CZ306199A3 - Chimérní gen - Google Patents

Abstract

Terapeutické indukce apoptózy u aktivovaných zánětlivých buněk nebo buněk v místě zánětu lze dosáhnout zavedenímdo těchto buněk chimémího genu ohsahujícího gen indukující apoptózu řízený promotoreminducibilního genu aktivovaného při zánětu a zesilující oblast promotoru, čúiě se dosáhne selektivního působení na zánětlivé buňky. Vjednomprovedení obsahuje chimérní gen alespoňjednu zesilující oblast promotoru TNFa připojenou k funkční kopii minimálního TNFa a dále připojenou k alespoňjedné kopii genu indukujícího apoptózu, přičemž exprese genuje řízena promotoremTNFa. Připojení může být přímé, ve větší nebo menší vzdálenosti nebo kombinované. Příklady genů indukujících apoptózujsou například kaspáza 3, kaspáza 4, kaspáza 5, granzymB. Chimérní gen TNFp-AIGse exprimuje s výhodou pouze utěch buněk, které produkují zánětlivý cytokin, TNFa. Navíc také sekvestruje chimérní gen TNFp-AIGinducibilní transkripční faktoryTNFp, čímž snižuje endogenní produkci TNFa. Způsob výroby a použití chimémích genů způsobujících samovolně řízenou apoptózu a farmaceutických prostředků sjejich obsahempro léčení zánětlivých onemocnění.

Description

Chimérní gen

Oblast techniky

Vynález se týká terapeutické indukce apoptózy u zánětlivých buněk zavedením genu, který indukuje apoptózu (naprogramovanou smrt buňky nebo nenekrotickou smrt buňky) do těchto buněk. Gen indukující apoptózu (Apoptosis-lnducing Gene, bude také označován jako AIG) je řízen promotorem TNFa (TNFp) nebo jiným inducibilním genem aktivovaným při zánětu. V jednom provedení se apoptóza selektivně indukuje u těch buněk, které jsou schopné produkovat

TNFa. Gen TNFp-AIG nebo jiný chimérní gen může být pohodlně zaveden in vivo použitím běžných technik genové terapie. V provedení, kde chimérním genem je TNFp-AIG je exprimován pouze u těch buněk, které produkují zánětlivy^yťokiřTTNFaTTšIavíčrproťože· chimérní gen TNFp-AIG obsahuje prvky promotoru TNFa, sekvestruje také inducibilní, TNFp-selektivní transkripční faktory. Tato sekvestrace vede ke snížení endogenní produkce TNFa. Předkládaný vynález se týká zvláště genu TNFp-AIG a podobných genových konstruktů, buněk obsahujících chimérní geny, způsobů indukce apoptózy u buněk transfekovaných chimérními geny, farmaceutických prostředků

2o obsahujících chimérní geny, způsobů selekce in vitro variant somatických buněk neprodukujících TNFa mezi populací buněk produkujících TNFa apod., a způsobu identifikace dominantně negativních/dominantně supresivních genů odpovědných za inhibici produkce TNFa.

Dosavadní stav techniky

Při mnoha zánětlivých stavech se v nadbytku.produkují cytokiny jako IL-1, IL-10, GM-CSF a TNFa jako důsledek masívní agregace • ·

- 2 a akumulace zánětlivých buněk (Brennan F. M. a další, British Medical Bulletin 1995, 51/2, 368 - 384). Regulace způsobující nadměrnou produkci a/nebo nedostatečná regulace cytokinů v zánětlivé tkáni může být přímo nebo nepřímo odpovědná za vypuknutí chronických zánětlivých onemocnění. Například nejvýznamnější patologické změny při revmatoidní artritidě (RA) se vyskytují v místě lokálního zánětu (například synoviální klouby). Proto je pravděpodobné, že cytokiny produkované v synoviálních kloubech pacientů s revmatoidní artritidou mají důležitou úlohu při postupu onemocnění. Předpokládá se, že za io devastující destrukce chrupavky a erozi kostí, které charakterizují revmatoidní artritidu, jsou z těchto cytokinů odpovědné IL-1 a TNFa (Dayer J. M. a další, J. Exp. Med., 1985, 162, 1208 - 1215; Gowen M. a další, Nátuře, 1983, 306, 378 - 380). Přítomnost nadbytečných množství IL-1 a TNFa v synoviálních kloubech podle výzkumů

Iš iJřyčlTlijje^_vývojkolagenem“indukované-artritidy-u -hlodavGŮ-CBfennan-P.

M. a další, Clin. Exp. Immunol. 1994, 97/1, 1 - 3). Nadměrná množství TNFa a IL-1 se vytvářejí v synoviální tkáni u řady typů buněk ve spojení chrupavka - pannus včetně buněk makrofágové linie, synoviocytů podobných makrofágům, aktivovaných T-buněk a možná i synoviocytů podobných fibroblastům (Chu C. Q. a další, Arthritis & Rheumatism, 1991, 34, 1125 - 1132; Deleuran B. W. a další, Arthritis & Rheumatism, 1992, 35, 1170 - 1178).

Navíc k výše popsaným účinkům při zánětech hraje TNFa všudypřítomnou a klíčovou úlohu v řadě událostí předcházejících zánětům, jako je indukce aktivity IL-1 v monocytech. Ve skutečnosti se ukázalo, že neutralizační protilátky proti TNFa snižují celkovou produkci IL-1 (Portillo a další, Immunol., 1989, 66, 170 - 175; Brennan F. M. a další, British Medical Bulletin, 1995, 51/2, 368 - 384). Další prospěšnou vlastností navíc k blokování účinku zánětlivého cytokinů

TNFa je snížení produkce stejně destruktivního mediátoru předcházejícího zánětům, IL-1. Navíc je dobře známo, že TNFa je • ·

	• ·			• ·
•	• ·			•	• ·
e	e e ·			• · ·	•
•	• ·				•
	• ·	• · ·	• · ·	• ·

- 3 aktivátor transkripce jiných genů souvisejících se záněty. Například přítomnost TNFa stimuluje produkci jiných cytokinů (jako GM-CSF) a receptorů buněčného povrchu včetně HLA antigenů třídy II a adhezních molekul (Alvaro-Garcia J. M. a další, J. Exp. Med., 1989, 146, 865 - 875), což vede k trvalé tvorbě aktivovaných T-buněk a neutrofilů, které způsobují synoviální zánět a hyperplasii a nakonec zvýšenou destrukci chrupavky a kosti (Allen J. B., J. Exp. Med., 1990, 171, 231).

Konvenční terapie zaměřená proti zánětlivým onemocněním směřuje typicky proti symptomatickému zánětu. Tyto terapie poskytují pouze dočasné zmírnění, aniž by výrazně oddálily postup nemoci. Naopak způsoby léčení, jejichž cílem je TNFa a další faktory indukované při zánětlivém procesu jsou pravděpodobně slibnější. Například u zvířecích modelů artritidy indukované kolagenem protilátka proti TNFa a rozpustná chimérická molekula ŤNFa receptor-lgG účinně snižovaly otok tlapky, postižení kloubů a destrukci chrupavky a kosti (Williams R. O., a další, Proč. Nati. Acad. Sci., 1992, 89, 9784 - 9788). Pokusy na lidech s použitím jak humanizovaných protilátek proti TNFa a chimérních molekul receptor TNFa-lgG poskytly dramatické výsledky (Elliot M. J. a další, Arthritis and Rheumatism, 1993, 36, 1681 - 1690; Elliot M. J. a další, Lancet, 343, 1105 - 1110). Ačkoliv se zdá, že léčení těmito antagonisty TNFa je dobře snášeno, vede také ke tvorbě protilátek proti rekombinantním proteinům. Tyto způsoby léčení tedy nemusí být vhodné pro dlouhodobé léčení a nedosáhne se s nimi opravdového potlačení nemoci. Aby bylo dosaženo skutečné změny postupu onemocnění, TNFa musí být trvalým cílem s využitím způsobů léčení zaměřených na TNFa. Takový terapeutický protokol je s uvedenými biologickými prostředky nepraktický a bylo by obtížné provádět dlouhodobé podávání.

Další možností léčení je chirurgické odstranění zaníceného synovia (Herold N. a Schroder H. A., Acta Orthop. Scand., 1995, 66,

252 - 254; Ogilvie-Harris D. J. a Weisleder L., Arthroscopy, 1995, 11, 91 - 95), chemicky (Cruz-Esteban C. a Wilke W. S., Bailliere’s Clinical Rheumatol., 1995, 9, 787 - 801) nebo radiačně indukovaná synovektomie (Cruz-Esteban C. a Wilke W. S., Bailliere’s Clinical s Rheumatol., 1995, 9, 787 - 801). Výsledky po artroskopické chirurgické synovektomii jsou dobré a vykazují zlepšení od předoperačního k pooperačnímu stavu. Nechirurgická synovektomie se provádí použitím různých chemických činidel jako je kyselina osmiová, alkylační činidla jako je Mechlorethamin (nitrogen io mustard, Mustargen®) a thiotepa, methotrexát. Nechirurgické způsoby provádění synovektomie (včetně chemických a radiačních) jsou však komplikované, poskytují pouze krátkodobou úlevu a pouze místní snížení synoviální hyperpíasie. Navíc je většina nechirurgických alternativ potenciálně teratogenních. Chemické poškození postižené rs—tkáně—při—nechirurgické—synovektomii—stejně_jako__chirurgicky indukované poškození tkáně navíc často způsobuje zánětlivé odezvy na tato poškození samotná. Nakonec je třeba uvést, že tyto postupy přinášejí rizika vedlejších účinků běžně související s konvenční farmaceutickou terapii a invazívními chirurgickými postupy včetně vysokých nákladů a nepohodlí hospitalizace a rehabilitace.

Existuje tedy stále potřeba účinných léčebných postupů zánětlivých onemocnění obecně a revmatoidní artritidy zvláště.

Podstata vynálezu

Tento vynález umožňuje předcházet nevýhodám spojeným s dosavadními způsoby léčby zánětlivých onemocnění použitím nového přístupu k léčbě. Podle jednoho provedení předkládaného vynálezu se v zánětlivých buňkách produkujících TNFa selektivně indukuje apoptóza, což způsobí destrukci těchto buněk bez související

3o zánětlivé reakce.

Jedním předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí způsobu léčení, který zahrnuje krok zavedení chimérního genu ¹ obsahujícího samoregulující gen indukující apoptózu (AIG). Produkce

AIG je řízena promotorem jako je promotor TNFa (TNFp; viz obr. 1 a

2) a s výhodou zesilující sekvencí promotoru. Proto je exprimován ve všech a pouze v těch buňkách, které jsou schopné produkovat TNFa.

Dalším předmětem vynálezu je poskytnutí TNFp-AIG a podobných chimérních genových konstruktů, způsobu jejich výroby, způsobů jejich použití a prostředků s jejich obsahem.

io Dalším předmětem vynálezu je způsob indukce apoptózy u buněk transfekovaných chimérním genem TNFp-AIG, způsob selekce variant somatických buněk neprodukujících TNFa in vitro v populaci, způsob identifikace dominantních/negativních genů ___odpovědných za vytvoření populace buněk neprodukujících TNFa a způsob identifikace produktů odpovědných za regulaci tvorby TNFa (obr. 10).

Tyto a další předměty budou zřejmé osobám s běžnými znalostmi v oboru na základě následujícího podrobného popisu vynálezu.

Tento vynález je založen na důkazech, že apoptóza zánětlivých buněk určitých zánětlivých onemocnění je terapeuticky prospěšná. Vynález se konkrétně týká genovou terapií samovolně řízené ' apoptózy. Podrobněji řečeno, při provedení vynálezu je připojen \j chimérní gen obsahující alespoň jednu zesilující sekvenci promotoru připojenou na alespoň jednu funkční kopii minimálního promotoru, kde promotorem je gen nebo kombinace genů aktivovaných v zánětlivých buňkách nebo v buňkách přítomných v místě zánětu, na alespoň jednu kopii genu indukujícího apoptózu (AIG) takovým způsobem, že exprese genu indukujícího apoptózu je řízena promotorem, a tím je zaměřena proti zánětlivým buňkám. Příklady promotorů inducibilních genů aktivovaných při zánětu jsou bez omezení cytokiny, interleukiny

• · • · · · • · · ·

A.

a jejich receptory, molekuly buněčné adheze a jejich ligandy, chemokiny a jejich receptory, enzymy předcházející zánětu apod. Chimérní geny podle vynálezu obsahují zesilující sekvenci (enhancer), promotor a prvky AIG v přímém, vzdálenějším nebo bližším uspořádání a jejich kombinace. Jak je uvedeno výše a jak bude podrobněji popisováno dále, v některých provedeních se pro maximální účinek používá větší počet kopií zesilující sekvence, promotoru a/nebo AIG.

Aby bylo možno lépe porozumět předkládanému vynálezu, je uveden následující podrobný popis pouze pro účely ilustrace s důrazem na chimérní geny obsahující alespoň jednu zesilující sekvenci promotoru TNFa připojenou na alespoň jednu funkční kopii minimálního promotoru TNFa a dále připojenou k alespoň jedné kopii AIG. Ačkoliv následující příklady používají také těchto typů konstrukcí, odborníkům v oboru bude zřejmé, že základní popisované konstrukty mohou být měněny pro získání jiných provedení, která používají produkty, způsoby, metody a prostředky podle vynálezu s jinými promotory zahrnující inducibilní geny aktivované při zánětu jako jsou typy genů uvedených výše, které mají podobné funkce využitelné jako cílové buňky v místě infekce.

Například mezi cytokiny a interleukiny použitelné jako promotory při konstrukty chimérních genů podle vynálezu patří bez omezení TNFa, TNFp, IL-1a, IL-Ιβ, IL-2, IL-6, IL-9, GM-CSF, interferon γ apod. a jejich funkční fragmenty a směsi. Mezi molekuly buněčné adheze a jejich ligandy patří bez omezení selektiny, integriny a členy třídy imunoglobulinů, jako je ICAM-1, V-CAM apod. a jejich funkční fragmenty a varianty a směsi. Mezi chemokiny a jejich receptory bez omezení patří látky ze skupiny C-X-C a C-C, jako jsou MlP-ta, MIP1 β, MCP1-4, RANTES, Mig, NAP2, IP10, Gro α-γ apod. a jejich funkční fragmenty a varianty a směsi. Enzymy předcházející zánětům jsou bez omezení COX-2, iNOS, fosfolipázy, proteázy (včetně metaloproteáz matrix) apod. a jejich funkční fragmenty a směsi.

-7 Pro objasnění následující diskuse příkladů chimérních genů TNFp-AIG podle vynálezu jsou dále uvedeny následující sekvence:

SEQ ID No. 1 je nukleotidová sekvence odpovídající úplné, referenční sekvenci promotoru lidského TNFa publikovaná v (Takashiba S., a další, Gene, 1993, 131, 307 - 308). Čísla nukleotidů používaná v této přihlášce se týkají číslování uvedené sekvence.

SEQ ID No. 2 je sekvence promotoru nativního TNFa genu, který se používal v rámci předkládaného vynálezu (-1077 nukleotidů od místa počátku* transkripce, TSS). Existuje několik odlišností ío v sekvenci TNFp u SEQ ID No. 1 a SEQ ID No. 2. Tyto rozdíly mezi nukleotidovými sekvencemi promotoru TNFa byly popsány (Takashiba

S. a další, Gene, 1993, 131, 307 - 308).

SEQ ID No. 3 je nativní sekvence minimálního promotoru TNFa

-(ntikleotidy-M^O—až-^TSST-která—obsahuje alespoň jeden zesilující prvek (místo k°; viz Pauli, U., Crit. Rev. in Eucaryotic Gene Expression, 1994, 4, 323 - 344; Rhoades K. L., a další, J. Biol. Chem., 1992, 267, 22102 - 22107; a Takashiba S. a další, Gene, 1993, 131,

307 - 308).

SEQ ID No. 4 je chimérní gen TNFp120 AIG.1 (obsahující -120 20 TNFp řídící expresi varianty genu CPP32 s odstraněnou prodoménou (kaspáza 3, publikováno v Tewari M. a další, Cell, 1955, 81 (5), 801 809, s variací V239A).

SEQ ID No. 5 je chimérní gen TNFp706 AIG.1 (obsahující úsek -706TNFp řídící expresi genu CPP32 s odstraněnou prodoménou).

SEQ ID No. 6 je TNFp1005 AIG.1 (obsahující úsek -1005 TNFp řídící expresi genu CPP 32 s odstraněnou prodoménou).

SEQ ID No. 7 je chimérní gen TNFp120 AIG.2 (obsahující úsek -120 TNFp řídící expresi genu Ty/x s vypuštěnou prodoménou). (Sekvence Ty (kaspáza 5) a Tx (kaspáza 4) jsou publikovány v článku ·

- 8 Faucheu, C. a další, Eur. J. Biochem., 236, 207 - 213, 1996; Faucheu, C., a další, EMBO J., 14, 1914 - 1922, 1995.)

SEQ ID No. 8 je chimérní gen TNFp706 AIG.2 (obsahující úsek -706TNFp řídící expresi genu Ty/x s vypuštěnou prodoménou.

SEQ ID No. 9 je gen TNFp1005 AIG.1 (obsahující oblast

-1005TNFp řídící expresi genu Ty/x s odstraněnou prodoménou).

SEQ ID No. 10 je zesilující oblast 1 (ER1) promotoru TNFa obsahující nukleotidy -1005 až -905.

SEQ ID No. 11 je zesilující oblast 2 (ER2) promotoru TNFa io obsahující nukleotidy -706 až -517.

SEQ ID No. 12 je další z vícenásobných klonovacích míst (MCS) vytvořených genetickým inženýrstvím proti směru exprese minimálního promotoru TNFa -120 v konstruktu -120pGL3.

SEQ ID No. 13 je 3’ nepřekládaná oblast (3’UTR) genu TNFa (Nedwin, G. E. a další, Nucleic Acid Research, 1985, 13, 6361 - 6373).

Prvky promotoru TNFa pro přípravu chimérního genu konstruktů podle tohoto vynálezu jsou zvoleny z prvků, které jsou schopny indukovat expresi terapeutického genu řízeného promotorem TNFa. Tyto prvky promotoru budou dále označovány jako „inducibilní cis prvky“, „cis inducibilní prvky“ nebo „zesilující prvky“ promotoru TNFa.

Zesilující prvky mohou být fyzikálně připojeny k sekvenci minimálního promotoru nebo odděleny od minimálního promotoru propojovací (linkerovou) sekvencí, která může nebo nemusí mít jedinečná štěpící místa. Jak je tedy souhrnně uvedeno výše, zesilující prvky mohou být připojeny přímo, ve větší nebo menší vzdálenosti nebo v jakékoliv kombinaci těchto prvků k chimérním genům podle vynálezu. Ty se typicky konstruují proti směru exprese promotoru. Příklady zesilujících prvků TNFa se uvádějí v SEQ ID No. 10 a SEQ ID No. 11; je možno použít funkčních částí nebo variant a jejich • ·^:5’. .

kombinací. Mezi výhodné genové konstrukty podle předkládaného vynálezu patří konstrukty, které obsahují vícečetné kopie zesilujících prvků, tj. dvě nebo více kopií. Některá provedení mají přibližně 2 až 25, přesněji 2 až 10 a ještě přesněji 2 až 5 kopií.

Termíny „promotor TNF“, „promotor TNFa,, á „TNFp“ se používají zaměnitelně. Pokud není uvedeno jinak, označují tyto termíny celé nukleotidové sekvence odpovídající nativní minimální promotorové sekvenci TNFa připojené na jeden nebo více ve směru exprese umístěných zesilujících prvků (buď přirozeně přítomných, tj. nativních, io nebo vložených metodami genetického inženýrství v laboratořích). Příklady zahrnují bez omezení SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 a SEQ ID No. 3 a jejich funkční části, varianty a směsi. Mnoho funkčních částí a variant těchto sekvencí TNFa a jiných zde popisovaných sekvěncí sdílejí sekvenční homologii alespoň přibližně 80 % a v některých případech více než 90 % s jejich nativními a metodami genetického inženýrství získanými protějšky, které jsou však známy odborníkům v oboru a definovány v zde uvedených odkazech.

V chimérních genech a zde popisovaných způsobech mohou být použity jakékoliv geny indukující apoptózu. Genem indukujícím 20 apoptózu využitelným v chimérních terapeutických genech podle předkládaného vynálezu může být gen stejný nebo odlišný od typu genu indukujícího apoptózu přítomného v nativní sekvenci zánětlivých buněk produkujících TNFa (pokud tyto buňky apoptický gen přirozeně obsahují). Výhodné AIG jsou bez omezení geny ze skupiny rodiny 25 ICE/CED3 proteáz indukujících apoptózu Gako je kaspáza-1 (ICE), hlCE, ICE-LAP45, Mch2a), kaspáza-2 (ICH1), kaspáza-3 (CPP32, Yama, Apopain), kaspáza-4 (TX, ICH2, ICE rel II), kaspáza-5 (ICE rel III, TY), kaspáza-6 (Mch-2), kaspáza-7 (Mch-3, ICE-LAP3, CMH-1), kaspáza-8 (MACH, FLICE, Mch-5), kaspáza-9 (ICE-LAP6, Mch6) 30 a kaspáza-10 (Mch4), geny z rodiny granzymů (jako je granzym A a granzym B), ligand Fas (FasL) a jejich funkční části, varianty

• ·	·· ·	• · ·	• ·
•
•	•	• ·	•	•	•	• · ·
•	•	• · ·	•	•	• ··	• · · ·
•	•	• ·	•	•		• ·
··		• ·	• · ·	• · ·	• ·	• ·

a směsi. Některá provedení používají kaspázu 3, kaspázu 4, kaspázu 5, granzym B a jejich funkční části, varianty a směsi. S výjimkou FasL tyto geny při nadměrné expresi po transfekci indukují apoptózu u transfekovaných buněk (Miura M. a další, Cell, 1993, 75, 653 - 660;

Chinnayan A. M., a další, Cell, 1995, 81, 505 - 512; Los a další, Nátuře, 1995, 375, 81; Muzio a další, Cell, 1996, 85, 817 - 827).

V případě FasL je apoptóza indukována (buď autokrinním nebo parakrinním způsobem) pouze u těch buněk, které exprimují Fas. Proto konstrukt chimérního genu TNFp-FasL poskytuje druhou úroveň io selektivity. Další výhodou chimérního genu TNFp-FasL je selektivní cílení těch buněk v synoviu, které neexprimují TNFa (a tím neřídí expresi genu indukujícího apoptózu), ale exprimují na svém povrchu Fas. V tomto případě bude FasL exprimován buňkami, které jsou schopny produkovat TNFa, jako jsou aktivované makrofágy a T-buňky.

Tyto buňky pak budou indukovat apoptózu u buněk exprimujících Fas, jako jsou rizikové aktivované T-buňky a synoviocyty exprimující Fas.

Předkládaný vynález poskytuje novou léčebnou metodu zahrnující krok zavedení chimérního genu obsahujícího gen indukující apoptózu (AIG) řízený promotorem TNFa (TNFp) do buněk savce.

Příklady chimérních genů podle vynálezu se uvádějí jako SEQ ID No. 4, 5, 6, 7, 8 a 9; je také možno použít funkčních částí nebo variant těchto genů. Aniž by si autoři přáli být vázáni teorií, jako důsledek řízení prostřednictví TNFp se AIG exprimuje pouze v těch buňkách, které produkují zánětlivý cytokin TNFa. Proto budou jakékoli buňky exprimující TNFa samodestruktivní, zatímco buňky, které TNFa neexprimují, zůstanou neovlivněné. Tohoto způsobu může být s výhodou použito pro zacílení jakýchkoli buněk produkujících TNFa (jako jsou aktivované makrofágy, aktivované T-buňky a synoviocyty podobné makrofágům a možná i synoviocyty podobné fibroblastům) bez ohledu na typ buněk. Buňka produkující TNFa, která je cílem, může být samozřejmě buňka, která normálně nese nebo exprimuje

- 11 00 00 0 0 00 00

0 0 0 00 00 0 0 0 0

0 00 · · 0 0 0 0 • · · · · · 0 0 000 000

0000 0 0 e e

00 000 000 00 00

F nebo nenese a neexprimuje gen pro apoptózu ve své přirozené, ř nezměněné formě. Proto je možno použitím chimérních genů a způsobů podle vynálezu vysoce selektivním způsobem zničit buněčné zdroje TNFa.

Další výhodou použití chimémího genu TNFp-AIG podle předkládaného vynálezu je skutečnost, že TNFp sekvestruje transkripční faktory potřebné pro endogenní TNFp, což vede ke snížení endogenní tvorby TNFa. V jednom výhodném provedení je «· TNFp přítomen v buňkách, které jsou terapeutickým cílem, ve io značném nadbytku. To může být dosaženo zavedením vícečetných kopií transfekovaného genu do buňky. Alternativně může obsahovat chimérní gen TNFp-AIG podle předkládaného vynálezu vícečetné kopie inducibilních prvků cis promotoru TNFa. Jak je uvedeno výše, vícečetné kopie „inducibilních zesilujících prvků“ genu TNFp jsou i5 přítomny v některých provedeních chimérních genů TNFp-ÁÍG podíě předkládaného vynálezu. Zavedením vícečetných kopií inducibilních prvků cis konstruktu TNFp jsou exogenně zavedenou sekvencí sekvestrovány transkripční faktory nutné pro produkci TNFa v transfekovaných buňkách. Tento výhodný chimérní konstrukt TNFp20 AIG je charakterizován zvýšenou účinností při soutěžení o TNFpspecifické transkripční faktory ve srovnání s chimérními geny podle předpokládaného vynálezu, které obsahují pouze jediný zesilující prvek připojený k TNFp. Tento „inducibilní superpromotor“ zkonstruovaný uvedeným způsobem je schopný (1) efektivněji soutěžit o inducibilní transkripční faktory specifické pro TNFa a (2) řídit expresi ’ genu indukujícího apoptózu zvýšeným způsobem působením • mnohočetných zesilujících prvků.

Ukázalose například, že u pacientů s revmatoidní artritidou je r klinicky prospěšná synovektomie, tj. odstranění synoviální tkáně. Na |b 30 rozdíl od konvenčních a chirurgických postupů synovektomie je způsob

K léčení zaměřený na buňky popisovaný v předkládaném vynálezu • 0 «

- 12 zaměřen pouze na buňky produkující TNFa. Výhodou tedy je, že zavedení a exprese chimérního genu TNFp-AIG a následná indukce apoptózy neindukuje zánětlivou odpověď. Způsoby podle vynálezu jsou tedy poměrně selektivní a vedou k minimálnímu poškození tkáně ’ a zmenšení zánětu.

Produkty a způsoby popisované v předkládaném vynálezu jsou využitelné také pro léčení jiných zánětlivých onemocnění. Mezi tato zánětlivá onemocnění patří bez omezení roztroušená skleróza, t syndrom Guillain-Barre, Crohnova nemoc, ulcerativní kolitida, lupénka, io onemocnění způsobené reakcí hostitele na štěp, lupus erythematosus, diabetes mellitus závislá na inzulínu, psoriatická artritida, sarkoidóza, pneumonitida z přecitlivělosti, ankylózní spondylitida a příbuzné spondyloartropatie, Reiterův syndrom a systémová skleróza. Vynález tedy zahrnuje způsoby léčení zánětlivého onemocnění u pacienta indukcí apoptózy u zánětlivých buněk nebo buněk v míšte~~žánetTT u pacienta zavedením alespoň jednoho chimérního genu podle vynálezu do buněk. Toho se typicky dosahuje přípravou farmaceutického prostředku obsahujícího alespoň jeden chimérní gen podle vynálezu a typicky farmaceuticky přijatelný nosič a podávání , prostředku pacientovi standardními způsoby. V některých provedeních se farmaceutický prostředek podává přímo do místa zánětu s použitím místních, intravenózních, intraperitoneálních a podobných způsobů. Další způsoby budou diskutovány dále.

<P

Navíc k terapeutickým indikacím mohou být geny a buňky podle > 25 předkládaného vynálezu použity v řadě metod systematického prohledávání (screeningu) a selekce. U jedné takové metody je možno provádět selekci in vitro variant somatických buněk neprodukujících TNFa v rámci populace buněk produkujících TNFa zavedením

S chimérního genu TNFp-AIG do buněčné populace produkující TNFa.

Buňky produkující TNFa podléhají apoptóze. Buňky, které TNFa

I neprodukují, přežijí. Selekce těchto variant buněk obsahujících fenotyp

- 13 ·« «# • · · · · · * 9 · 99 · • · · · · ·

9· 99 ··· «

9 9 9

9 9 9 • ··· 999

9 ·« ·» pro přežití je snadnou cestou pro identifikaci buněk, které TNFa neprodukují. Takový způsob selekce může být použit pro určení exprese genů, které působí in-trans pro řízení aktivity promotoru TNFa a tím snižují produkci TNFa. Tyto geny jsou charakterizovány dominantními négativními (DN)/dominantními supresivními geny v jiných systémech (Behrends S a další, J. Biol. Chem., 1995, 270, 21109 - 21113; Zhang S a další, J. Biol. Chem., 1995, 270, 23934 23936; Watowich S. S., a další, Mol. Cell Biol., 1994, 14/6, 3535 3549).

io Při další metodě in vitro může být použit chimérní gen TNFp-AIG podle předkládaného vynálezu pro identifikaci dominantních negativních genů odpovědných za tvorbu populace buněk neprodukujících TNFa. Podle této metody se zavede do buněk produkujících TNFa chimérní gen TNFp-AIG podle předkládaného vynálezu. Kromě přítomnosti dominantního negativního genu by měly tyto buňky po aktivaci podléhat apoptóze. Proto je možno vyvodit, že přežívající varianty mají dominantní negativní gen schopný regulovat tvorbu TNFa směrem ke snížení. Tento dominantní negativní gen může být snadno identifikován vytvořením knihovny cDNA a transfekováním buněčných linií (například Jurkat a THP-1). Tyto buňky jsou buď stabilní transfektanty nebo buňky TNFp-AIG transfekované inducibilním chimérickým genem TNFp-AIG nebo genem TNF-p-luciferáza a bude prováděna jejich selekce na fenotyp vedoucí k přežití po aktivaci in vitro; fenotyp vedoucí k přežití ukazuje na vliv genů DN. V buňkách transfekovaných genem TNFp-luciferáza bude ukazovat na vliv genů DN snížení aktivity luciferázy. Dominantní negativní geny identifikované s použitím tohoto protokolu mohou být použity samy jako budoucí terapeutické prostředky. Tyto geny budou kandidáty na genovou terapii vedoucí ke snížení produkce TNFa.

Metody využívané pro přenos genů jsou uspořádány do dvou širokých kategorií:

• · • · · ·

r- 14 1. Přímý přístup: Transdukce terapeutického genu in šitu do cílových buněk jako jsou synoviocyty s použitím vhodného vektoru jako nosiče terapeutického genu. Vektor obsahující terapeutický gen se vstříkne přímo do postižené oblasti (například artritického kloubu).

2. Nepřímý přístup: Transfekce terapeutičkého genu ex vivo do cílových buněk jako jsou synoviocyty. V tomto přístupu se z kloubů vyjme synovium, synoviocyty se izolují a kultivují in vitro. Buňky kultivované in vitro se transfekují terapeutickým genem a geneticky modifikovanaé synoviocyty se transplantují zpět do synovia.

io Pro přenos in vivo bylo testováno několik vektorů na jejich schopnost dodat gen do buňky (Nita, a další, Arthritis & Rheumatism, 1996, 39/5, 820 - 828). Mezi vektory používanými pro genovou terapii jsou nejrozvinutější vektory odvozené od retrovirů. Jsou schopny vnášet genetický materiál do hostitelského genomu a produkovat stabilní transfektanty. Tyto vektory jsou však neschopné infikovat buňky, které se nedělí, a protože jsou vloženy do genomu hostitele, nelze vyloučit možnost inzerční mutageneze. Ve srovnání s těmito vektory infikují vektory odvozené z adenovirů buňky, které se nedělí i buňky, které se dělí a vkládají DNA epizomálně. Nevýhoda vektorů založených na adenovirech spočívá v tom, že tyto vektory pokračují v produkci virových proteinů v infikovaných buňkách, čímž se tyto buňky stávají potenciálně antigenní. Třetí typ vektorů založený na virech je odvozený z virů Herpes simplex (HSV), který je schopen rovněž infikovat dělící se buňky i buňky, které se nedělí.

Mezi nevirovými vektorovými systémy byly testovány kationtové lipozomy a čistá plazmidová DNA. Lipozomy jsou v nejpokročilejším stupni vývoje, ačkoliv některé typy buněk jako jsou buňky svalů a kůže, přijmou a exprimují čistou plazmidovou DNA.

Je také možný systém vnášení genů zprostředkovaný částicemi (Rakhmilevich, a další, PNAS, 1996, 93, 6291), přičemž tento přístup je do budoucnosti poměrně slibný.

• ·	• · ·	• · ·	• ·	•
•	•	• ·	•	9	•	•	•	•
β	e	9 β β	β	•	• · β	•	• ·	•
•	•	• ·	•	•		•		•
• ·		• ·	• · ·	• · ·	• ·		« ·

- 15 Pro vnášení chimérních genů podle vynálezu do genu ,,/n vivo“ mohou být použity následující protokoly:

(1) Nita, a další, Arthritis & Rheumatism, 1996, 39/5, 820 - 823

Experimenty na králících in vivo:

Každý vektor se nastříkne intraartikulárně do jednoho kolenního kloubu. Pro virové vektory se do jednoho kloubu nastříkne mezi 1Ό⁸ a 10⁹ částic suspendovaných v 0,5 ml fyziologického roztoku.

Do jednoho kolenního kloubu se nastříknou komplexy lipozom io DNA (200 nmol DC-Chol v komplexu s 20 pg DNA/ml) v 1 ml fyziologického roztoku.

(2) Methods in Molecular Medicine: Gene Therapy Protocols, Paul ^{* 15 * * * * 20}

Robbins, ed., 1997, Barr a další, str. 205 - 212

Vnášení vektoru založeného na adenoviru do hepatocytů:

hepatocyty krysy 1x10¹¹ PFU na 100 g hmotnosti zvířete.

U psů (12 - 17 kg) se promývá portální žíla přibližně 1,5x10¹¹

PFU/kg, což poskytne jednu kopii genomu adenoviru na diploidní kopii hostitelské DNA.

U králíků (2 - 4 kg) poskytne 1,5x10¹³ částic viru (1,5x10¹¹ PFU)

100 % transdukci hepatocytů; 4x10¹² částic viru poskytne 50 - 75 % transdukci.

Yang N. S., a další, 281 - 296.

Vnášení genu prostřednictvím částic zlata: transfekce kožní tkáně savce množstvím 0,1, 0,5, 1,0 a 2,5 pg DNA/mg částic poskytuje lineární úměrnost s úrovní transgenní exprese.

Nabel, a další, 297 - 305.

• · • · ·· · · · · · · • ·· ·· · · · ······ ···· · · · · • · ·· ·· · ·· · · · · ·

- 16 Vnášení genu prostřednictvím lipozomů u lidí:

Protokol 1: 15 nmol lipozomů DC-Chol/Dope kombinovaných s 1 pg DNA v 0,7 ml. 0,2 ml výše uvedené směsi se nastříkne do melanomové uzliny pacienta. Pro vnášení katétrem se do tepny nastříkne 0,6 ml roztoku.

Protokol 2: 15 nmol lipozomů DMRIE/Dope kombinovaných s 5 pg DNA v 1,0 ml.

Pro přímé intratumorové injekce se používají rozmezí koncentrací DNA od 3 pg v komplexu s 4,5 nM DMRIE/Dope do 300 pg io v komplexu s 450 nM DMRIE/Dope.

(3) Roessler, a další, 369 - 374

Přenos genu do synovia:

Používá se rozmezí dávek 10⁹ - 10¹² částic adenoviru 15 obsahujících terapeutický gen na jeden kloub. Optimální dávka pro případné konkrétní řady experimentů musí být určena empiricky a závisí jak na vlastnostech použité rekombinantní genomické kostry adenoviru, tak i na exprimovaněm cizím genu.

V případě nepřímého přístupu byla vyvinuta řada způsobů 2o včetně použití transfekce založené na kationtovém lipidu nebo kationtovém polymeru a elektroporace.

Jakákoliv z výše uváděných technik může být změněna, aby vyhovovala konkrétním potřebám odborníka v oboru. Tyto modifikace spadají do rámce znalostí odborníků s obvyklou zkušeností v oboru a nevyžadují nadměrného rozsahu experimentů. Tyto varianty jsou tedy v rámci vynálezu zřejmé.

• ·

- 17 Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 se schematické znázornění chimérních genů podle předkládaného vynálezu. Gen indukující apoptózu (AIG) může být jakýkoliv z uvedených genů, přičemž na tyto geny není omezen, viz kaspázy 1 až 10, granzym B, ligand Fas a další.

Obr. 2 je schematické znázornění výsledků genové terapie s použitím chimérních genů TNFp-AIG podle předkládaného vynálezu.

Obr. 3 je souhrnné znázornění delečních konstruktů použitých pro identifikaci inducibilních prvků cis promotoru TNFa s využitím io exprese luciferázového genu (Luc) jako reporterového systému.

Obr. 4 (a a b) ukazuje souhrn výsledků dosažených s použitím konstruktů popsaných v obr. 3. Tranzientní exprese konstruktů byla zjišťována u dvou různých buněčných linií produkujících TNFa, viz

-Jurkat^- (obr—4a)^—a-ΤΉΡ^Ι^-(obr?^-4t)j7^-HistogTamy^-v^—obou^-ohrázcfcti ukazují index stimulace jako měřítko inducibility aktivačních prostředků jako je PMA (obr. 4a) nebo LPS (obr. 4b) pro jednotlivé experimenty. Čára proložená u každého obrázku ukazuje střední míru inducibility jako průměr ze čtyř až šesti experimentů......

Obr. 5 ke schéma přípravy TNFp-AIG s použitím vybraných nativních prvků promotoru TNFa a genů AIG s odstraněnou prodoménou (použitými AIG jsou kaspáza a kaspáza 4/5).

Obr. 6 (a, b a c) ukazuje souhrn výsledků z reprezentativních experimentů prováděných pro zjištění exprese chimérních genů TNFpAIG. Apoptóza u tranzientně transfekovaných buněk Jurkat (obr. 6a a 6b) a THP-1 (obr. 6c) byla testována testem Cell Death Elisa (test CDE). Ve všech třech obrázcích znázorňují vzestupně šrafované histogramy řízení transfekce, přičemž na buňky působilo transfekční činidlo v nepřítomnosti DNA. Histogramy šrafované sestupně znázorňují prvky TNFp řízenou expresi luciferázového genu a prázdné histogramy znázorňují expresi řízenou stejnými prvky TNFp buď AIG.1 • · • · • v · — — » - — w » W «·*· 9 9 9 · 9 9 ••••99 99999999 ······· ř·· ·· «9· · 9 9 ·· ··

- 18 | nebo AIG.2. Čísla v závorkách nad prázdnými histogramy udávají / faktor obohacení (poměr apoptózy indukované TNFp-AIG k apoptóze indukované kontrolním vektorem TNFpLuc.

Obr. 7 (a a b) je diagram znázorňující chimérní gen TNFp-AIG 5 podle předkládaného vynálezu obsahující mnohočetné kopie ; inducibilních prvků cis promotoru TNFa, který zase řídí expresi AIG (obr. 7a). Na obr. 7b je ukázán diagram chimérního genu TNFp-AIG obsahující mnohočetné kopie inducibilních prvků cis promotoru TNFa, ’ řídící expresi AIG, přičemž ve směru exprese je 3’-nepřekládaná io oblast genu TNFa (TNF3’ UTR). 3’UTR genu TNFa se předpokládá při regulaci inducibilní exprese TNFa (Han, J., a další, J. Immunology, 1991, 146, 1843 - 1843, Crawford, E. K., a další, J. Biol. Chem., 1997, 272, 21120 - 21137, a obr. 9).

Obr. 8 (a a b) jsou schémata přípravy chimérních konstruktů superpromotor TNFa-AIG.

Obr. 9 znázorňuje souhrn výsledků dvou experimentů s cílem ukázat regulační účinek TNF3’UTR na inducibilní expresi luciferázového reporterového genu. Tranzientní transfekce byla prováděna ve fibroblastové buněčné linii. Tečkované histogramy znázorňují inducibilitu TNFpLuc v nepřítomnosti TNF3’UTR a prázdné histogramy znázorňují inducibilitu TNFpLuc v přítomnosti TNF3’UTR.

Podobných výsledků se dosahuje u buněk Jurkat.

------------$ - -----......... - - Obr. 10 je diagram znázorňující selekci variant somatických v buněk neprodukujících TNFa uvnitř populace buněk produkujících

TNFa a identifikaci dominantních negativních supresivních genů odpovědných za inhibici tvorby TNFa.

i

Příklady provedení vynálezu

Pro lepší porozumění předkládanému vynálezu se uvádějí následující příklady. Tyto příklady jsou pro účel ilustrace některých výhodných provedení předkládaného vynálezu a nemají být považovány za jakýmkoli způsobem omezující rozsah vynálezu.

Příklad 1

Příprava konstruktů TNFp-AIG

Pro konstrukci chimérního genu AIG, jehož exprese je řízena io zesilujícími prvky cis promotoru TNF, buď ve formě jedné kopie nebo více kopií stejné oblasti nebo různých oblastí, byla provedena identifikace zajímavých oblastí odpovědných za optimální inducibilní expresi reporterového genu.

Selekce prvků promotoru TNF-α pro konstrukci chimérního genu

Oblasti promotoru TNF-α se amplifikují polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) s použitím primerů obsahujících různé deleční konstrukty promotoru TNF-α (obr. 3). Oblasti identifikované jinými výzkumníky v různých jiných buněčných systémech se používají jako

2o reference (Rhoades, a další, J. Biol. Chem., 1992, 267, 22102 22107; Leitman, a další, Mol. Cell Biol., 1992, 12, 1352 - 1356; Pauli s⁷

U., Crit. Reviews Eukaryotic Gene Expression, 1994, 4, 323 - 344). Geny amplifikované PCR se potom klonují proti směru exprese fc reporterového genu jako je luciferáza do komerčně dostupného ť' vektoru bez promotoru. Tyto konstrukty se testují na schopnost konstitutivní a inducibilní exprese v různých buněčných liniích jako je Jurkat (T-lymfoblastoid), U973 (myelomonocytová), THP-1

I(monocytová), bi'fibroblastech a lidských synoviocytech kultivovaných í in vitro. Identifikace oblastí odpovědných za inducibilní expresi reporterového genu je primárně založena na výsledcích získaných • ·

I ²⁰ k

L pomocí dvou buněčných linií produkujících TNFa jako Jurkat (po stimulaci PMA) a THP-1 (po stimulaci LPS), obr. 4a a b. Tyto buňky se

Γ tranzientně transfekují použitím známých způsobů a komerčně dostupných činidel, jako je například DEAE dextran a Superfect. Prvky ₅ cis promotoru TNF-α, které jsou odpovědné za indueibilní expresi t reporterového genu, se potom používají pro konstrukci chimérních genů TNFp-AIG. é* ίϊΡ'

Konstrukce chimérních genů TNFp-AIG io Z popisovaných genů indukujících apoptózu jsou výhodné následující geny:

i) cysteinová proteáza - CPP32 (známá také jako Yama, apopain nebo kaspáza 3) a ii) cysteinová proteáza Tx/Ty (kaspáza 4/kaspáza 5)

Geny AlG se používají jako zkrácené geny s odstraněnou prodoménou s cílem potenciálně potlačit autokatalýzu kaspáz. To je nezbytné pro konverzi inaktivní kaspázy na aktivní formu.

CPP32 s odstraněnou prodoménou se amplifikuje použitím primerů odpovídajících kodonům 29 - 36 a 271 - 278 (278 je stop kodon). Zkrácená forma CPP32 se zde označuje jako „aCPP32“ nebo „AIG.1“.

Pro amplifikaci PCR Ty s odstraněnou prodoménou se syntetizují primery odpovídající sekvencím v genu Ty. Všechny dosud objevené kaspázy jsou homologické s jinými členy rodiny kaspáz. Primer 3’ odpovídající kodonům 359 - 365 (kodon 365 je stop kodon) má 100 % sekvenční homologii s kodony 372 - 378 (kodon 378 je stop kodon) v genu Tx. 5’ primer odpovídající kodonům 81 - 87 genu Ty však nemá 100 % homologii s odpovídající oblastí genu Tx (kodony 94 - 100 genu Tx). Zbytek 87 (alanin) v genu Ty se liší od zbytku 100 (glycin) genu Tx. Produkt amplifikovaný PCR vytvořený z cDNA

- 21 připravené z aktivovaných lidských lymfocytů periferní krve obsahuje sekvenci Tx v důsledku zjevně vyššího relativního zastoupení transkriptů Tx. Proto zkrácená forma genu AIG vytvořená s použitím syntetických oligonukleotidových primerů odpovídajících sekvencím v genu Ty samozřejmě zachovává sekvence v Tx, i když jsou obklopeny sekvencemi Ty primerů. Sekvence Ty použitých primerů se také shodují se sekvencí Tx kromě jednoho kodonu. Gen používaný v předkládaném vynálezu se tedy shoduje se zkráceným genem Tx se změněným G na A v poloze 100. Tento gen se zde označuje jako io „ATy/x“ nebo „AIG.2“.

μ AIG.1 a AIG.2 se vkládají po směru exprese promotoru TNFa náhradou luciferázového reporterového genu v delečních konstruktech š, ( -120, -706 a -1005) promotoru TNFa (obr. 5). Tyto konstrukty se | testují na indukci apoptózy po stimulaci tranzientně infikovaných buněk Jurkat a THP-1 (obr. 6a, b a c).

Konstrukce chimérních genů superpromotor TNFa-AIG

- Pomocí PGR se amplifikují dvě široké výhodné oblasti ER1(-1005 až -905) (SEQ ID No. 10) a ER2(-706 až -517) (SEQ ID 20 No. 11) promotoru TNFa obsahující prvky odpovědné za inducibilní expresi výše popsaného reporterového genu (obr. 4a a 4b), které se ligují proti směru exprese za minimální nativní promotor (-120 až TSS, SEQ ID No. 3), buď jako jediná kopie nebo jako více kopií. Ještě dvě další oblasti (-234 až -120) a (-234 až -65) promotoru TNFa jsou také 25 identifikovány jako potenciální zesilující oblast 3 (ER3) a zesilující oblast 4 (ER4), které mohou být použity v chimérních konstruktech s použitím dále popisovaných strategií. Superpromotor obsahuje větší množství (2 až 10) kazet výše uvedených oblastí obsahujících prvky inducibilního promotoru (obr. 7). To se dosahuje amplifikací PCR 30 potřebných oblastí s použitím primerů syntetizovaných s restrikčními místy vloženými na 5’-konec každého primerů. Tato jedinečná . f

l· ř

í jř· ►

r í

I

Ϊ’-22restrikční místa obklopují amplifikovaný genový produkt, kterého je zapotřebí. S výhodou se gen AIG amplifikovaný PCR klonuje po směru exprese vzhledem k TNF (superpromotor, nahrazuje luciferázový reporterový gen v původním popisovaném konstruktu) (obr. 5) pro nativní promotor TNFa.

Schémata konstrukce superpromotoru TNFa a linkerových sekvencí představujících jedinečná restrikční místa (tato restrikční místa nejsou ve vybraných úsecích promotoru TNF-α a v příslušném AIG přítomna) pro účinnou směrovou inzerci se uvádějí níže a jsou io znázorněna v obr. 8:

Schéma 1:

Krok 1: Vložení minimálního promotoru TNFa (-120 až TSS) do základního (bez promotoru) luciferázového vektoru pGL3 (Promega):

Prvky základního vektoru pGL3, které se používají pro konstrukci chimérního genu TNFp-AIG, jsou uvedeny dále.

-Kpnl.Sací. Mlul. Nhel.Smál.Xhol.Bgl II. Hindi II. [luciferáza].XbalMinimální promotor se amplifikuje PCR použitím primerů 20 obsahujících štěpící místě Xhol a Bglll.Hindi11 tak, že místo Xhol je na 5’ konci a místa Bglll.Hindlll jsou na 3’ konci amplifikovaného produktu. Tento fragment se vloží do polylinkeru základního vektoru pGL3 použitím stejných restrikčních míst. Tento konstrukt se označuje jako „konstrukt A1“ a má následující strukturu:

—ΚρηI.Sací.Mlul.NheISmalXhol.(-120 až TSSBgl11).Hind111.[luciferáza] .Xbal—

Ě'·' i

I

- 23 Krok 2: Zesilující fragment (ER1 nebo ER2) se amplifikuje PCR použitím primeru obsahujícího několik restrikčních míst. Získaný fragment bude obsahovat restrikční místa Kpnl.AatlI.BssHII na 5’ konci a místa Nsil.Spel.Mlul na 3’ konci v následujícím uspořádání:

5’Kpnl.Aatll.BssHII.(ER1 nebo ĚR2).Nsil.Spel.Mlul 3”.

Fragment se vloží do „konstruktu A1“ vytvořeného v kroku 1 pomocí restrikčních míst Kpnl a Mlul. Tento konstrukt se označuje jako „konstrukt B1“ a má následující strukturu:

io ——Kpnl.Aatll.BssHII.(ER1 nebo ER2).Nsil.Spěl.Mlul.Nhel.Smál.Xhol (-120 až TSS Bg111).Hind111.[luciferázaj.Xbal-

&'

ξΐ/

Krok 3: Zesilující fragment TNFa (ER1 nebo ER2) se amplifikuje použitím primerů obsahujících restrikční místa Aatll a

BssHII pro vytvoření následujícího produktu PCR:

5’Aatll.(ER1 nebo ER2).BssHII 3’.

Tento fragment se klonuje do „konstruktu B1 “ pomocí stejných restrikčních míst. Tento konstrukt se označuje jako „konstrukt C1“ a má následující strukturu:

-Kpnl.Aatll.(ER1 nebo ER2),BssHII.(ER1 nebo ER2).Nsil.Spěl.

Mlul.Nhel.Smál.Xhol (-120 až TSS Bg111).Hind111.[luciferázaj.XbalKrok 4: Zesilující fragment TNFa (ER1 nebo ER2) se 25 amplifikuje použitím primerů obsahujících restrikční místa Nsil a Spěl pro vytvoření následujícího produktu PCR:

5’Nsil.(ER1 nebo ER2).Spel 3’.

- 24 ·· ·· « e c « » · ·· • · · · » · · i v · · <

9 99 i

4 ·· ··

Tento fragment se bude klonovat do „konstruktu C1“ pomocí stejných restrikčních míst. Tento konstrukt se označuje jako „konstrukt D1“ a má následující strukturu:

-Kpnl.Aatll.(ER1 nebo ER2).BssHII.(ER1 nebo ER2.Nsil.Spel.

Mlul.Nhel.Smal.Xhol (-120 až TSS Bglll).Hindlll.[luciferáza].XbalKrok 5: Kódující oblasti AIG.1 nebo AIG.2 (s výhodou, ale bez omezení na AIG.1 a AIG.2; je možno použít jakéhokoliv uvedeného io AIG) se amplifikují PCR použitím primerů obsahujících restrikční místa

Bglll a Xbal za vytvoření následujícího fragmentu:

5’Bglll.(AIG.1 nebo AIG.2).Xbal 3”.

Fragment se vloží do „konstruktu D1“ „použitím_stejnýchTestrikčních míst. Výsledný konstrukt se označuje jako „konstrukt ΕΓ a má následující strukturu:

——Kpnl.Aatll.(ER1 nebo ER2).BssHII.(ER1 nebo ER2.Nsil.(ER1 nebo ER2) Spěl Mlul.Nhel.Smál.Xhol(-120 až TSS.Bglll)[AIG.1 nebo AIG.2], Xbal20 Alternativně může být schéma 2 následující:

Schéma 2

Krok 1: Stejný jako ve schématu 1, vzniká následující „konstrukt

Kpnl.Sací.Mlul.Nhel.Smal.Xhol.(-120 až TSS Bglll).Hind111.[luciferáza] .Xbal □ ·?

- 25 o ·! 3 *

3 0 >

o o·¹

3 0 O

O O 3

O 4» O «

·)

0 3

3

3»·) O l > *’ • . 3 ♦ □ O 3 O 0 0 ό

O o ·> ♦>

□ ό ‘3 4 □ «

Krok 2: Vložení dalšího MCS. / u , . ,,

I.

Syntetizuji se dva komplementární oligonukleotidy · (5’fosforylované)' použitím komerčních zdrojů za získání —Nhel.Sacll.EcorV.AflIi.AatJÍ.AvrlJ.Spel.RvullrXhol—--^r — Tyto' oligonukleotidy se,teplotně .hybridizují a’potom klonují do míst Nhel a Xhol „konstruktu A1“. Získaný konstrukt,se ^označuje jako „konstrukt B2“ a má následující strukturu:

-Kpnl. Sací. Mlul. Nhel. Sací I. EcorV.Afl II. AatlI.Avríl. Spěl. Pvull. Xhol.

(-120 až TSS Bglll).Hindlll.[luciferáza].Xbal—

Krok 3: Zesilující fragment TNFa (ER1 nebo ER2) se amplifikujej3omocí prLmeiijibLsahujXcíoh-restFikěfií-místa-SpelTPvun na 5’-konci a Xhol na 3’-konci za vytvoření následujícího produktu PCR:

5’Spel.Pvull.(ER1 nebo ER2).Xhol 3’. Tento fragment se klonuje do „konstruktu B2“ použitím restrikčních míst Spěl a Xhol. Uvedený konstrukt se označuje jako „konstrukt C2“ a má následující strukturu:

-Kpnl. Sací. Mlul. Nhel. Sací I. EcorV.Afl II. AatlI.Avríl. Spěl. Pvull. (ER1 nebo ER2)Xhol.(-120 až TSS BglIl).Hindlll.[luciferázaj.XbaUKrok 4: Zesilující fragment TNFa (ER1 nebo ER2) se amplifikuje použitím primerů s restrikčními místy AvrlI.Spel na 5’-konci a Pvull na 3'-konci za vytvoření produktu PCR: 5’ Avrll.Spěl.(ER1 nebo ER2). Pvull 3’. Tento fragment se klonuje do „konstruktu C2“ použitím restrikčních míst Avrll a Pvull. Tento konstrukt se označuje jako „konstrukt D2“ a má následující strukturu:

- 26 ·· ·· φ · ·· ·· • · · * ·· ·· · φ φ • φ «φ φ · · · · φ φφ φφ φ · φ ΦΦΦΦ· • φφφ φ · φ

Φ· φφ ··· «φφ ·Φ ·Φ

-Kpnl. Sací. Mlul.Nhel. Sací I. EcorV.Afl 11 .Aatl I. Avrl I. Spěl. (ER1 nebo

ER2)Pvull.(ER1 nebo ER2)Xhol.(-120 až TSS Bglll).Hindlll. [luciferáza].XbalTak je možno použitím této strategie přidat postupně alespoň sedm kopií zesilujících oblastí (ER1, ER2 nebo ER3, jednotlivě nebo v kombinaci) použitím dalšího restrikčního místa proti směru exprese vzhledem k předcházejícímu restrikčnímu místu při amplifikaci PCR zesilujících oblastí podle výběru.

Jakmile se přidá požadovaný počet kopií zesilujících oblastí, vloží se AIG po směru exprese vzhledem k superpromotoru. jak se popisuje v kroku 5 schématu 1.

Inducibilní exprese chimérního genu TNFp-AIG se testuje tranzientní transfekcí výše uvedených buněčných linií. Exprese genu TNFp-AIG se měří detekcí apoptózy transfekovaných buněk, testováním proteinů exprimovaných AIG pomocí westernového přenosu použitím komerčně dostupných protilátek a měřením aktivity proteázy pomocí komerčně dostupného, dobře popsaného specifického syntetického tetrapeptidového substrátu.

Inducibilní exprese chimérního genu TNFp-FasL se testuje tranzientní transfekcí stejných buněčných linií. Exprese FasL na povrchu buněk transfekovanými buňkami se kvantitativně stanoví použitím vazby protilátky proti FasL při detekci nepřímou imunofluorescencí a měřením indukce apoptózy Fas-pozitivních buněk.

Regulace exprese reporterového genu řízeného TNFp

3’ nepřekládaná oblast genu TNFa má důležitou úlohu při regulaci biosyntézy TNFa. Účastní se translační exprese genu TNFa v normálních, neaktivovaných stavech. Je důležité, že tyto prvky dovolují derepresi, jestliže jsou buňky produkující TNFa aktivovány

- 27 ΐ) V ·□ ο ο ο 3 ο $ ο os

0 0 3 3 3

0 3 0 3

3? 03 33 3

Ο 3 V 3

3 0 7 3 0

3 Ο 3 Φ

3 300 00 3

3 0

0 ΟΟ 0 3 vnějšími podněty (Han, J. a další, J. immunology, 1991, 146, 1843 1848; Crawford, F. K„ a další, J. Biol. Chem., 1996, 271, 22383 22390).

Připravují se genetické konstrukty,, ^ve kterých, je celá 3’ nepřekládaná oblast (SEQ ID No. 13) vložena ve směru translace vzhledem k luciferázovému genu řízenému delečními fragmenty, výše, -120, -706 a -1005 promotoru TNFa. Výsledky tranzientní exprese těchto konstruktů jsou souhrnně uvedeny v obr. 9.

Příklad 2

Protokoly testů

Metody in vitro

Stanovení lueiferázy: aktivita lueiferázy se stanoví pomocí komerčně dostupných činidel (Promega).

Genová exprese AIG.1 a AIG.2:

a) westernové přenosy transfekovaných buněčných lyzátů se vyvíjejí protilátkou proti CPP32 a protilátkou proti PRAP. Protilátka proti PRAP detekuje jak hydrolyzované, tak i nehydrolyzované produkty PRAP působením CPP32.

b) stanovení enzymu CPP32: tento test detekuje enzymatickou reakci CPP32 a rozpad kolorimetrického nebo fluorogenního substrátu. Pro stanovení se používá komerčně dostupného kitu (Clonotech, Pharmingen).

c) apoptóza transfekovaných buněk: apoptóza transfekovaných buněk působením AIG.1 a AIG.2 se stanovuje barvením jader propidiumjodidem (Krishan, A., J. Cell Biol., 66, 1994, 188 - 193), a komerčně dostupným kitem Cell Death Elisa (Boehringer, Mannheim).

Modely na zvířatech

Králičí model artritidy indukované IL-1 (Pettipher E. T., a další, Proč. Nati. Acad. Sci., 1086, 83, 8749 - 8753): IL-1 se nastříkne do kolenních kloubů novozélandských bílých králíků. Intraartikulární injekce IL-1 způsobí infiltraci leukocytů závislou na dávce do kloubního prostoru a ztrátu proteoglykanu z artikulární chrupavky.

Artritida indukovaná antigenem: Intraartikulární injekce antigenu (vaječný albumin) do kolenních kloubů indukuje akumulaci leukocytů to a degradaci chrupavky, která silně připomíná revmatoidní artritidu u lidí. Otok kloubu po injekci přetrvával 14 dnů.

Model lidských synoviocytů na scid-myši (Houri, J. M., a další, Current Opinions in Pheumatol., 1995, 7, 201 - 205; Sack, U., a další, J. Autoimmunity, 1995, 9, 51 - 58; Geiler, T., a další, Arthritis &

Rheumatism, 1994, 37, 1664 - 1671): nedávno byly vyvinuty modely artritidy, u kterých se implantuje čerstvá synoviální tkáň pacientů s revmatoidní artritidou s normální lidskou chrupavkou do myši scid buď podkožně, nebo do ledvinového pouzdra (Geiler T. a daiší, Arthritis & Rheumatism, 19894, 37, 1664 - 1671) nebo do kolenních kloubů (Sack, U., a další, J. Autoimmunity, 1995, 9, 51 - 58). Implantáty rostou způsobem podobným artritidě včetně tvorby tkáně pannus s vysokou hustotou buněk, erozí kosti a chrupavky, vyvinutím vícejaderných obřích buněk a invazí synoviálních fibroblastů do chrupavky.

Nepřímá metoda: synoviocyty se transfekují in vitro terapeutickým genem a transplantují zpět králíkům. U těchto králíků se indukuje artritida nastříknutím IL-1 a stanovuje se exprese terapeutického genu po aktivaci. Exprese chimérního genu indukovaná aktivací indukuje u transplantovaných buněk apoptózu.

-29 Přímá metoda: intraartikulární injekce chimérních genů. Je možno použít jakéhokoli výše popsaného způsobu vložení genů včetně čisté plazmidové DNA a vložení pomocí kationtových lipozomů. Pro použití dodávání genů pomocí virálních vektorů se chimérní geny 5 klonují do vhodných vektorů. Tyto vektory se potom modifikují delecí eukaryontního promotoru přítomného v uvedených vektorech. Potom je možno provést intraartikulární injekci terapeutických genů vložených do vhodných vektorů pro zjištění terapeutických i preventivních účinků.

r

Příklad 3

Selekce variant somatických buněk neprodukujících TNF-α '

Buňky (THP-1, Jurkat) se stabilně transfekují in vitro chimérním genem TNFp-AIG. Po několika_cyk1ech_stimiiJace,--které--indukujr apoptózu u buněk exprimujících gen TNFp-AIG, se oddělí buňky, které přežily. Z těchto buněk se vytvoří knihovna cDNA, která se použije pro funkční klonování (Legerski, R. a Peterson, C., Nátuře, 1992, 359, 70 73; Jaattela, M., a další, Oncogene, 1995, 10, 2297 - 2305). . . )

Příklad 4 \

Identifikace a charakterizace dominantních negativních (DN) genů

Buňky THP-1 a Jurkat stabilně transfekované TNFp-AIG se opakovanými cykly stimulují pro aktivaci exprese TNFp-AIG. Ty buňky, které neexprimují negativní regulační geny, podléhají apoptóze, zatímco buňky exprimující dominantní negativní geny přežívají.

U těchto buněk, které přežívají, působí produkty genu DN in-trans s promotorem TNFa, čímž se inhibují jeho aktivace pro přepis AIG, což nakonec vede k fenotypu vhodnému pro přežití. Z těchto buněk se zkonstruuje knihovna cDNA použitím polyadenylované mRNA. Geny DN, které zachraňují buňky THP-1 nebo Jurkat transfekované TNFp30 AIG od apoptózy, se identifikují funkčním klonováním, jak se popisuje

- 30 • « · · · · · · · · • · · ·· · · · ······ • · · · ·· · · • · · · · · · · · · ·· ·· pro další geny (Legerski, R. a Peterson, C., Nátuře, 1992, 359, 70 73; Jaattela, M., a další, Oncogene, 1995, 10, 2297 - 2305).

Výše uvedený popis je uveden pro poučení osob s obvyklou znalostí v oboru, jak lze provádět předkládaný vynález, a nemá podrobně uvádět všechny modifikace a variace předkládaného vynálezu, které budou odborníkům v oboru po přečtení tohoto popisu zřejmé. Předpokládá se však, že všechny tato zřejmé modifikace a variace budou spadat do rámce předkládaného vynálezu, který je definován následujícími nároky. Nároky mají pokrývat nárokované io složky a kroky v jakémkoli pořadí, které je účinné pro splnění zamýšlených cílů, pokud ze souvislosti specificky nevyplývá opak.

Uváděné citace jsou zařazeny ve svém celku odkazem.

VÝPIS SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) ŽADATEL: Revati J. Tatake, Steven D. Mariin a Randall

W. Bartoň (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Samovolně řízená apoptóza zánětlivých buněk dosažená genovou terapií (iii) POČET SEKVENCÍ: 13 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:

o (A) JMÉNO: Boehringer Ingelheim Corporation (B) ULICE: 900 Ridgebury Road, P.O.Box 368 (C) MĚSTO: Ridgefield (D) STÁT: Connecticut (E) ZEMĚ: USA |T ”(F)”PSČr06877-0368----(v) POČÍTAČOVÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: disketa 3,5”, 1,44 Mb (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: MS-DOS >o (D) SOFTWARE: Textový procesor (vi) ÚDAJE O PŘEDKLÁDANÉ PŘIHLÁŠCE (A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:

(B) DATUM PODÁNÍ:

(C) ZAŘAZENÍ DO TŘÍDĚNÍ:

(vii) ÚDAJE O PŘEDCHOZÍCH PŘIHLÁŠKÁCH:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: 60/038,266 (B) DATUM PODÁNÍ: 28. 'února 1997 (viii) INFORMACE O ZÁSTUPCI:

(A) Jméno: Robert P. Raymond 30 (B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 25089 (C) REFERENČNÍ ČÍSLO: 9/121PCT (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:

* · (A) TELEFON: 203-798-4865 (B) TELEFAX: 203-791-6183 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:1: s (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1178 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární io (ii) TYP MOLEKULY:

(A) POPIS: DNA (ix) VLASTNOST:

(A) NÁZEV/KLÍČ: Referenční promotor lidského TNFa (x) INFORMACE O ZVEŘEJNĚNÍ:

(A) AUTOŘTTTak^lTiba7S7raLdaŤš1--—----(C) ČASOPIS: Gene (D) DÍL: 131 (E) STRANY: 307 - 308 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:1:

GGGGAAGCAÁ AGGAGAAGCT GAGAAGATGA AGGAAAAGTC AGGGTCTGGA 50 GGGGCGGGGG TCAGGGAGCT CCTGGGAGAT ATGGCCACAT GTAGCGGCTC. 100 TGAGGAATGG GTTACAGGAG ACCTCTGGGG AGATGTGACC ACAGCAATGG 150 GTAGGAGÁAT GTCCAGGGCT ATGGAAGTCG AGTATCGGGG ACCCCCCCTT 200 AACGAAGACA GGGCCATGTA GAGGGCCCCA. GGGAGTGAAA GAGCCTCCAG 250 GACCTCCAGG TATGGAATAC AGGGGÁCGTT TAAGAAGATA TGGCCACACA 300 CTGGGGCCCT GAGAAGTGAG AGCTTCATGA AAAAAATCAG GGACCCCAGA 350 GTTCCTTGGA AGCCAAGACT GAAACCAGCA TTATGAGTCT CCGGGTCAGA 400 ATGAAAGAAG AAGGCCTGCC CCAGTGGTCT GTGAATTCCC GGGGGTGATT 450 TCACTCCCCG GGCTGTCCCA GGCTTGTCCC TGCTACCCCC ACCCAGCCTT 500 TCCTGAGGCC TCAAGCTGCC ACCAAGCCCC CAGCTCCTTC TCCCCGCAGA 550 CCCAAACACA GGCCTCAGGA CTCAACACAG CTTTTCCCTC CAACCCCGTT 600 TTCTCTCCCT CAAGGACTCA GCTTTCTGAA GCCCCTCCCA GTTCTAGTTC 650 TATCTTTTTC CTGCATGCTG TCTGGAAGTT AGAAGGAAAC AGACCACAGA 700 CCTGGTCCCC AAAAGAAATG GAGGCAATAG GTTTTGAGGG GCATGGGGAC 750 GGGGTTCAGC CTCCAGGGTC CTACACACAA ATCAGTCAGT GGCCCAGAAG 800 ACCCCCCTCG GAATCGGAGC AGGGAGGATG GGGAGTGTGA GGGGTATCCT 850 TGATC-CTTGT GTGTCCCCAA CTTTCCAAAT NCCCGCCCCC GCGATGGAGA 900 AGAAACCGAG ACAGAAGGŤG CAGGGCGCAC TACCGCTTCC TCCAGATGAG · 950 CTTATGGGTT TCTCCAČCAA GGAAGTTTTC CGCTGGTTGA ATGATTCTTT 1000 CCCCGCCCTC CTCTCGCCCC AGGGACATAT AAAGGCAGTT GTTGGCACAC 1050 CCAGCCAGCA GACGCTCCCT CAGCAAGGAC AGGAGAGGAC CAGCTAAGAG 1100 GGAGAGAAGC AACTGCAGAC CCCCCCTGAA AACAACCCTC AGACGCCACA 1150 TCCCCTGACA AGCTGCCAGG CAGGTTCT 1178

- 33 • 4 •4 · · · (3) INFORMACE PRO SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

s (A) DÉLKA: 1096 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY:

io (A) POPIS: DNA (ix) VLASTNOST:

(A) NÁZEV/KLÍČ: Gen lidského promotoru TNFa (x) INFORMACE O ZVEŘEJNĚNÍ:

___(A) AUTOŘI: Takashiba, S., a další · (C) ČASOPIS: Gene — (D) DÍL: 131 ;

(E) STRANY: 307 - 308 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:

GAGGCCGCCA GACTGCTGCA GGGGAAGCAA AGGAGAAGCT GAGAAC-ATGA 50

AGGAAAAGTC AGGGTCTGGA GGGGCGGGGG TCÁGGGAGCT CCTGGGAGAT 10 0

ATGGCCACAT' GTAGCGGCTC TGÁGGAÁTGG GTTACAGGAG ACCTCTGGGG 150

AGATGTGACC ACAGCAATGG GTAGGAGAAT GTCCAGGGCT ATGGAAGTCG 200

P - AG-TATGGGGA GCCCCCCTTA ACGAAGACAG GGCCATGTAG AGGGCCCCAG 250

GGAGTGAAAG AGCCTCCAGG ACČTCCAGGT ATGGAATAGA GGGGACGTTT . 3 00

AAGAAGATAT GGCCACACAC TGGGGCCCTG AGAAGTGAGA GCTTCA-TGAA 3 50 ’^r AAAAATCAGG GACCCCAGAG TTCCTTGGAA GCCAAGACTG AAACCAGCAT 4 00

TAŤGAGTCTC CGGGTCAGAA TGAAAGAAGA AGGCCTGCCC CAGTGGGGTC .4 50 TGTGAATTCC CGGGGGTGAT-TTCACTCCCC GGGGCTGTCC CAGGCTTGTC 500 ČCTGCŤACCC CCACCCAGCC TTTCCTGAGG CCTCAAGCCT GCCACCAAGC 550

CCCCAG.CTCC TTCTCCCCGC AGGGACCCAA ACACAGGCCT CAGGACTCAA 600

CACAGCTTTT CCCTCCAACC CCGTTTTCTC TCGCTCAAGG ACTCAGCTTT 650

CTGAAGCCCC TCCCAGTTCT AGTTCTATCT TTTTCCTGCA TCCTGTCTGG 700

AAGTTAGAAG GAAACAGACC ACAGACCTGG TCCCCAAAAG AAATGGAGGC 750

AATAGGTTTT GAGGGGCATG GGGACGGGGT TCAGCCTCCA GGGTCCTACA 800

CACAAATCAG TCAGTGGCCC AGAAGACCCC CCTCGGAATC GGAGCAGGGA 8 50

GGATGGGGAG TGTGAGGGGT·ATCCTTGATG CTTGTGTGTC CCCAACTTTC 9 00 CAAATCCCCG CCCCCGCGAT GGAGAAGAAA CCGAGACAGA AGGTGCAGGG 950

CCCACTACCG CTTCCTCCAG ATGAGCTCAT GGGTTTCTCC ACCAAGGAAC- 1000

TTTTCCGCTG GTTGAATGAT TCTTTCCCCG CCCTCCTCTC GCCCCAGGGA 1050

CATATAAAGG CAGTTGTTGG CACACCCAGC CAGCAGACGC TCCCTČ 1096

- 34 00 ·» « 0 · · 0 • · ··

• 00 »· ·· · 0-0 · • · 0 · '0 • · 000 000 • 0 · «·« 00 00 (4) INFORMACE PRO SEQ ID N0:3:.

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 139 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY:

(A) POPIS: DNA o (ix) VLASTNOST:

(A) NÁZEV/KLÍČ: Nativní minimální promotor TNFa (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:

OCGCTTCCTC CAGATGAGCT CATGGGTTTC TCCACCAAGG AAGTTTTCCG -eTQGTTGAAT-GATY4YTILTCC-_CCG_CCf.n^CT CTCGCCCCAC GGACATATAA AGGCAGTTGT ATGGCACACC CGCCAGCAGA CGCTCCCTC ‘

0 10 0

X3-9' (5) INFORMACE PRO SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 904 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární .. (ii) TYP.MOLEKULY:

(A) POPIS: DNA (ix) VLASTNOST:

(A) NÁZEV/KLÍČ: Chimérní gen TNFp120 AIG.1 (D) DALŠÍ INFORMACE: Zbytky 1 až 139 obsahují sekvenci promotoru; zbytky 140 až 151 obsahují sekvenci linkeru a zbylé zbytky obsahují sekvenci AIG. 1 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:

··

CCGCTTCCTC CAGATGAGCT CATGGGTTTC TCCACCAAGG AACTTTTCCG 50

CTGGTTGAAT GATTCTTTCG CCGCCCTCCT CTCGCCCCAG GGACATATAA 100

AGGCAGTTGT TGGCACACCC AGCCAGCAGA CGCTCCCTCA GCAGATCCAC 150’

CATGTCTGGA ATATCCCTGG ACAACAGTTA TAAAATGGAT TATCCTGAGA 200

TGGGTTTATG TATAATAATT AATAATAAGA ATTTTCATAA AAGCACTGGA 2S'O

ATGACATCTC GGTCTGGTAC AGATGTCGAT' GCAGCAAACC TCAGGGAAAC 300

ATTCAGAAAC TTGAAATATG AAGTCAGGAA TAAAAATGAT CTTACACGTG 350

AAGAAATTGT GGAATTGATG CGTGATGTTT CTAAAGAAGA TCACAGCAAA 400

AGGAGCAGTT TTGTTTGTGT GCTTC.TGAGC CATGGTGAAG AAGGAATAAT 450

TTTTC-GAACA AATGGACCTG TTGAGCTGAA AAAAATAACA AACTTTTTCA 500

GAGGGGATCG TTGTAGAAGT CTAACTGGAA AAGCCAAACT TTTCATTATT 550 '

CAGGCCTGCC GTGGTACAGA ACTGGACTGT GGCATTGAGA CAGACAGTGG 600

TGTTGATGAT GACATGGCGT GTCATAAAAT ACCAGTGGAG GCCGACTTCT 650

TGTATGCATA CTCCACAGCA CCTGGTTATT ATTCTTGGCG AAATTCAAAG 700

GATGGCTCCT GGTTCATCCA GTCGCTTTGT GCCATGCTGA AACAGTATGC 750

CGACAAGCTT GAATTTATGČ ACATTCTTAC CCGGGCTAAC CGAAAGGTGG 800

CAACAGAATT'TGAGTCCTTT TCCTTTGACG CTACTTTTCA TGCAAAGAAA 850 CAGATTCCAT GTATTGTTTC CATGCTCACA AAAGAACTCT ATTTTTATCA 900 CTAA. ' . * 904

-('6jH N FO RM-AO E-PRO-S RQ-LD_NO:5.:__________ __ (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1490 (B) TYP: nukleová kyselina . (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý \ (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY:

(A) POPIS: DNA (ix) VLASTNOST:

(A) NÁZEV/KLÍČ: Chimérní gen TNFp706 AIG. 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: Zbytky 1 až 724 obsahují sekvenci promotoru; zbytky 725 až 736 obsahují sekvenci linkeru a ostatní zbytky obsahují sekvenci AIG. 1 • (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:· • ·

TCCTTGGAAG

GAAAGAAGAA

TCACTCCCCG

TTCCTGAGGC

GGACCCAAAC

GTTTTCTCTC

TTCTATCTTT

AGACCTGGTC

GACGGGGTTC

AAGACCCCCC

CCTTGATGCT

AGAAGAAACC

GAGCTCATGG

TTTCCCCGCC

CACCCAGCCA

CCTGGACAAC

TAATTAATAA

GGTACAGATG

ATATGAAGTC

TGATGCGTGA

TGTGTGCTTC

ACCTGTTGAC

GAAGTGTAAC

ACAGAACTGG

GGCGTGTČAT

CAGCACCTGG

ATCCAGTCGC

TTATGCACAT

TCCTTTTCCT

TGTTTCCATG

CCAAGACTGA

GGCCTGCCCC

GGGCTGTCCC

TCAAGCCTGC

ACAGGCCTCA

CCTCAAGGAC.

TTCCTGCATC

CCCAAAAGAA

AGCCTCCAGG

TCGGAATCGG

TGTGTGTCCC

GAGACAGAAG

GTTTCTCCAC

CTCCTCTCGC

GCAGACGCTC

AGTTATAAAA

TAAGAATTTT

TCGATGCAGC

AGGAATAÁAA

TGTTTCTAAA

TGAGCCATGG

CTGAAAAAAA'

TGGAAAACCC

ACTGTGGCA7

AAAATACCAG

TTATTATTCT

TTTGTGCCAT

TCTTACGCGG

TTGACGCTAG

CTCACAAAAG

AACCAGCATT

AGTGGGGTCT

AGGCTTGTCC

CACCAAGCCC

GGACTCAACA

TCAGCTTTCT

CTGTCTGGAA

ATGGAGGCAA

GTCCTACACA

AGCAGGGAGG

CAACTTTCCA

GTGCAGGGCC

CAAGGAAGTT

CCCAGGGACA

CCTCAGCAGA

TGGATTATCC

CATAAAAGCA

AAACCTCAGG

ATGATCTTAC..

GAAGATCACA .TGAAGAAGGA

TAACAAACTT

AAACTTTTCA “TGAGACAGAC”

TGGAGGCCGA

TGGCGAAATT

TGCTGAAACA

GCTAACGGAA

TTTTCATGCA

AACTCTATTT

ATGAGTCTCC GTGAATTCCC CTGCTACCCC CCAGCTCCTT CAGCTTTTCC GAAGCCCCTC GTTAGAAGGA TAGGTTTTGA CAAATCAGTC ATGGGGAGTG AATCCCCGCC CACTACCGCT TTCCGCTGGT TATAAAGGCA TCCACCATGT TGAGATGGGT CTGGAATGAC GAAACATTCA ACGTGAAGAA GCAAAAGGAG ATAATTTTTG TTTCAGAGGG TTATTCAGGC “AGTGGTGTTG' CTTCTTGTAT CAAAGGATGG ' GTATGCCGAC AijíjTGGGAAC AAGAAACAGA TTATCACTAA

GGGTCAGAAT

GGGGGTGATT

CACCCAGCCT

CTCCCCGCAG

CTCCAACCCC

CCAGTTCTAG

AACAGACCAC

GGGGCATGGG

AGTGGCCCAG

TGAGGGGTAT

CCCGCGATGG

TCCTCCAGAT

TGAATGATTC

GTTGTTGGCA

CTGGAATATC

TTATGTATAA

ATCTCGGTGT

GAAACTTGAA

ATTGTGGAAT

CAGTTTTGTT

GAACAAATGG

GATCGTTGTA

CTGCCGTGGT

ATGATGACAT

GCATACTCCA

CTCCTGGTÍC

AAGCTTGAAT

AGAATTTGAG

TTCCATGTAT

100 150 200 250 300 3 50 400 450 500 550 600 650 7 00 . 750 800 850 900 950

100 0 1050 1100 1150

12001250 1300 1350 14 0 0 14 5 0 1490 (7) INFORMACE PRO SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1789 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY:

(A) POPIS: DNA 25 (ix) VLASTNOST:

(A) NÁZEV/KLÍČ: Chimérní gen TNFp1005 AIG.1 (D) DALŠÍ INFORMACE: Zbytky 1 až 1023 obsahují sekvenci promotoru; zbytky 1024 až 1036

- 37 - obsahují sekvenci linkeru a ostatní zbytky obsahují sekvenci AIG.1 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6:

GGCGGGGGTC AGGGAGCTCC TGGGAGATAT GGCCACATGT AGCGGCTCTG

AGGAAT.GGGT TACAGGAGAC CTCTGGGGAG ATGTGACCAC AGCAATGGGT '1

AGGAGAATGT CCAGGGCTAT GGAAGTCGAG TATGGGGACC CCCCCTTAAC 1

GAAGACAGGG CCATGTAGAG GGCCCCAGGG AGTGAAAGAG CCTCCAGGAC 2

CTCCAGGTAT GGAATACAGG GGACGTTTAA GAAGATATGG CCACACACTG 2

GGGCCCTGAG AAGTGAGAGC TTCATGAAAA AAATCAGGGA CCCCAGAGTT 3

CCTTGGAAGC CAAGACTGAA ACCAGCATTA TGAGTCTCCG GGTCAGAATG 3

AAAGAAGAAG GCCTGCCCCA GTGGGGTCTG TGAATTCCCG GGGGTGATTT 4

CACTCGCCGG GGCTGTCCCA GGCTTGTCCC TGGTACCCCC ACCCAGCCTT 4

TCCTGAGGCC TCAAGCCTGC CACCAAGCCC CCAGCTCCTT CTCCCCGCAG 5

GGACCCAAAC ACAGGCCTCA GGACTCAACA CAGCTTTTCC CTCCAACCCC 5

GTTTTCTCTC CCTCAAGGAC TCAGCTTTCT GAAGCCCCTC CCAGTTCTAG 6

TTCTATCTTT TTCCTGCATC CTGTCTGGAA GTTAGAAGGA AACAGACCAC 6

AGACCTGGTC CCCAAAAGAA ATGGAGGCAA TAGC-TTTTGA GGGGCATGGG 7

GACGGGGTTC AGCCTCCAGG GTCCTACACA CAAATCAGTC AGTGGCCCAG 7

AÁGACCCCCC TCGGAATCGG AGCAGGGAGG ATGGGGAGTG TGAGGGGTA.T 8

Č CTTGATGCT~ TGTGTGTCGG-GAAeTTTee-A-—AAT-eeGGGGG—GGGGGGAT-GG—_c.

AGAAGAAACC GAGACAGAAG GTGCAGGGCC CACTACCGCT TCCTCCAGAT - 9

GAGCTCATGG GTTTCTCCAC CAAGGAAGTT .TTCCGCTGGT TGAATGATTC . 9

TTTC.CCCGCC CTCCTCTCGC CCCAGGGACA TATAAAGGCA GTTC-TTGGCA ‘ 10

CACCCAGCCA GCAGACGCTC CCTCAGCAGA TCCACCATGT CTGGAATATC 10

CCTGGACAAC AGTTATAAAA TGGATTATCC TGAGATGGGT TTATGTATAA . 11

TAATTAATAA TAAGAATTTT CATAAAAGCA CTGGAATGAC ATGTCGGTCT 11

GGTACAGATG TCGATGCAGC AAACCTCAC-G GAAACATTCA GAAACTTGAA 12

ATATGAAGTC AGGAATAAAA ATGATCTTAC ACGTGAAGAA ATTGTGGAAT 12

TGATGCGTGA TGTTTCTAAA GAAGA.TCACA GCAAAAGGAG. CAGTTTTGTT 13

TGTGTGCTTC TGAGCCATGG TGAAGAAGGA ATAATTTTTG GAACAAATGG 13

ACCTGTTGAC CTGAAAAAAA TAACAAACTT TTTCAGAGGG GATCGTTGTA 14

GAAGTCTAAC TGGAAAACCC AAACT7TTCA TTATTCAGGC CTGCCGTGGT 14

ACAGAACTGG ACTGTGGCAT TGAGACAGAC AGTGGTGTTG ATGATGACAT 15

GGCGTGTCAT AAAATACCAG TGGAGGCCGA CTTCTTGTAT GCATACTCCA 15

CAGCAČCTGG' 'TTATTATTCT TGGCGAAATT CAAAGGATGG CTCCTGGTTC 1.6

ATCCAGTCGC TTTGTGCCAT GCTGAAACAG TATGČCGACA AGCTTGAATT ' 16

TATGCACATT CTTACCCGGC- CTAACCGAAA. GGTGGCAACA GAATTTGAGT 17

GCTTTTCCTT TGACGCTACT TTTCATGC.AA. AGAAACAGAT TCCATGTATT 17 GT7TCCATGC TCACAAAAGA ACTCTATTTT TATCACTAA 17 (8) INFORMACE PRO SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1008

- 38 ·· ·· • · · · • · ·· (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY:

(A) PÓPIS: DNA (ix) VLASTNOST:

(A) NÁZEV/KLÍČ: Chimérní gen TNFp120 AiG.2 (D) DALŠÍ INFORMACE: Zbytky 1 až 138 obsahují sekvenci promotoru; zbytky 139 až 150 to obsahují sekvenci linkeru a ostatní zbytky obsahují sekvenci AlG.2 (xi) POPiS SEKVENCE: SEQ ID NO:7: GGGG77-GC7C—CAGA7GAGG7_ CA7GGG777C 7CCACCAAGG AAG7777CCG 5 0

C7GG77GAA7 GATTCT-TTCC CCGCCCTCCT CTCGCCCCAG GGACATATAA™--1ΌΌAGGCAGT.TGT TGGCACACCC AGGCAGCAGA GCTCCCTCAG CAGATCCACC 150

ATGGCTGGAC CACCTGAGTC AGCAGAATCT ACAGATGCCC TCAAGCTTTG 200

TCCTCATGAA GAATTCCTGA GACTATGTAA AGAAAGAGCT'GAAGAGATCT . 250 ACCCAATAAA GGAGAGAAAC AACCGCACAC GCCTGGCTCT CATCATATGC 300

AATACAGAGT TTGACCATCT GCCTCCGAGG AATGGAGCTG AGTTTGACAT ' 350

CACAGGGATG AAGGAGCTAC TTGAGGGTCT GGACTATAGT GTAGATGTAG 400

AAGAGAATCT GACAGCCAGG GATATGGAGT CAGCGCTGAG GGCATTTGCT 450

ACCAGACCAG AGCACAAGTC CTCTGACAGG ACATTCTTGG TÁCTCATGTC 500

TCATGGČATC CTGGAC-GGAA TCTGCGGAAC TGTGGATGAT GAGAAAAAAC 55 0

CAGATGTGCT GCTTTATGAC ACCATCTTCC AGATATTCAA CAACCGCAAC 600

TGCCTCAGTC TGAAGGACAA ACCCAAGGTC ÁTCA7TGTCC AGGCCTGCAG 650

AGGTGCAAAC CGTGGGGAAG TGTGGGTCAG AGACTCTCCA GCATCCTTGG 700

AAGTGGCCTG TTCACAGTCA TCTGAGAACG TGGAGGAAGA TGGTGTTTAG 750

-AAGACCGACG .TGGAGAAGGA CTTCATTGCT TTCTGCTC7T CAACGCCACA 80 0

CAACG7GTCC 7GGAGAGACA GCACAATGGG C7CTA7CT7C ATCAGACAAC 85 0

TCATCACATG.CTTCCAGAAA 7A77C77GG7 GC7GGCACG7 AGAGGAAGTA 90 0

77TCGGAAGC- 7ACAGCAA7C ATTTGAAACT CCAAGGGCCA AAGCTCAAAT 950

GCCCACCATA GAACGACTGT CCA7GACAAG A7A777C7AG C7C777CC7G 1000

GCAATTGA 1008 (9) INFORMACE PRO SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1587 • ·

- 39 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (íi) TYP MOLEKULY:

(A) POPIS: DNA (ix) VLASTNOST:

(A) NÁZEV/KLÍČ: Chimérní gen TNFp706 AIG.2 (D) DALŠÍ INFORMACE: Zbytky 1 až 724 obsahují sekvenci promotoru; zbytky 725 až 736 io. obsahují sekvenci linkeru a ostatní zbytky obsahují sekvenci AIG.2.

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8:

TCCTTGGAAG CCAAGACTGA AACCAGCATT ATGAGTCTCC GGGTCAGAAT 50

C-AAAGAAGAÁ GGCGTGCCCC AGTGGGGTCT GTGAATTCCC GGGGGTGATT 100

TCACTCCCCG GGGCTGTCCC AGGCTTGTCHCTGCTACCCCHZACCCAGCCT——1-5-0-TTCCTGAGGC CTCAAGCCTG CCACCAAGCC CCCAGCTCCT TCTCCCCGCA 200

GGGACCCAAA CACAGGCCTC AGGACTCAAC ACAGCTTTTC CCTCCAACCC -.-250 .

CGTTTTCTCT CCCTCAAGGA CTCAGCTTTC TGAAGCCCCT CCCAGTTCTA 300

GTTCTATCTT TTTCCTGCAT CCTGTCTGGA AGTTAGAAGG AAACAGACCA 35 0

CAGACCTGGT CCCCAAAAGA AATGGAGGCA. ATAGGTTTTG AGGGGCATGG 4 00

GGACGGGGTT „CAGCCTCCAG GGTCCTACAC ACAAATCAGT CAGTGGCCCA 4 50

AAGACCCCCC TCGGAATCGG’AGČÁGGGAGG ATGGGGAGTG TGAGGGGTAT 5 00 CCTTGATGCT TGTGTGTCCC CAACTTTCCA AATCCCCGCC CCCGCGATGG 550

AGAAGAAACC GAGACAGAAG GTGCAGGGCC CACTACCGCT TCCTCCAGAT 600

GAGCTCATGG GTTTCTCCAC CAAGGAAGTT TTCCGCTGGT TGAATGATTC 650

TTTCCCCGCC CTCCTCTCGC CCCAGGGACA TATAAAGGCA GTTGTTGGCA 700

CACCCAGCCA GCAGACGCTC CCTCAGCAGA TCCACCATGG CTGGACCACC 75 0

TGAGTCAGCA GAATCTACAG ATGCCCTCAA GCTTTGTCCT CATGAAGAAT 800

TCCTGAGACT ATGTAAAGAA AGAGCTGAAG AGATCTACCC AATAAAGGAG 850

AGAAACAACC GCACACGCCT GGCTCTCATC ATATGCAATA CAGÁGTTTGA 900

CCATCTGGCT CCGAGGAATG GAGCTGACTT GACATCACAG GATGAAGGAC- 950

TACTTGAGGG TCTGGACTAT GTGTAGATGT GAAGAGAATC GACAGCCAGG 1000

ATATGGAGTC AGCGCTGAGG GCATTTGCTA CCAGACCAGA GCACAAGTCC 1050

TCTGACAGCA CATTCTTGGT ACTCATGTCT CATGGCATCC TGGAGGGAAT 1100

CTGCGGAACT GTGCATGATG AGAAAAAACC AGATGTGCTG CTTTATGACA 1150

CCATCTTCCA GATATTCAAC AACCGCAACT GCCTCAGTCT GAAGGACAAA 12 0 0

CCCAAGGTCA TCATTGTCCA GGCCTGCAGA GGTGCAAACC GTGGGGAACT 125 0

GTGGGTCAGA GACTCTCCAG CATCGTTGGA AGTGGCCTCT TCACAGTCAT 1300

CTGAGAACCT GGAGGAAGAT GCTGTTTACA AGACCCACGT GGAGAAGGAC 1350

TTCATTGCTT TCTGCTCTTC AACGCCACAC AACGTGTCCT GGAGAGACAC- 1400

CACAATGGGC TCTATCTTCA TCACACAACT CATCACATGC TTCCAGAAAT 1450

ATTCTTGGTG CTGCCACCTA GAGGAAGTAT TTCGGAAGGT ACAGCAATCA 1500

TTTGAAACTC CAAGGGCCAA AGCTCAAATG CCCACCATAG AACGACTGTC 15 50

CATGACAAGA TATTTCTACC TCTTTCCTGG CAATTGA 1587

- 40 ♦ ·

·· A (10) INFORMACE PRO SEQ ID NO:9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1894 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý io (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY:

(A) POPIS: DNA (ix) VLASTNOST:

; q;ATNÁZE^V/Ktíě-:-Otíimérní~gen--TNFp4-005-AJ.G-.2_.__ ' (D) DALŠÍ INFORMACE: Zbytky 1 až 1024 obsahují sekvenci promotoru; zbytky 1025 až 1036 obsahují sekvenci linkeru a ostatní zbytky obsahují sekvenci AIG.2 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:9:

GGCGGGGGTC AGGGAGCTCC TGGGAGATAT GGCCACATGT AGCGGCTCTG 50

AGGAATGGGT TACAGGAGAC CTCTGGGGAG ATGTGACCAC AGCAATGGGT 100

í. AGGÁGAATGT CCAGGGCTAT GGAAGTCGAG TATGGGGACC CCCCCTTAAC 150

GAAGAČAGGG CCATGTAGAG GGCCCCAGGG AGTGAAAGAG CCTCCAGGAC 200

CTCCAGGTAT GGAATACAGG GGACGTTTAA GAAGATATGG CCACACACTG 250 v GGGCCCTGAG AAGTGAGAGC TTCATGAAAA AAATCAGGGA.CCCCAGAGTT 300

CCTTGGAAGC CAAGACTGAA ACCAGCATTA TGAGTCTCCG GGTCAGAATG 350

AAAGAAGAAG GCCTGCCCCA GTGGGGTCTG TGAATTCCCG GGGGTGATTT 400

CACTCCCCGG GGCTGTCCCA GGCTTGTCCC TGCTACCCCC ACCCAGCCTT 450

TCCTGAGGCC TCAAGCCTGC CACCAAGCCC CCAGCTCCTT CTCCCCGCAG 500

GGACCCAAAC ACAGGCCTCA GGACTCAACA CAGCTTTTCC CTCCAACCCC 550

GTTTTCTCTC CCTCAAGGAC TCAGCTTTCT GAAGCCCCTC CCAGTTCTAG 600

TTCTATCTTT TTCCTGCATC CTGTCTGGAA GTTAGAAGGA AACAGACCAC 650

AGACCTGGTC CCCAAAAGAA ATGGAGGCAA TAGGTTTTGA GGGGCATGGG 700

GACGGGGTTC AGCCTCCAGG GTCCTACACA CAAATCAGTC AGTGGCCCAG 750

AAGACCCCCC TCGGAATCGG AGCAGGGAGG ATGGGGAGTG TGAGGGGTAT 800

CCTTGATGCT TGTGTGTCCC CAACTTTCCA AATCCCCGCC CCCGCGATGG 850

AGAAGAAACC GAGACAGAAG GTGCAGGGCC CACTACCGCT TGCTCCAGAT 900

GAGCTCATGG GTTTCTCCAC CAAGGAAGTT TTČCGCTGGT TGAATGATTC 950 > · · .« » · » · « ·-·« » · · · ·· · · • · · · · • · ······ • · · • ··· ·· ··

TTTCCCCGCC CTCCTCTCGC CCCAGGGACA TATAAAGGCA GTTGTTGGCA . 1000 CACCCAGCCA GCAGACGCTC CCTCAGCAGA TCCACCATGG CTGGACCACC 1050 TGAGTCAGCA GAATCTACAG ATGCCCTCAA GCTTTGTCCT CATGAAGAAT 1100 TCCTGAGACT ATGTAAAGAA AGAGCTGAAG AGATCTACCC AATAAAGGAG 1150 AGAAACAACC GCACACGCCT GGCTCTCATC ATATGCAATA CAGAGTTTGA 1200 CCATCTGCCT CCGAGGAATG GAGCTGACTT ŤGACATCACA GGGATGAAGG 1250 AGCTACTTGA GGGTCTGGAC TATAGTGTAG ATGTAGAAGA GAATCTGACA 1300 GCCAGGGATA TGGAGTCAGC GCTGAGGGCA TTTGCTACCA GACCAGAGCA 13 50. CAAGTCCTCT GACAGCACAT TCTTGGTACT CATGTCTCAT GGCATCCTGG J 1400 AGGGAATCTG CGGAACTGTG CÁTGATGAGA AAAAACCAGA TGTGCTGCTT :* 1450 TATGACACCA TCTTCCAGAT ATTCAACAAC CGCAACTGCC TCAGTCTGAA 1500 GGACAAACCČ AAGGTCATCA TTGTCCAGGC CTGCAGAGGT GCAAACCGTG 1550 GGGAACTGTG GGTCAGAGAC TCTCCAGCAT CCTTGGAAGT GGCCTCTTCA 1600 CAGTCATCTG AGAACCTGGA GGAAGATGCT GTTTACAAGA CCCACGTGGA 1650 GAAGGACTTC ATTGCTTTCT _;GCTCTTCAAC GCCACACAAC GTGTCCTGGA 17 00 GAGACAGCAC AATGGGCTCT.ATCTTCATCA CACAACTCAT CACATGCTTC .1750 CAGAAATATT CTTGGTGCTG CCACCTAGAG GAAGTATTTC GGAAGGTACA 1800 GCAATCATTT. GAAACTCCAA GGGCCAAAGC TCAAATGCCC ACCATAGAAC 1850 GACTGTCCAT GACAAGATAT TTCTACCTCT TTCCTGGCAA TTGA 1894 (11) INFORMACE PRO SEQ ID NO:10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 123 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY:

(A) POPIS: DNA (ix) VLASTNOST:

(A) NÁZEV/KLÍČ: Zesilující oblast 1 (ER1) promotoru TNFa (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:10:

GGGGCGGGGG

TGAGGAATGG

GTAGGAGAAT

TCAGGGAGCT CCTGGGAGAT ATGGCCACAT GTAGCGGCTC GTTACAGGAG ACCTCTGGGG AGATGTGACC ACAGCAATGG GTCCAGGGCT ATG

100

123'

(12) INFORMACE PRO SEQ ID N0:11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: .

(A) DÉLKA: 190 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY:

. (A) POPIS: DNA (ix) VLASTNOST:

(A) NÁZEV/KLÍČ: Zesilující oblast 2 (ER2) promotoru TNFa

--(-xi)-POPI-S”S-EKV-E-NGE+-SĚQ-ID-N-Oť1-1-:_________

TCCTTGGAAG CCAAGACTGA AACCAGCATT ATGÁGTCTCC GGGTCAGAAT 5 0

GAAAGAAGAA GGCCTGCCCC AGTGGGGTCT GTGAATTCCC GGGGGTGATT 100

TCACŤCCCCG GGGCTGTCČC AGGCTTGTCC CTGCTACČCC CACCCAGCGT 1 TTCCTGAGGC CTCAAGCCTG CGACCAAGCC CCCAGCTCCT 1 tjl σι (13) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 223 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY:

(A) POPIS: DNA (ix) VLASTNOST: '

- 43 99 99 » · · « • · · (A) NÁZEV/KLÍČ: Vícenásobná klonovací místa (D) JINÉ INFORMACE: Vícenásobná klonovací místa získaná genetickým inženýrstvím vložená proti směru exprese vzhledem k minimálnímu ¹ ♦ , · promotoru TNFa v konstruktu-120pGL3 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:12:

GGTACCGAGC TCTTACGCGT GCTAGCCGCG GATATCTTAA GACGTCCTAG GACTAGTCAG CTGCTCC-AGC CGCTTCCTCC ÁGATGAGCTC ATGGGTTTCT CCACCAAGGA AGTTTTCCGC TGGTTGAATG ATTCTTTCCC CGCCCTCCTC TCGCCCCAGG GACATATAAA GGCAGTTGTT GGCACACCCA GCCAGCAGAC GCTCCCTCAG CAGATCTAAG CTT

0 100 150 200 223 • (14) INFORMACE PRO SEQ ID NÓ:13:

s (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 787 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární o (ii) TYP MOLEKULY:

(A) POPIS: DNA . .

(ix) VLASTNOST:

(A) NÁZEV/KLÍČ: Nepřekládaná oblast TNFa (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:13:

TCTAGAGGAG

TCCCTTTATT

AAGAGAATTG

CAAGACCACC

GACGAACATC

ACCCCCTCCT

GGGGCTTAGG

ACTTCGAAAC

CAACCTTCCC

TCAGACACCC

GTCGGAACCC

CTGGGATTCA

AAACGCCTCC

TCAACCTCTT

AAGCTTAGAA

GGAATGTGTG

CCTGCCCCAA

CTGGCTCAAA

CTTTAAGCAA

GCCTGCACAG

100

150

200

TGAAGTGCTG TGG.GGCCTAC CCTTTGGTTC AATTGACACA TTCCTTGAGA TTATGTTTGC ACAGATGAAT GTAGGAGCTG aataggctgt TGTTTTTTAA GTGACCAACT • TCTGTAATCG

GCAACCACTA AGAATTCAAA CTGGGGCCTC CAGAACTCAC 250 AGCTTTGATC CCTGACATCT GGAAT.CTGGA GACCAGGGAG 3 00. TGGCCAGAAT GCTGCAGGAC TTGAGAAGAC CTCACCTAGA'. 350 AGTGGACCTT AGGCCTTCCT CTCTCCAGAT GTTTCCAGAC 400 CACGGAGCCC AGCCCTCCCC ATGGAGCCAG CTCCCTCTAT 450 ACTTGTGATT ATTTATTATT TATTTATTAT TTATTTATTT 500 GTATTTATTT GGGAGACCGG GGTATCCTGG GGGACCCAAT 550 CCTTGGCTCA GACATGTTTT CCGTGAAAAC GGAGGTGAAC 600 TCCCATGTAG CCCCCTGGCC TCTGTGCCTT CTTTTGATTA 650 AATATTTATC TGATTAAGTT GTCTAAACAA TGCTGATTTG 700 GTCACTCATT GCTGAGCCTC TGCTCCCČAG GGGAGTTGTG 750 CCCTACTATT CAGTGGCGAG ATCTAGA 787

Zastupuje:

Claims (24)

1. Chimérní gen, který, obsahuje alespoň jednu zesilující oblast

5 promotoru TNFa připojenou k funkční kopii minimálního promotoru TNFa a dále připojenou k alespoň jedné kopii genu indukujícího apoptózu, přičemž exprese genu indukujícího apoptózu je řízena promotorem TNFa.

ío 2. Gen podle nároku 1, kde připojení zesilující oblasti k promotoru a promotoru ke génu indukujícímu apoptózu je zvoleno ze skupiny přímé připojení, připojení ve větší vzdálenosti, připojení v menší vzdálenosti a jejich kombinace.

3. Gen podle nároku 1, který obsahuje dvě nebo více kopií zesilujících oblastí promotoru TNFa.

4. Gen podle nároku 1, ve kterém je zesilující oblastí promotoru TNFa SEQ ID No. 10 nebo SEQ ID No. 11 nebo jejich

2o funkční části nebo varianty.

5. Gen podle nároku 1, ve kterém je promotor TNFa zvolený ze skupiny SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 a jejich funkčních částí nebo variant.

6. Gen podle nároku 1, kde gen indukující apoptózu je zvolený ze skupiny kaspáza 1, kaspáza 2, kaspáza 3, kaspáza 4, kaspáza 5, kaspáza 6, kaspáza 7, kaspáza 8, kaspáza 9,

- 46 «· *· • · · · • 0 ·· • · · · 0 • · · · ·· ·· • < er ·· ·· ·· · · · · • · · · · · • · · ··· ··· • · · · ··· ··· ·· ·· kaspáza 10, granzym A, granzym B, ligand Fas, a jejich funkčních částí, variant a směsí.

7. Gen podle nároku 6, kde gen indukující apoptózu je zvolený ze

5 skupiny kaspáza 3, kaspáza 4, kaspáza 5, granzym B, a jejich funkčních částí, variant a směsí.

8. Gen podle nároku 1 zvolený ze skupiny SEQ ID No. 4, SEQ ID

No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID io No. 9 a jeho funkční části nebo varianty.

9. Gen podle nároku 1 zvolený ze skupiny SEQ ID No. 4, SEQ ID ._No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No, 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID

No. 9 a jeho funkční části nebo varianty, kde 3’ nepřekládaná •r

15 oblast genu TNFa je vložena ve směru exprese vzhledem ke genu indukujícímu apoptózu.

10. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje gen podle nároku 1.

11. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje gen podle nároku 9.

12. Chimérní gen podle nároku 1 pro použití jako léčivo pro léčení

25 zánětlivých onemocnění zavedením do buněk pacienta indukcí apoptózy u zánětlivých buněk nebo u buněk v místě zánětu.

- 47 • ·

13. Použití podle nároku 12, kde indukce apoptózy neindukuje zánětlivou odpověď u pacienta. 14. Použití podle nároku 12, kde zánětlivou buňkou je buňka 5 produkující TNFa. 15. Použití podle nároku 12, kde zánětlivým onemocněním je onemocnění zvolené ze skupiny revmatoidní artritida, roztroušená skleróza, syndrom Guillain-Barre, Crohnova

ίο choroba, ulcerativní kolitida, lupénka, onemocnění způsobené odmítnutím štěpu hostitelem, lupus erythematosus, diabetes mellitus závislá na inzulínu, psoriatická artritida, sarkoidóza, pneumonitida z přecitlivělosti, ankylózní spondylitida, Reiterův syndrom a sysfěmová škleróza.

16. Použití podle nároku 15, kde zánětlivým onemocněním je revmatoidní artritida.

17. Chimérní gen obsahující dvě až deset kazet zesilující oblasti

2o promotoru TNFa připojených k alespoň jedné kopii minimálního promotoru TNFa a alespoň jedné kopii genu indukujícího apoptózu zvoleného ze skupiny kaspáza 3, kaspáza 4, kaspáza 5, granzym B a jejich funkčních částí, variant a směsí, kde exprese genu indukujícího apoptózu je řízena promotorem

25 TNF. .

18. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje gen podle nároku 17.

- 48 19. Chimérní gen podle nároku 17 pro použití jako léčivo pro indukci apoptózy v zánětlivé buňce produkující TNFa zavedením do buňky

20. Chimérní gen podle nároku 17 pro použití jako léčivo pro léčení zánětlivého onemocnění zavedením do buněk pacienta indukcí apoptózy u zánětlivých buněk nebo buněk v místě zánětu, aniž by došlo k indukci zánětlivé odpovědi u pacienta.

21. Způsob konstrukce chimérního genu, obsahujícího alespoň jednu zesilující oblast promotoru TNFa připojenou k funkční

- kopii minimálního promotoru TNFa a dále k alespoň jedné kopii genu indukujícího apoptózu, přičemž exprese genu

15 indukujícího apoptózu je řízena promotorem TNFa, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky

a) polymerázovou řetězovou reakcí se amplifikuje promotor TNFa s použitím primerů obsahujících deleční konstrukty promotoru TNFa;

20 b) geny amplifikované PCR získané v kroku a) se klonují proti směru exprese vzhledem k reporterovému genu;

c) konstrukty získané v kroku b) se testují na jejich konstitutivní a inducibilní expresi v alespoň jedné buněčné linii produkující TNFa;

25 d) vybere se promotor TNFa odpovědný za inducibilní expresi reportéru v buněčné linii; a buď

e) se provede amplifikace PCR oblastí promotoru TNFa, které zvyšují expresi reportéru,' pro získání zesilující oblasti, a provede se vložení alespoň jedné kopie zesilující oblasti proti směru exprese vzhledem k promotoru; nebo

f) se vloží alespoň jedna kopie genu indukujícího apoptózu s odstraněnou prodoménou po směru exprese vzhledem k

5 promotoru TNFa náhradou reporterového genu delečními konstrukty genu indukujícího apoptózu pro získání chimérního genu, nebo

g) se provede pomocí PCR amplifikace 3’ nepřekládané oblasti TNFa a vloží se ve směru exprese vzhledem k reporterovému io genu, nebo se použije jakákoliv z kombinací uvedených způsobů.

22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, ~ že proti směru exprese vzhledem k promotoru se vloží dvě

15 nebo více kopií zesilujících oblasti.

23. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, ž e jako reporterový gen se použije luciferáza.

20

24. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, ž e se použije zesilující oblasti obsahující SEQ ID No. 10 nebo SEQ ID No. 11.

25. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím,

25 že gen indukující apoptózu s odstraněnou prodoménou se volí ze skupiny kaspáza 3, kaspáza 4, kaspáza 5, granzym B a jejich funkční části a varianty.

26. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že se vytvoří gen zvolený ze skupiny SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9 a jejich funkčních částí nebo variant.

27. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, ž e jako buněčných linií pro testování konstruktů se použije buněčných linií zvolených ze skupiny T lymfoblastoid, myelomonocytická buňka, monocytická buňka, fibroblast io a kultivované lidské synoviocyty.

28. Chimérní gen, obsahující

a) alespoň jednu zesilující oblast promotoru připojenou k funkční kopii minimálního pTómótorů^za^předpoklačlu, žě

15 promotorem je gen nebo kombinace genů aktivovaných v zánětlivých buňkách nebo v buňkách v místě zánětu, a

b) dále připojený k alespoň jedné kopii genu indukujícího apoptózu, kde exprese genu indukujícího apoptózu je řízena promotorem a promotor je zvolený ze skupiny cytokiny,

20 interleukiny a jejich receptory, molekuly buněčné adheze a jejich ligandy, chemokiny a jejich receptory, enzymy předcházející zánětu a jejich směsi.

29. Gen podle nároku 28, kde promotor je zvolený ze skupiny

25 TNFp, IL-1a, IL-Ιβ, IL-2, IL-6, IL-8, GM-CSF, interferon γ a jejich funkční části, varianty a směsi.

• ·

- 51

30. Gen podle nároku 28, kde promotor je zvolený ze skupiny selektiny, integriny, ICAM-1, V-CAM, jejich funkční části, varianty a směsi.

5

31. Gen podle nároku 28, kde promotor je zvolený ze skupiny MIP1α, ΜΙΡ-1β, MCP1-4, RANTES, Mig, NAP2, IP10, Gro α-γ, jejich funkční části, varianty a směsi.

.

32. Gen podle nároku 28, kde promotor je zvolený ze skupiny io COX-2, iNOS, fosfolipázy, proteázy, jejich funkční částí, varianty a směsi.

33. Gen podle nároku 28, kde připojení zesil uj ící oblasti k promotoru a promotoru ke'genu indukujícímu apoptózu je

15 zvoleno ze skupiny přímé připojení, připojení ve větší vzdálenosti, připojení v menší vzdálenosti a jejich kombinace.

Zastupuje: