ES2290177T3

ES2290177T3 - Inmunizacion genetica contra el carcinoma cervical.

Info

Publication number: ES2290177T3
Application number: ES01979106T
Authority: ES
Inventors: Djoeke Geesje Regts; Marijke Holtrop; Jan Christiaan Wilschut; Catharina Arnoldine Daemen
Original assignee: Rijksuniversiteit Groningen
Current assignee: Rijksuniversiteit Groningen
Priority date: 2000-10-06
Filing date: 2001-10-08
Publication date: 2008-02-16
Anticipated expiration: 2021-10-08
Also published as: US20040005711A1; EP1865066A3; CA2424700A1; ATE366819T1; WO2002029074A2; US7198792B2; WO2002029074A3; EP1865066A2; EP1370666A2; EP1195438A1; DE60129358D1; DE60129358T2; EP1370666B1; CA2424700C; AU2002211095A1; US20070166328A1

Abstract

Sistema de vector de Virus del Bosque de Semliki que comprende un ácido nucleico que codifica, como mínimo, un fragmento de polipéptido antigénico de la proteína E6 y/o proteína E7 de un virus del papiloma humano (HPV).

Description

Inmunización genética contra el carcinoma cervical.

La presente invención se refiere al sector del cáncer cervical causado por papilomavirus humanos. Los papilomavirus son virus tumorales pequeños con ADN desnudo (7,9 kb, de doble cadena), que son altamente específicos de especie. Se han descrito más de 90 tipos individuales de virus del papiloma humano (HPV). La infección genital por HPV en mujeres jóvenes sexualmente activas es común y la mayor parte de los individuos eliminan la infección, o bien, si se desarrollan lesiones, éstas revierten. Sólo un subconjunto de individuos infectados tienen lesiones que progresan hasta un elevado grado de neoplasia intraepitelial y sólo una fracción de éstas progresan aún más hacia un carcinoma invasivo. El carcinoma de cérvix en las mujeres se desarrolla a través de una etapa intermedia precancerosa hasta un carcinoma invasivo que conduce frecuentemente a la muerte. La infección de las células epiteliales genitales con los tipos 16 y 18 de papilomavirus humano (HPV) se asocia estrechamente con el desarrollo de carcinoma cervical. El genoma del HPV codifica 7 proteínas tempranas (E) reguladoras no estructurales, y dos proteínas tardías (L) estructurales. La integración del ADN viral en el genoma de la célula huésped, que se considera una etapa fundamental en el desarrollo del carcinoma cervical inducido por HPV16 o HPV18, da como resultado una pérdida del control transcripcional mediado por E1 o E2. Como consecuencia, las células transformadas sobreexpresan las proteínas E6 y E7, iniciando el proceso de transformación maligna [Pei (1996) Carcinogenesis 1996; 17: 1395-1401].

Se cree que la inmunidad mediada por células específicas juega un papel esencial en el control de las infecciones por HPV y del carcinoma cervical. Esta suposición se basa en observaciones que muestran: (i) que las lesiones inducidas por HPV revierten espontáneamente en la mayor parte de los individuos, y (ii) que los pacientes inmunodeficientes desarrollan significativamente más lesiones proliferativas relacionadas con HPV en la piel y el tejido anogenital que los individuos inmunocompetentes. En diversos modelos animales se ha demostrado que las proteínas E6 y E7 de HPV, que se expresan constitutivamente en células transformadas por HPV, pueden actuar como dianas para la muerte de células tumorales mediada por CTL y la estimulación de la actividad CTL específica de tumor. La inducción de una respuesta CTL específica de antígeno requiere un procesamiento intracelular del antígeno diana y la presentación de péptidos antigénicos por las moléculas MHC de clase I.

En los últimos años se han descrito varias estrategias de inmunización basadas en péptidos/proteínas o inmunización genética para la inducción de actividad CTL específica para HPV. Los principales inconvenientes asociados al enfoque basado en péptidos incluyen el problema del polimorfismo MHO y el riesgo de inducción de tolerancia de células T antes que la activación de las células T. Debido a la inducción de tolerancia específica de células T, se ha demostrado que la vacunación con un péptido específico de tumor da como resultado una extensión aumentada del tumor. La inmunización con proteínas más grandes superaría estos problemas, pero esto requiere sistemas de liberación de antígeno eficaces y/o coadyuvantes seguros para una sensibilización inmune eficaz. La inducción de respuestas CTL específicas para HPV en ratones tras la inmunización con un virus de vacuna recombinante que expresa E6 o E7 de HPV produjo, inesperadamente, titulaciones más bajas en comparación con la cepa parental, lo cual reduce seriamente la eficacia para la inducción de respuestas CTL específicas para HPV. Otras desventajas asociadas con la utilización del sistema de vector basado en virus de vacuna son las respuestas inmunes contra proteínas virales en pacientes preinmunes o la integración más seriamente de genes recombinantes en el genoma de la célula huésped (retrovirus). Especialmente, cuando el virus recombinante codifica oncoproteínas, tales como E6 o E7 de HPV, el riesgo de integración en el genoma de la célula huésped es un factor de principal preocupación, ya que las células infectadas, de hecho, pueden sobrevivir y volverse tumorigénicas (inmortalizadas).

La presente invención da a conocer un sistema de vector de "Semliki Forest Virus" (SFV) ("Virus del Bosque de Semliki") que comprende un ácido nucleico que codifica, como mínimo, un fragmento de polipéptido antigénico de la proteína E6 y/o la proteína E7 del mencionado HPV. El Virus del Bosque de Semliki comprende una nucleocápside con una copia de una molécula de ARN de cadena simple rodeada de una envoltura que contiene proteínas de espícula. El ARN del SFV tiene una polaridad positiva que permite al ARN genómico iniciar una infección cuando se introduce dentro del citoplasma de una célula. Además, el ARN es autorreplicante, dado que codifica su propia replicasa, y la replicación da como resultado un nivel elevado de expresión de las proteínas virales en las células del huésped. Tal como se utiliza en la presente invención, secuencia de ácido nucleico o molécula de ácido nucleico se refieren a un oligonucleótido, nucleótido o polinucleótido, y a fragmentos o partes del mismo, y a ADN o ARN de origen genómico o sintético que puede ser de cadena simple o doble, y representa la cadena sentido o antisentido. La definición ARN "antisentido" es una secuencia de ARN que es complementaria a una secuencia de bases en el ARNm correspondiente; complementaria en el sentido de que cada base (o la mayoría de las bases) en la cadena antisentido del Virus del Bosque de Semliki (leído en el sentido 5' a 3') es capaz de emparejarse con la base correspondiente (G con C, A con U), en la secuencia de ARNm leída en el sentido 5' a 8'. La definición ARN "sentido" es una secuencia de ARN, que es sustancialmente homóloga, como mínimo, a una parte de la correspondiente secuencia de ARNm. Una realización preferente es aquella en la que los ácidos nucleicos se obtienen de un virus del papiloma humano (HPV) de tipo 16 y/o tipo 18. La presente invención da a conocer un ácido nucleico que puede ser un gen o una parte funcional de un gen (en la que el gen es un ácido nucleico que se puede expresar) o un precursor de un gen o un gen transcrito en cualquier nivel de ácido nucleico (ADN y/o ARN: cadena doble o simple) y/o producto génico que se obtiene de los mismos que puede superar la supresión del ciclo celular mediante la inactivación de las principales proteínas supresoras tumorales, productos génicos P58 y pRB (retinoblastoma), que conducen, respectivamente, a la pérdida de la diferenciación celular normal y el desarrollo de un carcinoma. En la presente invención, un producto génico se refiere a ARNm y la cadena polipeptídica traducida de una molécula de ARNm, que a su vez se transcribe a partir de un gen; si el transcrito de ARN no se traduce (por ejemplo, ARNr, ARNt) la molécula de ARN representa el producto génico. En la presente invención, el producto génico se refiere a cualquier sustancia proteinácea. Una sustancia proteinácea se refiere a cualquier molécula que comprende péptidos o proteínas. La presente invención dio a conocer, preferentemente, un vector de SFV, que comprende un ácido nucleico que se obtiene del virus del papiloma humano (HPV) de tipo 16 y/o 18 y que codifica los oncogenes E6 y E7 o fragmentos funcionales o derivados del mismo que están implicados en la transformación. En la presente invención fragmento funcional o derivados del mismo significa que la secuencia distintiva del individuo puede variar de la secuencia de referencia en una o más sustituciones, supresiones o adiciones, el efecto neto de las cuales no dará como resultado desigualdad funcional entre las dos secuencias. Entre los expertos en la materia se sabe que como resultado de la degeneración del código genético, se pueden producir una multitud de secuencias génicas, algunas de las cuales tienen una homología mínima con respecto a las secuencias de nucleótidos de cualquiera de los genes conocidos y presentes de forma natural. La presente invención contempla cada una y todas las posibles variaciones de los ácidos nucleicos que podrían hacerse seleccionando combinaciones basadas en selecciones de codones posibles. Estas combinaciones se han hecho según el código genético estándar del triplete. Debe considerarse que todas las variaciones de este tipo se describirán específicamente. Teóricamente, una longitud de fragmento mínima sería 9 AA, dado que esta es la longitud promedio del epítopo CTL. La vacunación con péptidos de esta longitud, de hecho, da como resultado una respuesta CTL. Sin embargo, es preferente utilizar construcciones que codifiquen péptidos/proteínas más largos, de modo que las preparaciones no están limitadas por la restricción HLA.

La presente invención da a conocer un sistema de vector de SFV que comprende un ácido nucleico, en el que dicho ácido nucleico codifica, como mínimo, un fragmento de polipéptido antigénico del HPV, codificando dicho ácido nucleico, como mínimo, un fragmento de polipéptido antigénico de la proteína E6 y/o proteína E7 de dicho HPV. Tal como se utiliza en la presente invención, un "fragmento de polipéptido antigénico" se refiere a, como mínimo, un producto génico o fragmento del mismo que se obtiene a partir de dicho ácido nucleico, en el que dicho producto génico comprende una o más sustancias proteináceas en el que dicha sustancia proteinácea es un antígeno (invasor foráneo que habitualmente es una proteína o fracción acoplada de proteína) capaz de iniciar una respuesta inmune. En la presente invención, una "respuesta inmune" se refiere a la respuesta o respuestas fisiológicas que se derivan de la activación del sistema inmune por los antígenos. Una realización preferente es aquella en la que dicha respuesta inmune implica la producción de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos para HPV.

La presente invención da a conocer un sistema de vector de SFV que comprende un ácido nucleico, en el que dicho ácido nucleico codifica, como mínimo, un fragmento de polipéptido antigénico del HPV, en el que dicho fragmento de polipéptido antigénico es de la proteína E6 y/o de la proteína E7 del HFV. E6 y E7 son oncogenes virales. Más preferentemente, el producto génico comprende un fragmento de polipéptido antigénico de la proteína E6 y/o E7 del HPV. Las proteínas E6 y E7 se refieren a oncoproteínas que se obtienen a partir de los genes E6 y E7 del HPV, respectivamente, y son productos asociados a virus expresados en el cáncer cervical que pueden inmortalizar células diana. La expresión de los genes E6 y E7 se mantiene selectivamente en lesiones cervicales premalignas y malignas y sus productos génicos contribuyen al proceso de transformación y son necesarios para mantener el estado transformado.

La presente invención también proporciona un sistema de vector de SFV que comprende un ácido nucleico, en el que dicho ácido nucleico codifica, como mínimo, un fragmento de polipéptido antigénico del HPV, en el que dicho fragmento de polipéptido antigénico comprende un fragmento de polipéptido antigénico de E6 y un fragmento de polipéptido antigénico de E7. En la presente invención, fragmento de polipéptido antigénico del HPV se refiere a antígenos tumorales de E6 y E7 que se pueden unir a los productos celulares supresores de tumores pRB y P53. Preferentemente, un ácido nucleico que codifica E6 y E7 o fragmentos de los mismos están fusionados conservando la pauta de lectura.

La presente invención también da a conocer un sistema de vector de SFV que comprende un ácido nucleico en el que dicho ácido nucleico codifica, como mínimo, un fragmento de polipéptido antigénico de la proteína E6 y/o proteína E7 de un HPV en el que a dicho fragmento de polipéptido antigénico se le ha privado, como mínimo parcialmente, de la capacidad de unión a una proteína pRb y/o P53. El gen (pRb) retinoblastoma y el gen p58 codifican productos génicos supresores de tumores que controlan la proliferación celular. La pérdida de actividad de ambos genes causa un crecimiento celular incontrolado. E7 es una fosfoproteína de serina citoplásmica, y se ha mostrado como un transactivador transcripcional y una proteína transformadora. E7 se une a la proteína Rb y, a continuación, presumiblemente se desplaza al núcleo. E6 se une a una proteína celular denominada E6-Ap. Este complejo, entonces, se une a p53. E6-Ap es una ubiquitina ligasa. Los enzimas celulares la cargan con moléculas de ubiquitina activadas, que se transfieren a p53. La carga de ubiquitina de p53 la señala como diana para la degradación por proteolisis mediada por proteasoma. La entrada forzada en la fase S junto con la inestabilidad genómica, que resulta de la degradación de p53, puede conducir a la malignidad. Las proteínas E6/7 de cepas del HPV de "bajo riesgo" no parece que se asocien con Rb y p53. La expresión de construcciones E6/7 antisentido reduce el crecimiento celular, indicando que E6/7 pueden no sólo participar en la iniciación, sino también mantener el fenotipo proliferativo y maligno. Para superar el riesgo de que una célula infectada por un virus que expresa E6 y E7 sobreviva para volverse tumorigénica (inmortalizada), un riesgo asociado con otros sistemas de vector (es decir, virus de vacuna) utilizados en la técnica anterior, la presente invención proporciona un virus recombinante que expresa los oncogenes E6 y E7 desprovisto de la capacidad de suprimir los productos génicos retinoblastoma (pRb) y p53. De este modo, las células infectadas con el virus se mantienen en un estado no tumorigénico (u oncogénico). Se conocen métodos para reducir la interacción ADN-proteína y proteína-proteína. Éstos incluyen la ingeniería de proteínas, aunque no se limitan a ella. En la presente invención, ingeniería de proteínas se refiere a cualquier técnica bioquímica mediante la cual se producen moléculas de proteínas nuevas. Entre estas técnicas se puede incluir la síntesis de novo de proteínas mediante el ensamblaje de unidades funcionales de diferentes proteínas naturales y a través de la introducción de pequeños cambios, tales como inserciones, supresiones y sustituciones en la secuencia del nucleótido o de la proteína. Una "supresión" se define como un cambio en una secuencia de nucleótido o bien de proteína en la cual uno o más nucleótidos o amino cambia dichas inserciones, supresiones y sustituciones en la secuencia del nucleótido o de proteína. Una "supresión" se define como un cambio en una secuencia de un nucleótido o bien de una proteína en la cual uno o más nucleótidos o residuos de aminoácidos, respectivamente, están ausentes. Una "inserción" o "adición" es aquel cambio en la secuencia de nucleótidos o de proteína que ha dado como resultado la adición de uno o más nucleótidos o residuos de aminoácidos, respectivamente, si se compara con el polipéptido o polipéptidos de origen natural. Una "sustitución" es el resultado del reemplazo de uno o más nucleótidos o aminoácidos por diferentes nucleótidos o aminoácidos, respectivamente.

La presente invención, además, da a conocer un sistema de vector de SFV que comprende un elemento potenciador de la traducción. Para superar la expresión más baja o mejorar la expresión en proteínas heterólogas con respecto a la obtenida por las proteínas virales estructurales durante una infección por SFV de tipo salvaje, la presente invención da a conocer un sistema de vector de SFV que comprende un elemento potenciador de la traducción, en el que dicho elemento potenciador de la traducción comprende, preferentemente, un segmento de gen de cápside viral, más preferentemente, de un alfavirus (por ejemplo, el virus del Bosque de Semliki (SFV)). En la presente invención, un elemento potenciador de la traducción se define como un segmento de secuencia funcional, por ejemplo, de un procariota, eucariota, origen viral, etc. que puede aumentar la utilización de promotores, y puede funcionar en cualquier orientación y localización (es decir, hacia arriba (hacia el extremo 5') o hacia abajo (hacia el extremo 3') en relación al promotor. Evidentemente, también se da a conocer la utilización de elementos potenciadores, en general, que pueden aumentar la síntesis de proteínas heterólogas de un sistema de vector de alfavirus. Es probable que el efecto de tales potenciadores esté mediado por la secuencia de ARNm que actúa en cis durante la iniciación de la traducción de la proteína. Además, la localización original del iniciador AUG es importante para dicho efecto
potenciador.

En una realización, la presente invención también da a conocer un sistema de vector de SFV en el que las proteínas de cápside y espícula del SFV se expresan, como mínimo, a partir de una molécula de ácido nucleico. Las proteínas de la cápside y de la espícula del SFV son proteínas estructurales virales. El sistema basado en el Virus del Bosque de Semliki tiene una bioseguridad aumentada sobre los sistemas de base viral utilizados actualmente. Mediante la escisión de la región de la cápside que contiene un potenciador de la traducción y la región de proteína de la espícula en dos moléculas independientes de ARN y mediante la cotransfección de una célula con dichas dos moléculas independientes de ARN y el replicón del vector de SFV, la recombinación del ARN es despreciable y, de este modo, la producción de virus de replicación eficaz. Además, mediante la supresión de la actividad autoproteasa de la proteína de la cápside el aumento la seguridad del sistema significa que también se evita la producción de virus de replicación eficaz. En otra realización, la presente invención también da a conocer un sistema de vector de SFV en el que las proteínas de la cápside y de la espícula del SFV se expresan a partir de, como mínimo, dos moléculas independientes de ácido nucleico. Dichos sistemas de vectores a los que se ha hecho referencia anteriormente, se denominan comúnmente sistema auxiliar-2 y 2-auxiliar o sistema auxiliar de escisión.

La presente invención, además, da a conocer un sistema de expresión del virus del Bosque de Semliki (SFV). El SFV pertenece al género Alfavirus de la familia de los Togaviridae. Se ha clonado una copia de ADNc de longitud completa del genoma viral del SFV en un plásmido bacteriano que incluye una ARN polimerasa dependiente de ADN de origen procariota, de modo que el ARN viral se puede transcribir in vitro. Estos transcritos de ARN son completamente infecciosos (es decir, la introducción dentro de las células es suficiente para iniciar la replicación y el ciclo de infección completo, que da como resultado la formación del virus). El sistema de expresión del virus del Bosque de Semliki (SFV) permite la expresión eficaz de secuencias codificadoras foráneas como parte del replicón del ARN del SFV. El sistema viral del SFV es especialmente adecuado para introducir de forma segura respuestas inmunes celulares contra oncoproteínas, tales como E6 y E7 de HPV 16/18. En primer lugar, el SFV es un virus de ARN que replica en el citosol de la célula, de modo que no hay riesgo de la integración de los genes E6 y E7 en el genoma celular. Además, la infección por SFV es citolítica por apoptosis, de modo que no es probable que la información genética de E6 y E7 persista más de una semana después de la inyección. Además, aparte de pequeñas cantidades de replicasa viral, no se produce ninguna otra proteína del vector. Las respuestas inmunes contra el propio vector de SFV no inhiben las respuestas a los estímulos por inmunizaciones posteriores con el mismo vector, problema que se asocia con otros sistemas de vectores virales. Además, tal como se explicará con más profundidad en la descripción detallada de la presente invención, se ha clonado una copia de ADNc de longitud completa del genoma viral del SFV en un plásmido bacteriano que incluye una ARN polimerasa dependiente de ADN de origen procariota, de modo que el ARN viral se puede transcribir in vitro. Estos transcritos de ARN son completamente infecciosos (es decir, la introducción dentro de las células es suficiente para iniciar la replicación y el ciclo de infección completo, que da como resultado la formación del virus). El sistema de expresión del virus del Bosque de Semliki (SFV) permite la expresión eficaz de secuencias codificadoras foráneas como parte del replicón del ARN del SFV.

La presente invención también da a conocer un sistema de vector de SFV en el que dicho HPV comprende HPV16 y/o HPV18. Más preferentemente, el sistema de vector de alfavirus comprende un sistema de vector basado en el papilomavirus Humano (HPV), e incluso más preferente, un sistema de vector de HPV basado en los tipos 16 y 18 del HPV que están asociados más estrechamente con el desarrollo del carcinoma cervical. Se incluyen las variantes virales de todos los sistemas de vectores virales preferentes de la presente invención.

La presente invención también da a conocer un sistema de vector de SFV según la presente invención, en el que dicho ácido nucleico también codifica un gen de citoquina o un fragmento funcional del mismo. Las citoquinas están implicadas, principalmente, en la señalización entre células del sistema inmune. En la presente invención se da a conocer la utilización del Factor Estimulador de Colonias de Macrófagos y Granulocitos (GM-CSF) y/o de Interleuquina 12 (IL-12), sin embargo, se podrían considerar, además, IL-2, IL-6, IL-18, y también otras. En la presente invención también se da a conocer la utilización de partículas de vector separadas, por ejemplo, partículas de SFV que codifican citoquinas y partículas de SFV que codifican eE6,7. Las partículas no necesariamente actúan al mismo tiempo/lugar, haciendo las partículas separadas las preparaciones se pueden administrar separadamente (en tiempo/vía/dosis). En la presente invención, la definición "fragmento funcional" significa un fragmento (es decir, una secuencia de referencia) que se obtiene a partir de la secuencia del individuo (por ejemplo, un gen de citoquina) el cual puede variar de la secuencia del individuo en una o más sustituciones, supresiones o adiciones, el efecto neto de lo cual no da como resultado una desigualdad funcional entre la secuencia de referencia y la del individuo.

La presente invención también da a conocer una célula que comprende uno o varios sistemas de vector de SFV, según la presente invención. Se conocen métodos para infectar una célula diana con un virus recombinante de la presente invención. La presente invención da a conocer, además, la utilización de uno o varios sistemas de vector de SFV, según la presente invención y/o una célula infectada con uno o varios sistemas de vector de SFV, según la presente invención, para la preparación de un medicamento. Una realización preferente es un medicamento que es un producto farmacéutico. En la presente invención también se dan a conocer composiciones para la preparación de un medicamento, y métodos para liberar dicho medicamento, que comprende un alfavirus recombinante y/o una célula que comprende dicho SFV recombinante, tema de la presente invención. La presente invención también da a conocer la utilización de uno o varios sistemas de vector de SFV, según la presente invención, y/o una célula infectada con uno o varios sistemas de vector de SFV, según la presente invención, para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer cervical.

La presente invención también da a conocer la utilización de uno o varios sistemas de vector de SFV, según la presente invención, y/o una o varias células infectadas con uno o varios sistemas de vector de SFV, según la presente invención, para la preparación de un medicamento, en la que dicho medicamento es una vacuna. En la técnica se conocen bien composiciones de vacuna y métodos para la administración de una vacuna a un paciente. En una realización preferente, la presente invención da a conocer un método bioseguro para la vacunación contra el cáncer cervical, que comprende el suministro de un sistema de vector de SFV con una variedad de huéspedes amplia, que comprende un ácido nucleico que codifica antígenos tumorales desprovistos de la capacidad de unión a los productos supresores de tumores celulares, pRB y P53, y que es capaz de inducir una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos para HPV contra las células tumorales transformadas por HPV que expresan antígenos tumorales. Los CTLs pueden destruir células que expresan antígenos foráneos a través del reconocimiento de péptidos foráneos generados dentro de la célula y transportados a la superficie celular y presentados por antígenos del complejo de histocompatibilidad (MHC)
de clase I. Por este motivo, se trata de agentes poderosos potencialmente para la destrucción de células tumorales.

La presente invención también da a conocer la utilización de uno o varios sistemas de vector de SFV, según la presente invención, y/o una o varias células infectadas con uno o varios sistemas de vector de SFV, según la presente invención, para la preparación de un medicamento, en la que dicho medicamento es una vacuna para el tratamiento del cáncer cervical. Los mencionados Virus del Bosque de Semliki recombinantes comprenden, como mínimo, un ácido nucleico que se obtiene de los oncogenes virales E6 del HPV y/o E7 del HPV, que se obtienen del HPV de tipo 16 y/o 18, a efectos de inmunizar el cuerpo, preferentemente, contra HPV de tipo 16 y/o 18 para el tratamiento y prevención del cáncer cervical.

La presente invención también da a conocer un método para el tratamiento o prevención del cáncer cervical, que comprende la administración a un individuo de un medicamento que comprende uno o varios sistemas de vector de SFV, según la presente invención, y/o una o varias células infectadas con uno o varios sistemas de vector de SFV, según la presente invención, para la preparación de un medicamento, en la que dicho medicamento es una vacuna para el tratamiento del cáncer cervical.

Descripción detallada Inmunización genética contra el carcinoma cervical

A partir de estudios moleculares, clínicos y epidemiológicos es evidente que los virus del papiloma humano HPV16 y HPV18 de alto riesgo están relacionados con el desarrollo de lesiones precursoras del cáncer cervical y del carcinoma cervical invasivo. El genoma del HPV codifica 7 proteínas tempranas (E) reguladoras no estructurales, y dos proteínas tardías (L) estructurales. La integración del ADN viral en el genoma de la célula huésped, que se considera una etapa fundamental en el desarrollo del carcinoma cervical inducido por el HPV16 o HPV18, da como resultado una pérdida del control transcripcional mediado por E1 o E2. Como consecuencia, las células transformadas sobreexpresan las proteínas E6 y E7, iniciando el proceso de transformación maligno.

Se cree que la inmunidad mediada por células específicas juega un papel esencial en el control de las infecciones por HPV y del carcinoma cervical. Esta suposición se basa en observaciones que muestran (i) que las lesiones inducidas por el HPV revierten espontáneamente en la mayor parte de los individuos, y (ii) que los pacientes inmunodeficientes desarrollan significativamente más lesiones proliferativas relacionadas con el HPV en la piel y el tejido anogenital que los individuos inmunocompetentes. En diversos modelos animales se ha demostrado que las proteínas E6 y E7 del HPV, que se expresan constitutivamente en células transformadas por el HPV, pueden actuar como dianas para la muerte de células tumorales mediada por CTL y la estimulación de la actividad CTL específica de tumor.

La inducción de una respuesta CTL específica de antígeno requiere un procesamiento intracelular del antígeno diana y la presentación de péptidos antigénicos por las moléculas MHC de clase I. Esto se puede conseguir de forma eficaz con vectores virales recombinantes. Heino P. y otros: "Las proteínas de la cápside del papilomavirus humano de tipo 16 producidas a partir de virus del Bosque de Semliki recombinante se ensamblan en partículas similares a virus" ("Human papillomavirus type 16 capsid proteins produced from recombinant Semliki Forest virus assemble into virus-like particles") describen un método para la producción de partículas similares a virus HPV16 (VLP's). Estas VLPs comprenden las dos proteínas estructurales del HPV16, L1 y L2. Tras la expresión de L1 y L2 en cultivos celulares productores, las células generan VLPs. En este artículo, el sistema de vector de virus del Bosque de Semliki (SFV) se utiliza para expresar L1 y L2 en un cultivo celular productor con el propósito de generar VLPs de HPV16. El artículo no se refiere al desarrollo de un vector de alfavirus para la inmunización genética contra el carcinoma cervical. De acuerdo con ello, no se refiere a la expresión de los antígenos tumorales E6 y E7 del HPV16. El artículo sólo se refiere, indirectamente, a que las VLPs de HPV16 que comprenden L1 y L2 podrían utilizarse como vacuna para la inducción de una respuesta de anticuerpos contra el virus HPV16. Sin embargo, dicha respuesta no se dirigiría contra tumores inducidos por el HPV16, ya que dichos tumores sólo expresan los antígenos tumorales E6 y E7 del virus.

Boursnell M.E.G. y otros: "Construcción y caracterización de un virus de vacuna recombinante que expresa proteínas del papilomavirus humano para inmunoterapia del cáncer cervical" ("Construction and characterisation of a recombinant vaccinia virus expressing human papillomavirus proteins for immunotherapy of cervical cancer") da a conocer la construcción y caracterización de un vector de virus de vacuna recombinante (TA-HPV) que expresa los antígenos tumorales E6 y E7 del HPV16 o HPV18. Se demuestra que el virus recombinante, tras la administración intraperitoneal en ratones, tiene la capacidad de provocar una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) contra células infectadas con el mismo vector de virus o sensibilizadas con un epítopo de péptido E7 sintético. El vector de SFV que se da a conocer en la presente invención presenta diversas e importantes ventajas con respecto al vector TA-HPV. En primer lugar, el vector de SFV es incompetente para la replicación, mientras que el vector de virus de vacuna, que se basa en poxvirus vivo atenuado, es competente para la replicación. La competencia para la replicación representa un principal problema de seguridad, debido a que los vectores TA-HPV tienen secuencias potencialmente oncogénicas que provienen de HPV16 o HPV18.

En segundo lugar, el virus de vacuna es un virus de ADN, mientras que los Virus del Bosque de Semliki (SFV) son virus de ARN, los cuales replican y traducen su ARN en el citosol de las células sin implicación de ningún procesado nuclear. Por lo tanto, los genes codificados por un vector de SFV no pueden acabar integrados en el genoma de la célula, mientras que en el caso de vectores de virus de ADN nunca se puede descartar esta posibilidad. El procesamiento del ARN citosólico exclusivo del genoma de los vectores de SFV representa un aspecto de seguridad importante en estos sistemas.

En tercer lugar, el vector de SFV que se da a conocer en la presente invención contiene un potenciador de la traducción frente a la secuencia antigénica que se obtiene del HPV. Este potenciador de la traducción asegura niveles elevados de expresión de antígenos en las células diana. De este modo, el vector de SFV que se da a conocer es considerablemente más eficaz que el vector TA-HPV, induciendo niveles más elevados de actividad CTL con dosis más pequeñas de virus.

La patente EP 0 711 829 A se refiere a una subcategoría específica de vectores de alfavirus, es decir, vectores de virus Sindbis. La invención de los presentes inventores da a conocer otro vector de alfavirus (que se obtiene del virus del Bosque de Semliki), que codifica una secuencia antigénica de un HPV. Mientras se indica que las secuencias antigénicas foráneas se pueden incluir en el vector obtenido de Sindbis (se mencionan muchas posibilidades, incluyendo secuencias que se obtienen de un HPV), ninguno de los ejemplos implica la expresión de secuencias antigénicas de E6 y/o E7 obtenidas de HPV, pero se refieren a la expresión de secuencias antisentido respecto a E6 y/o E7 en lugar de un enfoque completamente diferente dirigido a la inhibición de la expresión de E6 y/o E7 más que a la estimulación de una respuesta inmune contra E6 y/o E7, y sin mencionar la inducción de una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) mediante el vector derivado de Sindbis, tal como se da a conocer en la presente invención. Además, el vector obtenido de Sindbis no comprende una secuencia potenciadora de traducción.

La patente WO 99 28487 A (Corona a la derecha de la reina "Crown in the right of the Queen"; Khromykh; Varnavs).

"Expresión de flavivirus y sistemas de liberación" ("Flavivirus expression and delivery systems") da a conocer un sistema de expresión de flavivirus. No implica vectores de expresión de alfavirus. Los flavivirus comprenden una familia diferente de virus de ARN de cadena positiva, es decir, los Flaviridae. Los alfavirus pertenecen a la familia de los Togaviridae.

Borysiewicz L.K. y otros: "Un virus de vacuna recombinante que codifica las proteínas E6 y E7 de los tipos 16 y 18 del papilomavirus humano como inmunoterapia para el cáncer cervical" ("A recombinant vaccinia virus encoding human papillomavirus types 16 and 18, E6 and E7 proteins as immunotherapy for cervical cancer") da a conocer los resultados de un primer ensayo clínico humano con un vector de virus de vacuna recombinante vivo que expresa las proteínas E6 y E7 de HPV16 y HPV18 (TA-HPV). En Boursnell y otros se describe la construcción y caracterización del vector TA-HPV. Berglund P. y otros: "La inmunización con virus del Bosque de Semliki recombinante induce protección contra el ataque con influenza en ratones" ("Immunization with recombinant Semliki Forest virus induces protection against influenza challenge in mice") describen un estudio de inmunización en ratones, utilizando el sistema de vector de SFV recombinante que codifica la nucleoproteína del virus de influenza o LacZ de E. coli. No se refiere a SFV que codifica antígenos obtenidos de HPV.

En el presente estudio, el enfoque de los presentes inventores es la utilización del sistema de expresión del virus del Bosque de Semliki (SFV). SFV pertenece al género Alfavirus de la familia de los Togaviridiae.^{13} Los alfavirus comprenden una nucleocápside con una copia de una molécula de ARN de cadena simple rodeada por una envoltura que contiene proteínas de espícula. El ARN de los alfavirus tiene una polaridad positiva que permite al ARN genómico iniciar una infección cuando se introduce dentro del citoplasma de una célula. Además, el ARN es autorreplicante, ya que codifica su propia replicasa, y la replicación da como resultado un nivel elevado de expresión de las proteínas virales en las células del huésped. Se ha clonado una copia de ADNc de longitud completa del genoma viral en un plásmido bacteriano que incluye una ARN polimerasa dependiente de ADN de origen procariota, de modo que el ARN viral se puede transcribir in vitro. Estos transcritos de ARN son completamente infecciosos, es decir, la introducción dentro de las células es suficiente para iniciar la replicación y un ciclo de infección completo, que da como resultado la formación del virus^{14}. Liljeström y sus colaboradores^{14-16} desarrollaron un sistema de vector que permite la expresión eficaz de secuencias codificadoras foráneas como parte del replicón del ARN del SFV. Se obtiene un nivel de bioseguridad elevado mediante la separación de la replicasa y los genes estructurales del genoma viral. De este modo, se pueden producir partículas virales recombinantes que infectan las células sólo una vez. Además, el SFV auxiliar (que contiene los genes estructurales) se mutó en el gen que codifica una de las proteínas de la espícula.^{15} Efectivamente, dichas partículas de virus no pueden infectar células a menos que se activen con proteasa exógena.

Descripción detallada Ejemplo 1

En la presente invención se describe la construcción de SFV recombinante que codifica E6 y E7 de HPV16 y la respuesta inmune celular en ratones inducida por estas partículas SFV-E6E7 recombinantes. La infección de las células epiteliales de los genitales con papilomavirus humano (HPV) de tipo 16 y 18 se asocia estrechamente con el desarrollo del carcinoma cervical. El potencial transformador de estos HPVs de alto riesgo depende de la expresión de los productos génicos virales tempranos E6 y E7. Dado que la expresión de E6 y E7 se mantiene selectivamente en lesiones cervicales premalignas y malignas, estas proteínas son candidatos atractivos para las estrategias inmunoterapéuticas y profilácticas. En la presente invención se describen la constitución, caracterización y el potencial inmunoterapéutico in vivo de virus del Bosque de Semliki (SFV) recombinante que expresa las proteínas E6 y E7 de HPV16 (SFV-E6E7). Los análisis de transferencia Western y de tinción para inmunofluorescencia demostraron la expresión de E6 y E7 en células BHK infectadas con SFV-E6E7. La inmunización de ratones con SFV-E6E7 dio como resultado una sensibilización eficaz in vivo de la actividad CTL específica para HPV. Los CTLs inducidos lisaron las células tumorales murinas transformadas con el genoma del HPV16 y las células EL4 cargadas con un péptido E7 del HPV de unión a un inmunodominante de clase I. Los CTLs podrían inducirse reproduciblemente por inmunización con tres inyecciones de tan solo 10^{5} unidades infecciosas de SFV-E6E7. Se estudió la protección frente la inducción de tumores mediante la línea de células tumorales TC-1. La inmunización con 5x10^{6} partículas SFV-E6E7 proporcionó al ratón un 40% de protección frente a la inducción tumoral. Estos resultados indican que la expresión de E6E7 mediante el sistema de SFV recombinante, eficaz y seguro, representa una estrategia prometedora para la inmunoterapia o inmunoprofilaxis del carcinoma cervical.

Resultados Producción y determinación del título de partículas de SFV

Se produjeron partículas de SFV recombinantes en células BHK por electroporación de ARN recombinante y de Auxiliar 2 dentro de estas células. Después de 24 horas el medio que contenía el virus se eliminó de las células y las partículas de virus se purificaron. Los títulos se determinaron por inmunofluorescencia, utilizando un anticuerpo contra SFV-nsP3 (replicasa). Este anticuerpo se escogió porque la replicasa está presente en todas las células infectadas con SFV recombinante. De este modo, se pueden determinar los títulos de diferentes SFVs recombinantes, independientemente del gen o genes foráneos insertados. Típicamente, los títulos de virus impurificado fueron de 10^{9}-10^{10} unidades infecciosas/ml. Después de la purificación, los títulos estuvieron entre 10^{10}-10^{11} unidades infecciosas/ml.

Análisis por transferencia Western de la expresión de E6 y E7

A efectos de verificar que SFV-E6E7 inducía la expresión de las proteínas recombinantes E6 y E7, se infectaron células BHK con SFV-E6E7 o SFV-LacZ que sirvió de control negativo. En la Figura 1, se muestran las transferencias Western de lisados celulares explorados con anti-E6 de HPV16 (panel A) o anti-E7 de HPV16 (panel B). La tinción con el anticuerpo policlonal anti-E6 reveló una banda con una M_{r} de 17 kDa, aproximadamente. La tinción con anticuerpo monoclonal anti-E7 reveló una banda con un movilidad electroforética aparente de 20 kDa, aproximadamente. Esta M_{r} no corresponde a la M_{r} calculada (11 kDa), pero está de acuerdo con otros estudios en los cuales E7 se produjo por sistemas de expresión eucariotas, así como procariotas.^{17-20}

Expresión de E6 y E7 del HPV16 en células infectadas con SFV-E6E7

La expresión de E6 y E7 también se analizó mediante un análisis de inmunofluorescencia indirecta de células BHK infectadas con SFV-E6E7. Se escogió una proporción de partícula respecto a célula baja, de modo no todas las células en los pocillos quedarían infectadas, a efectos de visualizar células positivas y negativas dentro del campo del microscopio. Tal como se muestra en la Figura 2, se encontró una fuerte fluorescencia tanto de E6 como de E7 en las células infectadas. En general, se encontró una tinción brillante de E6 en el perinúcleo y el citoplasma, mientras que E7 se encontró, principalmente, en el perinúcleo. Estudios previos demostraron la localización de la proteína E6 del HPV18 en la matriz nuclear y en membranas no nucleares^{21,22} y de E7 del HPV16 en el núcleo.^{18} Sin embargo, es muy probable que las diferencias en el patrón d=e tinción se puedan ver influenciadas por las cantidades de proteínas producidas y el vector utilizado para la expresión de las proteínas.^{18}

CTLs específicos para HPV inducidos por inmunización de ratones con SFV-E6E7

Los ratones se inmunizaron s.c. y se reinmunizaron dos veces (s.c e i.p.) con 10^{6} partículas purificadas de SFV-E6E7, SFV-LacZ o tampón, como control. La actividad CTL se determinó una semana más tarde de la última inmunización de refuerzo. Después de 11 y 18 días de reestimulación in vitro se ensayó la actividad citolítica, frente las células diana 13-2, de las células efectoras resultantes. Tal como se muestra en la Figura 3, se indujo una fuerte actividad CTL tras la administración con partículas SFV-E6E7 (Figuras 3A y 3B, cuadrados y rombos), mientras que no se indujo actividad CTL específica para HPV tras la inmunización con partículas SFV-LacZ o PBS (Figuras 3, triángulos y cruces, respectivamente). El nivel promedio de citólisis en el día 11 (Figura 3A) aumentó ligeramente tras la reestimulación in vitro prolongada, es decir, 18 días de cultivo (Figura 3B).

Dado que las células 13-2 sólo expresan el epítopo de CTL de unión a MHC de clase I H-2D^{b}, del péptido 49-57 (RAHYNIVTF)^{9} de E7 del HPV16, los clones de CTL dirigidos contra otros epítopos sobre E6 y E7 no se detectan. Los presentes inventores también ensayaron la actividad CTL contra células C3 como células diana, es decir, células que expresan el genoma del HPV16 completo. Los CTLs presentes después de 11 días de reestimulación utilizando células C3 como células estimuladoras, lisaron las células 13-2 (Figura 4A) y las células C3 (Figura 4B) en la misma extensión. Este resultado sugiere que el péptido 49-57 de E7 del HPV16 es uno de los epítopos de CTL dominantes reconocido por los CTLs, generado en ratones C57BL/6 (H-2^{b}) tras la inmunización con E6 y E7.

Este indicio está respaldado por la observación de que las células diana cargadas con el péptido 49-57 de E7 del HPV16 se reconocieron y lisaron en un nivel muy alto. La Figura 5A muestra la actividad CTL, inducida en dos ratones inmunizados con 10^{6} partículas SFV-E6E7, contra células EL4 cargadas con el péptido 49-57 de E7 como dianas. Por otra parte, los ratones inmunizados con partículas SFV-LacZ o PBS no reconocieron las células EL4 cargadas con péptido (Figura 5A, triángulos y cruces, respectivamente). Además, las células EL4 no cargadas no se reconocieron ni lisaron por estos CTLs (Figura 5B).

Para determinar la dosis eficaz mínima de partículas SFV-E6E7, los ratones se inmunizaron y reinmunizaron dos veces con 10^{4}, 10^{5} ó 10^{6} partículas por inmunización. En las Figuras 6A y 6B, se muestran los resultados de dos experimentos separados, cada uno incluyendo dos ratones por dosis de inyección. En ambos experimentos, la inmunización con 10^{6} partículas SFV-E6E7 (cuadrados) pero también con tan solo 10^{5} partículas (rombos), todos los ratones desarrollaron una respuesta CTL específica para HPV. La inmunización con 10^{4} partículas (Figura 6, triángulos rellenos), dio como resultado una respuesta baja pero detectable en dos sobre 4 ratones.

Respuestas antitumorales inducidas por la inmunización de ratones con partículas SFV-E6E7

Para examinar si las partículas de SFV recombinantes podrían generar inmunidad protectora contra una inducción tumoral posterior, se inmunizaron ratones y se reinmunizaron con partículas SFV-E6E7 y se indujeron s.c. con células TC-1, células tumorales que expresan E6 y E7 del HPV16. Los estudios de inoculación de tumores llevados a cabo antes de la iniciación de estos estudios de inmunización revelaron que la inoculación s.c. de 2x10^{4} células TC-1 indujo reproduciblemente tumores dentro de las 2 a 4 semanas después de la inoculación en todos los ratones analizados (n=15). Las Figuras 7 y 8 muestran los resultados combinados de dos estudios de inmunización separados. Los ratones de control, a los que se inyectaron PBS (n=10) o partículas SFV.LacZ (n=10), desarrollaron tumores palpables dentro de las 2 a 4 semanas después de la inoculación de células tumorales (Figura 7, paneles A y B, respectivamente; Figura 8, círculos abiertos y cuadrados abiertos, respectivamente). La inmunización con 10^{6} partículas SFV-E6E7 (n=10) dio como resultado un retraso en la aparición de tumores en el 50% de los ratones, comparado con los ratones de control, con uno sobre diez ratones que no desarrolló un tumor (Figura 7, panel C; Figura 8, rombos). Tras la inmunización con una dosis de partículas SFV-E6E7 5 veces más elevada dos sobre cinco ratones no desarrollaron un tumor (Figura 7, panel D; Figura 8, cuadrados cerrados).

Este ejemplo describe la construcción, caracterización y potencial inmunoterapéutico celular de partículas de SFV recombinantes que codifican las proteínas tempranas E6 y E7 del HPV16. El último objetivo del estudio de los presentes inventores es desarrollar una estrategia de inmunización eficaz para el tratamiento y/o prevención del carcinoma cervical inducido por HPV.

La inmunización de ratones con partículas de SFV que codifican E6 y E7 del HPV16 dio como resultado una respuesta CTL específica para HPV. Tres inyecciones de tan solo 10^{4} partículas de SFV fueron suficientes para la inducción de una respuesta CTL en el 50% de los ratones, mientras que tres inmunizaciones con 10^{5} partículas de SFV indujeron una respuesta CTL específica para HPV en todos los ratones analizados. El aumento de la dosis a 10^{6} partículas de SFV por inyección dio como resultado una respuesta CTL reproducible con un nivel elevado de lisis específica de células tumorales. Los experimentos de bloqueo in vitro con anticuerpos contra CD4 y CD8 revelaron que la actividad lítica era debida a células T CD8^{+}, no se encontró inhibición con anticuerpos anti-CD4 (no mostrados). Los experimentos de inducción tumoral demostraron que la inmunización con 10^{6} partículas SFV-E6E7 dio como resultado un retraso en la aparición de tumores mientras que uno sobre diez ratones no desarrolló un tumor. Tras la inmunización con una dosis 5 veces más alta de partículas SFV-E6E7, un 40% de los ratones no desarrollaron un tumor.

En los últimos años se han descrito varias estrategias de inmunización basada en péptidos/proteínas o inmunización genética para la inducción de actividad CTL específica para HPV.^{10-12} Las principales desventajas asociadas con un enfoque basado en péptidos incluyen el problema del polimorfismo MHC y el riesgo de inducción de tolerancia de células T más que de activación de células T. Debido a la inducción de tolerancia de células T específica, la vacunación con un péptido específico de tumor se ha demostrado que da como resultado una extensión aumentada del tumor.^{23} La inmunización con proteínas más grandes superaría estos problemas, pero requiere sistemas eficaces de liberación de antígenos y/o adyuvantes seguros para la sensibilización eficaz de la respuesta inmune. Varios grupos han descrito la inducción de respuestas CTL específicas para HPV en ratones tras la inmunización con virus de vacuna recombinantes que expresan E6 o E7 del HPV^{24,25} o con células singeneicas transfectadas retroviralmente con el gen E6 del HPV.^{26} En un estudio en fase I/II, que implicó ocho pacientes con un estado terminal de cáncer cervical, la vacunación con virus de vacuna recombinante que expresaba E6 y E7 del HPV18 indujo CTLs específicos para HPV en uno de los tres pacientes evaluables.^{27} Los inconvenientes potenciales asociados con la utilización de sistemas de vectores virales son las respuestas inmunes contra las proteínas virales en pacientes preinmunes (virus de vacuna) o la integración de genes recombinantes dentro del genoma celular del huésped (retrovirus). Especialmente, cuando el virus recombinante codifica oncoproteínas, tales como E6 o E7 del HPV, el riesgo de integración dentro el genoma de la célula huésped es un punto de principal preocupación.

Los presentes inventores han escogido el sistema de expresión del SFV, el cual, aparte de su eficacia de transfección y elevada bioseguridad, parecería ser especialmente adecuado para inducir de forma segura respuestas celulares inmunes contra oncoproteínas, tales como E6 y E7 del HPV16. En primer lugar, el SFV es un virus de ARN que replica en el citosol celular; por lo tanto, no hay riesgo de integración de los genes E6 y E7 en el genoma celular. Además, la infección por SFV es citolítica por apoptosis.^{13,28} Por lo tanto, no persistirá ninguna información genética de E6 y E7 durante más de una semana después de la infección. Además, no se produce ninguna otra proteína del vector, aparte de pequeñas cantidades de replicasa viral. Berglund y otros demostraron que las respuestas inmunes contra el propio vector no inhibían respuestas de refuerzo por inmunizaciones posteriores con el mismo vector.^{29}

El reconocimiento por el sistema inmune de las células infectadas por virus o células tumorales tiene lugar a través de péptidos antigénicos específicos de virus o de tumor presentados en el contexto de las moléculas MHC de clase I. La infección de células con partículas de SFV recombinantes da como resultado la producción de la proteína recombinante dentro del citoplasma, permitiendo la presentación de la proteína recombinante a través de la vía convencional de presentación de MHC de clase I. Sin embargo, para la inducción de CTLs específicos de tumor o de virus, la presentación de antígeno tiene que ir acompañada de señalización coestimuladora. Las moléculas coestimuladoras se limitan a las células presentadoras de antígeno profesionales (APCs). Por lo tanto, la respuesta CTL inducida tras la inmunización con partículas SFV-E6E7 puede tener lugar mediante la transfección de APCs in vivo. Alternativamente, las APCs recogerán residuos de otras células que se han transfectado en un proceso de sensibilización cruzada. La recogida de material de las células infectadas por parte de las APCs se espera que sea muy eficaz, dado que una infección por SFV induce muerte celular apoptótica.^{13,28} Después de la recogida de material de células infectadas (antígeno exógeno) la proteína recombinante se procesará y se presentará por las moléculas MHC de clase II activando de este modo células T auxiliares CD4+. Además, las células dendríticas y los macrófagos son capaces de presentar antígenos exógenos en el contexto de moléculas MHC de clase I para la presentación a células T CD8+ y la activación de las mismas.^{30} De este modo, ambos brazos del sistema inmune celular, esenciales para la inducción de una respuesta inmune óptima, se activarán tras la administración de partículas de SFV recombinantes, provocando, de este modo, una respuesta CTL fuerte. Además, la inmunización con SFV introducirá tanto epítopos antigénicos de clase I como de clase II en uno y en el mismo que APC, lo cual se ha demostrado recientemente que se requiere para una activación completa de APCs.^{31-34} Tal como han demostrado Zhou y otros^{35}, la inmunización de ratones con partículas de SFV que codifican la nucleoproteína del virus influenza, no sólo induce la actividad CTL específica para influenza, sino también una respuesta de anticuerpos específica de nucleoproteínas. Esta observación apoya la hipótesis de sensibilización cruzada y presentación indirecta de péptidos antigénicos.

En conclusión, los presentes inventores han demostrado que la inmunización de ratones con partículas SFV-E6E7 recombinantes induce una respuesta CTL fuerte contra células tumorales transformadas por HPV. Este prometedor resultado, combinado con estudios que muestran la elevada eficacia del sistema del SFV para la sensibilización tanto del sistema inmune de ratones como del de primates,^{29,35,36} y el reciente desarrollo del extremadamente seguro sistema de dos auxiliares^{37} proporcionan los pasos esenciales hacia el diseño de una estrategia de inmunización eficaz para el tratamiento y profilaxis de carcinoma cervical inducido por HPV.

Materiales y métodos Líneas celulares

Se obtuvieron células de riñón de cría de hámster (BHK-21) de la Colección Americana de Cultivos Tipo (#CCL-10). Las células se hicieron crecer en GMEM (Life Technologies, Paisley, UK) que contenía un 5% de suero de ternero fetal (PAA laboratories, Linz, Austria). Los doctores Dr. C. Melief y Dr. R. Offringa (Leiden University, Países Bajos) suministraron amablemente las células C3, células 13-2 y células TC-1. La línea celular C3 se obtuvo a partir de células embrionarias C57BL/6 (H-2^{b}) transfectadas con un plásmido que contenía el genoma completo del HPV16. La línea celular 13-2 se generó a partir de células embrionarias C57BL/6 (H-2^{b}) transfectadas con la región E1 de adenovirus de tipo 5 en las cuales el epítopo E1A adenoviral SGPSNTPPEI se sustituye por un epítopo CTL de E7 de HPV16, AA49-57 (RAHYNIVTF) (R. Ofringa, comunicación personal). La línea celular TC-1 se generó a partir de células primarias C57B1/6 epiteliales de pulmón con un vector retroviral que expresa E6E7 del HPV16 más un retrovirus que expresa c-Ha-ras^{25} activada. El Dr. L. Leserman (Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy, France) proporcionó amablemente células EL4. Las células C3, 13-2, TC-1 y EL4 se hicieron crecer en IMDM (Life Technologies) complementadas con un 10% de suero de ternero fetal. Ambos medios contenían penicilina y estreptomicina (Life Technologies; 100 U/ml y 100 \mug/ml, respectivamente).

Ratones

Ratones C57B1/6 hembra libres de patógenos específicos (Harlan CPB, Zeist, Países Bajos) tenían entre 6 y 10 semanas de edad en el comienzo de los protocolos de inmunización.

Péptidos

El Dr. J. W. Drijfhout (Academic Hospital Leiden, Países Bajos) sintetizó y purificó el péptido E7 de unión a
H-2D^{b} del HPV16, RAHYNIVTF (residuo 49-57). El péptido se analizó por HPLC en fase inversa y se encontró que tenía una pureza por encima del 90%.

Clonación de E6 y E7 del HPV16 en pSFV3

El Dr. P. Liljeström (Karolinska Institute, Estocolmo, Suecia) suministró amablemente pSFV-Auxiliar 2^{16} y
pSVF3.^{16} Los genes E6 y E7 del HPV16 se obtuvieron a partir del plásmido pRSV-HPV16E6E7,^{38} que suministró amablemente el Dr. J. Ter Schegget (Free University, Amsterdam, Países Bajos). En este plásmido los genes E6 y E7 deL HPV16 están presentes en tándem, con un codón de parada después del gen E6. La amplificación del gen en tándem E6E7 se realizó por PCR mediante los siguientes cebadores, escritos en la dirección 5' a 3': GACGGATCCAAAGA
GAACTCCAAT G (E6 hacia delante) y GAGAATTCGGATCCGCCATGGTAGATTAT (E7 hacia atrás). El producto de PCR se digirió con BamHI y se clonó en el lugar de BamHI de pGEM7Zf+. Después de la confirmación de secuencia, el fragmento E6E7 se clonó en el único lugar BamHI de pSFV3, produciendo pSFV3-E6E7.

Producción y purificación de partículas de SFV recombinantes

pSFV3-LacZ^{15} fue un amable regalo del Dr. P. Liljeström (Karolinska Institute, Estocolmo, Suecia). Los plásmidos pSFV3-E6E7, pSFV3-LacZ y pSFV-Auxiliar 2 se aislaron mediante el kit de purificación de plásmidos Qiagen Midi y se linealizaron por digestión con SpeI (Life Technologies). A partir del ADN linealizado se sintetizó ARN por transcripción in vitro mediante ARN polimerasa SP6 (Amersham Pharmacia Biotech. Inc., Piscataway, NJ, USA). Se obtuvo un análogo de la caperuza de protección del extremo de ARN ("capping") de Life Technologies. Se mezclaron quince \mug de ARN SFV3-E6E7 o SFV3-LacZ y 7,5 \mug de ARN SFV-Auxiliar 2 y se cotransfectaron dentro de 8x10^{6} células BHK en 0,8 ml de GMEM por electroporación mediante el Biorad Gene Pulser^{R}II (dos pulsos de 850 V/25 mF; Biorad, Hercules, CA, USA). Tras los pulsos, las células se suspendieron en 10 ml de GMEM y se cultivaron durante 36 horas a 37ºC y con CO_{2} al 5%. El medio, que contenía las partículas SFV-E6E7 o SFV-LacZ, se centrifugó dos veces en un rotor JA 20 (Beckman, St. Paul, MN, USA) a 1800 rpm (es decir, 40.000xg a r_{max}) para eliminar las células y restos celulares.

Las partículas de SFV se purificaron en un gradiente de densidad discontinuo de sacarosa (2 ml de una solución de sacarosa al 15% (p/v) y 1 ml de una solución de sacarosa al 50% (p/v) en un tampón TNE (Tris-Cl 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4)). El virus se recogió de la interfase. La sacarosa se eliminó de la solución de virus dializando durante la noche contra el tampón TNE. La suspensión de virus se concentró aproximadamente 10 veces (filtro Centricon 30; Millipore, Bedford, MA, USA), se congeló rápidamente en N_{2} y se almacenó en fracciones alícuotas a -80ºC.

Antes de su utilización, las partículas de SFV se incubaron con un volumen 1/20 de \alpha-quimotripsina (10 mg/ml; Sigma Chemical Co., St. Luis, MO, USA) durante 30 min a temperatura ambiente para romper las proteínas de la espícula mutadas. Posteriormente, se inactivó la \alpha-quimotripsina mediante la adición de un volumen 0,5 de aprotinina (2 mg/ml; Sigma Chemical Co.).

Determinación del título de las partículas de SFV

Se titularon partículas de SFV recombinante mediante diluciones en serie sobre monocapas de células BHK. Tras la infección e incubación durante la noche, las células se fijaron durante 10 minutos en acetona al 10% y se tiñeron utilizando un anticuerpo policlonal anti-replicasa (nsP3) de conejo (un amable regalo del Dr. T. Ahola, Biocentre Viiki, Helsinki, Finlandia) como anticuerpo primario e IgG de cabra anti-conejo marcada con FITC como anticuerpo secundario (Southern Biotech. Ass., Birmingham, AL, USA). Se contaron las células positivas y se determinó el título tras la corrección del factor de dilución y la dilución provocada por la activación y el volumen de partículas añadidas.

Análisis de la expresión de E6 Y E7 por transferencia Western

Las células BHK se infectaron con partículas SFV-E6E7 o, como control, con partículas SFV-LacZ. Tras la incubación durante toda la noche, las células se recogieron y lisaron en un tampón de lisis (Tris.Cl 50 mM, EDTA 5 Mm, NaCl 150 mM, Tritón X-100 al 0,5%, pH 7,4). Los extractos libres de células se analizaron por SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a una membrana PVDF (Immobilon-P, Millipore Corp., Bedford, MA, USA) y se detectaron E6 y E7 con un anticuerpo policlonal de conejo anti-E6 de HPV16 (un amable regalo del Dr. I. Jochmus, Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Alemania) y un anticuerpo monoclonal de ratón anti-E7 de HPV16 (Zymed Lab. Inc. South San Francisco, CA, USA), respectivamente. Tras la incubación con anticuerpos secundarios unidos a fosfatasa alcalina, las transferencias se tiñeron con nitroazul de tetrazolio y 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (Sigma Chemical Co.).

Análisis de Inmunofluorescencia Indirecta de E6 y E7 en células infectadas con SFV-E6E7

En una placa de 8 pocillos (Life Technologies) se infectó una monocapa de células BHK con SFV-E6E7. La fijación y tinción de las células se realizó tal como se ha descrito para la inmunofluorescencia con anti-replicasa, excepto por los anticuerpos utilizados. Como anticuerpos primarios, se utilizaron anti-E6 de HPV16 o anti-E7 de HPV16, tal como se ha mencionado anteriormente. Los anticuerpos secundarios fueron IgG anti-conejo e IgG anti-ratón marcadas con FITC, respectivamente (Southern Biotechn. Ass., Birmingham, AL, USA).

Inmunizaciones

Se inmunizaron ratones subcutáneamente (s.c.), intraperitonealmente (i.p.) o intravenosamente (i.v.) y se reinmunizaron dos veces con un intervalo de 2 semanas, con de 10^{4} a 5x10^{6} partículas SFV-E6E7. Como controles negativos, se inyectaron a los ratones dosis iguales de partículas SFV-LacZ o PBS.

Ensayo CTL

De siete a 21 días después de la última inmunización de refuerzo, se aislaron células del bazo y se cocultivaron con células C3 irradiadas (100 Gy) en una proporción de 25:1, en frascos de cultivo de 25 cm^{2}, colocados verticalmente. Después de una y dos semanas en cultivo, las células se recogieron y reestimularon con células de bazo vírgenes ("naive") irradiadas (30 Gy) y se irradiaron células C3 en una proporción de 2:5:0,1 en placas de 24 pocillos en presencia de 4 IU de hIL2/ml recombinante (Strathmann Biotech GMBH, Hamburgo, Alemania). Cinco días después de la primera y/o segunda reestimulaciones, las células se recogieron y se llevó a cabo un ensayo CTL mediante un ensayo estándar de liberación de ^{51}Cr de 4 horas en determinaciones por triplicado. Las células diana se marcaron durante 1 hora con 3,7 MBq de ^{51}Cr/10^{6} células en 100 ml de medio (^{51}Cr provenía de Amersham, Londres, UK). Las células diana EL4 se cargaron con el péptido 49-57 de E7 del HPV16 (RAHYNIVTF) mediante 1 hora de incubación de las células en presencia de 15 mg/ml de péptido en 100 ml de medio de cultivo antes de la marcación de las células con ^{51}Cr. Se calculó el porcentaje promedio de la liberación específica de ^{51}Cr de los pocillos triplicados, según la fórmula: % liberación específica = [(liberación experimental-liberación espontánea)/(liberación máxima-liberación espontánea)] cpm x 100. En todos los casos, la liberación espontánea de ^{51}Cr fue <15%. Los errores estándares de las medias de las determinaciones triplicadas fueron <10% del valor de la media.

Experimentos de inducción tumoral

Se inmunizaron y reinmunizaron ratones, tal como se ha descrito anteriormente, con de 10^{6} a 5x10^{6} partículas SFV-E6E7, partículas SFV-LacZ o PBS. Una semana después de la última inmunización de refuerzo los ratones se indujeron s.c. con 2x10^{4} células TC-1 suspendidas en 0,2 ml de una Solución de Sal Tamponada de Hanks (Life Technologies). Las medidas de tumores las realizó, en todos casos, el mismo técnico especializado. El ratón se sacrificó a un tamaño de tumor de 1000 mm^{3}, aproximadamente.

Ejemplo 2

Los presentes inventores también generaron dos plásmidos de SFV recombinantes que contienen un potenciador de traducción. Un plásmido codifica una proteína de fusión de E6 y E7, mediante la inserción de un par de bases entre E6 y E7 y mediante el cambio el codón de parada de E6, este plásmido se denomina pSFV3-eE6,7 (Figuras 9 y 19). En el otro plásmido, el potenciador de la traducción se coloca delante de la construcción original E6E7, pSFV3-eE6E7.

Análisis por transferencia Western de la expresión de proteínas

Para verificar que SFV-eE6,7 inducía expresión de una proteína de fusión de E6 y E7 recombinante mientras que SFV-E6E7 induce la expresión de las proteínas E6 y E7 separadas, se compararon los lisados de células infectadas con SFV-eE6E7 o SFV-eE6,7 mediante análisis de transferencia Western. Además, se analizaron los lisados de las células infectadas con la construcción en la cual el potenciador de la traducción se había clonado delante de la construcción original E6E7, es decir, SFV-eE6E7.

En la Figura 10, se muestran las transferencias Western exploradas con anti-E6 de HPV16 o anti-E7 de HPV16. La tinción de los anticuerpos anti-E6 y anti-E7 reveló tres bandas destacadas en los lisados de las células infectadas con SFV-eE6,7 (carriles 3 y 7), mientras que se pudo demostrar ninguna o muy poca presencia de E6 y E7 tras la infección con SFV-E6E7 (carriles 1 y 5). Sin embargo, debería indicarse que el procedimiento (cantidad de material y tiempo de tinción) utilizado para la demostración de la proteína de fusión altamente expresada mediante transferencia Western no es óptima para la demostración de la expresión relativamente baja de E6 y E7 en células infectadas con SFV-E6E7. En un estudio previo se pudo demostrar la expresión de E6 y E7 en células infectadas con SFV-E6E7 utilizando más material y un tiempo de tinción más largo.

Las tres bandas principales observadas en los lisados de SFV-eE6,7 tenían movilidades electroforéticas aparentes de, aproximadamente, 26 kDa, 36 kDa y 44 kDa, respectivamente. La banda de 26 kDa representa la proteína de fusión de E6 y E7 (17 kDa y 11 kDa, respectivamente). Las bandas de 36 kDa y 44 kDa, sin embargo, no corresponden a los M_{r}s calculados de complejos diméricos y triméricos de la proteína de fusión. Sin embargo, dado que ambas bandas presentan tinción positiva con el anticuerpo anti-E6, así como con el anticuerpo anti-E7, las bandas reflejan un complejo de proteína compuesto tanto de E6 como de E7. En este sentido, debería indicarse que otros y los presentes inventores han demostrado que el M_{r} de la proteína E7 recombinante producida (Figura 10, carril 8) no se corresponde con el M_{r} calculado (11 kDa). De forma similar, las M_{r}s aparentes de las bandas pueden no reflejar el M_{r} real de las proteínas de fusión.

La tinción del lisado de las células infectadas con SFV-eE6,E7 con el anticuerpo anti-E6 reveló dos bandas de 22 kDa y 32 kDa, aproximadamente (Figura 10, carril 2). La tinción de este carril con el anticuerpo anti-E7 no reveló una banda (Figura 10, carril 6) demostrando que, tal como se esperaba, sólo la proteína E6 se tradujo de una forma aumentada. La banda de 22 kDa observada en la transferencia de anti-E6 es ligeramente mayor que la M_{r} calculada de E6, es decir, 17 kDa. La banda de 32 kDa podría representar un complejo dimérico de E6.

Análisis de la expresión de E6 y E7 por marcación por pulsos

Se analizó la producción y estabilidad de E6, E7 y de la proteína de fusión E6,7 mediante células BHK trasfectadas con partículas de SFV mediante marcación por pulso y caza ("pulse-chase-labelling") de las células con ^{35}S-metionina/cisteína. Tal como se muestra en la Figura 11 (carril 6), la infección de las células BHK con partículas SFV-eE6,7 y radiomarcación durante una hora, dio como resultado tres bandas destacadamente marcadas de la proteína de fusión E6,7. Estas bandas corresponden a las bandas reveladas en las transferencias Western. Aunque puede parecer que la banda de 44 kDa también está presente en los lisados de control, un examen más profundo revela que esta banda de la proteína de fusión superior en los carriles 6-9 se coloca ligeramente más abajo que la banda en los carriles 1-5. Las bandas de 36 y 46 kDa todavía están presentes después del período de caza de 6-16 horas. Incluso después de un periodo de caza de 40 horas, ambas bandas están visibles, aunque se destacan menos. El corto tiempo de exposición que era suficiente para visualizar las proteínas de fusión aumentadas podría no revelar las bandas de las proteínas E6 y E7 producidas tras la infección con SFV-E6E7, después de un período de caza de 6 horas (Figura 11; carril 2) o bien directamente tras la marcación (no mostrado). Previamente, los presentes inventores demostraron que se necesita un tiempo de exposición más largo de la película para visualizar estas proteínas.

La autorradiografía de los lisados de las células infectadas con SFV-eE6E7 directamente tras la marcación (Figura 11, carril 3) reveló las mismas bandas que las observadas mediante el análisis por transferencia Western, es decir, una banda de 22 y una de 32 kDa. Sin embargo, a diferencia de la proteína de fusión potenciada, dentro de un periodo de caza de 6 horas la mayor parte de la proteína E6 se degradó. Después de 16 horas, la proteína se degradó casi completamente.

CTLs específicos para HPV inducidos por inmunización de ratones con SFV-eE6,7 y SFV-E6E7

Los ratones se inmunizaron s.c. y reinmunizaron dos veces (s.c. e i.p.) con 10^{6} partículas purificadas SFV-E6E7, SFV-eE6,7, SFV-eE6E7, SFV-LacZ o tampón, como control. La actividad CTL se determinó una semana después de la última inmunización de refuerzo. Después de 7 días (Figura 12 A) y 14 días (Figura 12 B) de reestimulación in vitro, se evaluó la actividad citolítica de las células efectoras resultantes contra células diana 13-2 y células diana C3. Se indujeron niveles similares de citólisis contra ambas líneas de células. Tal como se muestra en la Figura 12, las células de bazo aisladas de ratones inmunizados con 10^{6}, aunque también con tan solo 10^{5} partículas SFV-eE6,7, todavía mostraron un elevado nivel de citólisis en el protocolo de reestimulación a corto plazo (es decir, 7 días; Figura 12 A). Tras la inmunización con 10^{6} SFV-E6,E7, se pudieron determinar niveles significativos de actividad CTL sólo después de una reestimulación a largo plazo (Figura 12 B), la reestimulación a corto plazo dio como resultado un nivel muy bajo de actividad CTL. Tras la inmunización con 10^{5} SFV-E6E7 no fue detectable ninguna actividad CTL. La inmunización con SFV-E6,E7 no indujo niveles detectables de actividad CTL contra células 13-2 ni contra células diana C3, que expresan el genoma completo de E6E7 del HPV16 (no
mostrado).

A continuación, se determinaron el nivel y mantenimiento de la actividad CTL inducida tras la administración de dosis más altas de partículas SFV-eE6,7. Los ratones se inmunizaron con 1, 2,5 ó 5x10^{6} partículas de SFV y se determinó la actividad CTL 18 días y 8 semanas después de la última inmunización de refuerzo. Tal como se muestra en la Figura 13, el nivel de actividad CTL inducida con 10^{6} SFV-eE6,7 es supuestamente el máximo nivel de lisis que se puede conseguir y detectar de actividad CTL en la mayor parte del ensayo de liberación ^{51}Cr, dado que la inmunización con 2,5 y 5x10^{6} SFV-eE6,7 no aumentó el porcentaje de lisis específica. De forma importante, 8 semanas más tarde de la última inmunización de refuerzo, los niveles de citólisis fueron tan altos como 18 días después de la última reinmunización (Figura 13 B y Figura 13 A, respectivamente).

Para esta parte principal del ensayo de CTL, se reestimulan células de bazo in vitro durante varios días dando como resultado la proliferación de precursores de CTL. Por lo tanto, este ensayo no es un ensayo fiable para determinar la frecuencia real de precursores de CTL que se ha inducido in vivo. Para evaluar el número de precursores de CTL se llevó a cabo un ensayo Elispot de IFN-a del HPV16. Tal como se demuestra en la Tabla 1, el número de precursores CTL 18 días después de la inyección de 1, 2,5 y 5x10^{6} partículas SFV-eE6,7 estaba dentro del intervalo de 1 en 1780 a 1 en 6600 células de bazo totales. Dado que aproximadamente el 8% de células de bazo de C57B1/6 son células T CD8+, lo que significa que de 1 en 140 a 1 en 530 células T esplénicas positivas en CD8 son específicas para HPV. Ocho semanas después de la última inmunización de refuerzo el nivel osciló entre 1 en 430 y 1 en 1090 células T CD8+. Aunque no se pueden extraer conclusiones en firme a partir de estas cifras, dado que cada dosis y momento representa un único ratón, no se observó correlación entre la dosis inyectada y el nivel de CTLs específicos.

En protocolos de inmunización previos los ratones se inmunizaron en todos los casos tres veces (es decir, una inmunización primaria seguida de dos inmunizaciones de refuerzo). A efectos de determinar el número de inmunizaciones necesarias para inducir una respuesta a largo plazo, los presentes inventores inmunizaron ratones una o dos veces y determinaron el nivel de actividad CTL a los 10 días, 1 mes o tres meses más tarde, después de la última inmunización.

La Figura 14A muestra que una única inmunización de 2,5x10^{6} partículas SFV-eE6,7 induce un nivel significativo de citólisis a los 10 días después de la inmunización (cuadrados). Este nivel gradualmente disminuye en los próximos tres meses (1 mes: círculos; tres meses: triángulos). Sin embargo, un solo refuerzo es suficiente para inducir una respuesta CTL significativa hasta 3 meses después de la inmunización de refuerzo (Figura 14B, triángulos) que era tan alta como la respuesta después de 1 mes (figura 14B, círculos).

Finalmente, la vía de inmunización se varió. Los ratones se inmunizaron s.c., i.p. o i.v. con 1x10^{6} partículas SFV-eE6,7. La mayor parte del ensayo de CTL muestra que los niveles de lisis específica por las células de bazo aisladas de los ratones inmunizados i.v. (n=3) son ligeramente superiores (a una proporción E:T de 3 ya hay lisis casi máxima) que los de los ratones inmunizados s.c. (n=2) o i.p. (n=3) (Figura 15, tres paneles superiores). Separadamente, utilizando las mismas células de bazo, se determinaron las frecuencias de precursores de CTL mediante tetrámeros MHC clase I específicos para E7 del HPV16. En los paneles inferiores de la Figura 15, se dan los porcentajes de tetrámero^{+}/células T CD8+. Las barras corresponden a los datos de CTL en los paneles superiores. El nivel relativamente superior de lisis específica observado tras la inmunización i.v. también se ve reflejado en el número de tetrámero^{+}/células
T CD8+.

Inducción tumoral y reinducción tras la inmunización de ratones con partículas SFV-eE6,7

A efectos de examinar si las partículas de SFV recombinantes podrían generar inmunidad protectora contra una inducción tumoral posterior, los ratones se inmunizaron y reinmunizaron con partículas SFV-eE6,7 y se indujeron s.c. con células TC-1 tumorales que expresan E6E7 del HPV16. La Figura 16 muestra los resultados combinados de dos estudios de inmunización separados. Los ratones de control, a los que se había inyectado PBS (n=10) o partículas SFV-LacZ (n=10), desarrollaron tumores palpables en las 2 a 4 semanas después de la inoculación de células tumorales. En un estudio previo, los presentes inventores demostraron que la inmunización con 5x10^{6} partículas SFV-E6E7 dio como resultado una protección frente a los tumores parcial, es decir, dos de cinco ratones no desarrollaron un tumor. En la presente descripción, los inventores demuestran que la inmunización con 10^{6} partículas SFV-eE6,7 protege 9 de 10 ratones frente al desarrollo de un tumor (Figura 16). La inmunización con una dosis 5 veces superior (5x10^{6} partículas) protege 4 de 5 ratones (tabla 2).

Para determinar si se induce protección a largo plazo, a los ratones que no desarrollaron un tumor se les indujeron s.c. con 2x10^{4} células tumorales en la semana 25 (exp. 1) o en la semana 13 (exp. 2) tras la inducción tumoral inicial.

Tal como se muestra en la Tabla 2, todos los ratones inmunizados con 5x10^{6} SFV-eE6,7 que no desarrollaron un tumor en la inducción tumoral inicial se protegieron contra la segunda inducción tumoral 13 semanas más tarde. De los ratones inmunizados con 10^{6} SFV-eE6,7, el 50% y el 60% no desarrollaron un tumor tras una segunda inducción tumoral en la semana 25 y en la semana 13, respectivamente.

Tratamiento de tumores tras la inmunización con partículas SFV-eE6,7

Los prometedores resultados obtenidos en los experimentos de inducción tumoral, tal como se ha descrito anteriormente, condujeron a los presentes inventores a la determinación de la eficacia de la inmunización con SFV-eE6,7 en un marco de tratamiento de tumores. Los ratones se inocularon s.c. con 2x10^{4} células TC-1. A diversos momentos después de la inoculación del tumor, los ratones se inmunizaron s.c. con 5x10^{6} partículas SFV-eE6,7, SFV-LacZ o PBS. En la Figura 17 se muestran los volúmenes de los tumores de ratones individuales de dos experimentos separados. La Figura 18 muestra los resultados combinados de estos experimentos como porcentajes de ratones libres de tumores en el tiempo. Los ratones de control y a los que se inyectaron SFV-LacZ desarrollaron un tumor dentro de las dos semanas posteriores a la inoculación del tumor. Todos los ratones inmunizados con partículas SFV-eE6,7 en los días 2, 7 y 14 después de la inoculación del tumor, estaban libres de tumores en el día 100 tras la inoculación de tumores (Figura 17, panel C). En 4 de 7 ratones de este grupo, un tumor muy pequeño fue palpable en el día 14 tras la inoculación tumoral (Figura 17). Estos nódulos tumorales desaparecieron dentro de los 7 días y todos los ratones permanecieron libres de tumores. En el segundo grupo de ratones, inmunizados con partículas SFV-eE6,7 en los días 7, 14 y 21 después de la inoculación tumoral, todos los ratones (n=14) en ambos experimentos desarrollaron un tumor pequeño palpable en el día 14. En 12 de 14 ratones estos nódulos habían desaparecido el día 21. Finalmente, 9 de 14 ratones permanecieron libres de tumores (Figura 17). Al final, en un grupo de ratones la inmunización se inició tan tarde como el día 14 después de la inoculación tumoral. Tal como se muestra en la figura 17, 3 de 7 ratones eliminaron los tumores iniciales. Uno de estos ratones eliminó un tumor de un volumen de 650 mm^{3} en el día 20. Un ratón nuevamente desarrolló un tumor tan tarde como 60 días después de la inoculación tumoral.

La inducción de tumores y reinducción tras la inmunización s.c. con partículas SFV-eE6,7. En uno de los experimentos descritos anteriormente, a los ratones libres de tumores se les reindujeron células TC-1 sin inmunización adicional, 13 semanas más tarde de la inoculación tumoral inicial. Dado que ninguno de los ratones de control estaban libres de tumores después de 13 semanas, se incluyeron 4 ratones de control en el experimento en el momento de la segunda inoculación tumoral. Tal como se muestra en la figura 20, todos los ratones libres de tumores inmunizados en los días 7, 14 y 21 después de la inoculación tumoral inicial permanecieron libres de tumores tras una segunda inducción tumoral. En el grupo de ratones inmunizados en los días 2, 7 y 14 sólo uno de siete ratones desarrollaron un tumor después de la segunda inoculación tumoral.

Tratamiento de los tumores después de la inmunización intravenosa con partículas SFV-eE6,7

El análisis Elispot y la tinción con tetrámero demostraron que tras la inmunización intravenosa se inducen números más elevados de precursores CTLs que después de la inmunización s.c. e i.p. Los presentes inventores, por lo tanto, desarrollaron estudios de terapia tumoral en los cuales los ratones se inmunizaron intravenosamente. Los experimentos se desarrollaron de forma similar a los experimentos descritos anteriormente. Tal como se muestra en la figura 21, todos los ratones inmunizados con 5x10^{6} partículas SFV-eE6,7 en los días 7, 14 y 21 tras la inoculación tumoral, permanecieron libres de tumores. Incluso en los casos en los que la inmunización se inició a los 14 días después de la inoculación tumoral, un momento en el cual todos los ratones habían desarrollado un tumor palpable, todos los tumores revirtieron. Finalmente, 4 de 7 ratones erradicaron el tumor completamente y permanecieron libres de tumores a partir de entonces.

Tratamiento de tumores tras la inmunización intravenosa con tan solo 5x10^{4} partículas SFV-eE6,7

A efectos de determinar la dosis mínima efectiva, los ratones se inmunizaron con cantidades decrecientes de partículas SFV-eE6,7 en los días 7, 14 y 21 después de la inoculación de tumores. Tal como se demuestra en la figura 22, todos los ratones inmunizados con 5x10^{5} partículas SFV-eE6,7 y seis de siete ratones inmunizados con tan solo 5x10^{4} partículas SFV-eE6,7 eliminaron el tumor y permanecieron libres de tumores hasta 10 semanas después de la inoculación tumoral.

Materiales y métodos Líneas celulares

Se obtuvieron células de riñón de cría de hámster (BHK-21) de la Colección Americana de Cultivos Tipo (#CCL-10). Las células se hicieron crecer en GMEM (Life Technologies, Paisley, UK) que contenía un 5% de suero de ternero fetal (PAA laboratories, Linz, Austria). Los doctores Dr. C. Melief y Dr. R. Offringa (Leiden University, Países Bajos) facilitaron amablemente las células C3, células 13-2 y células TC-1. La línea celular C3 se obtuvo a partir de células embrionarias C57BL/6 (H-2^{b}) transfectadas con un plásmido que contenía el genoma completo del HPV16. La línea celular 13-2 se generó a partir de células embrionarias C57B1/6 (H-2^{b}) transfectadas con la región E1 de un adenovirus de tipo 5 en la cual el epítopo E1A adenoviral SGPSNTPPEI se sustituye por un epítopo CTL de E7 del HPV16, AA49-57 (RAHYNIVTF) (R. Ofringa, comunicación personal). La línea celular TC-1 se generó a partir de células primarias C57B1/6 epiteliales de pulmón con un vector retroviral que expresa E6E7 del HPV16 más un retrovirus que expresa c-Ha-ras^{25} activada. Las células C3, 13-2 y TC-1 se hicieron crecer en IMDM (Life Technologies) complementadas con un 10% de suero de ternero fetal. Ambos medios contenían penicilina y estreptomicina (Life Technologies; 100 U/ml y 100 \mug/ml, respectivamente).

Ratones

Construcción de pSFV3-E6E7, pSFVS-eE6,7 y pSFV-eE6E7

El Dr. P. Liljeström (Karolinska Institute, Estocolmo, Suecia) suministró amablemente pSFV-Auxiliar 2^{16} y
pSVF3.^{15} Los genes E6 y E7 del HPV16 se obtuvieron a partir del plásmido pRSV-HPV16E6E7,^{38} que suministró amablemente el Dr. J. Ter Schegget (Free University, Amsterdam, Países Bajos). En este plásmido los genes E6 y E7 del HPV16 están presentes en tándem, con un codón de parada después del gen E6. La amplificación del gen en tándem E6E7 se realizó por PCR. El producto de PCR se digirió con BamHI y se clonó en el lugar de BamHI de pGEM7Zf+. Después de la confirmación de secuencia, el fragmento E6E7 se clonó en el único lugar BamHI de pSFV3, produciendo pSFV3-E6E7.

El plásmido pSFV3-eE6,7 se generó para expresar niveles elevados de una proteína de fusión de E6 y E7 del HPV16 incluyendo un potenciador de la traducción. La construcción se representa en la Figura 17 y es tal como se describe a continuación.

Fuera del pSFV3-E6E7, la secuencia de E6 se modificó con un sitio NcoI en el extremo 5' y un sitio EcoRI en el extremo 3'. La secuencia de E7 se modificó con un sitio EcoRI en el extremo 5' y un sitio BamHI en el extremo 3' mediante PCR.

El extremo 5' del gen de la cápside del SFV que codifica los primeros 34 residuos de aminoácidos se ha mostrado que contiene un potenciador de la traducción. Smerdou y Liljeström (J. Virol. 73, 1092-1098, 1999) clonaron este potenciador en una construcción pSFV-auxiliar-S1. Además, insertaron la secuencia de la autoproteasa 2A (17 aminoácidos) del virus de la fiebre aftosa (FMDV) dentro del marco de lectura entre el potenciador de la traducción y p62 (proteína de la envoltura del SFV) a efectos de proporcionar una escisión entre las proteínas. Los presentes inventores sintetizaron la secuencia que contiene el potenciador de la traducción y la autoproteasa A2 de FMDV a partir de pSFV-auxiliar-S1, y se generaron por PCR los sitios de restricción BamHI y NcoI en los extremos 5' y 3', respectivamente. Los fragmentos de enh-proteasa A2 del FMDV, de E6 y E7 se clonaron en el sitio BamHI de pSFV3, produciendo pSFV3-eE6,7.

En el plásmido original, los genes E6 y E7 del HPV16 están presentes en tándem, con un codón de parada después del gen E6. En pSFV3-eE6,7 un par de bases se inserta entre E6 y E7 y el codón de parada TAA de E6 se cambia a GAA. De este modo, en pSFV3-eE6,7 la secuencia que codifica E6 y E7 mantiene la pauta de lectura, expresando un producto de fusión de E6 y E7.

La construcción de pSFV3-E6E7 se realizó mediante la clonación del fragmento E6E7 intacto y el fragmento potenciador de la traducción-autoproteasa A2 del FMDV en pSFV3-E6E7. Dado que E6 y E7 no mantienen la misma pauta de lectura cabe esperar que este plásmido codifique E6 de una manera aumentada mientras que la traducción de E7 no está potenciada.

Los insertos que codifican eE6E7 o eE6,7 se secuenciaron para verificar que no se habían generado modificaciones durante el PCR.

Producción y purificación de partículas de SFV recombinantes

pSFV3-LacZ^{15} fue un amable regalo del Dr. P. Liljeström (Karolinska Institute, Estocolmo, Suecia). Los plásmidos pSFV3-E6E7, pSFV3-eE6E7, pSFV3-eE6,7, pSFV3-LacZ y pSFV-Auxiliar 2 se aislaron mediante el kit de purificación de plásmidos Qiagen Midi y se linealizaron por digestión con SpeI (Life Technologies). A partir del ADN linealizado se sintetizó ARN por transcripción in vitro mediante ARN polimerasa SP6 (Amersham Pharmacia Biotech. Inc., Piscataway, NJ, USA). Se obtuvo un análogo de la caperuza de protección del extremo de ARN ("capping") de Life Technologies. Se mezclaron quince \mug de ARN de SFV3-E6E7 o SFV3-LacZ y 7,5 \mug de ARN SFV-Auxiliar 2 y se cotransfectaron dentro de 8x10^{6} células BHK en 0,8 ml de GMEM por electroporación mediante el Biorad Gene Pulser^{R}II (dos pulsos de 850 V/25 mF; Biorad, Hercules, CA, USA). Tras los pulsos, las células se suspendieron en 10 ml de GMEM y se cultivaron durante 36 horas a 37ºC y con CO_{2} al 5%. El medio, que contenía las partículas SFV-E6E7 o SFV-LacZ, se centrifugó dos veces en un rotor JA 20 (Beckman, St. Paul, MN, USA) a 1800 rpm (es decir, 40.000xg a r_{max}) para eliminar las células y restos celulares.

\newpage

Antes de su utilización, las partículas de SFV se incubaron con un volumen 1/20 de \alpha-quimotripsina (10 mg/ml; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) durante 30 min a temperatura ambiente para romper las proteínas de la espícula mutadas. Posteriormente, se inactivó la \alpha-quimotripsina mediante la adición de un volumen 0,5 de aprotinina (2 mg/ml; Sigma Chemical Co.)

Determinación del título de las partículas de SFV

Se titularon partículas de SFV recombinantes mediante diluciones en serie sobre monocapas de células BHK. Tras la infección e incubación durante la noche las células se fijaron durante 10 minutos en acetona al 10% y se tiñeron utilizando un anticuerpo policlonal anti-replicasa (nsP3) de conejo (un amable regalo del Dr. T. Ahola, Biocentre Viiki, Helsinki, Finlandia) como anticuerpo primario e IgG de cabra anti-conejo marcada con FITC como anticuerpo secundario (Southern Biotech. Ass., Birmingham, AL, USA). Se contaron las células positivas y se determinó el título tras la corrección del factor de dilución y la dilución provocada por la activación y el volumen de partículas añadidas.

Análisis de la expresión de E6 Y E7 por transferencia Western

Se infectaron células BHK con partículas SFV-E6E7, SFV-eE6,E7 o SFV-eE6E7. Tras la incubación durante la noche, las células se recogieron y lisaron en un tampón de lisis (Tris.Cl 50 mM, EDTA 5 Mm, NaCl 150 mM, Tritón X-100 al 0,5%, pH 7,4). Los extractos libres de células se analizaron por SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a una membrana PVDF (Immobilon-P, Millipore Corp., Bedford, MA, USA) y se detectaron E6 y E7 con un anticuerpo policlonal de conejo anti-E6 del HPV16 (un amable regalo del Dr. I. Jochmus, Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Alemania) y un anticuerpo monoclonal de ratón anti-E7 del HPV16 (Zymed Lab. Inc. South San Francisco, CA, USA), respectivamente. Tras la incubación con anticuerpos secundarios unidos a fosfatasa alcalina, las transferencias se tiñeron con nitroazul de tetrazolio y 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (Sigma Chemical Co.).

Análisis de la expresión de E6 y E7 por marcación por pulsos

Mediante marcación por pulsos se infectaron células BHK con partículas SFV-E6E7, SFV-eE6,E7 o SFV-eE6,7. Después de 6 horas se eliminó el medio, las placas se lavaron tres veces con tampón fosfato salino (PBS) y las células se cultivaron durante 30 minutos adicionales con DMEM libre de metionina y cisteína (ICN Biomedicals). En este momento, se añadió a los cultivos ^{35}S-metionina/cisteína (0,37 MBq/pocillo; Amersham). Después de una hora, los pocillos se lavaron hasta estar libres de radioisótopos y se recogieron directamente o cultivaron durante 6, 16 ó 40 horas adicionales antes de la recolección. En estos momentos, las células se lavaron con PBS (4ºC), se recogieron por raspado y resuspendieron en un tampón de lisis que contenía 0,2 mM de fluoruro de fenilo-metano-sulfonilo. Después de la centrifugación los sobrenadantes de los lisados celulares se analizaron por SDS/PAGE y autorradiografía.

Inmunizaciones

Se inmunizaron ratones subcutáneamente (s.c.), intraperitonealmente (i.p.) o intravenosamente (i.v.) con de 10^{4} a 5x10^{6} partículas recombinantes de SFV, seguido de una o dos inmunizaciones de refuerzo con un intervalo de dos semanas o sin refuerzo. Como controles negativos, se inyectaron a los ratones dosis iguales de partículas SFV-LacZ o PBS.

Ensayo CTL

De siete días a 3 meses después de la última inmunización (de refuerzo), se aislaron células de bazo y se cocultivaron con células TC-1 irradiadas (100 Gy) en una proporción de 25:1, en frascos de cultivo de 25 cm^{2}, colocados verticalmente. Después de una semana en cultivo, las células se recogieron y se llevó a cabo un ensayo CTL mediante un ensayo estándar de liberación de ^{51}Cr de 4 horas en determinaciones por triplicado. Las células diana se marcaron durante 1 hora con 3,7 MBq de ^{51}Cr/10^{6} células en 100 ml de medio (^{51}Cr provenía de Amersham, Londres, UK). Se calculó el porcentaje promedio de la liberación específica de ^{51}Cr de los pocillos triplicados, según la fórmula: % liberación específica = [(liberación experimental-liberación espontánea)/(liberación máxima-liberación espontánea)] cpm x 100. En todos los casos, la liberación espontánea de ^{51}Cr fue <15%. Los errores estándares de las medias de las determinaciones triplicadas fueron <10% del valor de la media.

Inicialmente, el análisis CTL también se llevó a cabo después de un periodo adicional de estimulación in vitro. Para estos experimentos se cultivaron células de bazo durante una semana, tal como se ha descrito anteriormente, se recogieron y reestimularon con células de bazo vírgenes ("naive") irradiadas (30 Gy) y se irradiaron células C3 en una proporción de 2:5:0,1 en placas de 24 pocillos en presencia de 4 IU de hIL2/ml recombinante (Strathmann Biotech GMBH, Hamburgo, Alemania). Cinco días después de la reestimulación, las células se recogieron y se llevó a cabo un ensayo de liberación de ^{51}Cr, tal como se ha descrito anteriormente.

Determinación de la frecuencia de precursores de CTL mediante análisis Elispot de IFN-alfa

El análisis Elispot se realizó básicamente según el método descrito por Miyahira y otros (J Immunol. Methods 181, 45054, 1995). Brevemente, se colocaron en placas con pocillos, números conocidos de células de bazo recién aisladas, diluidas en serie (placas de gran afinidad de 96 pocillos, Greiner) que se habían recubierto durante la noche con el anticuerpo anti-ratón IFN-alfa mAb (Pharmingen, CA). Posteriormente, se añadieron células 13-2 (que expresan sólo el epítopo de CTL E7_{49-57} del HPV16) para la reestimulación in vitro utilizando proporciones de células efectoras respecto a estimuladoras de 1:1 a 4:1. Además, las células de bazo se cultivaron sin células estimuladoras como controles para determinar la secreción de IFN-alfa independiente de antígeno. Después de la incubación durante la noche, los pocillos se lavaron extensivamente y se incubaron con el anticuerpo biotinilado anti-ratón IFN-ā mAb (Pharmingen, CA). Después de una incubación de 1 hora a 37ºC, las placas se lavaron y se añadió el complejo estrepavidina-fosfatasa alcalina. Después de una incubación de 1 hora a 37ºC, las placas se lavaron y se desarrollaron manchas mediante la adición del sustrato BCIP (Sigma) en agarosa. Después de la incubación durante la noche a 4ºC se determinó el número de manchas mediante un estereomicroscopio.

Determinación de la frecuencia de CTL mediante tetrámeros MHC de clase I específicos para HPV

El Dr. T. Schumacher (NKI, Ámsterdam, Países Bajos) suministró amablemente los tetrámeros MHC de clase I E7_{49-57} del HPV16 marcados con picoeritrina (PE). Se tiñeron células de bazo recién aisladas con tetrámero E7_{49-57} del HPV16 marcado con PE y FITC-anti-CD8 (Pharmingen) durante 20 minutos sobre hielo seguido de lavados extensivos con PBS que contenía BSA (0,5%) y NaNs (0,02%). Antes del análisis FACS, se añadió yoduro de propidio (PI). Se separaron los linfocitos pequeños mediante dispersión de luz frontal y lateral.

Experimentos de inducción tumoral

Se inmunizaron y reinmunizaron ratones, tal como se ha descrito anteriormente, con de 10^{6} a 5x10^{6} partículas SFV-E6E7, SFV-eE6,7, partículas SFV-LacZ o PBS. Una semana después de la última inmunización de refuerzo los ratones se indujeron s.c en el cuello con 2x10^{4} células TC-1 suspendidas en 0,2 ml de una Solución de Sal Tamponada de Hanks (Life Technologies). Las medidas de tumores las realizó, en todos casos, el mismo técnico especializado. Los ratones se sacrificaron a un tamaño de tumor de 1000 mm^{3}, aproximadamente.

Experimentos de tratamiento de los tumores

Se inocularon a los ratones s.c. en el cuello 2x10^{4} células TC-1 suspendidas en 0,2 ml de una Solución de Sal Tamponada de Hanks (Life Technologies). Los ratones se inmunizaron a diferentes tiempos después de la inoculación de los tumores subcutánea o intravenosamente con de 5x10^{4} a 5x10^{6} partículas SFV-eE6,7. Los ratones se inmunizaron los días 2, 7 y 14 después de la inoculación de tumores, o los días 7, 14 y 21 después de la inoculación o, finalmente, los días 14, 21 y 28 después de la inoculación. Además, se incluyeron grupos de control que se inmunizaron con PBS o bien con 5x10^{6} partículas SFV-LacZ en los días 2, 7 y 14 después de la inoculación de los tumores. Las medidas de tumores las realizó, en todos los casos, el mismo técnico especializado. Los ratones se sacrificaron a un tamaño de tumor de 1000 mm^{3}, aproximadamente.

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TABLA 1 Frecuencia de precursores de CTL en ratones inmunizados con SFV-eE6,7, tal como determina el ensayo Elispot de IFN-gamma

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TABLA 2 Protección frente al crecimiento de células tumorales TC-1 en ratones inmunizados con SFV-eE6,7 tras la inducción y reinducción tumoral

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Referencias

1 Zur Hausen H. "Virus en cáncer humano" ("Viruses in human cancer"). Science 1991; 254: 1167-1173.

2 Münger K, Scheffner M, Huibregtse JM, Howley PM. "Interacciones de E6 y E7 de HPV con productos génicos supresores de tumores" ("Interactions of HPV E6 and E7 with tumor suppressor gene products"). Cancer Surv 1992; 12: 197-217.

3 Werness BA, Levine AJ, Howley PM. "Asociación de las proteínas E6 de los tipos de papilomavirus humano 16 y 18 con p53" ("Association of human papillomavirus types 16 and 18 E6 proteins with p53"). Science 1990; 248: 76-79.

4 Pei XF. "Los genes E6/E7 del papilomavirus humano inducen cambios discordantes en la expresión de proteínas reguladoras del crecimiento celular" ("The human papillomavirus E6/E7 genes induce discordant changes in the expression of cell growth regulatory proteins"). Carcinogenesis 1996; 17: 1395-1401.

5 Jones DL, Münger K. "Interacciones de la proteína E7 del papilomavirus humano con reguladores del ciclo celular" ("Interactions of human papillomavirus E7 protein with cell cycle regulators"). Seminars Cancer Biol 1996; 7: 327-337.

6 Gulliver GA, Herber RL, Liem A, Lambert PF. "Tanto la región 1 conservada (CR1) como la CR2 del oncogén E7 del papilomavirus humano de tipo 16 se requieren para la inducción de hiperplasia epidérmica y para la formación de tumores en ratones transgénicos" ("Both conserved region 1 (CR1) and CR2 of the human papillomavirus type 16 E7 oncogene are required for induction of epidermal hyperplasia and tumor formation in transgenic mice"). J Virol 1997; 71: 5905-5914.

7 Porreco R y otros "Malignidades ginecológicas en receptores de homoinsertos de órganos inmunosuprimidos" ("Gynecological malignancies in immunosuppressed organ homograft recipients"). Obstet Gynecol 1975; 45: 359-364.

8 Johnson JC y otros "Elevada frecuencia de infecciones cervicales por papilomavirus humano latentes y clínicas en mujeres inmunocomprendidas infectadas con el virus de inmunodeficiencia humano" ("High frequency of latent and clinical human papillomavirus cervical infections in immunocomprised human immunodeficiency virus-infected women"). Obstet Gynecol 1992; 79: 321-327.

9 Feltkamp MC y otros "La vacunación con péptidos que contienen epítopos de los linfocitos T citotóxicos protege contra un tumor inducido por células transformadas por el papilomavirus humano de tipo 16" ("Vaccination with cytotoxic T lymphocyte epitope containing peptide protects against a tumor induced by human papillomavirus type 16-transformed cells" Eur J Immunol 1993; 23: 2242-2249.

10 Feltkamp MC y otros (1995) "Los linfocitos T citotóxicos aumentados frente un epítopo subdominante ofrecido como péptido sintético erradicaron tumores inducidos por el papilomavirus humano de tipo 16" ("Cytotoxic T lymphocytes raised against a subdominant epitope offered as a synthetic peptide eradicate human papillomavirus type 16-induced tumors". Eur J Immunol 1995; 25: 2638-2642.

11 Jochmus I y otros "Especificidad de los linfocitos T citotóxicos humanos inducidos por un péptido obtenido a partir de E7 del papilomavirus humano de tipo 16" ("Specificity of human cytotoxic T lymphocytes induced by a human papillomavirus type 16 E7 derived peptide"). J Gen Virol 1997; 78: 1689-1695.

12 De Bruijn ML y otros "La inmunización con células dendríticas cargadas con Oncoproteínas del Papilomavirus Humano de Tipo 16 (BPV16) como las proteínas en adyuvantes induce la protección restringida por MHC de Clase I a las células tumorales inducidas por HPV16" ("Immunization with Human Papillomavirus Type 16 (BPV16) Oncoprotein-loaded dendritic cells as well as protein in adjuvant induces MHC Class I-restricted protection to HPV16-induced tumor cells"). Cancer Res 1998; 58:724-731.

13 Strauss JH, Strauss EG. "Los alfavirus: expresión, replicación, y evolución génica" ("The alphaviruses: gene expression, replication, and evolution"). Microbiology Reviews 1994; 58: 491-562.

14 Liljeström P, Lusa S, Huylebroeck D, Garoff H. "Mutagénesis in vitro de un clon con ADNc de longitud completa del virus del Bosque de Semliki: la pequeña proteína de membrana de peso molecular 6.000 modula la liberación de virus" ("In vitro mutagenesis of a full-length cDNA clone of Semliki Forest virus: the small 6,000-molecular-weight membrane protein modulates virus release"). J Virol 1991; 65:4107-4113.

15 Liljeström P, Garoff H. "Una nueva generación de vectores de expresión celular animal basados en el replicón del virus del Bosque de Semliki" ("A new generation of animal cell expression vectors based on the Semliki Forest virus replicon"). Biotechnol 1991; 9: 1356-1361.

16 Berglund P y otros "Sistema de expression del virus del Bosque de Semliki: Producción de partículas recombinantes infecciosas condicionalmente" ("Semliki Forest virus expression system: Production of conditionally infectious recombinant particles"). Biotechnol 1993; 11: 916-920.

17 Sedman SA y otros "La proteína E6 de longitud completa del Papilomavirus Humano de tipo 16 presenta actividades transformadoras y activadoras en trans y colabora con E7 para inmortalizar querationocitos en cultivos" ("The full-lenght E6 protein of Human Papillomavirus type 16 has transforming and trans-activating activities and cooperates with E7 to immortalize keratinocytes in culture"). J Virol 1991; 65: 4860-4866.

18 Greenfield I, Nickerson J, Penman S, Stanley M. "La proteína E7 del papilomavirus Humano de tipo 16 se asocia con la matriz del núcleo" ("Human papillomavirus 16 E7 protein is associated with the nuclear matrix"). Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 11217-11221.

19 Nindl I y otros "La proteína E7 del virus papilomavirus humano (HPV) de tipo 16 expresada por un virus de vacuna recombinante se puede utilizar para la detección de anticuerpos en suero de pacientes con cáncer cervical" ("The E7 protein of human papillomavirus (HPV) type 16 expressed by recombinant vaccinia virus can be used for detection of antibodies in sera from cervical cancer patients"). J Virol Methods 1996; 62: 81-85.

20 Braspenning J y otros "Protocolo de purificación general para proteínas E7 de un Papilomavirus Humano de tipo de alto y bajo riesgo expresadas en levaduras Schizosaccharamyces pombe" ("A general purification protocol for E7 proteins from Ahigh- and low-risk@ Human Papillomavirus types expressed in the yeast Schizosaccharamyces pombe"). Protein Expression Purif 1997; 10: 192-201.

21 Grossman SR, Mora R, Laimins LA. "Localización intracellular y propiedades de unión al ADN de la proteína E6 del papilomavirus Humano de tipo 18 expresada con un vector de baculovirus" ("Intracellular localization and DNA-binding properties of human papillomavirus type 18 E6 protein expressed with a baculovirus vector"). J Virol 1989; 63: 366-374.

22 Daniels PR, Sanders CM, Maitland NY. "Caracterización de las interacciones de E6 del papilomavirus humano con p53 y de proteínas asociadas a E6 en células de insectos y humanas" ("Characterization of the interactions of human papillomavirus type 16 E6 with p53 and E6-associated protein in insect and human cells"). J Gen Virol 1998; 79: 489-499.

23 Toes REM y otros "La vacunación con péptidos puede conducir al crecimiento aumentado de tumores a través de la inducción a tolerancia de células T específicas") ("Peptide vaccination can lead to enhanced tumor growth through specific T-cell tolerance induction"). Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 7855-7860.

24 Boursnell MEG y otros "Construcción y caracterización de una vacuna recombinante que expresa proteínas del Papilomavirus Humano para inmunoterapia del cáncer cervical" ("Construction and characterization of a recombinant vaccinia expressing Human Papillomavirus proteins for immunotherapy of cervical cancer"). Vaccine 1996; 14: 1485-1494.

25 Lin KY y otros "Tratamiento de tumores establecidos con una vacuna nueva que potencia la presentación de antígenos tumorales del complejo mayor histocompatibilidad de clase II" ("Treatment of established tumors with a novel vaccine that enhances major histocompatibility class II presentation of tumor antigen"). Cancer Res 1996; 56: 21-26.

26 Chen L y otros "Inducción de linfocitos T citotóxicos específicos para un tumor singeneico que expresa la oncoproteína E6 del papilomavirus humano de tipo 16" ("Induction of cytotoxic T lymphocytes specific for a syngeneic tumor expressing the E6 oncoprotein of human papillomavirus type 16"). J Immmtol 1992; 148: 2617-2621.

27 Boiysiewicz LK y otros "Un virus de vacuna recombinante que codifica las proteínas E6 y E7 del papilomavirus humano de tipo 16 y 18, como inmunoterapia para el cáncer cervical" ("A recombinant vaccinia virus encoding human papillomavirus types 16 and 18, E6 and E7 proteins as immunotherapy for cervical cancer"). Lancet 1996; 347: 1523-1527.

28 Glasgow GM, McGee MM, Sheahan BJ, Atkins GJ. "Mecanismos de muerte en cultivos celulares infectados por el virus del Bosque de Semliki" ("Death mechanisms in cultured cells infected by Semliki Forest virus"). J Gen Virol 1997; 78: 1559-1563.

29 Berglund P, Fleeton MN, Smerdou C, Liljeström P. "La inmunización con virus del Bosque de Semliki induce la protección contra el ataque con influenza en ratones" ("Immunization with recombinant Semliki Forest virus induces protection against influenza challenge in mice"). Vaccine 1999; 17: 497-507.

30 Rock KL. "Una nueva política exterior: más moléculas MHC de clase I monitorizan el mundo exterior" ("A new foreign policy: MHC class I molecules monitor the outside world"). Immunod Today 1996; 17:131-137.

31 Bennett SRM. "La ayuda para respuestas de células T citotóxicas está mediada por la señalización de CD40") ("Help for cytotoxic-T-cell responses is mediated by CD40 signalling"). Nature 1998; 393: 478-480.

32 Lanzavecchia A. "Inmunología. Licencia para matar". ("Immunology. Licence to kill") Nature 1998; 393: 413-414.

33 Ridge JP, Di Rosa F, Matzinger P. "Una célula dendrítica condicionada puede ser un puente temporal entre un auxiliar T CD4+ y una célula asesina T". ("A conditioned dendritic cell can be a temporal bridge between a CD4+ T-helper and a T-killer cell") Nature 1998; 393: 474-478.

34 Schoenberger SP y otros "La ayuda de células T a los linfocitos T citotóxicos está mediada por las interaccciones CD40-CD40L" ("T-cell help for cytotoxic T lymphocytes is mediated by CD40-CD40L interactions") Nature 1998; 393: 480-483.

35 Zhou X y otros "Generación de respuestas inmunes citotóxicas y humorales mediante virus del Bosque de Semliki recombinante no replicativo" ("Generation of cytotoxic and humoral immune responses by nonreplicative recombinant Semliki Forest virus"). Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 3009-3013.

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36 Berglund P y otros "Consecuencias de la inmunización de monos Cynomolgus con virus recombinante del Bosque de Semliki que codifica la proteína de la envoltura del virus de Inmunodeficiencia Humano de tipo I y ataque con una dosis elevada de virus SHIV-4" ("Outcome of immunization of Cynomolgus monkeys with recombinant Semliki Forest virus encoding Human Immunodeficiency virus type I envelope protein and challenge with a high dose of SHIV-4 virus"). AIDS Res Hum Retroviruses 1997; 13: 1487-1495.

37 Smerdou C, Liljeström P. "Sistema de ARN de dos-auxiliares para la producción de partículas del virus del Bosque de Semliki". ("Two-helper RNA system for production of recombinant Semliki forest virus particles"). J Virol 1999; 73: 1092-1098.

38 Smits PHM, Smits HL, Jebbink MF, Ter Schegget J. "El brazo corto del cromosoma 11 está probablemente implicado en la regulación del potenciador-promotor temprano del papilomavirus humano de tipo 16 y en la supresión de la actividad transformadora del ADN viral" ("The short arm of chromosome 11 likely is involved in the regulation of the human papillomavirus type 16 early enhancer-promoter and in the suppression of the transforming activity of the viral DNA"). Virol 1990; 176: 158-165.

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Títulos y leyendas de las figuras

Figura 1 Análisis de transferencia Western de extractos de células BHK transfectadas con SFV-E6E7. Se infectaron las células BHK con partículas SFV-E6E7 o partículas SFV-LacZ. Después de la incubación durante la noche, las proteínas celulares se extrajeron y analizaron por SDS-PAGE e inmunotransferencia. Se detectó E6 utilizando un anticuerpo policlonal de conejo anti-E6 del HPV16 (sección A), E7 se detectó utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón anti-E7 de BPV 16 (sección B). Carriles 1: células BHK21 no infectadas; carriles 2: células BHK21 infectadas con partículas SFV-E6E7; carriles 3: células BHK21 infectadas con partículas SFV-LacZ; M: marcador de proteínas.

Figura 2 Localización intracelular de E7 en células BHK infectadas con SFV-E6E7. Las células BHK21 se infectaron con SFV-E6E7. Después de la incubación durante la noche, las células se tiñeron mediante anticuerpos anti-E6 de HPV16 o anti-E7 de HPV16. A: Tinción inmunofluorescente de células infectadas con SFV-E6E7 con anti-E6 de HPV16, B: Tinción inmunofluorescente de células infectadas con SFV-E6E7 con anti-E7 de HPV16. Magnificación 40 x.

Figura 3 Actividad CTL inducida tras la inmunización con partículas SFV-E6E7, tal como se determinó después de una reestimulación in vitro a los 11 y 18 días. Los ratones se inmunizaron s.c. y se reinmunizaron dos veces (s.c. e i.p.) con 10^{6} SFV-E6E7 (n=4, cuadrados abiertos y cerrados y rombos), partículas SFV-LacZ (triángulos) o PBS (cruces), como control. La actividad CTL se determinó una semana más tarde de la última inmunización de refuerzo. Después de 11 días (panel A) y 18 días (panel B) en la reestimulación in vitro, se ensayó la actividad citolítica de las células efectoras resultantes frente a células 13-2 diana en un ensayo en pocillos por triplicado. Se muestran los niveles de citólisis a diferentes proporciones de efector respecto a diana. En todos los casos los errores estándares de las medias de las determinaciones por triplicado fueron <10% del valor de la media.

Figura 4 Reconocimiento de células C3 así como de células 13-2, que expresan el epítopo de CTL de unión a HPV 16 H-2D^{b} transformadas por HPV16 y lisis de las mismas, mediante CTLs inducidos tras la inmunización con partículas SFV-E6E7. Los ratones se inmunizaron s.c. y se reinmunizaron dos veces (s.c. e i.p.) con 10^{6} SFV-E6E7 purificadas (n=2, cuadrados y rombos), partículas SFV-LacZ (triángulos abiertos) o PBS (cruces), como control. Después de 11 días de la reestimulación in vitro, se ensayó la actividad citolítica de las células efectoras resultantes frente a células diana 13-2 (panel A) y células C3 (panel B) en un ensayo en pocillos por triplicado. Se muestran los niveles de citólisis a diferentes proporciones de efector con respecto a diana. En todos los casos los errores estándares de las medias de las determinaciones por triplicado fueron <10% del valor de la media.

Figura 5 Reconocimiento de células singenéicas EL4 cargadas con el péptido 49-57 de E7 mediante los CTLs inducidos tras la inmunización con partículas SFV-E6E7. Los ratones se inmunizaron s.c. y se reinmunizaron dos veces (s.c. e i.p.) con 10^{6} SFV-E6E7 purificadas (n=2, cuadrados y rombos), partículas SFV-LacZ (triángulos abiertos) o PBS (cruces), como control. Después de 18 días de la reestimulación in vitro se ensayó la actividad citolítica de las células efectoras resultantes contra las células EL4 cargadas con el péptido 49-57 de E7 (panel A) y de las células EL4 no cargadas (panel B) en un ensayo en pocillos por triplicado. Se muestran los niveles de citólisis a diferentes proporciones de efector con respecto a diana. En todos los casos los errores estándares de las medias de las determinaciones por triplicado fueron <10% del valor de la media.

Figura 6 Actividad CTL en ratones inmunizados con diferentes dosis de partículas SFV-E6E7. En dos experimentos por separado, los ratones se inmunizaron s.c. y se reinmunizaron dos veces (s.c. e i.p.) con 10^{4} partículas SFV-E6E7 purificadas (triángulos rellenos), 10^{5} (rombos rellenos) o 10^{6} (cuadrados rellenos), 10^{6} partículas SFV-LacZ (triángulos) o PBS (cruces), como control. La actividad CTL se determinó una semana después de la última inmunización de refuerzo. Después de 18 días de la reestimulación in vitro se ensayó la actividad citolítica de las células efectoras resultantes contra células 13-2 en un ensayo en pocillos por triplicado. Se muestran los niveles de citólisis a diferentes proporciones de efector con respecto a diana de dos experimentos individuales. En todos los casos los errores estándares de las medias de las determinaciones por triplicado fueron <10% del valor de la media.

Figura 7 Crecimiento de células tumorales TC-1 en ratones inmunizados con SFV-E6E7. Los ratones se inmunizaron s.c. y se reinmunizaron dos veces (s.c. e i.p.) con PBS (Panel A; n=10), 5x10^{6} partículas SFV-LacZ (Panel B; n=10), 10^{6} partículas SFV-E6E7 (Panel C; n=10) o 5x10^{6} partículas SFV-E6E7 (Panel D; n=5). El crecimiento de los tumores se monitorizó dos veces semanalmente. Cada línea representa el volumen del tumor de un ratón por
separado.

Figura 8 Crecimiento de células tumorales TC-1 en ratones inmunizados con SFV-E6E7. Los ratones se inmunizaron s.c. y se reinmunizaron dos veces (s.c. e i.p.) con PBS (n=10, círculos abiertos), 5x10^{6} partículas SFV-LacZ (n=10, cuadrados abiertos), 10^{6} partículas SFV-E6E7 (n=10, rombos rellenos) o 5x10^{6} partículas SFV-E6E7 (n=5, cuadrados rellenos). El crecimiento de los tumores se monitorizó dos veces semanalmente. Se muestran los porcentajes de ratones sin tumores palpables.

Figura 9 Estrategia de clonación para la construcción de SFV-enhE6,7.

Fuera del pSFV3-E6E7, la secuencia de E6 se modificó con un sitio NcoI en el extremo 5' y un sitio EcoRI en el extremo 3'. La secuencia de E7 se modificó con un sitio EcoRI en el extremo 5' y un sitio BamHI en el extremo 3' mediante PCR. El extremo 5' del gen de la cápside del SFV que codifica los primeros 34 residuos de aminoácidos se ha mostrado que contiene un potenciador de la traducción. Smerdou y Liljeström (J. Virol. 73, 1092-1098, 1999) clonaron este potenciador en una construcción pSFV-auxiliar-S1. Además, insertaron la secuencia de la autoproteasa 2A (17 aminoácidos) del virus de la fiebre aftosa (FMDV) dentro del marco de lectura entre en potenciador de la traducción y p62 (proteína de envoltura del SFV) a efectos de proporcionar una escisión entre las proteínas. Los presentes inventores sintetizaron la secuencia que contiene el potenciador de la traducción y la autoproteasa A2 del FMDV a partir de pSFV-auxiliar-S1, y se generaron por PCR los sitios de restricción BamHI y NcoI en los extremos 5' y 3', respectivamente. Los fragmentos de enh-proteasa A2 del FMDV, de E6 y E7 se clonaron en el sitio BamHI de pSFV3, produciendo pSFV3-eE6,7.

En el plásmido original los genes E6 y E7 del HPV16 están presentes en tándem, con un codón de parada después del gen E6. En pSFV3-eE6,7 un par de bases se inserta entre E6 y E7 y el codón de parada TAA de E6 se cambia a GAA. De este modo, en pSFV3-eE6,7 la secuencia que codifica E6 y E7 mantiene la pauta de lectura, expresando un producto de fusión de E6 y E7.

Figura 10 Análisis de transferencia Western de extractos de células BHK transfectadas con recSFV. Las células BHK se infectaron con partículas SFV-E6E7, SFV-eE6E7 o SFV-eE6,7. Después de la incubación durante la noche, las proteínas celulares se extrajeron y analizaron mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia. E6 se detectó utilizando un anticuerpo policlonal de conejo anti-E6 de HPV16 (carriles 1-3); E7 se detectó utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón anti-E7 de BPV 16 (carriles 5-8). Carriles 1 y 5: células BHK21 infectadas con partículas SFV-E6E7; Carriles 2 y 6: células BHK21 infectadas con partículas SFV-eE6E7; Carriles 3 y 7: células BHK21 infectadas con partículas SFV-eE6,7; Carril 4: marcador de proteínas (M); Carril 8: proteína E7 recombinante producida por
E. coli.

Figura 11 Análisis de la expresión de E6 y E7 mediante marcación por pulsos. Se infectaron células BHK con partículas SFV-E6E7, SFV-eE6,E7 o SFV-eE6,7. Después de 6 horas las células se cultivaron durante 30 minutos adicionales con medio libre de metionina y cisteína seguido de un periodo de marcación de 1 hora con ^{35}S-metionina/cisteína. Después de una hora, las células se lavaron y recogieron o cultivaron durante 6, 16 ó 40 horas adicionales antes de la recolección. Los lisados celulares se analizaron mediante SDS/PAGE y autorradiografía. Carril 1: células BHK21 no infectadas, analizadas después de una caza a las 6 horas; Carril 2: células BHK21 infectadas con SFV-E6E7, analizadas después de una caza a las 6 horas; Carriles 3-5: células BHK infectadas con partículas SFV-eE6E7, analizadas directamente o después de una caza a las 6 horas o 16 horas, respectivamente; Carriles 6-9: células BHK21 infectadas con partículas SFV-eE6,7, analizadas directamente o después de una caza a las 6 horas, 16 horas o 40 horas, respectivamente.

Figura 12 Actividad CTL inducida tras la inmunización con partículas SFV-E6E7, determinada después de una reestimulación in vitro a los 7 y 14 días. Los ratones se inmunizaron s.c. y se reinmunizaron dos veces (s.c. e i.p.) con 10^{6} partículas purificadas SFV-eE6,7 (n=2, cuadrados cerrados), 10^{5} SFV-eE6,7 (n=2, cuadrados abiertos), 10^{6} SFV-E6E7 (n=2, círculos cerrados), 10^{5} partículas SFV-E6E7 (n=2, círculos abiertos) o con 10^{6} SFV-LacZ (n=2, triángulos cerrados) o PBS (n=2, triángulos abiertos), como controles. La actividad CTL se determinó una semana después de la última inmunización de refuerzo. Después de 7 días (panel A) y 14 días (panel B) de la reestimulación in vitro se ensayó la actividad citolítica de las células efectoras resultantes contra células 13-2 en un ensayo en pocillos por triplicado. Se muestran los niveles de citólisis a diferentes proporciones de efector con respecto a diana. En todos los casos los errores estándares de las medias de las determinaciones por triplicado fueron <10% del valor de la
media.

Figura 13 Actividad CTL inducida tras la inmunización con 1, 2,5 y 5x10^{6} partículas SFV-eE67. Los ratones se inmunizaron s.c. y se reinmunizaron dos veces (s.c. e i.p.) con 5x10^{6} SFV-eE6,7 purificadas (cuadrados cerrados), 2,5x10^{6} SFV-eE6,7 (círculos abiertos), 10^{6} SFV-eE6,7 (cuadrados abiertos) o con 5x10^{6} SFV-LacZ (triángulos cerrados) o PBS (triángulos abiertos), como controles. La actividad CTL se determinó 18 días (panel A) u 8 semanas (panel B) después de la última inmunización de refuerzo. Después de 7 días de la reestimulación in vitro se ensayó la actividad citolítica de las células efectoras resultantes contra células 13-2 diana en un ensayo en pocillos por triplicado. Se muestran los niveles de citólisis a diferentes proporciones de efector con respecto a diana. En todos los casos los errores estándares de las medias de las determinaciones por triplicado fueron <10% del valor de la media.

Figura 14 La inducción de actividad CTL a largo plazo requiere una única inmunización de refuerzo. Los ratones recibieron una única inyección s.c. de 2,5x10^{6} partículas SFV-eE6,7 (Panel A) o dos inyecciones s.c. de 2,5x10^{6} partículas SFV-eE6,7 (Panel B). La actividad CTL se determinó 10 días (cuadrados), 1 mes (círculos) o tres meses (triángulos) después de la (última) inyección de partículas. Después de 7 días de la reestimulación in vitro se ensayó la actividad citolítica de las células efectoras resultantes contra células 13-2 en un ensayo en pocillos por triplicado. Se muestran los niveles de citólisis a diferentes proporciones de efector con respecto a diana. En todos los casos los errores estándares de las medias de las determinaciones por triplicado fueron <10% del valor de la media.

Figura 15 Actividad CTL y frecuencia de los precursores de CTL en ratones inmunizados con partículas SFV-eE6,7 a través de diferentes vías. Los ratones se inmunizaron y se reinmunizaron dos veces con 10^{6} partículas SFV-eE6,7 purificadas s.c. (n=2), i.p. (n=3) o i.v. (n=3). Se aislaron células de bazo una semana después de la última inmunización de refuerzo. Para la actividad CTL, las células del bazo se reestimularon durante 7 días in vitro. Se ensayó la actividad citolítica de las células efectoras resultantes contra células 13-2 diana en un ensayo en pocillos por triplicado. En los tres paneles superiores se muestran los niveles de citólisis a diferentes proporciones de efector con respecto a diana. Para la tinción de tetrámeros, las células de bazo se tiñeron directamente tras el aislamiento con anticuerpo anti-CD8-FITC y un tetrámero MHC de clase I específico de E7 del HPV16 (marcado con PE). En los tres paneles inferiores se muestran los porcentajes en células T CD8^{+}/tetrámero^{+} de los ratones individuales. Las barras rellenas, grises y abiertas en los paneles inferiores corresponden a los niveles de actividad CTL de los símbolos rellenos, grises y abiertos de los paneles superiores.

Figura 16 Protección frente al crecimiento de células tumorales TC-1 en ratones inmunizados con SFV-eE6,7. Los ratones se inmunizaron s.c. y se reinmunizaron dos veces (s.c. e i.p.) con PBS (n=10, círculos abiertos), 10^{6} partículas SFV-LacZ (n=10, cuadrados abiertos) o 10^{6} partículas SFV-E6,7 (n=10, cuadrados rellenos). El crecimiento de los tumores se monitorizó dos veces semanalmente. Se muestran los porcentajes de ratones sin tumores palpables en el tiempo.

Figura 17 Tratamiento terapéutico de tumores TC-1 mediante inmunización con SFV-eE6,7. En el cuello de los ratones se inocularon s.c. 2x10^{4} células TC-1. En varios momentos después de la inoculación del tumor, se inyectaron a los ratones s.c. 5x10^{6} partículas SFV-eE6,7 (tres paneles inferiores). Un grupo de ratones (n=7) se inmunizó en los días 2, 7 y 14 después de la inoculación del tumor, un segundo grupo de ratones (n=14) se inmunizó en los días 7, 14 y 21 después de la inoculación y el último grupo (n=6) se inmunizó en los días 14, 21 y 28 después de la inoculación. Además se incluyeron dos grupos de control a los que se inyectaron PBS (n=9) o bien 5x10^{6} partículas SFV-LacZ (n=5) en los días 2, 7 y 14 después de la inoculación tumoral. El crecimiento de los tumores se monitorizó dos veces semanalmente. Cada línea representa el volumen del tumor de un ratón por separado. Se muestran los resultados combinados de los dos experimentos.

Figura 18 Tratamiento terapéutico de tumores TC-1 mediante la inmunización con SFV-eE6,7. Resultados combinados de la figura 17 que muestran los porcentajes de ratones libres de tumores en el tiempo. En el cuello de los ratones se inocularon s.c. 2x10^{4} TC-1. En varios momentos después de la inoculación de los tumores, se inyectaron a los ratones partículas SFV-eE6,7, tal como se ha descrito en la leyenda de la figura 17. Se muestran los porcentajes de ratones libres de tumores después de la inyección de SFV-eE6,7 en los días 2, 7 y 14 después de la inoculación de tumores (n=7, cuadrados rellenos), después de la inyección de SFV-eE6,7 en los días 7, 14 y 21 (n=14, rombos abiertos) o después de la inyección con PBS (n=9, círculos abiertos) o 5x10^{6} partículas SFV-LacZ (n=5, triángulos abiertos) en los días 2, 7 y 14 después de la inoculación tumoral. El crecimiento de los tumores se monitorizó dos veces semanalmente.

Figura 19 Secuencia nucleotídica de la construcción enhE6,7

Figura 20 Reinducción tumoral de ratones que sobrevivieron a la primera tumoral. El panel de la izquierda representa los porcentajes de ratones libres de tumores en el momento de uno de los experimentos, tal como se muestra y describe en la figura 17. 13 semanas más tarde de la primera inoculación de tumores los ratones se reindujeron con 2x10^{4} TC-1 sin inmunización adicional. El panel de la derecha muestra los porcentajes de ratones libres de tumores tras la reinducción de tumores de ratones inmunizados originalmente con SFV-eE6,7 en los días 2, 7 y 14 (n=7, cuadrados) o con SFV-eE6,7 en los días 7, 14 y 21 (n=4, rombos). Dado que todos los ratones de control habían desarrollado un tumor tras la primera inducción tumoral, 4 ratones de control se incluyeron en experimento de reinducción (círculos). El crecimiento de los tumores se monitorizó dos veces semanalmente.

Figura 21 Tratamiento terapéutico de tumores TC-1 mediante inmunización intravenosa con partículas SFV-eE6,7. Los ratones se inocularon en el cuello s.c. con 2x10^{4} TC-1. A diferentes momentos después de la inoculación de tumores a los ratones se les inyectaron i.v. 5x10^{6} partículas SFV-eE6,7 o PBS. Los ratones se inmunizaron en los días 7, 14 y 21 (n=7; panel medio) después de la inoculación de tumores en los días 14, 21 y 28 (n=7,panel derecho) después de la inoculación de tumores. Además, se incluyó un grupo de control con tampón (PBS) (n=5, panel izquierdo). El crecimiento de los tumores se monitorizó dos veces semanalmente. Cada línea representa el volumen del tumor de un ratón por separado.

Figura 22 Tratamiento terapéutico de tumores TC-1 mediante inmunización intravenosa con cantidades decrecientes de partículas SFV-eE6,7. Los ratones se inocularon en el cuello s.c. con 2x10^{4} TC-1. A diferentes momentos después de la inoculación de tumores a los ratones se les inyectaron i.v. 5x10^{6} partículas SFV-eE6,7 (n=7; panel inferior izquierdo), 5x10^{5} partículas SFV-eE6,7 (n=7; panel inferior medio), 5x10^{4} partículas SFV-eE6,7 (n=7; panel inferior derecho) o PBS (n=5, panel superior) a los 7, 14 y 21 días después de la inoculación. El crecimiento de los tumores se monitorizó dos veces semanalmente. Cada línea representa el volumen del tumor de un ratón por separado.

<110> Rijksuniversiteit Groningen

\hskip1cm Regts, Djoeke G.

\hskip1cm Holtrop, Marijke

\hskip1cm Wilschut, Jan C.

\hskip1cm Daemen, Catharina A.H.H.

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<120> Inmunización genética contra el carcinoma cervical

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<130> P53839PC00

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<140> PCT/NL01/00740

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<141> 2001-10-08

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<150> EP 00203472.6

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<151> 2000-10-06

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<160> 7

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: epítopo de CTL de E7 del HPV16

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<220>

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<221> SITIO

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<222> (1)..(9)

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<400> 1

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\sa{Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe}

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<210> 2

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: epítopo de E1a adenoviral

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<220>

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<221> SITIO

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<222> (1)..(10)

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<400> 2

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\sa{Ser Gly Pro Ser Asn Thr Pro Pro Glu Ile}

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<210> 3

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de E6 hacia adelante

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<220>

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<221> misc_característica

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<222> (1)..(25)

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

gacggatcca aagagaactc caatg

\hfill

25

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<210> 4

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de E7 hacia atrás

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<220>

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<221> misc característica

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<222> (1)..(29)

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

gagaattcgg atccgccatg gtagattat

\hfill

29

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<210> 5

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<211> 3

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: codón de parada

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<220>

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<221> misc característica

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<222> (1)..(3)

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

taa

\hfill

3

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<210> 6

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<211> 3

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: codón modificado

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<220>

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<221> misc_característica

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<222> (1)..(3)

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

gaa

\hfill

3

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<210> 7

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<211> 939

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia nucleotídica de la construcción enh E6,7

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<220>

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<221> misc_característica

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<222> (1)..(939)

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<400> 7

3

Claims

1. Sistema de vector de Virus del Bosque de Semliki que comprende un ácido nucleico que codifica, como mínimo, un fragmento de polipéptido antigénico de la proteína E6 y/o proteína E7 de un virus del papiloma humano (HPV).

2. Sistema de vector, según la reivindicación 1, en el que dicho fragmento comprende un fragmento de polipéptido antigénico de E6 y un fragmento de polipéptido antigénico de E7.

3. Sistema de vector, según la reivindicación 1 ó 2, en el que a dicho fragmento se le ha privado, como mínimo, parcialmente, de la capacidad de unión a las proteínas pRb y/o P53.

4. Sistema de vector, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que además comprende un elemento potenciador de la traducción.

5. Sistema de vector, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que además comprende un ácido nucleico que codifica una autoproteasa.

6. Sistema de vector, según la reivindicación 5, en el que dicha autoproteasa se obtiene del virus de la fiebre aftosa.

7. Sistema de vector, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que una proteína estructural y una no estructural del Virus del Bosque de Semliki se expresan a partir de, como mínimo, dos moléculas de ácido nucleico independientes.

8. Sistema de vector, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho HPV comprende HPV16 y/o HPV18.

9. Sistema de vector, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho ácido nucleico también codifica un gen de citoquina o un fragmento funcional del mismo.

10. Sistema de vector, según la reivindicación 9, en el que dicha citoquina comprende GM-CSF o IL12.

11. Célula que comprende el sistema de vector, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Sistema de vector, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o célula, según la reivindicación 11, para su utilización como medicamento.

13. Utilización de un sistema de vector, según la reivindicación 12, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer cervical.

14. Utilización, según la reivindicación 12 ó 13, en la que dicho medicamento es una vacuna.

15. Medicamento que comprende un sistema de vector, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o una célula, según la reivindicación 11.

16. Medicamento, según la reivindicación 15, para el tratamiento o prevención del cáncer cervical.