이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 암억제 유전자 및/또는 혈관신생 억제 유전자를 발현하는 알파바이러스계 발현벡터 (Alphavirus-based expression vector)를 제공한다.
"알파바이러스(Alphavirus)"란 당업계에서 통상적으로 알파 바이러스로 분류되는 바이러스 종 및 서브타입을 말하며, 예를 들어, Eastern Equine Encephalitis virus (EEE), Venezuelan Equine Encephalitis virus (VEE), Everglades virus, Mucambo virus, Pixuna virus, Western Encephalitis virus (WEE), Sindbis virus,South African Arbovirus No. 86, Girdwood S.A. virus, Ockelbo virus, Semliki Forest virus, Middleburg virus, Chikungunya virus, O'Nyong-Nyong virus, Ross River virus, Barmah Forest virus, Mayaro virus, Getah virus, Sagiyama virus, Bebaru virus, Mayaro virus, Una virus, Aura virus, Whataroa virus, Babanki virus, Kyaylagach virus, Highlands J virus, Fort Morgan virus, Ndumu virus, Buggy Creek virus 및 기타 바이러스 학명에 관한 국제 위원회 (International Committee on Taxonomy of Viruses)에서 알파 바이러스로 분류한 것들이 이에 포함된다.
알파바이러스(Alphavirus)는 토가비리디(Togaviridae)에 속하는 바이러스로서, 피막을 가지고 있는 (+)쇄(positive-strand) RNA 바이러스이며 광범위한 세포(곤충, 조류, 포유류)에 감염될 수 있다. 바이러스의 RNA 게놈이 스스로 RNA 리플리카제를 암호하기 때문에 RNA 복제와 전사가 효율적으로 이루어지는 발현 시스템이다 [Liljestrom, P. and H.Garoff, Biotechnology, 9, 1356-1361(1991)].
본 발명의 알파바이러스는 바람직하게는 "셈리키 포리스트 (SFV: Semliki Forest Virus) 바이러스"와 "신드비스 바이러스 (Sindbis Virus)"이다. 본 발명의 알파바이러스 더욱 바람직하게는 SFV이다. 본 발명의 구체예에서 사용된 SFV계 발현벡터 pSFV-1은 SP6 프로모터를 가진 플라스미드에 SFV의 cDNA 게놈을 삽입한 것으로, SP6 폴리머라제를 사용하여 in vitro 전사가 가능하며, 구조 유전자 대신 삽입된 외래 유전자가 26S 서브게노믹 프로모터에 의해 발현 될 수 있도록 변환된 발현 벡터이다.
감염에 의해 재조합 RNA를 세포 내로 도입시키기 위해서는 in vivo 패키징 시스템을 이용할 필요가 있다. in vitro 패키징 시스템은 헬퍼-플라스미드와 패키징 세포주를 사용할 수 있다. 본 발명의 구체예에서 사용한 SFV계 헬터 플라스미드의 구조를 도 1에 나타내었다.
본 발명자들은 놀라웁게도 알파바이러스계 벡터에 약 5 kb 이상의 외래 유전자를 삽입하여도 유전자가 안정하게 발현됨을 발견하고, 하나 이상의 암억제 유전자 및/또는 혈관신생 억제 유전자를 발현하는 알파바이러스계 재조합 벡터를 제조하였다.
본 발명의 정의상 "암억제 유전자 (tumor suppressor genes)"란 정상 세포의 암화를 억제하는 활성 및/또는 암세포의 증식을 억제하는 활성을 지닌 단백질을 코드하는 유전자를 말한다. 암억제 유전자의 예로는 다음과 같은 것을 들 수 있다; pRb/p110 또는 그 동족체 p107 및 p120, p53 단백질, p21 단백질 (WAF-1), bak, BRCA1, BRCA2, PTEN, APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, zac1, p73, VHL, FCC 및 MCC.
본 발명의 암억제 유전자로 특히 바람직한 것은 p53이다. p53 유전자는 사람의 암세포 중 가장 많은 종류의 암세포에서 결손을 보이는 암억제 유전자이다. 사람 염색체 17의 밴드 13에 위치하며 393개 아미노산으로 구성된 핵인단백질 (53 kDa)을 암호화한다. p53 단백질은 전사 활성인자 및 신호전달 매개체로 작용하는 다기능성 단백질로서 특정 유전자 발현을 조절하고, 세포주기 동안 DNA 복제시 세포의 발달을 억제하며, 세포소멸 또는 프로그램된 세포 소멸을 유도하는 것으로 알려져 있다 [Nigro, J. et al., Nature, 342, 705-708 (1989); Takahashi, T. et al., Science, 246, 491-494 (1989)].
본 발명의 암억제 유전자로 또한 바람직한 것은 PTEN 유전자이다. PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted from chromosomal 10) 유전자는 외암, 흉부암, 전립선암, 흑색종 등의 암세포에서 결손을 보이는 암억제 유전자이다. 사람의 염색체 10q23에 위치하며 403개의 아미노산으로 구성된 단백질 (47 kDa)을 암호화한다. PTEN은 일명 MMAC1 (mutated in multiple advanced cancers) 또는 TEP1 (TGFβ-regulated and epithelial cell-enrich phosphatase)이라고도 하며, 세포 내에서 PTEN 유전자의 결손과 p53 유전자의 결손은 독립적으로 존재한다. PTEN 단백질은 지질과 단백질 포스파타제 활성을 가지고 있으며 세포의 증식/생존 및 이동/부착에 관여하는 것으로 알려져 있다 [Cantley, L. C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 4240-4245 (1999); Antonio, D. C. et al., Cell, 100, 387-390 (2000)].
본 발명의 정의상 "혈관신생 억제 유전자 (anti-angiogenic genes)"란 혈관의 형성을 억제하는 활성을 가진 단백질을 코드하는 유전자를 말한다. 혈관신생 억제 유전자의 예로는 다음과 같은 것을 들 수 있다; PAI-1, PAI-2, PAI-3, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 혈소판인자 IV, IL-12, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, LIF (leukemia inhibitory factor), 프로리퍼린(proliferlin) 관련 단백질, 프로테아제 억제제, 프로타민, 프로락틴 단편, 라미닌, 트롬보스폰딘 1.
혈관신생 (angiogenesis)은 새로운 혈관을 생성하는 과정으로 암세포의 증식과 전이에 필요하다. 안지오스타틴 (angiostatin)은 혈관신생을 억제하는 대표적 단백질이다. 안지오스타틴은 종양유래의 혈관신생 억제물질로서 루이스(Lewis) 폐 암종을 갖는 쥐(mouse)의 혈청과 뇨에서 추출되었으며, 단백분해효소에 의해 플라즈미노겐의 도메인에서 분리되어 38 kDa의 단백질로서 그 기능을 한다. 내피 세포에 특이적으로 작용하여 세포의 분화와 전이를 억제하며 체액을 순환하면서 종양부위의 혈관신생을 억제하고 암세포의 성장을 억제하는 것으로 알려져 있다 [O'Reilly, M. S. et al., Cell, 79, 315-328 (1994)].
본 발명의 정의상 "발현 벡터"는 적당한 숙주 세포에서 mRNA 또는 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 단백질의 발현을 조절할 수 있는 조절 서열 (control sequences)에 작동 가능하도록 연결된 DNA 서열 및 기타 유전자 조작을 용이하게 하거나 단백질의 발현을 최적화하거나 또는 벡터의 복제에 필요한 서열들을 함유하는 DNA 구조물 (DNA construct)을 말한다. 상기 조절 서열에는 전사를 조절하기 위한 프로모터 (promoter), 전사를 조절하기 위해 선택적으로 부가된 오페레이터 (operator), 적절한 mRNA 리보좀 결합 부위 및 전사/번역의 종료를 조절하는 서열들이 포함된다.
본 발명의 범위에 포함되는 "암억제 유전자 및/또는 혈관신생 억제 유전자를 발현하는 알파바이러스계 발현 벡터"의 일 구체예는 암억제 유전자 및/또는 혈관신생 억제 유전자들을 각 하나의 서브 게놈 프로모터, 바람직하게는 26S 서브게놈 프로모터하에 작동가능하게 연결시킨 셈리키 포리스트 바이러스(SFV)계 발현 벡터이다. 상기 암억제 유전자와 혈관신생 억제 유전자는 각각 단독으로, 또는 2 이상의 조합으로 본 발명의 발현 벡터에 삽입될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 벡터에 삽입된 SP6 프로모터에 의해 RNA 전사물을 만들어 세포 내에 도입하거나, 세포 내에서의 전사를 가능하게 하는 구조물을 삽입하여 직접 DNA 자체를 세포에 도입시킬 수 있다. 상기 DNA 구조물의 예로 사이토메갈로바이러스(CMV)의 즉시-초기발현형 (IE) 인헨서/프로모터, SV40 초기 프로모터 및 라우스 사코마 바이러스의 긴 말단 유전자가 있다.
본 발명은 일 구체예로서, 야생형 p53 유전자를 하나의 서브게놈 프로모터, 바람직하게는 26S 서브게놈 프로모터하에 작동가능하도록 연결시킨 알파바이러스계 발현 벡터, 바람직하게는 SFV계 발현 벡터를 제공한다. 다른 양태로, 본 발명은 PTEN 유전자를 하나의 서브게놈 프로모터, 바람직하게는 26S 서브게놈 프로모터하에 작동가능하도록 연결시킨 알파바이러스계 발현 벡터, 바람직하게는 SFV계 발현 벡터를 제공한다. 또 다른 양태로, 본 발명은 안지오스타틴 유전자를 하나의 서브게놈 프로모터, 바람직하게는 26S 서브게놈 프로모터하에 작동가능하도록 연결시킨 알파바이러스계 발현 벡터, 바람직하게는 SFV계 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 나아가 동일 (예, A-A) 또는 상이 (예, A-B)한 두 개의 암억제 단백질 및/또는 혈관신생 억제 단백질 유전자를 발현하는 알파바이러스계 발현 벡터를 제공한다. 두 개의 암억제 단백질 및/또는 혈관신생 억제 단백질 유전자는 각각 서브게놈 프로모터 하에 연결되며, 유전자는 임의의 조합으로 삽입될 수 있다.
구체예로서, PTEN 유전자를 제1의 서브게놈 프로모터, 바람직하게는 26S 서브게놈 프로모터하에 작동가능하도록 연결시키고, 야생형 p53 유전자를 제2의 서브게놈 프로모터, 바람직하게는 26S 서브게놈 프로모터하에 작동가능하도록 연결시킨 알파바이러스계 발현 벡터, 바람직하게는 SFV 발현 벡터를 제공한다. 다른 양태로, 본 발명은 안지오스타틴 유전자를 제1의 서브게놈 프로모터, 바람직하게는 26S 서브게놈 프로모터하에 작동가능하도록 연결시키고, 야생형 p53 유전자를 제2의 서브게놈 프로모터, 바람직하게는 26S 서브게놈 프로모터하에 작동가능하도록 연결시킨 알파바이러스계 발현 벡터, 바람직하게는 SFV 발현 벡터를 제공한다. 또 다른 양태로서 본 발명은 안지오스타틴 유전자를 제1의 서브게놈 프로모터, 바람직하게는 26S 서브게놈 프로모터하에 작동가능하도록 연결시키고, PTEN 유전자를 제2의 서브게놈 프로모터, 바람직하게는 26S 서브게놈 프로모터하에 작동가능하도록 연결시킨 알파바이러스계 발현 벡터, 바람직하게는 SFV 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 나아가 동일 (예, A-A-A) 또는 상이 (예, A-B-C, A-B-A, A-A-B)한 세 개의 암억제 단백질 및/또는 혈관신생 억제 단백질 유전자를 발현하는 알파바이러스계 발현 벡터를 제공한다. 세 개의 암억제 단백질 및/또는 혈관신생 억제 단백질 유전자는 각각 서브게놈 프로모터 하에 연결되며, 유전자는 임의의 조합으로 삽입될 수 있다. 구체예로서, 본 발명은 안지오스타틴 유전자를 제1 서브게놈 프로모터, 바람직하게는 26S 서브게놈 프로모터하에 작동가능하도록 연결시키고, p53 유전자를 제2의 서브게놈 프로모터, 바람직하게는 26S 서브게놈 프로모터하에 작동가능하도록 연결시킨 다음, PTEN 유전자를 제3의 서브게놈 프로모터, 바람직하게는 26S 서브게놈 프로모터하에 작동가능하도록 연결시킨 알파바이러스계 발현 벡터,바람직하게는 SFV 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 알파바이러스는 RNA 계를 이용함과 동시에 시험관내 RNA 전사체를 만들지 않고 보다 편리하게 DNA 자체를 암세포에 직접 적용하여 유전자 치료를 가능하게 하기 위하여, 동물 세포 내에서 전사를 가능하게 하는 서열, 예를 들어 SV40 프로모터 또는 CMV/IE 유전자를 삽입할 수 있다. 본 발명의 pcSFV는 상기 벡터의 예이다 (도 1). 하기 실시예를 통해 이 발현 벡터를 기본 벡터로서 사용하였지만, 본 발명은 이 발현 벡터에만 국한되는 것은 아니다.
본 발명을 예시하기 위한 기본 벡터 pcSFV의 제조에 사용된 상기 발현벡터 pSFV-1은 GIBCO BRL(Cat. No. : 18448-019)의 상품으로 SP6 프로모터를 가지고 있으며, 아울러 바이러스 복제에 필요한 복제효소를 포함하는 비구조 단백질을 암호화하는 유전자, 외래 유전자를 삽입할 수 있는 다중클로닝 부위 및 외래 유전자를 발현하기 위한 서브게놈 프로모터를 가지고 있다. 감염성 바이러스를 제조하기 위해 pSFV-1과 더불어 SFV의 구조 단백질을 암호화하는 플라즈미드 pSFV-helper(GIBCO BRL, Cat. No : 10180-016)가 함께 사용되었다.
본 발명은 기본 발현 벡터 pcSFV에 암억제 단백질 및 혈관생성 억제 단백질을 발현하는 유전자를 삽입함으로써 암 치료제에 이용할 수 있는 재조합 바이러스 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 pcSFV-p53, pcSFV-PTEN, pcSFV-Agt는 한 개의 유전자가 삽입된 발현 벡터의 예이다(도 2 및 도 3). 본 발명의 pcSFV-PTEN/p53 및 pcSFV-Agt/p53은 두 개의 암억제 유전자 및/또는 혈관신생 억제 유전자를 발현하는 발현 벡터의 예이다 (도 4 및 도 5). 상기 pcSFV 기본 벡터를 이용하여 만들어진 pcSFV-Agt/p53/PTEN는 세 개의 암억제 유전자 및/또는 혈관신생 억제 유전자를 발현하는 발현 벡터의 예이다 (도 6). 이렇게 제조된 pcSFV-Agt/p53/PTEN은 기탁 번호 KCCM-10249로서 기탁하였다 (대한민국 서울시에 소재하는 한국미생물보존센터에 2001년 2월 5일자로 기탁됨).
본 발명은 상기 발현 벡터 또는 그 RNA 전사물로 형질 전환된 숙주 세포 및 상기 발현 벡터를 숙주 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는 암억제 또는 혈관신생 억제 단백질의 제조방법을 제공한다.
알파 바이러스 발현 벡터 또는 그 RNA 전사물은 통상의 형질감염 방법, 예를 들어 DEAE-덱스트란, 칼슘 포스페이트법, 미세주사법, DNA-함유한 리포좀 방법, 리포펙타민-DNA 복합체 방법 등, 바람직하게는 엘렉트로포레이션에 의해 알파바이러스의 숙주 세포, 바람직하게는 동물 세포, 더욱 바람직하게는 BHK 세포, CHO 세포, COS 세포 및 하기의 암세포에 도입시킬 수 있다. 상기 형질감염 방법은 당업계에 공지되어 있다 [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)].
암세포의 예는 다음과 같다; 뇌암 세포 (U87MG, U251MG, 534T, 132T, U373MG, 134T, DBTRG-05MG, U178 등), 난소암 세포 (BCE, HUVE, MA148, SK-OV-3, Cao-3, ES-2, MDAH2774, NIH:OVCAR-3, OV-1063, SW626, SNU-8, SNU-119, Caov-4 등), 흉부암 세포 (MDA-MB-231, MDA-MB-157, MDA-MB-453, MCF-7, MDA-MB-468, BT549, SK-BR-3, SW613, Hs578T, ZR-75-1 등), 전립선암 세포 (DU145, LNCaP, TSU, PC-3, LNCaP 등), 폐암 세포 (NCI-H23, NCI-H522, NCI-H1435, NCI-H1793, SK-LU-1,NCI-H835, NCI-H727, A-549, A-427 등), 간암 세포 (Hep3B, Hep3B, Huh-7, PLC/PRF5, SNU-398, SNU-423, SNU-475, SNU-182, SNU-387, SNU-354, SNU-368 등), 결장암 세포 (SW480, LS174T, Lovo, NCI-H854, WiDr, Colo 320DM, Colo 205, DLD-1, Colo 201, HCT-15, NCI-H548, HT-29, SNU-C1, SNU-C2A, SNU-C4, SNU-C5, NCI-H716, NCI-H508, NCI-H498, HCT-8, HCT-116 등), 흑색종 세포 (UM449, WN35, A375P, A375SM, DX3, DM-4, G361, TXM18, TXM40, TXM13, SK-MEL-31, Malme-3M, RPMI-7951, SK-MEL-1, SK-MEL-2, SK-MEL-3, SK-MEL-5 등), 자궁 경부암 또는 자궁암 세포 (SNU-682, SNU-523, SNU-703, SNU-1160, SNU-17, SNU-778, SNU-902, SNU-1005, SNU-1299, SiHa, HeLa, HeLa 229, HeLa S3 등), 위암 세포 (SNU-1, MKN-45, AGS, SNU-5, SNU-16, SNU-216, SNU-484, SNU-520, SNU-719, MKN-28, MKN-74 등), 신장암 세포 (A-704, A-498, SN12C, SN12PM6, Caki-2 등), 방광암 세포 (253J, 253J-BV, HT-1197, 5637, J82, T24, HT-1376 등), 표피양암 세포 (A-431, Hep-2. KB, PANC-1, A-253 등) 및 림프종 세포 (LBRM-33-1A5, RPMI 6666, Daudi, H9, NCI-H78; Hut 78, NCI-H102; Hut 102).
세포의 형질전환은 감염성 바이러스 입자로 감염시키는 경우 그 발현 효율이 증대한다. 본 발명은 헬퍼 플라스미드를 이용하여 만든 본 발명에 따른 RNA 전사물을 포함하고 있는 감염성 바이러스 입자인 재조합 바이러스 입자(Recombinant Virus Particle)를 숙주 세포에 감염시킴으로써 재조합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 벡터, 그 전사물 또는 재조합 바이러스에 의하여 생산된 암억제단백질 또는 혈관신생 억제 단백질들은 다양한 방법에 의해 분리될 수 있다. 유전자를 적당한 숙주 세포에서 발현시켜 그 세포 용해물을 만든 후 당업계에 공지된 단백질 분리 방법에 의해 유전자 재조합 단백질을 정제할 수 있다. 통상, 세포 조각 (cell debris) 등을 제거하기 위해 상기 세포 용해물 또는 in vitro 번역한 결과물을 원심분리한 후, 침전, 투석, 각종 컬럼 크로마토그라피 등을 적용한다. 이온교환 크로마토그라피, 겔-퍼미에이션 크로마토그라피, HPLC, 역상-HPLC, 프렙용 SDS-PAGE, 친화성 컬럼 등이 그 예이다.
본 발명은 p53, PTEN 및 안지오스타틴 중에서 선택된 둘 이상의 유전자를 포함하는 벡터를 세포에 도입하여 암을 치료하는 방법을 제공한다. 두 개 이상의 유전자를 동시에 하나의 세포에서 발현시키는 경우라 하여도 여러 생리 활성 네트워크가 작동하는 세포에서 두 단백질이 항상 상승적으로 작용한다고 보기는 어렵다. 대부분의 암억제 단백질 및 혈관신생억제 단백질은 다기능성 단백질로서 세포 생리 조절에 복잡하게 연관되어 있으므로 더욱 그 상승 효과를 예측하기 어렵다. 암억제 단백질인 p53과 시토킨인 인터루킨-2를 동시 적용한 경우 이들을 각각 적용한 경우와 비슷한 정도의 피하 C6 신경교종의 성장억제 효과를 보았을 뿐 상승적 암억제 효과를 얻지 못한 것이 바로 그 예 중의 하나이다 (Fodor, I. et al., Anticancer Res., 20, 1337-1342(2000)].
그러나, 본 발명자들은 놀라웁게도 p53와 안지오스타틴 및 PTEN과 p53가 동시에 발현되는 경우 각각의 단백질이 발현되었을 때 보다 암을 억제하는 효과가 상승되며, p53과 PTEN 및 안지오스타틴을 동시에 발현시키는 경우 더 우수한 암 억제효과가 얻어짐을 실험으로 확인하였다 (도 16 내지 도 19 및 표 1 참조). 특히 in vivo 실험에서 이와 같은 결과는 항상성이 유지되고 신호 전달 체계가 얽힌 in vivo 시스템에서는 기대하기 어려운 매우 놀라운 결과였다.
암을 치료하기 위해 유전 물질을 세포 내로 도입하는 경우, 가사 특정 유전자의 조합이 상승 효과를 갖는 것을 예측하였다 하여도 이를 고효율로 세포 내로 도입하는 것은 용이하지 않다. 따라서, 상승 효과가 있는 것으로 알려진 유전자들을 하나의 벡터에 클로닝하는 것은 효과적인 유전자 치료의 발판이 된다. 본 발명자들은 p53와 PTEN 및 안지오스타틴의 상승 효과를 in vitro, ex vivo 및 in vivo에서 확인하였을 뿐만 아니라, 이를 고효율로 전달할 수 있도록 하나의 벡터에 다수의 항암 유전자를 클로닝하는데 성공하였다. 따라서, 본 발명은 상기 발현 벡터, 그 RNA 전사물 및 재조합 바이러스를 이용하여 암을 치료하는 방법, 특히 유전자 치료법을 제공한다. 유전자 치료를 위해 본 발명의 발현 벡터 등을 도입하는 것은 공지되어 있다.
본 발명은 나아가 암을 치료하기에 충분한 양의 상기 발현 벡터, 상기 벡터의 RNA 전사물 또는 상기 재조합 바이러스를 포함하는 암 치료용 약학 조성물 및 이를 투여하여 암을 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 용매, 분산 매질, 흡수 지연제 등을 포함된다. 본 발명의 약학 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 국부, 경구, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내, 경피등으로 투여 될 수 있고, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다. 바람직한 제형은 주사제이다. 투여량은 환자의 질병 종류 및 정도, 연령, 성별 등에 따라 당업계의 기술을 고려하여 결정한다.
본 발명의 약학 조성물은 뇌암, 난소암, 흉부암, 전립선암, 폐암, 간암, 결장암, 흑색종, 자궁 경부암, 자궁암, 위암, 신장암, 방광암, 표피양암 및 림프종 등의 질병을 치료하는 데 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정이 되는 것은 아니다.
<실시예 1>
DNA계 발현 벡터 pcSFV의 제작
SFV를 기질로 이용한 DNA계 발현 벡터를 제작하기 위하여, RNA계 발현 플라즈미드 pSFV-1 (GIBCO BRL, Cat. No : 18448-019)을 이용하였다. 우선 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시-초기 발현형(immediate-early: IE) 인헨서/프로모터를 암호화하는 유전자를 얻기 위하여 프라이머 1 및 프라이머 2(SphI 인식부위 존재)를 시발체로 하여 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 주형으로는 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기발현형(IE) 인헨서/프로모터를 지니고 있는 pCMV-Script (STRATAGENE, Cat. No.: 212220)를 사용하였다[Shimotohno, K. et al., Journal of virology, 73, 4713-4720(1999)].
플라즈미드 pCMV-Script (100ng/㎕)에, 2.5mM dNTP (Boehringer Mannheim, Germany) 4㎕, 센스 프라이머 (10pmol/㎕) 5㎕, 안티센스 프라이머 (10pmol/㎕) 5㎕, Taq 폴리머라제 10× 완충액 5㎕, 증류수 37㎕를 넣어 혼합액을 만들어 95℃에서 5분 동안 변형시킨 후 Taq 폴리머라제 1㎕를 첨가한 뒤 94℃에서 50초, 54℃에서 50초, 72℃에서 2분을 유지시키는 일련의 반응을 30회 반복하였다.
프라이머 1 : 센스 (서열 1)
5'-ACATGCATGCGTCCGTTACATAACTTAC-3'
프라이머 2 : 안티센스 (서열 2)
5'-ACATGCATGCGTCCGGAGGCTGGATCGG-3'
CMV-IE 인헨서/프로모터 유전자 부위 (686bp-1279bp)가 증폭되었다. 상기 CMV-IE 인헨서/프로모터 유전자를 제한 효소인 SphI으로 절단한 다음 pSFV-1의 SphI 부위에 삽입하여 DNA계 SFV 발현 벡터 (11754bp)를 제작하고 이를 기본 발현 벡터 pcSFV로 명명하였다. 제작된 발현 벡터 pcSFV를 도 1에 나타내었다.
<실시예 2>
암억제 유전자 발현 벡터 pcSFV-p53의 제작
실시예 1에서 제조한 pcSFV를 이용하여 야생형의 인간 p53 암억제 유전자를 발현할 수 있는 발현 벡터 pcSFV-p53을 제조하였다. 벡터 pcSFV에 인간 p53 암억제 유전자를 도입하기 위하여, 범용 포유류 발현 벡터인 pCEP4 (Invitrogen, Cat. No : V044-50)에 클로닝되어 있는 p53 유전자 (1182bp)를 주형으로 사용하고, 프라이머 3 및 프라이머 4(BamH1의 인식부위 존재)를 시발체로 하여 실시예 1에서와 같이 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
프라이머 3 : 센스 (서열 3)
5'-CCCGGATCCATGGAGGAGCCGCAG-3'
프라이머 4 : 안티 센스 (서열 4)
5'-CCCGGATCCTAACCTCAGTCTGAGTC-3'
p53 유전자(406bp-1588bp)가 증폭되었다. 상기 증폭된 p53 유전자를 제한효소 BamHI으로 처리한 후 pcSFV의 BamH1 부위에 삽입하여 인간 p53유전자를 발현하는 발현 벡터 pcSFV-p53 (12936bp)를 제작하였다. 이렇게 제작된 발현 벡터 pcSFV-p53을 도 2에 나타내었다.
<실시예 3>
암억제 유전자 발현 벡터 pcSFV-PTEN의 제작
실시예 1에서 제조한 pcSFV를 이용하여 야생형의 인간 PTEN 암억제 유전자를 발현할 수 있는 발현 벡터 pcSFV-PTEN을 제조하였다. 벡터 pcSFV에 인간 야생형 PTEN 유전자를 도입하기 위하여, 범용 포유류 발현 벡터인 pcDNA-3 (Invitrogen, Cat. No : V790-20)에 클로닝되어 있는 PTEN 유전자 (1212bp)를 주형으로 사용하고, 프라이머 5 및 프라이머 6 (BamHI의 인식부위 존재)을 시발체로 하여 실시예 1에서와 같이 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
프라이머 5 : 센스 (서열 5)
5'-CCCGGATCCATGACAGCCATCATCAAAGAG-3'
프라이머 6 : 안티 센스 (서열 6)
5'-CCCGGATCCAATCTTCAGACTTTTGTAATTTGTG-3'
PTEN 유전자 (908bp-2120bp)가 증폭되었다. 상기 증폭된 p53 유전자를 제한효소 BamHI으로 처리한 후 pcSFV의 BamHI 부위에 삽입하여 인간 야생형 PTEN 유전자를 발현하는 발현 벡터 pcSFV-PTEN (12966 bp)를 제작하였다. 이렇게 제작된 발현 벡터 pcSFV-PTEN은 도 3에 나타내었다.
<실시예 4>
암억제 유전자 발현 벡터 pcSFV-Agt의 제작
실시예1에서 제조한 pcSFV를 이용하여 암억제 및 혈관신생 억제 효과를 갖는 안지오스타틴 유전자를 발현, 분비할 수 있는 발현 벡터 pcSFV-Agt를 제조하였다. 벡터 pcSFV에 안지오스타틴 유전자를 도입하기 위하여, 안지오스타틴 유전자 (1220bp)를 포함하고 있는 범용 포유류 발현 벡터인 pSecTaq2A (Invitrogen, Cat. No : V900-20)를 주형으로 사용하고, 프라이머 7 및 프라이머 8 (BglII 인식부위 존재)을 시발체로 하여 실시예 1에서와 같이 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
프라이머 7 : 센스 (서열 7)
5'-CCCAGATCTATGGAGACAGACACACTC-3'
프라이머 8 : 안티 센스 (서열 8)
5'-CCCAGATCTTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3'
안지오스타틴 유전자 앞에 발현 단백질의 분비를 위한 쥐의 Ig κ쇄 리더 (905bp-967bp) 유전자와 안지오스타틴 유전자 뒤에 발현 단백질의 확인과 정제를 위한 C-myc 에피토프(1082bp-1114bp)와 6개 직렬의 히스티딘 (1127bp-1144bp) 유전자를 포함하는 유전자 (905-2381bp; 이하, Agt 유전자)를 증폭하였다. 증폭된 유전자는 1476bp이다. 상기 증폭된 Agt 유전자를 pcSFV의 BglII 부위에 삽입하여 인간 안지오스타틴 유전자를 발현하는 발현 벡터 pcSFV-Agt를 제작하였다. 이렇게 제작된 발현 벡터 pcSFV-Agt은 도 3에 나타내었다.
<실시예 5>
암억제 유전자 발현 벡터 pcSFV-PTEN/p53의 제작
실시예 1에서 제조한 pcSFV를 이용하여 PTEN 유전자와 p53 유전자를 동시에 발현할 수 있는 발현 벡터 pcSFV-PTEN/p53를 제조하였다. 실시예 3에서 제작한 발현 벡터 pcSFV-PTEN에 인간 p53유전자를 도입하기 위하여, 실시예 2에서 제작한 발현 벡터인 pcSFV-p53을 주형으로 사용하고, 프라이머 9 및 프라이머 10을 (SmaI 인식부위 존재) 시발체로 하여 실시예 1에서와 같이 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
프라이머 9 : 센스 (서열 9)
5'-TCCCCCGGGACCTCTACGGCGGTCCTA-3'
프라이머 10 : 안티 센스 (서열 10)
5'-TTACCCGGGCCCTCGCGAGCGGCCGCTTAACCTCAGTCTGAGTC-3'
상기 반응에 의해 26S 서브게놈 프로모터를 포함하는 p53 유전자 (7350bp-8582bp) 부위가 증폭되었다. p53 유전자의 하단 부에는 NotI, NruI, ApaI 등의 제한효소부위를 인위적으로 삽입하여 다중클로닝 부위를 만들었다. 증폭된 유전자 부위는 1262bp 크기였다. 상기 증폭된 p53 유전자 부위를 제한효소 SmaI으로 처리한 후 pcSFV-PTEN의 SmaI 부위에 삽입하여 발현 벡터 pcSFV-PTEN/p53 (14228bp)를 제작하였다. 이렇게 제작된 발현 벡터 pcSFV-PTEN/p53은 도 4에 나타내었다.
<실시예 6>
암억제 유전자 발현 벡터 pcSFV-Agt/p53의 제작
실시예 1에서 제조한 pcSFV를 이용하여 안지오스타틴 유전자와 p53 유전자를 동시에 발현할 수 있는 발현 벡터 pcSFV-Agt/p53를 제조하였다. 안지오스타틴 유전자를 발현하는 발현 벡터 pcSFV-Agt에 p53유전자를 도입하기 위하여, 실시예 5에서와 같이 프로모터 및 다중 클로닝 부위를 포함한 p53 유전자 부위 (1262 bp)를 증폭하였다.
상기 증폭된 p53 유전자 부위를 제한효소 SmaI으로 처리한 후 발현 벡터 pcSFV-Agt의 SmaI 부위에 삽입하여 안지오스타틴과 p53 유전자를 발현하는 발현 벡터 pcSFV-Agt/p53 (14492bp)를 제작하였다. 이렇게 제작된 발현 벡터 pcSFV-Agt/p53은 도 5에 나타내었다.
<실시예 7>
암억제 유전자 발현 벡터 pcSFV-Agt/p53/PTEN의 제작
실시예 1에서 제조한 pcSFV를 이용하여 안지오스타틴과 p53 및 PTEN을 동시에 발현할 수 있는 발현 벡터 pcSFV-Agt/p53/PTEN를 제조하였다. 발현 벡터 pcSFV-Agt/p53에 PTEN 유전자를 도입하기 위하여, 실시예 3에서 제작한 발현 벡터pcSFV-PTEN에 클로닝되어 있는 1212bp의 PTEN 유전자를 주형으로 사용하고, 프라이머 11 및 프라이머 12 (NruI 인식부위 존재)를 시발체로 하여 실시예 1에서와 같이 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
프라이머 11 : 센스 (서열 11)
5'-CTAGTCGCGAACCTCTACGGCGGTCCTA-3'
프라이머 12 : 안티 센스 (서열 12)
5'-CTAGTCGCGACAGACTTTGTAATTTGTG-3'
상기 반응에 의해 SFV 벡터의 26S 서브게놈 프로모터를 포함하는 1274 bp 크기의 PTEN 유전자 (7350bp-8624bp)가 증폭되었다. 상기 증폭된 PTEN 유전자를 제한효소 NruI으로 처리한 후 발현 벡터 pcSFV-Agt/p53의 NruI 부위에 삽입하여 안지오스타틴과 인간 p53 및 PTEN을 발현하는 발현 벡터 pcSFV-Agt/p53/PTEN (15766bp)를 제작하였다. 이렇게 제작된 발현 벡터 pcSFV-Agt/p53/PTEN은 도 6에 나타내었다.
<실시예 8>
암억제 유전자 p53의 RNA계에 의한 발현
발현 벡터 pcSFV-p53, pcSFV-Agt/p53, pcSFV-PTEN/p53, pcSFV-Agt/p53/PTEN에 의한 p53 단백질의 발현을 확인하기 위하여 상기 플라즈미드와 pc-helper 플라즈미드의 시험관내 전사체를 만들어, BHK-21 세포에 형질감염시킨 후 면역세포화학 방법으로 그 발현을 확인하였다. 구체적으로, pc-helper를 포함하는 각각의 DNA들을 제한효소 SpeI으로 처리하여 선상 DNA를 만든 후 페놀/클로로포름/이소아미노알코올로 처리한 다음, 얻어진 DNA 10㎕에 10× SP6 완충액(TaKaRa) 2㎕, 10mM m7G(5')ppp(5')G (BM) 2㎕, 100mM DTT 1㎕, rNTP 혼합물(10mM ATP, 10mM CTP, 10mM UTP, 5mM GTP, Beoringer Manheim) 2㎕, RNasin (Beoringer Manheim) 2㎕, SP6 RNA 폴리머라제(TaKaRa) 2㎕를 첨가하여 혼합물을 만든 후 37℃에서 1시간 30분 동안 반응시켰다.
MEM(5% 소혈청 함유)에 현탁시킨 BHK-21 세포(107세포/㎖) 800㎕에 전사 확인된 mRNA (pc-helper mRNA 전사체 10㎕에 pcSFV-p53, pcSFV-Agt/p53, pcSFV-PTEN/p53, pcSFV-Agt/p53/PTEN mRNA 전사체를 20㎕씩 첨가한 혼합물)를 넣은 다음, 0.4㎝ 전기침투용 큐벳(electroporation cuvette)에서 850V/25㎌로 두번 펄스를 주어 mRNA의 형질감염을 수행하였다(Bio-Rad Gene Pulser).
형질감염 후 48시간이 지난 후에 각 세포에서의 p53 단백질 발현을 확인하기 위하여 다음과 같이 면역세포화학 방법을 실시하였다.
먼저, 세포를 예비냉각된 메탄올로 고정시킨 후 1% 젤라틴을 함유한 PBS 완충액으로 차단시켰다. 이 후 첫 번째 항체인 p53 단클론 항체 (DAKO)로 약 3시간 반응시키고 PBS 완충액으로 3번 세척한 후 두 번째 항체인 바이오틴 표지된 항쥐IgG로 약 1시간 반응시키고 다시 PBS 완충액으로 3번 세척한 후 아비딘-바이오틴 용액과 약 30분간 반응시켰다. 세척 후 DAB 기질 키트(VECTOR Laboratories 제품, 조성은 완충액, 과산화수소효소 용액, 3,3'-디아미노벤지딘[DAB] 용액, 니켈 용액 함유) 용액을 사용하여 발색시키고, 각 발현 벡터의 mRNA로 형질감염시킨 세포내에서의 p53 단백질 발현을 광학 현미경으로 확인하였다. 모든 벡터에서 p53 단백질이 거의 비슷하게 발현되었다. pcSFV-Agt/p53/PTEN으로 발현시킨 경우를 도 7, A의 제2열에서 보여주고 있다.
[도 7의 A: 면역세포화학 사진; 제 1열: 음성대조군, 제 2열: pcSFV-Agt/p53/PTEN로 형질감염, 제 3열: pcSFV-Agt/p53/ PTEN 로부터 얻은 재조합 바이러스로 감염]
상기 각 발현 벡터의 mRNA와 pc-helper mRNA로 형질감염후 48시간이 지난 세포의 배지를 3,000 rpm에서 15분간 원심분리한 후 초원심분리기 (SW 41 rotor, BECKMAN)로 35,000 rpm에서 3시간 동안 4℃에서 원심분리하여 세포에서 배지로 분비되는 재조합 SFV 입자를 농축하였다. 재조합 SFV 입자가 포함된 각각의 펠렛을 TNE [50mM Tris-HCl(pH 7.4), 100mM NaCl, 0.5mM EDTA] 완충액에 현탁시켜 실험 전까지 -70℃에 보관하였다. TNE 완충용액에 현탁되어 있는 재조합 SFV 입자로 세포를 감염시켜 p53의 발현 여부를 면역세포화학 방법과 웨스턴 면역블럿팅으로 확인하였다.
구체적으로 TNE 완충용액에 현탁되어 있는 바이러스 입자 100㎕에 키모트립신(chymotrypsin, 10㎎/㎖) 5㎕와 50mM CaCl22.5㎕를 넣고 얼음에서 30분 동안 반응시킨 후 아프로티닌(aprotinin, 2㎎/㎖) 45㎕를 넣어 바이러스 입자를 활성화시킨 후 MEM (1% 소혈청) 배지에 현탁시켜 70%의 단층 BHK-21 세포를 감염시켰다. 감염은 약 1시간 30분 동안 37℃의 5% CO2 배양기에서 수행하였고, 그 후 새 배지를 넣고 24 내지 48시간 동안 항온 배양하였다. 감염 후 24 내지 48시간이 지난 세포들을 상기의 면역세포화학 방법에 따라 관찰하였다. 그 결과 pcSFV-Agt/p53/PTEN로부터 얻은 재조합 바이러스로 감염시킨 후 모든 BHK-21 세포들이 p53, 안지오스타틴 및 PTEN을 각각 발현함을 도 7의 제 3열에서 보여주고 있다.
웨스턴 블럿팅 방법은 다음과 같이 실시하였다. 세포들을 세포 용해 완충액[1% NP40, 50mM Tris-HCl (pH7.6), 150mM NaCl, 2mM EDTA, 1㎍/㎕ PMSF]으로 용해시킨 후 동일한 세포 농도에서 얻은 단백질을 시료로 하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 후 분획된 단백질들을 PVDF 막으로 옮겼다. 단백질들이 옮겨진 PVDF 막을 차단 완충용액(50 mM Tris-HCl, 5% 스킴 밀크, pH 8.0)에서 1시간 동안 진탕시킨 후 p53 단백질에 대한 단클론 1차 항체 (1000배 희석)와 16시간 동안 반응시켰다. 막을 세척 완충액(20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20)으로 세척하고 바이오틴 표지된 항쥐 IgG 2차 항체 (1000배 희석)로 4시간 동안 반응시킨 후, 세척 완충액으로 재세척하고 아비딘-바이오틴(avidin-biotin) 시약과 1시간 동안 반응시킨 후 다시 세척하였다. 세척된 막을 DAB 기질 키트(VECTOR laboratories)내 용액으로 발색시켰다.
이 웨스턴 블럿으로부터 플라스미드 pcSFV-p53, pcSFV-Agt/p53, pcSFV-PTEN/p53, pcSFV-Agt/p53/PTEN 각각에 의해 BHK-21 세포에서 p53 단백질이 발현되었음을 확인하였다 (도 8의 A). [도 8의 A: 재조합 바이러스 감염 후의 웨스턴 블럿; 레인 1: BHK-21, 레인 2: pcSFV-p53, 레인 3: pcSFV-PTEN/p53, 레인 4: pcSFV-Agt/p53, 레인 5는 pcSFV-Agt/p53/PTEN]
위에서 얻어진 농축 재조합 SFV 입자를 전술한 방법과 동일한 방식으로 70%의 단층(monolayer)의 뇌암 세포 (U87MG: PTEN 돌연변이체, U251MG: PTEN과 p53 돌연변이체)에 감염시켰다. 48시간이 지난 각각의 세포에서 p53 단백질의 발현을 확인하기 위해 전술한 바와 동일한 방법으로 면역세포화학 방법을 수행하였다. 그 결과 암세포인 뇌암 세포(U87MG, U251MG)에서도 p53 단백질이 발현되었음을 확인할 수 있었다 (도 9 및 도 10).
[도 9 및 도 10: 면역세포화학 사진; 도 9는 U87MG세포, 도 6은 U251MG 세포이다; A: 음성 대조군, B: pcSFV-p53, C: pcSFV-Agt/p53, D: pcSFV-PTEN/p53, E: pcSFV-Agt/p53/PTEN]
또한, 농축 재조합 SFV 입자로 감염된 U87MG 및 U251MG 뇌암 세포를 p53에 대한 단클론 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅한 결과 p53 단백질이 생성되었음을 확인하였다 (도 11). [도 11: 웨스턴 블럿; (A: U87MG 세포, B: U251MG 세포); 레인 1: 음성 대조군, 레인 2: pcSFV-p53, 레인 3: pcSFV-PTEN/p53, 레인 4: pcSFV-Agt/p53, 레인 5: pcSFV-Agt/p53/PTEN]
위 결과로부터 pcSFV-p53, pcSFV-Agt/p53, pcSFV-PTEN/p53, pcSFV-Agt/p53/PTEN 벡터들의 RNA 전사물이 BHK-21 세포와 뇌암 세포(U87MG, U251MG)에서 p53 단백질을 발현시킴을 알 수 있었고, 나아가 위 각 발현 벡터와 pc-helper로부터 얻어진 재조합 SFV 입자가 p53 유전자를 충전하고 있음을 알 수 있었다.
<실시예 9>
암억제 유전자 PTEN의 RNA 계에 의한 발현
본 실시예에서는 발현 벡터 pcSFV-PTEN, pcSFV-PTEN/p53, pcSFV-Agt/p53/PTEN 플라즈미드를 가지고 PTEN 단백질의 발현을 확인하기 위하여 실시예 8의 방법에 따라 실험을 수행하였다. 면역세포화학 방법 및 웨스턴 블럿에는 PTEN에 대한 단클론 항체 (Santa Cruz Biotechnology)를 사용하였다.
면역세포화학으로 확인한 결과 pc-helper와 pcSFV-PTEN, pcSFV-PTEN/p53, pcSFV-Agt/p53/PTEN 플라즈미드의 RNA 전사물로부터 얻어진 재조합 바이러스는 BHK-21 세포에서 모두 PTEN 단백질을 발현하였다. 모든 벡터에서 PTEN 단백질이 거의 비슷하게 발현되었다. 또한, 웨스턴 면역블럿팅으로 확인한 결과 모두 PTEN에 대한 단클론 항체와 특이적으로 결합하는 약 55 KDa의 단백질을 발현시켰다. pcSFV-Agt/p53/PTEN 플라즈미드에 의한 발현을 도 7의 B 및 도 8의 B에 나타내었다.
[도 7의 B: 면역세포화학 사진; 제 1열: 음성대조군, 제 2열: pcSFV-Agt/p53/PTEN로 형질감염, 제 3열: pcSFV-Agt/p53/ PTEN 로부터 얻은 재조합 바이러스로 감염]
[도 8의 B: 재조합 바이러스 감염 후의 웨스턴 블럿; 레인 1: BHK-21, 레인 2: pcSFV-PTEN, 레인 3: pcSFV-PTEN/p53, 레인 4: pcSFV-Agt/p53/PTEN]
상기의 BHK-21 세포에서 만들어져 분비되는 재조합 SFV 입자를U87MG 및 U251MG 뇌암 세포에 감염시켜 면역세포화학 방법을 수행하고 아울러 각 세포 샘플을 웨스턴 블럿팅하였다. U87MG 및 U251MG 뇌암 세포에서 pcSFV-PTEN, pcSFV-PTEN/p53, pcSFV-Agt/p53/PTEN 플라즈미드 모두에 의해 PTEN 단백질이 발현되었고 (도 12), 그 발현된 단백질이 약 55 KDa의 PTEN 단백질임을 확인하였다 (도 13).
[도 12: 면역세포화학 사진; (A 내지 D: U87MG 세포, E 내지 H: U251MG 세포); (A, E): 음성 대조군, (B, F): pcSFV-PTEN, (C, G): pcSFV-PTEN/p53, (D, H): pcSFV-Agt/p53/PTEN]
[도 13: 재조합 바이러스 감염 후의 웨스턴 블럿; 레인 1: 음성 대조군, 레인 2: pcSFV-PTEN, 레인 3: pcSFV-PTEN/p53, 레인 4: pcSFV-Agt/p53/PTEN]
상기 실험 결과는 실시예 8의 결과와 함께 pcSFV-PTEN/p53, pcSFV-Agt/p53/PTEN의 경우 p53과 PTEN 단백질이 한 세포에서 발현됨을 의미하며 상기 벡터에 의해 만들어진 재조합 SFV 입자가 p53 유전자와 더불어 PTEN을 충전하고 있음을 나타낸다.
<실시예 10>
암억제 유전자 안지오스타틴의 RNA계에 의한 발현
본 실시예에서는 상기 발현 벡터 pcSFV-Agt, pcSFV-Agt/p53, pcSFV-Agt/p53/PTEN 플라즈미드를 가지고 안지오스타틴 단백질의 발현을 확인하기 위하여 실시예 8의 방법에 따라 실험을 수행하였다. 면역세포화학 방법 및 웨스턴 면역블럿팅에는 c-myc에 대한 단클론 항체(Invitrogen)를 사용하였다.
면역세포화학으로 확인한 결과 pc-helper와 pcSFV-Agt, pcSFV-Agt/p53, pcSFV-Agt/p53/PTEN 플라즈미드의 RNA 전사물로부터 얻어진 재조합 바이러스는 BHK-21 세포에서 모두 안지오스타틴 단백질을 비슷하게 발현하였다. 또한, 웨스턴 면역블럿팅으로 확인한 결과 모두 C-myc에 대한 단클론 항체와 특이적으로 결합하는 약 63 KDa의 재조합 안지오스타틴 단백질을 발현시켰다. pcSFV-Agt/p53/PTEN 플라즈미드에 의한 발현을 도 7의 C 및 도 8의 C에 나타내었다.
[도7의 C: 면역세포화학 사진; 제 1열: 음성대조군, 제 2열: pcSFV-Agt/p53/PTEN로 형질감염, 제 3열: pcSFV-Agt/p53/ PTEN 로부터 얻은 재조합 바이러스로 감염]
[도 8의 C: 재조합 바이러스 감염 후의 웨스턴 블럿; 레인 1: BHK-21, 레인 2: pcSFV-Agt, 레인 3: pcSFV-Agt/p53, 레인 4: pcSFV-Agt/p53/PTEN]
상기의 BHK-21 세포에서 만들어져 분비되는 재조합 SFV 입자를 U251MG 뇌암 세포에 감염시켜 면역세포화학 방법을 수행하고 아울러 각 세포 샘플을 웨스턴 블럿팅하였다. U251MG 세포에서 pcSFV-Agt, pcSFV-Agt/p53, pcSFV-Agt/p53/PTEN 플라즈미드 모두에 의해 안지오스타틴 단백질이 발현되었고 (도 14), 웨스턴 블럿팅으로 발현된 단백질이 약 63 kDa의 재조합 안지오스타틴임을 확인하였다 (도 15의 A). 재조합 안지오스타틴은 U251MG 뇌암 세포 배양 배지에서도 검출되었다 (도 15의 B).
[도 14: 면역세포화학 사진; A: 음성 대조군(U251MG), B: pcSFV-Agt, C: pcSFV-Agt/p53, D: pcSFV-Agt/p53/PTEN]
[도 15: 웨스턴 블럿; (A: 세포내 발현, B: 세포외 배지로 분비) 레인 1: 음성 대조군 (U251MG), 레인 2: pcSFV-Agt, 레인 3: pcSFV-Agt/p53 레인 4: pcSFV-Agt/p53/PTEN]
위 결과로부터 pcSFV-Agt/p53의 경우 p53과 더불어 안지오스타틴이 한 세포에서 발현되었음을, 그리고 pcSFV-Agt/p53/PTEN의 경우 p53, PTEN과 더불어 안지오스타틴이 한 세포에서 발현되었음을 알 수 있다. 위 실험은 나아가 pcSFV-Agt/p53/PTEN에 의한 재조합 SFV 입자의 경우 p53, PTEN 유전자와 더불어 안지오스타틴을 충전하고 있음을 보여주는 것이다.
<실시예 11>
재조합 SFV 입자에 의한 시험관내 암세포 증식억제
본 실시예에서는 실시예 2 내지 5에서 제작한 발현 벡터 pcSFV-p53, pcSFV-PTEN, pcSFV-Agt, pcSFV-PTEN/p53, pcSFV-Agt/p53, pcSFV-Agt/p53/PTEN의 mRNA와pc-helper mRNA에 의해 만들어져 세포에서 배지로 분비되는 재조합 SFV 입자 (p53, PTEN 또는 Agt 유전자를 각각 하나 또는 두 개 또는 세 개 포함)를 암세포인 뇌암 세포(U87MG 및 U251MG)에 감염시킨 후 트립판 블루 배제 방법으로 암세포 증식 억제를 확인하였다.
구체적으로 1 × 106의 암세포인 뇌암 세포(U87MG 및 U251MG)에 각각의 재조합 SFV 입자 5 × 106을 감염시키고 3시간이 지난 후 새로운 배지로 교체를 한 후 48시간 동안 항온배양한 뒤 암세포를 모아 트립판 블루로 살아 있는 세포를 염색하여 그 수를 혈구세포계수기로 측정하였다 (도 16). [도 16: 암세포 억제능 실험; None: 음성 대조군, A: pcSFV-lacZ, B: pcSFV-p53, C: pcSFV-PTEN, D: pcSFV-Agt, E: pcSFV-Agt/p53, F: pcSFV-PTEN/p53, G: pcSFV-Agt/p53/PTEN]. 도 16에서 보는 바와 같이 음성 대조군의 U87MG(백색 막대) 및 U251MG(빗금친 막대) 암세포는 그 성장과 분화를 계속하였고 pSFV-lacZ의 재조합 바이러스(재조합 SFV 입자)로 감염시켰을 경우에는 처음 세포수의 약 10% 감소를, 각각의 발현 벡터 pcSFV-p53, pcSFV-PTEN, pcSFV-Agt의 재조합 바이러스로 감염시켰을 경우에는 처음 세포수의 약 50% 감소를 보여 암세포의 억제를 확인하였다. 그리고 pcSFV-PTEN/p53과 pcSFV-Agt/p53의 재조합 바이러스로 감염시켰을 경우에는 처음 세포수의 약 60 내지 70% 감소를 보여 암세포의 억제를 확인하였으며, pcSFV-Agt/p53/PTEN의 경우에는 약 90% 감소를 보여 암세포의 억제를 분명하게 확인하였다.
상기의 실시예 결과로 p53, PTEN 그리고 안지오스타틴 유전자를 각각 혹은 두 개 혹은 세 개를 충전하고 발현하는 재조합 SFV 입자가 암세포인 뇌암 세포(U87MG, U251MG)에 감염이 되어 세포의 분화와 성장을 상승적으로 억제하였음을 알 수 있었다.
<실시예 12>
재조합 SFV 입자에 의한 암세포의 세포소멸 유도
본 실시예에서는 상기의 발현 벡터 pcSFV-p53, pcSFV-PTEN, pcSFV-Agt, pcSFV-PTEN/p53, pcSFV-Agt/p53, pcSFV-Agt/p53/PTEN 의 mRNA와 pc-helper mRNA에 의해 만들어져 세포에서 배지로 분비되는 p53, PTEN 및 안지오스타틴 유전자를 각각 혹은 두 개 혹은 세 개 함유한 재조합 SFV 입자가 암세포인 뇌암 세포(U87MG 및 U251MG)에 감염되어 증식을 억제시키는 것이 암세포들의 세포소멸 유도에 의한 것임을 세포소멸 검출 시스템인 플루오레세인(Promega)에 의해 확인하였다. 세포소멸 검출 시스템인 플루오레세인(Promega)은 고사 세포들의 단편 DNA를 튜넬(TUNEL) 염색과 요오드화프로피듐(PI) 표지화로 측정하였다.
U251MG 세포의 세포소멸을 가시화한 튜넬 분석 결과, 음성 대조군으로서 감염시키지 않은 U251MG 세포에서는 세포소멸을 나타내는 형광을 볼 수 없었으나, pcSFV-p53, pcSFV-PTEN, pcSFV-Agt, pcSFV-Agt/p53, pcSFV-PTEN/p53, pcSFV-Agt/p53/PTEN의 재조합 바이러스로 감염된 경우에는 세포들의 세포소멸을 나타내는형광을 볼 수 있었다. 세포소멸체들의 수는 p53, PTEN 및 안지오스타틴 유전자가 단독 포함된 경우 보다 두 개 그리고 그것 보다 세 개의 유전자를 함유한 재조합 SFV 입자로 감염시켰을 경우에 더 증가되었다.
세포소멸률을 보다 정량적으로 비교하기 위해 FACScan 유동 세포계수법(Becton Dickinson)을 사용하여 측정하였다. 음성 대조군으로서 감염시키지 않은 U251MG 세포, pcSFV-lacZ, pcSFV-p53, pcSFV-Agt/p53, pcSFV-PTEN/p53, pcSFV-Agt/p53/PTEN의 재조합 바이러스로 감염시킨 세포들 중에서 세포소멸율이 세 개의 유전자를 함유한 플라즈미드인 pcSFV-Agt/p53/PTEN의 재조합 바이러스로 감염된 세포에서 가장 높게 나타남을 정량적으로 확인하였다 (도 17).
결론적으로, p53, PTEN 및 안지오스타틴 유전자가 동시 발현되는 경우 암세포의 분화와 성장이 보다 현저하게 억제되는 것은 각 발현 단백질들이 상승적 세포소멸 작용을 유도하기 때문인 것으로 해석된다.
<실시예 13>
재조합 SFV 입자에 의한 생체외 암세포 증식억제
본 실시예에서는 상기의 발현 벡터 pcSFV-p53, pcSFV-PTEN, pcSFV-Agt, pcSFV-PTEN/p53, pcSFV-Agt/p53, pcSFV-Agt/p53/PTEN 의 mRNA와 pc-helper mRNA에 의해 만들어져 세포에서 배지로 분비되는 p53, PTEN 그리고 안지오스타틴 유전자를 각각 혹은 두 개 혹은 세 개의 유전자를 함유한 재조합 SFV 입자를 암세포인 뇌암세포 (U251MG)에 감염시킨 후 감염된 암세포를 누드 쥐(nude mouse)의 피하에 주사하여 암세포들의 증식억제를 암세포의 크기로 확인하였다.
구체적으로 1 x 106의 뇌암 세포(U251MG)에 각각의 재조합 SFV 입자 5 x 107을 감염시키고 3시간이 지난 후 세포들을 트립신 처리한 뒤 수집하여 트립판 블루로 염색하고 살아있는 2 x 106의 세포를 그룹 당 4마리씩의 누드 쥐의 피하에 주입하였다. 주입 후 30일이 지난 뒤 각각의 쥐에서 증식한 암의 크기를 캘리퍼로 측정한 후, 0.5 × 암의 최장 직경 × (암의 최단 직경)2의 공식으로 계산하여 각각의 그룹당 암의 크기에 대한 평균과 표준편차를 측정하였다(표 1).
표 1에서 보는 바와 같이 대조군인 U251MG 암세포는 그 성장과 분화를 계속하여 암의 크기가 3124 (㎣) ± 801(s.d.)까지 자랐으며 pSFV-lacZ의 재조합 바이러스 (재조합 SFV 입자)로 감염된 세포가 주입된 누드 쥐의 경우에는 대조군 크기의 약 52%였고, 각각의 발현 벡터 pcSFV-p53, pcSFV-PTEN, pcSFV-Agt의 재조합 바이러스로 감염시킨 세포가 주입된 누드 쥐의 경우에는 대조군 크기의 약 20 내지 25% 크기였다. 그리고 pcSFV-PTEN/p53와 pcSFV-Agt/p53의 재조합 바이러스로 감염시킨 세포가 주입된 누드 쥐의 경우에는 대조군 크기의 약 10 내지 15% 크기로 억제되었으며, pcSFV-Agt/p53/PTEN의 경우에는 대조군 크기의 약 5% 이하의 크기로 암세포를 억제하는 것을 확인하였다.
본 실시예는 p53/PTEN, PTEN/안지오스타틴, p53/안지오스타틴 및 p53/PTEN/안지오스타틴 단백질이 발현된 경우 각각 단백질이 발현된 경우보다 in vitro 경우와 마찬가지로 ex vivo에서도 암억제 면에서 상승 효과를 나타냄을 보여주는 것이다.
생체외에서 재조합 바이러스로 감염된 U251MG 세포를 누드 쥐에게 주입한 후 누드 쥐내에 나타나는 종양 증식
처리물 |
평균 용적(㎣±s.d.) |
모의군(n=4) |
3124±801 |
SFV-lacZ(n=4) |
1634±754 |
SFV-p53(n=4) |
726±194 |
SFV-PTEN(n=4) |
751±367 |
SFV-Agt(n=4) |
692±259 |
SFV-Agt/p53(n=4) |
312±103 |
SFV-PTEN/p53(n=4) |
479±179 |
SFV-Agt/p53/PTEN(n=4) |
156±72 |
세포를 재조합 바이러스로 4 내지 5시간 동안 감염시킨 후, 세척하고 누드 쥐에게 피하로 후속 주사하였다. 종양의 용적은 4주 후에 측정하였다. 그 결과를 종양의 평균 크기± 표준편차로 나타내었다. |
<실시예 14>
재조합 SFV 입자에 의한 생체내 암세포 증식억제
본 실시예에서는 상기의 발현 벡터 pcSFV-p53, pcSFV-PTEN, pcSFV-Agt, pcSFV-PTEN/p53, pcSFV-Agt/p53, pcSFV-Agt/p53/PTEN의 mRNA와 pc-helper mRNA에 의해 만들어져 세포에서 배지로 분비되는 p53, PTEN 또는 안지오스타틴의 유전자를 각각 혹은 두 개 그리고 세 개 함유한 재조합 SFV 입자를 누드 쥐의 피하로 주사하여 암세포인 뇌암 세포(U251MG)의 억제성을 암세포의 크기로 확인하였다.
구체적으로 1 × 107의 암세포인 뇌암 세포(U251MG)를 누드 쥐의 피하에 투여하여 암조직의 부피가 약 20 mm3가 되었을 때, 100㎕의 TNE 완충액에 현탁된 각각의 재조합 SFV 입자 1 × 109을 그룹당 4마리씩 나누어 각 그룹의 쥐의 피하에 생긴 암조직에 직접 투여하고 주입 후 3일이 지난 다음 동일양의 재조합 SFV 입자를 다시 같은 암조직에 투여하였다. 주입 후 5일마다 각 쥐에서 증식한 암의 크기를 캘리퍼로 측정하고 30일이 지난 뒤 다시 측정하였으며, 0.5 × 암의 최장 직경 × (암의 최단 직경)2의 공식으로 계산하여 각 그룹당 기간별 암의 크기에 대한 평균과 표준편차를 측정하였다 (도 18 및 도 19).
도 20에서 보는 바와 같이 대조군인 U251MG 암세포는 그 성장과 분화를 계속하여 암의 크기가 7432 (mm3) ± 669 (s.d.)까지 자랐으며 pSFV-lacZ의 재조합 바이러스(○)로 감염된 세포가 주입된 누드 쥐의 경우, 상기 암세포의 크기는 대조군 크기의 약 65%였고, 각각의 발현 벡터 pcSFV-p53(■), pcSFV-PTEN(▽), pcSFV-Agt(▼)의 재조합 바이러스로 감염시킨 세포가 주입된 누드 쥐의 경우, 상기 암세포의 크기는 대조군 크기의 약 40 내지 45%였다. 도 21에서 보는 바와 같이 pcSFV-PTEN/p53(▽)와 pcSFV-Agt/p53(▼)의 재조합 바이러스로 감염시킨 세포가 주입된 누드 쥐의 경우, 암세포의 크기는 대조군 크기의 약 20% 이하로 억제되었으며, pcSFV-Agt/p53/PTEN(■)의 경우에는 대조군 크기의 약 5% 이하로 관찰되어 암세포의 억제를 확인하였다.
본 실시예는 실시예 11 내지 실시예 13의 결과를 in vivo에서도 확인하였다는 점에 의의가 있다.
<실시예 15>
암억제 유전자 p53의 DNA계에 의한 발현
본 실시예에서는 발현 벡터의 시험관내 전사체를 만들지 않고 각각의 pcSFV-p53, pcSFV-Agt/p53, pcSFV-PTEN/p53, pcSFV-Agt/p53/PTEN 플라즈미드를 BHK-21 세포에 퓨진(Fugene) 6 시약을 사용하여 형질감염시켰다. 면역세포화학 방법과 웨스턴 면역블럿팅으로 p53의 발현을 확인하였다. 면역세포화학 방법과 웨스턴 블럿팅은 실시예 8의 방법에 따라 수행하였다.
본 발명의 발현 벡터 pcSFV-p53, pcSFV-Agt/p53, pcSFV-PTEN/p53 및 pcSFV-Agt/p53/PTEN의 DNA로 형질감염된 세포에서는 다량의 p53가 발현되었다. pcSFV-Agt/p53/PTEN DNA의 경우를 도 20의 A에 나타내었다. [도 20의 A: 면역세포화학 사진; 좌측 열: 음성 대조군, 우측 열: pcSFV-Agt/p53/PTEN]
또한, 도 21의 A에 도시한 웨스턴 블럿 결과를 통해서도 음성 대조군(BHK-21: 레인 1)과 달리 pcSFV-p53 (레인 2), pcSFV-PTEN/p53 (레인 3), pcSFV-Agt/p53/PTEN (레인 4)의 DNA로 형질감염된 세포에서 발현된 p53의 존재를 확인할 수 있었다.
<실시예 16>
암억제 유전자 PTEN의 DNA계에 의한 발현
본 실시예는 발현 벡터 pcSFV-PTEN, pcSFV-PTEN/p53, pcSFV-Agt/p53/PTEN 플라즈미드에 의한 PTEN 단백질의 발현을 확인하기 위하여 실시예 15와 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. 면역세포화학 방법과 웨스턴 면역블럿팅에는 PTEN에 대한 단클론 항체를 사용하였다.
본 발명의 발현 벡터 pcSFV-PTEN, pcSFV-PTEN/p53 및 pcSFV-Agt/P53/PTEN의 DNA로 형질감염된 세포에서 PTEN이 다량 발현됨을 확인하였다. pcSFV-Agt/p53/PTEN DNA의 경우를 도 20의 B에 나타내었다. [도 20의 B: 면역세포화학 사진; 좌측 열: 음성 대조군, 우측 열: pcSFV-Agt/p53/PTEN]
또한 도 21의 B에 도시한 웨스턴 블럿 실험에서도 음성 대조군 (BHK-21: 레인 1)과 달리 pcSFV-PTEN (레인 2), pcSFV-PTEN/p53 (레인 3), pcSFV-Agt/p53/PTEN (레인 4)의 DNA로 형질감염된 세포에서 발현된 PTEN의 존재를 확인할 수 있었다.
<실시예 17>
암억제 유전자 안지오스타틴의 DNA계에 의한 발현
본 실시예에서는 발현 벡터 pcSFV-Agt, pcSFV-Agt/p53, pcSFV-Agt/p53/PTEN 플라즈미드에 의한 안지오스타틴 단백질의 발현을 확인하기 위하여 실시예 15와 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. 면역세포화학 방법과 웨스턴 면역블럿팅은 C-myc에 대한 단클론 항체를 사용하였다.
면역세포화학 방법을 통해 음성 대조군의 경우와 달리 본 발명의 발현 벡터 pcSFV-Agt, pcSFV-Agt/p53 및 pcSFV-Agt/P53/PTEN의 DNA로 형질감염된 세포에서는 안지오스타틴이 다량 발현됨을 확인하였다. pcSFV-Agt/p53/PTEN DNA의 경우를 도 20의 C에 나타내었다. [도 20의 C: 면역세포화학 사진; 좌측 열: 음성 대조군, 우측 열: pcSFV-Agt/p53/PTEN]
도 21의 C에서 보는 바와 같이, 발현 플라즈미드 pcSFV-Agt (레인 2)에 의해서 발현된 약 63 KDa의 안지오스타틴 단백질 밴드를 확인하였다.