ES2229528T3 - Composicion antitumoral a base de polipetido inmunogeno de localizacion celular modificada. - Google Patents
Composicion antitumoral a base de polipetido inmunogeno de localizacion celular modificada.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a una composición antitumoral que comprende como agente terapéutico uno o varios polipéptidos inmunogénicos, de os cuales al menos uno está modificado para presentar una localización celular diferente de su localización nativa. La invención se refiere también a una composición a base de vector recombinante que expresa dicho polipéptido inmunogénico. La invención se refiere también a un vector recombinante que comprende al menos las secuencias que codifican un polipéptido inmunogénico originario de una región precoz y/o tardía de un papilomavirus modificado en su localización así como una partícula viral que comprende dicho vector. La invención se refiere finalmente, a la utilización terapéutica de la composición del vector recombinante y de la partícula viral según la invención.
Description
Composición antitumoral a base de polipéptido
inmunógeno de localización celular modificada.
La presente invención tiene por objeto una
composición antitumoral que comprende, como agente terapéutico o
profiláctico, al menos un vector recombinante que contiene las
secuencias que codifican un polipéptido inmunógeno modificado a fin
de presentar una localización membránica en la superficie de las
células en las que se expresa, diferente de su localización nativa.
La presente invención se refiere asimismo a una composición
antitumoral que comprende dicho polipéptido inmunógeno. Tal
composición está destinada más particularmente al tratamiento o a
la prevención de lesiones asociadas a los papilomavirus.
Se admite generalmente que el cáncer es una
enfermedad que resulta de una pérdida de control de la
multiplicación celular. Sus causas pueden ser múltiples y debidas
especialmente a una disfunción de los genes celulares (por ejemplo,
activación mediante mutación somática de genes potencialmente
oncogénicos; desregulación de la expresión; inhibición de la
expresión de genes supresores de tumores), o a la expresión no
deseada de los genes víricos.
En el ser humano, los papilomavirus (HPV) se
asocian a patologías tales como una infección benigna de la piel,
verrugas, hasta tumores malignos. Entre los 75 tipos de HPV
identificados hasta ahora, 20 aislados distintos son altamente
específicos de los conductos genitales, y 5 de ellos
(HPV-16 y 18, y, en menor grado, los
HPV-31, 33 y 45) están claramente asociados con el
cáncer de cuello uterino y de las vías bajas. Toda una serie de
estudios demuestra el papel transformador de estos virus, su
integración específica en el genoma de células neoplásicas, su
actividad génica en las células cancerígenas y la importancia de la
expresión de algunos genes víricos en el mantenimiento del fenotipo
maligno de las células neoplásicas HPV positivas (Monsenego, J.
Impact Medecin, 11 de marzo de 1994).
De manera general, los papilomavirus son virus
con ADN que posee un genoma circular de aproximadamente 7900 pares
de bases rodeado por una cápsida proteica. Se ha identificado un
cierto número de tipos de papilomavirus, especialmente bovinos
(BPV) y humanos (HPV) (Pfister, 1987, en The papoviridae: The
Papillomaviruses, edición Salzman y Howley, Plenum Press, Nueva
York, p. 1-38). Sus genomas comprenden una región
precoz que contiene los cuadros de lectura E1, E2, E4, E5, E6 y E7,
y una región tardía que codifica las proteínas de cápsida
L1 y L2.
L1 y L2.
Las proteínas precoces tienen la capacidad de
unir el ADN, y se encuentran de manera predominante en el núcleo.
Los productos de expresión E1 y E2 regulan la replicación vírica y
la expresión de los genes víricos, mientras que los de las regiones
E5, E6 y E7 están implicados en los procesos de transformación
oncogénica de las células infectadas. Para ello, se ha demostrado
experimentalmente que la proteína E5 de BPV-1 puede
transformar células in vitro (Schlegel et al., 1986,
Science, 233, 464-467). Se ha demostrado el
poder transformador del E7 para HPV-16 y
HPV-18 (Kanda et al., 1988, J. Virol.
62, 610-613; Vousden et al., 1988,
Oncogene Res., 3, 1-9; Bedell et al.,
1987, J. Virol. 61, 3635-3640), y se ha
correlacionado con su capacidad en unir el producto del gen del
retinoblastoma (Rb) (Munger et al., 1989, EMBO J. 8,
4099-4105; Heck et al., 1992, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89, 4442-4446). Por otra
parte, Crook et al. (1991, Cell 67,
547-556) han demostrado que el antígeno E6 del
HPV-16 y 18 puede complejar el producto del gen p53,
lo que explica su papel predominante en la transformación
celular.
Las patologías asociadas a los virus HPV plantean
un problema terapéutico por el hecho de su naturaleza persistente y
recurrente. Aunque los enfoques clásicos son la cirugía y la
quimioterapia, ahora se considera la inmunoterapia para el
tratamiento de estas enfermedades. El candidato ideal como vacuna
debe, a título preventivo (inmunoprofilaxis), impedir que la
infección se establezca de forma duradera y se propague a los
tejidos vecinos, y, a título curativo (inmunoterapia), debe reducir
la evolución tumoral en los pacientes infectados. Se ha propuesto
hasta ahora utilizar los antígenos de cápsida para inducir la
producción de anticuerpos contra los epítopos localizados en la
superficie de las partículas víricas, y las proteínas precoces para
establecer la inmunidad celular frente a las células infectadas
después de la integración del ADN vírico.
A este respecto, la patente europea EP 0.462.187
describe un enfoque terapéutico mediante administración de poxvirus
que expresan los genes precoces de los papilomavirus. El enfoque de
vacunación descrito en el documento WO 93/02184 se basa en la
utilización de los antígenos de cápsida como agentes inmunógenos y
especialmente como partículas víricas vacías de ADN (VLP del inglés
partículas similares a virus) reconstituidas in vitro. La
solicitud francesa 96/09584 divulga una composición que asocia el
efecto preventivo proporcionado por los polipéptidos precoces y el
efecto curativo conferido por los polipéptidos tardíos de los
papilomavirus. Sin embargo, hasta ahora se han utilizado las
proteínas víricas, eventualmente mutadas a fin de eliminar su
eficacia transformadora, pero no obstante nativas desde el punto de
vista de su localización celular.
Se puede igualmente citar la solicitud
internacional de patente publicada con el número WO 94/21680 que
describe vectores que comprenden secuencias que codifican un
polipéptido inmunógeno fusionado con una secuencia señal del
retículo endoplásmico, y sus utilizaciones en composiciones para el
tratamiento de cánceres y de infecciones víricas, interviniendo la
secuencia señal para permitir el anclaje de los polipéptidos
quiméricos en la membrana del retículo endoplásmico.
La presente invención propone la utilización de
las proteínas inmunógenas, cuya localización ha sido modificada con
el objeto de mejorar su accesibilidad al sistema inmunitario del
hospedante a fin de mejorar o estimular una respuesta inmunitaria
atendiendo al tumor o al cáncer a tratar, que sea específica o no y
de tipo humoral (producción de anticuerpos) o celular (respuesta
citotóxica CTL).
Se han modificado ahora los antígenos nucleares
E6 y E7 del HPV-6 mediante introducción de
secuencias de anclaje y de secreción apropiadas a fin de
conferirles una presentación transmembránica. El cambio de
localización tiene un efecto beneficioso sobre la respuesta
inmunitaria, que se traduce por una actividad antitumoral superior
en los animales tratados con un virus de la viruela vacuna que
coexpresa los antígenos E6 y E7 membránicos y la
IL-2 humana, comparado con los animales que han
recibido un virus equivalente que produce los antígenos nucleares.
El objeto de la presente invención es poner a disposición del
público composiciones antitumorales más eficaces que las
composiciones de la técnica anterior, para inhibir al menos
parcialmente el establecimiento o la progresión de un tumor o un
cáncer. Una aplicación particularmente útil es el tratamiento de
las infecciones por HPV y más particularmente de patologías graves
tales como el cáncer de cuello uterino.
Es por ello que la presente invención tiene por
objeto una composición antitumoral que comprende, como agente
terapéutico o profiláctico, al menos un vector recombinante que
contiene las secuencias que codifican uno o varios polipéptidos
inmunógenos, presentando naturalmente al menos uno de dichos
polipéptidos una localización no membránica y estando modificado
por una inserción de una secuencia de anclaje membránica y, en el
caso de que el polipéptido inmunógeno nativo no la tenga, de una
secuencia de secreción, a fin de presentar una localización
membránica en la superficie de las células en las que se expresa,
presentando dicho polipéptido inmunógeno un grado de similitud
superior a 70% con todo o parte de un polipéptido codificado por
una región precoz y/o tardía de un papilomavirus.
En el sentido de la presente invención, la
expresión "polipéptido inmunógeno" designa un polipéptido que
no encuentra su equivalente en las células normales. Un ejemplo
preferido está constituido por un antígeno específico de tumores.
Como ilustración, se pueden citar los antígenos celulares cuya
expresión aparece durante el periodo fetoembrionario y se reduce
desde el parto hasta su desaparición; los antígenos que se expresan
normalmente en un nivel muy bajo y que, expresados en un nivel
fuerte, se vuelven característicos de un tumor; los antígenos
celulares cuya estructura o conformación se modifica; o también los
antígenos no celulares, particularmente víricos que derivan de un
virus oncogénico. Por ejemplo, se puede tratar de productos de
expresión de los genes BRCA-1 (Miki et al.,
1994, Science 226, 66-71),
BRCA-2 (Wooster et al., 1995, Nature
378, 789-792), MUC-1
(Hareuveni et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87, 9498-9502), CEA, etc., en los que están
implicadas algunas mutaciones o la sobrexpresión en el desarrollo
cancerígeno. Por lo que respecta a los antígenos víricos, se pueden
citar más particularmente los productos de expresión de los genes
precoces o tardíos de los papilomavirus, EBNA-1 del
virus Epstein Barr, los antígenos de los virus HTLV (virus de
linfocitos T humanos) I y II, o los virus de las hepatitis B y C.
Los antígenos específicos de tumores se describen ampliamente en la
bibliografía accesible para el experto en la técnica.
La característica esencial del polipéptido para
uso en la presente invención es presentar una localización
diferente de su localización nativa. Los mecanismos de transporte y
las señales implicadas se describen en los documentos de biología
celular (véase, por ejemplo, Molecular Biology of the Cell, tercera
ed., Garland Publishing Inc., NY y Londres). Brevemente, la gran
mayoría de los polipéptidos se sintetiza en ribosomas libres en el
citosol, en el que ejercen su actividad. Sin embargo, algunos
polipéptidos tienen un destino celular diferente, generalmente
determinado por la presencia de señales peptídicas apropiadas, y
deben ser transportados hasta ellas. Así, los polipéptidos
destinados a ser exportados hacia la membrana plasmática, o
segregados en el exterior de la célula, se sintetizan mediante
ribosomas asociados al retículo endoplásmico (RE), generalmente en
forma de precursores que tienen en su extremo aminoterminal una
secuencia de secreción (o péptido señal) que inicia su paso al RE.
Después, se elimina mediante una endopeptidasa específica para dar
el polipéptido maduro. Una secuencia de secreción contiene
habitualmente 15 a 35 aminoácidos esencialmente hidrofobos. No
existe secuencia consensual, y parece que la estructura secundaria
es la que determina el reconocimiento mediante la endopeptidasa.
Sin embargo, ruptura proteólica tiene lugar lo más frecuentemente
después un residuo glicina, serina o alanina.
Las proteínas membránicas contienen generalmente
una secuencia de anclaje de naturaleza fuertemente hidrófoba que
queda insertada en la membrana plásmica. El polipéptido puede ser
transmembránico con uno de sus extremos expuesto en el exterior de
la célula, atravesando la secuencia de anclaje la membrana y el otro
extremo del lado citosólico. En la mayoría de los casos, la cadena
polipeptídica imbricada en la doble capa lipídica de la membrana
tiene una conformación en hélice \alpha (véase, por ejemplo,
Branden y Tooze, 1991, en Introduction to Protein Structure, p.
202-214, NY Garland).
En cuanto a la localización nuclear, se puede
conferida por la presencia de una secuencia corta llamada de
localización nuclear (NLS) compuesta principalmente de restos
cargados positivamente, tales como lisina y arginina. A título de
ejemplos, se pueden citar las señales de translocación nuclear
KRKKRK y RKRRKR presentes en los polipéptidos L1 y L2 de HPV (Zhou
et al., 1991, Virology 185, 625-632).
Sin embargo, algunos polipéptidos que ejercen su función en el seno
del núcleo no poseen secuencia NLS típica. Es el caso de los
antígenos E6 y E7 del papilomavirus.
El polipéptido inmunógeno comprendido en la
composición según la invención puede resultar de la introducción
y/o la eliminación de señales de localización apropiadas en el seno
de un polipéptido nativo, de un fragmento de éste, de una quimera
que contiene secuencias de orígenes diferentes o de una variante
(eliminación, inserción y/o sustitución de uno o varios
aminoácidos). De manera más particular, su secuencia de aminoácidos
presenta un grado de similitud, con todo o parte de la secuencia
del polipéptido nativo del que deriva, superior a 70%,
ventajosamente superior a 80% y, preferentemente, superior a 90%. El
grado de similitud se puede calcular fácilmente con la ayuda de un
programa informático apropiado, o alineando las secuencias a fin de
obtener el grado máximo de homología y contando el número de
posiciones en las que los aminoácidos de las dos secuencias son
idénticos con relación al numero total de posiciones.
El experto en la técnica conoce las señales que
permiten el cambio de presentación celular de un polipéptido. En el
caso en el que se desee que se segregue el polipéptido inmunógeno,
la adición de una secuencia de secreción en su extremo aminoterminal
permitirá su transporte vía el RE hacia el exterior de la célula
hospedante. La inserción tiene lugar con preferencia inmediatamente
en dirección 3' del codón iniciador de la traducción. En el ámbito
de la presente invención, puede ser ventajoso mutar/eliminar todo o
una parte de los restos que determinan la localización nativa, para
evitar las interferencias. Por ejemplo, si el polipéptido nativo
tiene un destino membránico, ya tiene una secuencia de secreción y
se procederá eventualmente a la mutación o eliminación de la
secuencia de anclaje hidrófoba. Además, la inactivación (por
mutación/eliminación) de las señales nativas puede permitir una
localización citoplásmica. La presentación citoplásmica de un
péptido inmunógeno que presenta normalmente una localización
celular diferente (por ejemplo, nuclear, membránica, segregada,
etc.) puede favorecer la presentación peptídica mediada por los
antígenos de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad y la
respuesta CTL in vivo (Tobery y Siliciano, 1997, J. Exp.
Med. 5, 909-920). Otro modo de realización
factible consiste en fusionar el polipéptido inmunógeno con la
ubiquitina igualmente con el objetivo de estimular una respuesta
CTL potente.
La composición según la invención comprende al
menos un vector recombinante que contiene las secuencias que
codifican un polipéptido inmunógeno modificado a fin de presentar
una localización membránica en la superficie de las células en las
que se expresa, mediante inserción de una secuencia de anclaje
membránica y, en el caso en el que el polipéptido nativo no la
tenga, de una secuencia de secreción. El sitio de inserción
preferido de la secuencia de secreción es el extremo
N-terminal, según se indica anteriormente, y el de
la secuencia de anclaje membránica es el extremo
C-terminal, por ejemplo inmediatamente en dirección
5' del codón de finalización. En este contexto, puede ser
igualmente ventajoso proceder a la mutación/eliminación de todo o
parte de las señales de localización nativas (por ejemplo,
secuencia NLS) para no interferir con la nueva localización.
La elección de la señal de localización
susceptible de ser utilizada en el ámbito de la presente invención
es amplia. Puede derivar de toda proteína que tenga un origen
eucariota o no (virus, parásito, hongo, etc.) desde el momento en
que sea reconocida por la célula a tratar. Puede ser natural o
sintética, heteróloga u homóloga frente a esta última. Puede
igualmente tener una o varias modificaciones con relación a la señal
de la que deriva, con tal de que no
\hbox{afecte(n)}a su función. A título indicativo, se prefiere recurrir a las secuencias de secreción y/o de anclaje membránica de la glicoproteína de la rabia, de la glicoproteína env del virus del VIH, o de la proteína F del virus de la rubéola. En el caso en el que la modificación del polipéptido inmunógeno haga intervenir varias señales de localización (por ejemplo, secuencia de secreción y de anclaje membránica), estas pueden tener un origen común o diferente.
Es igualmente posible utilizar señales de
localización que se dirijan a un compartimento celular particular.
Se puede citar especialmente una secuencia consenso de endocitosis
(por ejemplo, la presente en la región C-terminal de
las cadenas pesadas de inmunoglobulina IgG1 de secuencia IPNYRNM;
Kaisho et al., 1997, Science 276,
412-414), o una secuencia que permita dirigirse a la
membrana del aparato de Golgi (Mochamer y Rose, 1987, J. Cell Biol.
105, 1205-1214; Mochamer, 1993, Curr. Opin.
Cell Biol. 5, 606-612). Se puede contemplar
particularmente el uso de secuencias derivadas de la glicoproteína
E1 de Coronavirus divulgadas en la base de datos
Swiss-Prot con el numero de accesión P11222. Este
tipo de secuencia se puede incorporar en el extremo
C-terminal del polipéptido inmunógeno.
Por otra parte, la modificación de la
localización celular se puede realizar mediante toda técnica
convencional, especialmente mediante mutagénesis dirigida, ligación
de señales exógenas o PCR.
Según un modo de realización preferido, una
composición antitumoral según la invención se destina para tratar o
prevenir las infecciones con papilomavirus y los trastornos
resultantes de las mismas, en particular las displasias del cuello
de bajo grado y el cáncer de cuello uterino. La composición
antitumoral según la invención comprende al menos un polipéptido
inmunógeno originario de una región precoz y/o tardía de un
papilomavirus, especialmente de un virus de riesgo, tal como
HPV-16, 18, 31, 33 o también 45.
Conforme a los objetivos perseguidos por la
presente invención, se puede utilizar uno cualquiera o varios
polipéptidos inmunógenos de papilomavirus. Como se recuerda
anteriormente, su genoma codifica 8 polipéptidos, dos polipéptidos
tardíos L1 y L2 que componen la cápsida vírica, y 6 polipéptidos
precoces (E1, E2, E4, E5, E6 y E7) implicados en la regulación, el
mantenimiento del genoma vírico y la transformación de las células
infectadas.
Tratándose de un polipéptido inmunógeno de tipo
precoz, se elige ventajosamente utilizar un polipéptido E6 o E7,
modificado especialmente a fin de presentar una localización
membránica. Habiéndose hecho las observaciones anteriores sobre el
poder transformador, se recurre preferentemente a una variante no
oncogénica, mutada en el nivel de la región implicada en el proceso
de transformación celular. Tales variantes se describen en la
bibliografía (Munger et al., 1992, EMBO J. 8,
4099-4105; Crook et al., 1991, Cell
67, 547-556; Heck et al., 1992, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89, 4442-4446; Phelps
et al., 1992, J. Virol. 66,
2418-2427). Un polipéptido inmunógeno que conviene
particularmente a los fines de la presente invención es el antígeno
E6 del HPV-16 eliminado de los restos 111 a 115
(+1, que representa el primer aminoácido del antígeno vírico nativo)
y fusionado a las señales de secreción y de anclaje de la proteína
F del virus de la rubéola (SEC ID nº: 1). Se puede igualmente
utilizar el antígeno E7 de HPV-16 eliminado de los
restos 22 a 25 y fusionado a las secuencias de anclaje y de
secreción de la glicoproteína de la rabia (SEC ID nº: 2).
La composición antitumoral según la invención
puede igualmente comprender un polipéptido inmunógeno originario de
la región tardía de un papilomavirus, que deriva del L1 o L2.
Bien entendido, la composición antitumoral según
la invención puede comprender varios polipéptidos inmunógenos, de
los cuales al menos uno presenta una localización celular diferente
de su localización nativa. Se puede citar, como ilustración, una
composición que asocia varios polipéptidos derivados del
papilomavirus, que pueden tener un origen común o diferente (por
ejemplo HPV-16 y 18 con el objetivo de ampliar el
espectro de acción). Una composición que combina varios polipéptidos
de origen precoz permitirá mejorar el efecto terapéutico. La
combinación de los polipéptidos derivados de L1 y L2 podrían tener
un efecto beneficioso sobre las propiedades preventivas de la
composición. Finalmente, una composición que conviene muy
particularmente a los objetivos perseguidos por la presente
invención comprende al menos un polipéptido precoz y al menos un
polipéptido tardío de papilomavirus, con el fin de combinar el
efecto preventivo y curativo. Según un modo preferido, al menos uno
de los polipéptidos inmunógenos de origen precoz se modifica a fin
de presentar una localización membránica, mediante adición de
secuencias de secreción y de anclaje tales como las citadas
anteriormente.
A este respecto, una composición preferida según
la invención comprende:
(1) un polipéptido inmunógeno que tiene una
secuencia homóloga o idéntica a la que se muestra en la SEC ID nº:
1,
(2) un polipéptido inmunógeno que tiene una
secuencia homóloga o idéntica a la que se muestra en la SEC ID nº:
2,
(3) un polipéptido inmunógeno que tiene una
secuencia homóloga o idéntica a la que se muestra en la SEC ID nº:
1 y un polipéptido inmunógeno que tiene una secuencia homóloga o
idéntica a la que se muestra en la SEC ID nº: 2,
(4) un polipéptido inmunógeno que tiene una
secuencia homóloga o idéntica a la que se muestra en la SEC ID nº:
1, siendo un polipéptido inmunógeno la proteína L1 de un
papilomavirus y/o siendo un polipéptido inmunógeno la proteína L2 de
un papilomavirus,
(5) un polipéptido inmunógeno que tiene una
secuencia homóloga o idéntica a la que se muestra en la SEC ID nº:
2, siendo un polipéptido inmunógeno la proteína L1 de un
papilomavirus y/o siendo un polipéptido inmunógeno la proteína L2 de
un papilomavirus, o
(6) un polipéptido inmunógeno que tiene una
secuencia homóloga o idéntica a la que se muestra en la SEC ID nº:
1, un polipéptido inmunógeno que tiene una secuencia homóloga o
idéntica a la que se muestra en la SEC ID nº: 2, siendo un
polipéptido inmunógeno la proteína L1 de un papilomavirus y/o siendo
un polipéptido inmunógeno la proteína L2 de un papilomavirus.
El término "homóloga" hace referencia a un
grado de identidad con dicha secuencia superior a 70%,
ventajosamente superior a 80%, preferentemente superior a 90% y, de
manera muy preferida, superior a 95%.
Ventajosamente, una composición antitumoral según
la invención puede comprender además al menos un compuesto que
mejora su efecto antitumoral, con el objeto de aumentar la
intensidad de la respuesta inmunitaria específicamente o no.
Independientemente de los adyuvantes, los inmunoestimulantes
representan compuestos particularmente preferidos. Por
"inmunoestimulantes" se entiende un compuesto que tiene la
capacidad de reforzar una respuesta inmunitaria humoral a fin de
ampliar la producción de anticuerpos dirigidos contra el
polipéptido inmunógeno o, por mediación celular, a fin de iniciar
una respuesta citotóxica significativa contra las células tumorales
o infectadas. A título indicativo, la inmunoestimulación se puede
evaluar mediante un modelo animal cancerígeno comparando el
porcentaje de rechazo en un animal tratado con el polipéptido
inmunógeno, en presencia y en ausencia del inmunoestimulante. De
manera más general, los medios para poner en evidencia una
inmunoestimulación se indican en Roitt (Immunology, 4ª
edición, Moby Ltd). Una de las ventajas de tal composición es que
combina la inmunidad específica inducida por el polipéptido
inmunógeno y la inmunidad no específica inducida por la molécula
inmunoestimulante.
En el ámbito de la presente invención, se puede
utilizar un inmunoestimulante nativo, especialmente de origen
humano, una parte de éste, una quimera que proviene de la fusión de
secuencias de orígenes diversos, o también un mutante, con la
condición sin embargo de conservar la función inmunoestimulante.
Entre todas las moléculas factibles, se prefiere utilizar un
inmunoestimulante elegido entre la interleuquina-2,
la interleuquina-7, la
inteleuquina-12 y las moléculas de la coadhesión
B7.1 y B7.2. Se indica que la interleuquina-2 y la
molécula B7.1 son particularmente preferidos.
De manera general, los polipéptidos inmunógenos e
inmunoestimulantes se pueden producir mediante los métodos
convencionales de síntesis química, o bien mediante técnicas del
ADN recombinante (véase, por ejemplo, Maniatis et al., 1989,
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY). Más particularmente, un procedimiento de
preparación comprende cultivar una célula transformada mediante un
fragmento de ADN que codifica el polipéptido en cuestión para
generar una célula productora, y recolectar dicho polipéptido a
partir del cultivo. La célula productora puede ser, de cualquier
origen y sin limitación, una bacteria, una levadura o bien una
célula de mamífero, en la medida en la que el fragmento de ADN
considerado se integre en su genoma o bien se integre en un vector
de expresión apropiado. Bien entendido, el fragmento de ADN se pone
bajo control de señales de transcripción y de traducción que
permiten su expresión en la célula productora. Se conocen los
vectores de expresión y las señales de control por el experto en la
técnica.
La presente invención se dirige así a una
composición antitumoral que comprende a título de agente
terapéutico o profiláctico al menos un vector recombinante que
comprende las secuencias que codifican uno o varios polipéptidos
inmunógenos según la presente invención, y, eventualmente, un
compuesto que mejora el efecto antitumoral. Este tipo de
composición presenta la ventaja de una producción poco costosa y de
una gran estabilidad en diversas condiciones medioambientales. En
particular, las condiciones de conservación son menos restrictivas.
Los polipéptidos tienen las características tales como se definen
aquí anteriormente.
Las secuencias que codifican el polipéptido
inmunógeno o que mejoran el efecto antitumoral se pueden obtener
mediante clonación, PCR (reacción en cadena de polimerasa) o
mediante síntesis química según las técnicas convencionales
comúnmente en uso y a partir de datos de la bibliografía.
Refiriéndose al modo de realización preferido, las secuencias que
codifican los polipéptidos de papilomavirus se pueden aislar a
partir de células de papilomavirus positivas obtenidas de pacientes
o de colecciones. La inserción de señales de localización
apropiadas se puede realizar mediante las técnicas de biología
molecular. Las secuencias que codifican el inmunoestimulante se
pueden clonar a partir del ADN celular o de los ARN mensajeros de
una célula en la que se expresa. El experto en la técnica es capaz
de generar las sondas o cebadores apropiados a partir de los datos
publicados. Se indica que la secuencia nucleotídica de los genomas
HPV-16 y 18 se divulga en Genbank con los números
de accesión K02718 y X05015 respectivamente. La secuencia del gen
humano IL-2 se describe en la patente francesa 85
09480 y en Taniguchi et al. (1983, Nature 302,
305-311), y la que codifica el antígeno B7.1 en
Freeman et al. (1989, J. of Immunology 143,
2714-2722).
Un vector preferido en el ámbito de la invención
puede ser un poxvirus. Se puede utilizar un vector plásmico o
vírico, especialmente un adenovirus, un retrovirus, un virus del
herpes, o un virus asociado a adenovirus. Ventajosamente, se tratará
de un vector no integrante y de una virulencia atenuada. Tales
vectores así como sus técnicas de preparación son conocidos por el
experto en la técnica.
En el caso en el que se utilice un vector
adenovírico, se recurre preferentemente a un vector no replicativo
por eliminación de regiones esenciales para la replicación y,
especialmente, de la mayoría de la región E1, a fin de evitar su
propagación en el seno del organismo hospedante o del
medioambiente. Es evidente que se puede modificar o eliminar otras
regiones del genoma adenovírico, especialmente en el seno de las
regiones E2, E4 y/o L1-L5, en la medida en la que
las funciones esenciales defectuosas se complementen en
trans. Para ilustrar estos modos de realización, se puede
citar la mutación termosensible que afecta al gen DBP (del inglés
Proteína de Unión a ADN) de la región E2A (Ensinger et al.,
1972, J. Virol. 10, 328-339). Igualmente es
factible una eliminación parcial de la región E4, con la excepción
de las secuencias que codifican los cuadros de lectura abiertos
(ORF) 6 y 7 (Ketner et al., 1989, Nucleic Acids Res.
17, 3037-3048). Otra posibilidad es la
eliminación total de la unidad transcripcional E4. Por otra parte,
el vector adenovírico según la invención puede ser desprovisto de
todo o de una parte de la región no esencial E3. Según esta
alternativa, puede ser interesante conservar sin embargo las
secuencias E3 que codifican los polipéptidos que permiten el escape
al sistema inmunitario del hospedante, especialmente la
glicoproteína gp19k (Gooding et al. 1990, Critical Review of
Immunology 10, 53-71). Un vector adenovírico
preferido según la invención retendrá al mínimo las secuencias
esenciales al encapsidamiento, a saber, las ITR (repeticiones
terminales invertidas) 5' y 3' y la región de encapsidamiento. Se
indica que puede derivar de un adenovirus humano o animal, y de un
serotipo cualquiera. Los adenovirus humanos del subgrupo C y
especialmente los adenovirus 2 (Ad2) y 5 (Ad5) convienen muy
particularmente a la realización de la invención. Los diferentes
vectores adenovíricos así como sus técnicas de preparación son
convencionales y se describen en Graham y Prevect (1991, en
Methods in Molecular Biology, vol. 7, p.
109-128; Ed: E.J. Murey, The Human Press Inc.) y en
la solicitud internacional WO 94/28152. Por ejemplo, se puede
generar in vitro en Escherichia coli (E. coli)
mediante ligación o recombinación homóloga (véase, por ejemplo, la
Solicitud Internacional WO 96/17070), o también mediante
recombinación en una línea de complementación.
Si se trata de un retrovirus, se conservan los
LTR (repeticiones terminales largas) y las secuencias de
encapsidamiento (véase, por ejemplo, Naviaux y Verma, 1992, Current
Opinion in Biotechnology 3, 540-547). La
secuencia que codifica el o los polipéptidos inmunógenos se puede
poner bajo control del LTR retrovírico o de un promotor interno
tales como los descritos a continuación. Puede derivar de un
retrovirus de cualquier origen (murino, primate, felino, humano,
etc.), y en particular del MoMuLV (virus de la leucemia murina de
Moloney), MVS (virus del sarcoma murino) o retrovirus murino de
Friend (Fb29). Igualmente puede tener modificaciones, especialmente
a nivel de los LTR (sustitución de la región promotora por un
promotor eucariota) o de la región de encapsidamiento (sustitución
por una región de encapsidamiento heteróloga, por ejemplo de tipo
VL30) (véanse las solicitudes francesa 94 08300 y 97 05203).
Según un modo de realización ventajoso, un vector
recombinante según la invención es un poxvirus y, especialmente, un
poxvirus aviar, tal como el poxvirus del canario, una viruela aviar
o un virus de la viruela vacuna, siendo este último el preferido.
Entre todos los virus de la viruela vacuna factibles en el ámbito de
la presente invención, se elige preferentemente las cepas
Copenhague, Wyeth y Ankara modificada (MVA por virus Ankara
modificado de la viruela vacuna).
Generalmente, el sitio de inserción se elige en
una región no esencial para la replicación, de manera que las
capacidades de replicación y de propagación del virus recombinante
no se alteren. A título indicativo, cuando se utiliza un virus de
la cepa Copenhague, el sitio de inserción preferido es el locus TK,
lo que tiene por efecto inactivar éste y así facilitar la selección
de los recombinantes. Se puede igualmente utilizar el locus K1L. En
cuanto a un virus MVA, la inserción de las secuencias recombinantes
(inmunógenas y inmunoestimulantes) se puede realizar en el seno de
al menos una de las escisiones I a VI, y especialmente II ó III
(Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72,
1031-1038; Sutter et al., 1994, Vaccine
12, 1032-1040). La inserción puede tener
lugar igualmente en una región vírica esencial, como la región D4R,
pudiendo la función defectuosa ser suministrada en trans,
por ejemplo mediante una línea de complementación.
Bien entendido, en el ámbito de la presente
invención las secuencias que codifican el polipéptido inmunógeno o
que mejoran el efecto antitumoral son puestas bajo control de los
elementos necesarios para su expresión en una célula o un organismo
hospedante. Éstos incluyen los elementos de regulación de la
transcripción así como señales de iniciación y de terminación de la
traducción. Entre éstos, el promotor reviste una importancia
particular. De manera general, se recurre a un promotor funcional en
el organismo o en la célula hospedante que se quiere tratar y
adaptar al vector usado. Además, se puede modificar a fin de
contener las secuencias reguladoras, por ejemplo un elemento
activador de la transcripción o de las secuencias que responden a
algunas señales celulares. Con este fin, puede ser ventajoso
utilizar un promotor específico de tejido, porque las lesiones
asociadas a los papilomavirus se localizan al nivel de las vías
genitales, o un promotor que responde a señales específicamente
tumorales (por ejemplo, activado en presencia de factores de
crecimiento generalmente sobreexpresados por células tumorales), a
fin de limitar la expresión solamente a las células tumorales.
Entre los promotores factibles en el ámbito de la
invención, se pueden citar los promotores SV40 (virus del simio
40), HMG
(hidroximetil-glutaril-coenzima A),
TK (timidina quinasa), CMV (citomegalovirus), RSV (virus del
sarcoma de Rous), MLP (promotor tardío principal) adaptado al
vector adenovírico, y el LTR del Mo-MLV (virus de la
leucemia murina de Moloney), más específico de los vectores
retrovíricos. Se prefiere más particularmente el promotor precoz
del citomegalovirus (CMV). Se puede igualmente tratar de un
promotor que estimula la expresión en una célula tumoral o
cancerígena. Se pueden citar especialmente los promotores de los
genes MUC-1 sobreexpresado en los cánceres de mama y
de próstata (Chen et al., 1995, J. Clin. Invest. 96,
2775-2782), de tirosinosis sobreexpresado en los
melanomas (Vile et al., 1993, Cancer Res. 53,
3860-3864) y ERB-2 sobreexpresado
en los cánceres de mama y de páncreas (Harris et al., 1994,
Gene Therapy 1, 170-175). Los promotores en
cuestión se describen en la bibliografía y se pueden clonar a
partir del genoma celular o vírico mediante las técnicas
clásicas.
Tratándose de un vector poxvírico, se recurre a
un promotor pox, por ejemplo 7,5K, H5R, TK, p.28, p.11 o también
K1L del virus de la viruela vacuna. Un promotor sintético conviene
igualmente a la realización de la presente invención (véase, por
ejemplo, Chakrabarti et al., 1997, Biotechniques 23,
1094-1097; Hammond et al., 1997, J.
Virological Methods 66, 135-138, y Kumar y
Boyle, 1990, Virology 179, 151-158). Con
este fin, se trata ventajosamente de un promotor quimera entre un
promotor tardío y un promotor precoz.
Por otra parte, los elementos necesarios para la
expresión pueden igualmente contener secuencias que mejoran la
expresión o el mantenimiento en la célula hospedante (intrón,
secuencia terminadora de la transcripción, sitio de iniciación de la
traducción, etc.). Sin embargo, en el caso de un vector poxvírico,
se evita el uso de intrones.
Una composición según la invención puede
comprender uno o varios vectores recombinantes que expresan las
secuencias correspondientes a los polipéptidos elegidos puestos
bajo el control de elementos independientes o comunes. Según esta
última opción, se puede recurrir a secuencias que permiten iniciar
la traducción de manera interna (IRES) o a fusiones de fase de los
diferentes genes.
Las condiciones generales para la obtención de un
vector recombinante de uso en la presente invención se describen
ampliamente en la técnica anterior. Tratándose de un vector
poxvírico, se puede citar la patente europea EP 83.286 cuyo
contenido se incorpora aquí como referencia. Estas condiciones se
pueden aplicar a otros virus aceptables como vector, que poseen una
región genómica en la que se pueden incorporar los bloques de
expresión. Bien entendido, se pueden insertar en el mismo locus o en
un locus diferente.
Conforme a los objetivos perseguidos por la
presente invención, un vector recombinante puede además comprender
un bloque de expresión de un gen marcador de selección a fin de
facilitar las etapas de aislamiento y de purificación del virus
recombinante. Se puede citar especialmente el gen neo que
confiere resistencia al antibiótico G418, el gen pac de
resistencia a la puromicina, el gen TK del virus del herpes simple
de tipo 1 (HSV-1) que confiere sensibilidad a
algunos análogos de nucleósidos tales como el ganciclovir o el
aciclovir, el gen gpt (xantina guanina fosforibosil
transferasa), los genes bacteriocidas LacZ que codifican la
\beta-galactosidasa y gus A que codifica la
\beta-glucuronidasa. Estos dos últimos
marcadores enzimáticos permiten señalar los virus recombinantes
mediante coloración en presencia de los substratos
X-Gal
(5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido)
y XglcA
(5-bromo-6-cloro-3-indolil-\beta-D-glucurónido),
respectivamente.
Una composición antitumoral preferida está
destinada al tratamiento o a la prevención de una infección o tumor
con papilomavirus, y comprende al menos un virus de la viruela
vacuna de la cepa Copenhague o MVA en el que se insertan:
(1) las secuencias que codifican un polipéptido
inmunógeno que tiene una secuencia homóloga o idéntica a la que se
muestra en la SEC ID nº: 1,
(2) las secuencias que codifican un polipéptido
inmunógeno que tiene una secuencia homóloga o idéntica a la que se
muestra en la SEC ID nº: 2,
(3) las secuencias que codifican un polipéptido
inmunógeno que tiene una secuencia homóloga o idéntica a la que se
muestra en la SEC ID nº: 1, y un polipéptido inmunógeno que tiene
una secuencia homóloga o idéntica a la que se muestra en la SEC ID
nº: 2,
(4) las secuencias que codifican un polipéptido
inmunógeno que tiene una secuencia homóloga o idéntica a la que se
muestra en la SEC ID nº: 1, siendo un polipéptido inmunógeno la
proteína L1 de un papilomavirus y/o siendo un polipéptido
inmunógeno la proteína L2 de un papilomavirus,
(5) las secuencias que codifican un polipéptido
inmunógeno que tiene una secuencia homóloga o idéntica a la que se
muestra en la SEC ID nº: 2, siendo un polipéptido inmunógeno la
proteína L1 de un papilomavirus y/o siendo un polipéptido
inmunógeno la proteína L2 de un papilomavirus, o
(6) las secuencias que codifican un polipéptido
inmunógeno que tiene una secuencia homóloga o idéntica a la que se
muestra en la SEC ID nº: 1, un polipéptido inmunógeno que tiene una
secuencia homóloga o idéntica a la que se muestra en la SEC ID nº:
2, siendo un polipéptido inmunógeno la proteína L1 de un
papilomavirus y/o siendo un polipéptido inmunógeno la proteína L2
de un papilomavirus.
Dicha composición puede igualmente comprender las
secuencias que codifican un inmunoestimulante elegido
preferentemente entre IL-2 ó B7.1. El
inmunoestimulante puede ser llevado por uno de los vectores
recombinantes que permiten la expresión del o de los genes
inmunógenos, o por un vector independiente.
Una composición según la invención se puede
preparar según los procedimientos conocidos en el campo de las
vacunas; y las dosis aplicables pueden variar en un amplio
intervalo. Las dosis están en función especialmente de los
polipéptidos y del vector usados, de la patología a tratar, del
estado del paciente y de otros parámetros que se pueden evaluar por
el médico. Sin embargo, en general, la dosis de virus será de
10^{4} a 10^{13}, ventajosamente de 10^{5} a 10^{12}, y
preferentemente de 10^{5} a 10^{9} unidades formadoras de
colonias (ufc), cuando el agente terapéutico es un vector vírico, y
de 0,05 a 500 mg, ventajosamente de 0,5 a 200 mg, y preferentemente
de 1 a 100 mg, cuando el agente terapéutico es de origen
polipeptídico.
Una composición según la invención se puede
administrar según cualquier vía convencional de administración,
preferentemente sistémica y en particular por vía intramuscular,
intravenosa, intrapulmonar, subcutánea o subepitelial, o bien por
escarificación. En el caso de un tumor accesible, es igualmente
posible recurrir a una inyección directa in situ o en la
proximidad del tumor, o a una aplicación tópica. Como vacuna, una
composición según la invención se puede administrar según las
prácticas corrientes en este campo, por ejemplo en dosis única o
repetida, una o varias veces después de un cierto intervalo. Por el
contrario, en el ámbito de un tratamiento curativo, se puede
administrar frecuentemente durante un periodo suficiente para que
el tratamiento sea eficaz. Cuando el agente terapéutico es un
vector vírico, el virus está preferentemente en forma viva.
Tratándose de un vector vírico, se prefiere usar una cepa atenuada,
tal como la cepa MVA o la cepa Copenhague timidina quinasa
negativa. Finalmente, un vector vírico recombinante se puede
atenuar mediante un tratamiento químico apropiado conocido por el
experto en la técnica. Sin embargo, se puede también considerar la
inyección de un vector recombinante exterminado.
Según un modo de realización preferido, una
composición antitumoral según la invención comprende una cantidad
terapéuticamente eficaz del agente terapéutico, en asociación con
un soporte aceptable desde un punto de vista farmacéutico. El
soporte se elige a fin de permitir su administración mediante
inyección al ser humano o al animal. Igualmente puede comprender un
vehículo, un diluyente y/o un adyuvante, y se puede presentar en
forma líquida o liofilizada. Con este fin, se puede considerar la
asociación de una o varias sustancias susceptibles de mejorar la
eficacia transfeccional y/o la estabilidad del vector. Estas
sustancias están ampliamente documentadas en la bibliografía
accesible al experto en la técnica (véase, por ejemplo, Felgner
et al., 1989, Proc. West. Pharmacol. Soc. 32,
115-121; Hodgson y Solaiman, 1996, Nature
Biotechnology 14, 339-342; Remy et
al., 1994, Bioconjugate Chemistry 5,
647-654). A título ilustrativo pero no limitativo,
se puede tratar de polímeros, de lípidos especialmente catiónicos,
de liposomas, de proteínas nucleares y de lípidos neutros. Una
posible combinación es un vector plásmico asociado a lípidos
catiónicos (DC-Cho1, DOGS, etc.) y lípidos neutros
(DOPE). La composición se puede igualmente asociar a otras
sustancias, especialmente anti-cancerígenas,
pudiendo éstas ser administradas separadamente o de manera
concomitante. El ligando Flt3 es un ejemplo, entre otros (Lynch
et al., 1997, Nature Medicine 3, 625; Brasel et
al., 1996, Blood 88, 2004-2012;
Marakovsky et al., 1996, J. Exp. Med. 184,
1953-1962). Se indica que la composición puede
estar en forma de seudopartículas cuando comprende los polipéptidos
L1 y/o L2.
La presente invención tiene igualmente por objeto
un vector recombinante que comprende al menos las secuencias que
codifican un polipéptido inmunógeno originario de una región precoz
y/o tardía de un papilomavirus, teniendo dicho polipéptido las
características definidas anteriormente. Además, puede contener
otras secuencias de interés, por ejemplo que codifican uno o varios
otros péptidos inmunógenos y/o inmunoestimulantes, tales como se
describen anteriormente.
La elección de un vector según la invención es
amplia. Se puede tratar de un vector plasmídico o vírico, tal como
los citados anteriormente. Un modo de realización preferido
consiste en un vector poxvírico y muy particularmente un virus de la
viruela vacuna de la cepa Copenhague o MVA. Los sitios de inserción
y los elementos necesarios para la expresión de las secuencias de
interés a expresar se pueden elegir entre los mencionados
anteriormente.
Un vector preferido es un virus de la viruela
vacuna de la cepa Copenhague o MVA en el que se insertan:
(1) las secuencias que codifican un polipéptido
inmunógeno que tiene una secuencia homóloga o idéntica a la
mostrada en la SEC ID nº: 1,
(2) las secuencias que codifican un polipéptido
inmunógeno que tiene una secuencia homóloga o idéntica a la
mostrada en la SEC ID nº: 2,
(3) las secuencias que codifican un polipéptido
inmunógeno que tiene una secuencia homóloga o idéntica a la
mostrada en la SEC ID nº: 1, y un polipéptido inmunógeno que tiene
una secuencia homóloga o idéntica a la mostrada en la SEC ID nº:
2,
(4) las secuencias que codifican un polipéptido
inmunógeno que tiene una secuencia homóloga o idéntica a la
mostrada en la SEC ID nº: 1, un polipéptido inmunógeno siendo la
proteína L1 de un papilomavirus y/o siendo un polipéptido inmunógeno
la proteína L2 de un papilomavirus,
(5) las secuencias que codifican un polipéptido
inmunógeno que tiene una secuencia homóloga o idéntica a la
mostrada en la SEC ID nº: 2, un polipéptido inmunógeno siendo la
proteína L1 de un papilomavirus y/o siendo un polipéptido inmunógeno
la proteína L2 de un papilomavirus,
(6) las secuencias que codifican un polipéptido
inmunógeno que tiene una secuencia homóloga o idéntica a la
mostrada en la SEC ID nº: 1, un polipéptido inmunógeno que tiene
una secuencia homóloga o idéntica a la mostrada en la SEC ID nº: 2,
siendo un polipéptido inmunógeno la proteína L1 de un papilomavirus
y/o siendo un polipéptido inmunógeno la proteína L2 de un
papilomavirus.
De manera opcional, igualmente se puede incluir
las secuencias que codifican la IL2 o el polipéptido B7.1.
La presente invención se refiere igualmente a una
partícula vírica preparada a partir de un vector vírico
recombinante según la invención. Tratándose de un vector
adenovírico, las partículas víricas se pueden generar mediante
transfección del vector en una célula de complementación adaptada a
sus deficiencias. Se recurre por ejemplo a la estirpe 293
establecida a partir de células de riñón embrionario humano, que
complementa eficazmente la función E1 (Graham et al., 1977,
J. Gen. Virol. 36, 59-72), la estirpe
A549-E1 (Imler et al., 1996, Gene Therapy
3, 75-84) o una estirpe que permite una doble
complementación (Yeh et al., 1996, J. Virol. 70,
559-565; Krougliak y Graham, 1995, Human Gene
Therapy 6, 1575-1586; Wang et al.,
1995, Gene Therapy 2, 775-783; solicitud
internacional WO 97/04119). Por célula de complementación, se
entiende una célula capaz de complementar en trans un vector
defectuoso para generar una partícula vírica. Dicha célula puede no
complementar ella sola todas las funciones defectuosas del vector, y
en este caso se puede recurrir a un virus auxiliar para una
complementación parcial. La partícula vírica se puede recuperar del
sobrenadante del cultivo, pero igualmente de las células. Uno de los
métodos frecuentemente utilizados consiste en lisar las células
mediante ciclos consecutivos de congelación/descongelación para
recolectar los viriones en el sobrenadante del lisado. Éstos se
pueden amplificar y purificar según las técnicas anteriores
(procedimiento cromatográfico, ultracentrifugación, especialmente a
través de un gradiente de cloruro de cesio, etc.).
Una partícula retrovírica se puede obtener
mediante transfección del vector retrovírico en una estirpe
apropiada, por ejemplo una estirpe capaz de proporcionar en
trans los polipéptidos víricos gag, pol y/o env cuyas
secuencias están eliminadas/son no funcionales en el vector. Tales
estirpes se describen en la bibliografía (PA317, Psi CRIP GP
+
Am-12, etc.).
Am-12, etc.).
Tratándose de un vector poxvírico, las
condiciones generales de obtención de un virus de la viruela
vacuna, capaz de expresar un gen heterólogo, se exponen en la
patente europea EP 83.286 y la solicitud de patente EP 206.920. En
cuanto al virus MVA, se describe más particularmente en Mayr et
al. (1975, Infection 3, 6-14) y Sutter y
Moss (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,
10847-10851). Brevemente, los genes a transferir,
puestos bajo el control de los elementos apropiados para su
expresión in vivo, se insertan en un vector de transferencia
que incluye secuencias víricas a un lado y a otro del sitio de
inserción. Se introduce en células infectadas por un virus de la
viruela vacuna infeccioso. El gen recombinante se integra en el
genoma vírico mediante recombinación homóloga entre las secuencias
homólogas del virus infeccioso y del vector de transferencia.
El vector recombinante o la partícula vírica se
puede eventualmente asociar a una o varias sustancias que mejoran
la eficacia transfeccional y/o la estabilidad del vector ya
citadas.
En el ámbito de la presente invención, dicho
polipéptido inmunógeno se puede anclar en la estructura proteica
que rodea a la partícula vírica (cápsida, envoltorio, etc.).
Los poxvirus son estructuras complejas rodeadas
por múltiples membranas. Se producen dos tipos de partículas
víricas: los viriones maduros intracelulares (IMV) y los viriones
envueltos extracelulares (EEV). La superficie de los IMV está
compuesta de 2 membranas superpuestas, y el envoltorio de los EEV
consiste en 4 membranas que incluyen la membrana plásmica. Conforme
a los objetivos de la presente invención, las secuencias que
codifican el polipéptido inmunógeno se pueden igualmente modificar a
la vista de una inserción en una u otra de las membranas poxvíricas
(IMV o EEV), con el objetivo de mejorar la respuesta inmunitaria.
Según un modo de realización ventajoso, el péptido inmunógeno se
ancla en la membrana externa del envoltorio de una partícula EEV
(Katz et al. 1997, AIDS Res. Hum. Retrov. 13,
1497-1500). Con este fin, las secuencias que
codifican la parte C-terminal de la proteína B5R,
constituyente proteico de dicha membrana externa, se insertan en 3'
de la región codificante del polipéptido inmunógeno justo en
dirección 5' del codón STOP. Un ejemplo muy preferido es una fusión
entre el polipéptido E7 o uno de sus mutantes no oncógenos y los 42
restos C-terminales de la proteína B5R. El efecto
beneficioso sobre la respuesta inmunitaria se puede evaluar mediante
estudios de inmunoprofilaxis y de inmunoterapia según el protocolo
descrito en los ejemplos a continuación que comparan las diferentes
formulaciones (localización nativa, anclaje en la membrana celular,
anclaje en la membrana vírica).
La presente invención se refiere igualmente a una
composición antitumoral caracterizada porque contiene uno o varios
polipéptidos inmunógenos, presentando al menos uno de dichos
polipéptidos las características definidas aquí anteriormente para
las composiciones antitumorales según la presente invención que
comprenden al menos un vector recombinante.
La presente invención se refiere igualmente a la
utilización de una composición antitumoral, de un vector
recombinante o de una partícula vírica según la invención, para la
preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención
del cáncer o de tumores y, particularmente del cáncer de cuello
uterino, de una displasia del cuello de grado bajo o de una
infección con papilomavirus. La utilización preferida es para la
preparación de un medicamento inyectable por vía intramuscular.
Finalmente, se puede citar un método de
tratamiento o de prevención de las patologías citadas aquí arriba,
según el cual se administra a un individuo que necesita de tal
tratamiento una cantidad eficaz desde un punto de vista farmacéutico
de una composición antitumoral, de un vector recombinante o de una
partícula vírica según la invención.
La presente invención se ilustra con referencia a
las figuras siguientes.
La Figura 1 es una representación esquemática de
pTG8042. BRG3 y BRD3 representan los brazos de recombinación
izquierdo y derecho que permiten la inserción al nivel de la zona
de escisión III del virus MVA. El pTG8042 comprende un casete de
expresión del gen de E6 de HPV16 fusionado a la secuencia señal (SF)
y la región transmembránica (TMF) de la proteína F del virus de la
rubéola, dirigido por el promotor 7.5K; un casete de expresión del
gen de IL-2 puesto bajo control del promotor pH5R;
un casete de expresión del gen de E7 de HPV16 fusionado a la
secuencia señal (SR) y la región transmembránica (TMR) de la
glicoproteína rábica, puesto bajo control del promotor p7.5; y un
casete de expresión del gen gusA (uidA) puesto bajo control
del promotor p7.5.
La Figura 2 es una representación esquemática del
vector pTG9936. BRG3 y BRD3 representan los brazos de recombinación
izquierdo y derecho que permiten la inserción al nivel de la zona
de escisión III del genoma de MVA. El pTG9936 contiene el promotor
p4BK1L que dirige la expresión del gen marcador gpt, el
promotor p4BK1L que dirige la expresión del gen L2 de HPV16, el
promotor pH5R que dirige la expresión de la IL-2, el
promotor p11k7.5 que dirige la expresión del gen L1 de HPV16, el
promotor p7.5 que dirige la expresión del gen E7 de HPV16 fusionado
a la secuencia señal (SR) y la región transmembránica (TMR) de la
glicoproteína del virus de la rabia, seguido de una secuencia IRES,
y del gen E6 de HPV16 fusionado a la secuencia señal (SF) y la
región transmembránica (TMF) de la proteína F del virus de la
rubéola.
La Figura 3 ilustra el ensayo N121 que presenta
el porcentaje de supervivientes en función del tiempo (en días) de
los animales vacunados antes de la prueba tumoral con el virus
MVATG8042, MVATG6090, MVAN33 o con PBS.
La Figura 4 representa el porcentaje de animales
sin tumores en función del tiempo (en días) después de la
administración de 10^{7}, 10^{6} ó 10^{5} pfu (pfu = unidades
formadoras de colonias) de los virus MVAN33 o MVATG8042 (ensayo
N127).
La Figura 5 ilustra el ensayo N134 que representa
el porcentaje de supervivientes en función del tiempo (en días) de
los animales tratados mediante el virus MVATG8042 o mediante el
control MVAN33, por escarificación, vía subcutánea (SC),
intraperitoneal (IP) e intramuscular (IM).
La presente invención se describe de forma más
completa, con la ayuda de los ejemplos siguientes, sin estar
limitada a los mismos.
Las construcciones descritas a continuación se
realizan según las técnicas generales de ingeniería genética y de
clonación molecular, detalladas en Maniatis et al., (1989,
supra), o según las recomendaciones del fabricante cuando se
utilice un kit comercial. La mutagénesis dirigida in vitro
mediante oligonucleótidos sintéticos se efectúa con la ayuda del
kit distribuido por Amersham. Las técnicas de amplificación por PCR
son conocidas por el experto en la técnica (véase, por ejemplo, PCR
Protocols-A guide to methods and applications, 1990,
publicado por Innis, Gelfand, Sninsky y White, Academic Press Inc).
Haciendo referencia a la reparación de los sitios de restricción, la
técnica utilizada consiste en un llenado de los extremos 5'
sobresalientes con la ayuda del gran fragmento del ADN polimerasa I
de E. coli (Klenow). En lo que se refiere a las etapas de
clonación, los bacteriófagos M13 recombinantes se multiplican sobre
la cepa de E. coli NM522 (Stratag\thetane) en un medio
mínimo gelificado (agar 7,5%), o en un medio rico LBM líquido. Los
plásmidos recombinantes que contienen el gen de resistencia a la
ampicilina se replican en las cepas de E.coli C600
(Stratag\thetane), BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol.
166, 557-580) y NM522 en medio gelificado o
líquido suplementado con 100 \mug/ml de antibiótico. Se utiliza
preferentemente la cepa BJ5183 cuando la clonación se efectúa
mediante recombinación homóloga (Bubeck et al., 1993,
Nucleic Acid Res. 21, 3601-3602).
La construcción de los virus de la viruela vacuna
recombinantes se efectúa según la tecnología clásica en el campo,
divulgada en los documentos ya citados y en Mackett et al.,
(1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79,
7415-7419) y Mackett et al. (1984, J. Virol.
49, 857-864).
Los ensayos in vivo (inmunoprofilaxis o
inmunoterapia) se realizan sobre ratones hembra C57B16 (C. Rivers
Rouen, Francia), o ratones atímicos (Janvier, Le Genest St. Isle,
Francia), que tienen de 6 a 8 semanas. Los animales se reparten
generalmente en grupos de 20 (salvo cuando se indique) según los
virus, la dosis o la vía de administración a ensayar. Las células
tumorales TC1 (Wu, John Hopkins University, Baltimore, USA) se
obtienen de células de pulmón tomadas de ratones C57 B16
transducidas con dos retrovirus, uno que expresa los genes E6 y E7
nativos de HPV-16, y el otro que expresa el oncogén
ras. Las células se cultivan en medio DMEM (medio Eagles modificado
de Dubelcco) en presencia de G418 (0,5 mg/ml). Las células se
utilizan para el ensayo animal, después del tratamiento con
tripsina y 3 lavados en medio isotónico.
Los genes E6 y E7 se aíslan a partir de la
estirpe celular Caski como se describe en los ejemplos 2 y 3 de la
patente europea EP 0.462.187. Se han derivado dos construcciones
del clon M13E7/E6 que contiene los genes E6 y E7 del
HPV-16 a fin de facilitar las etapas ulteriores de
clonación. La primera, denominada M13TG8188, resulta de la
introducción mediante mutagénesis dirigida de sitios PstI y
BamHI respectivamente en dirección 5' y en dirección 3' del
gen E7; y la segunda, M13TG8189, contiene un sitio PstI en
dirección 5' del gen E6. La introducción de mutaciones puntuales en
dirección 5' de un ATG iniciador y en dirección 3' de un codón stop
son conocidas por el experto en la técnica.
La asociación de la proteína E7 de
HPV-16 con el producto del gen de retinoblastoma ha
sido demostrada por diversos autores (véase, por ejemplo, Munger
et al., 1989, EMBO J. 8, 4099-4105),
y se ha correlacionado con su poder transformador. Por razones
evidentes de seguridad, se genera un mutante no oncogénico eliminado
de los codones 21 a 26 de la proteína E7 nativa implicados en la
función de transformación, mediante mutagenesis dirigida del vector
M13TG8188 con la ayuda del oligonucleótido oTG5118 (SEC ID nº: 3).
Se obtiene M13TG9104 que contiene el gen E7 mutado, denominado a
continuación E7*.
Las señales de secreción y de anclaje de la
glicoproteína rábica se aíslan del gen de la glicoproteína rábica
insertado en forma de un fragmento Bg/II en el pBR327
(pTG150 descrito en la patente francesa nº 83 15716) y subclonado en
el vector M13 (M13TG177). Se introduce entre estas señales un sitio
BamHI, en fase con estos últimas, mediante mutagénesis
dirigida con la ayuda del oligonucleótido oTG5745 (SEC ID nº: 4). La
construcción resultante se denomina M13TG9128. Después, las
secuencias de secreción y de anclaje se aíslan del M13TG9128
mediante digestión PstI y se insertan en 3' del promotor
natural del virus de la viruela vacuna p7.5 en el vector pTG5003
linealizado mediante PstI, para dar pTG5016. A título
indicativo, pTG5003 deriva de pTG186poli (descrito en la patente
francesa nº 2.583.429) mediante digestión SalI, tratamiento
con el fragmento Klenow, y después digestión mediante SmaI y
religan, de manera que no contiene más que los sitios PstI y
EcoRI en su poliligador. El vector M13TG9104 se modifica
mediante mutagénesis dirigida con la ayuda de los oligonucleótidos
oTG6390 y oTG6880 (SEC ID nº: 5 y 6) a fin de poner en fase las
secuencias E7* y las señales de secreción y de anclaje de la
glicoproteína rábica (denominadas a continuación E7*TMR). La
construcción resultante se denomina M13TG9150.
Asimismo, se ha demostrado que la proteína E6 de
HPV-16 podía interaccionar con el producto de
expresión del gen supresor de tumor p53 (Crook et al.,
1991, Cell 67, 547-556). El campo implicado
en esta interacción se ha definido claramente, y se sitúa entre los
restos 111 a 115 de la proteína nativa. El vector M13TG9125 se
genera mediante mutagénesis de M13TG8189 con la ayuda del
oligonucleótido oTG5377 (SEC ID nº: 7). El gen E6
\lambda111-115 se denomina en lo sucesivo E6*.
Las señales de secreción y de anclaje de la
proteína F del virus de la rubéola se aíslan mediante PCR a partir
de la construcción plasmídica pTG2148 (descrita en la patente
europea EP 0.305.229) que contiene el ADN que codifica la proteína F
del virus de la rubéola. La fusión entre estas secuencias y las que
codifican E6* se realiza mediante PCR directa: la secuencia de
secreción se amplifica con la ayuda de los oligonucleótidos
oTG10829 que contiene en 5' un sitio XbaI (SEC ID nº: 8) y
oTG10830 que cubre el extremo 5' de E6 (SEC ID nº: 9); las
secuencias que codifican el mutante E6* se amplifican a partir del
M13TG9125 con la ayuda de los oligonucleótidos oTG10835, que permite
la fusión con el extremo 3' de la señal de secreción de la proteína
F (SEC ID nº: 10), y oTG10836, que permite la fusión con el extremo
5' de la secuencia de anclaje de la proteína F (SEC ID nº: 11).
Para la secuencia de anclaje, se utilizan los cebadores oTG10833,
que permite la fusión entre el 3' de E6* y el 5' de la secuencia de
anclaje (SEC ID nº: 12), y oTG10834, que crea en 3' los sitios
KpnI y SphI (SEC ID nº: 13). El fragmento amplificado
que contiene las secuencias E6*, fusionadas en N y
C-terminal, respectivamente, a las secuencias de
secreción y de anclaje membránica de la proteína F (denominada en lo
sucesivo E6*TMF), se digiere mediante XbaI y SphI y
después se inserta en los mismos sitios en el vector M13TG131
(Kieny et al., 1983, Gene 26, 91-99).
La construcción así obtenida se denomina M13TG9199.
El virus MVA deriva de la cepa del virus de la
viruela vacuna Ankara. No es capaz de generar partículas
infecciosas en las células de los mamíferos, pero se desarrolla
correctamente en fibroblastos embrionarios de pollo. Su adaptación a
estas células ha provocado la escisión de 6 regiones no esenciales
para su desarrollo y su sistema infeccioso en este tipo de células
(desaparición de aproximadamente 15% del genoma vírico; Meyer et
al., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038).
La integración de material genético exógeno se puede realizar a
nivel de una cualquiera de estas zonas de escisión. En el ámbito de
la presente invención, se utilizan las escisiones II y III
localizadas a nivel de los fragmentos de restricción HindIII
N y A, respectivamente (Altenburger et al., 1989, Arch.
Virol. 105, 15-27).
En primer lugar, se construye el vector pTG6019
que permite la inserción en la zona de escisión III del virus MVA.
Los brazos de recombinación homóloga a cada lado de la zona de
escisión III se aíslan mediante PCR a partir del genoma vírico
(véase la patente americana US 5.185.146) y los cebadores oTG7637 y
oTG7638 (SEC ID nº: 14 y 15) por el brazo izquierdo, y oTG7635 y
oTG7636 (SEC ID nº: 16 y 17) por el brazo derecho. Los fragmentos
amplificados se clonan al sitio EcoRI del vector pTG1E, para
dar pTG6019. El material genético a transferir se inserta entre los
dos brazos de recombinación. El vector pTG1E es similar al pTG1H
(patente francesa 2.583.429), salvo por la presencia de un
adaptador EcoRI en lugar de sitios múltiples de
clonación.
En primer lugar, se inserta un casete de
expresión del gen marcador gus A. Se clona primero el
promotor 7,5K en el sitio BamHI de pTG6019. Se obtiene
pTG6021 en el sitio BamHI, del cual se inserta el gen gus
A generado en forma de un fragmento Bg/II-BamHI.
Éste se puede obtener a partir de la secuencia divulgada en la
bibliografía. La construcción resultante se denomina pTG6022. La
presencia del marcador permitirá discriminar los virus salvajes de
los virus recombinantes, por detección de la actividad enzimática
GUS mediante el sustrato XglcA. Una coloración roja revela actividad
de \beta-glucuronidasa. Sin embargo, en la óptica
de una aplicación clínica, puede ser útil poder eliminar este
marcador bacteriano del producto final después de la selección de
los virus recombinantes. Para ello, se utiliza la capacidad de la
viruela vacuna para eliminar las secuencias comprendidas entre dos
sitios homólogos. Es por ello que se inserta un segundo promotor
p7,5K en dirección 3' del gen gus A en una orientación
sentido con relación al promotor que dirige la expresión de este
último. El vector pTG6025 resulta de la inserción entre los sitios
BamHI y SacI de pTG6022 de un fragmento p7,5K que
tiene extremos cohesivos.
Por otra parte, el ADNc que codifica la
interleukina-2 humana se aísla del plásmido pTG36
(patente francesa 2.583.770) mediante digestión PstI y se
inserta en el sitio PstI del plásmido pTG186 (patente
fancesa 2.583.429), dando lugar a pTG188. El virus obtenido
mediante recombinación homóloga se denomina VVTG188. Después de la
digestión Bg/II/EcoRI, las secuencias de
IL-2 se insertan en 3' del promotor natural de la
viruela vacuna pH5R en los sitios BamHI/EcoRI del
M13TG9132, para dar M13TG9185. A título indicativo, el vector
M13TG9132 proviene de la inserción del promotor del gen H5R aislado
mediante PCR del genoma vírico en el fago M13TG6131, el cual deriva
de M13TG131 (Kieny et al., 1983, supra) mediante
mutación del sitio Bg/II interno situado fuera de los sitios
múltiples de clonación.
Después, los genes HPV-16 e
IL-2 se clonan en la zona de escisión III del
genoma del MVA. Las secuencias E7*TMR se aíslan mediante digestión
Bg/II/HindIII y se insertan entre los sitios
BamHI y HindIII del pTG6025 en 3' del promotor de la
viruela vacuna p7.5. La construcción resultante se denomina
pTG6050. Se crea un sitio de inserción del casete de expresión del
gen de la IL-2 humana mediante recombinación
homóloga entre los sitios HindIII y KpnI del pTG6050,
por inserción de los oligonucleótidos oTG10502 y oTG10503 (SEC ID
nº: 18 y 19). Después, el vector generado pTG6074 se linealiza
mediante digestión HindIII/KpnI, y se realiza la
recombinanción homóloga con el casete de expresión
pH5R-IL-2 aislado del M13TG9185
mediante digestión Bg/II/EcoRI. Finalmente, la
construcción resultante pTG6088 se linealiza mediante KpnI y
se liga con el gen E6*TMF, aislado del M13TG9199 mediante digestión
KpnI/XbaI, y el promotor p7.5, aislado del M13TG9136
mediante digestión XbaI/KpnI. La construcción
resultante se denomina pTG8042 (Figura 1). El vector M13TG9136
proviene de M13TG5107 modificado mediante mutagénesis dirigida con
la ayuda de los oTG5925 (creación de un sitio PstI en 3' del
promotor p7.5; SEC ID nº: 20) y oTG5924 (creación de un sitio
BamHI y KpnI en 5' del promotor p7.5; SEC ID nº:
21).
El virus MVATG8042 se genera mediante
recombinación homóloga con el genoma de MVA según las técnicas
anteriores. El aislamiento de los recombinantes se facilita
mediante la presencia del gen marcador gusA.
Se verifica que la modificación de la
localización celular de los antígenos precoces de HPV no perjudica
su expresión. El análisis mediante transferencia Western de
extractos celulares infectados por MVATG8042 con la ayuda de un
anticuerpo anti-E7 permite la detección de 3 bandas
con peso molécular comprendido entre 20 y 35 kDa. Esta
heterogeneidad se puede explicar por la presencia de un sitio
potencial de O-glicolización en la
zona de anclaje membránica de la glicoproteína rábica. Cuando el
análisis de transferencia Western se repite en presencia de
fenil-Gal-Nac
(Fenil-N-acetil-\alpha-D-galactopiranósido,
Sigma, P4023), se detecta sólo una forma de 20 kDa lo que confirma
la
O-glicosilación del producto de expresión del gen E7*TMR.
O-glicosilación del producto de expresión del gen E7*TMR.
La detección mediante transferencia Western con
la ayuda de un anticuerpo E6 del producto de expresión del gen
E6*TMF pone de manifiesto una sola banda que migra al peso
molecular esperado de 20 kDa, lo que confirma la ausencia de
modificaciones postraduccionales. A título indicativo, los
anticuerpos anti-E6 y E7 antes citados son
antisueros de conejo obtenidos mediante administración del antígeno
purificado. Pero igualmente pueden ser convenientes otros
anticuerpos específicos, ya sean monoclonales o policlonales.
La expresión del gen hIL-2 se
evalúa mediante ELISA (Quantikine R&D Systems) y el ensayo de
proliferación celular dependiente de IL-2. Según las
condiciones de cultivo, la cantidad de IL-2
producida varía de 200 a 800 ng/ml/24 h por 10^{6} células
infectadas con 0,1 pfu/célula.
Se inoculan ratones C57BL6 con 10^{3} células
BMK-16 myc implantadas por vía subcutánea. A título
indicativo, la estirpe celular deriva de células de riñón de
ratones neonatos transfectadas mediante el genoma
HPV-16 y el gen c myc murino. Después, se
administran 10^{7} pfu (unidades formadoras de colonias) de virus
MVATG8042 igualmente de forma subcutánea en el D3, D6 y D9, y se
sigue regularmente la evolución de los tumores. Los ratones
tratados presentan un retraso del crecimiento tumoral de hasta D15
(15 días) con relación a los controles formados por animales que han
recibidos un virus MVA no recombinante. Además, el tratamiento se
acompaña de una regresión parcial de los tumores en
D30-35 que no se observa cuando se utiliza un MVA
equivalente que expresa los mutantes E6* y E7* de localización
nuclear nativa.
Las secuencias E7*TMR se aíslan del M13TG9150
mediante digestión Bg/II/BamHI, y se insertan al
sitio BamHI del pTG5016. La construcción resultante,
denominada pTG5095, contiene las secuencias E7* fusionadas a las
señales de secreción y de anclaje de la glicoproteína rábica, bajo
control del promotor p7.5. El virus VVTG5095 se genera mediante
recombinación homóloga con el genoma de la viruela vacuna.
El gen B7.1 humano se aísla a partir de una
estirpe celular humana Daudi mediante PCR inversa
(RT-PCR) con la ayuda de los cebadores oTG6353 y
oTG6352 (SEC ID nº: 22 y 23), y se inserta entre los sitios
Bg/II y EcoRI de M13TG6131. Se obtiene M13TG9149 del
cual se aísla el fragmento Bg/II-EcoRI el cual se
subclona entre los mismos sitios de M13TG5107, en 3' del promotor
p7.5 (M13TG5107 contiene las secuencias promotoras p7.5 clonadas en
el sitio BamHI del M13TG130). El casete
p7.5-B7.1 se aísla de la construcción así obtenida,
denominada M13TG9152, mediante digestión EcoRI/PstI,
y se introduce en el sitio EcoRI de pTG5095 con la ayuda del
oTG1086 (5'AATTTG
CA3'). La construcción resultante se denomina pTG6002 y los virus recombinantes VVTG6002 se producen mediante recombinación homóloga con el genoma de la viruela vacuna.
CA3'). La construcción resultante se denomina pTG6002 y los virus recombinantes VVTG6002 se producen mediante recombinación homóloga con el genoma de la viruela vacuna.
Se realiza una construcción equivalente mediante
inserción de los casetes de expresión de los genes E7* y B7.1 en la
zona de escisión III del genoma de MVAN33, según la misma
tecnología que la desarrollada en el ejemplo 2.
Se han vacunado ratones C57BL6 en tres ocasiones
por vía subcutánea con 10^{7} pfu de VVTG5095 o VVTG6002. Tres
días después de la última inmunización, estos animales se exponen a
10^{3} células E7W1 implantadas por vía subcutánea. A título
indicativo, las células E7W1 provienen de una estirpe de linfoma
murino transfectada mediante un vector que expresa el gen E7
oncogénico de HPV-16. El porcentaje de
supervivientes de los animales, en función del tiempo, se compara
con el obtenido con ratones testigo tratados con 10^{7} pfu de un
virus de la viruela vacuna no recombinante VVTG186 (derivado del
vector TG186 descrito aquí arriba). El seguimiento de la mortalidad
muestra una diferencia entre los tres grupos. Mientras que en el
grupo del testigo el 100% de los animales están muertos el D36, se
observa la supervivencia de aproximadamente un cuarto de los
animales vacunados por VVTG5095. La protección se mejora
sensiblemente con la construcción VVTG6002, que incluye las
secuencias que codifican el antígeno B7.1.
Se aíslan los fragmentos que codifican las
proteínas L1 y L2 de HPV16, mediante PCR a partir de ADN genómico
de células Caski (ATCC 1550), según las técnicas generales de la
técnica anterior. El fragmento de amplificación que contiene las
secuencias L1 se subclona en M13TG130 (Kieny et al., 1983,
Gene 26, 91-99), para dar la construcción
M13TG8171. La secuencia del gen L1 clonado revela varias mutaciones
con relación a la secuencia contenida en Genebank (Accesión
K02718): C en lugar de A en posición 248, C en lugar de A en
posición 253, G en lugar de A en posición 537, G en lugar de C en
posición 682, G en lugar de A en posición 874, inserción de un
triplete ACT en posición 1393, eliminación de un triplete GAT en
posición 1390. La secuencia se corrige mediante mutagénesis puntual
a fin de adecuarla a la publicada por Zhou et al. (1991,
Virology 185, 251-257), e introducir
mutaciones silenciosas a nivel de las secuencias TTTTTNT que
constituyen sitios potenciales de terminación de la transcripción
precoz susceptibles de interferir con la fase precoz de desarrollo
de la viruela vacuna. La técnica de mutagénesis dirigida es conocida
por el experto en la técnica. El vector que contiene la secuencia
corregida se denomina M13TG4041.
La inserción del fragmento de PCR que contiene
las secuencias L2 en el vector M13TG6131 conduce a
M13TG9126. Se cuentan 5 mutaciones puntuales con relación a la secuencia divulgada en Genebank: C en lugar de T en posición 378, A en lugar de G en posición 691, A en lugar de G en posición 702, G en lugar de A en posición 990 y C en lugar de A en posición 1092. A título indicativo, el vector M13TG6131 deriva de M13TG131 (Kieny et al., 1983, Gene 26, 91-99) mediante mutación del sitio Bg/II interno situado fuera de los sitios múltiples de
clonación.
M13TG9126. Se cuentan 5 mutaciones puntuales con relación a la secuencia divulgada en Genebank: C en lugar de T en posición 378, A en lugar de G en posición 691, A en lugar de G en posición 702, G en lugar de A en posición 990 y C en lugar de A en posición 1092. A título indicativo, el vector M13TG6131 deriva de M13TG131 (Kieny et al., 1983, Gene 26, 91-99) mediante mutación del sitio Bg/II interno situado fuera de los sitios múltiples de
clonación.
El vector M13TG4041 se digiere mediante
XbaI-SacI, y el fragmento que contiene las secuencias
L1 se inserta entre los sitios XbaI-SacI de M13TG9126
en dirección 3' del gen L2 y en dirección opuesta. La construcción
así generada se denomina M13TG4042. Después, las secuencias L1 y L2
se aíslan mediante digestión Bg/II y se subclonan entre los
sitios Bg/II y BamHI del vector M13TG4052 que contiene
el promotor sintético p11K7.5, que resulta de la fusión de los
promotores tardíos p11K y precoz p7.5. De las dos orientaciones, se
selecciona la que pone el gen L1 en dirección 3' del promotor, que
se denomina M13TG4055. Después, el casete de expresión, que
contiene el promotor pH5R y el gen hIL-2, se aísla
de pTG8042 mediante digestión HindIII antes de ser
introducido en el sitio HindIII de M13TG4055 situado entre
los genes L1 y L2. Finalmente, la construcción obtenida, M13TG4057,
se digiere mediante Bg/II, y el fragmento que contiene las
secuencias tardías de HPV16 se inserta en el sitio BamHI de
M13TG4060, el cual resulta de la clonación del promotor sintético
p4BK1L. Este último es un promotor híbrido entre el promotor precoz
p4B (Davidson y Moss, 1989, J. Mol. Biol. 210,
749-769) y tardío (Davidson y Moss, 1989, J. Mol.
Biol. 210, 771-784). Se obtiene M13TG4062 que
comprende el gen L1 bajo control de p11K7.5, el casete
pH5R-IL2 y el gen L2 bajo control de p4BK1L en
orientación inversa con relación a las secuencias L1.
Se construye un casete policistrónico que
contiene las secuencias que codifican E7*TMR y E6*TMF. En primer
lugar, las secuencias IRES del virus EMC (encefalomiocardiovirus;
Genbank accesión M22458) se aíslan, mediante las técnicas
convencionales, en forma de fragmento EcoRI-NcoI
introducido en dirección 3' del gen E7*TMR entre los sitios
EcoRI y NcoI de pTG6002 (ejemplo 5), para dar
pTG8084. Después, el gen E6*TMF se amplifica mediante PCR con la
ayuda de cebadores apropiados creando un sitio NcoI en su
extremo 5'. El fragmento Bg/II-NcoI, que contiene el
gen E7*TMR y las secuencias IRES, obtenido de pTG8084, y el
fragmento PCR, que contiene el gen E6*TMF digerido mediante
NcoI y SacI, se reconstituyen en el vector M13TG6131
(ejemplo 2) anteriormente digerido mediante Bg/II y
SacI. Se obtiene M13TG4059. Después, el bloque
E7*TMR-IRES-E6*TMF se aísla de este
último en forma de un fragmento Bg/II, y se inserta en el
sitio BamHI de pTG8093 en dirección 3' del promotor p7.5K.
(pTG8093 resulta de la clonación del promotor p7.5K en el vector
pTG6025). La construcción así obtenida se denomina pTG9901.
El fragmento SacI de M13TG4062 se clona en
el sitio SacI de pTG9901, para dar pTG9902. El gen de
selección gpt (Falkner y Moss, 1988, J. Virol. 62,
1849-1854) se empalma con los genes tardíos e IL2 en
el vector p poli II (Lathe et al., 1987, Gene 57,
193-201) de la siguiente manera. El primero se aísla
de M13TG4076 (este vector contiene el gen gpt flanqueado en
sus dos extremos por las secuencias promotoras p4BK1L) mediante
digestión Bg/II-NcoI, y los segundos se aíslan de
pTG9902 mediante digestión NcoI-SacI. Los fragmentos
purificados se clonan entre los sitios Bg/II-SacI de p
poli II. Se obtiene pTG9933, del cual se aísla el fragmento
SacI que se introduce en el vector pTG9901 escindido
mediante SacI. La construcción así obtenida, pTG9936, se
ilustra en la figura 2.
Los virus MVATG9936 se generan mediante
recombinación homóloga con el genoma de MVAN33. El aislamiento de
clones se puede realizar según las técnicas anteriores.
El objetivo de este estudio preclínico es
comparar la cepa vírica (virus de la viruela vacuna Copenhague
frente a MVA) y la formulación (presentación transmembránica frente
a localización nuclear nativa) en términos de protección
antitumoral.
Se vacunan ratones C57B16 en tres ocasiones con
10^{7} pfu de virus. Las inyecciones se llevan a cabo cada diez
días (D1, D11 y D21), por vía intraperitoneal. Los animales se
exponen 7 días después de la última inmunización, por administración
subcutánea en su lado derecho, a 5 x 10^{4} células TC1. Se
constituyen ocho grupos de 20 animales en función del virus o de la
disolución administrada, respectivamente:
1. MVATG8042 (ejemplo 2, E6*TMF, E7*TMR,
IL-2),
2. MVATG6037 (ejemplo 5, E7*TMR, B7.1),
3. VVTG5095 (ejemplo 4, E7*TMR),
4. MVATG6090 (E6*, E7*,
IL-2),
5. VVTG5061x188 (E6*, E7*,
IL-2),
6. VVTG186 (virus de la viruela vacuna no
recombinante),
7. MVAN33 (virus MVA no recombinante), y
8. una disolución salina (PBS).
Los grupos 1 a 3 se vacunan con los virus de la
presente invención que expresan al menos un antígeno HPV
transmembránico, mientras que los grupos 4 y 5 han recibido virus
que expresan los antígenos precoces de HPV16 de localización nuclear
nativa; y los grupos 6 a 8, virus de control no recombinantes o una
disolución salina. Se indica que los virus MVATG6090 y VVTG5061x188
se describen en la Solicitud Internacional WO98/04705. El
porcentaje de supervivientes de los animales de los diferentes
grupos se sigue durante las 12 semanas que siguientes a la
exposición tumoral. Los resultados se pueden resumir de la
siguiente manera.
De manera general, la mortalidad es importante en
los tres grupos testigo, llegando al 95% (con los virus MVAN33 y
VV186) y 81% (con el PBS).
Se observa un crecimiento significativo de la
supervivencia de los animales inmunizados con los virus que
expresan los antígenos nucleares de HPV. Así, el 55% de los ratones
que han recibidos el virus MVATG6090 están libres de tumores,
mientras que la administración de VVTG5061x188 induce un porcentaje
de rechazo tumoral de 75%.
Sin embargo, la gran mayoría de los animales
vacunados con los virus que expresan los antígenos transmembránicos
de HPV16 han rechazados su tumor, o presentan un importante retraso
del crecimiento tumoral. Más precisamente, se observa 100% de
rechazo con MVATG8042, 95% con MVATG6037 y 90% con VVTG5095.
La Figura 3 presenta las curvas de supervivencia
obtenida con los animales vacunados con MVATG8042 y
MVATG6090 con relación a los controles (MVAN33 y PBS).
MVATG6090 con relación a los controles (MVAN33 y PBS).
En su conjunto, estos datos ponen en evidencia la
ausencia de diferencia significativa entre los virus que provienen
de un virus de la viruela vacuna Copenhague y de un MVA, y la mejor
inmunogenecidad conferida por la presentación membránica. De todos
los virus ensayados, el virus MVATG8042 es el más eficaz porque da
lugar a 100% de rechazo tumoral en este modelo animal de
inmunoprofilaxis.
Se inmunizan los ratones C57B16 por vía
intraperitoneal con 10^{7} pfu de virus en D1, D11 y D21 antes de
ser expuestos en el D82, mediante administración subcutánea en su
lado derecho, a 5 x 10^{4} células TC1. Se constituyen ocho grupos
idénticos al ensayo anterior (N121). Se sigue la evolución de los
tumores en función del tiempo. Los datos obtenidos 50 días después
de la exposición tumoral confirman que el virus más eficaz en
términos de rechazo tumoral es el virus MVATG8042. Su administración
protege al 100% de los animales, indicando su capacidad para
inducir una inmunidad a largo plazo.
Se inmunizan los ratones C57B16 por vía
intraperitoneal en D1, D11 y D21 con 10^{5}, 10^{6} o 10^{7}
pfu de virus MVATG8042 antes de ser expuestos en el D28, mediante
administración subcutánea en su lado derecho, a 5 x 10^{4} células
TC1. Los animales del control reciben cantidades idénticas de
MVAN33. Se sigue la evolución de los tumores dos veces por semana
durante 12 semanas. Los resultados (Figura 4) muestran 100% de
protección independientemente de la dosis de MVATG8042 administrada,
mientras que la gran mayoría de los animales testigo desarrollan
tumores. Estos datos confirman la eficacia del virus MVATG8042
también con dosis bajas.
Se inmunizan los ratones C57B16 por diferentes
vías de administración (escarificación, subcutánea, intraperitoneal
o intramuscular) en D1, D11 y D21 con 10^{7} pfu de virus antes
de ser expuestos en el D44, por administración subcutánea en su lado
derecho, a 5 x 10^{4} células TC1. Se sigue la evolución de los
tumores dos veces por semana durante 12 semanas. Como se muestra en
la figura 5, las vías intraperitoneal o intramuscular dan los
porcentajes de protección más elevados con el virus MVATG8042.
El objetivo de este estudio es comparar las
capacidades terapéuticas frente a un tumor preestablecido de los
virus que presentan los antígenos HPV en una forma membránica o
nuclear. Para ello, se administran 5 x 10^{4} células TC1 por vía
subcutánea en el lado derecho de los ratones C57B16 (D0). Después,
se inyectan 10^{7} pfu de virus por vía intraperitoneal en D7,
D14 y D21. Se constituyen cuatro grupos de animales según el virus
administrado: respectivamente MVAN33 (control negativo), una
disolución salina de Tris-HCl/NaCl (control
negativo), MVATG8042 (formulación transmembránica) y MVATG6090
(formulación nuclear). La evolución de los tumores se evalúa dos
veces por semanas durante 12 semanas. Los resultados muestran una
mejor eficacia de la presentación membránica en términos de
protección antitumoral en un contexto terapéutico. El 100% de los
ratones que han recibido MVATG8042 han sobrevivido 140 días después
de la implantación de las células tumorales, mientras que el
porcentaje es de aproximadamente 60% para los animales inyectados
con MVATG6090, y muy inferior por los animales del control.
Es importante verificar la ausencia de virulencia
de los virus antes de considerar su aplicación a los tumores
humanos. Se administran a ratones atímicos (5 animales/grupo)
10^{6} o 10^{7} pfu de virus MVATG8042, MVAN33 o un virus de la
viruela vacuna Copenhague salvaje (VVwt), por vía intracraneal. La
supervivencia de los ratones se sigue durante 20 días.
Los resultados se presentan en la tabla 1
siguiente:
Virus | Numero de ratones atímicos supervivientes | |
10^{6} pfu | 10^{7} pfu | |
MVAN33 | 5/5 | 5/5 |
MVATG8042 | 5/5 | 5/5 |
VVwt | - | 0/5 |
No se detecta ningún efecto secundario después de
la administración intracraneal de 10^{7} pfu del virus MVATG8042,
mientras que todos los ratones tratados con el virus de la viruela
vacuna salvaje están muertos tres días después de la inyección. El
virus MVA de control tampoco es tóxico para los animales, lo que
confirma su atenuación con relación al virus de la viruela vacuna
ya descrita en la bibliografía.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- DEPOSITARIO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Transgene SA
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DIRECCIÓN: 11 rue de Molsheim
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Estrasburgo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAIS: Francia
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CÓDIGO POSTAL: 67082
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TELÉFONO: (33) 03 88 27 91 00
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- FAX: (33) 03 88 27 91 11
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Composición antitumoral a base de polipéptido inmunógeno de localización celular modificada.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 23
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Cinta
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, versión #1.25 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 243 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Papilomavirus humano
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: HPV-16
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA INDIVIDUAL: Proteína E6 fusionada a señales de la proteína F
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- CLON: E6*TMF
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 185 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Papilomavirus humano
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: HPV-16
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA INDIVIDUAL: E7 fusionada a las señales de la glicoproteína rábica
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- CLON: E7*TMF
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(4) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Papilomavirus humano
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: HPV-16
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA INDIVIDUAL: oligonucleótido de síntesis oTG5118 (E7 eliminado 21 26)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTGAGCTGT CATTTAATTG AGTTGTCTCT GGTTGC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(5) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus de la rabia
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA CLÍNICA INDIVIDUAL: oligonucleótido de mutagénesis oTG5745
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCACTCAGT AATACATAGG ATCCAATAGG GAATTTCCCA AA
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
(6) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA INDIVIDUAL: oligonucleótido de síntesis oTG6390
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTATCTCCAT GCATGGATCC TGCAGGGTTT CTCTACGT
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(7) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA INDIVIDUAL: oligonucleótido de síntesis oTG6880
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGATCCGCCA TGGTAGATCT TGGTTTCTGA GAACAG
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(8) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus de la rabia
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: HPV-16
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA INDIVIDUAL: oligonucleótido de síntesis oTG5377 (E6 eliminado 111 a 115)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTCCAGATG TCTTTGCAGT GGCTTTTGAC AG
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(9) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: oligonucleótido de síntesis oTG10829
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGCGCTCTA GAATTATGGG TCTCAAGGTG AACG
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(10) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: oligonucleótido de síntesis oTG10830
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTTCTCTT TTGGTGCATG CCCCAATGGA TTTGA
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(11) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: oligonucleótido de síntesis oTG10835
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGCTAGTGC TCGATAAACC CAGCTGGGTT TCTCTACG
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(12) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: oligonucleótido de síntesis oTG10836
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCAAATCCAT TGGGGCATGC ACCAAAAGAG AACTG
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(13) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA INDIVIDUAL: oligonucleótido de síntesis oTG10833
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTAGAGAAA CCCAGCTGGG TTTATCGAGC ACTAGCAT
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(14) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- CEPA CLÍNICA INDIVIDUAL: oligonucleótido de síntesis oTG10834
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGGGCATGC GGTACCTCAG AGCGACCTTA CATAGG
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(15) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la viruela vacuna
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- CEPA: Ankara modificada
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA CLÍNICA INDIVIDUAL: Oligonucleótido de síntesis oTG7637 (PCR zona III)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGAAT TCAGTAAACT TGACTAAATC TT
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(16) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la viruela vacuna
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Ankara modificada
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA INDIVIDUAL: Oligonucleótido de síntesis oTG7638 (PCR zona III)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGGAT CCGAGCTCAC CAGCCACCGA AAGAGCAAT
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(17) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la viruela vacuna
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Ankara modificada
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA INDIVIDUAL: Oligonucleótido de síntesis oTG7635 (PCR zona III)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGGAT CCGGAAAGTT TTATAGGTAG TT
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(18) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la viruela vacuna
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Ankara modificada
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA INDIVIDUAL: Oligonucleótido de síntesis oTG7636 (PCR zona III)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEC ID nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGAAT TCTTTGTATT TACGTGAACG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(19) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 77 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: oligonucleótido de síntesis oTG10502
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCTTTTTAT TCTATACTTA AAAAATGAAA ATAAACTCGA GTTGTCAAAG CATCATCTCA
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACACTGACTT GAGGTAC
\hfill77
\vskip1.000000\baselineskip
(20) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 69 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- CEPA: oligonucleótido de síntesis oTG10503
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCAAGTCAG TGTTGAGATG ATGCTTTGAC AACTCGAGTT TATTTTCATT TTTTAAGTAT
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGAATAAAA
\hfill69
\vskip1.000000\baselineskip
(21) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- NÚMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA INDIVIDUAL: oligonucleótido de síntesis oTG5925
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCAGATCTGT CGAGGGATCT GCAGCTTCTT CTAGAGGTA
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(22) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA INDIVIDUAL: oligonucleótido de síntesis oTG5924
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTGAATTGC TGCAGGTACC CGGATCCGCA TCGACTATCG ACAT
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
(23) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Estirpe celular Daudi
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA INDIVIDUAL: cebador PCR oTG6353 (clonación B7.1)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCAGCCCCTG AATTCTGCGG ACACTGTTAT ACAGG
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(24) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Estirpe celular Daudi
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA INDIVIDUAL: cebador PCR oTG6352 (clonación B7.1)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGACCCTAA AGATCTGAAG CCATGGGCCA CAC
\hfill33
Claims (22)
1. Composición antitumoral que comprende al menos
un vector recombinante que contiene las secuencias que codifican
uno o varios polipéptidos inmunógenos, caracterizada porque
al menos uno de dichos polipéptidos es un polipéptido que presenta
naturalmente una localización no membránica y está modificado
mediante la inserción de una secuencia de anclaje membránica y, en
el caso en que el polipéptido inmunógeno nativo esté desprovisto de
ella, de una secuencia de secreción a fin de presentar una
localización membránica en la superficie de las células en las que
se expresa, y caracterizada porque dicho polipéptido
inmunógeno presenta un grado de similitud superior a 70% con la
totalidad o parte de un polipéptido codificado por una región
precoz y/o tardía de un papilomavirus.
2. Composición antitumoral según la
reivindicación 1, caracterizada porque dicho polipéptido
presenta naturalmente una localización nuclear y además se elimina
de susecuencia natural de localización nuclear.
3. Composición antitumoral según una de las
reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque dicha secuencia
de anclaje membránica y/o la secuencia de secreción se selecciona
de entre el grupo constituido por la de la glicoproteína rábica, la
glicoproteína env del virus VIH, y la proteína F del virus de la
rubéola.
4. Composición antitumoral según una de las
reivindicaciones 2 a 3, caracterizada porque dicha secuencia
de secreción se inserta en el extremo N-terminal, y
la secuencia de anclaje membránica se inserta en el extremo
C-terminal de dicho polipéptido inmunógeno.
C-terminal de dicho polipéptido inmunógeno.
5. Composición antitumoral según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque dicho
polipéptido inmunógeno presenta un grado de similitud superior a
70% con un polipéptido codificado mediante la región precoz de un
papilomavirus.
6. Composición antitumoral según la
reivindicación 5, caracterizada porque dicho polipéptido
inmunógeno es un polipéptido E6 o E7 de un papilomavirus.
7. Composición antitumoral según la
reivindicación 6, caracterizada porque dicho polipéptido
inmunógeno es una variante no oncogénica de dicho polipéptido E6 o
E7 de un papilomavirus mutado a nivel de la región implicada en el
proceso de transformación celular.
8. Composición antitumoral según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque dicho
polipéptido inmunógeno presenta un grado de similitud superior a
70% con un polipéptido L1 o L2 de un papilomavirus.
9. Composición antitumoral según una de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque al menos un
polipéptido inmunógeno presenta un grado de similitud superior a
70% con un polipéptido precoz, y porque al menos un polipéptido
inmunógeno presenta un grado de similitud superior a 70% con un
polipéptido tardío de un papilomavirus.
10. Composición antitumoral según una de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque al menos un
polipéptido inmunógeno es tal que:
(1) dicho polipéptido inmunógeno tiene una
secuencia que presenta un grado de identidad superior a 70% o es
idéntica a la que se muestra en la SEC ID nº: 1,
(2) dicho polipéptido inmunógeno tiene una
secuencia que presenta un grado de identidad superior a 70% o es
idéntica a la que se muestra en la SEC ID nº: 2,
(3) dicho polipéptido inmunógeno tiene una
secuencia que presenta un grado de identidad superior a 70% o es
idéntica a la que se muestra en la SEC ID nº: 1, y un polipéptido
inmunógeno que tiene una secuencia que presenta un grado de
identidad superior a 70% o es idéntica a la que se muestra en la SEC
ID nº: 2,
(4) dicho polipéptido inmunógeno tiene una
secuencia que presenta un grado de identidad superior a 70% o es
idéntica a la que se muestra en la SEC ID nº: 1, siendo un
polipéptido inmunógeno la proteína L1 de un papilomavirus y/o siendo
un polipéptido inmunógeno la proteína L2 de un papilomavirus,
(5) dicho polipéptido inmunógeno tiene una
secuencia que presenta un grado de identidad superior a 70% o es
idéntica a la que se muestra en la SEC ID nº: 2, siendo un
polipéptido inmunógeno la proteína L1 de un papilomavirus y/o siendo
un polipéptido inmunógeno la proteína L2 de un papilomavirus, o
(6) dicho polipéptido inmunógeno tiene una
secuencia que presenta un grado de identidad superior a 70% o es
idéntica a la que se muestra en la SEC ID nº: 1, y un polipéptido
inmunógeno que tiene una secuencia que presenta un grado de
identidad superior a 70% o es idéntica a la que se muestra en la SEC
ID nº: 2, siendo un polipéptido inmunógeno la proteína L1 de un
papilomavirus y/o siendo un polipéptido inmunógeno la proteína L2
de un papilomavirus.
11. Composición antitumoral según una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque dicho
papilomavirus es un papilomavirus humano, tal como
HPV-16, 18, 31, 33 ó 45.
12. Composición antitumoral según una de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque dicho vector
recombinante comprende además las secuencias que codifican al menos
para un compuesto que mejora el efecto antitumoral de dicha
composición.
13. Composición antitumoral según la
reivindicación 12, caracterizada porque dicho compuesto que
mejora el efecto antitumoral es un inmunoestimulante.
14. Composición antitumoral según la
reivindicación 13, caracterizada porque dicho compuesto
inmunoestimulante se selecciona de entre el grupo constituido por la
interleuquina-2, la interleuquina-7,
la interleuquina-12 y las moléculas de
co-adhesión B7.1 y B7.2.
15. Composición antitumoral según una de las
reivindicaciones 1 a 14, caracterizada porque dicho vector
recombinante es un poxvirus.
16. Composición antitumoral según la
reivindicación 15, caracterizada porque dicho poxvirus es un
MVA.
17. Composición antitumoral según una de las
reivindicaciones 1 a 16, que contiene un soporte aceptable desde un
punto de vista farmacéutico, que permite su administración mediante
inyección al ser humano o al animal.
18. Vector recombinante que comprende las
secuencias que codifican para uno o varios polipéptidos
inmunógenos, caracterizado porque al menos uno de dichos
polipéptidospresenta las características definidas en las
reivindicaciones 1 a 17.
19. Partícula vírica que comprende un vector
recombinante según la reivindicación 18.
20. Composición antitumoral caracterizada
porque comprende uno o varios polipéptidos inmunógenos,
caracterizada porque al menos uno de dichos polipéptidos
presenta las características definidas en las reivindicaciones 1 a
11.
21. Utilización de una composición antitumoral
según una de las reivindicaciones 1 a 17 y 20, de un vector
recombinante según la reivindicación 18, o de una partícula vírica
según la reivindicación 19, para la preparación de un medicamento
destinado al tratamiento o a la prevención de un cáncer o de un
tumor.
22. Utilización según la reivindicación 21, para
la preparación de un medicamento destinado al tratamiento o a la
prevención de un cáncer de cuello uterino, de una displasia del
cuello de bajo grado o de una infección con papilomavirus.
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