaaaca
ctcacacaca	ctacaagagg	tgaagatgac	agtgcaggaa	gatcgaaagt	gcgaatctga
cttacgccat	tattacgaca	gtaccattga'	gttgtgcgtg	ggggacocag	agattaaaaa
u gacttccttt	aagggggact	ctggaggccc	tcttgtgtgt	aacaaggtgg	cccagggcat
tgtctcctat	ggacgaaaca	atggcatgcc	tccacgagcc	tgcaccaaag	tctcaagctt
tgtacactgg n	ataaagaaaa	ccatgaaacg	ctactaagaa	ttctctagag	gaggacgaac
LJ atccaacctt Π	cccaaacgcc	tcccctgccc	caatcccttt	attaccccct	ccttcagaca
Lj ccctcaacct n	cttctggctc	aaaaagagaa	ttgggggctt	agggtcggaa	cccaagctta
L_ gaactttaag	caacaagacc	accacttcga	aacctgggat	tcaggaatgt	gtggcctgca
cagtgaagtg	ctggcaacca	ctaagaattc	aaactggggc	ctccagaact	cactggggce
tacagctttg n	atccctgaca	tctggaatct	ggagaccagg	gagcctttgg	ttctggccag
aatgctgcag τη	gacttgagaa	gacctcacct	agaaattgac	acaagtggac	ctťaggcctt
LJ cctctctcca □ cagctccctc n	gatgtttcca	gacttccttg	agacacggag	cccagccctc	cccatggagc
tatttatgtt	tgcacttgtg	attatttatt	atttatttat	tatttattta
L_l tttacagatg π	aatgtattta	tttgggagac	cggggtatcc	tgggggaccc	aatgtaggag
LJ ctgccttggc □ tagccccctg □ gttgtctaaa π	tcagacatgt	tttccgtgaa	aacggagctg	aacaataggc	tgttcccatg
gcctctgtgc	cttcttttga	ttatgttttt	taaáatattt	aťctgattaa
caatgctgat	ttggtgacca	actgtcactc	attgctgagc	ctctgctccc
LJ caggggagtt	gtgtctgtaa	tcgccctact	attcagtggc	gagatctaga

□

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

2220

2280

2340

2400

2460

2520

2570

Claims (18)

1.. Molekula chimerové nukleové kyseliny, která zahrnuje: alespoň jednu zesilovací oblast promotoru TNFa, která je připojená k tomuto promotoru, zesilovací oblast obsahující nukleovou kyselinu SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 nebo konzervativní substituci nebo její aleové varianty, přičemž promotor TNFa je dále zachycen na sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje protein granzym B nebo konzervativní substituci nebo její alelické varianty, které jsou naopak dále připojeny na sekvenci 3'UTR nukleové kyseliny.

2. Molekula chimerové nukleové kyseliny podle nároku 1, kde je přítomno dvě až pět zesilovacích oblastí promotoru TNFa a kde.libovolná ze zesilovacích oblastí zahrnuje SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 12 nebo jejich kombinace.

3. Molekula chimerové nukleové kyseliny podle nároku 2, kde promotor TNFa obsahuje nukleovou kyselinu SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 nebo konzervativní substituci nebo její alelické varianty.

4. Molekula chimerové nukleové kyseliny podle nároku 1, kde sekvence molekuly nukleové kyseliny se vybrala ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 a konzervativní substituci nebo jejich alelické varianty.

5. Molekula chimerové nukleové kyseliny podle nároku 1, kde se 3'UTR ligovala po směru exprese sekvence nukleové kyseliny granzymu B.

6. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se tím, že obsahuje molekulu chimerové nukleové kyseliny podle nároku 1.

7. Způsob léčby zánětlivých stavů, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje aplikaci pacientovi, který potřebuje • 4 44 44 ·· 44 · 9 9 4

4 4 * 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 • 44 444 44 44 takovou léčbu, farmaceuticky účinné' množství prostředku podle nároku 6.

8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že zánětlivý stav se vybral ze skupiny zahrnující revmatoidní artritidu, roztroušenou sklerózu, Guillain-Barrův syndrom, Crohnovu nemoc, ulcerativní kolitidu, lupénku, lupus erythematodes, odmítnutí štěpů, cukrovka se závislostí na inzulínu, psoriatická artritida, sarkoidóza, hypercitlivá pneumonitida, ankylozující spondylitida, Reiterův syndrom a generalizovaná skleróza.

9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že zánětlivý stav je revmatoidní artritida.

10. Způsob konstrukce molekuly chimérové nukleové kyseliny, vyznačující se tím, že alespoň jeden zesilovač promotoru TNFa je připojen k funkční kopii minimálního promotoru TNFa připojeného alespoň k jedné kopii molekuly nukleové kyseliny vyvolávající apoptózu, která je dále připojena k sekvenci nukleové kyseliny TNFa-3'UTR, kde exprese nukleové kyseliny vyvolávající apoptózu je řízena promotorem TNFa, přičemž uvedený způsob zahrnuje:

a) amplifikaci molekuly nukleové kyseliny zahrnující promotor TNFa polymerázovou řetězovou reakci za použití primerů, které obsahují deleční konstrukce promotoru TNFa,

b) klonování nukleové kyseliny amplifikované PCR získané podle popisu v odstavci a) proti směru exprese od sekvence reportní nukleové kyseliny, přičemž vzniká konstrukce,

c) testování konstitutivní nebo indukovatelné exprese konstrukcí získaných podle popisu v odstavci b) v alespoň jedné buněčné linii, která produkuje TNFa,

d) výběr promotoru TNFa odpovědného za indukovatelnou expresi reportní molekuly v buněčné linii,

e) PCR amplifikace oblastí promotoru TNFa, která zesiluje expresi reportní molekuly, přičemž se získá zesilovač, a * ·

I · · <

» fcfc 4 fcfc fcfc » · · · · » fcfc 4 • · » 4 ·* »· ligace alespoň jedné kopie zesilovače proti směru exprese od promotoru,

f) začlenění alespoň jedné kopie molekuly nukleové kyseliny vyvolávající apoptózu po směru exprese od promotoru TNFa tím, že se nahradí promotor delečními konstrukcemi nukleové kyseliny, která vyvolává apoptózu a

g) PCR amplifikace TNFa-3'UTR a ligace po směru exprese molekuly nukleové kyseliny vyvolávající apoptózu, přičemž se získá molekula nukleové kyseliny.

11. Způsob podle . nároku 10, vyznačuj ící se tím, že dvě nebo více kopií zesilovače se začlenily proti směru exprese od promotoru.

12. Způsob podle nároku 10, vyznačuj ící se tím, že sekvence reportní nukleové kyseliny je luciferáza.

13.

se tím,

14. Způsob se tím, že

15. Způsob se tím, že

Způsob podle nároku 10, vyznačuj ící ž e zesilovač obsahuje sekvenci vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 12.

podle nároku 13, vyznačuj ící nukleová kyselina vyvolávající apoptózu je granzym B nebo konzervativní substituce nebo jeho alelické varianty.

podle nároku 10, vyznačující molekula chimerové nukleové kyseliny se vybrala ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 a konzervativní substituci nebo její alelové varianty.

16. Způsob podle nároku 10, vyznačuj ící se tím, že buněčné linie vhodné pro testování konstrukcí se vybraly ze skupiny zahrnující T lymfoblastoidní, myelomonocytické, monocytické buňky, fibroblasty, kulltivované lidské synoviocyty a primární buňky, které se vyskytují u RA.

17. Způsob testování dominantních vyznačující se tím, že negativních genů, zahrnuje transfekci

4 4 sekvenci obsahující podle nároku 1 a výběr buněk, které • 4 44 • 4 4 • · 4

94 44

4 » « 4 » 4 4 <

» 4 4 4 ► ·· a »* *· populace buněk, které neprodukují TNFa, molekulu chimerové nukleové kyseliny stimulaci exprese začleněné sekvence a přežily a obsahují dominantní negativní geny.

18. Způsob podle nároku 17, vyznačuj ící se tím, že sekvence obsahuje molekulu chimerové nukleové kyseliny podle nároku 2.