DE60129358T2

DE60129358T2 - Genetische immunisierung gegen zervixkarzinom

Info

Publication number: DE60129358T2
Application number: DE2001629358
Authority: DE
Inventors: Djoeke Geesje Regts; Marijke Holtrop; Jan Christiaan Wilschut; Catharina Arnoldine Daemen
Original assignee: Rijksuniversiteit Groningen
Current assignee: Rijksuniversiteit Groningen
Priority date: 2000-10-06
Filing date: 2001-10-08
Publication date: 2008-05-08
Anticipated expiration: 2021-10-09
Also published as: EP1865066A2; EP1370666A2; ES2290177T3; AU2002211095A1; EP1865066A3; US20070166328A1; DE60129358D1; CA2424700C; US20040005711A1; US7198792B2; ATE366819T1; CA2424700A1; EP1370666B1; WO2002029074A3; WO2002029074A2; EP1195438A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet des Zervixkarzinoms, das von Humanpapillomviren verursacht wird. Papillomviren sind kleine nackte DNA-Tumorviren (7,9 kb, doppelsträngig), die in hohem Maße artspezifisch sind. Über 90 individuelle Typen des Humanpapillomvirus (HPV) wurden beschrieben. Eine Genital-HPV-Infektion bei jungen, sexuell aktiven Frauen ist häufig, und die meisten Individuen eliminieren entweder die Infektion, oder wenn sich Läsionen entwickeln, bilden sich diese wieder zurück. Nur eine Teilmenge der infizierten Individuen haben Läsionen, die zu einer hochgradigen intraepithelialen Neoplasie fortschreiten, und nur ein Bruchteil davon schreiten weiter zu einem invasiven Karzinom fort. Ein Karzinom des Gebärmutterhalses bei Frauen entwickelt sich über ein präkanzeröses Zwischenstadium zu einem invasiven Karzinom, das häufig zum Tod führt. Die Infektion von Genital-Epithelzellen mit Humanpapillomvirus (HPV) Typ 16 und 18 ist eng mit der Entwicklung von Zervixkarzinomen verknüpft. Das HPV-Genom codiert 7 frühe (E) nichtstrukturelle regulatorische Proteine und zwei späte (L) strukturelle Proteine. Die Integration der viralen DNA in das Genom der Wirtszelle, die bei der HPV16- oder HPV18-induzierten Entwicklung von Zervixkarzinom als wesentlicher Schritt angesehen wird, führt zu einem Verlust der E1- oder E2-vermittelten transkriptionellen Regulation. Infolgedessen überexprimieren die transformierten Zellen die Proteine E6 und E7, was den malignen Transformationsvorgang einleitet [Pei (1996) Carcinogenesis 1996; 17: 1395-1401].
Die spezifische zellvermittelte Immunität spielt vermutlich eine wesentliche Rolle bei der Bekämpfung von HPV-Infektionen und von Zervixkarzinom. Diese Vermutung beruht auf Beobachtungen, die zeigen, (i) dass sich HPV-induzierte Läsionen bei der Mehrzahl der Individuen spontan wieder zurückbilden und (ii) dass immunschwache Patienten signifikant mehr HPV-verursachte proliferative Läsionen in der Haut und im anogenitalen Gewebe entwickeln als immunkompetente Individuen. In mehreren Tiermodellen wurde nachgewiesen, dass die HPV-Proteine E6 und E7, die in HPV-transformierten Zellen konstitutiv exprimiert werden, als Ziele für die CTL-vermittelte Abtötung von Tumorzellen und Stimulierung der tumorspezifischen CTL-Aktivität wirken kann. Die Induktion einer antigenspezifischen CTL-Antwort erfordert eine intrazelluläre Prozessierung des Zielantigens und eine Präsentation von antigenen Peptiden durch MHC-Klasse-I-Moleküle.
In den letzten Jahren wurden mehrere auf Peptid/Protein basierende oder genetische Immunisierungsstrategien für die Induktion von HPV-spezifischer CTL-Aktivität beschrieben. Zu den größeren Nachteilen, die mit einem auf Peptid basierenden Ansatz verbunden sind, gehören das Problem des MHC-Polymorphismus und die Gefahr des Induzierens einer T-Zell-Toleranz anstatt einer T-Zell-Aktivierung. Es wurde gezeigt, dass die Impfung mit einem tumorspezifischen Peptid aufgrund der Induktion einer spezifischen T-Zell-Toleranz zu einem verstärkten Auswuchs des Tumors führt. Eine Immunisierung mit größeren Proteinen würde diese Probleme überwinden, aber dies erfordert effiziente Antigen-Abgabesysteme und/oder sichere Adjuvantien für eine effiziente Erstimmunisierung. Die Induktion von HPV-spezifischen CTL-Antworten bei Mäusen nach Immunisierung mit rekombinantem Vacciniavirus, das HPV E6 oder E7 exprimiert, führte unerwarteterweise zu geringeren Titern im Vergleich zu dem Parentalstamm, was die Effektivität zum Induzieren der HPV-spezifischen CTL-Antwort stark reduziert. Weitere Nachteile, die mit der Verwendung des auf Vacciniavirus beruhenden Vektorsystems verbunden sind, sind Immunantworten gegen virale Proteine bei Präimmunpatienten oder ernster die Integration von rekombinanten Genen in das Wirtszellgenom (Retrovirus). Insbesondere wenn das rekombinante Virus Oncoproteine wie HPV E6 oder E7 codiert, gibt die Gefahr der Integration in das Wirtszellgenom Anlass zu größerer Sorge, da infizierte Zellen tatsächlich überleben und tumorigen (immortalisiert) werden können.
Die Erfindung stellt ein Semliki-Forest-Virus(SFV)-Vektorsystem bereit, das eine Nucleinsäure umfasst, die wenigstens ein antigenes Polypeptidfragment von Protein E6 und/oder Protein E7 des HPV codiert, Semliki-Forest-Viren bestehen aus einem Nucleocapsid mit einer Kopie eines einzelsträngigen RNA-Moleküls, das von einer Hülle umgeben ist, die Spike-Proteine enthält. SFV-RNA hat eine positive Polarität, die es der genomischen RNA ermöglicht, eine Infektion einzuleiten, wenn sie in das Cytoplasma einer Zelle eingeführt wird. Außerdem ist die RNA selbstreplizierend, da sie ihre eigene Replicase codiert, und die Replikation führt zu einer Expression der viralen Proteine in Wirtszellen auf hohem Niveau. Der hier verwendete Ausdruck "Nucleinsäuresequenz" oder "Nucleinsäuremolekül" bezieht sich auf ein Oligonucleotid, Nucleotid oder Polynucleotid sowie Fragmente oder Teile davon und auf DNA oder RNA genomischen oder synthetischen Ursprungs, die einzel- oder doppelsträngig sein kann und den Sense- oder Antisense-Strang darstellt. Die Definition "Antisense"-RNA ist eine RNA-Sequenz, die komplementär zu einer Sequenz von Basen in der entsprechenden mRNA ist: komplementär in dem Sinn, dass jede Base (oder die Mehrzahl der Basen) im Antisense-Strang (gelesen in der 5'→3'-Richtung) in der Lage ist, sich mit der entsprechenden Base in der mRNA-Sequenz, die in 5'→3¹-Richtung gelesen wird, zu paaren (G mit C, A mit U). Die Definition "Sense"-RNA ist eine RNA-Sequenz, die im Wesentlichen homolog zu wenigstens einem Teil der entsprechenden mRNA-Sequenz ist. Eine bevorzugte Ausführungsform besteht darin, dass die Nucleinsäuren von einem Humanpapillomvirus (HPV) Typ 16 und/oder Typ 18 abgeleitet sind. Die Erfindung stellt eine Nucleinsäure bereit, bei der es sich um ein Gen oder einen funktionellen Bestandteil eines Gens (wobei ein Gen eine Nucleinsäure ist, die exprimiert werden kann) oder einen Vorläufer eines Gens oder ein transcribiertes Gen auf irgendeinem Nucleinsäureniveau (DNA und/oder RNA: doppel- oder einzelsträngig) und/oder ein davon abgeleitetes Genprodukt handeln kann, das die Unterdrückung des Zellzyklus überwinden kann, indem es Haupttumorsuppressorproteine, d.h. die Genprodukte P58 und pRB (Retinoblastom), inaktiviert, was zum Velust der normalen zellulären Differenzierung bzw. zur Entwicklung eines Karzinoms führt. "Genprodukt" bezieht sich hier auf mRNA und die ausgehend von einem mRNA-Molekül translatierte Polypeptidkette, die wiederum ausgehend von einem Gen transcri biert wird; wenn das RNA-Transcript nicht translatiert wird (z.B. rRNA, tRNA), stellt das RNA-Molekül das Genprodukt dar. "Genprodukt" bezieht sich hier auf irgendeine proteinartige Substanz. "Proteinartige Substanz" bezieht sich auf irgendein Molekül, das ein Peptid oder Protein umfasst. Die Erfindung stellt vorzugsweise einen SFV-Vektor bereit, der eine Nucleinsäure umfasst, die vom Humanpapillomvirus (HPV) Typ 16 und/oder Typ 18 abgeleitet ist und die Oncogene E6 und E7 oder funktionelle Fragmente oder Derivate davon, die an der Transformation beteiligt sind, codiert. "Funktionelles Fragment oder Derivate davon" bedeutet hier, dass die betreffende Signatursequenz gegenüber der Referenzsequenz um eine oder mehrere Substitutionen, Deletionen oder Additionen variieren kann, deren Nettowirkung nicht zu einer funktionellen Ungleichheit zwischen den beiden Sequenzen führt. Der Fachmann weiß, dass als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes eine Vielzahl von Gensequenzen entstehen kann, von denen einige eine minimale Homologie zu den Nucleotidsequenzen irgendwelcher bekannter und irgendwelcher natürlich vorkommender Gene aufweisen. Die Erfindung zieht jede einzelne mögliche Variation der Nucleinsäure in Betracht, die erzielt werden könnte, indem man Kombinationen auf der Basis von möglichen unterschiedlichen Codons auswählt. Diese Kombinationen werden gemäß dem genetischen Standard-Triplett-Code erzeugt. Alle solche Variationen sind als spezifisch offenbart anzusehen. Theoretisch wäre eine minimale Fragmentlänge 9 Aminosäuren, da dies die Länge des durchschnittlichen CTL-Epitops ist. Eine Impfung mit Peptiden dieser Länge führt tatsächlich zu einer CTL-Antwort. Bevorzugt ist es jedoch, Konstrukte zu verwenden, die längere Peptide/Proteine codieren, so dass die Präparate nicht durch HLA-Restriktion eingeschränkt sind.
Die Erfindung stellt ein SFV-Vektorsystem bereit, das eine Nucleinsäure umfasst, wobei die Nucleinsäure wenigstens ein antigenes Polypeptidfragment von HPV codiert, wobei die Nucleinsäure wenigstens ein antigenes Polypeptidfragment von Protein E6 und/oder Protein E7 dieses HPV codiert. Der hier verwendete Ausdruck "antigenes Polypeptidfragment" bezieht sich auf wenigstens ein Genprodukt oder Fragment davon, das von der Nucleinsäure abgeleitet ist, wobei das Genprodukt eine oder mehrere proteinartige Substanzen umfasst, wobei die proteinartige Substanz ein Antigen ist (ein fremder Eindringling, bei dem es sich gewöhnlich um ein Protein oder eine proteingebundene Struktureinheit handelt), das eine Immunantwort auslösen kann. "Immunantwort" bezieht sich hier auf die physiologische Reaktion oder die physiologischen Reaktionen, die auf die Aktivierung des Immunsystems durch Antigene zurückgehen. Eine bevorzugte Ausführungsform ist eine, bei der die Immunantwort die Produktion von HPV-spezifischen cytotoxischen T-Lymphocyten (CTL) beinhaltet.
Die Erfindung stellt ein SFV-Vektorsystem bereit, das eine Nucleinsäure umfasst, wobei die Nucleinsäure wenigstens ein antigenes Polypeptidfragment von HPV codiert, wobei das antigene Polypeptidfragment von Protein E6 und/oder Protein E7 von HPV stammt. E6 und E7 sind virale Oncogene. Besonders bevorzugt umfasst das Genprodukt ein antigenes Polypeptidfragment vom E6-Protein und/oder E7-Protein von HPV. "E6- und E7-Protein" bezieht sich auf Oncoproteine, die von E6- bzw. E7-HPV-Gen abgeleitet sind und bei denen es sich um virale assoziierte Produkte handelt, die bei Zervixkarzinom exprimiert werden und Zielzellen immortalisieren können. Die Expression von E6- und E7-Genen wird in prämalignen und malignen Zervixläsionen selektiv aufrechterhalten, und ihre Genprodukte tragen zum Transformationsvorgang bei und sind notwendig, um den transformierten Zustand aufrechtzuerhalten.
Die Erfindung stellt auch ein SFV-Vektorsystem bereit, das eine Nucleinsäure umfasst, wobei die Nucleinsäure wenigstens ein antigenes Polypeptidfragment von HPV codiert, wobei das antigene Polypeptidfragment ein antigenes Polypeptidfragment von E6 und ein antigenes Polypeptidfragment von E7 umfasst. "Antigenes Polypeptidfragment von HPV" bezieht sich hier auf die Tumorantigene E6 und E7, die an die zellulären Tumorsuppressorprodukte pRB und P53 binden können. Vorzugsweise werden Nucleinsäuren, die E6 und E7 oder Fragmente davon codieren, rasterpassend miteinander fusioniert.
Die Erfindung stellt auch ein SFV-Vektorsystem bereit, das eine Nucleinsäure umfasst, wobei die Nucleinsäure wenigstens ein antigenes Polypeptidfragment von Protein E6 und/oder Protein E7 von HPV codiert, wobei das antigene Polypeptidfragment wenigstens teilweise seiner Fähigkeit, an pRb- und/oder P53-Protein zu binden, beraubt ist. Das Retinoblastom(pRb)-Gen und das p53-Gen codieren Tumorsuppressor-Genprodukte, die die Zellproliferation steuern. Ein Verlust der Aktivität beider Gene verursacht ein uneingeschränktes Zellwachstum. E7 ist ein cytoplasmatisches Serin-Phosphoprotein, und es zeigte sich, dass es sich um ein transcriptionales Transaktivator- und transformierendes Protein handelt. E7 bindet Rb-Protein und bewegt sich dann vermutlich zum Zellkern. E6 bindet an ein zelluläres Protein, das E6-Ap genannt wird. Dieser Komplex bindet dann an p53. E6-Ap ist eine Ubiquitin-Ligase. Zelluläre Enzyme beladen es mit aktivierten Ubiquitin-Molekülen, die auf p53 übertragen werden. Durch seine Ubiquitin-Beladung wird p53 zum Abbau durch Proteasomvermittelte Proteolyse gelenkt. Der erzwungenhe Eintritt in die S-Phase in Verbindung mit genomischer Instabilität, die aus einem p53-Abbau resultiert, kann zur Bösartigkeit führen. E6/7-Proteine von "risikoarmen" HPV-Stämmen scheinen nicht mit Rb und p53 zu assoziieren. Die Expression von E6/7-Antisense-Konstrukten reduziert das Zellwachstum, was darauf hinweist, dass E6/7 vielleicht nicht an der Einleitung beteiligt ist, aber ebenfalls den proliferativen und malignen Phänotyp aufrechterhält. Um die Gefahr zu überwinden, dass eine virusinfizierte Zelle, die E6 und E7 exprimiert, überlebt und tumorigen (immortalisiert) wird, eine Gefahr, die mit anderen, im Stand der Technik verwendeten Vektorsystemen (d.h. Vacciniavirus) verbunden ist, stellt die Erfindung ein rekombinantes Virus bereit, das E6- und E7-Oncogene exprimiert, denen die Kapazität fehlt, die Genprodukte Retinoblastom (pRb) und p53 zu unterdrücken. Somit werden mit dem Virus infizierte Zellen in einem nichttumorigenen (oder oncogenen) Zustand gehalten. Verfahren zum Reduzieren der DNA-Protein-Wechselwirkung und der Protein-Protein-Wechselwirkung sind bekannt. Dazu gehört unter anderem das Protein-Engineering. "Protein-Engineering" bezieht sich hier auf jede biochemische Technik, mit der neue Proteinmoleküle produziert werden. Diese Techniken können die de-novo-Synthese von Protein durch Zusammensetzen von funktionellen Einheiten von verschiedenen natürlichen Proteinen und durch Einführung kleiner Veränderungen, wie Insertionen, Deletionen und Substitutionen, in der Nucleotid- oder Proteinsequenz umfassen. Eine "Deletion" ist definiert als Veränderung entweder in der Nucleotid- oder in der Proteinsequenz, wobei ein oder mehrere Nucleotide bzw. Aminosäurereste fehlen. Eine "Insertion" oder "Addition" ist diejenige Veränderung in der Nucleotid- oder Proteinsequenz, die zur Hinzufügung von einem oder mehreren Nucleotiden bzw. Aminosäureresten im Vergleich zu dem oder den natürlich vorkommenden Polypeptiden führt. Eine "Substitution" resultiert aus dem Ersatz von einem oder mehreren Nucleotiden oder Aminosäuren durch verschiedene Nucleotide bzw. Aminosäuren.
Die Erfindung stellt weiterhin ein SFV-Vektorsystem bereit, das ein Translations-Enhancer-Element umfasst. Um eine niedrigere Expression zu überwinden oder die Expression von heterologen Proteinen gegenüber derjenigen, die man bei strukturellen viralen Proteinen während einer Wildtyp-SFV-Infektion erhält, zu verbessern, stellt die Erfindung ein SFV-Vektorsystem bereit, das ein Translations-Enhancer-Element umfasst, wobei das Translations-Enhancer-Element vorzugsweise ein virales Capsid-Gnsegment umfasst, besonders bevorzugt von einem Alphavirus (z.B. Semliki-Forest-Virus (SFV)). Ein "Translations-Enhancer-Element" ist hier definiert als funktionelles Sequenzsegment, das zum Beispiel von einem Prokaryonten, Eukaryonten oder Virus usw. stammt und das die Ausnutzung von Promotoren erhöhen kann und seine Funktion in beiden Orientierungen und an jeder Stelle (d.h. stromaufwärts oder stromabwärts) in Bezug auf den Promotor erfüllen kann. Angegeben wird selbstverständlich die Verwendung von Enhancer-Elementen im Allgemeinen, die die Synthese eines heterologen Proteins in einem Alphavirus-Vektorsystem verstärken kann. Die Wirkung solcher Enhancer wird wahrscheinlich durch die mRNA-Sequenz vermittelt, die während der Einleitung der Proteintranslation in cis wirkt. Weiterhin ist der ursprüngliche Ort des Startcodons AUG für eine solche Enhancer-Wirkung wichtig.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung witerhin ein SFV-Vektorsystem bereit, bei dem das Capsid- und das Spike-Protein von SFV ausgehend von wenigstens einem Nucleinsäuremolekül exprimiert werden. Das Capsid- und das Spike-Protein von SFV sind virale Strukturproteine. Das auf dem Semliki-Forest-Virus basierende System weist gegenüber derzeit verwendeten Systemen auf Visusbasis eine verstärkte biologische Sicherheit auf. Durch Aufteilen des Capsidbereichs, der einen Translations-Enhancer enthält, und des Spike-Proteinbereichs auf zwei unabhängige RNA-Moleküle und durch Cotransfizieren einer Zelle mit diesen beiden unabhängigen RNA-Molekülen und dem SFV-Vektor-Replicon ist die RNA-Rekombination wie auch die Produktion von replikationseffizienten Viren vernachlässigbar. Außerdem wird durch Abschaffen der Autoprotease-Aktivität des Capsidproteins die Sicherheit des Systems erhöht, was bedeutet, dass die Produktion von replikationseffizienten Viren weiterhin verhindert wird. In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung weiterhin ein SFV-Vektorsystem bereit, bei dem das Capsid- und das Spike-Protein von SFV ausgehend von wenigsetns zwei unabhängigen Nucleinsäuremolekülen exprimiert werden. Solche Vektorsysteme, von denen oben die rede ist, werden gewöhnlich Helfer-2-System und 2-Helfer- oder aufgeteiltes Helfersystem genannt.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Semliki-Forest-Virus(SFV)-Expressionssystem bereit. SFV gehört zur Gattung Alphavirus der Familie Togaviridae. Eine cDNA-Kopie des viralen SFV-Genoms in voller Länge wurde in ein bakterielles Plasmid kloniert, das eine prokaryontische DNA-abhängige RNA-Polymerase beinhaltet, so dass virale RNA in vitro transcribiert werden kann. Diese RNA-Transcripte sind voll infektiös (d.h. die Einführung in Zellen genügt, um die Replikation und einen vollen Infektionszyklus einzuleiten, was zur Virusbildung führt). Das Semliki-Forest-Virus(SFV)-Expressionssystem erlaubt eine effiziente Expression von fremden codierenden Sequenzen als Teil des SFV-RNA-Replicons. Das virale SFV-System ist besonders gut geeignet, um zelluläre Immunantworten gegen Oncoproteine wie HPV-16/18 E6 und E7 sicher zu induzieren. Erstens ist SFV ein RNA-Virus, das im Cytosol der Zelle repliziert wird, so dass es keine Gefahr der Integration des E6- und des E7-Gens in das zelluläre Genom gibt. Außerdem bewirkt eine SFV-Infektion eine Cytolyse durch Apoptose, und daher ist es nicht wahrscheinlich, dass genetische Information von E6 und E7 nach der Injektion länger als eine Woche überdauert. Außerdem werden außer kleinen Mengen von viraler Replicase keine anderen Vektorproteine produziert. Immunantworten gegen den SFV-Vektor selbst hemmten keine Auffrischungsantworten durch anschließende Immunisierungen mit demselben Vektor, ein Problem, das mit anderen viralen Vektorsystemen assoziiert ist. Wie hier in der ausführlichen Beschreibung näher erläutert ist, wurde weiterhin eine cDNA-Kopie des viralen SFV-Genoms in voller Länge in ein bakterielles Plasmid kloniert, das eine prokaryontische DNA-abhängige RNA-Polymerase beinhaltet, so dass virale RNA in vitro transcribiert werden kann. Diese RNA-Transcripte sind voll infektiös (d.h. die Einführung in Zellen genügt, um die Replikation und einen vollen Infektionszyklus einzuleiten, was zur Virusbildung führt). Das Semliki-Forest-Virus(SFV)-Expressionssystem erlaubt eine effiziente Expression von fremden codierenden Sequenzen als Teil des SFV-RNA-Replicons.
Die Erfindung stellt weiterhin ein SFV-Vektorsystem bereit, wobei das HPV HPV16 und/oder HPV18 umfasst. Besonders bevorzugt umfasst das Alphavirus-Vektorsystem ein auf Humanpapillomvirus (HPV) basierendes Vektorsystem und ganz besonders bevorzugt ein HPV-Vektorsystem auf der Basis von HPV Typ 16 und 18, die enger mit der Entwicklung von Zervixkarzinom verbunden sind. Mit eingeschlossen sind viralen Varianten aller bevorzugten viralen Vektorsysteme der vorliegenden Erfindung.
Die Erfindung stellt weiterhin ein SFV-Vektorsystem gemäß der vorliegenden Erfindung bereit, bei dem die Nucleinsäure weiterhin ein Cytokin-Gen oder ein funktionelles Fragment davon codiert. Cytokine sind primär an der Signalübermittlung zwischen Zellen des Immunsystems beteiligt. Es wird hier die Verwendung von Granulocyten-Makrophagen-koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF) und/oder Interleukin 12 (IL-12) angegeben, doch könnte man auch IL-2, IL-6, IL-18 und auch andere in Betracht ziehen. Es wird hier auch die Verwendung von getrennten Vektorpartikeln, zum Beispiel SFV-Partikeln, die Cytokine codieren, und SFV-Partikeln, die eE6,7 codieren, angegeben. Die Partikel wirken nicht notwendigerweise zu demselben Zeitpunkt/an derselben Stelle, und durch Herstellung getrennter Partikel können die Präparate getrennt (zeitlich/in Bezug auf Verabreichungsweg/Dosierung) gegeben werden. Die Definition "funktionelles Fragment" bedeutet hier ein Fragment (d.h. Referenzsequenz), das von der betreffenden Sequenz (z.B. einem Cytokin-Gen) abgeleitet ist und das gegen über der betreffenden Sequenz um eine oder mehrere Substitutionen, Deletionen oder Additionen variieren kann, deren Nettowirkung nicht zu einer nachteiligen funktionellen Ungleichheit zwischen der Referenz- und der betreffenden Sequenz führt.
Die Erfindung stellt weiterhin eine Zelle bereit, die einen oder mehrere SFV-Vektorsysteme gemäß der Erfindung umfasst. Verfahren zum Infizieren einer Zielzelle mit einem rekombinanten Virus der vorliegenden Erfindung sind bekannt. Die Erfindung gibt weiterhin die Verwendung eines oder mehrerer SFV-Vektorsysteme gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder einer Zelle, die mit einem oder mehreren SFV-Vektorsystemen gemäß der vorliegenden Erfindung infiziert ist, zur Herstellung eines Medikaments an. Eine bevorzugte Ausführungsform ist ein Medikament, das ein Pharmakon ist. Zusammensetzungen für die Herstellung eines Medikaments und Verfahren zum Verabreichen des Medikaments, das ein rekombinantes Alphavirus und/oder eine Zelle, die das erfindungsgegenständliche rekombinante SFV enthält, werden hier ebenfalls bereitgestellt. Die Erfindung gibt weiterhin die Verwendung eines oder mehrerer SFV-Vektorsysteme gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder einer Zelle, die mit einem oder mehreren SFV-Vektorsystemen gemäß der vorliegenden Erfindung infiziert ist, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Zervixkarzinom an.
Die Erfindung gibt weiterhin die Verwendung eines oder mehrerer SFV-Vektorsysteme gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder einer oder mehrerer Zellen, die mit einem oder mehreren SFV-Vektorsystemen gemäß der vorliegenden Erfindung infiziert sind, zur Herstellung eines Medikaments an, wobei das Medikament ein Impfstoff ist. Impfstoffzusammensetzungen und Verfahren zum Verabreichen eines Impfstoffs an einen Patienten sind in der Technik wohlbekannt. In einer bevorzugten Ausführungsform gibt die Erfindung ein biologisch sicheres Verfahren zum Impfen gegen Zervixkarzinom an, das das Bereitstellen eines SFV-Vektorsystems mit einem breiten Wirtsspektrum umfasst, welches eine Nucleinsäure umfasst, die Tumorantigene codiert, denen die Fähigkeit fehlt, an die zellulären Tumorsuppressorprodukte pRB und p53 zu binden, und die in der Lage sind, eine HPV-spezifische cytotoxische T-Lymphocyten(CTL)-Antwort gegen HPV-transformierte Tumorzellen, die Tumorantigene exprimieren, zu induzieren. CTLs können Zellen zerstören, die fremde Antigene exprimieren, und zwar durch Erkennung von fremden Peptiden, die innerhalb der Zelle erzeugt und zur Zelloberfläche transportiert und durch Histokompatibilitäskomplex(MHC)-Klasse-I-Antigene präsentiert werden. Sie sind daher potentiell starke Mittel zur Tumorzellzerstörung.
Die Erfindung gibt weiterhin die Verwendung eines oder mehrerer SFV-Vektorsysteme gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder einer oder mehrerer Zellen, die mit einem oder mehreren SFV-Vektorsystemen gemäß der vorliegenden Erfindung infiziert sind, zur Herstellung eines Medikaments an, wobei das Medikament ein Impfstoff für die Behandlung von Zervixkarzinom ist. Solche rekombinanten Semliki-Forest-Viren umfassen wenigstens eine Nucleinsäure, die von den viralen Oncogenen HPV E6 und/oder HPV E7 abgeleitet sind, welche von HPV Typ 16 und/oder 18 stammen, um den Körper für die Behandlung und Prävention von Zervixkarzinom gegen vorzugsweise HPV Typ 16 und/oder 18 zu immunisieren.
Die Erfindung gibt weiterhin ein Verfahren zur Behandlung oder Prävention von Zervixkarzinom an, das das Versorgen eines Individuums mit einem Medikament umfasst, das einen oder mehrere SFV-Vektorsysteme gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder eine oder mehrere Zellen, die mit einem oder mehreren SFV-Vektorsystemen gemäß der vorliegenden Erfindung infiziert sind, zur Herstellung eines Medikaments umfasst, wobei das Medikament ein Impfstoff für die Behandlung von Zervixkarzinom ist.
Ausführliche Beschreibung
Genetische Immunisierung gegen Zervixkarzinom
Aus molekularen, klinischen und epidemiologischen Studien geht hervor, dass die risikoreichen Humanpapillomviren HPV16 und HPV18 mit der Entwicklung von Vorläuferläsionen von Zervixkarzinom und invasivem Zervixkarzinom verknüpft sind. Das HPV-Genom codiert 7 frühe (E) nichtstrukturelle regulatorische Proteine und zwei späte (L) strukturelle Proteine. Die Integration der viralen DNA in das Genom der Wirtszelle, die ein wesentlicher Schritt bei der HPV16- oder HPV18-induzierten Entwicklung von Zervixkarzinom ist, führt zu einem Verlust der E1- oder E2-vermittelten transkriptionellen Regulation. Infolgedessen überexprimieren die transformierten Zellen die Proteine E6 und E7, was den malignen Transformationsvorgang einleitet.
Die spezifische zellvermittelte Immunität spielt vermutlich eine wesentliche Rolle bei der Bekämpfung von HPV-Infektionen und von Zervixkarzinom. Diese Vermutung beruht auf Beobachtungen, die zeigen, (i) dass sich HPV-induzierte Läsionen bei der Mehrzahl der Individuen spontan wieder zurückbilden und (ii) dass immunschwache Patienten signifikant mehr HPV-verursachte proliferative Läsionen in der Haut und im anogenitalen Gewebe entwickeln als immunkompetente Individuen. In mehreren Tiermodellen wurde nachgewiesen, dass die HPV-Proteine E6 und E7, die in HPV-transformierten Zellen konstitutiv exprimiert werden, als Ziele für die CTL-vermittelte Abtötung von Tumorzellen und Stimulierung der tumorspezifischen CTL-Aktivität wirken kann.
Die Induktion einer antigenspezifischen CTL-Antwort erfordert eine intrazelluläre Prozessierung des Zielantigens und eine Präsentation von antigenen Peptiden durch MHC-Klasse-I-Moleküle. Dies kann mit rekombinanten viralen Vektoren effizient erreicht werden. Heino P. et al., "Human papillomavirus type 16 capsid Proteins produced from recombinant Semliki Forest virus assemble into virus-like particles" beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von HPV16-virusartigen Partikeln (VLPs). Diese VLPs bestehen aus dem zwei HPV16-Strukturproteinen L1 und L2. Nach Expression von L1 und L2 in produzierenden Zellkulturen erzeugen die Zellen VLPs. In diesem Artikel wird das Semliki-Forest-Virus(SFV)-Vektorsystem verwendet, um L1 und L2 in einer produzierenden Zelle mit dem Zweck zu exprimieren, HPV16-VLPs zu erzeugen. Der Artikel bezieht sich nicht auf die Entwicklung eines Alphavirusvektors für die genetische Immunisierung gegen Zervixkarzinom. Dementsprechend bezieht er sich nicht auf die Expression der HPV16-Tumorantigene E6 und E7. Der Artikel ist nur insofern indirekt relevant, als HPV16-VLPs, die aus L1 und L2 bestehen, als Impfstoff für die Induktion einer Antikörperantwort gegen das Virus HPV16 verwendet werden könnten. Eine solche Antwort wäre jedoch nicht gegen HPV16-induzierte Tumoren gerichtet, da solche Tumoren nur die viralen Tumorantigene E6 und E7 exprimieren.
Boursnell M.E.G. et al., "Construction and characterization of a recombinant vaccinia virus expressing human papillomavirus Proteins for immunotherapy of cervical cancer", beschreiben die Konstruktion und Charakterisierung eines rekombinanten Vacciniavirusvektors (TA-HPV), der die Tumorantigene E6 und E7 von HPV16 oder HPV18 exprimiert. Es wird nachgewiesen, dass das rekombinante Virus nach intzraperitonealer Verabreichung an Mäuse die Fähigkeit hat, eine cytotoxische T-Lymphocyten(CTL)-Antwort gegen Zellen, die mit demselben Virusvektor infiziert oder mit einem synthetischen E7-Peptidepitop sensibilisiert sind, im Sinne einer Erstimmunisierung auszulösen. Der in der vorliegenden Erfindung offenbarte SFV-Vektor hat gegenüber dem TA-HPV-Vektor mehrere ausgeprägte und wichtige Vorteile. Erstens ist der SFV-Vektor replikationsinkompetent, während der Vacciniavirusvektor, der auf abgeschwächtem lebenden Pockenvirus beruht, replikationstüchtig ist. Die Replikationstüchtigkeit stellt ein großes Sicherheitsproblem dar, da die TA-HPV-Vektoren potentiell oncogene Sequenzen tragen, die von HPV16 oder HPV18 abgeleitet sind.
Zweitens ist das Vacciniavirus ein DNA-Virus, während Semliki-Forest-Viren RNA-Viren sind, die ihre RNA im Cytosol von Zellen replizieren und translatieren, ohne dass eine Prozessierung im Zellkern beteiligt ist. Daher können Gene, die von einem SFV-Vektor codiert werden, nicht in das Genom der Zelle integriert werden, während diese Möglichkeit im Falle von DNA-Virusvektoren nie ausgeschlossen werden kann. Die ausschließlich cytosolische RNA-Prozessierung des Genoms von SFV-Vektoren stellt ein wichtiges Sicherheitsmerkmal dieser Systeme dar.
Drittens enthält der in der vorliegenden Erfindung offenbarte SFV-Vektor einen Translations-Enhancer vor der antigenen Sequenz, die von HPV abgeleitet ist. Dieser Translations-Enhancer gewährleistet hohe Niveaus der Antigenexpression in Zielzellen. Der offenbarte SFV-Vektor ist also erheblich effizienter als der TA-HPV-Vektor und induziert höhere Niveaus der CTL-Aktivität mit kleineren Dosen des Virus.
EP 0 711 829 A bezieht sich auf eine spezifische Unterkategorie von Alphavirusvektoren, d.h. Sindbis-Virusvektoren. Unsere vorliegende Erfindung offenbart einen anderen Alphavirusvektor (vom Semliki-Forest-Virus abgeleitet), der eine antigene Sequenz eines HPV codiert. Während darauf hingewiesen wird, dass fremde antigene Sequenzen in den vom Sindbis-Virus abgeleiteten Vektor mit aufgenommen werden können (viele Möglichkeiten werden erwähnt, einschließlich Sequenzen, die von einem HPV abgeleitet sind), beinhaltet keines der Beispiele die Expression der von HPV abgeleiteten antigenen Sequenzen E6 und/oder E7, sondern beziehen sich stattdessen auf die Expression von Antisense-Sequenzen gegen E6 und/oder E7, in einem völlig anderen Ansatz, der auf die Hemmung der E6- und/oder E7-Expression und nicht auf die Stimulierung einer Immunantwort gegen E6 und/oder E7 abzielt, ganz zu schweigen von einer Induktion einer cytotoxischen T-Lymphocyten-Antwort unter Verwendung des vom Sindbis-Virus abgeleiteten Vektors, wie es in der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird. Weiterhin umfasst der vom Sindbis-Virus abgeleitete Vektor keine Translations-Enhancer-Sequenz.
WO 99/28487 A (Crown in the right of the Queen; Khromykh; Varnavs), "Flavivirus expression and delivery systems", diskutiert ein Flavivirus-Expressionssystem. Es beinhaltet keine Alphavirus-Expressionsvektoren. Flaviviren umfassen eine andere Familie von positivsträngigen RNA-Viren, d.h. die Flaviridae. Alphaviren gehören zur Familie Togaviridae.
Borysiewicz L.K. et al., "A recombinant vaccinia virus encoding human papillomavirus types 16 and 18, E6 and E7 proteins as immunotherapy for cervical cancer", beschreibt das Ergebnis eines ersten humanen klinischen Versuchs mit einem lebenden rekombinanten Vacciniavirusvektor, der das E6- und das E7-Protein von HPV16 und HPV18 exprimiert (TA-HPV). Die Konstruktion und Charakterisierung des TA-HPV-Vektors ist bei Boursnell et al. beschrieben.
Berglund P. et al., "Immunization with recombinant Semliki Forest virus induces protection against influenza challenge in mice", beschreibt eine Immunisierungsstudie bei Mäusen unter Verwendung des rekombinanten SFV-Vektorsystems, das das Influenzavirus-Nucleoprotein oder E.-coli-LacZ codiert. Es bezieht sich nicht auf SFV, das von HPV abgeleitete Antigene codiert.
In der vorliegenden Studie besteht unser Ansatz darin, das Semliki-Forest-Virus(SFV)-Expressionssystem zu verwenden. SFV gehört zur Gattung Alphavirus der Familie Togaviridae.¹³ Alphaviren bestehen aus einem Nucleocapsid mit einer Kopie eines einzelsträngigen RNA-Moleküls, das von einer Hülle umgeben ist, die Spike-Proteine enthält. Alphavirus-RNA hat eine positive Polarität, die es der genomischen RNA ermöglicht, eine Infektion einzuleiten, wenn sie in das Cytoplasma einer Zelle eingeführt wird. Außerdem ist die RNA selbstreplizierend, da sie ihre eigene Replicase codiert, und die Replikation führt zu einer Expression der viralen Proteine in Wirtszellen auf hohem Niveau. Eine cDNA-Kopie des viralen SFV-Genoms in voller Länge wurde in ein bakterielles Plasmid kloniert, das eine prokaryontische DNA-abhängige RNA-Polymerase beinhaltet, so dass virale RNA in vitro transcribiert werden kann. Diese RNA-Transcripte sind voll infektiös, d.h. die Einführung in Zellen genügt, um die Replikation und einen vollen Infektionszyklus einzuleiten, was zur Virusbildung führt.¹⁴ Liljeström und Mitarbeiter^14-16 entwickelten ein Vektorsystem, das eine effiziente Expression von fremden codierenden Sequenzen als Teil des SFV-RNA-Replicons erlaubt. Ein hohes Niveau der biologischen Sicherheit wird dadurch erreicht, dass man die Replicase- und Struktur-Gene des viralen Genoms voneinander trennt. So können rekombinante Viruspartikel produziert werden, die Zellen nur einmal infizieren. Außerdem wurde bei dem SFV-Helfer (der die Struktur-Gene enthält) eine Mutation in das Gen eingeführt, das eines der Spike-Proteine codiert.¹⁵ Tatsächlich können solche Viruspartikel keine Zellen infizieren, es sei denn, sie werden mit exogener Protease aktiviert.
Ausführliche Beschreibung
Beispiel 1
Hier beschreiben wir die Konstruktion von rekombinantem SFV, das HPV16 E6 und E7 codiert, und die zelluläre Immunantwort bei Mäusen, die durch diese rekombinanten SFV-E6/E7-Partikel induziert wird. Die Infektion von Genital-Epithelzellen mit Humanpapillomvirus (HPV) Typ 16 und 18 ist eng mit der Entwicklung von Zervixkarzinom verbunden. Das Transformationspotential dieser risikoreichen HPVs hängt von der Expression der frühen viralen Genprodukte E6 und E7 ab. Da die Expression von E6 und E7 bei prämalignen und malignen Zervixläsionen selektiv aufrechterhalten wird, sind diese Proteine attraktive Kandidaten für immuntherapeutische und prophylaktische Strategien. Hier beschreiben wir die Konstruktion, Charakterisierung und das in-vivo-immuntherapeutische Potential von rekombinantem Semliki-Forest-Virus (SFV), das die HPV16-Proteine E6 und E7 exprimiert (SFV-E6E7). Die Western-Blot-Analyse und die Immunfluoreszenzfärbung bewiesen die Expression von E6 und E7 in mit SFV-E6E7 infizierten BHK-Zellen. Die Immunisierung von Mäusen mit SFV-E6E7 führte zu einer effizienten in-vivo-Erstimmunisierung von HPV-spezifischer CTL-Aktivität. Die induzierten CTLs lysierten murine Tumorzellen, die mit dem HPV16-Genom transformiert waren, und EL4-Zellen, die mit einem immundominanten Klasse-I-bindenden HPV-E7-Peptid beladen waren. CTLs konnten reproduzierbar durch Immunisierung mit drei Injektionen von nur 10⁵ infektiösen Einheiten SFV-E6E7 induziert werden. Der Schutz vor der Tumor-Challenge wurde unter Verwendung der Tumorzelllinie TC-1 untersucht. Eine Immunisierung mit 5 × 10⁶ SFV-E6E7-Partikeln schützte 40% der Mäuse vor einer Tumor-Challenge. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die E6E7-Expression durch das effiziente und sichere rekombinante SFV-System eine vielversprechende Strategie für die Immuntherapie oder die Immunprophylaxe von Zervixkarzinom darstellt.
Ergebnisse
Produktion und Titerbestimmung von SFV-Partikeln
Rekombinante SFV-Partikel wurden in BHK-Zellen durch Einfügung von rekombinanter und Helfer-2-RNA in diese Zellen durch Elektroporation hergestellt. Nach 24 h wurde das Medium, das das Virus enthält, von den Zellen entfernt, und die Viruspartikel wurden gereinigt. Titer wurden durch Immunfluoreszenz unter Verwendung eines Antikörpers gegen SFV-nsP3 (Replicase) bestimmt. Dieser Antikörper wurde gewählt, weil Replicase in allen Zellen vorhanden ist, die mit rekombinantem SFV infiziert sind. Somit können Titer von verschiedenen rekombinanten SFVs unabhängig von dem bzw. den eingefügten Fremdgenen bestimmt werden. Typischerweise betrugen die Titer des ungereinigten Virus 10⁹-10¹⁰ infektiöse Einheiten/ml. Nach der Reinigung betrugen die Titer 10¹⁰-10¹¹ infektiöse Einheiten/ml.
Western-Blot-Analyse der E6- und E7-Expression
Um zu bestätigen, dass SFV-E6E7 die Expression der rekombinanten E6- und E7-Proteine induzierte, wurden BHK-Zellen mit SFV-E6E7 oder SFV-LacZ, das als negative Kontrolle diente, infiziert. In 1 sind Western-Blots von Zelllysaten gezeigt, die mit Anti-HPV16-E6 (Bild A) oder Anti-HPV16-E7 (Bild B) sondiert wurden. Durch das Anfärben mit dem polyklonalen Anti-E6-Antikörper zeigte sich eine Bande mit einem M_r von ungefähr 17 kDa. Durch das Anfärben mit dem monoklonalen Anti-E7-Antikörper zeigte sich eine Bande mit einer scheinbaren elektrophoretischen Mobilität von ungefähr 20 kDa. Dieses Mr entspricht nichrt dem berechneten Mr (11 kDa), steht aber im Einklang mit anderen Studien, bei denen E7 durch eukaryontische sowie prokaryontische Expressionssysteme produziert wurde.^17-20
Expression von HPV16 E6 und E7 in SFV-E6E7-infizierten Zellen
Die Expression von E6 und E7 wurde auch durch indirekte Immunofluoreszenzanalyse von BHK-Zellen, die mit SFV-E6E7 infiziert waren, analysiert. Ein niedriges Partikel-Zellen-Verhältnis wurde gewählt, so dass nicht alle Zellen in den Näpfen infiziert werden, um positive und negative Zellen innerhalb eines einzigen mikroskopischen Gesichtsfelds sichtbar zu machen. Wie in 2 gezeigt ist, wurde bei infizierten Zellen eine starke Fluoreszenz sowohl von E6 als auch von E7 gefunden. Im Allgemeinen wurde eine satte Färbung von E6 im Perinucleus und im Cytoplasma gefunden, während E7 hauptsächlich im Perinucleus gefunden wurde. Frühere Studien bewiesen eine Lokalisierung des HPV18-E6-Proteins in der Zellkernmatrix und in nichtnukleären Membranen^21,22 und von HPV16 E7 im Zellkern¹⁸. Es ist jedoch sehr wahrscheinlich, dass Unterschiede im Anfärbungsmuster durch die Mengen an produzierten Proteinen und den für die Expression der Proteine verwendeten Vektor beeinflusst werden können¹⁸.
HPV-spezifische CTLs, induziert durch Immunisierung von Mäusen mit SFV-E6E7
Mäuse wurden mit 10⁶ gereinigten SFV-E6E7-, SFV-LacZ-Partikeln oder Puffer als Kontrolle subkutan immunisiert und zweimal (s.c. und i.p.) einer Auffrischimpfung unterzogen. Die CTL-Aktivität wurde eine Woche nach der letzten Auffrischimpfung bestimmt. Nach 11 bzw. 18 Tagen in-vitro-Restimulierung wurden die resultierenden Effektorzellen auf ihre cytolytische Aktivität gegen 13-2-Zielzellen getestet. Wie in 3 gezeigt ist, wurde nach Verabreichung von SFV-E6E7-Partikeln eine starke CTL-Aktivität induziert (3A und 3B, Quadrate und Rauten), während nach Immunisierung mit SFV-LacZ-Partikeln oder PBS (3, Dreiecke bzw. Kreuze) keine HPV-spezifische CTL-Aktivität induziert wurde. Das mittlere Niveau der Cytolyse am Tag 11 (3A) erhöhte sich leicht nach längerer in-vitro-Restimulierung, d.h. nach 18 Tagen Kultur (3B).
Da 13-2-Zellen nur das MHC-Klasse-I-H-2D^b-bindende CTL-Epitop des HPV16-E7-Peptids 49-57 (RAHYNIVTF)⁹ exprimieren, werden gegen andere Epitope auf E6 und E7 gerichtete CTL-Klone nicht nachgewiesen. Wir testeten auch die CTL-Aktivität gegen C3-Zellen als Zielzellen, d.h. Zellen, die das gesamte HPV16-Genom exprimieren. CTLs, die nach 11 Tagen Restimulierung unter Verwendung von C3-Zellen als Stimulatorzellen vorhanden waren, lysierten 13-2-Zellen (4A) und C3-Zellen (4B) im gleichen Maße. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass das HPV16-E7-Peptid 49-57 eines der dominanten CTL-EPitope ist, das von CTLs erkannt wird, die nach Immunisierung mit E6 und E7 in C57BL/6(H-2^b)-Mäusen erzeugt werden.
Diese Vermutung wird durch die Beobachtung gestützt, dass mit HPV16 E7 49-57 beladene Zielzellen in sehr hohem Maße erkannt und lysiert wurden. 5A zeigt CTL-Aktivität, die in zwei mit 10⁶ SFV-E6E7-Partikeln immunisierten Mäusen induziert wurde, gegen EL4-Zellen, die mit dem E7-49-57-Peptid beladen sind, als Targets. Andererseits erkannten mit SFV-LacZ-Partikeln oder PBS immunisierte Mäuse keine peptidbeladenen EL4-Zellen (5A, Dreiecke bzw. Kreuze). Außerdem wurden unbeladene EL4-Zellen von diesen CTLs nicht erlkannt und lysiert (5B).
Um die minimale effektive Dosis von SFV-E6E7-Partikeln zu bestimmen, wurden Mäuse mit 10⁴, 10⁵ oder 10⁶ Partikeln pro Immunisierung immunisiert und zweimal einer Auffrischimpfung unterzogen. In den 6A und 6B sind die Ergebnisse von zwei getrennten Experimenten, die jeweils zwei Mäuse pro Injektionsdosis beinhalten, angegeben. In beiden Experimenten, bei Immunisierung mit 10⁶ SFV-E6E7-Partikeln (Quadrate), aber auch mit nur 10⁵ Partikeln (Rauten), entwickelten alle Mäuse eine HPV-spezifische CTL-Antwort. Eine Immunisierung mit 10⁴ Partikeln (6, ausgefüllte Dreiecke) führte bei zwei von vier Mäusen zu einer niedrigen, aber nachweisbaren Antwort.
Antitumorantworten, induziert durch Immunisierung von Mäusen mit SFV-E6E7-Partikeln
Um zu untersuchen, ob rekombinante SFV-Partikel schützende Immunität gegen eine anschließende Tumor-Challenge erzeugen können, wurden Mäuse mit SFV-E6E7-Partikeln immunisiert und einer Auffrischimpfung unterzogen und einer subkutanen Challenge mit TC-1-Zellen, d.h. Tumorzellen, die HPV16-E6E7 exprimieren, unterzogen. Tumorimpfungsstudien, die vor der Einleitung dieser Immunisierungsstudien durchgeführt wurden, zeigten, dass eine subkutane Impfung mit 2 × 10⁴ TC-1-Zellen bei allen getesteten Mäusen (n = 15) innerhalb von 2 bis 4 Wochen nach der Impfung reproduzierbar Tumoren induzierte. 7 und 8 zeigen kombinierte Ergebnisse von zwei getrennten Immunisierungsstudien. Kontrollmäuse, denen PBS (n = 10) oder SFV-LacZ-Partikel (n = 10) injiziert wurden, entwickelten innerhalb von 2 bis 4 Wochen nach der Impfung mit Tumorzellen tastbare Tumoren (7, Bild A bzw. B; 8, leere Kreise bzw. leere Quadrate). Die Immunisierung mit 10⁶ SFV-E6E7-Partikeln (n = 10) führte zu einer Verzögerung der Tumorbildung bei 50% der Mäuse im Vergleich zu Kontrollmäusen, wobei eine von zehn Mäusen keinen Tumor entwickelte (7, Bild C; 8 Rauten). Nach der Immunisierung mit einer fünfmal so hohen Dosis an SFV-E6E7-Partikeln entwickelten zwei von fünf Mäusen keinen Tumor (7, Bild D; 8, ausgefüllte Quadrate).
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion, Charakterisierung und das zelluläre immuntherapeutische Potential von rekombinanten SFV-Partikeln, die die frühen Proteine E6 und E7 von HPV16 codieren. Das letztendliche Ziel unserer Studien ist die Entwicklung einer effektiven Immunisierungsstrategie für die Behandlung und/oder Prävention von HPV-induziertem Zervixkarzinom.
Die Immunisierung von Mäusen mit SFV-Partikeln, die HPV16 E6 und E7 codieren, führte zu einer HPV-spezifischen CTL-Antwort. Drei Injektionen mit nur 10⁴ SFV-Partikeln genügten für die Induktion einer CTL-Antwort bei 50% der Mäuse, während drei Immunisierungen mit 10⁵ SFV-Partikeln bei allen getesteten Mäusen eine HPV-spezifische CTL-Antwort induzierte. Eine Erhöhung der Dosis auf 10⁶ SFV-Partikel pro Injektion führte zu einer reproduzierbaren CTL-Antwort mit einem hohen Ausmaß an spezifischer Tumorzelllyse. In-vitro-Blockierungsexperimente mit Antikörpern gegen CD4 und CD8 zeigten, dass die lytische Aktivität auf CD8-positive T-Zellen zurückzuführen war, und mit Anti-CD4-Antikörpern wurde keine Hemmung gefunden (nicht gezeigt). Tumor-Challenge-Experimente bewiesen, dass eine Immunisierung mit 10⁶ SFV-E6E7-Partikeln zu einer Verzögerung der Tumorbildung führte, während eine von zehn Mäusen keinen Tumor entwickelte. Nach der Immunisierung mit einer fünfmal so hohen Dosis von SFV-E6E7-Partikeln entwickelten 40% der Mäuse keinen Tumor.
In den letzten Jahren wurden mehrere auf Peptid/Protein basierende oder genetische Immunisierungsstrategien für die Induktion von HPV-spezifischer CTL-Aktivität beschrieben^10-12 Zu den größeren Nachteilen, die mit einem auf Peptid basierenden Ansatz verbunden sind, gehören das Problem des MHC-Polymorphismus und die Gefahr des Induzierens einer T-Zell-Toleranz anstatt einer T-Zell-Aktivierung. Es wurde gezeigt, dass die Impfung mit einem tumorspezifischen Peptid aufgrund der Induktion einer spezifischen T-Zell-Toleranz zu einem verstärkten Auswuchs des Tumors führt²³. Eine Immunisierung mit größeren Proteinen würde diese Probleme überwinden, aber dies erfordert effiziente Antigen-Abgabesysteme und/oder sichere Adjuvantien für eine effiziente Erstimmunisierung. Mehrere Gruppen haben die Induktion von HPV-spezifischen CTL-Antworten bei Mäusen nach Immunisierung mit rekombinantem Vacciniavirus, das HPV E6 oder E7 exprimiert^24-25, oder mit syngenischen Zellen, die retroviral mit dem HPV-E6-Gen transfiziert sind²⁶, beschrieben. In einem Phase-I/II-Versuch, an dem acht Patienten mit Zervixkarzinom im späten Stadium beteiligt waren, induzierte die Impfung mit rekombinantem Vacciniavirus, das HPV18 E6 und E7 exprimiert, bei einem von drei verwertbaren Patienten HPV-spezifische CTLs²⁷. Potentielle Nachteile, die mit der Verwendung von viralen Vektorsystemen verbunden sind, sind Immunantworten gegen virale Proteine bei Präimmunpatienten (Vacciniavirus) oder die Integration von rekombinanten Genen in das Wirtszellgenom (Retrovirus). Insbesondere wenn das rekombinante Virus Oncoproteine wie HPV E6 oder E7 codiert, gibt die Gefahr der Integration in das Wirtszellgenom Anlass zu größerer Sorge.
Wir haben das SFV-Expressionssystem gewählt, das neben seiner Transfektionseffizienz und hohen biologischen Sicherheit anscheinend besonders gut geeignet ist, um zelluläre Immunantworten gegen Oncoproteine wie HPV16 E6 und E7 sicher zu induzieren. Erstens ist SFV ein RNA-Virus, das im Cytosol der Zelle repliziert wird; daher gibt es keine Gefahr der Integration des E6- und des E7-Gens in das zelluläre Genom. Außerdem bewirkt eine SFV-Infektion eine Cytolyse durch Apoptose^13,28. Daher wird keine genetische Information von E6 und E7 nach der Injektion länger als eine Woche überdauern. Außerdem werden außer kleinen Mengen von viraler Replicase keine anderen Vektorproteine produziert. Berglund et al. bewiesen, dass Immunantworten gegen den Vektor selbst keine Auffrischungsantworten durch anschließende Immunisierungen mit demselben Vektor hemmten²⁹.
Die Erkennung von viral infizierten Zellen oder Tumorzellen durch das Immunsystem erfolgt über virus- oder tumorspezifische antigene Peptide, die im Kontext von MHC-Klasse-I-Molekülen präsentiert werden. Eine Infektion von Zellen mit rekombinanten SFV-Partikeln führt zur Produktion des rekombinanten Proteins innerhalb des Cytoplasma, was eine Präsentation des rekombinanten Proteins über den herkömmlichen MHC-Klasse-I-Präsentationsweg erlaubt. Für die Induktion von tumor- oder virusspezifischen CTLs muss die Antigenpräsentation jedoch von einer costimulatorischen Signalübermittlung begleitet sein. Costimulatorische Moleküle sind auf professionelle antigenpräsentierende Zellen (APCs) beschränkt. Daher kann die CTL-Antwort, die nach Immunisierung mit SFV-E6E7-Partikeln induziert wird, durch Transfektion von APCs in vivo erfolgen. Alternative dazu können APCs auch Reste von anderen Zellen, die transfiziert wurden, in einem Vorgang der Kreuzaktivierung aufnehmen. Es wird erwartet, dass die Aufnahme von Trümmern von infizierten Zellen durch APCs sehr effizient ist, da eine SFV-Infektion einen apoptotischen Zelltod induziert^13,28. Nach der Aufnahme von infiziertem Zellmaterial (exogenes Antigen) wird das rekombinante Protein von MHC-Klasse-II-Molekülen prozessiert und präsentiert, wodurch CD4-positive T-Helferzellen aktiviert werden. Außerdem sind dendritische Zellen und Makrophagen in der Lage, exogenes Antigen im Kontext von MHC-Klasse-I-Molekülen gegenüber CD8-positiven T-Zellen zu präsentieren und diese zu aktivieren³⁰. Somit werden nach der verabreichung von rekombinanten SFV-Partikeln beide Waffendes zellulären Immunsystems, die für die Induktion einer optimalen Immunantwort wesentlich sind, aktiviert, wodurch eine starke CTL-Antwort hervorgerufen wird. Außerdem führt die SFV-Immunisierung antigene Epitope sowohl der Klasse I als auch der Klasse II in ein und dieselbe APC ein, wobei vor kurzem bewiesen wurde, dass ebendies für eine volle Aktivierung von APCs erforderlich ist^31,34. Wie Zhou et al.³⁵ bewiesen haben, induziert die Immunisierung von Mäusen mit SFV-Partikeln, die das Nucleoprotein von Influenzavirus codieren, nicht nur eine influenzaspezifische CTL-Aktivität, sondern auch eine nucleoproteinspezifische Antikörperreaktion. Diese Beobachtung stützt die Hypothese der Kreuzaktivierung und der indirekten Präsentation von antigenen Peptiden.
Wir haben also bewiesen, dass eine Immunisierung von Mäusen mit rekombinanten SFV-E6E7-Partikeln eine starke CTL-Antwort gegen HPV-transformierte Tumorzellen induziert. Dieses vielversprechende Ergebnis sorgt in Kombination mit Studien, die die hohe Wirksamkeit des SFV-Systems bei der Aktivierung des Immunsystems von Mäusen sowie Primaten zeigen^29,35,36, und der neueren Entwicklung des äußerst sicheren Zwei-Helfer-Systems³⁷ für die wesentlichen Schritte hin zur Gestaltung einer effektiven Immunisierungsstrategie für die Behandlung und Prophylaxe von HPV-induziertem Zervixkarzinom.
Materialien und Verfahren
Zelllinien
Babyhamster-Nierenzellen (BHK-21) wurden von der American Type Culture Collection (Nr. CCL-10) erhalten. Die Zellen wurden in GMEM (Life Technologies, Paisley, UK), das 5% fetales Kälberserum (PAA Laboratories, Linz, Österreich) enthielt, wachsen gelassen. C3-Zellen, 13-2-Zellen und TC-1-Zellen wurden freundlicherweise von Dr. C. Melief und Dr. R. Offringa (Universität Leiden, Niederlande) zur Verfügung gestellt. Die C3-Zelllinie war von embryonalen C57BL/6(H-2^b)-Zellen abgeleitet, die mit einem Plasmid, das das vollständige HPV16-Genom enthielt, transfiziert waren. Die 13-2-Zelllinie wurde aus embryonalen C57BL/6(H-2^b)-Zellen erzeugt, die mit dem E1-Bereich von Adenovirus Typ 5, bei dem das adenovirale E1A-Epitop SGPSNTPPEI durch ein HPV16-E7-CTL-Epitop AA 49-57 (RAHYNIVTF) ersetzt war, transfiziert waren (R. Offringa, persönliche Mitteilung). Die TC-1-Zelllinie wurde aus primären C57BL/6-Lungenepithelzellen mit einem retroviralen Vektor, der HPV16-E6E7 exprimiert, plus einem Retrovirus, das aktiviertes c-Ha-ras exprimiert, erzeugt²⁵. EL4-Zellen wurden freundlicherweise von Dr. L. Leserman (Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy, Frankreich) zur Verfügung gestellt. C3-, 13-2-, TC-1- und EL4-Zellen wurden in IMDM (Life Technologies), das mit 10% fetalem Kälberserum ergänzt war, wachsen gelassen. Beide Medien enthielten Penicillin und Streptomycin (Life Technologies; 100 E/ml bzw. 100 μg/ml).
Mäuse
Weibliche C57BL/6-Mäuse, die frei von spezifischem Pathogen waren (Harlan CPB, Zeist, Niederlande), waren zu Beginn der Immunisierungsvorschriften in einem Alter zwischen 6 und 10 Wochen.
Peptid
Das HPV16-H-2D^b-bindende E7-Peptid RAHYNIVTF (Reste 49-57) wurde von Dr. J.W. Drijfhout (Academisch Ziekenhuis Leiden, Niederlande) synthesiert und gereinigt. Das Peptid wurde durch Umkehrphasen-HPLC analysiert, und es zeigte sich, dass es über 90% rein war.
Klonierung von HPV16 E6 und E7 in pSFV3
pSFV-Helfer 2¹⁶ und pSFV3¹⁵ wurden freundlicherweise von Dr. P. Liljeström (Karolinska Institute, Stockholm, Schweden) zur Verfügung gestellt. Das HPV16-E6- und -E7-Gen wurden aus dem Plasmid pRSV-HPV16E6E7³⁸ erhalten, das freundlicherweise von Dr. J. Ter Schegget (Frije Universiteit Amsterdam, Niederlande) zur Verfügung gestellt wurde. In diesem Plasmid liegen das HPV16- E6- und -E7-Gen in Tandemanordnung vor, mit einem Stopcodon nach dem E6-Gen. Die Amplifikation des E6E7-Tandem-Gens erfolgte durch PCR unter Verwendung der folgenden Primer, geschrieben in 5¹→3¹-Richtung: GACGGATCCAAAGAGAACTCCAATG (E6 vorwärts) und GAGAATTCGGATCCGCCATGGTAGATTAT (E7 rückwärts). Das PCR-Produkt wurde mit BamHI verdaut und in die BamHI-Stelle von pGEM7Zf+ kloniert. Nach der Sequenzbestätigung wurde das E6E7-Fragment in die einzige BamHI-Stelle von pSFV3 kloniert, wobei pSFV3-E6E7 entstand.
Produktion und Reinigung von rekombinanten SFV-Partikeln
pSFV3-LacZ¹⁵ war eine freundliche Spende von Dr. P. Liljeström (Karolinska Institute, Stockholm, Schweden). Das pSFV3-E6E7-, pSFV3-LacZ- und das pSFV-Helfer-2-Plasmid wurden mit Hilfe des Qiagen-Midi-Plasmid-Reinigungskits isoliert und durch Verdau mit SpeI (Life Technologies) linearisiert. RNA wurde aus der linearisierten DNA durch in-vitro-Transcription unter Verwendung von SP6-RNA-Polymerase (Amersham Pharmacia Biotech. Inc., Piscataway, N.J., USA) synthetisiert. Das Capping-Analogon wurde von Life Technologies erhalten. 15 μg SFV3-E6E7 oder SFV3-LacZ und 7,5 μg SFV-Helfer-2-RNA wurden miteinander gemischt, und damit wurden 8 × 10⁶ BHK-Zellen in 0,8 ml GMEM durch Elektroporation unter Verwendung des Biorad Gene Pulser^RII (zwei Pulse von 850 V/25 μF; Biorad, Hercules, CA, USA) cotransfiziert. Nach dem Pulsen wurden die Zellen in 10 ml GMEM suspendiert und 36 h lang bei 37 °C und 5% CO₂ kultiviert. Das Medium, das die SFV-E6E7- oder SFV-LacZ-Partikel enthielt, wurde zweimal in einem JA-20-Rotor (Beckman, St. Paul, MN, USA) mit 1800 U/min (d.h. 40 000 × g bei r_max) zentrifugiert, um Zellen und Zelltrümmer zu entfernen.
Die SFV-Partikel wurden auf einem diskontinuierlichen Saccharose-Dichtegradienten (2 ml einer 15%igen Saccharoselösung (w/v) und 1 ml einer 50%igen Saccharoselösung (w/v) in TNE-Puffer (50 mM Tris-Cl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4)) gereinigt. Das Virus wurde an der Grenzfläche gesammelt. Saccharose wurde durch Dialyse gegen TNE-Puffer über Nacht aus der Viruslö sung entfernt. Die Virussuspension wurde ungefähr 10fach konzentriert (Centricon-30-Filter; Millipore, Redford, MA, USA), schnell in N₂ eingefroren und in Aliquoten bei –80 °C aufbewahrt.
Vor der Verwendung wurden SFV-Partikel 30 min lang bei Raumtemperatur mit 1/20 Volumen α-Chymotrypsin (10 mg/ml; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) inkubiert, um die mutierten Spike-Proteine zu spalten. Anschließend wurde α-Chymotrypsin durch die Zugabe von 0,5 Volumina Aprotinin (2 mg/ml; Sigma Chemical Co.) inaktiviert.
Titerbestimmung von SFV-Partikeln
Rekombinante SFV-Partikel wurden durch serielle Verdünnung auf Monoschichten von BHK-Zellen titriert. Nach Infektion und Inkubation über Nacht wurden die Zellen 10 Minuten lang in 10% Aceton fixiert und unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Anti-Replicase(nsP3)-Antikörpers (einer freundlichen Spende von Dr. T. Ahola, Biocentre Viiki, Helsinki, Finland) als primären Antikörper und FITC-markiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG als sekundären Antikörper (Southern Biotech. Ass., Birmingham, AL, USA) angefärbt. Positive Zellen wurden gezählt, und der Titer wurde nach Korrektur bezüglich des Verdünnungsfaktors und der durch die Aktivierung verursachten Verdünnung und des Volumens der hinzugefügten Partikel bestimmt.
Analyse der E6- und E7-Expression durch Western-Blotting
BHK-Zellen wurden mit SFV-E6E7-Partikeln oder als Kontrolle mit SFV-LacZ-Partikeln infiziert. Nach Inkubation über Nacht wurden die Zellen geerntet und in Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, pH 7,4) lysiert. Zellfreie Extrakte wurden durch SDS-PAGE analysiert. Die Proteine wurden durch Blotting auf PVDF-Membran (Immobilon-P, Millipore. Corp., Redford, MA, USA) übertragen, und E6 und E7 wurden mit einem polyklonalen Kaninchen-Anti-HPV16-E6-Antikörper (einer freundlichen Spende von Dr. I. Jochmus, Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Deutschland) bzw. einem monoklonalen Maus-Anti-HPV16-E7-Antikörper (Zymed Lab. Inc. South San Francisco, CA, USA) nachgewiesen. Nach Inkubation mit sekundären Antikörpern, die mit Alkalischer Phosphatase konjugiert waren, wurden die Blots mit Nitroblautetrazolium und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (Sigma Chemical Co.) angefärbt.
Indirekte Immunfluoreszenzanalyse von E6 und E7 in SFV-E6E7-infizierten Zellen
In einem 8-Napf-Kulturkammerträger (Life Technologies) wurde eine Monoschicht von BHK-Zellen mit SFV-E6E7 infiziert. Die Fixierung der Zellen und das Anfärben erfolgten gemäß der Beschreibung für die Immunfluoreszenz mit Anti-Replicase, abgesehen von den verwendeten Antikörpern. Als primäre Antikörper wurden Anti-HPV16-E6 oder Anti-HPV16-E7, wie sie oben erwähnt sind, verwendet. Die sekundären Antikörper waren FITC-markierte Anti-Kaninchen-IgG bzw. Anti-Maus-IgG (Southern Biotechn. Ass., Birmingham, AL, USA).
Immunisierungen
Mäuse wurden mit 10⁴ bis 5 × 10⁶ SFV-E6E7-Partikeln subkutan (s.c.), intraperitoneal (i.p.) oder intravenös (i.v.) immunisiert und zweimal im Abstand von 2 Wochen einer Auffrischimpfung unterzogen. Als negative Kontrollen wurden Mäusen gleiche Dosen SFV-LacZ-Partikel oder PBS injiziert.
CTL-Assay
Sieben bis 21 Tage nach der letzten Auffrischimpfung wurden Milzzellen isoliert und in aufrecht gestellten 25-cm²-Kulturkolben mit bestrahlten (100 Gy) C3-Zellen in einem Verhältnis von 25:1 cokultiviert. Nach einer bzw. zwei Wochen in Kultur wurden Zellen geerntet und mit bestrahlten naiven Milzzellen (30 Gy) und bestrahlten C3-Zellen in einem Verhältnis von 2:5:0,1 in 24-Napf-Platten in Gegenwart von 4 IE rekombinantem hIL2/ml (Strathmann Biotech GmbH, Hamburg, Deutschland) restimuliert. Fünf Tage nach der ersten und/oder zweiten Restimulierung wurden Zellen geerntet, und ein CTL-Assay wurde als Standard-4-h-⁵¹Cr-Freisetzungsassay in drei Parallelbestimmungen durchgeführt. Zielzellen wurden 1 h lang mit 3,7 MBq ⁵¹Cr/10⁶ Zellen in 100 μl Medium markiert (⁵¹Cr stammte von Amersham, London, UK). EL4-Zielzellen wurden durch 1 h Inkubation der Zellen in Gegenwart von 15 μg/ml Peptid in 100 μl Kulturmedium mit dem HPV16-E7-49-57-Peptid (RAHYNIVTF) beladen, bevor die Zellen mit ⁵¹Cr markiert wurden. Der mittlere Prozentsatz der spezifischen ⁵¹Cr-Freisetzung von drei parallel angesetzten Näpfen wurde gemäß der folgenden Formel berechnet: % spezifische Freisetzung = [(experimentelle Freisetzung – spontane Freisetzung)/(maximale Freisetzung – spontane Freisetzung)] cpm × 100. Die spontane ⁵¹Cr-Freisetzung war immer < 15%. Die Standardfehler der Mittelwerte der dreifachen Parallelbestimmungen betrugen < 10% des Mittelwerts.
Tumor-Challenge-Experimente
Mäuse wurden gemäß der obigen Beschreibung mit 10⁶ bis 5 × 10⁶ SFV-E6E7-Partikeln, SFV-LacZ-Partikeln oder PBS immunisiert und einer Auffrischimpfung unterzogen. Eine Woche nach der letzten Auffrischimpfung wurden die Mäuse einer subkutanen Challenge mit 2 × 10⁴ TC-1-Zellen, die in 0,2 ml Hanks Buffered Salt Solution (Life Technologies) suspendiert waren, unterzogen. Tumormessungen wurden immer durch denselben Fachmann vorgenommen. Bei einem Tumorvolumen von ungefähr 1000 mm³ wurden die Mäuse getötet.
Beispiel 2
Wir erzeugten weiterhin zwei rekombinante SFV-Plasmide, die einen Translations-Enhancer enthalten. Ein Plasmid codiert ein Fusionsprotein von E6 und E7 durch Einfügen eines Basenpaars zwischen E6 und E7 und durch Änderung des Stopcodons von E6, und dieses Plasmid heißt pSFV3-eE6,7 (9 und 19). In dem anderen Plasmid befindet sich der Translations-Enhancer vor dem ursprünglichen E6E7-Konstrukt, pSFV3-eE6E7.
Western-Blot-Analyse der Proteinexpression
Um zu bestätigen, dass SFV-eE6,7 die Expression eines rekombinanten Fusionsproteins von E6 und E7 induzierte, während SFV-E6E7 die Expression der getrennten E6- und E7-Proteine induziert, wurden Lysate von Zellen, die mit SFV-E6E7 oder SFV-eE6,7 infiziert waren, durch Western-Blot-Analyse miteinander verglichen. Außerdem wurden Lysate von Zellen analysiert, die mit dem Konstrukt infiziert waren, bei dem der Translations-Enhancer vor dem ursprünglichen E6E7-Konstrukt kloniert war, d.h. SFV-eE6E7.
In 10 sind Western-Blots gezeigt, die mit Anti-HPV16-E6 oder Anti-HPV16-E7 sondiert wurden. Die Anfärbung mit sowohl dem Anti-E6- als auch dem Anti-E7-Antikörper ergab drei auffällige Banden in Lysaten von Zellen, die mit SFV-eE6,7 infiziert waren (Spur 3 und 7), während nach Infektion mit SFV-E6E7 kein oder nur sehr wenig E6 und E7 nachgewiesen werden konnte (Spur 1 und 5). Es sei jedoch angemerkt, dass das Verfahren (Menge des Materials und Anfärbungszeit), das für den Nachweis des hochgradig exprimierten Fusionsproteins durch Western-Blotting verwendet wurde, für den Nachweis der relativ niedrigen Expression von E6 und E7 in SFV-E6E7-infizierten Zellen nicht optimal ist. In einer früheren Studie konnte die Expression von E6 und E7 in Zellen, die mit SFV-E6E7 infiziert waren, unter Verwendung von mehr Material und einer längeren Anfärbungszeit nachgewiesen werden.
Die drei Hauptbanden, die man in den SFV-eE6,7-Lysaten beobachtet, hatten scheinbare elektrophoretische Mobilitäten von ungefähr 26 kDa, 36 kDa bzw. 44 kDa. Die 26-kDa-Bande stellt das Fusionsprotein von E6 und E7 dar (17 kDa bzw. 11 kDa). Die Banden von 36 kDa und 44 kDa entsprechen jedoch nicht den berechneten M_r-Werten von dimeren und trimeren Komplexen des Fusionsproteins. Da beide Banden eine positive Färbung mit dem Anti-E6-Antikörper sowie mit dem Anti-E7-Antikörper ergeben, spiegeln die Banden dennoch einen Proteinkomplex wider, der sowohl aus E6 als auch aus E7 besteht. In diesem Zusammenhang sei darauf hingewiesen, dass andere und wir selbst bewiesen haben, dass das M_r von rekombinant produziertem E7-Protein (10, Spur 8) nicht dem berechneten M_r (11 kDa) entspricht. Ähnlich kann es auch sein, dass die scheinbaren M_r-Werte der Banden nicht die tatsächlichen M_r-Werte der Fusionsproteine widerspiegeln.
Eine Anfärbung des Lysats von Zellen, die mit SFV-eE6,E7 infiziert waren, mit dem Anti-E6-Antikörper ergab zwei Banden von ungefähr 22 kDa und 32 kDa (10, Spur 2). Eine Anfärbung dieser Spur mit dem Anti-E7-Antikörper ergab keine Bande (10; Spur 6), was beweist, dass erwartungsgemäß nur das E6-Protein in verstärkter Weise translatiert wurde. Die 22-kDa-Bande, die man im Anti-E6-Blot beobachtet, ist etwas höher als der berechnete M_r von E6, d.h. 17 kDa. Die 32-kDa-Bande könnte einen dimeren Komplex von E6 darstellen.
Analyse der E6- und E7-Expression durch Puls-Markierung
Die Produktion und Stabilität von E6, E7 und des Fusionsproteins E6,7 durch BHK-Zellen, die mit SFV-Partikeln transfiziert sind, wurde durch Pulse-Chase-Markierung der Zellen mit ³⁵S-Methionin/-Cystein analysiert. Wie in 11 gezeigt ist (Spur 6), führte die Infektion von BHK-Zellen mit SFV-eE6,7-Partikeln und eine Stunde Radiomarkierung zu drei deutlich markierten Banden des E6,7-Fusionsproteins. Diese Banden entsprechen den Banden, die auf den Western-Blots auftreten. Obwohl es scheinen mag, als ob die 44-kDa-Bande in den Kontrolllysaten ebenfalls vorhanden ist, zeigt eine nähere Untersuchung, dass diese obere Fusionsproteinbande in den Spuren 6-9 etwas niedriger verläuft als die Bande in den Spuren 1-5. Die Banden von 36 und 46 kDa sind nach einer Chase-Zeit von 6 bzw. 16 h noch vorhanden. Selbst nach einer Chase-Zeit von 40 h sind beide Banden noch sichtbar, wenn auch weniger deutlich. Die kurze Einwirkungszeit, die genügte, um die verstärkten Fusionsproteine sichtbar zu machen, konnte die Banden des E6 und des E7-Proteins, die nach Infektion mit SFV-E6E7 produziert wurden, entweder nach einer 6-h-Chase-Zeit (11; Spur 2) oder direkt nach der Markierung (nicht gezeigt) nicht zeigen. Zuvor haben wir bewiesen, dass eine längere Einwirkungszeit des Films benötigt wird, um diese Proteine sichtbar zu machen.
Eine Autoradiographie von Lysaten von Zellen, die mit SFV-eE6E7 infiziert waren, direkt nach der Markierung (11, Spur 3) zeigte dieselben Banden, wie sie durch Western-Blot-Analyse beobachtet wurden, d.h. eine 22- und eine 32-kDa-Bande. Im Gegensatz zu dem verstärkten Fusionsprotein wurde jedoch der größte Teil des E6-Proteins innerhalb einer 6-h-Chase-Zeit abgebaut. Nach 16 h war das Protein fast vollständig abgebaut.
HPV-spezifische CTLs, induziert durch Immunisierung von Mäusen mit SFV-eE6,7 und SFV-E6E7
Mäuse wurden mit 10⁶ gereinigten SFV-E6E7-, SFV-eE6,7-, SFV-eE6E7-, SFV-LacZ-Partikeln oder Puffer als Kontrolle subkutan immunisiert und zweimal (s.c. und i.p.) einer Auffrischimpfung unterzogen. Die CTL-Aktivität wurde eine Woche nach der letzten Auffrischimpfung bestimmt. Nach 7 Tagen (12A) bzw. 14 Tagen (12B) in-vitro-Restimulierung wurden die resultierenden Effektorzellen auf ihre cytolytische Aktivität gegen 13-2-Zielzellen und C3-Zielzellen getestet. Gegen beide Zelllinien wurden ähnliche Cytolyseniveaus induziert. Wie in 12 gezeigt ist, wiesen Milzzellen, die aus Mäusen isoliert wurden, welche mit 10⁶, aber auch mit nur 10⁵ SFV-eE6,7-Partikeln immunisiert wurden, bereits ein hohes Niveau der Cytolyse in der Kurzzeit-Restimulierungsvorschrift (d.h. 7 Tage; 12A). Nach Immunisierung mit 10⁶ SFV-E6,E7 konnten signifikante Niveaus der CTL-Aktivität erst nach längerer Restimulierung bestimmt werden (12B), während eine kurzzeitige Restimulierung zu einem sehr niedrigen Niveau der CTL-Aktivität führte. Nach Immunisierung mit 10⁵ SFV-E6E7 war keine CTL-Aktivität nachweisbar. Durch Immunisierung mit SFV-eE6,E7 wurden keine nachweisbaren Niveaus von CTL-Aktivität gegen 13-2-Zellen oder gegen C3-Zielzellen, die das gesamte HPV16-E6E7-Genom exprimieren (nicht gezeigt), induziert.
Dann wurden das Niveau und die Aufrechterhaltung der CTL-Aktivität, die nach Verabreichung höherer Dosen von SFV-eE6,7-Partikeln induziert wurde, bestimmt. Mäuse wurden mit 1, 2,5 oder 5 × 10⁶ SFV-Partikeln immunisiert, und die CTL-Aktivität wurde 18 Tage bzw. 8 Wochen nach der letzten Auffrischimp fung bestimmt. Wie in 13 gezeigt ist, ist das Niveau der CTL-Aktivität, die mit 10⁶ SFV-eE6,7 induziert wird, vermutlich das maximale Lyseniveau, das erreicht und im Bulk-CTL-⁵¹Cr-Freisetzungsassay nachgewiesen werden kann, da eine Immunisierung mit 2,5 und 5 × 10⁶ SFV-eE6,7 den Prozentsatz der spezifischen Lyse nicht erhöhte. Was wichtig ist, 8 Wochen nach der letzten Auffrischimpfung waren die Nieaus der Cytolyse genauso hoch wie 18 Tage nach der letzten Auffrischimpfung (13B bzw. 13A).
Für diesen Bulk-CTL-Assay werden Milzzellen mehrere Tage lang in vitro restimuliert, was zur Proliferation von CTL-Vorläufern führt. Daher ist dieser Assay kein zuverlässiger Assay, um die tatsächliche Häufigkeit von CTL-Vorläufern zu bestimmen, die in vivo induziert wurde. Um die Zahl von CTL-Vorläufern zu bewerten, wurde ein HPV16-IFN-α-Elispot-Assay durchgeführt. Wie in Tabelle 1 bewiesen wird, lag die Zahl der CTL-Vorläufer 18 Tage nach der Injektion von 1, 2,5 und 5 × 10⁶ SFV-eE6,7-Partikel im Bereich von 1 auf 1780 bis 1 auf 6600 Milzzellen insgesamt. Da ungefähr 8% der C57BL/6-Milzzellen CD8-positive T-Zellen sind, bedeutet dies, dass 1 auf 140 bis 1 auf 530 CD8-positive Milz-T-Zellen HPV-spezifisch ist. Acht Wochen nach der letzten Auffrischimpfung lag das Niveau im Bereich von 1 auf 430 bis 1 auf 1090 CD8-positiven T-Zellen. Obwohl aus diesen Zahlen keine festen Schlussfolgerungen gezogen werden können, da jede Dosis und jeder Zeitpunkt eine einzelne Maus darstellt, wurde keine Korrelation zwischen der injizierten Dosis und dem Niveau der spezifischen CTLs beobachtet.
In früheren Immunisierungsvorschriften wurden die Mäuse immer dreimal immunisiert (d.h. eine Erstimmunisierung gefolgt von zwei Auffrischimpfungen). Um die Zahl der Immunisierungen zu bestimmen, die benötigt werden, um eine langfristige Antwort zu induzieren, immunisierten wir Mäuse einmal oder zweimal und bestimmten das Niveau der CTL-Aktivität 10 Tage, 1 Monat oder drei Monate nach der letzten Immunisierung.
14A zeigt, dass eine einzige Immunisierung mit 2,5 × 10⁶ SFV-eE6,7-Teilchen 10 Tage nach der Immunisierung ein signifikantes Cytolyseniveau induziert (Quadrate). Dieses Niveau nimmt in den nächsten drei Monaten allmählich ab (1 Monat: Kreise; drei Monate: Dreiecke). Eine einzige Auffrischimpfung genügt jedoch, um bis zu 3 Monate nach der Auffrischimpfung eine signifikante CTL-Antwort zu induzieren (14B, Dreiecke), die so hoch war wie die Antwort nach 1 Monat (14B, Kreise).
Schließlich wurde der Immunisierungsweg variiert. Mäuse wurden s.c., i.p. oder i.v. mit 1 × 10⁶ SFV-eE6,7-Partikeln immunisiert. Der Bulk-CTL-Assay zeigt, dass die Niveaus der spezifischen Lyse durch Milzzellen, die aus den i.v. immunisierten Mäusen (n = 3) isoliert wurden, geringfügig höher sind (bei einem E:T-Verhältnis von 3 bereits fast maximale Lyse) als diejenigen von Mäusen, die s.c. (n = 2) oder i.p. (n = 3) immunisiert wurden (15, obere drei Bilder). Getrennt davon wurden unter Verwendung derselben Milzzellen CTL-Vorläuferhäufigkeiten bestimmt, wobei HPV-16-E7-spezifische MHC-Klasse-I-Tetramere verwendet wurden In den unteren Bildern von 15 sind die Prozentsätze von tetramerpositiven/CD8-positiven T-Zellen angegeben. Die Balken entsprechen den CTL-Daten in den oberen Bildern. Das relativ höhere Niveau der spezifischen Lyse, das man nach i.v. Immunisierung beobachtet, spiegelt sich ebenfalls in der Zahl der tetramerpositiven/CD8-positiven T-Zellen wider.
Tumor-Challenge und erneute Challenge nach Immunisierung von Mäusen mit SFV-eE6,7-Partikeln
Um zu untersuchen, ob rekombinante SFV-Partikel schützende Immunität gegen eine anschließende Tumor-Challenge erzeugen können, wurden Mäuse mit SFV-eE6,7-Partikeln immunisiert und einer Auffrischimpfung unterzogen und einer subkutanen Challenge mit TC-1-Zellen, d.h. Tumorzellen, die HPV16-E6E7 exprimieren, unterzogen. 16 zeigt die kombinierten Ergebnisse von zwei getrennten Immunisierungsstudien. Kontrollmäuse, denen PBS-(n = 10) oder SFV-LacZ-Partikel (n = 10) injiziert wurden, entwickelten innerhalb von 2 bis 4 Wochen nach der Einimpfung von Tumorzellen tastbare Tumoren. In einer früheren Studie bewiesen wir, dass eine Immunisierung mit 5 × 10⁶ SFV-E6E7-Partikeln zu einem partiellen Tumorschutz führte, d.h. zwei von fünf Mäusen entwickelten keinen Tumor. Hier beweisen wir, dass eine Immunisierung mit 10⁶ SFV-eE6,7-Partikeln 9 von 10 Mäusen davor schützt, einen Tumor zu entwickeln (16). Eine Immunisierung mit einer fünffach höheren Dosis (5 × 10⁶ Partikel) schützt 4 von 5 Mäusen (Tabelle 2).
Um zu bestimmen, ob ein langfristiger Schutz induziert wird, wurden Mäuse, die keinen Tumor entwickelten, in der Woche 25 (Exp. 1) oder in der Woche 13 (Exp. 2) nach der anfänglichen Tumor-Challenge erneut einer subkutanen Challenge mit 2 × 10⁴ Tumorzellen unterzogen.
Wie in Tabelle 2 gezeigt ist, waren alle mit 5 × 10⁶ SFV-eE6,7 immunisierten Mäuse, die bei der anfänglichen Tumor-Challenge keinen Tumor entwickelten, 13 Wochen später vor der zweiten Tumor-Challenge geschützt. Von dem mit 10⁶ SFV-eE6,7 immunisierten Mäusen entwickelten 50% bzw. 60% nach einer zweiten Tumor-Challenge in Woche 25 bzw. in Woche 13 keinen Tumor.
Tumorbehandlung nach Immunisierung mit SFV-eE6,7-Partikeln
Die vielversprechenden Ergebnisse, die in den oben beschriebenen Tumor-Challenge-Experimenten erhalten wurden, veranlassten uns, die Wirksamkeit einer SFV-eE6,7-Immunisierung im Rahmen einer Tumorbehandlung zu bestimmen. Mäuse wurden s.c. mit 2 × 10⁴ TC-1-Zellen geimpft. Zu mehreren Zeitpunkten nach der Impfung mit dem Tumor wurden Mäuse s.c. mit 5 × 10⁶ SFV-eE6,7-Partikeln, SFV-LacZ oder PBS immunisiert. In 17 sind die Tumorvolumina von individuellen Mäusen von zwei getrennten Experimenten gezeigt. 18 zeigt die kombinierten Ergebnisse dieser Experimente als zeitliche Prozentsätze von tumorfreien Mäusen. Kontrollmäuse und Mäuse, denen SFV-LacZ injiziert wurde, entwickelten innerhalb von 2 Wochen nach der Impfung mit Tumor einen Tumor. Alle Mäuse, die an den Tagen 2, 7 und 14 nach der Impfung mit Tumor mit SFV-eE6,7-Partikeln immunisiert wurden, waren am Tag 100 nach der Impfung mit Tumor tumorfrei (17, Bild C). Bei 4 von 7 Mäusen dieser Gruppe war am Tag 14 nach der Impfung mit Tumor ein sehr kleiner Tumor tastbar (17). Diese Tumorknötchen verschwanden innerhalb von 7 Tagen, und alle Mäuse blieben tumorfrei. In der zweiten Gruppe von Mäusen, die am Tag 7, 14 bzw. 21 nach der Impfung mit Tumor mit SFV-eE6,7-Partikeln immunisiert wurden, entwickelten alle Mäuse (n = 14) in beiden Experimenten am Tag 14 einen kleinen tastbaren Tumor. Bei 12 von 14 Mäusen waren diese Knötchen am Tag 21 verschwunden. Letzlich blieben 9 von 14 Mäusen tumorfrei (17). Schließlich wurde bei einer Gruppe von Mäusen die Immunisierung erst am Tag 14 nach der Impfung mit Tumor eingeleitet. Wie in 17 gezeigt ist, eliminierten 3 von 7 Mäusen die anfänglichen Tumoren. Eine dieser Mäuse eliminierte am Tag 20 einen Tumor mit einem Volumen von 650 mm³. Eine Maus entwickelte noch 60 Tage nach der Impfung mit Tumor einen Tumor.
Tumor-Challenge und erneute Challenge nach s.c. Immunisierung mit SFV-eE6,7-Partikeln
In einem der oben beschriebenen Experimente wurden tumorfreie Mäuse 13 Wochen nach der anfänglichen Impfung mit Tumor erneut einer Challenge mit TC-1-Zellen ohne zusätzliche Immunisierung ausgesetzt. Da nach 13 Wochen keine der Kontrollmäuse tumorfrei war, wurden zum Zeitpunkt der zweiten Impfung mit Tumor 4 Kontrollmäuse in das Experiment mit aufgenommen. Wie in 20 gezeigt ist, blieben alle tumorfreien Mäuse, die am Tag 7, 14 bzw. 21 nach der anfänglichen Impfung mit Tumor immunisiert wurden, nach einer zweiten Tumor-Challenge tumorfrei. In der Gruppe von Mäusen, die am Tag 2, 7 und 14 immunisiert wurden, entwickelte nur eine von sieben Mäusen nach der zweiten Impfung mit Tumor einen Tumor.
Tumorbehandlung nach intravenöser Immunisierung mit SFV-eE6,7-Partikeln
Elispot-Analyse und Tetramer-Anfärbung bewiesen, dass nach intravenöser Immunisierung eine größere Zahl von Vorläufer-CTLs induziert wird als nach s.c. und i.p. Immunisierung. Wir führtemn daher Tumortherapiestudien durch, bei denen Mäuse intravenös immunisiert wurden. Die Experimente wurden ähnlich wie die oben beschriebenen Experimente durchgeführt. Wie in 21 gezeigt ist, blieben alle Mäuse, die am Tag 7, 14 und 21 nach der Impfung mit Tumor mit 5 × 10⁶ SFV-eE6,7-Partikeln immunisiert wurden, tumorfrei. Selbst wenn die Immunisierung 14 Tage nach der Impfung mit Tumor eingeleitet wurde, einem Zeitpunkt, an dem alle Mäuse einen tastbaren Tumor entwickelt haben, gingen alle Tumoren zurück. Letztlich rotteten 4 von 7 Mäusen den Tumor vollständig aus und blieben danach tumorfrei.
Tumorbehandlung nach intravenöser Immunisierung mit nur 5 × 10⁴ SFV-eE6,7-Partikeln
Um die minimale effektive Dosis zu bestimmen, wurden Mäuse an Tag 7, 14 und 21 nach der Impfung mit Tumor mit abnehmenden Mengen an SFV-eE6,7-Partikeln immunisiert. Wie in 22 gezeigt ist, eliminierten alle Mäuse, die mit 5 × 10⁵ SFV-eE6,7-Partikeln immunisiert waren, und sechs von sieben Mäusen, die mit nur 5 × 10⁴ SFV-eE6,7-Partikeln immunisiert waren, den Tumor und blieben bis zu 10 Wochen nach der Impfung mit Tumor tumorfrei.
Materialien und Verfahren
Zelllinien
Babyhamster-Nierenzellen (BHK-21) wurden von der American Type Culture Collection (Nr. CCL-10) erhalten. Die Zellen wurden in GMEM (Life Technologies, Paisley, UK), das 5% fetales Kälberserum (PAA Laboratories, Linz, Österreich) enthielt, wachsen gelassen. C3-Zellen, 13-2-Zellen und TC-1-Zellen wurden freundlicherweise von Dr. C. Melief und Dr. R. Offringa (Universität Leiden, Niederlande) zur Verfügung gestellt. Die C3-Zelllinie war von embryonalen C57BL/6(H-2^b)-Zellen abgeleitet, die mit einem Plasmid, das das vollständige HPV16-Genom enthielt, transfiziert waren. Die 13-2-Zelllinie wurde aus embryonalen C57BL/6(H-2^b)-Zellen erzeugt, die mit dem E1-Bereich von Adenovirus Typ 5, bei dem das adenovirale E1A-Epitop SGPSNTPPEI durch ein HPV16-E7-CTL-Epitop AA 49-57 (RAHYNIVTF) ersetzt war, transfiziert waren (R. Offringa, persönliche Mitteilung). Die TC-1-Zelllinie wurde aus primären C57BL/6-Lungenepithelzellen mit einem retroviralen Vektor, der HPV16-E6E7 exprimiert, plus einem Retrovirus, das aktiviertes c-Ha-ras exprimiert, erzeugt²⁵. C3-, 13-2- und TC-1-Zellen wurden in IMDM (Life Technologies), das mit 10% fetalem Kälberserum ergänzt war, wachsen gelassen. Beide Medien enthielten Penicillin und Streptomycin (Life Technologies; 100 E/ml bzw. 100 μg/ml).
Mäuse
Weibliche C57BL/6-Mäuse, die frei von spezifischem Pathogen waren (Harlan CPB, Zeist, Niederlande), waren zu Beginn der Immunisierungsvorschriften in einem Alter zwischen 6 und 10 Wochen.
Konstruktion von pSFV3-E6E7, pSFV3-eE6,7 und pSFV-eE6E7
pSFV-Helfer 2¹⁶ und pSFV3¹⁵ wurden freundlicherweise von Dr. P. Liljeström (Karolinska Institute, Stockholm, Schweden) zur Verfügung gestellt. Das HPV16-E6- und -E7-Gen wurden aus dem Plasmid pRSV-HPV16E6E7³⁸ erhalten, das freundlicherweise von Dr. J. Ter Schegget (Frije Universiteit Amsterdam, Niederlande) zur Verfügung gestellt wurde. In diesem Plasmid sind das HPV16-E6- und -E7-Gen in Tandemanordnung vorhanden, mit einem Stopcodon nach dem E6-Gen. Die Amplifikation des E6E7-Tandem-Gens erfolgte durch PCR. Das PCR-Produkt wurde mit BamHI verdaut und in die BamHI-Stelle von pGEM7Zf+ kloniert. Nach der Sequenzbestätigung wurde das E6E7-Fragment in die einzige BamHI-Stelle von pSFV3 kloniert, wobei pSFV3-E6E7 entstand.
Das Plasmid pSFV3-eE6,7 wurde so erzeugt, dass es hohe Niveaus eines Fusionsproteins von HPV16 E6 und E7 exprimierte, indem man einen Translations-Enhancer mitverwendete. Die Konstruktion ist in 17 gezeigt und entspricht der folgenden Beschreibung.
Aus dem pSFV3-E6E7 wurde die E6-Sequenz mit einer NcoI-Stelle am 5'-Ende und einer EcoRI-Stelle am 3'-Ende modifiziert. Die E7-Sequenz wurde durch PCR mit einer EcoRI-Stelle am 5'-Ende und einer BamHI-Stelle am 3'-Ende modifiziert.
Es wurde gezeigt, dass das 5'-Ende des Capsid-Gens von SFV, das für die ersten 34 Aminosäuren codiert, einen Translations-Enhancer enthält. Dieser Enhancer wurde von Smerdou and Liljeström (J. Virol. 73, 1092-1098, 1999) in ein pSFV-Helfer-S1-Konstrukt kloniert. Außerdem fügten sie die Sequenz der 2A-Autoprotease des Maul-und-Klauenseuche-Virus (FMDV) (17 Aminosäuren) rasterpassend zwischen den Translations-Enhancer und p62 (SFV-Hüllprotein) ein, um für eine Spaltung zwischen den Proteinen zu sorgen. Wir synthetisierten die Sequenz, die den Translations-Enhancer und die FMDV-A2-Autoprotease aus pSFV-Helfer-S1 enthielt, und durch PCR wurden BamHI- und NcoI-Restriktions stellen am 5'- bzw. 3'-Ende erzeugt. Die enh-FMDV-A2-Protease-, E6- und E7-Fragmente wurden in die BamHI-Stelle von pSFV3 kloniert, wobei pSFV3-eE6,7 entstand.
Im ursprünglichen Plasmid liegen das HPV16-E6- und -E7-Gen in Tandemanordnung vor, mit einem Stopcodon nach dem E6-Gen. In pSFV3-eE6,7 ist ein Basenpaar zwischen E6 und E7 eingefügt, und das Stopcodon TAA von E6 ist zu GAA verändert. Somit ist die E6 und E7 codierende Sequenz in pSFV3-eE6,7 rasterpassend und exprimiert ein Fusionsprodukt von E6 und E7.
Die Konstruktion von pSFV3-eE6E7 erfolgte durch Klonieren des intakten E6E7-Fragments und des Translations-Enhancer-FMDV-A2-Autoprotease-Fragments in pSFV3-eE6E7. Da E6 und E7 nicht rasterpassend sind, ist zu erwarten, dass dieses Plasmid E6 verstärkt codiert, während die Translation von E7 nicht verstärkt ist.
Die eE6E7 oder eE6,7 codierenden Einschübe wurden sequenziert, um zu überprüfen, dass während der PCR keine Modifikationen erzeugt wurden.
Produktion und Reinigung von rekombinanten SFV-Partikeln
pSFV3-LacZ¹⁵ war eine freundliche Spende von Dr. P. Liljeström (Karolinska Institute, Stockholm, Schweden). Das pSFV3-E6E7-, pSFV3-eE6E7-, pSFV3-eE6,7-, pSFV3-LacZ- und das pSFV-Helfer-2-Plasmid wurden mit Hilfe des Qiagen-Midi-Plasmid-Reinigungskits isoliert und durch Verdau mit SpeI (Life Technologies) linearisiert. RNA wurde aus der linearisierten DNA durch in-vitro-Transcription unter Verwendung von SP6-RNA-Polymerase (Amersham Pharmacia Biotech. Inc., Piscataway, N.J., USA) synthetisiert. Das Capping-Analogon wurde von Life Technologies erhalten. 15 μg SFV3-E6E7 oder SFV3-LacZ und 7,5 μg SFV-Helfer-2-RNA wurden miteinander gemischt, und damit wurden 8 × 10⁶ BHK-Zellen in 0,8 ml GMEM durch Elektroporation unter Verwendung des Biorad Gene Pulser^RII (zwei Pulse von 850 V/25 μF; Biorad, Hercules, CA, USA) cotransfiziert. Nach dem Pulsen wurden die Zellen in 10 ml GMEM suspendiert und 36 h lang bei 37 °C und 5% CO₂ kultiviert. Das Medium, das die SFV-E6E7- oder SFV-LacZ-Partikel enthielt, wurde zweimal in einem JA-20-Rotor (Beckman, St. Paul, MN, USA) mit 1800 U/min (d.h. 40 000 × g bei r_max) zentrifugiert, um Zellen und Zelltrümmer zu entfernen.
Die SFV-Partikel wurden auf einem diskontinuierlichen Saccharose-Dichtegradienten (2 ml einer 15%igen Saccharoselösung (w/v) und 1 ml einer 50%igen Saccharoselösung (w/v) in TNE-Puffer (50 mM Tris-Cl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4)) gereinigt. Das Virus wurde an der Grenzfläche gesammelt. Saccharose wurde durch Dialyse gegen TNE-Puffer über Nacht aus der Viruslösung entfernt. Die Virussuspension wurde ungefähr 10fach konzentriert (Centricon-30-Filter; Millipore, Redford, MA, USA), schnell in N₂ eingefroren und in Aliquoten bei –80 °C aufbewahrt.
Vor der Verwendung wurden SFV-Partikel 30 min lang bei Raumtemperatur mit 1/20 Volumen α-Chymotrypsin (10 mg/ml; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) inkubiert, um die mutierten Spike-Proteine zu spalten. Anschließend wurde α-Chymotrypsin durch die Zugabe von 0,5 Volumina Aprotinin (2 mg/ml; Sigma Chemical Co.) inaktiviert.
Titerbestimmung von SFV-Partikeln
Rekombinante SFV-Partikel wurden durch serielle Verdünnung auf Monoschichten von BHK-Zellen titriert. Nach Infektion und Inkubation über Nacht wurden die Zellen 10 Minuten lang in 10% Aceton fixiert und unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Anti-Replicase(nsP3)-Antikörpers (einer freundlichen Spende von Dr. T. Ahola, Biocentre Viiki, Helsinki, Finland) als primären Antikörper und FITC-markiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG als sekundären Antikörper (Southern Biotech. Ass., Birmingham, AL, USA) angefärbt. Positive Zellen wurden gezählt, und der Titer wurde nach Korrektur bezüglich des Verdünnungsfaktors und der durch die Aktivierung verursachten Verdünnung und des Volumens der hinzugefügten Partikel bestimmt.
Analyse der E6- und E7-Expression durch Western-Blotting
BHK-Zellen wurden mit SFV-E6E7-, SFV-eE6,7- oder SFV-eE6E7-Partikeln infiziert. Nach Inkubation über Nacht wurden die Zellen geerntet und in Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, pH 7,4) lysiert. Zellfreie Extrakte wurden durch SDS-PAGE analysiert. Die Proteine wurden durch Blotting auf PVDF-Membran (Immobilon-P, Millipore Corp., Bedford, MA, USA) übertragen, und E6 und E7 wurden mit einem polyklonalen Kaninchen-Anti-HPV16-E6-Antikörper (einer freundlichen Spende von Dr. I. Jochmus, Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Deutschland) bzw. einem monoklonalen Maus-Anti-HPV16-E7-Antikörper (Zymed Lab. Inc. South San Francisco, CA, USA) nachgewiesen. Nach Inkubation mit sekundären Antikörpern, die mit Alkalischer Phosphatase konjugiert waren, wurden die Blots mit Nitroblautetrazolium und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (Sigma Chemical Co.) angefärbt.
Analyse der E6- und E7-Expression durch Puls-Markierung
Für die Pulsmarkierung wurden BHK-Zellen mit SFV-E6E7-, SFV-eE6,E7- oder SFV-eE6,7-Partikeln infiziert. Nach 6 h wurde das Medium entfernt, die Platten wurden dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, und die Zellen wurden weitere 30 min lang mit methionin- und cysteinfreiem DMEM (ICN Biomedicals) kultiviert. Zu diesem Zeitpunkt wurde ³⁵S-Methionin/-Cystein (0,37 MBq/Napf; Amersham) zu den Kulturen gegeben. Nach einer Stunde wurden die Näpfe von Radioisotop freigewaschen und direkt geerntet oder vor der Ernte weitere 6, 16 oder 40 h kultiviert. Zu diesen Zeitpunkten wurden die Zellen mit PBS (4 °C) gewaschen, durch Abkratzen geerntet und in Lysepuffer, der 0,2 mM Phenylmethan-Sulfonylfluorid enthielt, resuspendiert. Nach der Zentrifugation wurden die Überstände der Zelllysate durch SDS/PAGE und Autoradiographie analysiert.
Immunisierungen
Mäuse wurden mit 10⁴ bis 5 × 10⁶ rekombinanten SFV-Partikeln subkutan (s.c.), intraperitoneal (i.p.) oder intravenös (i.v.) immunisiert und anschließend einer oder zwei Auffrischimpfungen im Abstand von 2 Wochen oder keiner Auffrischimpfung unterzogen. Als negative Kontrollen wurden Mäusen gleiche Dosen SFV-LacZ-Partikel oder PBS injiziert.
CTL-Assay
Sieben Tage bis 3 Monate nach der letzten Immunisierung (Auffrischimpfung) wurden Milzzellen isoliert und in aufrecht gestellten 25-cm²-Kulturkolben mit bestrahlten (100 Gy) TC-1-Zellen in einem Verhältnis von 25:1 cokultiviert. Nach einer Woche in Kultur wurden Zellen geerntet, und ein CTL-Assay wurde als Standard-4-h-⁵¹Cr-Freisetzungsassay in drei Parallelbestimmungen durchgeführt. Zielzellen wurden 1 h lang mit 3,7 MBq ⁵¹Cr/10⁶ Zellen in 100 μl Medium markiert (⁵¹Cr stammte von Amersham, London, UK). Der mittlere Prozentsatz der spezifischen ⁵¹Cr-Freisetzung von drei parallel angesetzten Näpfen wurde gemäß der folgenden Formel berechnet: % spezifische Freisetzung = [(experimentelle Freisetzung – spontane Freisetzung)/(maximale Freisetzung – spontane Freisetzung)] cpm × 100. Die spontane ⁵¹Cr-Freisetzung war immer < 15%. Die Standardfehler der Mittelwerte der dreifachen Parallelbestimmungen betrugen < 10% des Mittelwerts.
Am Anfang wurde die CTL-Analyse auch nach einer zusätzlichen Zeit der in-vitro-Stimulation durchgeführt. Für diese Experimente wurden Milzzellen, die eine Woche lang gemäß der obigen Beschreibung kultiviert worden waren, geerntet und mit bestrahlten naiven Milzzellen (30 Gy) und bestrahlten C3-Zellen in einem Verhältnis von 2:5:0,1 in 24-Napf-Platten in Gegenwart von 4 IE rekombinantem hIL2/ml (Strathmann Biotech GmbH, Hamburg, Deutschland) restimuliert. Fünf Tage nach der Restimulierung wurden Zellen geerntet, und ein ⁵¹Cr-Freisetzungsassay wurde durchgeführt, wie es oben beschrieben ist.
Vorläufer-CTL-Häufigkeitsbestimmung durch IFN-alpha-Elispot-Analyse
Eine Elispot-Analyse wurde im Wesentlichen gemäß dem von Miyahira et al. (J. Immunol. Methods 181, 45054, 1995) beschriebenen Verfahren durchgeführt. Kurz gesagt, eine seriell verdünnte, bekannte Anzahl von frisch isolierten Milzzellen wurde in Näpfen (96-Napf-Hochaffinitätsplatten, Greiner) plattiert, die über Nacht mit gereinigten Anti-Maus-IFN-alpha-mAb (Pharmingen, CA) beschichtet worden waren. Anschließend wurden 13-2-Zellen (die nur das HPV16-E7_49-57-CTL-Epitop exprimierten) für eine in-vitro-Restimulierung hinzugefügt, wobei man Effektor-Stimulator-Zellverhältnisse von 1:1 bis 4:1 verwendete. Außerdem wurden Milzzellen ohne Stimulatorzellen als Kontrollen kultiviert, um die antigenunabhängige IFN-alpha-Sekretion zu bestimmen. Nach Inkubation über Nacht wurden die Näpfe ausgiebig gewaschen und mit biotinylierten Antihaus-IFN-α-mAb (Pharmingen, CA) inkubiert. Nach einer Stunde Inkubation bei 37 °C wurden die Platten gewaschen, und Streptavidin/Alkalische Phosphatase wurde hinzugefügt. Nach einer Stunde Inkubation bei 37 °C wurden die Platten gewaschen, und die Spots wurden entwickelt, indem man das Substrat BCIP (Sigma) in Agarose hinzufügte. Nach Inkubation bei 4 °C über Nacht wurde die Zahl der Spots mit Hilfe eines Stereomikroskops bestimmt.
Vorläufer-CTL-Häufigkeitsbestimmung mit Hilfe von HPV-spezifischen MHC-Klasse-I-Tetrameren
Mit Phycoerythrin (PE) markierte HPV16-E7_49-57-MHC-Klasse-I-Tetramere wurden freundlicherweise von Dr. T. Schumacher (NKI, Amsterdam, Niederlande) zur Verfügung gestellt. Frisch isolierte Milzzellen wurden 20 min lang auf Eis mit PE- markierten HPV16-E7_49-57-Tetramer und FITC-Anti-CD8 (Pharmingen) angefärbt, und anschließend erfolgten ausgiebige Waschungen mit PBS, das BSA (0,5%) und NaN₃ (0,02%) enthielt. Vor der FACS-Analyse wurde Propidiumiodid (PI) hinzugefügt. Kleine Lymphocyten wurden durch Vorwärts- und Seitwärtsstreuprofilierung ausgeschleust.
Tumor-Challenge-Experimente
Mäuse wurden gemäß der obigen Beschreibung mit 10⁶ bis 5 × 10⁶ SFV-E6E7-, SFV-eE6,7-Partikeln, SFV-LacZ-Partikeln oder PBS immunisiert und einer Auffrischimpfung unterzogen. Eine Woche nach der letzten Auffrischimpfung wurden die Mäuse einer subkutanen Challenge am Hals mit 2 × 10⁴ TC-1-Zellen, die in 0,2 ml Hanks Buffered Salt Solution (Life Technologies) suspendiert waren, unterzogen. Tumormessungen wurden immer durch denselben Fachmann vorgenommen. Bei einem Tumorvolumen von ungefähr 1000 mm³ wurden die Mäuse getötet.
Tumorbehandlungsexperimente

Mäuse wurden am Hals subkutan mit 2 × 10⁴ TC-1-Zellen geimpft, die in 0,2 ml Hanks Buffered Salt Solution (Life Technologies) suspendiert waren. Zu mehreren Zeitpunkten nach der Impfung mit Tumor wurden die Mäuse subkutan oder intravenös mit 5 × 10⁴ bis 5 × 10⁶ SFV-eE6,7-Partikeln immunisiert. Die Mäuse wurden an den Tagen 2, 7 und 14 nach der Impfung mit Tumor oder an den Tagen 7, 14 und 21 nach der Impfung oder schließlich an den Tagen 14, 21 und 28 nach der Impfung immunisiert. Außerdem wurden Kontrollgruppen mit aufgenommen, die an den Tagen 2, 7 und 14 nach der Impfung mit Tumor entweder mit PBS oder mit 5 × 10⁶ SFV-LacZ-Partikeln immunisiert wurden. Tumormessungen wurden immer durch denselben Fachmann vorgenommen. Bei einem Tumorvolumen von ungefähr 1000 mm³ wurden die Mäuse getötet. Tabelle 1 Vorläufer-CTL-Häufigkeit bei SFV-eE6,7-immunisierten Mäusen, bestimmt durch IFN-gamma-Elispot-Assay

Immunisierung	Dosis	Bewertungszeitpunkt	pCTL-Häufigkeit gesamt Milz¹	pCTL-Häufigkeit in CD8-positiven T-Zellen²
SFV-eE6,7	1 × 10⁶	18 Tage	1 von 6557	1 von 524
"	2,5 × 10⁶	"	1 von 1785	1 von 143
"	5 × 10⁶	"	1 von 4081	1 von 326
"	1 × 10⁶	8 Wochen	1 von 5381	1 von 430
"	2,5 × 10⁶	"	1 von 13636	1 von 1090
"	5 × 10⁶	"	1 von 7692	1 von 615
SFV-LacZ	5 × 10⁶	18 Tage und 8 Wochen	0 von 4 × 10⁵	-
PBS		"	0 von 4 × 10⁵	-

Die Mäuse wurden mit 1, 2,5 oder 5 × 10⁶ SFV-eE6,7 oder mit 5 × 10⁶ SFV-LacZ oder PBS als Kontrolle subkutan immunisiert und zweimal (s.c. und i.p.) einer Auffrischimpfung unterzogen.

¹ Die Milzzellen wurden 18 Tage oder 8 Wochen nach der letzten Auffrischimpfung isoliert, und die Häufigkeit von Vorläufer-CTLs wurde nach in-vitro-Stimulation über Nacht mit 13-2-Zellen, die HPV16-E7-49-57 (MHC-Klasse-I-Epitop) exprimieren, durch INF-gamma-Elispot-Assay bestimmt.
² Berechnete Häufigkeit unter Verwendung einer CD8-Häufigkeit von 8% der gesamten Milz.

Immunisierung¹	Zahl der tumorfreien Mäuse nach der ersten Tumor-Challenge/Gesamtzahl der Mäuse²	Zahl der tumorfreien Mäuse nach der zweiten Tumor-Challenge/Gesamtzahl der Mäuse³
Exp. 1 Tumor-Challenge Tag 0, erneute Tumor-Challenge Woche 25
SFV-eE6,7 [1 × 10⁶]	4/5	2/4
SFV-LacZ [1 × 10⁶]	0/5	-
PBS	0/5	0/3⁴
Exp. 2 Tumor-Challenge Tag 0, erneute Tumor-Challenge Woche 13
SFV-eE6,7 [1 × 10⁶]	5/5	3/5
SFV-eE6,7 [5 × 10⁶]	4/5	4/4
SFV-LacZ [5 × 10⁶]	0/5	-
PBS	0/5	0/34

¹ Die Mäuse wurden mit 1 × 10⁶ oder 5 × 10⁶ SFV-LacZ-Partikeln oder SFV-eE6,7-Partikeln oder PBS subkutan immunisiert und zweimal (s.c. und i.p.) einer Auffrischimpfung unterzogen. Eine Woche nach der letzten Auffrischimpfung wurden am Hals 2 × 10⁴ TC-1-Zellen subkutan eingeimpft.
² Das Tumorwachstum wurde zweimal pro Woche überwacht. Gezeigt ist die Zahl der tumorfreien Mäuse pro Gesamtzahl von Mäusen pro Gruppe.
³ Mäuse, die tumorfrei geblieben waren, wurden anschließend einer erneuten Challenge mit 2 × 10⁴ TC-1-Zellen unterzogen; im ersten Experiment in Woche 25, im zweiten Experiment in Woche 13 nach der ersten Tumor-Challenge.
⁴ Bei den Experimenten mit erneuter Challenge wurden drei altersangepasste Kontrollmäuse mit aufgenommen.

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Titel und Legenden zu Figuren
1: Western-Blot-Analyse von Extrakten von mit SFV-E6E7 transfizierten BHK-Zellen. BHK-Zellen wurden mit SFV-E6E7-Partikeln oder SFV-LacZ-Partikeln infiziert. Nach Inkubation über Nacht wurden die zellulären Proteine extrahiert und durch SDS-PAGE und Immunoblotting analysiert. E6 wurde unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Anti-HPV16-E6-Antikörpers nachgewiesen (Abschnitt A), und E7 wurde unter Verwendung eines monoklonalen Maus-Anti-HPV16-E7-Antikörpers nachgewiesen (Abschnitt B). Spuren 1: BHK21-Zellen nicht infiziert; Spuren 2: BHK21-Zellen mit SFV-E6E7-Partikeln infiziert; Spuren 3: BHK21-Zellen mit SFV-LacZ-Partikeln infiziert; M: Proteinmarker.
2: Intrazelluläre Lokalisierung von E7 in SFV-E6E7-infizierten BHK-Zellen. BHK21-Zellen wurden mit SFV-E6E7 infiziert. Nach Inkubation über Nacht wurden die Zellen mit Hilfe von Anti-HPV16-E6- oder Anti-HPV16-E7-Antikörpern angefärbt. A: Immunfluoreszenzfärbung von SFV-E6E7-infizierten Zellen mit Anti-HPV16-E6; B: Immunfluoreszenzfärbung von SFV-E6E7-infizierten Zellen mit Anti-HPV16-E7. Vergrößerung 40×.
3: Nach Immunisierung mit SFV-E6E7-Partikeln induzierte CTL-Aktivität, bestimmt nach 11 bzw. 18 Tagen in-vitro-Restimulierung. Mäuse wurden mit gereinigtem 10⁶ SFV-E6E7 (n = 4, leere und ausgefüllte Quadrate und Rauten), SFV-LacZ-Partikeln (Dreiecke) oder PBS (Kreuze) als Kontrolle subkutan immunisiert und zweimal (s.c. und i.p.) einer Auffrischimpfung unterzogen. Die CTL-Aktivität wurde eine Woche nach der letzten Auffrischimpfung bestimmt. Nach 11 Tagen (Bild A) bzw. 18 Tagen (Bild B) in-vitro-Restimulierung wurden die resultierenden Effektorzellen auf cytolytische Aktivität gegen 13-2-Zielzellen im Assay mit 3 parallel angesetzten Näpfen getestet. Gezeigt sind die Niveaus der Cytolyse bei verschiedenen Effektor-Target-Verhältnissen. Die Standardfehler der Mittelwerte der dreifachen Parallelbestimmungen waren stets < 10% des Mittelwerts.
4: Erkennung und Lyse von HPV16-transformierten C3-Zellen sowie 13-2-Zellen, die das H-2D^b-bindende HPV16-CTL-Epitop exprimieren, durch CTLs, die nach Immunisierung mit SFV-E6E7-Partikeln induziert wurden. Mäuse wurden mit gereinigtem 10⁶ SFV-E6E7 (n = 2, Quadrate und Rauten), SFV-LacZ-Partikeln (leere Dreiecke) oder PBS (Kreuze) als Kontrolle subkutan immunisiert und zweimal (s.c. und i.p.) einer Auffrischimpfung unterzogen. Nach 11 Tagen in-vitro-Restimulierung wurden die resultierenden Effektorzellen auf cytolytische Aktivität gegen 13-2-Zielzellen (Bild A) und C3-Zellen (Bild B) im Assay mit 3 parallel angesetzten Näpfen getestet. Gezeigt sind die Niveaus der Cytolyse bei verschiedenen Effektor-Target-Verhältnissen. Die Standardfehler der Mittelwerte der dreifachen Parallelbestimmungen waren stets < 10% des Mittelwerts.
5: Erkennung von mit E7-49-57 beladenen syngenischen EL4-Zellen durch CTLs, die nach Immunisierung mit SFV-E6E7-Partikeln induziert wurden. Mäuse wurden mit gereinigtem 10⁶ SFV-E6E7 (n = 2, Quadrate und Rauten), SFV-LacZ-Partikeln (Dreiecke) oder PBS (Kreuze) als Kontrolle subkutan immunisiert und zweimal (s.c. und i.p.) einer Auffrischimpfung unterzogen. Nach 18 Tagen in- vitro-Restimulierung wurden die resultierenden Effektorzellen auf cytolytische Aktivität gegen mit E7-49-57 beladenen syngenischen EL4-Zellen (Bild A) und unbeladenen EL4-Zellen (Bild B) im Assay mit 3 parallel angesetzten Näpfen getestet. Gezeigt sind die Niveaus der Cytolyse bei verschiedenen Effektor-Target-Verhältnissen. Die Standardfehler der Mittelwerte der dreifachen Parallelbestimmungen waren stets < 10% des Mittelwerts.
6: CTL-Aktivität in Mäusen, die mit verschiedenen Dosen von SFV-E6E7-Partikeln immunisiert wurden. In zwei getrennten Experimenten wurden Mäuse mit gereinigten 10⁴ (ausgefüllte Dreiecke), 10⁵ (ausgefüllte Rauten) oder 10⁶ (ausgefüllte Quadrate) SFV-E6E7-Partikeln, 10⁶ SFV-LacZ-Partikeln (Dreiecke) oder PBS (Kreuze) als Kontrolle subkutan immunisiert und zweimal (s.c. und i.p.) einer Auffrischimpfung unterzogen. Die CTL-Aktivität wurde eine Woche nach der letzten Auffrischimpfung bestimmt. Nach 18 Tagen in-vitro-Restimulierung wurden die resultierenden Effektorzellen auf cytolytische Aktivität gegen 13-2-Zellen im Assay mit 3 parallel angesetzten Näpfen getestet. Gezeigt sind die Niveaus der Cytolyse bei verschiedenen Effektor-Target-Verhältnissen in zwei individuellen Experimenten. Die Standardfehler der Mittelwerte der dreifachen Parallelbestimmungen waren stets < 10% des Mittelwerts.
7: Wachstum von TC-1-Tumorzellen in SFV-E6E7-immunisierten Mäusen. Mäuse wurden mit PBS (Bild A; n = 10), 5 × 10⁶ SFV-LacZ-Partikeln (Bild B; n = 10), 10⁶ SFV-E6E7-Partikeln (Bild C; n = 10) oder 5 × 10⁶ SFV-E6E7-Partikeln (Bild D; n = 5) subkutan immunisiert und zweimal (s.c. und i.p.) einer Auffrischimpfung unterzogen. Das Tumorwachstum wurde zweimal pro Woche überwacht. Jede Linie stellt das Tumorvolumen einer einzelnen Maus dar.
8: Wachstum von TC-1-Tumorzellen in SFV-E6E7-immunisierten Mäusen. Mäuse wurden mit PBS (n = 10; leere Kreise), 5 × 10⁶ SFV-LacZ-Partikeln (n = 10; leere Quadrate), 10⁶ SFV-E6E7-Partikeln (n = 10; ausgefüllte Rauten) oder 5 × 10⁶ SFV-E6E7-Partikeln (n = 5; ausgefüllte Quadrate) subkutan immunisiert und zweimal (s.c. und i.p.) einer Auffrischimpfung unterzogen. Das Tumor- Wachstum wurde zweimal pro Woche überwacht. Gezeigt sind die Prozentsätze der Mäuse mit nicht tastbaren Tumoren.
9: Klonierungsstrategie für die Konstruktion von SFV-enhE6,7
Aus dem pSFV3-E6E7 wurde die E6-Sequenz mit einer NcoI-Stelle am 5'-Ende und einer EcoRI-Stelle am 3'-Ende modifiziert. Die E7-Sequenz wurde durch PCR mit einer EcoRI-Stelle am 5'-Ende und einer BamHI-Stelle am 3'-Ende modifiziert. Es wurde gezeigt, dass das 5'-Ende des Capsid-Gens von SFV, das für die ersten 34 Aminosäurereste codiert, einen Translations-Enhancer enthält. Dieser Enhancer wurde von Smerdou and Liljeström (J. Virol. 73, 1092-1098, 1999) in ein pSFV-Helfer-S1-Konstrukt kloniert. Außerdem fügten sie die Sequenz der 2A-Autoprotease des Maul-und-Klauenseuche-Virus (FMDV) (17 Aminosäuren) rasterpassend zwischen den Translations-Enhancer und p62 (SFV-Hüllprotein) ein, um für eine Spaltung zwischen den Proteinen zu sorgen. Wir synthetisierten die Sequenz, die den Translations-Enhancer und die FMDV-A2-Autoprotease aus pSFV-Helfer-S1 enthielt, und durch PCR wurden BamHI- und NcoI-Restriktionsstellen am 5'- bzw. 3'-Ende erzeugt. Die enh-FMDV-A2-Protease-, E6- und E7-Fragmente wurden in die BamHI-Stelle von pSFV3 kloniert, wobei pSFV3-eE6,7 entstand.
Im ursprünglichen Plasmid liegen das HPV16-E6- und -E7-Gen in Tandemanordnung vor, mit einem Stopcodon nach dem E6-Gen. In pSFV3-eE6,7 ist ein Basenpaar zwischen E6 und E7 eingefügt, und das Stopcodon TAA von E6 ist zu GAA verändert. Somit ist die E6 und E7 codierende Sequenz in pSFV3-eE6,7 rasterpassend und exprimiert ein Fusionsprodukt von E6 und E7.
10: Western-Blot-Analyse von Extrakten von mit recSFV transfizierten BHK-Zellen. BHK-Zellen wurden mit SFV-E6E7-, SFV-eE6E7- oder SFV-eE6,7-Partikeln infiziert. Nach Inkubation über Nacht wurden die zellulären Proteine extrahiert und durch SDS-PAGE und Immunoblotting analysiert. E6 wurde unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Anti-HPV16-E6-Antikörpers nachgewiesen (Spur 1-3), und E7 wurde unter Verwendung eines monoklonalen Maus- Anti-HPV16-E7-Antikörpers nachgewiesen (Spur 5-8). Spuren 1 und 5: BHK21-Zellen mit SFV-E6E7-Partikeln infiziert; Spuren 2 und 6: BHK21-Zellen mit SFV-eE6E7-Partikeln infiziert; Spuren 3 und 7: BHK21-Zellen mit SFV-eE6,7-Partikeln infiziert; Spur 4: Proteinmarker (M); Spur 8: rekombinant (E. coli) produziertes E7-Protein.
11: Analyse von E6- und E7-Expression durch Puls-Markierung. BHK-Zellen wurden mit SFV-E6E7-, SFV-eE6E7- oder SFV-eE6,7-Partikeln infiziert. Nach 6 h wurden die Zellen weitere 30 min lang mit methionin- und cysteinfreiem Medium kultiviert, woraufhin eine Markierungszeit von 1 h mit ³⁵S-Methionin/-Cystein folgte. Nach einer Stunde wurden die Zellen gewaschen und geerntet oder vor der Ernte weitere 6, 16 oder 40 h kultiviert. Die Zelllysate wurden durch SDS/PAGE und Autoradiographie analysiert. Spur 1: BHK21-Zellen nicht infiziert, nach 6 h Chase analysiert; Spur 2: BHK21-Zellen mit SFV-E6E7 infiziert, direkt bzw. nach 6 h oder 16 h Chase analysiert; Spuren 3-5: BHK-Zellen mit SFV-eE6,E7 infiziert, direkt, bzw. nach 6 h oder 16 h Chase analysiert; Spuren 6-9: BHK21-Zellen mit SFV-eE6,E7 infiziert, direkt bzw. nach 6 h, 16 h oder 40 h Chase analysiert.
12: CTL-Aktivität induziert nach Immunisierung mit SFV-E6E7-Partikeln, bestimmt nach 7 bzw. 14 Tagen in-vitro-Restimulierung. Mäuse wurden mit gereinigtem 10⁶ SFV-eE6,7 (n = 2; ausgefüllte Quadrate), 10⁵ SFV-eE6,7 (n = 2; leere Quadrate), 10⁶ SFV-E6E7 (n = 2; ausgefüllte Kreise), 10⁵ SFV-E6E7-Partikeln (n = 2; leere Kreise) oder 10⁶ SFV-LacZ (n = 2; ausgefüllte Dreiecke) oder PBS (n = 2; leere Dreiecke) als Kontrolle subkutan immunisiert und zweimal (s.c. und i.p.) einer Auffrischimpfung unterzogen. Die CTL-Aktivität wurde eine Woche nach der letzten Auffrischimpfung bestimmt. Nach 7 Tagen (Bild A) bzw. 14 Tagen (Bild B) in-vitro-Restimulierung wurden die resultierenden Effektorzellen auf cytolytische Aktivität gegen 13-2-Zielzellen im Assay mit 3 parallel angesetzten Näpfen getestet. Gezeigt sind die Niveaus der Cytolyse bei verschiedenen Effektor-Target-Verhältnissen. Die Standardfehler der Mittelwerte der dreifachen Parallelbestimmungen waren stets < 10% des Mittelwerts.
13: CTL-Aktivität induziert nach Immunisierung mit 1, 2,5 und 5 × 10⁶ SFV-eE6,7-Partikeln. Mäuse wurden mit gereinigtem 5 × 10⁶ SFV-eE6,7 (ausgefüllte Quadrate), 2,5 × 10⁶ SFV-eE6,7 (leere Kreise), 10⁶ SFV-eE6,7 (leere Quadrate) oder 5 × 10⁶ SFV-LacZ (ausgefüllte Dreiecke) oder PBS (leere Dreiecke) als Kontrollen subkutan immunisiert und zweimal (s.c. und i.p.) einer Auffrischimpfung unterzogen. Die CTL-Aktivität wurde 18 Tage (Bild A) bzw. 8 Wochen (Bild B) nach der letzten Auffrischimpfung bestimmt. Nach 7 Tagen in-vitro-Restimulierung wurden die resultierenden Effektorzellen auf cytolytische Aktivität gegen 13-2-Zielzellen im Assay mit 3 parallel angesetzten Näpfen getestet. Gezeigt sind die Niveaus der Cytolyse bei verschiedenen Effektor-Target-Verhältnissen. Die Standardfehler der Mittelwerte der dreifachen Parallelbestimmungen waren stets < 10% des Mittelwerts.
14: Die Induktion einer langfristigen CTL-Aktivität erfordert eine einzige Auffrischimpfung. Mäuse erhielten eine einzige subkutane Injektion von 2,5 × 10⁶ SFV-eE6,7-Partikeln (Bild A) oder zwei subkutane Injektionen von 2,5 × 10⁶ SFV-eE6,7-Partikeln (Bild B). Die CTL-Aktivität wurde 10 Tage (Quadrate), 1 Monat (Kreise) oder drei Monate (Dreiecke) nach der (letzten) Injektion von Partikeln bestimmt. Nach 7 Tagen in-vitro-Restimulierung wurden die resultierenden Effektorzellen auf cytolytische Aktivität gegen 13-2-Zielzellen im Assay mit 3 parallel angesetzten Näpfen getestet. Gezeigt sind die Niveaus der Cytolyse bei verschiedenen Effektor-Target-Verhältnissen. Die Standardfehler der Mittelwerte der dreifachen Parallelbestimmungen waren stets < 10% des Mittelwerts.
15: CTL-Aktivität und Vorläufer-CTL-Häufigkeit bei Mäusen, die über verschiedene Wege mit SFV-eE6,7-Partikeln immunisiert wurden. Mäuse wurden mit gereinigten 10⁶ SFV-eE6,7-Partikeln s.c. (n = 2), i.p. (n = 3) oder i.v. (n = 3) immunisiert und zweimal einer Auffrischimpfung unterzogen. Eine Woche nach der letzten Auffrischimpfung wurden Milzzellen isoliert. Für die CTL-Akivität wurden Milzzellen 7 Tage lang in vitro restimuliert. Die resultierenden Effektorzellen wurden auf ihre cytolytische Aktivität gegen 13-2-Zielzellen im Assay mit 3 parallel angesetzten Näpfen getestet. In den oberen drei Bildern sind die Niveaus der Cytolyse bei verschiedenen Effektor-Target-Verhältnissen angegeben. Für die Tetramer-Anfärbung wurden Milzzellen direkt nach der Isolierung mit Anti-CD8-FITC-Antikörper und einem HPV16-E7-spezifischen MHC-Klasse-I-Tetramer (PE-markiert) angefärbt. In den unteren drei Bildern sind die Prozentsätze von CD8-positiven/tetramerpositiven T-Zellen für die individuellen Mäuse angegeben. Die ausgefüllten, grauen und leeren Balken in den unteren Bildern entsprechen den Niveaus der CTL-Aktivität der ausgefüllten, grauen und leeren Symbole in den oberen Bildern.
16: Schutz vor Wachstum von TC-1-Tumorzellen in mit SFV-eE6,7 immunisierten Mäusen. Mäuse wurden mit PBS (n = 10; leere Dreiecke), 10⁶ SFV-LacZ-Partikeln (n = 10; leere Quadrate) oder 10⁶ SFV-E6,7-Partikeln (n = 10; ausgefüllte Quadrate) subkutan immunisiert und zweimal (s.c. und i.p.) einer Auffrischimpfung unterzogen. Das Tumorwachstum wurde zweimal pro Woche überwacht. Gezeigt sind die Prozentanteile von Mäusen mit nicht tastbaren Tumoren in der Zeit.
17: Therapeutische Behandlung von TC-1-Tumoren durch SFV-eE6,7-Immunisierung. Mäuse wurden am Hals subkutan mit 2 × 10⁴ TC-1 geimpft. Zu mehreren Zeitpunkten nach der Impfung mit Tumor wurden den Mäusen subkutan 5 × 10⁶ SFV-eE6,7-Partikel injiziert (drei untere Bilder). Eine Gruppe von Mäusen (n = 7) wurde an den Tagen 2, 7 und 14 nach der Impfung mit Tumor immunisiert, eine zweite Gruppe (n = 14) wurde an den Tagen 7, 14 und 21 nach der Impfung immunisiert, und die letzte Gruppe (n = 6) wurde an den Tagen 14, 21 und 28 nach der Impfung immunisiert. Außerdem wurden zwei Kontrollgruppen mit aufgenommen, denen an den Tagen 2, 7 und 14 nach der Impfung mit Tumor entweder PBS (n = 9) oder 5 × 10⁶ SFV-LacZ-Partikel (n = 5) injiziert wurden. Das Tumorwachstum wurde zweimal pro Woche überwacht. Jede Linie stellt das Tumorvolumen einer einzelnen Maus dar. Angegeben sind die kombinierten Ergebnisse von zwei Experimenten.
18: Therapeutische Behandlung von TC-1-Tumoren durch SFV-eE6,7-Immunisierung. Kombinierte Ergebnisse von 17, die die Prozentanteile von tumorfreien Mäusen in der Zeit zeigen. Mäuse wurden am Hals subkutan mit 2 × 10⁴ TC-1 geimpft. Zu mehreren Zeitpunkten nach der Impfung mit Tumor wurden den Mäusen SFV-eE6,7-Partikel injiziert, wie es in der Legende zu 17 beschrieben ist. Gezeigt sind die Prozentanteile von tumorfreien Mäusen nach der Injektion von SFV-eE6,7 an den Tagen 2, 7 und 14 nach der Impfung mit Tumor (n = 7; ausgefüllte Quadrate), nach der Injektion von SFV-eE6,7 an den Tagen 7, 14 und 21 (n = 14; leere Rauten) oder nach der Injektion mit PBS (n = 9; leere Kreise) oder 5 × 10⁶ SFV-LacZ-Partikel (n = 5, leere Dreiecke) an den Tagen 2, 7 und 14 nach der Impfung. Das Tumorwachstum wurde zweimal pro Woche überwacht.
19: Nucleotidsequenz des Konstrukts enhE6,7
20: Erneute Tumor-Challenge bei Mäusen, die eine erste Tumor-Challenge überlebt haben. Das linke Bild zeigt die Prozentanteile von tumorfreien Mäusen in der Zeit für eines der Experimente, wie sie in 17 gezeigt und beschrieben sind. 13 Wochen nach der ersten Impfung mit Tumor wurden Mäuse erneut einer Challenge mit 2 × 10⁴ TC-1 ohne zusätzliche Immunisierung ausgesetzt. Das rechte Bild zeigt den Prozentanteil der tumorfreien Mäuse nach erneuter Tumor-Challenge von Mäusen, die ursprünglich mit SFV-eE6,7 an den Tagen 2, 7 und 14 (n = 7; Quadrate) oder mit SFV-eE6,7 an den Tagen 7, 14 und 21 (n = 4; Rauten) immunisiert worden waren. Da alle Kontrollmäuse nach der ersten Tumor-Challenge einen Tumor entwickelt hatten, wurden 4 Kontrollmäuse in das Experiment mit der erneuten Challenge mit aufgenommen (Kreise). Das Tumorwachstum wurde zweimal pro Woche überwacht.
21: Therapeutische Behandlung von TC-1-Tumoren durch intravenöse Immunisierung mit SFV-eE6,7-Partikeln. Mäuse wurden am Hals subkutan mit 2 × 10⁴ TC-1 geimpft. Zu mehreren Zeitpunkten nach der Impfung mit Tumor wurden den Mäusen intravenös 5 × 10⁶ SFV-eE6,7-Partikel oder PBS injiziert. Mäuse wurden an den Tagen 7, 14 und 21 (n = 7; mittleres Bild) nach der Impfung mit Tumor oder an den Tagen 14, 21 und 28 (n = 7; rechtes Bild) nach der Impfung mit Tumor immunisiert. Außerdem wurde eine Puffer(PBS)- Kontrollgruppe mit aufgenommen (n = 5; linkes Bild). Das Tumorwachstum wurde zweimal pro Woche überwacht. Jede Linie stellt das Tumorvolumen einer einzelnen Maus dar.
22: Therapeutische Behandlung von TC-1-Tumoren durch intravenöse Immunisierung mit abnehmenden Mengen von SFV-eE6,7-Partikeln. Mäuse wurden am Hais subkutan mit 2 × 10⁴ TC-1 geimpft. Zu mehreren Zeitpunkten nach der Impfung mit Tumor wurden den Mäusen intravenös 5 × 10⁶ SFV-eE6,7-Partikel (n = 7; unteres linkes Bild), 5 × 10⁵ SFV-eE6,7-Partikel (n = 7; unteres mittleres Bild), 5 × 10⁴ SFV-eE6,7-Partikel (n = 7; unteres rechtes Bild) oder PBS (n = 5; oberes Bild) an den Tagen 7, 14 und 21 nach der Impfung mit Tumor injiziert. Das Tumorwachstum wurde zweimal pro Woche überwacht. Jede Linie stellt das Tumorvolumen einer einzelnen Maus dar.
Sequenzprotokoll

Claims

Semliki-Forest-Virus-Vektorsystem, das eine Nucleinsäure umfasst, die wenigstens ein antigenes Polypeptidfragment von Protein E6 und/oder Protein E7 eines Humanpapillomvirus (HPV) codiert.
Vektorsystem gemäß Anspruch 1, wobei das Fragment ein antigenes Polypeptidfragment von E6 und ein antigenes Polypeptidfragment von E7 umfasst.
Vektorsystem gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Fragment wenigstens teilweise seiner Fähigkeit, an pRb- und/oder P53-Protein zu binden, beraubt wurde.
Vektorsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, das weiterhin ein translationales Enhancer-Element umfasst.
Vektorsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, das weiterhin eine Nucleinsäure umfasst, die eine Autoprotease codiert.
Vektorsystem gemäß Anspruch 5, wobei die Autoprotease vom Maul-und-Klauen-Seuche-Virus abgeleitet ist.
Vektorsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei ein Semliki-Forest-Virus-Struktur- und ein Nichtstrukturprotein ausgehend von wenigstens zwei unabhängigen Nucleinsäuremolekülen exprimiert werden.
Vektorsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das HPV HPV16 und/oder HPV18 umfasst.
Vektorsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Nucleinsäure weiterhin ein Cytokin-Gen oder ein funktionelles Fragment davon codiert.
Vektorsystem gemäß Anspruch 9, wobei das Cytokin GM-CSF oder IL-12 umfasst.
Zelle, die ein Vektorsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 umfasst.
Vektorsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 oder Zelle gemäß Anspruch 11 zur Verwendung als Medikament.
Verwendung eines Vektorsystems gemäß Anspruch 12 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention von Zervixkarzinom.
Verwendung gemäß Anspruch 12 oder 13, wobei das Medikament ein Impfstoff ist.
Medikament, das ein Vektorsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 oder eine Zelle gemäß Anspruch 11 umfasst.
Medikament gemäß Anspruch 15 zur Behandlung oder Prävention von Zervixkarzinom.