BRPI0806350A2 - uso de uma molécula de ácido nucléico, uso de um vetor, uso de um particula viral infecciosa, vetores, particula viral infecciosa e composição - Google Patents

Abstract

USO DE UMA MOLéCULA DE áCIDO NUCLéICO, USO DE UM VETOR, USO DE UMA PARTìCULA VIRAL INFECCIOSA, VETORES, PARTìCULA VIRAL INFECCIOSA E COMPOSIçãO. A presente invenção refere-se ao uso de uma molécula de ácido nuclé iço que codifica pelo menos um polipeptideo de papiloma vírus E2 ou um vetor, partícula viral infecciosa ou sua composição para a preparação de uma droga destinada ao tratamento de pacientes que sofrem de uma infecção por papiloma vírus persis tente causada por pelo menos um papiloma vírus. A presente invenção também fornece um vetor que compreende uma molécula de ácido nucléico que compreende uma primeira seqúência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo E1 de papiloma vírus e uma segunda sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptideo E2 de papiloma vírus em que a parte 3' do primeiro nucleotídeo que, no contexto natural, é 100% idêntica à parte 5' do segundo nucleotideo é modificada de forma a exibir um percentual de identidade entre as mencionadas partes de, no máximo, 75%.

Description

"USO DE UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, USO DE UM VETOR, USO DE UMA PARTÍCULA VIRAL INFECCIOSA, VETORES, PARTÍCULA VIRAL INFECCIOSA E COMPOSIÇÃO"

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao uso de uma molécula de ácido nucléico, vetor ou partícula viral infecciosa que codifica pelo menos um polipeptídeo papiloma vírus E2 para a preparação de uma droga destinada ao tratamento de infecções por papiloma vírus. A presente invenção possui interesse muito especial no campo de imunoterapia e, mais especificamente, para o tratamento de pacientes que sofrem de uma infecção persistente por papiloma vírus.

Antecedentes da invenção

Papiloma vírus foram isolados em uma série de organismos superiores nos quais infectam tecidos epiteliais da pele e da mucosa. Atualmente, mais de cem genótipos de papiloma vírus humano (HPV) foram identificados em seres humanos (Stoler, 2000, Int. J. Gynecoi Path 19, 16-28), que podem ser classificados em genótipos de "baixo risco" normalmente associados a tumores benignos (tais como HPV-6 e HPV-11) e genótipos de "alto risco" que são associados a lesões com potencial de progresso para lesões pré-malignas (tais como neoplasia intraepitelial cervical (NIC)) e, por fim, para tumores malignos. Mais de 99% de cânceres da cervical contêm DNA de HPV e cinco genótipos de HPV de "alto risco" (HR-HPV) foram reconhecidos como a principal causa com detecção de HPV-16 e HPV-18 em cerca de 70% dos cânceres da cervical invasivos diagnosticados em todo o mundo (Clifford et al, 2003, Br. J. Câncer 88, 63-73) e HPV-31, HPV-33 e HPV-45 representaram 10% adicionais (Cohen et al, 2005, Science 308, 618-621).

Papiloma vírus são pequenos vírus de DNA rodeados por um capsídeo de proteína (vide, por exemplo, Pfister, 1987, em The Papovaviridae: the Papillomaviruses, Salzman e Howley1 Ed., Plenum Press, Nova Iorque, págs. 1-38). O genoma é um DNA circular de fita dupla com cerca de 7900 pares de bases que consiste de três regiões funcionais, as regiões de controle inicial (E), posterior (L) e longa (LCR). A LCR contém seqüências reguladoras de transcrição tais como amplificadores e promotores. A região posterior codifica as proteínas L1 e L2 estruturais, respectivamente as proteínas de capsídeo maior e menor, enquanto a região inicial codifica proteínas reguladoras (E1-E7) encontradas predominantemente no núcleo que controlam a reprodução viral, transcrição e transformação celular.

A proteína E1 é a maior (HPV-16 E1 possui 649 aminoácidos de comprimento) e mais conservada proteína codificada pelo genoma de papiloma vírus. E1 é uma fosfoproteína de união de DNA com atividade de helicase dependente de ATP que necessita de dimerização e interação com E2 para estimular a reprodução viral (Desaintes e Demeret, 1996, Semin. Câncer Biol. 7, 339-347; Wilson et al, 2002, Virus Gene 24, 275-290). A atividade de helicase foi posicionada no domínio C-terminal de E1 e domínio de união de DNA no domínio central. A proteína E2 (HPV-16 E2 possui 365 aminoácidos de comprimento) é uma fosfoproteína de união de DNA multifuncional que regula a transcrição de gene viral e controla a reprodução de DNA (Bechtold et al, 2003, J. Virol. 77, 2021-2028). A regulagem da transcrição viral requer dimerização e união dos dímeros de E2 a um local de união de E2 (seqüência ACCN6GGT de consenso), cujo contexto determina se a transcrição viral é trans-ativada ou reprimida (Ham et al, 1991, Trends Biochem. Sei. 16, 440-444; McBride et al, 1991, J. Biol. Chem. 266, 18411-18444). E2 também fornece a repressão do promotor HPV-16 p97 que controla a expressão de oncoproteínas E6 e E7. Por fim, E2 está envolvido no fornecimento de genoma viral em células filhotes. O domínio N-terminal de HPV-16 E2 é responsável pela trans-ativação, interação com E1 e estímulo da reprodução, enquanto o domínio C-terminal está envolvido na união e dimerização de DNA (McBride et al, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A, 86, 510-514). A proteína codificada por E4 une e rompe a rede de queratina citoplasmática e desempenha um papel na maturação viral. A função da proteína E5 ainda é controversa. As proteínas E6 e E7 estão envolvidas na transformação oncogênica de células infectadas com HR-HPV (Kanda et al, 1988, J. Viroi 62, 610-613; Vousden et al, 1988, Oncogene Res. 3, 1-9; Bedell et al, 1987, J. Virol. 61, 3635-3640) por meio da união dessas proteínas virais a produtos genéticos supressores de tumores celulares p53 e retinoblastoma (Rb), respectivamente (analisada em Howley, 1996, Papillomaviruses and their Replication, págs. 2045-2076, em Β. N. Fields, D. M. Knipe e Ρ. M. Howley (Ed.), Virology, terceira edição, Lippincott-Raven Press, Nova Iorque NY).

A infecção por HPV é uma das infecções transmitidas sexualmente mais freqüentes e cerca de 25% de adultos sexualmente ativos são infectados com HPV (Woodman et al, 2001, The Lancet 357, 1831-1836). Cerca de 80% dos pacientes atingem erradicação viral espontânea em até seis a doze meses (Ho et al, 1998, N. Engl. J. Med. 338, 423-428). Nos 20% restantes, entretanto, a infecção por HPV progride para lesões de NIC pré- malignas que, se não diagnosticadas, podem gerar cânceres invasivos (0'Shaughnessy et al, 2002, Clinicai Câncer Research 2, 314-346). O mecanismo indutor de neoplasia aparentemente envolve a integração do genoma de HPV nos cromossomos celulares (Cullen et al, 1991, J. Virol. 65, 606-612). Na maior parte dos casos, isso gera o rompimento do DNA genômico de HPV na região E1/E2, liberação do promotor E6/E7 do efeito repressor de E2 e conseqüente regulagem para cima da transformação celular e da expressão de E6 e E7.

As vacinas profiláticas destinadas à prevenção de infecções por HPV estão agora perto de atingir o mercado. Elas dirigem-se a proteínas de capsídeos expressas na superfície do vírus, a fim de bloquear o vírus antes que penetre nas células hospedeiras principalmente por meio da indução de anticorpos neutralizantes. Elas se baseiam geralmente em proteínas L1 produzidas de forma recombinante que se reagrupam espontaneamente em VLPs (partículas similares a vírus). Duas vacinas de HPV fabricadas pela Merck e GIaxoSmithKIine (GSK) completaram com sucesso testes clínicos de fase Ill exibindo quase 100% de eficácia na prevenção de infecções cervicais específicas de tipo. A vacina da GSK compreende uma mistura de VLPs de HPV-16 e HPV-18, enquanto a Merck também incluiu VLPs de HPV-6 e HPV-11, que causam verrugas genitais.

Os pacientes já infectados com HPV1 entretanto, não são adequados a receber vacinas profiláticas e são de interesse vacinas terapêuticas para o tratamento de pacientes infectados em risco de desenvolvimento de lesões com potencial oncogênico. Como a atividade oncogênica foi atribuída à expressão de genes HPV E6 e E7 nas células infectadas, grande parte dos esforços vem se dirigindo ao bloqueio da sua expressão ou indução da reação imunológica celular contra esses produtos genéticos de transformação. Foram descritas numerosas abordagens na literatura, tais como dependendo do uso de RNA sem sentido (Steele et al, 1993, CancerRes. 53, 2330-2337; He et al, 1997, CancerRes. 57, 3993-3999; Choo et al, 2000, Gynecol. Oncoi 78, 293-301), ribozimas (Chen et al, 1996, Câncer Gen. Ther. 3, 18-23; Pan et al, 2004, Moi Ther. 9, 596-606), siRNA (Butz et al, 2003, Oncogene 22, 5938-5945; Koivusalo et al, 2005, Mol. Pharmacol. 68, 372-382), peptídeos imunogênicos (Feltkamp et al, 1993, Eur. J. Immunol. 23, 2242-2249), plasmídeos codificadores de E6 e/ou E7 (Peng et al, 2004, J. Virol. 78, 8468-8476) e vetores virais (WO 90/10459; WO 99/03885; Kaufmann et al, 2002, Clinicai CancerRes. 8, 3676-3685).

Como se expressa na fase inicial da infecção por HPV, a proteína E2 representa um segundo alvo potencial para vacinação terapêutica. Estudos clínicos prévios realizados em coelhos infectados com papiloma vírus de coelho de rabo de algodão (CRPV) exibiram proteção contra lesões associadas a papiloma vírus implementadas após a expressão de E2. A administração de um vetor de adenovírus recombinante que expressa a proteína CRPV E2 resultou na liberação de infecção e papiloma induzido por CRPV1 propensa por meio de imunidade mediada por célula (Brandsma et al, 2004, J. Viroi 78, 116- 123). A administração de proteínas E1 e E2 de CRPV codificadoras de DNA também foi eficaz para evitar ou pelo menos retardar o desenvolvimento de carcinoma de papilomas da pele induzidos por CRPV (Han et al, 2000, J. Viroi 74, 9712-9716), embora se demonstre que a imunidade protetora depende da via de administração (Han et al, 2000, Vaccine 18, 2937-2944). O potencial terapêutico de E2 para o tratamento de lesões associadas a papiloma vírus também foi sustentado em pacientes humanos que foram expostos a HPV. Detectou-se freqüentemente uma imunidade auxiliar T específica de anti-E2 em pacientes saudáveis (De Jong et al, 2002, Câncer Res. 62, 472-479), enquanto uma imunidade de células T CD4+ impedida contra E2 e E6 foi observada em mulheres portadoras de cânceres da cervical associados a HPV-16 (De Jong et al, 2004, CancerRes. 64, 5449-5455).

Testes clínicos de fase II encontram-se em andamento em pacientes com NIC 2 e 3 em alto grau associado a HPV utilizando um vetor MVA (Vírus Ancara Modificado) recombinante que codifica uma proteína E2 de papiloma vírus bovino (BPV). As partículas de vírus são injetadas diretamente nas lesões NIC e espera-se que a produção de E2 em células que expressam E6 e E7 gere apoptose. Observou-se, de fato, uma regressão de lesões NIC na maior parte dos pacientes tratados. Em alguns casos, entretanto, DNA viral não foi eliminado e a recorrência de lesões foi detectada um ano mais tarde (Garcia-Hernandez etal, 2006, CancerGene Ther. 13, 592-597). Pode-se esperar que HPV continue a ser uma séria ameaça à saúde global por muitos anos, devido à natureza persistente da infecção, sua alta incidência e morbidez significativa de cânceres induzidos por HPV. Demonstrou-se, de fato, que mulheres com infecção por HR-HPV persistente apresentam risco significativamente mais alto, até duzentas vezes, de desenvolver lesões de NIC em comparação com mulheres não infectadas ou mulheres que atingem liberação viral espontânea (Bory et al, 2002, Int. J. Câncer 102, 519-525).

As infecções por HPV geralmente são detectadas após seleção anormal (tal como teste de rasgo Pap). Atualmente, a única vantagem médica do diagnóstico de infecção por HPV é a implementação de um acompanhamento mais freqüente, a fim de detectar as lesões (tais como NIC 2/3 de alto grau) assim que elas ocorrerem para que possam ser removidas por procedimentos ablativos, tais como extirpação eletrocirúrgica de circuito (LEEP) e biópsia de cone (conização). Estes procedimentos são globalmente 90% eficientes, mas com risco de complicações obstétricas (que podem possuir incidência, por exemplo, sobre o potencial de gravidez de mulheres em idade reprodutiva). Além de não ser totalmente satisfatória do ponto de vista médico, esta situação também gera desconforto do paciente (ansiedade).

Existe, portanto, a necessidade de desenvolver uma vacina para o tratamento de pacientes com infecção persistente por HPV, especialmente em vista do alto risco nessa população de progresso para lesões pré-malignas e, em seguida, câncer.

Desta forma, a presente invenção representa um avanço significativo neste contexto. A presente invenção fornece um procedimento seguro e não invasivo que oferece proteção inicial contra infecções causadas por genótipos de HR-HPV. A presente invenção possui a vantagem de fornecer tratamento dos pacientes infectados antes da ocorrência de lesões associadas a papiloma vírus e, conseqüentemente, reduzir o risco de desenvolvimento de tumores pré-malignos e malignos. A presente invenção permite convenientemente a redução dos riscos associados a procedimentos ablativos convencionais (tais como complicações obstétricas), aumentando ao mesmo tempo o conforto do paciente (reduzindo, por exemplo, a ansiedade associada à pesquisa de lesões). De forma importante, a presente invenção pode também permitir a redução do risco de recorrências futuras devido a reinfecções por HPV por meio de erradicação do papiloma vírus infeccioso e seus isolados relacionados.

Este problema da técnica é solucionado por meio do fornecimento das realizações definidas nas reivindicações.

Outros aspectos, características e vantagens adicionais da presente invenção serão evidentes a partir da descrição a seguir das realizações da presente invenção preferidas no presente. Estas realizações são fornecidas para fins de descrição.

Descrição da invenção Conseqüentemente, em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece o uso de uma molécula de ácido nucléico que codifica pelo menos um polipeptídeo de papiloma vírus E2 ou um vetor ou partícula viral infecciosa que compreende a mencionada molécula de ácido nucléico para a preparação de uma droga destinada ao tratamento de um organismo hospedeiro que sofre de uma infecção por papiloma vírus persistente causada por pelo menos um papiloma vírus. A presente invenção também se refere à mencionada molécula de ácido nucléico, vetor ou partícula viral infecciosa para uso no tratamento de infecções persistentes por papiloma vírus em um organismo hospedeiro. Segundo uma realização, a mencionada molécula de ácido nucléico, vetor ou partícula viral infecciosa é administrada após a exposição do organismo hospedeiro ao pelo menos um papiloma vírus e antes da detecção/surgimento de uma lesão associada a papiloma vírus.

Da forma utilizada no presente ao longo de todo o presente pedido, os termos "um" e "uma" são utilizados no sentido de "pelo menos um(a)", "pelo menos um(a) primeiro(a)", "um(a) ou mais" ou "uma série" dos compostos ou etapas indicadas, a menos que o contexto indique ao contrário. A expressão "um polipeptídeo E2 de papiloma vírus", por exemplo, engloba um tipo exclusivo de polipeptídeo E2 de papiloma vírus ou uma série de polipeptídeos E2 de papiloma vírus que inclui uma de suas misturas.

O termo "e/ou", sempre que indicado no presente, inclui o significado de "e", "ou" e "toda ou qualquer outra combinação dos elementos conectados pelo mencionado termo".

A expressão "cerca de" ou "aproximadamente", da forma utilizada no presente, indica até 20%, preferencialmente até 10% e, de maior preferência, até 5% de um dado valor ou faixa.

Os termos "aminoácidos" e "resíduos" são sinônimos e englobam aminoácidos naturais bem como análogos de aminoácidos (tais como aminoácidos não naturais, sintéticos e modificados, incluindo isômeros óticos D ou L).

Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são utilizados de forma intercambiável no presente para indicar polímeros de resíduos de aminoácidos que compreendem nove ou mais aminoácidos unidos por meio de uniões de peptídeo. O polímero pode ser linear, ramificado ou cíclico, pode compreender análogos de aminoácidos e/ou aminoácidos de ocorrência natural e pode ser interrompido por não aminoácidos. Como indicação geral, caso o polímero de aminoácido seja longo (tal como mais de cinqüenta resíduos de aminoácidos), ele é preferencialmente denominado polipeptídeo ou proteína, enquanto, caso contenha cinqüenta aminoácidos de comprimento ou menos, é denominado "peptídeo". Dentro do contexto da presente invenção, as expressões "ácido nucléico", "molécula de ácido nucléico", "polinucleotídeo" e "seqüência de nucleotídeos" são utilizadas de forma intercambiável e definem um polímero com qualquer comprimento de polideoxirribonucleotídeos (DNA) (tal como cDNA, DNA genômico, plasmídeos, vetores, genomas virais, DNA isolado, sondas, primers e qualquer de suas misturas) ou moléculas de polirribonucleotídeos (RNA) (tais como mRNA, RNA sem sentido) ou polirribopolideoxirribonucleotídeos misturados. Eles englobam polinucleotídeos de fita simples ou dupla, lineares ou circulares, naturais ou sintéticos. Além disso, um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos não de ocorrência natural, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeos (vide US 5.525.711, US 4.711.955 ou EPA 302.175 como exemplos de modificações), e pode ser interrompido por componentes não de nucleotídeos. Quando presentes, podem ser impostas modificações ao nucleotídeo antes ou depois da polimerização.

Da forma utilizada no presente, quando utilizada para definir produtos, composições e métodos, a expressão "que compreende" destina-se a indicar que os produtos, composições e métodos incluem os componentes ou etapas indicadas, mas sem excluir outros. "Que consiste essencialmente de" deverá indicar como excluindo outros componentes ou etapas com qualquer significado essencial. Desta forma, uma composição que consiste essencialmente dos componentes indicados não excluiria traços de contaminantes e veículos farmaceuticamente aceitáveis. "Que consiste de" deverá indicar como excluindo mais que elementos de traços de outros componentes ou etapas. Um polipeptídeo "consiste de" uma seqüência de aminoácidos, por exemplo, quando o polipeptídeo não contiver nenhum aminoácido além da seqüência de aminoácidos indicada. Um polipeptídeo "consiste essencialmente de" uma seqüência de aminoácidos quando essa seqüência de aminoácidos estiver presente junto com apenas alguns resíduos de aminoácidos adicionais, tipicamente cerca de 1 a cerca de 50 resíduos adicionais. Um polipeptídeo "compreende" uma seqüência de aminoácidos quando a seqüência de aminoácidos for pelo menos parte da seqüência de aminoácidos do polipeptídeo. Esse polipeptídeo pode conter até algumas centenas de resíduos de aminoácidos adicionais. Esses resíduos de aminoácidos adicionais podem desempenhar um papel no tráfego de polipeptídeos, facilitar a produção ou purificação de polipeptídeos; prolongar a meia vida, entre outros. O mesmo pode aplicar-se a seqüências de nucleotídeos.

A expressão "célula hospedeira" deverá ser compreendida amplamente, de forma a englobar células isoladas, um grupo de células, bem como uma organização específica de células, tal como em tecido ou órgão. Essas células podem ser células primárias, transformadas ou cultivadas. Elas podem ser procarióticas (tais como Escherichia coli), de leveduras (tais como Saccharomyces eerevisiae, Saccharomyees pombe ou Piehia pastoris) ou eucarióticas (tais como células de insetos, vegetais e mamíferos, incluindo humanas). A expressão "célula hospedeira" inclui células que podem ser ou tenham sido receptoras da molécula de ácido nucléico, o vetor ou a partícula viral infecciosa em uso na presente invenção e uma prole dessas células.

A expressão "organismo hospedeiro" indica um vertebrado, particularmente um membro das espécies de mamíferos e, especialmente, animais domésticos, animais de criação, animais esportivos e primatas, incluindo seres humanos. Preferencialmente, o organismo hospedeiro é um paciente que sofre de uma infecção por papiloma vírus persistente causada por pelo menos um papiloma vírus.

"Papiloma vírus" designa um vírus que pertence à subfamília de papiloma virídeos. A definição engloba papiloma vírus de animais com origem em espécie não humana, incluindo, mas sem limitações, bois, cavalos, coelhos, carneiros, cães, primatas não humanos e roedores, bem como papiloma vírus humano (HPV).

"HPV" indica, mais especificamente, papiloma vírus com origem em espécie humana e/ou que são capazes de infectar um ser humano. Mais de cem genótipos de HPV foram identificados até o momento e eles foram numerados segundo a ordem cronológica do seu isolamento.

Convencionalmente, a classificação de HPV é baseada no grau de relação dos seus genomas. Foi construída uma árvore filogenética a partir do alinhamento das seqüências de nucleotídeos disponíveis (Van Ranst et al, 1992, J. Geri. Virol. 73, 2653; De Villiers et al, 2004, Virology 324, 17-27). HPV pode ser dividido em "alto risco" (HR-HPV) e "baixo risco" (LR-HPV). HR-HPV designa HPV que possui forte associação com transformação celular que pode gerar lesões com potencial de progresso até lesões malignas. Os tipos de HR-HPV incluem, sem limitações, HPV-16, HPV-18, HPV-30, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66, HPV- 68, HPV-70 e HPV-85. LR-HPV designa HPV que possui um fraco potencial de transformação celular que pode gerar lesões benignas tais como verrugas com baixo potencial de progresso para lesões malignas. Os tipos de LR-HPV incluem, sem limitações, HPV-6 e HPV-11.

Papiloma vírus pode ser isolado, clonado ou derivado de qualquer fonte natural. Essas fontes incluem amostras biológicas, células cultivadas e materiais recombinantes. Da forma utilizada no presente, uma "amostra biológica" engloba uma série de amostras recolhidas de um organismo hospedeiro que foi exposto a um papiloma vírus que podem ser utilizadas como uma fonte de papiloma vírus ou em um teste de diagnóstico ou monitoramento. No contexto da presente invenção, uma amostra biológica pode haver sido manipulada de qualquer forma após a sua coleta, tal como por meio de tratamento com reagentes, solubilização ou enriquecimento com certos componentes (tais como polipeptídeos ou moléculas de ácido nucléico). A definição engloba fluidos biológicos (tais como sangue, plasma, soro), amostras de líquidos (tais como amostras vaginais, fluidos cervicais e citológicas), amostras de tecidos sólidos (tais como seções de tecido, amostras de biópsia) e cultivos de tecido. A expressão "células cultivadas" engloba células em cultivo (tais como células CaSki disponíveis na ATCC), sobrenadantes celulares e Iisatos celulares. Materiais recombinantes incluem, sem limitações, papiloma vírus (tal como disponível em instituições depositárias), genoma de papiloma vírus, bibliotecas de cDNA ou genômicas, plasmídeos que contêm fragmento(s) de genoma de papiloma vírus ou qualquer vetor do estado da técnica que conhecidamente inclua esses elementos.

Como informação geral, as seqüência de nucleotídeos de uma série de genoma de papiloma vírus e as seqüência de aminoácidos dos polipeptídeos codificados foram descritas na literatura e são disponíveis em bancos de dados especializados, tais como números de acesso Genbank NC 01526 e K02718 com relação a HPV-16; NC_001357 e X05015 com relação a HPV-18; J04353 com relação a HPV-31; M12732 com relação a HPV-33; NC 001529 com relação a HPV-35; NC_001535 com relação a HPV- 39; X74479 com relação a HPV-45; NC_001533 com relação a HPV-51; NC 001592 com relação a HPV-52; X74483 com relação a HPV-56; D90400 com relação a HPV-58; NC_001635 com relação a HPV-59; X67160 e M73258 com relação a HPV-68; U21941 com relação a HPV-70 e AF131950 com relação a HPV-85.

Da forma utilizada no presente, a expressão "polipeptídeo de papiloma vírus E2" engloba polipeptídeos E2 nativos (ou seja, conforme expresso a partir de um ORF E2 em uma fonte de papiloma vírus da natureza), polipeptídeos E2 modificados e seus peptídeos imunogênicos.

Um peptídeo E2 imunogênico contém pelo menos nove aminoácidos e esta expressão inclui epítopos E2 (tais como motivos de aminoácidos específicos que são capazes de induzir ou ativar uma reação imunológica por meio do processo mediado por classe I e/ou classe Il MHC, tal como os descritos em EP 523.395), construção com múltiplos epítopos (tal como conforme descrito em WO 2005/089164) e polipeptídeos E2 truncados. A truncagem pode variar de um a trezentos resíduos de aminoácidos que podem ser contíguos ou não e localizados em terminal N e/ou terminal C e/ou internamente.

O polipeptídeo E2 codificado pela molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção pode originar-se de qualquer genótipo de papiloma vírus, com uma preferência especial para um genótipo HR-HPV tal como o selecionado a partir do grupo que consiste dos relacionados acima e, mais especificamente, HPV-16, HPV-18, HPV-33 ou HPV-52 ou qualquer de suas combinações (tais como HPV-16 e HPV-18). Uma grande quantidade de polipeptídeos E2 nativos foi descrita na literatura, tal como HPV-18 E2 em Cole et al (1987, J. Mol. Biol. 193, 599-608); HPV-16 E2 em Seedorf et al (1985, Virology, 145, 181-185) e Kennedy et al (1991, J. Virol., 65, 2093-2097), HPV- 31 E2 em Goldsborough et al (1989, Virology 171, 306-311), HPV-33 E2 em Cole et al (1986, J. Virol., 58, 991-995) e o papiloma vírus bovino BPV-1 E2 em Chen et al (1982, Nature 299, 529-534) e em Danos et al (1983, J. Virol. 46, 557-566). Para fins de ilustração, a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo HPV-16 E2 é fornecida em SEQ ID N0 1.

A presente invenção não se limita, entretanto, a estes exemplos de seqüências. De fato, as seqüências de nucleotídeos e aminoácidos podem variar entre diferentes isolados de papiloma vírus e esta variação genética natural é incluída no escopo da presente invenção, bem como modificação(ões) não natural(is) tal(is) como as descritas acima. O termo "modificação" inclui exclusão, substituição ou adição de um ou mais resíduos de nucleotídeos ou qualquer combinação dessas possibilidades. Quando diversas modificações forem contempladas, elas podem referir-se a resíduos consecutivos e/ou resíduos não consecutivos. Pode(m) ser gerada(s) modificação(ões) na molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção por meio de uma série de formas conhecidas dos técnicos no assunto, tais como mutagênese dirigida a local (utilizando, por exemplo, o sistema de mutagênese in vitro Sculptor® da Amersham, Les Ullis, França), mutagênese de PCR, troca de DNA e por meio de métodos sintéticos químicos (o que resulta, por exemplo, em uma molécula de ácido nucléico sintético).

A(s) modificação(ões) contemplada(s) pela presente invenção engloba(m) modificações silenciosas que não alteram a seqüência de aminoácidos do papiloma vírus E2 codificado, bem como modificações que são traduzidas no polipeptídeo E2 codificado, resultando em uma seqüência de aminoácidos modificada em comparação com a nativa correspondente.

Modificações que são silenciosas no nível do polipeptídeo E2 codificado são tipicamente realizadas por meio de substituição de um ou mais códons da seqüência de codificação E2 com um ou mais códons que codifica(m) o mesmo aminoácido. Embora um códon exclusivo codifique resíduo de Met ou Trp, sabe-se bem na técnica que podem ser utilizados seis códons diferentes para codificar arginina, Ieucina ou serina e quatro diferentes para codificar alanina, glicina, prolina, treonina e valina. É possível, portanto, modificar a seqüência de nucleotídeos que codifica E2 sem alterar a seqüência de aminoácidos. Desejavelmente, essas modificações destinam-se a aumentar a expressão do polipeptídeo E2 de papiloma vírus em um dado organismo ou célula hospedeira, tal como em células hospedeiras de mamíferos, incluindo seres humanos. Exemplos representativos dessas modificações incluem, sem limitações, a supressão de códon(s) raramente utilizado(s) por otimização de códons, supressão de elementos de seqüências negativas que se espera influenciarem negativamente os níveis de expressão e/ou a supressão de seqüências homólogas que se espera influenciar negativamente a estabilidade da molécula de ácido nucléico ou vetor de acordo com a presente invenção.

Tipicamente, a otimização de códons é realizada substituindo-se um ou mais códons "nativos" (tais como HPV) correspondentes a um códon utilizado raramente na célula hospedeira de interesse por um ou mais códons que codificam o mesmo aminoácido que é utilizado com mais freqüência. Não é necessário substituir todos os códons nativos correspondentes a códons utilizados raramente, pois o aumento da expressão pode ser atingido mesmo com substituição parcial. Além disso, alguns desvios da aderência estrita ao uso de códons otimizado podem ser realizados para acomodar a introdução de local(is) de restrição na molécula de ácido nucléico resultante. Essas moléculas de ácido nucléico otimizadas por códons são descritas na literatura, tal como em WO 01/14416, WO 02/08435 e WO 03/018055.

Exemplos representativos de elementos de seqüência negativos que são apropriados para supressão no contexto da presente invenção incluem, sem limitações, as regiões que possuem teor de GC muito alto (> 80%) ou muito baixo (< 30%); as regiões que possuem teor de AT muito alto; seqüências de repetição diretas instáveis ou invertidas; estruturas secundárias de RNA; e/ou elementos reguladores crípticos internos tais como caixas TATA internas, locais chi, locais de entrada de ribossomos e/ou locais doadores/aceitadores de divisão.

Espera-se que a presença de seqüências homólogas no vetor ou molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção influencie negativamente a sua estabilidade, especialmente durante a etapa de produção de vetores. Pode ocorrer recombinação entre as seqüências homólogas, o que possivelmente leva à perda da parte compreendida entre as duas seqüências homólogas. Da forma utilizada no presente, a expressão "seqüências homólogas" indica seqüências de nucleotídeos que retêm um alto grau de identidade entre si ao longo de pelo menos 40, convenientemente pelo menos 45, preferencialmente pelo menos 50, de maior preferência pelo menos 55 ou, de preferência ainda maior, pelo menos 59 nucleotídeos consecutivos. Um alto grau de identidade é de 75% ou mais de 75%, convenientemente 80% ou mais de 80%, desejavelmente 85% ou mais de 85%, preferencialmente 90% ou mais de 90%, de maior preferência 95% ou mais de 95%, de preferência ainda maior 97% ou mais de 97% (tal como identidade seqüencial de 100%). O percentual de identidade entre duas seqüências de nucleotídeos é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas seqüências, considerando o número de espaços que necessitam ser introduzidos para alinhamento ideal e o comprimento de cada espaço. Diversos programas de computador e algoritmos matemáticos são disponíveis na técnica para determinar identidades percentuais entre seqüências de nucleotídeos tais como um pacote GCG Wisconsin.

A homologia entre duas seqüências de nucleotídeos homólogas é preferencialmente suprimida por meio de degeneração do uso de códons em pelo menos uma das seqüências homólogas, de tal forma que o percentual de identidade entre as seqüências anteriormente homólogas seja reduzido para menos de 75%. Isso pode ser realizado por meio de substituição de um ou mais códons "nativos" (tais como HPV) presentes na parte homóloga por um ou mais códons que codificam o mesmo aminoácido. Não é necessário degenerar todos os códons nativos, pois a homologia pode ser suficientemente reduzida com substituição parcial. Essas modificações são particularmente úteis quando o vetor ou molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção codificar dois polipeptídeos de papiloma vírus cujas seqüências de aminoácidos e nucleotídeos são relativamente conservadas (tais como seqüências que codificam dois ou mais polipeptídeos E2 tais como polipeptídeos HPV-16 e HPV-18 E2) ou que contêm uma parte comum (tais como seqüências co dificadoras de HPV-16 E1 e E2 que compartilham 59 nucleotídeos em comum). Um exemplo representativo dessa realização é fornecido em SEQ ID N0 6, que fornece um exemplo de seqüências degeneradas correspondentes à parte de 59 nucleotídeos presentes em seqüências codificadoras E1 e E2.

Modificações que traduzem no nível do polipeptídeo E2 codificado resultam na mutação de um ou mais resíduos de aminoácidos do polipeptídeo E2. Convenientemente, o polipeptídeo E2 modificado retém um alto grau de identidade de seqüências de aminoácidos com o polipeptídeo nativo correspondente ao longo da seqüência de aminoácidos de comprimento total ou um de seus fragmentos (tal como pelo menos nove, vinte, cinqüenta, cem, duzentos ou trezentos aminoácidos de comprimento), que é 75% ou mais de 75%, convenientemente mais de 80%, desejavelmente mais de 85%, preferencialmente mais de 90%, de maior preferência mais de 95%, de preferência ainda maior mais de 97% (tal como 100% de identidade de seqüências). O percentual de identidade entre dois polipeptídeos é uma função da quantidade de posições idênticas compartilhadas pelas seqüências, considerando o número de espaços que necessitam ser introduzidos para alinhamento ideal e o comprimento de cada espaço. São disponíveis na técnica vários programas de computador e algoritmos matemáticos para determinar os percentuais de identidade entre seqüências de aminoácidos, tais como o software W2H HUSAR e o programa Blast (tal como Altschul et al, 1997, Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402; Altschul et al, 2005, FEBS J. 272, 5101- 5109) disponível em NCBI.

Em uma realização, a molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção é modificada de forma a codificar um polipeptídeo E2 com defeito para pelo menos uma das atividades biológicas de um polipeptídeo E2 nativo e, mais especificamente, com defeito para ativação de transcrição e/ou reprodução viral. Os aminoácidos que são fundamentais para essas atividades biológicas podem ser identificados por meio de métodos rotineiros, tais como por meio de análise estrutural e funcional e os técnicos no assunto podem determinar facilmente o tipo de mutação(ões) que é capaz de reduzir ou abolir uma dada atividade biológica. Sabe-se bem na técnica que os resíduos envolvidos nas atividades de reprodução e ativação da transcrição de E2 estão localizados na parte N-terminal, enquanto a parte C-terminal é responsável pelo reconhecimento de locais de união E2 sobre DNA viral e dimerização. Da forma utilizada no presente, a parte N-terminal de E2 inclui os primeiros 220 resíduos de aminoácidos a partir do iniciador Met. Pode-se proceder, por exemplo, por meio de métodos de PCR ou mutagênese dirigida a local, a fim de excluir ou substituir um ou mais dos resíduos de aminoácidos na parte N- terminal E2 que regula a reprodução viral, de forma a reduzir significativamente ou abolir a(s) função(ões) de reprodução de E2 e gerar um polipeptídeo E2 com defeito para a reprodução de genoma de papiloma vírus. Alternativamente ou em combinação, pode-se excluir ou substituir um ou mais dos resíduos de aminoácidos na parte N-terminal E2 responsável pela ativação de transcrição, de forma a reduzir significativamente ou abolir a capacidade de E2 de ativar a transcrição de promotores de papiloma vírus. Exemplos representativos de polipeptídeos E2 defeituosos apropriados são descritos na literatura disponível para os técnicos no assunto, tal como em Demeret et al (1995, Nucleic Acids Res. 23, 4777-4784), Sakai et al (1996, J. Viroi 70, 1602-1611), Brokaw et al (1996, J. Virology 70, 23-29) e Ferguson et al (1996, J. Virology 70, 4193- 4199). A redução ou falta de reprodução das atividades de ativação de transcrição e reprodução de E2 pode ser facilmente determinada em testes apropriados, utilizando métodos padrão conhecidos nos técnicos no assunto (Sakaietal, 1996, J. Virol. 70, 1602-1611).

Um polipeptídeo E2 com defeito de reprodução preferido codificado pelo ácido nucléico de acordo com a presente invenção origina-se de HPV-16 e compreende a seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N0 1, exceto pelo fato de que pelo menos o resíduo Glu na posição 39 (E39) é modificado, tal como substituído por qualquer resíduo de aminoácido diferente de Glu. Um outro polipeptídeo E2 preferido com defeito para ativação de transcrição origina-se em HPV-16 e compreende a seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N0 1, exceto pelo fato de que o resíduo Ile na posição 73 (I73) é modificado, tal como substituído por qualquer resíduo de aminoácido diferente de lie. Um polipeptídeo E2 de preferência ainda maior com defeito para ativação de transcrição e reprodução origina-se em HPV-16 e compreende a seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N0 1, exceto pelo fato de que pelo menos o resíduo Glu (E39) na posição 39 e o resíduo Ile na posição 73 (I73) são modificados, tais como substituídos por qualquer resíduo de aminoácidos diferente de Glu e Ile nas posições correspondentes 39 e 73. De maior preferência, o resíduo Glu na posição 39 e/ou o resíduo Ile na posição 73 são substituídos com um resíduo Ala (E39A e/ou I73A). No contexto da presente invenção, esse polipeptídeo E2 defeituoso pode originar-se de qualquer papiloma vírus e encontra-se dentro do alcance dos técnicos no assunto como adaptar as modificações descritas com relação a HPV-16 E2 para um polipeptídeo E2 originário de um outro genótipo de papiloma vírus (o(s) resíduo(s) de aminoácido(s) localizado(s) em uma posição equivalente à posição 39 e/ou posição 73 de HPV-16 E2 pode(m) ser identificado(s), por exemplo, por meio de comparação de seqüências e modificado(s) por meio de métodos padrão). Para fins de ilustração, esses resíduos correspondem, respectivamente, a Glu na posição 43 e Ile na posição 77 em HPV-18 E2, a Glu na posição 39 e Ile na posição 73 em HPV-33 e HPV-52.

Em uma outra realização, a molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção é modificada de forma a codificar uma fusão de um polipeptídeo E2 de papiloma vírus para um ou mais parceiros de fusão, seja no terminal N1 no terminal C ou em ambos, terminal N e C, de E2. O parceiro de fusão pode originar-se de um papiloma vírus ou não. A fusão pode ser realizada por meios genéticos, ou seja, por meio de fusão em quadro das seqüências de nucleotídeos que codificam o polipeptídeo E2 e os que codificam o(s) parceiro(s) de fusão, de forma que a expressão das seqüências de codificação fundidas resultem em um único polipeptídeo. A fusão pode ser direta (ou seja, sem nenhum resíduo de aminoácido adicional entre eles) ou através de um peptídeo ligante para conectar o polipeptídeo E2 ao(s) parceiro(s) de fusão. A presença de um ligante pode possibilitar a formação correta, dobra e/ou funcionamento da proteína de fusão. Os ligantes apropriados de acordo com a presente invenção possuem de dois a trinta aminoácidos de comprimento e são compostos de resíduos de aminoácidos tais como glicina, serina, treonina, asparagina, alanina e/ou prolina (vide, por exemplo, Wiederrecht et al, 1988, Cell 54, 841; Aumailly et al, 1990, FEBS Lett. 262, 82; e Dekker et al, 1993, Nature 362, 852).

Parceiros de fusão não de papiloma vírus apropriados incluem, sem limitações, calreticulina (Cheng et al, 2001, J. Clin. Invest. 108, 669-678), proteína de choque de aquecimento de tuberculose micobactriana 70 (HSP70) (Chen et al, 2000, Câncer Res. 60, 1035-1042), ubiquitina (Rodriguez et al, 1997, J. Viroi 71, 8497-8503) e toxina bacteriana tal como o domínio de translocalização de exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (ETA (dIII)) (Hung et al, 2001, CancerRes. 61, 3698-3703).

Parceiros de fusão de papiloma vírus apropriados podem ser qualquer polipeptídeo de papiloma vírus, posterior ou inicial, ou qualquer de seus fragmentos. Um parceiro de fusão preferido origina-se de um polipeptídeo HPV inicial selecionado a partir do grupo que consiste de E1, E2, E4, E5, E6 e E7 ou uma de suas misturas. O polipeptídeo E2 e o parceiro de fusão de papiloma vírus podem originar-se do mesmo genótipo de papiloma vírus, tal como a fusão de polipeptídeos HPV-16 E1 e E2. Alternativamente, o polipeptídeo E2 e o parceiro de fusão de papiloma vírus podem originar-se de diferentes genótipos de papiloma vírus, em que um exemplo representativo é a fusão de polipeptídeos HPV-16 E2 e HPV-18 E2.

Independentemente ou em combinação com a(s) modificação(ões) definida(s) acima, a molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção pode compreender ainda modificações adicionais que sejam benéficas para o processamento, estabilidade e/ou solubilidade do polipeptídeo E2 codificado, tal como supressão de potencial(is) local(is) de divisão, supressão de local(is) de glicosilação potencial(is) e/ou apresentação do polipeptídeo E2 codificado na superfície das células hospedeiras que o expressam. A supressão de um local de glicosilação potencial pode ser atingida, por exemplo, identificando-se um potencial local de N-glicosilação (tal como que compreende um motivo Asn-Val-Ser-Val) e substituindo-se um ou mais resíduos de aminoácidos por um resíduo diferente (substituindo-se, por exemplo, o resíduo Ser com um resíduo Gly ou Ala) para fornecer um polipeptídeo E2 que não pode ser glicosilado mediante expressão em um organismo ou célula hospedeira eucariótica.

Em uma realização preferida, a molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção é modificada de forma a codificar um polipeptídeo E2 apresentado por membrana, a fim de aprimorar a apresentação de MHC classe I e/ou MHC classe Il e, desta forma, a sua potencial imunogenicidade no organismo ou célula hospedeira. Demonstrou-se anteriormente que a apresentação de membrana permite aumentar a eficácia terapêutica dos polipeptídeos HPV-16 E6 e E7 (vide, por exemplo, WO 99/03885). O polipeptídeo de papiloma vírus E2 é uma proteína nuclear, embora nenhum sinal de localização nuclear típico tenha sido identificado. A apresentação de membranas pode ser atingida por meio de fusão do polipeptídeo E2 a uma seqüência de secreção (ou seja, um peptídeo de sinal) e de ancoragem de membrana. Estas seqüências são conhecidas na técnica. Resumidamente, seqüências de secreção estão geralmente presentes no terminal N de polipeptídeos secretados ou apresentados por membranas e iniciam a sua passagem para o retículo endoplasmático (ER). Elas compreendem 15 a 35 aminoácidos essencialmente hidrofóbicos que são removidos em seguida por uma endopeptidase localizada em ER específica para gerar o polipeptídeo maduro. As seqüências de ancoragem de membranas normalmente possuem natureza altamente hidrofóbica e servem para ancorar os polipeptídeos na membrana celular (vide, por exemplo, Branden e Tooze, 1991, em Introduction to Protein Structure, págs. 202-214, NY Garland).

A seleção das seqüências de secreção e/ou ancoragem de membranas que podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção é ampla. Elas podem ser obtidas a partir de qualquer polipeptídeo secretado e/ou ancorado por membrana (tal como polipeptídeo celular ou viral), como a glicoproteína de hidrofobia, a glicoproteína de envelope do vírus HIV ou a proteína F do vírus do sarampo, ou podem ser sintéticas. O local preferido de inserção da seqüência de secreção é o terminal N abaixo no fluxo do códon para início de tradução e o da seqüência de ancoragem de membranas é o terminal C, tal como imediatamente acima no fluxo do códon de parada. Além disso, pode ser utilizado um peptídeo Iigante para conectar a seqüência de secreção e/ou a seqüência de ancoragem de membranas ao polipeptídeo E2.

O polipeptídeo E2 dirigido por membrana codificado pelo ácido nucléico de acordo com a presente invenção é preferencialmente modificado por meio de fusão às seqüências de ancoragem de membranas e de secreção da glicoproteína de hidrofobia, conforme ilustrado no capítulo de exemplos abaixo.

Os vetores preferidos de acordo com a presente invenção englobam:

um vetor que compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E2;

um vetor que compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-18 E2;

um vetor que compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-33 E2; e

um vetor que compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-52 E2.

Segundo uma realização particularmente preferida, a molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo E2 compreende, consiste essencialmente ou consiste alternativamente da seqüência d e aminoácidos exibida em SEQ ID N0 2. Para informações, o polipeptídeo de SEQ ID N0 2 compreende o polipeptídeo HPV-16 E2 (da posição 24 até a posição 387) com defeito para atividades de reprodução e transativação (modificações do resíduo Glu na posição 61 e do resíduo Ile na posição 95 por resíduos Ala correspondentes aos resíduos Glu e Ile nas posições 39 e 73, respectivamente, no polipeptídeo E2 nativo) fundido às seqüências de secreção de glicoproteína de hidrofobia (da posição 2 à posição 23) e de ancoragem de membranas (da posição 388 à posição 453).

A presente invenção também engloba um vetor ou partícula infecciosa que compreende moléculas de ácido nucléico que codificam pelo menos dois polipeptídeos E2 originários de diferentes genótipos de papiloma vírus e o uso desse vetor ou partícula infecciosa para a preparação de uma droga destinada ao tratamento de infecções por papiloma vírus, especialmente infecções persistentes com HR-HPV. Em uma realização vantajosa, "pelo menos dois" são dois, três ou quatro e cada um dos polipeptídeos E2 codificados origina-se de HR-HPV de diferentes genótipos. Independentemente ou em combinação, os polipeptídeos E2 são preferencialmente modificados conforme descrito acima (tal como com defeito para reprodução e/ou ativação de transcrição e/ou apresentados por membrana). As moléculas de ácido nucléico que codificam os pelo menos dois polipeptídeos E2 podem ser colocadas sob seqüências reguladoras independentes ou podem ser fundidas entre si para expressão em uma única cadeia de polipeptídeo. Conforme descrito no presente, exemplos representativos incluem um vetor que compreende moléculas de ácido nucléico que codificam polipeptídeos HPV-16 e HPV-18 E2, bem como um vetor que compreende moléculas de ácido nucléico que codificam polipeptídeos HPV-16, HPV-18, HPV-33 e HPV-52 E2, colocados sob seqüências reguladoras independentes. Quando o vetor de acordo com a presente invenção ou utilizado na presente invenção compreender duas ou mais moléculas de ácido nucléico que codificam polipeptídeos E2, recomenda-se que as seqüências de nucleotídeos que codificam E2 sejam degeneradas, de forma a exibir um percentual de homologia de menos de 75% cada uma. Preferencialmente, as mencionadas moléculas de ácido nucléico codificadoras de E2 não compreendem uma porção de quarenta ou mais (tal como 50, 55, 59, 70 ou até mais) nucleotídeos contíguos que exibem um percentual de identidade de 75% ou mais de 75%.

Em uma realização específica da presente invenção, a molécula de ácido nucléico, vetor ou partícula infecciosa descrita no presente pode também ser utilizada em combinação com um ou mais polipeptídeos adicionais ou um ou mais ácidos nucléicos, vetores ou partículas infecciosas que codificam esse(s) polipeptídeo(s) adicional(is). Desejavelmente, o(s) polipeptídeo(s) é(são) capaz(es) de fortalecer a atividade terapêutica fornecida pelo agente ativo descrito acima. O ácido nucléico que codifica esse(s) polipeptídeo(s) adicional(is) pode ser inserido no vetor de acordo com a presente invenção ou em um vetor independente, tal como um dos descritos no presente, e a sua expressão pode ser colocada sob o controle de seqüências reguladoras apropriadas tais como as descritas no presente. O(s) polipeptídeo(s) adicional(is) pode(m) ter origem em papiloma vírus ou origem não em papiloma vírus.

O(s) polipeptídeo(s) adicional(is) não de papiloma vírus apropriado(s) inclui(em), sem limitação, citoquinas (tais como IL-2, IL-7, IL-15, IL-18, IL-21, IFNg) e produtos genéticos suicidas (tais como a timidino quinase de HSV-1 descrita em Caruso et al, 1993, Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A. 90, 7024-7028; FCU-1 descrita em WO 99/54481).

O(s) polipeptídeo(s) adicional(is) de papiloma vírus apropriado(s) inclui(em), sem limitações, qualquer polipeptídeo de HPV precoce (ou fragmento) selecionado a partir do grupo que consiste de E1, E2, E4, E5, E6 e E7, ou qualquer de suas misturas.

Em um aspecto da presente invenção, o(s) polipeptídeo(s) adicional(is) de papiloma vírus pode(m) originar-se do mesmo genótipo de papiloma vírus do polipeptídeo E2 codificado pelo ácido nucléico descrito acima (tais como polipeptídeos E1 e E2 originários de HPV-16).

Alternativamente, em um outro aspecto da presente invenção, o(s) polipeptídeo(s) adicional(is) de papiloma vírus pode(m) originar-se de um genótipo de papiloma vírus diferente do polipeptídeo E2 codificado pelo ácido nucléico descrito acima. Convenientemente, o mencionado polipeptídeo E2 origina-se de HPV-16 e o(s) mencionado(s) polipeptídeo(s) de papiloma vírus adicional(is) origina(m)-se de HPV-18. O polipeptídeo adicional de papiloma vírus pode ser nativo ou modificado em comparação com a seqüência nativa correspondente. O(s) polipeptídeo(s) adicional(is) pode(m) ser, por exemplo, modificado(s) de forma a reduzir ou abolir a sua atividade biológica correspondente (tal como uma atividade enzimática), retendo ao mesmo tempo a sua atividade antigênica. Os exemplos de modificações ilustrados abaixo são fornecidos com relação a polipeptídeos de papiloma vírus HPV-16, mas os técnicos no assunto são capazes de transpor estes exemplos de mutações para os polipeptídeos correspondentes de outros genótipos de papiloma vírus. Além disso, o polipeptídeo adicional de papiloma vírus pode ser adicionalmente modificado, de forma a ser apresentado na membrana celular conforme descrito acima com relação a E2, bem como em WO 99/03885.

Um exemplo apropriado de polipeptídeo adicional de papiloma vírus é um polipeptídeo E1 modificado que compreende uma ou mais mutações em comparação com o polipeptídeo E1 nativo correspondente, de forma a ser defeituoso para o estímulo da reprodução viral. Desejavelmente, o polipeptídeo E1 modificado compreende a mutação de qualquer resíduo na posição 412, 439, 482 e/ou 496 do polipeptídeo E1 nativo, tal como as variantes W439R, Y412F, G482D e G496R de HPV-16 E1 descrito por Yasugi et al (1997, J. Viroi 71, 5942-5951), com uma preferência especial pela variante G482D que compreende a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo HPV-16 E1 nativo, exceto pela substituição do resíduo Gly na posição 482 com um resíduo Asp (tal como um polipeptídeo E1 modificado que possui a seqüência exibida em SEQ ID N0 3). Um outro exemplo de polipeptídeo E1 modificado compreende o polipeptídeo HPV-18 E1 com uma substituição do resíduo Gly na posição 489 com um resíduo Asp.

Um outro exemplo apropriado de polipeptídeos adicionais de papiloma vírus é um polipeptídeo E6 modificado que é não oncogênico e alterado para união ao produto genético supressor de tumores celulares p53. Ainda outro exemplo apropriado de polipeptídeos adicionais de papiloma vírus é um polipeptídeo E7 modificado que é não oncogênico e alterado para união ao produto genético supressor de tumores celulares Rb. Essas variantes não oncogênicas são descritas, por exemplo, em Pim et al (1994, Oncogene 9, 1869-1876), Munger et al (1989, EMBO J. 8, 4099-4105), Crook et al (1991, Cell 67, 547-556), Heck et al (1992, Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A. 89, 4442- 4446) e Phelps et al (1992, J. Viroi 66, 2148-2427). Um polipeptídeo E6 não oncogênico preferido origina-se de HPV-16 e tem seus resíduos 118 a 122 excluídos (CPEEK) (em que +1 representa o primeiro aminoácido do polipeptídeo HPV-16 E6 nativo a partir do primeiro resíduo de Met). Um polipeptídeo E7 não oncogênico preferido origina-se de HPV-16 e tem excluídos os resíduos 21 a 26 (DLYCYE) (em que +1 representa o primeiro aminoácido do polipeptídeo HPV-16 E7 nativo).

Preferencialmente, o polipeptídeo adicional de papiloma vírus para uso na presente invenção, independentemente ou em combinação, é selecionado a partir do grupo que consiste dos polipeptídeos que compreendem qualquer das seqüências de aminoácidos fornecidas em SEQ ID N0 3 a 5. Mais especificamente, SEQ ID N0 3 fornece a seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo HPV-16 E1 apresentado por membrana com defeito para a atividade de reprodução (G482D). SEQ ID N0 4 fornece a seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo HPV-16 E6 não oncogênico e apresentado por membrana e SEQ ID N0 5, a seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo HPV-16 E7 não oncogênico e apresentado por membrana.

No contexto nativo (tal como o genoma HPV-16 ou HPV-18), a extremidade 3' da molécula de ácido nucléico que codifica E1 sobrepõe-se à extremidade 5' da molécula de ácido nucléico que codifica E2 por 59 nucleotídeos. Segundo uma realização preferida, a parte da molécula de ácido nucléico que codifica E1 que se sobrepõe à molécula de ácido nucléico que codifica E2 é modificada de forma a exibir um percentual de identidade de menos de 75% com as seqüências E2 sobrepostas. Desejavelmente1 as modificações são realizadas na molécula de ácido nucléico que codifica E1 no nível de nucleotídeo por meio de degeneração do uso de códons e silenciam no nível de aminoácidos, ou seja, essas modificações não se traduzem no polipeptídeo E1 de papiloma vírus codificado. Um exemplo representativo das modificações que podem ser introduzidas na parte 59bp presente na extremidade 3' da molécula de ácido nucléico que codifica HPV-16 E1 e sobrepostas no contexto nativo com a parte 5' da molécula de ácido nucléico que codifica HPV-16E2 é fornecido em SEQ ID N0 6.

A presente invenção também se refere a üm vetor ou partícula viral infecciosa (tal como para uso no tratamento de infecções por papiloma vírus persistentes conforme descrito no presente) que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo E1 de papiloma vírus e pelo menos uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de papiloma vírus E2 em que a parte 3' da mencionada molécula de ácido nucléico que codifica E1 que, no contexto natural é 100% idêntica à parte 5' da mencionada molécula de ácido nucléico que codifica E2, seja modificada de forma a exibir um percentual de identidade de menos de 75% com a mencionada parte da mencionada molécula de ácido nucléico que codifica E2. Em uma outra realização, a presente invenção também se refere a um vetor ou uma partícula infecciosa que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo E1 de papiloma vírus e pelo menos uma molécula de ácido nucléico que codifica um E2 de papiloma vírus, em que a molécula de ácido nucléico que codifica E1 e a molécula de ácido nucléico que codifica E2 não compreendem uma porção de quarenta ou mais (tal como 45, 50, 55, 59, 70) nucleotídeos que exibem um percentual de identidade de 75% ou mais de 75%.

Os vetores preferidos de acordo com a presente realização englobam um vetor selecionado a partir do grupo que consiste de:

um vetor que compreende (i) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E2 e que compreende adicionalmente (ii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-18 E2;

um vetor que compreende (i) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E2, (ii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-18 E2 e (iii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-33 E2;

um vetor que compreende (i) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E2, (ii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-18 E2 e (iii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-52 E2;

um vetor que compreende (i) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E2, (ii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-33 E2 e (iii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-52 E2;

- um vetor que compreende (i) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E2, (ii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-18 E2, (iii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-33 E2 e (iv) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-52 E2;

- um vetor que compreende (i) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E2 e (ii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E1;

um vetor que compreende (i) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E2, (ii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E1, (iii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-18 E2 e (iv) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-18 E1;

- um vetor que compreende (i) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E2 e (ii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E6;

um vetor que compreende (i) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E2 e (ii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E7;

um vetor que compreende (i) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E2, (ii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E1, (iii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E6 e (iv) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E7;

um vetor que compreende moléculas de ácido nucléico que codificam polipeptídeos HPV-16 E1, E2, E6 e E7 e polipeptídeos HPV-18 E1, E2, E6 e E7.

Desejavelmente, o(s) polipeptídeo(s) E2 codificado(s) é(são) apresentado(s) por membrana e defeituoso(s) para atividades de ativação de transcrição e reprodução. Preferencialmente, o polipeptídeo HPV-16 E2 compreende, alternativamente consiste essencialmente ou alternativamente consiste da seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N0 2; e/ou o polipeptídeo HPV-18 E2 compreende, alternativamente consiste essencialmente ou alternativamente consiste da seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N0 29; e/ou o polipeptídeo HPV-33 E2 compreende, alternativamente consiste essencialmente ou alternativamente consiste da seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N0 30; e/ou o polipeptídeo HPV-52 E2 compreende, alternativamente consiste essencialmente ou alternativamente consiste da seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N° 31.

Independentemente ou em combinação, o(s) polipeptídeo(s) E1 codificado(s) é(são) apresentado(s) por membrana e defeituoso(s) para atividade de reprodução. Preferencialmente, o polipeptídeo HPV-16 E1 compreende, alternativamente consiste essencialmente ou alternativamente consiste da seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N° 3 e/ou o polipeptídeo HPV-18 E1 compreende, alternativamente consiste essencialmente ou alternativamente consiste da seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N° 32. O(s) polipeptídeo(s) E6 e/ou E7 codificado(s) é (são) apresentado(s) por membrana e não oncogênico(s). Preferencialmente, o polipeptídeo HPV-16 E6 compreende, alternativamente consiste essencialmente ou alternativamente consiste da seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N° 4; e/ou o polipeptídeo HPV-16 E7 compreende, alternativamente consiste essencialmente ou alternativamente consiste da seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N° 5.

De maior preferência, a molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo HPV-16 E2 compreende, consiste essencialmente ou consiste da seqüência de nucleotídeos exibida em SEQ ID N° 8; e/ou a molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo HPV-18 E2 compreende, consiste essencialmente ou consiste da seqüência de nucleotídeos exibida em SEQ ID N° 33; e/ou a molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo HPV-33 E2 compreende, consiste essencialmente ou consiste da seqüência de nucleotídeos exibida em SEQ ID N° 34 ou em SEQ ID N° 35; e/ou a molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo HPV-52 E2 compreende, consiste essencialmente ou consiste da seqüência de nucleotídeos exibida em SEQ ID N° 36 ou em SEQ ID N° 37; e/ou a molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo HPV-16 E1 compreende, consiste essencialmente ou consiste da seqüência de nucleotídeos exibida em SEQ ID Nº 7 (seqüências degeneradas para reduzir a homologia com a parte sobreposta de HPV-16 E2); e/ou a molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo HPV-18 E1 compreende, consiste essencialmente ou consiste da seqüência de nucleotídeos exibida em SEQ ID Nº 38 (seqüência degenerada para reduzir a homologia com as seqüências codificadoras de HPV-16 E1).

Conforme discutido no presente com relação à realização relativa a um vetor que compreende duas ou mais moléculas de ácido nucléico que codificam polipeptídeos E2, recomenda-se que as seqüências de nucleotídeos que codificam E2 sejam degeneradas, de forma a exibir um percentual de homologia de menos de 75% entre si, preferencialmente ao longo de todo o comprimento de seqüência. Prefere-se que as mencionadas moléculas de ácido nucléico que codificam E2 não compreendam uma porção de quarenta ou mais (tal como 45, 50, 55, 59, 70 ou até mais) nucleotídeos contíguos que exibem um percentual de identidade de 75% ou mais de 75%. As seqüências de nucleotídeos descritas acima atendem a esta realização.

A(s) molécula(s) de ácido nucléico em uso ou compreendidas no vetor ou partícula viral infecciosa de acordo com a presente invenção pode(m) ser gerada(s) utilizando dados de seqüências acessíveis na técnica e as informações de seqüências fornecidas no presente. Ela(s) pode(m) ser isolada(s) diretamente de células que contenham HPV (tais como células CaSki disponíveis na ATCC sob número de acesso CRL-1550) ou qualquer fonte de papiloma vírus conforme definido acima, por meio de biologia molecular convencional ou métodos de PCR e, se necessário, pode(m) ser adicionalmente modificada(s) conforme definido no presente por meio de métodos de mutagênese rotineira (tal como para otimizar a expressão em uma célula hospedeira específica, para gerar uma variante defeituosa etc.). Alternativamente, a(s) molécula(s) de ácido nucléico de acordo com a presente invenção pode(m) também ser gerada(s) por meio de síntese química em um processo automatizado (tal como montada(s) a partir de oligonucleotídeos sintéticos sobrepostos conforme descrito, por exemplo, em Edge, 1981, Nature 292, 756; Nambair et al, 1984, Science 223, 1299; Jay et al, 1984, J. Biol. Chem. 259, 6311).

Em uma outra realização, a(s) molécula(s) de ácido nucléico em uso de acordo com a presente invenção ou compreendida(s) no vetor ou partícula viral infecciosa de acordo com a presente invenção encontra(m)-se em uma forma apropriada para expressão do(s) polipeptídeo(s) codificado(s) em um organismo ou célula hospedeira, o que significa que a(s) molécula(s) de ácido nucléico é(são) colocada(s) sob o controle de uma ou mais seqüências reguladoras necessárias para a sua expressão.

Da forma utilizada no presente, a expressão "seqüências reguladoras" designa qualquer seqüência que permita, contribua ou module a expressão da molécula de ácido nucléico em uma dada célula hospedeira, incluindo a reprodução, duplicação, transcrição, divisão, tradução, estabilidade e/ou transporte do ácido nucléico ou um de seus derivados (ou seja, mRNA) para a célula hospedeira. Essas seqüências reguladoras são bem conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego). Os técnicos no assunto apreciarão que a escolha das seqüências reguladoras pode depender de fatores tais como o tipo de vetor, célula hospedeira, nível de expressão desejado etc. No contexto da presente invenção, as seqüências reguladoras são ligadas operativamente à molécula de ácido nucléico a ser expressa. "Ligado operativamente" destina-se a indicar que a molécula de ácido nucléico é ligada às seqüências reguladoras de uma forma que permita a sua expressão em um organismo ou célula hospedeira.

O promotor possui importância especial e a presente invenção engloba o uso de promotores constitutivos que dirigem a expressão da molécula de ácido nucléico em muitos tipos de células hospedeiras e as que dirigem a expressão apenas em certas células hospedeiras ou em resposta a eventos específicos ou fatores exógenos (tais como por temperatura, aditivo nutriente, hormônio ou outro ligante). Promotores apropriados são amplamente descritos na literatura e pode-se mencionar mais especificamente promotores virais tais como os promotores RSV (Vírus Sarcoma de Rous), SV40 (Vírus 40 dos Símios), CMV (Citomegalovírus) e MLP (Promotor Posterior Principal). Os promotores preferidos para uso em um vetor viral de varíola incluem, sem limitações, promotores de vacina 7,5K, H5R, TK, p28, p11 e K1L, promotores quiméricos entre os promotores virais de varíola inicial e posterior, bem como promotores sintéticos tais como os descritos em Chakrabarti et al (1997, Biotechniques 23, 1094-1097), Hammond et al (1997, J. Viroiogical Methods 66, 135-138) e Kumar e Boyle (1990, Virology 179, 151-158).

Os técnicos no assunto apreciarão que as seqüências reguladoras que controlam a expressão da molécula de ácido nucléico podem compreender ainda elementos adicionais para início, regulagem e/ou término adequado de transcrição (tais como seqüências de término de transcrição póli A), transporte de mRNA (tais como seqüências de sinal de localização nuclear), processamento (tais como sinais de divisão), estabilidade (tais como introns e seqüências não codificadoras 5' e 3') e tradução (tais como seqüências líderes tripartites, locais de união de ribossomos, seqüências Shine-Dalgarno etc.) no organismo ou célula hospedeira.

No contexto da presente invenção, uma ou mais cópias da molécula de ácido nucléico podem ser compreendidas no mencionado vetor ou partícula viral infecciosa utilizada de acordo com a presente invenção.

O termo "vetor", da forma utilizada no presente, define vetores virais bem como não virais (tais como DNA de plasmídeo), incluindo vetores extracromossômicos (tais como epissomo), multicópias e de integração (ou seja, para incorporação aos cromossomos hospedeiros). São particularmente importantes no contexto da presente invenção os vetores para uso em terapia genética (ou seja, que são capazes de fornecer a molécula de ácido nucléico a um organismo hospedeiro), bem como vetores de expressão para uso em diversos sistemas de expressão. Ao indicar-se um vetor viral, o termo "vetor", da forma utilizada no presente, indica qualquer molécula de ácido nucléico que compreende pelo menos um elemento de origem viral, incluindo um genoma viral completo, uma de suas partes ou um genoma viral modificado conforme descrito abaixo, bem como partículas virais geradas a partir dele (tais como um vetor viral embalado em um capsídeo viral para produzir partículas virais infecciosas).

Os vetores não virais apropriados incluem plasmídeos tais como pREP4, pCEP4 (Invitrogene), pCI (Promega), pCDM8 (Seed, 1987, Nature 329, 840), pVAX e pgWiz (Gene Therapy System Inc.; Himoudi et al, 2002, J. Virol. 76, 12735-12746).

Os vetores virais podem originar-se de uma série de vírus diferentes, especialmente de um vírus selecionado a partir do grupo que consiste de retrovírus, adenovírus, vírus associado a adenovírus (AAV), vírus de varíola, vírus da herpes, vírus do sarampo e vírus de espuma. Os vetores virais podem ser competentes para reprodução ou podem ser geneticamente incapacitados, de forma que sejam defeituosos para reprodução ou tenham sua reprodução impedida. A expressão "competente para reprodução", da forma utilizada no presente, engloba vetores virais seletivos para reprodução e de reprodução condicional que são elaborados para reprodução melhor ou seletiva em células de hospedeiros específicas (tais como células de tumores).

Em um aspecto, o vetor de acordo com a presente invenção é um vetor adenoviral (para análise, consulte Adenoviral Vectors for Gene Therapy, 2002, Ed. D. Curiel e J. Douglas, Academic Press). Ele pode originar-se de uma série de fontes humanas ou animais e qualquer sorotipo pode ser empregado a partir dos sorotipos de adenovírus 1 até 51. São particularmente preferidos os adenovírus humanos 2 (Ad2), 5 (Ad5), 6 (Ad6), 11 (Ad11), 24 (Ad24) e 35 (Ad35). Esses adenovírus são disponíveis por meio da Coleção Norte-Amerieana de Cultivos de Tipos (ATCC, Roekville MD) e foram o objeto de numerosas publicações que descrevem a sua seqüência, organização e métodos de produção, permitindo aos técnicos a sua aplicação (vide, por exemplo, US 6.133.028, US 6.110.735, WO 02/40665, WO 00/50573, EP 1016711; Vogels et al, 2003, J. Viroi 77, 8263-8271).

O vetor adenoviral de acordo com a presente invenção pode ser competente para reprodução. Numerosos exemplos de vetores adenovirais competentes para reprodução são facilmente disponíveis para os técnicos no assunto (Hernandez-Alcoceba et al, 2000, Human Gene Ther. 11, 2009-2024; Nemunaitis et al, 2001, Gene Ther. 8, 746-759; Alemany et al, 2000, Nature Biotechnology 18, 723-727). Eles podem ser elaborados, por exemplo, a partir de um genoma de adenovírus do tipo selvagem por meio de exclusão no domínio CR2 de E1A (tal como WO 00/24408) e/ou por meio de substituição dos promotores E1 e/ou E4 nativos com promotores específicos da situação das células, tumores ou tecidos (por exemplo, US 5.998.205, WO 99/25860, US 5.698.443, WO 00/46355, WO 00/15820 e WO 01/36650).

Alternativamente, o vetor adenoviral para uso na presente invenção é defeituoso para reprodução (vide, por exemplo, WO 94/28152; Lusky et al, 1998, J. Viroi 72, 2022-2032). Vetores adenovirais com defeito de reprodução preferidos são E1 defeituoso (tal como US 6.136.594 e US 6.013.638), com uma exclusão de E1 que se estende aproximadamente a partir das posições 459 a 3328 ou aproximadamente das posições 459 a 3510 (por meio de referência à seqüência do adenovírus humano tipo 5 descrito no GeneBank com o número de acesso M 73260 e em Chroboczek et al, 1992, Virol. 186, 280-285). A capacidade de clonagem pode ser adicionalmente aprimorada por meio de exclusão de parte(s) adicional(is) do genoma adenoviral (tal como na região E3 não essencial ou em outras regiões E2, E4 essenciais). A inserção da molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção pode ser realizada por meio de recombinação homóloga em qualquer local do genoma adenoviral, conforme descrito em Chartier et al (1996, J. Virol. 70, 4805-4810). Preferencialmente, ela é inserida em substituição da região E1. Ela pode ser posicionada em orientação com ou sem sentido com relação à direção de transcrição natural da região em questão.

Em um outro aspecto preferido, o vetor de acordo com a presente invenção é um vetor do vírus da varíola (vide, por exemplo, Cox et al em Viruses in Human Gene Therapy, Ed. J. M. Hos, Carolina Academic Press). Ele pode ser obtido a partir de qualquer membro dos virídeos de varíola, particularmente varíola dos canários (tal como ALVAC, conforme descrito em WO 95/22780), varíola das aves (tal como TROVAC, conforme descrito em Paoletti et al, 1995, Dev. Bioi Stand. 84, 159-163) ou vírus de vacina, em que este último é preferido. Os vírus de vacina apropriados incluem, sem limitações, a linhagem de Copenhague (Goebel et al, 1990, Virol. 179, 247-266 e 517-563; Johnson et al, 1993, Virol. 196, 381-401), a linhagem de Wyeth, NYVAC (vide WO 92/15672 e Tartaglia et al, 1992, Virology 188, 217-232) e a linhagem de Ancara modificada com alta atenuação (MVA) (Mayr et al, 1975, Infection 3, 6-16).

O método básico de inserção da molécula de ácido nucléico e elementos reguladores associados necessários para expressão em um genoma viral de varíola é descrito em numerosos documentos acessíveis para os técnicos no assunto (Paul et al, 2002, Câncer Gene Ther. 9, 470-477; Piccini et al, 1987, Methods of Enzymology 153, 545-563; US 4.769.330, US 4.772.848, US 4.603.112, US 5.100,587 e US 5.179.993). Normalmente, proceder-se-á por meio de recombinação homóloga entre seqüências sobrepostas (ou seja, ladeando o local de inserção desejado) presentes no genoma viral e um plasmídeo que conduz o ácido nucléico para o inserto. A molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção é preferencialmente inserida em um local não essencial do genoma de vírus da varíola, para que o vírus da varíola recombinante permaneça viável e infeccioso. Regiões não essenciais são regiões intergênicas não codificadoras ou qualquer gene para o qual a desativação ou exclusão não impede significativamente o crescimento, reprodução ou infecção viral. Pode-se também idealizar a inserção em um local viral essencial, desde que a função defeituosa seja fornecida in trans durante a produção de partículas virais, utilizando, por exemplo, uma linhagem de células auxiliares que conduz as seqüências complementares correspondentes às excluídas no genoma do vírus da varíola.

Ao utilizar o vírus da vacina de Copenhague, a molécula de ácido nucléico é preferencialmente inserida no gene timidino quinase (tk) (Hruby et al, 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 80, 3411-3415; Weir et al, 1983, J. Virol. 46, 530-537). Outros locais de inserção também são, entretanto, apropriados, tal como no gene de hemaglutinina (Guo et al, 1989, J. Virol. 63, 4189-4198), no local K1L, no gene u (Zhou et al, 1990, J. Geri. Virol. 71, 2185-2190) ou na extremidade esquerda do genoma do vírus da vacina, em que uma série de exclusões espontâneas ou elaboradas foi relatada na literatura (Altenburger et al, 1989, Archives Virol. 105, 15-27; Moss et al, 1981, J. Virol. 40, 387-395; Panicali et al, 1981, J. Virol. 37, 1000-1010; Perkus et al, 1989, J. Virol. 63, 3829-3836; Perkus et al, 1990, Virol. 179, 276-286; Perkus et al, 1991, Virol. 180, 406-410).

Ao utilizar MVA, a molécula de ácido nucléico pode ser inserida em qualquer das exclusões identificadas I a VII que ocorreram no genoma de MVA (Antoine et al, 1998, Virology 244, 365-396) bem como no local D4R, mas a inserção na exclusão Il ou Ill é preferida (Meyeret al, 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038; Sutteret al, 1994, Vaccine 12, 1032-1040).

Ao utilizar-se vírus da varíola das aves, embora possa ser considerada a inserção no gene timidino quinase, a molécula de ácido nucléico é introduzida preferencialmente na região intergênica situada entre ORFs 7 e 9 (vide, por exemplo, EP 314.569 e US 5.180.675).

Preferencialmente, o vetor de acordo com a presente invenção ou em uso de acordo com a presente invenção é um vetor de vírus de vacina com uma preferência especial por um vetor de MVA. De maior preferência, a(s) molécula(s) de ácido nucléico é(são) inserida(s) em exclusão Ill e, eventualmente em direção oposta, especialmente quando as mencionadas moléculas de ácido nucléico são colocadas sob o controle do mesmo promotor. Prefere-se que a(s) molécula(s) de ácido nucléico que codifica(m) E2 e/ou E7 seja(m) colocada(s) sob o promotor H5R de vacina e a(s) molécula(s) de ácido nucléico que codifica(m) E1 e/ou E6 sob o controle do promotor p7.5K.

A presente invenção também engloba o uso de um vetor em complexo com lipídios ou polímeros para formar estruturas particuladas tais como lipossomos, Iipoplexos ou nanopartículas. Estas tecnologias são disponíveis na técnica (vide, por exemplo, Arangoa et al, 2003, Gene Ther. 10: 5-14; Eliaz et al, 2002, Gene Ther. 9, 1230-1237 e Betageri et al, 1993, Liposome Drug Delivery Systems, Technomic Publishing Company, Inc.).

A presente invenção também se refere a partículas virais infecciosas que compreendem as moléculas de ácido nucléico descritas acima ou vetores e sua utilização conforme definido no presente.

Tipicamente, essas partículas virais são produzidas em uma linhagem celular apropriada cultivada sob condições apropriadas e utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Não serão realizadas no presente tentativas de descrição detalhada dos diversos métodos conhecidos de produção de partículas virais infecciosas.

Quando o vetor viral for defeituoso, as partículas infecciosas normalmente são produzidas em uma linhagem celular de complementação ou utilizando um vírus auxiliar, que fornece in trans os genes virais não funcionais. Linhagens celulares apropriadas para complementação de vetores adenovirais com E1 excluído incluem, por exemplo, as células 293 (Graham et al, 1997, J. Gen. Virol. 36, 59-72), bem como as células PER-C6 (Fallaux et al, 1998, Human Gene Ther. 9, 1909-1917) e derivados de PER-C6. Células apropriadas para a propagação de vetores de vírus da varíola são células de aves e, de maior preferência, fibroblastas de embriões de galinha (CEF) primários preparados a partir de embriões de galinhas obtidos de ovos fertilizados. As células produtoras podem ser cultivadas em biorreatores de fermentação convencionais, frascos e discos Petri sob condições apropriadas de temperatura, pH e oxigênio.

As partículas virais infecciosas podem ser recuperadas do sobrenadante de cultivo ou das células após a lise. Elas podem ser adicionalmente purificadas de acordo com métodos padrão (cromatografia, ultracentrifugação conforme descrito, por exemplo, em WO 96/27677, WO 98/00524, WO 98/22588, WO 98/26048, WO 00/40702, EP 1016700 e WO 00/50573).

A presente invenção também engloba o uso de moléculas de ácido nucléico, vetores ou partículas virais que tenham sido modificadas para permitir o direcionamento preferencial a uma célula alvo específica (vide, por exemplo, Wickam et al, 1997, J. Virol. 71, 8221-8229; Arnberg et al, 1997, Virol. 227, 239-244; Michael et al, 1995, Gene Therapy 2, 660-668; WO 94/10323; WO 02/96939 e EP 1.146.125). Uma função característica de vetores direcionados e partículas virais é a presença na sua superfície de um Iigante capaz de reconhecer um componente celular com superfície exposta e unir-se a ele, tal como um marcador específico de células (por exemplo, uma célula infectada por HPV), um marcador específico de tecido (tal como um marcador específico de células epiteliais), bem como um antígeno viral (tal como HPV).

Exemplos de Iigantes apropriados incluem anticorpos ou seus fragmentos dirigidos a um domínio antigênico de HPV. O direcionamento celular pode ser conduzido por meio de inserção genética do Iigante em um polipeptídeo presente sobre a superfície do vírus (tal como fibra adenoviral, penton, pIX ou produto genético vacina p14).

A presente invenção também se refere a células hospedeiras que compreendem as moléculas de ácido nucléico descritas acima, vetores ou partículas virais infecciosas para uso conforme definido no presente.

As moléculas de ácido nucléico, vetores e partículas virais infecciosas de acordo com a presente invenção podem ser introduzidas na célula hospedeira por meio de qualquer método conhecido na técnica. Esses métodos incluem, mas sem limitar-se a microinjeção (Capechi et al, 1980, Cell 22, 479-488), transfecção mediada por CaPO4 (Chen e Okayama, 1987, Moi Cell Biol. 7, 2745-2752), transfecção mediada por DEAE-dextran, eletroporação (Chu et al, 1987, Nucleic Acid Res. 15, 1311-1326), lipofecção/fusão de lipossomos (Felgner et al, 1987, Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A. 84, 7413-7417), bombardeamento de partículas (Yang et al, 1990, Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A. 87, 9568-9572), disparadores genéticos, transdução, infecção viral bem como administração direta a um organismo hospedeiro por diversos meios. Além disso, conforme discutido acima, eles podem ser utilizados em associação com reagentes de transfecção a fim de facilitar a sua introdução na célula hospedeira ou organismo, tais como polímeros policatiônicos (por exemplo, quitosana, polimetacrilato, PEI etc.) e lipídios catiônicos (tais como DC-Chol/DOPE, transfectam Iipofectina agora disponível por meio da Promega).

Em um outro aspecto da presente invenção, a molécula de ácido nucléico descrita acima, vetor ou partícula viral infecciosa (também denominada no presente "agente ativo") ou qualquer de suas combinações é compreendida em uma composição. Essa composição pode incluir vetores ou partículas virais que codificam polipeptídeos E2 de diferentes genótipos.

Convenientemente, a composição é uma composição farmacêutica que compreende adicionalmente uma quantidade terapeuticamente eficaz do(s) agente(s) ativo(s) e um veículo farmaceuticamente aceitável. Da forma utilizada no presente, "quantidade terapeuticamente eficaz" é uma dose suficiente para alívio de um ou mais sintomas normalmente associados à doença ou condição que se deseja tratar. Uma quantidade terapeuticamente eficaz poderá ser, por exemplo, a quantidade necessária para induzir uma reação imunológica ou ativar o sistema imunológico, resultando no desenvolvimento de uma reação anti-HPV. Da forma utilizada no presente, um "veículo farmaceuticamente aceitável" destina- se a incluir todo e qualquer veículo, solvente, diluente, excipiente, adjuvante, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes retardantes da absorção e similares, compatíveis com administração farmacêutica.

Desejavelmente, a composição em uso na presente invenção é formulada para uso humano ou animal. Ela é preferencialmente incluída em um diluente isotônico, hipotônico ou fracamente hipertônico e possui uma resistência iônica relativamente baixa. Exemplos representativos de diluentes apropriados incluem água estéril, solução salina fisiológica (tal como cloreto de sódio), solução de Ringer, soluções de glicose, tre-halose ou sacarose, solução de Hank e outras soluções de sais fisiologicamente equilibradas aquosas (vide, por exemplo, a última edição de Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincot, Williams & Wilkins). Além disso, a composição pode ser tamponada em pH fisiológico ou levemente básico (tal como cerca de pH 7 a cerca de pH 9). Tampões apropriados incluem, sem limitação, tampão de fosfato (tal como PBS), tampão de bicarbonato e tampão de Tris-HCI. Para fins de ilustração, as formulações que são particularmente adaptadas à presente invenção incluem:

1 M de sacarose, 150 mM de NaCI, 1 mM de MgCI2, 54 mg/l de Tween 80, 10 mM de Tris-HCI, pH 8,5 (especialmente quando o agente ativo for um vetor adenoviral); 10 mg/ml de manitol, 1 mg/ml de HSA, 20 mM de Tris, pH 7,2 e 150 mM de NaCI; e solução salina fisiológica.

Estas formulações são particularmente apropriadas para preservação da estabilidade da composição de acordo com a presente invenção sob temperatura de congelamento (tal como -70 0C, -20 0C), refrigerada (tal como 4 0C) ou ambiente. A composição de acordo com a presente invenção pode também ser formulada em forma de sólido. Composições sólidas (tais como em pó seco ou liofilizadas) podem ser obtidas por meio de um processo que envolve secagem a vácuo e secagem por congelamento. Elas são normalmente reconstituídas em um veículo apropriado antes do uso.

A composição pode também conter um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis para o fornecimento de propriedades farmacêuticas ou farmacodinâmicas desejáveis, que incluem, por exemplo, a modificação ou manutenção do pH, osmolaridade, viscosidade, claridade, coloração, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução da formulação, modificação ou manutenção da liberação ou absorção em um organismo humano ou animal, promoção do transporte através de uma barreira de mucosa ou penetração em um órgão específico. Uma composição apropriada para administração vaginal pode eventualmente incluir, por exemplo, um ou mais promotores da absorção úteis para aumentar o tamanho de poro das membranas de mucosa.

Além disso, a composição de acordo com a presente invenção pode compreender um ou mais adjuvantes apropriados para aplicação sistêmica ou via mucosa em seres humanos. Preferencialmente, o adjuvante é capaz de estimular imunidade ao agente ativo, especialmente imunidade mediada por células T, por exemplo, através dos receptores similares a sinos (TLR), tais como TLR-7, TLR-8 e TLR-9. Exemplos representativos de adjuvantes úteis incluem, sem limitação, alúmen, emulsão em óleo mineral tal como Freunds completo e incompleto (IFA), Iipopolissacarideo ou um de seus derivados (Ribi et al, 1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., Nova Iorque, págs. 407-419), saponinas tais como QS21 (Sumino et al, 1998, J. Viroi 72, 4931-4939; WO 98/56415), compostos de imidazoquinolina tais como Imiquimod (Suader, 2000, J. Am. Acad. Dermatol. 43, S6-S11), derivado de 1H-imidazo (4,5-c) quinolon-4-amina (Aldara®) e o composto relacionado S-27609 (Smorlesi, 2005, Gene Ther 12, 1324-1332), oligodeoxinucleotídeos de citosina fosfato guanosina, tais como 2CpG (Chu et al, 1997, J. Exp. Med. 186: 1623; Tritel et al, 2003, J. Immunol. 171: 2358-2547) e peptídeos catiônicos tais como IC-31 (Kritsch et al, 2005, J. Chromatogr. Anal. Technol. BiomedLife Sei. 822, 263-270).

A composição de acordo com a presente invenção pode ser administrada por meio de uma série de modos de administração, incluindo administração sistêmica, tópica e à mucosa. A administração sistêmica pode ser realizada por quaisquer meios, tal como por meio de injeção subeutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intravascular ou intra- arterial. As injeções podem ser realizadas com seringas e agulhas convencionais ou qualquer outro dispositivo apropriado disponível na técnica. A administração à mucosa pode ser realizada por via oral, nasal, intratraqueal, intrapulmonar, intravaginal ou intrarretal. A administração tópica pode ser realizada utilizando meios transdérmicos (tais como emplastros e similares). A composição de acordo com a presente invenção é preferencialmente formulada em uma forma apropriada para injeção, sendo preferida administração intramuscular ou subcutânea.

A dosagem apropriada pode ser adaptada em função de diversos parâmetros, particularmente o modo de administração; o agente ativo empregado; a idade, saúde e peso do organismo hospedeiro; tipo de tratamento concorrente; e/ou freqüência de tratamento. São rotineiramente realizados refinamentos adicionais dos cálculos necessários para determinar a dosagem apropriada de tratamento por um médico, à luz das circunstâncias relevantes. Para orientação geral, a dosagem apropriada de partículas de adenovírus varia de cerca de 105 a cerca de 1013 ui (unidades infecciosas), desejavelmente cerca de 107 a cerca de 1012 ui e, preferencialmente, cerca de 108 a cerca de 1011 ui. A dosagem apropriada para partículas de MVA varia de cerca de 104 a cerca de 1010 pfu (partículas formadoras de placas), desejavelmente cerca de 105 a cerca de 109 pfu e, preferencialmente, cerca de 106 a cerca de 108 pfu. Plasmídeos de vetor podem ser administrados em doses de 10 µg a 20 mg, preferencialmente de 100 µg a 2 mg.

Além disso, a administração pode ter lugar em uma dose única ou, alternativamente, em diversas doses de acordo com protocolos, dosagens e regimes padrão ao longo de várias horas, dias e/ou semanas. Além disso, a administração pode ser por injeção de mistura ou infusão contínua. O organismo hospedeiro pode ser tratado, por exemplo, com pelo menos duas (tais como de duas a dez) administrações da molécula de ácido nucléico, vetor, partícula infecciosa ou composição descrita acima. Preferencialmente, é conduzida seqüencialmente uma primeira série de administrações em um período de tempo que varia de alguns dias a quatro semanas, seguido por uma segunda série de administrações (tais como uma ou duas administrações) conduzidas em até um a seis meses após a última administração da primeira série. O período de tempo entre cada uma das administrações da segunda série pode ser de alguns dias a quatro semanas. Em uma realização preferida, a primeira série de administrações compreende três administrações seqüenciais em intervalos semanais e a segunda série compreende uma administração em até quatro a seis meses após a primeira série. Como orientação geral, quando forem utilizadas partículas infecciosas de MVA de acordo com a presente invenção, a administração é realizada preferencialmente por meio de via subcutânea com uma dose de partículas de MVA compreendida de 106 a 5 χ 108 pfu.

Conforme mencionado acima, a molécula de ácido nucléico, vetor, partícula viral infecciosa ou composição descrita no presente ou sua combinação é administrada preferencialmente após exposição do organismo hospedeiro (paciente) a pelo menos um papiloma vírus e antes da detecção/aparição de uma lesão associada a papiloma vírus. Em outras condições, organismos hospedeiros com infecção por HPV mas que ainda não progrediram para neoplasia são candidatos apropriados para o uso de acordo com a presente invenção, para evitar ou reduzir as possibilidades de progressão para neoplasia e, por fim, para câncer.

"Exposição" indica o encontro de um organismo hospedeiro com pelo menos um papiloma vírus que permite a infecção. Uma série de métodos de diagnóstico é agora disponível na técnica, o que permite o diagnóstico de infecção por papiloma vírus. Uma amostra biológica pode ser recolhida, por exemplo, de um organismo hospedeiro com risco de infecção por papiloma vírus e analisada para determinar a presença de papiloma vírus, ácido nucléico viral (tal como DNA ou mRNA) e/ou antígeno viral. Esses métodos incluem, sem limitações, PCR1 hibridização in situ, imunofluorescência, ELISA e uma série de testes de diagnóstico agora disponíveis. Exemplos representativos de testes apropriados incluem sistema LiPA (WO 99/14377; Lab Biomedical Products, Holanda), teste Hybrid Capture II® (HCII; Digene Corp., Estados Unidos, que permite a detecção de DNA para 13 HR-HPV), o teste Array Linear® (Roche, que permite genotipificação de DNA para genótipos 37 HPV), Sistema Thin Prep (Cytyc Corporate, Marlborogh MA), PreTect-HPV Proofer® (NorChip AS, Noruega, que permite detecção de mRNA E6/E7 para HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 e HPV-45), sistemas PCR/RT PCR e PCR em tempo real conforme descrito em Pretet et al (2004, J. Clin. Viroi 31, 140-147) ou Monnier-Benoit et al (2006, J. Clin. Virol. 31, 140-147). Primers apropriados são conhecidos dos técnicos no assunto ou podem ser facilmente sintetizados com base na seqüência de nucleotídeos do papiloma vírus detectado.

Da forma utilizada no presente, uma "lesão associada a papiloma vírus" designa qualquer doença ou condição causada por infecção por um papiloma vírus. Esta expressão engloba também lesões pré-malignas e malignas. Exemplos representativos de lesões pré-malignas incluem, sem limitações, neoplasia intraepitelial com grau baixo, moderado ou alto que pode ser detectada em diversos tecidos tais como NIC, neoplasia intraepitelial vulvar (VIN), neoplasia intraepitelial anal (AIN), neoplasia intraepitelial peniana (PIN) e neoplasia intraepitelial vaginal (VaIN). Exemplos representativos de lesões malignas incluem, sem limitações, carcinoma da cervical, carcinoma anal, câncer vaginal, câncer peniano e câncer oral. Uma lesão pré-maligna e maligna associada a papiloma vírus pode ser visualizada por meio de exame direto (tal como por colposcopia eventualmente após a aplicação de ácido acético) ou diagnosticada com métodos comumente praticados por médicos (tais como seleção de manchas de Pap1 detecção de células anormais de amostras de citologia). A biópsia local de regiões de acidófilos ou lesões visualizadas por meio de colposcopia pode ser recolhida e examinada, por exemplo, para determinar anormalidades morfológicas (tais como hiperplasia epitelial, anormalidades nucleares marcadas etc.). No contexto da presente invenção, lesões associadas a papiloma vírus não englobam anormalidades suaves tais como ASCUS (células escamosas atípicas com significado não determinado).

Segundo uma referência preferida, a molécula de ácido nucléico, vetor, partícula viral infecciosa ou composição descrita no presente ou sua combinação é utilizada para o tratamento de infecções persistentes causadas por pelo menos um papiloma vírus, especialmente um HR-HPV, com preferência especial para HPV-16, HPV-18, HPV-33 ou HPV-52 ou qualquer de suas combinações (tais como HPV-16 e HPV-18). No contexto da presente invenção, o polipeptídeo E2 pode originar-se do papiloma vírus infeccioso ou de um papiloma vírus que apresente reação cruzada com o papiloma vírus infeccioso.

Devido à conservação das seqüências de aminoácidos entre os polipeptídeos E2 de vários HR-HPV, poder-se-á esperar reação cruzada especialmente entre HPV16 e HPV31, HPV33, HPV35, HPV52 e HPV58. Em um aspecto, a presente invenção utiliza uma molécula de ácido nucléico, vetor, partícula viral infecciosa ou composição que codifica um polipeptídeo E2 originário de HPV-16 para o tratamento de pacientes que sofrem de infecções causadas por pelo menos um dentre HPV16, HPV31, HPV33, HPV35, HPV52 e HPV58.

De forma similar, pode-se esperar reação cruzada entre HPV-18 e HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-56, HPV-59, HPV-68, HPV-70 e HPV-85. Em um outro aspecto, a presente invenção utiliza uma molécula de ácido nucléico, vetor, partícula viral infecciosa ou composição que codifica um polipeptídeo E2 originário de HPV-18 para o tratamento de pacientes que sofrem de infecções causadas por pelo menos um dentre HPV-18, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV- 56, HPV-59, HPV-68, HPV-70 e HPV-85.

Conforme utilizado no presente, uma "infecção por papiloma vírus persistente" corresponde à fase assintomática da infecção por papiloma vírus em um organismo hospedeiro que não tenha atingido erradicação viral espontânea após exposição ao papiloma vírus. É estabelecida uma infecção por papiloma vírus persistente quando papiloma vírus ou pelo menos um dos seus elementos (tal como ácido nucléico, antígenos e similares) for detectado no organismo hospedeiro em dois testes sucessivos separados por vários meses, tais como pelo menos seis meses, convenientemente pelo menos oito meses, preferencialmente pelo menos dez meses e, de maior preferência, pelo menos doze meses, embora nenhum sinal clínico seja observado (tais como lesões associadas a papiloma vírus pré-malignas e/ou malignas). A fase assintomática é caracterizada por uma citologia normal (embora sejam toleradas anormalidades suaves tais como ASCUS). Uma infecção por papiloma vírus persistente é estabelecida, por exemplo, em pacientes que exibem testes de HCII positivos em intervalos de cerca de seis meses apesar de manchas de Pap normais.

Em uma realização, a molécula de ácido nucléico, vetor, partícula viral infecciosa ou composição descrita acima é utilizada de acordo com as modalidades descritas no presente para indução ou ativação de uma reação imunológica no organismo hospedeiro tratado em comparação com a não utilização desses agentes ativos.

A reação imunológica ativada ou induzida pode ser específica e/ou não específica e pode ser humoral e/ou mediada por células. Reações humorais incluem produção de anticorpos contra pelo menos um polipeptídeo de papiloma vírus, enquanto reação celular inclui células auxiliares T e/ou reação de CTL e/ou estímulo da produção de citoquina. Preferencialmente, a reação imunológica ativada ou induzida é eficaz para fornecer uma reação antiviral contra pelo menos um dos papiloma vírus infecciosos.

A capacidade da molécula de ácido nucléico, vetor, partícula viral infecciosa ou composição descrita acima de induzir ou ativar uma reação imunológica em um organismo hospedeiro tratado pode ser avaliada in vitro ou in vivo por meio de uma série de testes que são padrão na técnica (para uma descrição geral de métodos disponíveis para avaliar o início e a ativação de uma reação imunológica, vide, por exemplo, Coligan et al, 1992 e 1994, Current Protocols in Immunology, Ed. J. Wiley & Sons, Inc., National Institute of Health). A medição da imunidade celular pode ser realizada por meio de medição de perfis de citoquina secretados por células efetoras ativadas que incluem as derivadas de células T CD4+ e CD8+ (tais como quantificação de células produtoras de IL-10 ou IFNg por meio de ELIspot), por determinação da situação de ativação de células efetoras imunes (tais como testes de proliferação de células T por uma absorção clássica de [3H] timidina), por meio de teste de linfócitos T específicos de antígenos em um objeto sensibilizado (tal como Iise específica de peptídeo em um teste citotóxico). A capacidade de estimular uma reação celular poderá também ser avaliada, por exemplo, em camundongos singênicos (tais como H2Db) ou em camundongos transgênicos (tais como HLA A2 e HLA B7) por meio de ELISPOT, métodos analíticos com base em tetrâmeros ou outros métodos padrão para análise da imunidade mediada por células Τ. A reação humoral pode ser determinada por meio de união de anticorpos e/ou testes de competição (vide, por exemplo, Harlow, 1989, Antibodies, Cold Spring Harbor Press). Podem ser desenvolvidas, por exemplo, ferramentas imunológicas, tais como ELISA para detecção de anticorpos anti-E2 no organismo hospedeiro tratado.

Em uma outra realização, a molécula de ácido nucléico, vetor, partícula viral infecciosa ou composição descrita acima é utilizada de acordo com as modalidades descritas no presente para fornecer uma reação antiviral contra pelo menos um dos papiloma vírus infecciosos em comparação com a não utilização desses agentes ativos.

Da forma utilizada no presente, uma "reação antiviral" refere-se à redução ou eliminação de sintomas normalmente associados a uma infecção por papiloma vírus no organismo tratado. Uma reação antiviral pode ser determinada, por exemplo, pela capacidade do(s) agente(s) ativo(s) descrito(s) acima de controlar a infecção viral, reduzir ou liberar pelo menos um dos papiloma vírus infecciosos e/ou reduzir ou liberar as células infectadas ou as que expressam seqüências genéticas de papiloma vírus (especialmente os genes E6 e E7 potencialmente oncogênicos). Isso pode ser avaliado por uma redução significativa da falta de nível detectável de marcadores que indicam infecção por papiloma vírus, tais como papiloma vírus, ácido nucléico viral e/ou antígenos virais, em uma amostra biológica recolhida do organismo hospedeiro sendo tratado em comparação com antes do uso. A redução ou eliminação é indicada por meio de comparação do nível desse(s) marcador(es) medido no momento após o término do uso de acordo com a presente invenção ao nível do(s) mesmo(s) marcador(es) medido antes desse uso que representa infecção não tratada. Em uma realização preferida, a reação antiviral é tal que não há papiloma vírus, ácido nucléico viral e/ou antígenos medidos em uma amostra biológica recolhida do organismo hospedeiro sendo tratado por vários meses após o término do uso de acordo com a presente invenção.

Uma reação antiviral pode também ser determinada pela capacidade do(s) agente(s) ativo(s) descrito(s) acima de reduzir significativamente a ocorrência, o tamanho e/ou a severidade de lesões que tipicamente se desenvolvem em organismos infectados por papiloma vírus. Da forma utilizada no presente, "reduzir" significa evitar, atrasar, ocultar, reduzir a velocidade, retardar e/ou postergar o desenvolvimento em ocorrência, tamanho e/ou severidade das lesões associadas a papiloma vírus conforme definido no presente. A capacidade do agente ativo descrito acima de reduzir a ocorrência, o tamanho e/ou a severidade de lesões associadas a papiloma vírus pode ser avaliada por meio de acompanhamento regular do organismo hospedeiro tratado. Preferencialmente, a redução é tal que o organismo hospedeiro tratado não desenvolve nenhuma lesão associada a papiloma vírus (tais como lesões NIC confirmadas histologicamente) por pelo menos um ano, convenientemente por pelo menos dois anos, preferencialmente por pelo menos três anos e, de maior preferência, por pelo menos cinco anos após o término do uso de acordo com a presente invenção. De maior preferência, o uso de acordo com a presente invenção permite atrasar ou eliminar a necessidade de um procedimento ablativo (tal como conização) no organismo hospedeiro tratado.

Como indicação geral, o período de tempo que separa a última administração do agente ativo no organismo hospedeiro e a detecção da reação antiviral pode variar, dependendo da história da infecção por papiloma vírus, das modalidades de uso e/ou do organismo hospedeiro sendo tratado. Preferencialmente, é uma questão de três meses a vários anos, com preferência especial por pelo menos três meses, convenientemente pelo menos quatro meses, desejavelmente pelo menos cinco meses, preferencialmente pelo menos seis meses e, de maior preferência, pelo menos um ano. É determinada uma reação antiviral, por exemplo, se o organismo hospedeiro que foi positivo antes do tratamento para DNA HPV conforme detectado em uma amostra cervical, tal como por meio de Digen HCII, for detectado como negativo para o mesmo papiloma vírus pelo menos seis meses após a última administração do agente ativo descrito acima.

A presente invenção também se refere a um método de indução, ativação ou ampliação de uma reação imunológica contra pelo menos um dentre o papiloma vírus infeccioso em um organismo hospedeiro que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz ao mencionado organismo da molécula de ácido nucléico, vetor, partícula viral infecciosa ou composição descrita acima, de forma a induzir, ativar ou ampliar a mencionada reação imunológica, em que a mencionada molécula de ácido nucléico, vetor, partícula viral infecciosa ou composição é administrada após a exposição ao papiloma vírus e antes da detecção/aparição de uma lesão associada a papiloma vírus. Preferencialmente, a reação imunológica induzida ou ativada fornece uma reação antiviral contra pelo menos um dos papiloma vírus infecciosos, conforme definido acima.

Em uma realização, o método ou uso de acordo com a presente invenção pode ser conduzido em conjunto com uma ou mais modalidades terapêuticas convencionais. Diversas abordagens terapêuticas fornecem ao organismo hospedeiro uma intervenção em bases mais amplas. A sua administração pode preceder, ser concomitante ou subseqüente à administração da molécula de ácido nucléico, vetor, partícula viral infecciosa ou composição de acordo com a presente invenção.

Em uma outra realização, o método ou uso de acordo com a presente invenção pode ser conduzido de acordo com uma modalidade terapêutica de amplificação de primer que compreende a administração seqüencial de um ou mais primers e um ou mais amplificadores. Tipicamente, o primer e o amplificador utilizam diferentes veículos que compreendem ou codificam pelo menos um domínio imunogênico em comum. O primer é administrado inicialmente ao organismo hospedeiro e o amplificador é administrado em seguida ao mesmo organismo hospedeiro após um período que varia de um dia a doze meses. O método ou uso de acordo com a presente invenção pode compreender de uma a dez administrações seqüenciais do primer, seguidas por uma a dez administrações seqüenciais do amplificador. Além disso, o primer e o amplificador podem ser administrados no mesmo local ou em locais alternativos pela mesma via ou por vias diferentes de administração, tais como injeção subcutânea para um vetor de MVA1 injeção intramuscular para um plasmídeo de DNA e para um vetor adenoviral.

No contexto da presente invenção, a molécula de ácido nucléico, vetor, partícula viral infecciosa ou composição descrita acima pode ser utilizada para servir de primer ou amplificador ou de ambos, primer e amplificador, de uma reação imunológica antipapiloma vírus. Vetor ou partículas de adenovírus conforme definido acima podem ser utilizados, por exemplo, como um primer e vetor ou partículas de MVA, conforme definido acima, como um amplificador ou vice versa. Também é possível utilizar a molécula de ácido nucléico, vetor, partícula viral infecciosa ou composição descrita acima em combinação com qualquer material do estado da técnica que codifica ou compreende um domínio antigênico em comum com a composição de acordo com a presente invenção. A fonte desse material é ampla e inclui, sem limitações, peptídeos, proteínas (tais como um polipeptídeo E2 produzido de forma recombinante), vetores virais, DNA de plasmídeo, partículas proteináceas tais como partículas similares a vírus, materiais celulares tais como células irradiadas etc.

A presente invenção foi descrita de uma forma ilustrativa e deve- se compreender que a terminologia que foi utilizada destina-se a encontrar-se na natureza de palavras de descrição e não de limitação. Obviamente, muitas modificações e variações da presente invenção são possíveis à luz dos ensinamentos acima. Deve-se compreender, portanto, que, dentro do escopo das reivindicações anexas, a presente invenção pode ser praticada de uma forma diferente da descrita especificamente no presente.

Todas as descrições de patentes, publicações e listagens de bancos de dados mencionadas acima são integralmente incorporadas especificamente ao presente como referência da mesma forma como se cada uma dessas patentes, publicações ou listagens individuais fossem específica e individualmente indicadas como sendo incorporadas como referência.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 ilustra uma representação esquemática do plasmídeo pTG17408 que codifica um polipeptídeo HPV-16 E2 defeituoso e apresentado por membrana.

A Figura 2 ilustra uma representação esquemática do plasmídeo pTG17409 que codifica um polipeptídeo HPV-16 E1 apresentado por membrana e com defeito de reprodução, cuja seqüência de nucleotídeos foi degenerada na porção de 59 nucleotídeos comuns para a seqüência de codificação de HPV-16 E2.

A Figura 3 ilustra a resposta de IFNg Th 1 específica de E2 detectada por meio de ELISPOT em camundongos que receberam injeção de MVATG17408 (MVA-E2) ou do controle negativo MVA-N33.

Os exemplos a seguir servem para ilustrar a presente invenção.

Exemplos

As construções descritas abaixo são conduzidas de acordo com os métodos de clonagem molecular e elaboração genética gerais descritos em Maniatis et al (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque) ou de acordo com as recomendações do fabricante ao utilizar-se um kit comercial. Métodos de amplificação por PCR são conhecidos dos técnicos no assunto (vide, por exemplo, PCR Protocols - A Guide to Methods and Applications, 1990, publicado por lnnis, Gelfand, Sninski e White, Academic Press). Os plasmídeos recombinantes que conduzem o gene de resistência à ampicilina são reproduzidos em E. coli C600 (Stratagene), BJ5183 (Hanahan, 1983, J. Mol BioL 166, 557-580) e NM522 sobre Agar ou meio líquido suplementado com 100 pg/ml de antibiótico. A linhagem BJ5183 é preferencialmente utilizada ao conduzir-se a clonagem por meio de recombinação homóloga (Bubek et al, 1993, Nucleic Acid Res. 21, 3601-3602).

As construções dos vírus de vacina recombinantes são realizadas de acordo com a tecnologia convencional no campo nos documentos mencionados acima e em Mackett et al (1982, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 79, 7415-7419) e Mackett et al (1984, J. Viroi 49, 857-864). O gene de seleção gpt (xantino guanina fosforibosiltransferase) de E. coli (Falkner e Moss1 1988, J. Virol. 62, 1849-1854) é utilizado para facilitar a seleção dos vírus de vacina recombinantes.

Exemplo 1

Construção de um Vetor MVA Recombinante que Expressa Gene HPV-16 E2

Clonagem do gene HPV16 E2: As seqüências de nucleotídeos que codificam HPV16 E2 foram clonadas a partir do DNA genômico isolado de células CaSki (ATCC CRL- 1550). O gene E2 foi amplificado utilizando primers OTG16809 (SEQ ID N0 9) e OTG16810 (SEQ ID N0 10). O fragmento resultante foi digerido por meio de SamHI e EcoRI e inserido em pGEX2T (Amersham Biosciences) restrito pelas mesmas enzimas, gerando pTG17239. O seqüenciamento do gene E2 clonado exibiu cinco mutações que comparam seqüência de protótipos HPV16 E2 (descrita em Genbank NC-01526). Duas mutações foram silenciosas e as três mutações não silenciosas (T210I, S219P, K310T) foram corrigidas utilizando o Kit de Mutagênese Dirigida a Local QuikChange (Stratagene), gerando pTG 17268.

Modificação do polipeptídeo HPV-16 E2 As seqüências de nucleotídeos E2 incorporadas em pTG17268 foram modificadas por meio de mutagênese dirigida a local, a fim de gerar uma variante de HPV-16 E2 (E39A e I73A), denominada E2*. Mais especificamente, a função de reprodução de E2 foi abolida pela substituição do resíduo Glu na posição 39 com um Ala e a função de transativação por meio de substituição do resíduo de Ile na posição 73 com um Ala. O plasmídeo resultante pTG17318 compreende as seqüências modificadas que codificam HPV-16 E2*.

HPV-16 E2* foi adicionalmente modificado por meio de fusão no seu terminal N a um sinal de peptídeo e no seu terminal C a uma seqüência de ancoragem de membrana derivada da glicoproteína do isolado de vírus de hidrofobia (Genbank ay009097), de forma a dirigir a apresentação de HPV-16 E2* na expressão de células hospedeiras à superfície de membrana de plasma. As seqüências de nucleotídeos (SEQ ID N0 8) que codificam a variante com defeito de E2 apresentada pela membrana, denominada SS-E2*-TMR, foram novamente montadas por meio de PCR triplo utilizando os primers a seguir: OTG17500 (SEQ ID N0 11), OTG17501 (SEQ ID N0 12), OTG17502 (SEQ ID N0 13), OTG17503 (SEQ ID N0 14), OTG17504 (SEQ ID N0 15) e OTG17505 (SEQ ID N0 16). A seqüência montada novamente foi inserida em um vetor derivado de pBS (Stratagene), para gerar pTG17360, e clonada em seguida em um plasmídeo de transferência de vacina abaixo no fluxo do promotor pH5R (Rosei et al, 1986, J. Virol. 60, 436-449), resultando em pTG17408 (Figura 1).

O plasmídeo de transferência é projetado para permitir a inserção da seqüência de nucleotídeos a ser transferida para recombinação homóloga na exclusão III do genoma MVA. Ele se origina do plasmídeo pTG1E (descrito em Braun et al, 2000, Gene Ther. 7, 1447-1457) no qual foram clonadas as seqüências laterais (BRG3 e BRD3) em volta da exclusão Ill de MVA, que foram obtidas por meio de PCR a partir de DNA MVATGN33.1 (Sutter e Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 89, 10847-10851). O plasmídeo de transferência também contém uma fusão entre a proteína Fluorescente Verde amplificada por Aequorea victoria (gene eGFP, isolado a partir de pEGP-C1, Clontech) e o gene xantino-guanina fosforibosiltransferase de Escherichia coli (gene gpt) sob o controle do promotor sintético de vírus de vacina posterior inicial p11K7.5 (fornecido por R. Wittek, Universidade de Lausanne). A síntese de xantino-guanina fosforibosiltransferase permite a formação de placas por MVA recombinante GPT+ para formar placas em um meio seletivo que contém ácido micofenólico, xantina e hipoxantina (Falkner et al, 1988, J. Viroi 62, 1849-1854) e eGFP permite a visualização de placas de MVA recombinantes. O marcador de seleção eGPP-GPT é colocado entre duas seqüências homólogas na mesma orientação. Quando a seleção clonal for atingida, o marcador de seleção é facilmente eliminado por diversas passagens sem seleção, o que permite o crescimento de MVA recombinante de eGPP-GPT.

Construção de um MVA recombinante que expressa o gene HPV-16 SS-E2*-

TMR

A geração de vírus MVATG17408 foi realizada por meio de recombinação homóloga em fibroblastas de embriões de galinha (CEF) primários infectados com MVATGN33.1 (em MOI de 0,1 pfu/célula) e transfectados com pTG 17408 (de acordo com a precipitação de DNA de fosfato de cálcio padrão). A seleção viral foi realizada por meio de três rodadas de purificação de placas na presença de um meio seletivo que contém ácido micofenólico, xantina e hipoxantina. Conforme mencionado acima, o marcador de seleção foi eliminado em seguida por meio de passagem em um meio não seletivo. A ausência de contaminação por MVA parental foi verificada por meio de PCR.

Análise de expressão de E2 foi realizada por meio de Western Blot. CEF foram infectados em MOI 0,2 com MVATG17408 e, após 24 horas, as células foram colhidas. Realizou-se análise Western Blot utilizando anticorpo anti-E2 monoclonal comercial TVG271 (Abcam). Foi detectada a expressão de uma proteína com um peso molecular aparente de 55 kDa, embora o peso molecular teórico de E2*-TMR fosse de 48,9 kDa. Após o tratamento de extratos celulares com endoglicosidase F, observou-se uma redução do tamanho da proteína recombinante, o que sugere que E2*-TMR é modificado por meio de N-glicosilação.

Exemplo 2

Construção de um MVA Recombinante que Expressa Gene HPV-16 E1

As seqüências de nucleotídeos que codificam polipeptídeo HPV16 E1 foram clonadas a partir de DNA de células CaSki (ATCC CRL-1550). Mais especificamente, o gene E1 foi amplificado em duas partes E1a (nt 1 - 1102) e E1b (nt 1001 a 1950). Os primers OTG16811 (SEQ ID N0 17) e OTG 16814 (SEQ ID N0 18) foram utilizados para amplificar fragmento de E1a, que foi digerido por BamHI e EcoRI e inserido em pGEX2T restrito pelas mesmas enzimas, o que resulta em pTG17240. O fragmento de E1b foi gerado utilizando OTG16813 (SEQ ID N0 19) e OTG16812 (SEQ ID N0 20) e digerido por SamHI e EcoRI antes da inserção em pGEX2T, resultando em pTG17241. O seqüenciamento exibiu quatro mutações em comparação com a seqüência de protótipos HPV-16 E1 (descrita em Genbank NC-01526). Uma mutação foi silenciosa e as três mutações não silenciosas presentes em E1a (K130Q, N185T e T220S) foram corrigidas por meio de mutagênese dirigida a local. O gene E1 completo foi montado novamente em seguida por meio de clonagem do fragmento de E1a corrigido em pTG17241 digerido por SsrGI e EcoRI. O plasmídeo resultante foi denominado pTG 17289.

No genoma HPV-16, os 59 últimos nucleotídeos do gene E1 são idênticos aos 59 primeiros nucleotídeos do gene E2. A presença dessas seqüências homólogas pode gerar eventos de recombinação homóloga e, portanto, instabilidade durante etapas de produção de um vetor MVA que codifica E1 e E2. Esta parte de seqüências de codificação de E1 foi, portanto, modificada por meio de degeneração do uso de códons, de forma a reduzir a homologia de seqüência com a seqüência de codificação de E2. A seqüência degenerada foi obtida por meio de amplificação da extremidade 3' de gene E1 utilizando primers degenerados OTG17408 (SEQ ID N0 21) e OTG17409 (SEQ ID N0 22). O fragmento amplificado foi digerido por Λ/s/l e BgIW e inserido em pTG 17289 restringido pelas mesmas enzimas, gerando pTG 17340.

As seqüências E1 degeneradas por HPV-16 também sofreram mutação por meio de mutagênese dirigida a local, a fim de abolir a função de reprodução do polipeptídeo E1 codificado, substituindo o resíduo Gly na posição 482 de HPV-16 E1 com um resíduo Asp (G482D; também denominado no presente E1*), resultando em pTG17373.

As seqüências E1deg* de HPV-16 também foram modificadas de forma a dirigir a expressão do polipeptídeo codificado na superfície de células de plasma, por meio de fusão com o sinal de peptídeo e as seqüências de ancoragem de membranas derivadas da glicoproteína do isolado de vírus de hidrofobia (descrito em Genbank n° M38452). A seqüência de SS-E1deg*-TMR foi reconstituída por meio de PCR triplo utilizando os primers a seguir OTG17560 (SEQ ID N0 23), OTG17561 (SEQ ID N0 24), OTG17562 (SEQ ID N0 25), OTG17563 (SEQ ID N0 26), OTG17564 (SEQ ID N0 27) e OTG17565 (SEQ ID N0 28). A seqüência resultante (SEQ ID N0 7) foi inserida em um vetor derivado de pBS (Stratagene), gerando pTG17404. A seqüência SS-EIdeg*- TMR foi clonada em seguida no plasmídeo de transferência conforme descrito no Exemplo 1, abaixo no fluxo do promotor p7.5K (Cochran et al, 1985, J. Virol. 54: 30-37), gerando pTG17409 (Figura 2).

A geração de vírus MVATG17409 foi realizada em CEF por meio de recombinação homóloga conforme descrito no Exemplo 1.

Exemplo 3

Construção de um MVA Recombinante que Expressa Genes HPV-16 Ε1 ε E2 A seqüência de SS-E1deg*-TMR controlada pelo promotor p7.5K foi isolada de pTG17409 e inserida em pTG17408, gerando pTG17410.

A geração de vírus MVATG17410 foi realizada em CEF por meio de recombinação homóloga conforme descrito no Exemplo 1.

Exemplo 4

Construção de um MVA Recombinante que Expressa Genes HPV-16 E1. E2. E6 ε E7

O gene HPV-16 E7 foi isolado e modificado conforme descrito em

WO 99/03885, de forma a codificar um polipeptídeo E7 endereçado a membrana e não oncogênico ilustrado em SEQ ID N° 5. Realizou-se mutação não oncogênica por meio de exclusão dos resíduos de aminoácidos 21 a 26 (DLYCYE) e endereçamento de membranas por meio de fusão ao sinal de peptídeo e seqüências de ancoragem de membranas da glicoproteína do vírus de hidrofobia. A seqüência resultante foi clonada sob o controle do promotor de pH5R posterior inicial. O conjunto de expressão foi introduzido em seguida em pTG 17410, para gerar pTG17482.

O gene HPV-16 E6 foi isolado e modificado conforme descrito em WO 99/03885, de forma a codificar um polipeptídeo E6 endereçado a membrana e não oncogênico ilustrado em SEQ ID N° 4. Realizou-se mutação não oncogênica por meio da exclusão de resíduos de aminoácidos 118 a 122 (CPEEK) e endereçamento de membrana por meio de fusão ao sinal de peptídeo e seqüências de ancoragem de membrana da proteína F de vírus do sarampo. A seqüência resultante foi clonada sob o controle do promotor de p7.5K. O conjunto de expressão foi introduzido em seguida em pTG17482, para gerar pTG17483.

A geração de MVATG174783 foi realizada conforme descrito no

Exemplo 1.

Exemplo 5

Avaliação da Reação de Th1 Específica de HPV-16 E2 em Camundongos

A reação de Th1 específica de HPV-16 E2 foi avaliada por meio de ELISPOT em camundongos injetados com MVATG17408 (MVA-E2). Peptideos MHC classe I restritos por HLA-A0201 humanos e restringidos por H2b específicos de genótipos previstos por BIMAS e SYFPEITHI foram selecionados para analisar células produtoras de IFNy em resposta a E2. Estes peptídeos são exibidos na Tabela I a seguir.

Tabela I

<table>table see original document page 63</column></row><table>

Fêmeas de camundongos C57BI/6 foram imunizadas por via subcutânea por três vezes (no Dia 0, 7 e 14) com 5 χ 107 pfu de MVATGN33 (controle negativo) ou MVATG17408 (MVA-E2). Os baços foram retirados no dia 21 após a primeira imunização e γ-IFN ELISPOT foram realizados utilizando os peptídeos descritos acima em uma concentração de 5 pg/ml. Elispot foi conduzido utilizando o kit IFNy ELISPOTplus de camundongo Mabtech AB (Mabtech, França) de acordo com as instruções do fabricante. As manchas foram contadas utilizando o leitor Elispot Bioreader 4000 Pro-X (BIOSYS GmbH; Serlabo1 França). Os resultados foram obtidos após a subtração de antecedentes de peptídeos irrelevantes.

Conforme ilustrado na Figura 3, quatro peptídeos geram uma quantidade significativa de esplenócitos produtores de IFNy, em comparação com a reação de fundo medida em animais vacinados com MVA-N33. Todos esses peptídeos são específicos de HPV16. F9V e N9I foram definidos no contexto de H2-Db de camundongo e A9L e T9V foram definidos no contexto de HLA-A201 humano. Dever-se-á observar que o peptídeo A9L foi descrito como induzindo reação de CTL específica (Konya et al, 1997, J. Gen. ViroL 78, 2615-20).

Em conclusão, conforme exibido por meio de ELISPOT, a injeção subcutânea de MVATG17408 induz reações de células T contra HPV16 nos camundongos vacinados.

Exemplo 6

Construção de um Vetor de MVA Recombinante que Expressa os Genes HPV-18 Ε1 E E2 (MVATG17582) Os genes HPV-18 E1 e E2 foram reconstituídos como genes sintéticos e os oligonucleotídeos foram projetados de forma a reduzir a homologia para menos de 75% entre a parte de 59 nucleotídeos presentes na extremidade 3' da seqüência HPV-18 E1 nativa e na extremidade 5' da seqüência HPV-18 E2 e para introduzir as mutações abolindo as funções enzimáticas do produto genético HPV-18 E1 e E2 (E1: G489D, E2: E43A e I77A). A seqüência de HPV-18 E1 sintética também foi projetada de forma a reduzir o percentual de homologia entre as partes homólogas compartilhadas pelas seqüências HPV-16 e HPV-18 nativas para menos de 75%. Com este propósito, as seqüências de nucleotídeos de genes HPV-16 e HPV-18 E1 e E2 foram alinhadas e os oligonucleotídeos foram projetados de forma a reduzir a homologia para menos de seis nucleotídeos consecutivos.

A seqüência de HPV-18 degE1* foi reconstituída por meio de montagem de cinqüenta oligonucleotídeos e clonada em um vetor de pBS que gera pTG17473. A seqüência de E1 foi fundida em seguida à seqüência de nucleotídeos que codifica os peptídeos de sinalização de proteína F de vírus do sarampo (SS-18E1deg*-TMF) por um PCR triplo utilizando os primers OTG15315 (SEQ ID N0 39), OTG17881 (SEQ ID N0 40), OTG17882 (SEQ ID N0 41), OTG17883 (SEQ ID N0 42), OTG17884 (SEQ ID N0 43) e OTG17885 (SEQ ID N0 44). O fragmento resultante (SEQ ID N0 38) que codifica o polipeptídeo SS18deg E1*-TMF foi clonado em um vetor de transferência de MVA sob o controle de promotor p7.5K, para gerar pTG17521.

A seqüência de HPV-18 degE2* foi reconstituída por meio de montagem de 26 oligonucleotídeos e clonada em um vetor pBS, gerando pTG 17498. A fusão com o sinal e os peptídeos de ancoragem de membrana da glicoproteína do vírus da hidrofobia (linhagem ERA; Genbank n° M38452) foi realizada por meio de PCR triplo utilizando os primers OTG17875 (SEQ ID N0 45), OTG17876 (SEQ ID N0 46), OTG17877 (SEQ ID N0 47), OTG17878 (SEQ ID N0 48), OTG17879 (SEQ ID N0 49) e OTG1788Í) (SEQ ID N0 50). O fragmento resultante (SEQ ID N0 33) que codifica o polipeptídeo SS-18E2*- TMR foi inserido no plasmídeo de transferência de MVA abaixo no fluxo do promotor de pH5R, gerando pTG17552. Por fim, o conjunto de p7.5K-SS- E1deg*-TMF foi isolado de pTG17521 e inserido em pTG17552, gerando pTG 17582.

A geração de MVATG17521, MVATG17552 e MVATG17582 recombinante foi realizada conforme descrito acima. Após a infecção de células cultivadas, a expressão de polipeptídeo HPV-18 E1 das construções de MVA foi confirmada por meio de Western Blot utilizando soro obtido de coelhos imunizados. Exemplo 7

Construção de um Vetor de MVA Recombinante Multivalente que Expressa

os Genes HPV-16 ε HPV-18 E1 ε E2 (MVATG17583)

O conjunto de p7.5K-SS-18E1deg*-TMF e o conjunto de pH5R- SS-18E2*-TMR foram introduzidos em pTG17410 (que contém o conjunto p7.5K-SS-16E1 deg*-TMR e pH5R-SS-16E2*-TMR) e o plasmídeo de transferência resultante foi denominado pTG17583. A geração de MVATG17583 foi realizada conforme descrito acima. Após a infecção de células cultivadas por MVA TG17583, a expressão de polipeptídeos HPV-16 E1, HPV-16 E2 e HPV-18 E1 foi confirmada por meio de Western Blot utilizando soro obtido de coelhos imunizados.

Exemplo 8

Construção de um Vetor de MVA Recombinante que Expressa Gene HPV-33 E2

Um gene sintético que codifica polipeptídeo HPV-33 E2 foi sintetizado pela Geneart (Regensburg, Alemanha). A seqüência sintética foi projetada de forma a (i) reduzir o percentual de homologia para menos de 75% com genes E2 de HPV-16, HPV-18 e HPV-52 (caso partes homólogas possíveis sejam reduzidas para menos de seis nucleotídeos consecutivos) e (ii) introduzir as mutações abolindo as funções enzimáticas do produto genético HPV-33 (E39A e I73A).

A seqüência de HPV-33 degE2* foi fundida em seguida com seqüência de nucleotídeos que codifica o sinal e os peptídeos de ancoragem de membranas da glicoproteína do vírus de hidrofobia (linhagem ERA, Genbank n° M38452). Isso foi realizado por meio de PCR triplo utilizando os primers OTG18962 (SEQ ID Nº 51), OTG18963 (SEQ ID Nº 52), OTG18964 (SEQ ID Nº 53), OTG18965 (SEQ ID Nº 54), OTG18966 (SEQ ID Nº 55) e OTG18967 (SEQ ID Nº 56). O fragmento resultante (SEQ ID Nº 35) que codifica o polipeptídeo SS-33degE2*-TMR foi clonado em um vetor de transferência de MVA sob o controle de promotor p7.5K e as partículas de vírus foram geradas conforme descrito acima.

Exemplo 9

Construção de um Vetor de MVA Recombinante que Expressa Gene HPV-52 E2

Um gene sintético que codifica o polipeptídeo HPV-52 E2 foi sintetizado pela Geneart (Regensburg, Alemanha). A seqüência sintética foi projetada de forma a (i) reduzir o percentual de homologia para menos de 75% com genes E2 de HPV-16, HPV-18 e HPV-33 (as partes homólogas são preferencialmente reduzidas para menos de seis nucleotídeos consecutivos) e (ii) introduzir as mutações abolindo as funções enzimáticas do produto genético HPV-52 (E39A e I73A).

A seqüência de HPV-52 E2*deg sintética foi fundida em seguida com seqüências de nucleotídeos que codificam o sinal e os peptídeos de ancoragem de membrana da proteína de vírus do sarampo F (gerando SS- 52E2*deg-TMF) por meio de PCR triplo utilizando os primers OTG18968 (SEQ ID N0 57), OTG18969 (SEQ ID N0 58), OTG18970 (SEQ ID N0 59), OTG18971 (SEQ ID N0 60), OTG18972 (SEQ ID N0 61) e OTG18973 (SEQ ID N0 62).

O fragmento resultante (SEQ ID N0 37) que codifica o polipeptídeo SS-52E2*deg-TMF foi inserido em um plasmídeo de transferência de MVA abaixo no fluxo do promotor de p7.5K e foram geradas partículas de vírus conforme descrito acima.

Exemplo 10

Construção de um Vetor de MVA Recombinante Multivalente que Expressa Gene HPV-16. HPV-18, HPV-33 e HPV-52 E2

O conjunto de pH5R-SS-18E2*-TMR que codifica o polipeptídeo

HPV-18 E2 defeituoso enzimaticamente e apresentado por membrana (isolado de pTG17552), o conjunto p7.5K-SS-33degE2*-TMR que codifica o polipeptídeo HPV-33 E2 defeituoso enzimaticamente e apresentado por membrana e o conjunto p7.5K-SS-52degE2*-TMF que codifica o polipeptídeo HPV-52 E2 defeituoso enzimaticamente e apresentado por membrana foram introduzidos em pTG17408 (que contém o conjunto pH5R-SS-16E2*-TMR) e partículas de vírus foram geradas conforme descrito acima.

Exemplo 11

Modelo Animal para Avaliação da Eficácia Terapêutica das Construções de MVA Recombinantes

O modelo de CRPV é o único modelo de laboratório no qual persistem papilomas induzidos por vírus apesar da imunocompetência e evoluem sob pressão de hospedeiro seletiva em carcinomas de células escamosas metastáticos e invasivos (Brandsma, 1994, Intervirology 37, 189- 190 e Brandsma, 1996, Animal Models for Human Papillomavirus Vaccine Development, págs. 69-78, em C. Lacey (Ed.), Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses, Leeds University Press, Leeds, Reino Unido). MVA que expressa E2 poderá ser testado neste modelo, a fim de avaliar a sua eficácia terapêutica com relação a papiloma vírus persistente. Devido à falta de proteção cruzada entre os antígenos HPV e CRPV, entretanto, foram geradas construções de MVA específicas de CRPV recombinantes com os antígenos de CRPV (descritos no Genbank com o número de acesso NC_001541) que substituem os seus correspondentes HPV-16. Mais especificamente, foram construídos os MVAs recombinantes a seguir: MVATG17535 que compreende, inserido na exclusão III, o conjunto de expressão que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo CRPV E2 (seqüência de referência) fundido com os peptídeos de ancoragem de membrana e sinal da glicoproteína de vírus do sarampo F (SR-CRPVE2-TMF) colocados sob o controle do promotor de pH5R; MVATG17534 que compreende, inserido na exclusão III, o conjunto de expressão que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo CRPV E1 (seqüência de referência) fundido com os peptídeos de ancoragem de membrana e sinal da glicoproteína de vírus de hidrofobia (SR-CRPVE1-TMR) colocados sob o controle do promotor de p7.5K; e MVATG17562 que compreende, inseridos na exclusão III, os conjuntos de expressão de CRPV E2 (pH5R-SR-CRPVE2-TMF) e CRPV E1 (p7.5K-SR- CRPVE1-TMR).

Fêmeas de coelhos brancos da Nova Zelândia foram inoculadas com DNA de CRPV no Dia 1 utilizando transferência de DNA mediada por partículas com o sistema disparador de genes Helios (Biorad). Partículas de ouro com 1,6 pm foram revestidas com DNA viral conforme indicado pelo fabricante e foram fornecidas a 0,1 pg por local em três locais e a 0,5 pg por local em três outros locais nas costas do coelho. No dia 2, 9 e 16, o possível MVA recombinante de CRPV foi injetado por via intradérmica nas costas do coelho. Monitorou-se o desenvolvimento de verrugas semanalmente por oito a doze semanas.

Ao final do experimento, os coelhos foram sacrificados e locais epidérmicos que haviam sido injetados com DNA de CRPV e que não apresentaram papilomas foram extirpados e congelados. DNAs foram extraídos e a presença de DNA de CRPV foi testada por meio de análise de PCR, para determinar se a vacinação com MVA havia induzido a liberação viral. Listagem de Seqüências

<110> TRANSGENE S.A.

BAUDIN Martine BALLOUL Jean-Marc SILVESTRE Nathalie

<120> Polipeptideo E2 de papiloma virus usado para vacinação

<130> TG182 EXT

<140> PCT/EP2008/051032 <141> 29-01-2008

<150> EP07360004.1 <151> 30-01-2007

<150> EP07360018.1 <151> 15-05-2007

<160> 62

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1 <211> 365 <212> PRT

<213> Papiloma virus humano tipo 16

<400> 1

Met Glu Thr Leu Cys Gln Arg Leu Asn Val Cys Gln Asp Lys Ile Leu 15 10 15

Thr His Tyr Glu Asn Asp Ser Thr Asp Leu Arg Asp His Ile Asp Tyr

20 25 30

Trp Lys His Met Arg Leu Glu Cys Ala Ile Tyr Tyr Lys Ala Arg Glu

35 40 45

Met Gly Phe Lys His Ile Asn His Gln Val Val Pro Thr Leu Ala Val

50 55 60

Ser Lys Asn Lys Ala Leu Gln Ala Ile Glu Leu Gln Leu Thr Leu Glu 65 70 75 80

Thr Ile Tyr Asn Ser Gln Tyr Ser Asn Glu Lys Trp Thr Leu Gln Asp

85 90 95

Val Ser Leu Glu Val Tyr Leu Thr Ala Pro Thr Gly Cys Ile Lys Lys

100 105 110

His Gly Tyr Thr Val Glu Val Gln Phe Asp Gly Asp Ile Cys Asn Thr

115 120 125

Met His Tyr Thr Asn Trp Thr His Ile Tyr Ile Cys Glu Glu Ala Ser

130 135 140

Val Thr Val Val Glu Gly Gln Val Asp Tyr Tyr Gly Leu Tyr Tyr Val 145 150 155 160

His Glu Gly Ile Arg Thr Tyr Phe Val Gln Phe Lys Asp Asp Ala Glu

165 170 175

Lys Tyr Ser Lys Asn Lys Val Trp Glu Val His Ala Gly Gly Gln Val

180 185 190

Ile Leu Cys Pro Thr Ser Val Phe Ser Ser Asn Glu Val Ser Ser Pro

195 200 205

Glu Ile Ile Arg Gln His Leu Ala Asn His Pro Ala Ala Thr His Thr

210 215 220

Lys Ala Val Ala Leu Gly Thr Glu Glu Thr Gln Thr Thr Ile Gln Arg 225 230 235 240

Pro Arg Ser Glu Pro Asp Thr Gly Asn Pro Cys His Thr Thr Lys Leu 245 250 255 Leu His Arg Asp Ser Val Asp Ser Ala Pro Ile Leu Thr Ala Phe Asn

260 265 270

Ser Ser His Lys Gly Arg Ile Asn Cys Asn Ser Asn Thr Thr Pro Ile

275 280 285

Val His Leu Lys Gly Asp Ala Asn Thr Leu Lys Cys Leu Arg Tyr Arg

290 295 300

Phe Lys Lys His Cys Thr Leu Tyr Thr Ala Val Ser Ser Thr Trp His

305 310 315 320

Trp Thr Gly His Asn Val Lys His Lys Ser Ala Ile Val Thr Leu Thr

325 330 335

Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg Asp Gln Phe Leu Ser Gln Val Lys Ile

340 345 350

Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr Gly Phe Met Ser Ile

355 360 365

<210> 2 <211> 453 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de HPV-16 E2 defeituoso e apresentado por membrana <400> 2

Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Leu Val Pro Leu Leu Gly Phe Ser Leu

1 5 10 15

Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Glu Thr Leu Cys Gln Arg Leu Asn Val

20 25 30

Cys Gln Asp Lys Ile Leu Thr His Tyr Glu Asn Asp Ser Thr Asp Leu

35 40 45

Arg Asp His Ile Asp Tyr Trp Lys His Met Arg Leu Ala Cys Ala Ile

50 55 60

Tyr Tyr Lys Ala Arg Glu Met Gly Phe Lys His Ile Asn His Gln Val

65 70 75 80

Val Pro Thr Leu Ala Val Ser Lys Asn Lys Ala Leu Gln Ala Ala Glu

85 90 95

Leu Gln Leu Thr Leu Glu Thr Ile Tyr Asn Ser Gln Tyr Ser Asn Glu

100 105 110

Lys Trp Thr Leu Gln Asp Val Ser Leu Glu Val Tyr Leu Thr Ala Pro

115 120 125

Thr Gly Cys Ile Lys Lys His Gly Tyr Thr Val Glu Val Gln Phe Asp

130 135 140

Gly Asp Ile Cys Asn Thr Met His Tyr Thr Asn Trp Thr His Ile Tyr

145 150 155 160

Ile Cys Glu Glu Ala Ser Val Thr Val Val Glu Gly Gln Val Asp Tyr

165 170 175

Tyr Gly Leu Tyr Tyr Val His Glu Gly Ile Arg Thr Tyr Phe Val Gln

180 185 190

Phe Lys Asp Asp Ala Glu Lys Tyr Ser Lys Asn Lys Val Trp Glu Val

195 200 205

His Ala Gly Gly Gln Val Ile Leu Cys Pro Thr Ser Val Phe Ser Ser

210 215 220

Asn Glu Val Ser Ser Pro Glu Ile Ile Arg Gln His Leu Ala Asn His

225 230 235 240

Pro Ala Ala Thr His Thr Lys Ala Val Ala Leu Gly Thr Glu Glu Thr

245 250 255

Gln Thr Thr Ile Gln Arg Pro Arg Ser Glu Pro Asp Thr Gly Asn Pro

260 265 270

Cys His Thr Thr Lys Leu Leu His Arg Asp Ser Val Asp Ser Ala Pro

275 280 285

Ile Leu Thr Ala Phe Asn Ser Ser His Lys Gly Arg Ile Asn Cys Asn

290 295 300 Ser Asn Thr Thr Pro Ile Val His Leu Lys Gly Asp Ala Asn Thr Leu 305 310 315 320

Lys Cys Leu Arg Tyr Arg Phe Lys Lys His Cys Thr Leu Tyr Thr Ala

325 330 335

Val Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Gly His Asn Val Lys His Lys Ser

340 345 350

Ala Ile Val Thr Leu Thr Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg Asp Gln Phe

355 360 365

Leu Ser Gln Val Lys Ile Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr Gly Phe

370 375 380

Met Ser Ile Tyr Val Leu Leu Ser Ala Gly Thr Leu Ile Ala Leu Met 385 390 395 400

Leu Ile Ile Phe Leu Ile Thr Cys Cys Lys Arg Val Asp Arg Pro Glu

405 410 415

Ser Thr Gln Arg Ser Leu Arg Gly Thr Gly Arg Asn Val Ser Val Thr

420 425 430

Ser Gln Ser Gly Lys Phe Ile Ser Ser Trp Glu Ser His Lys Ser Gly

435 440 445

Gly Glu Thr Arg Leu 450

<210> 3 <211> 737 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante HPV-16 El defeituoso para replicação e apresentado por membrana

<400> 3

Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu 15 10 15

Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Ala Asp Pro Ala Gly Thr Asn Gly Glu

20 25 30

Glu Gly Thr Gly Cys Asn Gly Trp Phe Tyr Val Glu Ala Val Val Glu

35 40 45

Lys Lys Thr Gly Asp Ala Ile Ser Asp Asp Glu Asn Glu Asn Asp Ser

50 55 60

Asp Thr Gly Glu Asp Leu Val Asp Phe Ile Val Asn Asp Asn Asp Tyr 65 70 75 80

Leu Thr Gln Ala Glu Thr Glu Thr Ala His Ala Leu Phe Thr Ala Gln

85 90 95

Glu Ala Lys Gln His Arg Asp Ala Val Gln Val Leu Lys Arg Lys Tyr

100 105 110

Leu Gly Ser Pro Leu Ser Asp Ile Ser Gly Cys Val Asp Asn Asn Ile

115 120 125

Ser Pro Arg Leu Lys Ala Ile Cys Ile Glu Lys Gln Ser Arg Ala Ala

130 135 140

Lys Arg Arg Leu Phe Glu Ser Glu Asp Ser Gly Tyr Gly Asn Thr Glu 145 150 155 160

Val Glu Thr Gln Gln Met Leu Gln Val Glu Gly Arg His Glu Thr Glu

165 170 175

Thr Pro Cys Ser Gln Tyr Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Cys Ser Gln

180 185 190

Tyr Ser Ser Gly Ser Gly Gly Glu Gly Val Ser Glu Arg His Thr Ile

195 200 205

Cys Gln Thr Pro Leu Thr Asn Ile Leu Asn Val Leu Lys Thr Ser Asn

210 215 220

Ala Lys Ala Ala Met Leu Ala Lys Phe Lys Glu Leu Tyr Gly Val Ser 225 230 235 240

Phe Ser Glu Leu Val Arg Pro Phe Lys Ser Asn Lys Ser Thr Cys Cys 245 250 255 Asp Trp Cys Ile Ala Ala Phe Gly Leu Thr Pro Ser Ile Ala Asp Ser 260 265 270 Ile Lys Thr Leu Leu Gln Gln Tyr Cys Leu Tyr Leu His Ile Gln Ser 275 280 285 Leu Ala Cys Ser Trp Gly Met Val Val Leu Leu Leu Val Arg Tyr Lys 290 295 300 Cys Gly Lys Asn Arg Glu Thr Ile Glu Lys Leu Leu Ser Lys Leu Leu 305 310 315 320 Cys Val Ser Pro Met Cys Met Met Ile Glu Pro Pro Lys Leu Arg Ser 325 330 335 Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Trp Tyr Lys Thr Gly Ile Ser Asn Ile Ser 340 345 350 Glu Val Tyr Gly Asp Thr Pro Glu Trp Ile Gln. Arg Gln Thr Val Leu 355 360 365 Gln His Ser Phe Asn Asp Cys Thr Phe Glu Leu Ser Gln Met Val Gln 370 375 380 Trp Ala Tyr Asp Asn Asp Ile Val Asp Asp Ser Glu Ile Ala Tyr Lys 385 390 395 400 Tyr Ala Gln Leu Ala Asp Thr Asn Ser Asn Ala Ser Ala Phe Leu Lys 405 410 415 Ser Asn Ser Gln Ala Lys Ile Val Lys Asp Cys Ala Thr Met Cys Arg 420 425 430 His Tyr Lys Arg Ala Glu Lys Lys Gln Met Ser Met Ser Gln Trp Ile 435 440 445 Lys Tyr Arg Cys Asp Arg Val Asp Asp Gly Gly Asp Trp Lys Gln Ile 450 455 460 Val Met Phe Leu Arg Tyr Gln Gly Val Glu Phe Met Ser Phe Leu Thr 465 470 475 480 Ala Leu Lys Arg Phe Leu Gln Gly Ile Pro Lys Lys Asn Cys Ile Leu 485 490 495 Leu Tyr Gly Ala Ala Asn Thr Asp Lys Ser Leu Phe Gly Met Ser Leu 500 505 510 Met Lys Phe Leu Gln Gly Ser Val Ile Cys Phe Val Asn Ser Lys Ser 515 520 525 His Phe Trp Leu Gln Pro Leu Ala Asp Ala Lys Ile Gly Met Leu Asp 530 535 540 Asp Ala Thr Val Pro Cys Trp Asn Tyr Ile Asp Asp Asn Leu Arg Asn 545 550 555 560 Ala Leu Asp Gly Asn Leu Val Ser Met Asp Val Lys His Arg Pro Leu 565 570 575 Val Gln Leu Lys Cys Pro Pro Leu Leu Ile Thr Ser Asn Ile Asn Ala 580 585 590 Gly Thr Asp Ser Arg Trp Pro Tyr Leu His Asn Arg Leu Val Val Phe 595 600 605 Thr Phe Pro Asn Glu Phe Pro Phe Asp Glu Asn Gly Asn Pro Val Tyr 610 615 620 Glu Leu Asn Asp Lys Asn Trp Lys Ser Phe Phe Ser Arg Thr Trp Ser 625 630 635 640 Arg Leu Ser Leu His Glu Asp Glu Asp Lys Glu Asn Asp Gly Asp Ser 645 650 655 Leu Pro Thr Phe Lys Cys Val Ser Gly Gln Asn Thr Asn Thr Leu Tyr 660 665 670 Val Leu Leu Ser Ala Gly Thr Leu Ile Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe 675 680 685 Leu Ile Thr Cys Cys Lys Arg Val Asp Arg Pro Glu Ser Thr Gln Arg 690 695 700 Ser Leu Arg Gly Thr Gly Arg Asn Val Ser Val Thr Ser Gln Ser Gly 705 710 715 720 Lys Phe Ile Ser Ser Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg

725 730 735

Leu <210> 4 <211> 243 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante HPV-16 Ε6 não oncogênico e apresentado por membrana <400> 4

Met Gly Leu Lys Val Asn Val Ser Ala Ile Phe Met Ala Val Leu Leu 1 5 10 15

Thr Leu Gln Thr Pro Thr Gly Gln Ile His Trp Gly Met His Gln Lys

20 25 30

Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro

35 40 45

Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu

50 55 60

Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe 65 70 75 80

Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala

85 90 95

Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg

100 105 110

His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn

115 120 125

Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro

130 135 140

Leu Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly 145 150 155 160

Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg

165 170 175

Arg Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ser Ser Thr Ser Ile Val Tyr Ile Leu

180 185 190

Ile Ala Val Cys Leu Gly Gly Leu Ile Gly Ile Pro Ala Leu Ile Cys

195 200 205

Cys Cys Arg Gly Arg Cys Asn Lys Lys Gly Glu Gln Val Gly Met Ser

210 215 220

Arg Pro Gly Leu Lys Pro Asp Leu Thr Gly Thr Ser Lys Ser Tyr Val 225 230 235 240

Arg Ser Leu

<210> 5 <211> 185 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante HPV-16 E7 não oncogênico e apresentado por membrana <400> 5

Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu 1 5 10 15

Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Gly Ser Met His Gly Asp Thr Pro Thr

20 25 30

Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Gln Leu Asn

35 40 45

Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala

50 55 60

Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys 65 70 75 80 Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg

85 90 95

Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile

100 105 110

Cys Ser Gln Lys Pro Arg Ser Tyr Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu

115 120 125

Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Cys Arg Arg Val

130 135 140

Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr Gly Arg Glu 145 150 155 160

Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser Trp Glu Ser

165 170 175

His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu 180 185

<210> 6 <211> 59 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> porção de 59 nucleotideos de seqüência degenerada que codifica HPV- 16 El para reduzir homologia com seqüência que codifica HPV-16 E2 sobreposta

<400> 6

atggtgattc attacctaca ttcaagtgcg tatctggtca gaacacaaat actttgtga 59

<210> 7 <211> 2214 <212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Seqüência que codifica polipeptideo HPV-16 El defeituoso e edereçamento de membrana que inclui seqüência degenerada de 59 nucleotideos

<400> 7

atggtaccgc aagccctgct attcgtacct ttattggtct ttcccctctg tttcggtaag 60

tttcctatag ctgatcctgc aggtaccaat ggggaagagg gtacgggatg taatggatgg 120

ttttatgtag aggctgtagt ggaaaaaaaa acaggggatg ctatatcaga tgacgagaac 180

gaaaatgaca gtgatacagg tgaagatttg gtagatttta tagtaaatga taatgattat 24 0

ttaacacagg cagaaacaga gacagcacat gcgttgttta ctgcacagga agcaaaacaa 300

catagagatg cagtacaggt tctaaaacga aagtatttgg gtagtccact tagtgatatt 360

agtggatgtg tagacaataa tattagtcct agattaaaag ctatatgtat agaaaaacaa 420

agtagagctg caaaaaggag attatttgaa agcgaagaca gcgggtatgg caatactgaa 480

gtggaaactc agcagatgtt acaggtagaa gggcgccatg agactgaaac accatgtagt 540

cagtatagtg gtggaagtgg gggtggttgc agtcagtaca gtagtggaag tgggggagag 600

ggtgttagtg aaagacacac tatatgccaa acaccactta caaatatttt aaatgtacta 660

aaaactagta atgcaaaggc agcaatgtta gcaaaattta aagagttata cggggtgagt 720

ttttcagaat tagtaagacc atttaaaagt aataaatcaa cgtgttgcga ttggtgtatt 780

gctgcatttg gacttacacc cagtatagct gacagtataa aaacactatt acaacaatat 840

tgtttatatt tacacattca aagtttagca tgttcatggg gaatggttgt gttactatta 900

gtaagatata aatgtggaaa aaatagagaa acaattgaaa aattgctgtc taaactatta 960

tgtgtgtctc caatgtgtat gatgatagag cctccaaaat tgcgtagtac agcagcagca 1020

ttatattggt ataaaacagg tatatcaaat attagtgaag tgtatggaga cacgccagaa 1080

tggatacaaa gacaaacagt attacaacat agttttaatg attgtacatt tgaattatca 1140

cagatggtac aatgggccta cgataatgac atagtagacg atagtgaaat tgcatataaa 1200

tatgcacaat tggcagacac taatagtaat gcaagtgcct ttctaaaaag taattcacag 1260 gcaaaaattg taaaggattg tgcaacaatg tgtagacatt ataaacgagc agaaaaaaaa 1320

caaatgagta tgagtcaatg gataaaatat agatgtgata gggtagatga tggaggtgat 1380

tggaagcaaa ttgttatgtt tttaaggtat caaggtgtag agtttatgtc atttttaact 1440

gcattaaaaa gatttttgca aggcatacct aaaaaaaatt gcatattact atatggtgca 1500

gctaacacag ataaatcatt atttggtatg agtttaatga aatttctgca agggtctgta 1560

atatgttttg taaattctaa aagccatttt tggttacaac cattagcaga tgccaaaata 1620

ggtatgttag atgatgctac agtgccctgt tggaactata tagatgacaa tttaagaaat 1680

gcattggatg gaaatttagt ttctatggat gtaaagcata gaccattggt acaactaaaa 1740

tgccctccat tattaattac atctaacatt aatgctggta cagattctag gtggccttat 1800

ttacataata gattggtggt gtttacattt cctaatgagt ttccatttga cgaaaacgga 1860

aatccagtgt atgagcttaa tgataagaac tggaaatcct ttttctcaag gacgtggtcc 1920

agattaagtt tgcacgagga cgaggacaag gaaaacgatg gtgattcatt acctacattc 1980

aagtgcgtat ctggtcagaa cacaaatact ttgtacgtac tgctatcggc aggcacgttg 2040

atcgcactaa tgcttatcat cttcctaata acctgctgca agcgggttga taggcccgaa 2100

agtacccaaa ggtccttgag aggtaccgga cgcaacgtat cggtaacgtc gcaaagcggc 2160

aagttcatta gcagttggga gtcgcacaaa tcaggtggag agacccgcct gtga 2214

<210> 8 <211> 1362 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Seqüência de nucleotideos que codifica polipeptideo HPV-16 E2 defeituoso e endereçamento de membrana

<400> 8

atggtaccac aagcgctgtt acttgtccca ctgcttggtt tctctttatg ttttggaaaa 60

ttcccaatag agactctttg ccaacgttta aatgtgtgtc aggacaaaat actaacacat 120

tatgaaaatg atagtacaga cctacgtgac catatagact attggaaaca catgcgccta 180

gcatgtgcta tttattacaa ggccagagaa atgggattta aacatattaa ccaccaggtg 240

gtgccaacgc tggctgtatc aaagaataaa gcattacaag cagctgaact gcaactaacg 300

ttagaaacaa tatataactc acaatatagt aatgaaaagt ggacattaca agacgttagc 360

cttgaagtgt atttaactgc accaacagga tgtataaaaa aacatggata tacagtggaa 420

gtgcagtttg atggagacat atgcaataca atgcattata caaactggac acatatatat 480

atttgtgaag aagcatcagt aactgtggta gagggtcaag ttgactatta tggtttatat 540

tatgttcatg aaggaatacg aacatatttt gtgcagttta aagatgatgc agaaaaatat 600

agtaaaaata aagtatggga agttcatgcg ggtggtcagg taatattatg tcctacatct 660

gtgtttagca gcaacgaagt atcctctcct gaaattatta ggcagcactt ggccaaccac 720

cccgccgcga cccataccaa agccgtcgcc ttgggcaccg aagaaacaca gacgactatc 780

cagcgaccaa gatcagagcc agacaccgga aacccctgcc acaccactaa gttgttgcac 840

agagactcag tggacagtgc tccaatcctc actgcattta acagctcaca caaaggacgg 900

attaactgta atagtaacac tacacccata gtacatttaa aaggtgatgc taatacttta 960

aaatgtttaa gatatagatt taaaaagcat tgtacattgt atactgcagt gtcgtctaca 1020

tggcattgga caggacataa tgtaaaacat aaaagtgcaa ttgttacact tacatatgat 1080

agtgaatggc aacgtgacca atttttgtct caagttaaaa taccaaaaac tattacagtg 1140

tctactggat ttatgtctat atatgttctt ctctctgctg gaactttaat agctttaatg 1200

ttaataatat tcttaataac gtgctgtaaa agggtagacc gtccagagtc aactcagcgc 1260

agccttaggg gtactgggag aaatgtttcc gtgacatcac agagtggaaa atttatctcg 1320

tcttgggaat ctcataagag tggaggcgaa acacgtcttt ga 1362

<210> 9 <211> 34 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer sense

<400> 9 aaacccggat ccatggagac tctttgccaa cgtt

<210> 10 <211> 49 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer antisense <400> 10

aaacccgaat tcaagcttag atcttcatat agacataaat ccagtagac

<210> 11 <211> 33 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer sense <400> 11

aaacccggat ccatggtacc acaagcgctg tta

<210> 12 <211> 53 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer sense <400> 12

tctctttatg ttttggaaaa ttcccaatag agactctttg ccaacgttta aat

<210> 13 <211> 53 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer antisense <400> 13

atttaaacgt tggcaaagag tctctattgg gaattttcca aaacataaag aga

<210> 14 <211> 49 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer sense <400> 14

cagtgtctac tggatttatg tctatatatg ttcttctctc tgctggaac <210> 15

<211> 49

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer anti-sense

<400> 15

gttccagcag agagaagaac atatatagac ataaatccag tagacactg

<210> 16 <211> 44 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer sense <400> 16

aaacccagat cttcaaagac gtgtttcgcc tccactctta tgag

<210> 17 <211> 34 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer sense <400> 17

aaacccggat ccatggctga tcctgcaggt acca

<210> 18 <211> 34 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer anti-sense <400> 18

aaacccgaat tccattatcg taggcccatt gtac

<210> 19 <211> 32 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer sense <400> 19

aaacccggat ccgagacacg ccagaatgga ta

<210> 20 <211> 50 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer anti-sense <400> 20

aaacccgaat tcaagcttag atcttcataa tgtgttagta ttttgtcctg 50

<210> 21 <211> 88 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer anti-sense <400> 21

aaacccagat cttcacaaag tatttgtgtt ctgaccagat acgcacttga atgtaggtaa 60

tgaatcacca tcgttttcct tgtcctcg 88

<210> 22 <211> 21 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer sense <400> 22

gatgctacag tgccctgttg g 21

<210> 23 <211> 35 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer sense <400> 23

aaacccaagg atccatggta ccgcaagccc tgcta 35

<210> 24 <211> 52 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer sense <400> 24

ttcccctctg tttcggtaag tttcctatag ctgatcctgc aggtaccaat gg 52

<210> 25 <211> 52 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer anti-sense <400> 25

ccattggtac ctgcaggatc agctatagga aacttaccga aacagagggg aa 52

<210> 26

<211> 50

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer sense

<400> 26

tatctggtca gaacacaaat actttgtacg tactgctatc ggcaggcacg 50

<210> 27

<211> 50

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer anti-sense

<400> 27

cgtgcctgcc gatagcagta cgtacaaagt atttgtgttc tgaccagata 50

<210> 28 <211> 42 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer anti-sense <400> 28

aaacccaaag atcttcacag gcgggtctct ccacctgatt tg 42

<210> 29 <211> 453 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo E2 defeituoso para replicação e apresentado por membrana de HPV-18 (SS-18 E2*-TMR)

<400> 29

Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu 1 5 10 15

Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Gln Thr Pro Lys Glu Thr Leu Ser Glu

20 25 30

Arg Leu Ser Cys Val Gln Asp Lys Ile Ile Asp His Tyr Glu Asn Asp

35 40 45

Ser Lys Asp Ile Asp Ser Gln Ile Gln Tyr Trp Gln Leu Ile Arg Trp

50 55 60

Ala Asn Ala Ile Phe Phe Ala Ala Arg Glu His Gly Ile Gln Thr Leu 65 70 75 80 Asn His Gln Val Val 85 Pro Ala Tyr Asn Ile 90 Ser Lys Ser Lys Ala 95 His Lys Ala Ala Glu 100 Leu Gln Met Ala Leu 105 Gln Gly Leu Ala Gln 110 Ser Arg Tyr Lys Thr 115 Glu Asp Trp Thr Leu 120 Gln Asp Thr Cys Glu 125 Glu Leu Trp Asn Thr 130 Glu Pro Thr His Cys 135 Phe Lys Lys Gly Gly 140 Gln Thr Val Gln Val Tyr Phe Asp Gly Asn Lys Asp Asn Cys Met Thr Tyr Val Ala Trp 145 150 155 160 Asp Ser Val Tyr Tyr 165 Met Thr Asp Ala Gly 170 Thr Trp Asp Lys Thr 175 Ala Thr Cys Val Ser 180 His Arg Gly Leu Tyr 185 Tyr Val Lys Glu Gly 190 Tyr Asn Thr Phe Tyr 195 Ile Glu Phe Lys Ser 200 Glu Cys Glu Lys Tyr 205 Gly Asn Thr Gly Thr 210 Trp Glu Val His Phe 215 Gly Asn Asn Val Ile 220 Asp Cys Asn Asp Ser Met Cys Ser Thr Ser Asp Asp Thr Val Ser Ala Thr Gln Leu Val 225 230 235 240 Lys Gln Leu Gln His 245 Thr Pro Ser Pro Tyr 250 Ser Ser Thr Val Ser 255 Val Gly Thr Ala Lys 260 Thr Tyr Gly Gln Thr 265 Ser Ala Ala Thr Arg 270 Pro Gly His Cys Gly 275 Leu Ala Glu Lys Gln 280 His Cys Gly Pro Val 285 Asn Pro Leu Leu Gly 290 Ala Ala Thr Pro Thr 295 Gly Asn Asn Lys Arg 300 Arg Lys Leu Cys Ser Gly Asn Thr Thr Pro Ile Ile His Leu Lys Gly Asp Arg Asn Ser 305 310 315 320 Leu Lys Cys Leu Arg 325 Tyr Arg Leu Arg Lys 330 His Ser Asp His Tyr 335 Arg Asp Ile Ser Ser 340 Thr Trp His Trp Thr 345 Gly Ala Gly Asn Glu 350 Lys Thr Gly Ile Leu 355 Thr Val Thr Tyr His 360 Ser Glu Thr Gln Arg 365 Thr Lys Phe Leu Asn 370 Thr Val Ala Ile Pro 375 Asp Ser Val Gln Ile 380 Leu Val Gly Tyr Met Thr Met Tyr Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met 385 390 395 400 Leu Ile Ile Phe Leu 405 Met Thr Cys Cys Arg 410 Arg Val Asn Arg Ser 415 Glu Pro Thr Gln His 420 Asn Leu Arg Gly Thr 425 Gly Arg Glu Val Ser 430 Val Thr Pro Gln Ser 435 Gly Lys Ile Ile Ser 440 Ser Trp Glu Ser His 445 Lys Ser Gly Gly Glu 450 Thr Arg Leu

<210> 30 <211> 441 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo Ε2 defeituoso para replicação e apresentado por membrana de HPV-33 (SS-33 E2*-TMR)

<400> 30

Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu Cys Phe

Val Gln

Pro Ser

50 Leu Tyr 65

Val Pro

Leu Gln

Gln Trp

Pro Lys 130 Asn Asp 145

Ile Ile

Ile Gly

Phe Lys

His Val 210 Gln Ile 225

Arg Pro

Asp Thr

Asp Asn

Thr Val 290 Ser Asn 305

Leu Tyr

Asn Ser

Gln Gln

Ser Thr 370 Ile Ala 385

Asp Arg Val Ser His Lys

Gly Lys 20 Glu Lys 35

Gln Ile

Thr Ala

Ser Leu

Met Ala 100 Thr Leu 115

Cys Phe

Lys Lys

Glu Glu

Met Tyr 180 Glu Asp 195

Gly Gly

Ser Thr

Pro Gln

Ala Gln 260 Arg Thr 275

Cys Ser

Ser Leu

Ser Ser

Lys Asn 340 Met Phe 355

Gly Phe

Leu Met

Pro Glu

Val Thr 420 Ser Gly 435

Phe Pro

Ile Leu

Glu His

Lys Gln

70 Leu Ala 85

Leu Glu

Gln Gln

Lys Lys

Asn Thr 150 Asp Thr 165

Tyr Ile

Ala Ala

Gln Val

Thr Glu 230 Ala Ala 245

Pro Leu

Ala Arg

Ser Asn

Lys Cys 310 Met Ser 325

Gly Ile

Leu Gly

Met Thr

Leu Ile 390 Ser Thr 405

Ser Gln Gly Glu

Ile Glu Glu 25

Asp Leu Tyr 40

Trp Lys Leu 55

Met Gly Phe

Ser Lys Thr

Thr Leu Ser 105

Thr Ser Leu 120

Gln Gly Glu 135

Met Asp Tyr

Cys Thr Met

His Asn Cys 185

Lys Tyr Ser 200 Ile Val Cys 215

Thr Ala Asp

Ala Lys Arg

Thr Lys Leu 265

Thr Ala Thr 280 Val Ala Pro 295

Leu Arg Tyr

Ser Thr Trp

Val Thr Val 345

Thr Val Lys

360 Leu Tyr Val 375

Ile Phe Leu

Gln Arg Ser

Ser Gly Lys 425

Thr Arg Leu 440

10

Ile Ser

Glu Ala

Ile Arg

Ser His

75 Lys Ala 90

Lys Ser

Glu Val

Thr Val

Thr Asn 155 Val Thr 170

Glu Lys

Lys Thr

Pro Thr

Ile Gln 235 Arg Arg 250

Phe Cys

Asn Cys

Ile Val

Arg Leu 315 His Trp 330

Thr Phe

Ile Pro

Leu Leu

Ile Thr 395 Leu Arg 410

Phe Ile

Ala Arg

Asp Lys

45

Met Ala 60

Leu Cys

Phe Gln

Gln Tyr

Trp Leu 125 Thr Val 140

Trp Gly

Gly Lys

Val Tyr

Gln Met 205 Ser Ile 220

Thr Asp

Pro Ala

Ala Asp

Thr Asn 285 His Leu 300

Lys Pro

Thr Ser

Val Thr

Pro Thr 365 Ser Ala 380

Cys Cys Gly Thr Ser Ser

15

Leu Asn Ala 30

Thr Asp Leu

Cys Ala Leu

His Gln Val 80

Val Ala Glu 95

Ser Thr Ser 110

Cys Glu Pro

Gln Tyr Asp

Glu Ile Tyr 160

Val Asp Tyr

175 Phe Lys Tyr 190

Trp Glu Val

Ser Ser Asn

Asn Asp Asn 240

Asp Thr Thr

255 Pro Ala Leu 270

Lys Gln Arg

Lys Gly Glu

Tyr Lys Glu 320

Asp Asn Lys

335 Glu Gln Gln 350

Val Gln Ile

Gly Thr Leu

Lys Arg Val 400

Gly Arg Asn

415 Trp Glu Ser 430

<210> 31 <211> 457 <212> PRT <213> Seqüência

artificial <220>

<223> Polipeptideo Ε2 defeituoso para replicação e apresentado por membrana de HPV-52

<400> 31 Met Gly Leu Lys Val Asn Val Ser Ala Ile Phe Met Ala Val Leu Leu 1 5 10 15 Thr Leu Gln Thr Pro Thr Gly Gln Ile His Trp Gly Glu Ser Ile Pro 20 25 30 Ala Arg Leu Asn Ala Val Gln Glu Lys Ile Leu Asp Leu Tyr Glu Ala 35 40 45 Asp Ser Asn Asp Leu Asn Ala Gln Ile Glu His Trp Lys Leu Thr Arg 50 55 60 Met Ala Cys Val Leu Phe Tyr Lys Ala Lys Glu Leu Gly Ile Thr His 65 70 75 80 Ile Gly His Gln Val Val Pro Pro Met Ala Val Ser Lys Ala Lys Ala 85 90 95 Cys Gln Ala Ala Glu Leu Gln Leu Ala Leu Glu Ala Leu Asn Lys Thr 100 105 110 Gln Tyr Ser Thr Asp Gly Trp Thr Leu Gln Gln Thr Ser Leu Glu Met 115 120 125 Trp Arg Ala Glu Pro Gln Lys Tyr Phe Lys Lys His Gly Tyr Thr Ile 130 135 140 Thr Val Gln Tyr Asp Asn Asp Lys Asn Asn Thr Met Asp Tyr Thr Asn 145 150 155 160 Trp Lys Glu Ile Tyr Leu Leu Gly Glu Cys Glu Cys Thr Ile Val Glu 165 170 175 Gly Gln Val Asp Tyr Tyr Gly Leu Tyr Tyr Trp Cys Asp Gly Glu Lys 180 185 190 Ile Tyr Phe Val Lys Phe Ser Asn Asp Ala Lys Gln Tyr Cys Val Thr 195 200 205 Gly Val Trp Glu Val His Val Gly Gly Gln Val Ile Val Cys Pro Ala 210 215 220 Ser Val Ser Ser Asn Glu Val Ser Thr Thr Glu Thr Ala Val His Leu 225 230 235 240 Cys Thr Glu Thr Ser Lys Thr Ser Ala Val Ser Val Gly Ala Lys Asp 245 250 255 Thr His Leu Gln Pro Pro Gln Lys Arg Arg Arg Pro Asp Val Thr Asp 260 265 270 Ser Arg Asn Thr Lys Tyr Pro Asn Asn Leu Leu Arg Gly Gln Gln Ser 275 280 285 Val Asp Ser Thr Thr Arg Gly Leu Val Thr Ala Thr Glu Cys Thr Asn 290 295 300 Lys Gly Arg Val Ala His Thr Thr Cys Thr Ala Pro Ile Ile His Leu 305 310 315 320 Lys Gly Asp Pro Asn Ser Leu Lys Cys Leu Arg Tyr Arg Val Lys Thr 325 330 335 His Lys Ser Leu Tyr Val Gln Ile Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Ser 340 345 350 Asn Glu Cys Thr Asn Asn Lys Leu Gly Ile Val Thr Ile Thr Tyr Ser 355 360 365 Asp Glu Thr Gln Arg Gln Gln Phe Leu Lys Thr Val Lys Ile Pro Asn 370 375 380 Thr Val Gln Val Ile Gln Gly Val Met Ser Leu Gly Leu Ser Ser Thr 385 390 395 400 Ser Ile Val Tyr Ile Leu Ile Ala Val Cys Leu Gly Gly Leu Ile Gly 405 410 415 Ile Pro Ala Leu Ile Cys Cys Cys Arg Gly Arg Cys Asn Lys Lys Gly 420 425 430 Glu Gln Val Gly Met Ser Arg Pro Gly Leu Lys Pro Asp Leu Thr Gly 435 440 445 Thr Ser Lys Ser Tyr Val Arg Ser Leu 450 455

<210> 32

<211> 746

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Polipeptideo El defeituoso para replicação e apresentado por membrana de HPV-18

<400> 32

Met Gly Leu Lys Val Asn Val Ser Ala Ile Phe Met Ala Val Leu Leu 1 5 10 15

Thr Leu Gln Thr Pro Thr Gly Gln Ile His Trp Gly Ala Asp Pro Glu

20 25 30

Gly Thr Asp Gly Glu Gly Thr Gly Cys Asn Gly Trp Phe Tyr Val Gln

35 40 45

Ala Ile Val Asp Lys Lys Thr Gly Asp Val Ile Ser Asp Asp Glu Asp

50 55 60

Glu Asn Ala Thr Asp Thr Gly Ser Asp Met Val Asp Phe Ile Asp Thr 65 70 75 80

Gln Gly Thr Phe Cys Glu Gln Ala Glu Leu Glu Thr Ala Gln Ala Leu

85 90 95

Phe His Ala Gln Glu Val His Asn Asp Ala Gln Val Leu His Val Leu

100 105 110

Lys Arg Lys Phe Ala Gly Gly Ser Thr Glu Asn Ser Pro Leu Gly Glu

115 120 125

Arg Leu Glu Val Asp Thr Glu Leu Ser Pro Arg Leu Gln Glu Ile Ser

130 135 140

Leu Asn Ser Gly Gln Lys Lys Ala Lys Arg Arg Leu Phe Thr Ile Ser 145 150 155 160

Asp Ser Gly Tyr Gly Cys Ser Glu Val Glu Ala Thr Gln Ile Gln Val

165 170 175

Thr Thr Asn Gly Glu His Gly Gly Asn Val Cys Ser Gly Gly Ser Thr

180 185 190

Glu Ala Ile Asp Asn Gly Gly Thr Glu Gly Asn Asn Ser Ser Val Asp

195 200 205

Gly Thr Ser Asp Asn Ser Asn Ile Glu Asn Val Asn Pro Gln Cys Thr

210 215 220

Ile Ala Gln Leu Lys Asp Leu Leu Lys Val Asn Asn Lys Gln Gly Ala 225 230 235 240

Met Leu Ala Val Phe Lys Asp Thr Tyr Gly Leu Ser Phe Thr Asp Leu

245 250 255

Val Arg Asn Phe Lys Ser Asp Lys Thr Thr Cys Thr Asp Trp Val Thr

260 265 270

Ala Ile Phe Gly Val Asn Pro Thr Ile Ala Glu Gly Phe Lys Thr Leu

275 280 285

Ile Gln Pro Phe Ile Leu Tyr Ala His Ile Gln Cys Leu Asp Cys Lys

290 295 300

Trp Gly Val Leu Ile Leu Ala Leu Leu Arg Tyr Lys Cys Gly Lys Ser 305 310 315 320

Arg Leu Thr Val Ala Lys Gly Leu Ser Thr Leu Leu His Val Pro Glu

325 330 335

Thr Cys Met Leu Ile Gln Pro Pro Lys Leu Arg Ser Ser Val Ala Ala

340 345 350

Leu Tyr Trp Tyr Arg Thr Gly Ile Ser Asn Ile Ser Glu Val Met Gly

355 360 365

Asp Thr Pro Glu Trp Ile Gln Arg Leu Thr Ile Ile Gln His Gly Ile

370 375 380

Asp Asp Ser Asn Phe Asp Leu Ser Glu Met Val Gln Trp Ala Phe Asp 385 390 395 400

Asn Glu Leu Thr Asp 405 Glu Ser Asp Met Ala 410 Phe Glu Tyr Ala Leu 415 Leu Ala Asp Ser Asn 420 Ser Asn Ala Ala Ala 425 Phe Leu Lys Ser Asn 430 Cys Gln Ala Lys Tyr 435 Leu Lys Asp Cys Ala 440 Thr Met Cys Lys His 445 Tyr Arg Arg Ala Gln 450 Lys Arg Gln Met Asn 455 Met Ser Gln Trp Ile 460 Arg Phe Arg Cys Ser Lys Ile Asp Glu Gly Gly Asp Trp Arg Pro Ile Val Gln Phe Leu 465 470 475 480 Arg Tyr Gln Gln Ile 485 Glu Phe Ile Thr Phe 490 Leu Gly Ala Leu Lys 495 Ser Phe Leu Lys Gly 500 Thr Pro Lys Lys Asn 505 Cys Leu Val Phe Cys 510 Gly Pro Ala Asn Thr 515 Asp Lys Ser Tyr Phe 520 Gly Met Ser Phe Ile 525 His Phe Ile Gln Gly 530 Ala Val Ile Ser Phe 535 Val Asn Ser Thr Ser 540 His Phe Trp Leu Glu Pro Leu Thr Asp Thr Lys Val Ala Met Leu Asp Asp Ala Thr Thr 545 550 555 560 Thr Cys Trp Thr Tyr 565 Phe Asp Thr Tyr Met 570 Arg Asn Ala Leu Asp 575 Gly Asn Pro Ile Ser 580 Ile Asp Arg Lys His 585 Lys Pro Leu Ile Gln 590 Leu Lys Cys Pro Pro 595 Ile Leu Leu Thr Thr 600 Asn Ile His Pro Ala 605 Lys Asp Asn Arg Trp 610 Pro Tyr Leu Glu Ser 615 Arg Ile Thr Val Phe 620 Glu Phe Pro Asn Ala Phe Pro Phe Asp Lys Asn Gly Asn Pro Val Tyr Glu Ile Asn Asp 625 630 635 640 Lys Asn Trp Lys Cys 645 Phe Phe Glu Arg Thr 650 Trp Ser Arg Leu Asp 655 Leu His Glu Glu Glu 660 Glu Asp Ala Asp Thr 665 Glu Gly Asn Pro Phe 670 Gly Thr Phe Lys Leu 675 Arg Ala Gly Gln Asn 680 His Arg Pro Leu Gly 685 Leu Ser Ser Thr Ser 690 Ile Val Tyr Ile Leu 695 Ile Ala Val Cys Leu 700 Gly Gly Leu Ile Gly Ile Pro Ala Leu Ile Cys Cys Cys Arg Gly Arg Cys Asn Lys Lys 705 710 715 720 Gly Glu Gln Val Gly 725 Met Ser Arg Pro Gly 730 Leu Lys Pro Asp Leu 735 Thr Gly Thr Ser Lys 740 Ser Tyr Val Arg Ser 745 Leu

<210> 33 <211> 1362 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Seqüência de nucleotideos que codifica um polipeptideo HPV-18 E2 defeituoso para replicação e apresentado por membrana (degenerada para reduzir homologia com seqüência que codifica HPV-16)

<400> 33

atggttcctc aggctctcct gtttgtaccc cttctggttt ttccattgtg ttttgggaaa 60

ttccctattc agacaccgaa ggaaaccctt tcggaacgat taagttgcgt gcaagataag 120

atcatagacc actacgagaa cgacagtaaa gacatagaca gccaaataca gtactggcaa 180

ctaatacgtt gggcaaatgc aatattcttt gcagcaaggg aacatggcat acagacatta 240 aatcatcagg tagtcccagc ctataacatt tcgaaaagta aggcacataa agctgccgag 300

ctccaaatgg ccctacaagg ccttgcacaa agtcgataca aaaccgagga ttggactctg 360

caggacacat gcgaggaact atggaataca gaacctactc actgctttaa gaaaggtggc 420

caaaccgtac aagtatattt cgacggcaac aaagacaatt gtatgaccta tgtagcatgg 480

gacagtgtgt attatatgac tgatgcagga acatgggaca aaaccgctac ctgtgtaagt 54 0

cacaggggat tgtactacgt aaaggagggg tacaacacgt tttatataga attcaaaagt 600

gaatgtgaga agtatgggaa cacaggtacg tgggaggtac attttgggaa taatgtcatt 660

gattgtaatg actctatgtg cagtaccagt gacgacacgg tctccgctac tcagcttgtt 720

aaacagctac agcacacccc ctcaccgtat tccagcaccg tgtccgtggg aaccgcaaag 780

acctacggcc agacgtcggc tgctacacga cctggccact gtggactcgc ggagaagcag 840

cattgtggac ctgtcaaccc acttctcggt gcagctacac ctacaggcaa caacaagaga 900

cgaaaactct gcagtggtaa tacgacgcct ataatacact tgaagggaga cagaaacagt 960

ttgaagtgct tacggtacag gttgcgaaaa catagcgacc actatagaga tatatcatcc 1020

acctggcact ggaccggtgc aggcaatgaa aaaacaggaa tactgactgt aacctaccat 1080

agcgaaacac aaagaacaaa attcttaaat actgttgcaa ttccagatag tgtacaaata 1140

ttggtgggat acatgacaat gtatgtatta ctgagtgcag gggccctgac tgccttgatg 1200

ttgataattt tcctgatgac atgttgtaga agagtcaatc gatcagaacc tacgcaacac 1260

aatctcagag ggacagggag ggaggtgtca gtcactcccc aaagcgggaa gatcatatct 1320

tcatgggaat cacacaagag tgggggtgag accagactgt ga 1362

<210> 34 <211> 1062 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Seqüência de nucleotideos que codifica um polipeptideo HPV-33 E2 defeituoso para replicação

<400> 34

atggaggaaa tatcagcacg cttgaatgca gtccaagaga gcagataaaa ctgatttacc atctcaaatt gaacactgga gctttattgt atacagccaa acagatgggc ttttcacatt tctttgttag catccaaaac caaagcgttt caagtagcgg acattaagta aatcacagta tagcacaagc caatggacgt gtttggcttt gtgaaccacc aaaatgtttt aaaaagcaag tatgacaatg acaaaaaaaa taccatggac tatactaact gaggaagata catgtactat ggttacaggg aaagtagatt cataactgtg aaaaggtata ctttaaatat tttaaggagg acacaaatgt gggaagtcca tgtaggtggc caggttattg agcaatcaaa tatccactac tgagactgct gacatacaga ccacaagcag cggccaaacg acgacgacct gcagacacta acaaagctgt tctgtgcaga ccccgccttg gataatagaa tgcacaaata agcagcggac tgtgtgtagt tctaacgttg ggcgaatcaa atagcttaaa gtgtttgaga tacagattaa agttctatgt cttcaacttg gcactggact agtgacaaca gtaaccgtga catttgtaac tgaacagcaa caacaaatgt cctcctactg tgcagataag taccggattc atgaccttat

<210> 35 <211> 1326 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Seqüência de nucleotideos que codifica um polipeptideo HPV-33 E2

defeituoso para replicação e apresentado por membrana (SS-33E2*-TMR) (seqüência degenerada)

aaattctaga tctttacgaa 60 aattgatacg catggcctgc 120 tatgtcacca agtggtacct 180 aactacagat ggcattagag 240 tgcaacagac aagcttagag 300 gagaaacagt aactgtgcaa 360 ggggtgaaat atacattata 420 atataggtat gtattacata 480 atgctgccaa atactctaaa 540 tttgccctac gtctatatct 600 cagacaacga taaccgacca 660 ctgacaccgc ccagcccctt 720 cagcacgtac agcaactaac 780 caccaatagt gcatttgaaa 840 aaccttataa agagttgtac 900 aaaatagtaa aaatggcata 960 tcttgggtac cgtaaagata 1020 aa 1062

<400> 35 atggtaccgc aagccctgct attcgtacct ttattggtct ttcccctctg tttcggtaag 60

tttcctatag aggaaatatc agcacgcttg aatgcagtcc aagagaaaat tctagatctt 120

tacgaagcag ataaaactga tttaccatct caaattgaac actggaaatt gatacgcatg 180

gcctgcgctt tattgtatac agccaaacag atgggctttt cacatttatg tcaccaagtg 240

gtaccttctt tgttagcatc caaaaccaaa gcgtttcaag tagcggaact acagatggca 300

ttagagacat taagtaaatc acagtatagc acaagccaat ggacgttgca acagacaagc 360

ttagaggttt ggctttgtga accaccaaaa tgttttaaaa agcaaggaga aacagtaact 420

gtgcaatatg acaatgacaa aaaaaatacc atggactata ctaactgggg tgaaatatac 480

attatagagg aagatacatg tactatggtt acagggaaag tagattatat aggtatgtat 540

tacatacata actgtgaaaa ggtatacttt aaatatttta aggaggatgc tgccaaatac 600

tctaaaacac aaatgtggga agtccatgta ggtggccagg ttattgtttg ccctacgtct 660

atatctagca atcaaatatc cactactgag actgctgaca tacagacaga caacgataac 720

cgaccaccac aagcagcggc caaacgacga cgacctgcag acactactga caccgcccag 780

ccccttacaa agctgttctg tgcagacccc gccttggata atagaacagc acgtacagca 840

actaactgca caaataagca gcggactgtg tgtagttcta acgttgcacc aatagtgcat 900

ttgaaaggcg aatcaaatag cttaaagtgt ttgagataca gattaaaacc ttataaagag 960

ttgtacagtt ctatgtcttc aacttggcac tggactagtg acaacaaaaa tagtaaaaat 1020

ggcatagtaa ccgtgacatt tgtaactgaa cagcaacaac aaatgttctt gggtaccgta 1080

aagatacctc ctactgtgca gataagtacc ggattcatga ccttatacgt actgctatcg 1140

gcaggcacgt tgatcgcact aatgcttatc atcttcctaa taacctgctg caagcgggtt 1200

gataggcccg aaagtaccca aaggtccttg agaggtaccg gacgcaacgt atcggtaacg 1260

tcgcaaagcg gcaagttcat tagcagttgg gagtcgcaca aatcaggtgg agagacccgc 1320

ctgtga 1326

<210> 36 <211> 1107 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Seqüência de nucleotideos que codifica um polipeptideo HPV-52 E2 defeituoso para replicação ((52degE2*)(seqüência degenerada))

<400> 36

atggaatcga taccggcacg gttaaacgct gtgcaggaaa agatactcga tctatatgag 60

gctgacagca atgatctaaa cgcacaaatc gagcattgga agttgactcg aatggcttgt 120

gttttgtttt ataaagcaaa ggaactggga ataactcata taggccatca agtagtgcct 180

ccaatggcag tgtctaaggc aaaggcctgc caagccgcag agcttcaatt ggctttggag 240

gcattgaaca aaactcaata cagtacagat ggctggacct tacagcaaac aagtctagaa 300

atgtggcgtg cagagccaca aaaatacttc aagaagcacg ggtacacaat aacagtccaa 360

tacgataatg ataaaaacaa cactatggat tacacaaatt ggaaggaaat ttatttactt 420

ggtgagtgtg aatgcacaat tgtagaagga caagtggatt actatgggtt atactattgg 480

tgtgatggag aaaaaatcta tttcgtaaaa tttagtaacg acgcaaagca atattgtgta 540

acaggagtct gggaggtgca cgtgggcggt caagtaatcg tgtgtccagc atcggtatca 600

agtaacgagg tttctactac agaaacagct gtccacctat gcaccgaaac ctccaagacc 660

tccgcagtgt ccgtgggtgc caaagacaca cacctacaac caccacagaa gcgacgtcga 720

ccagatgtca cagattccag aaacaccaag taccccaaca accttttgcg gggacaacaa 780

tccgttgaca gcactacacg gggactcgta actgccactg agtgcactaa taaaggtcgg 840

gttgcacata caacttgtac tgctcctatt attcacctaa agggtgaccc caacagcttg 900

aaatgcctaa ggtatagggt aaaaacacat aaaagtttat atgttcaaat ttcatctacg 960

tggcattgga cgagtaatga atgtacaaat aataaactag gtattgtaac aataacgtac 1020

agtgatgaga cacagcgtca acagttttta aaaactgtca aaatcccaaa taccgtccaa 1080

gttatacaag gtgtcatgtc attgtaa 1107

<210> 37 <211> 1374 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220> <223> Seqüência de nucleotides que codifica um polipeptideo HPV-52 E2

defeituoso para replicação e apresentado por membrana (SS-52degE2*- TMF)( seqüência degenerada)

<400> 37

atgggtctca aggtgaacgt ctctgccata ttcatggcag tactgttaac tctccaaaca 60

cccaccggtc aaatccattg gggcgaatcg ataccggcac ggttaaacgc tgtgcaggaa 120

aagatactcg atctatatga ggctgacagc aatgatctaa acgcacaaat cgagcattgg 180

aagttgactc gaatggcttg tgttttgttt tataaagcaa aggaactggg aataactcat 240

ataggccatc aagtagtgcc tccaatggca gtgtctaagg caaaggcctg ccaagccgca 300

gagcttcaat tggctttgga ggcattgaac aaaactcaat acagtacaga tggctggacc 360

ttacagcaaa caagtctaga aatgtggcgt gcagagccac aaaaatactt caagaagcac 420

gggtacacaa taacagtcca atacgataat gataaaaaca acactatgga ttacacaaat 480

tggaaggaaa tttatttact tggtgagtgt gaatgcacaa ttgtagaagg acaagtggat 540

tactatgggt tatactattg gtgtgatgga gaaaaaatct atttcgtaaa atttagtaac 600

gacgcaaagc aatattgtgt aacaggagtc tgggaggtgc acgtgggcgg tcaagtaatc 660

gtgtgtccag catcggtatc aagtaacgag gtttctacta cagaaacagc tgtccaccta 720

tgcaccgaaa cctccaagac ctccgcagtg tccgtgggtg ccaaagacac acacctacaa 780

ccaccacaga agcgacgtcg accagatgtc acagattcca gaaacaccaa gtaccccaac 840

aaccttttgc ggggacaaca atccgttgac agcactacac ggggactcgt aactgccact 900

gagtgcacta ataaaggtcg ggttgcacat acaacttgta ctgctcctat tattcaccta 960

aagggtgacc ccaacagctt gaaatgccta aggtataggg taaaaacaca taaaagttta 1020

tatgttcaaa tttcatctac gtggcattgg acgagtaatg aatgtacaaa taataaacta 1080

ggtattgtaa caataacgta cagtgatgag acacagcgtc aacagttttt aaaaactgtc 1140

aaaatcccaa ataccgtcca agttatacaa ggtgtcatgt cattgggttt atcgagcact 1200

agcatagtct acatcctgat tgcagtgtgt cttggagggt tgatagggat ccccgcttta 1260

atatgttgct gcagggggcg ttgtaacaaa aagggagaac aagttggtat gtcaagacca 1320

ggcctaaagc ctgatcttac gggaacatca aaatcctatg taaggtcgct ctga 1374

<210> 38 <211> 2241 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Seqüência de nucleotideos que codifica HPV-18 El defeituoso para

replicação e apresentado por membrana(SS-18E1*-TMF)(degenerada para

reduzir a homologia com nucleotideo de HPV-16 que codifica El)

<400> 38

atgggtctca aggtgaacgt ctctgccata ttcatggcag tactgttaac tctccaaaca 60

cccaccggtc aaatccattg gggcgcagac ccagaaggca cagacggaga aggcacgggt 120

tgcaacggct ggttctacgt acaagctatt gtagacaaga agaccggaga tgtaatttct 180

gacgatgagg acgagaatgc aacagacaca gggtcggata tggttgactt cattgataca 240

caaggaacat tttgtgaaca agccgagcta gaaactgctc aggcattgtt ccatgcgcag 300

gaggtccaca atgatgcaca agtgttgcat gttttaaagc ggaagtttgc aggaggcagc 360

acagaaaaca gtccattagg ggagcggctg gaggtggata cagagttaag cccacggtta 420

caagaaatat ctttaaatag tgggcagaaa aaggctaaga ggcggctgtt tacaatatca 480

gatagtggct acggctgttc tgaggtggaa gcaacacaga ttcaggtaac tacaaatggc 540

gaacatggcg gcaatgtatg cagtggcggc agtacggagg ctatagacaa cggaggcaca 600

gagggcaaca acagcagtgt agacggtaca agcgacaata gcaatataga aaatgtaaat 660

ccacaatgta ccatagcaca attaaaagac ttgttaaaag taaacaataa acaaggagct 720

atgcttgcag tattcaagga cacatatggg ctatcattta cagatttagt tagaaatttc 780

aagagtgaca aaaccacatg tacagactgg gttacagcta tattcggagt aaacccaaca 840

atcgcagaag gatttaagac tctaatacag ccatttatat tgtatgccca tatacaatgt 900

ctagactgta agtggggtgt attaatatta gccctgttgc gttacaagtg cggtaagagt 960

agactaacag ttgctaaagg tttaagtacg ttgttacacg tacctgaaac ttgcatgtta 1020

attcaaccac ctaagttacg aagtagtgtt gctgcactat actggtacag aactggaatt 1080

tctaacataa gcgaggtaat gggtgacaca cctgagtgga ttcagagact tactattata 1140

cagcatggaa tagacgatag caatttcgat ttgtcagaaa tggttcagtg ggcatttgac 1200

aacgagctga cagatgaaag cgatatggca tttgaatacg ccttattagc tgacagcaac 1260 agcaacgcag ctgcattttt aaagagcaat tgccaagcta aatatttaaa agactgtgcc 1320

actatgtgca aacactatag gcgtgcccag aaacgacaga tgaatatgtc acagtggatt 1380

cgatttaggt gttcaaaaat agacgaaggg ggagactgga gaccaatagt gcaattcctg 1440

cgataccaac aaatagaatt cataacattc ttaggagcct tgaaatcatt cttaaaagga 1500

acccccaaga agaactgttt agtattttgt ggaccagcaa atactgacaa gtcatatttc 1560

ggaatgagct ttatacactt tatacaagga gcagttatat cattcgtgaa ctccactagt 1620

cacttctggc tggaaccgtt aacagacact aaggtggcca tgctagacga cgcaacgacc 1680

acgtgctgga catactttga tacctatatg aggaacgcgt tagacggcaa tccaataagt 1740

attgatagaa aacacaaacc tttaatacag cttaagtgtc cgccaatact actaaccaca 1800

aatatacatc cagcaaagga taatagatgg ccatacttag aaagtagaat aacagtattt 1860

gaattcccaa atgcattccc gttcgataaa aatggcaacc ctgtatacga aataaacgac 1920

aaaaattgga agtgtttctt tgaaagaaca tggtcaaggt tagatttaca tgaagaagaa 1980

gaagatgctg atacagaggg taatccattt ggtactttca aattacgagc tggacagaat 2040

cacaggcctc ttggtttatc gagcactagc atagtctaca tcctgattgc agtgtgtctt 2100

ggagggttga tagggatccc cgctttaata tgttgctgca gggggcgttg taacaaaaag 2160

ggagaacaag ttggtatgtc aagaccaggc ctaaagcctg atcttacggg aacatcaaaa 2220

tcctatgtaa ggtcgctctg a 2241

<210> 39 <211> 33 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer OTG15315 para reconstituir seqüência que codifica HPV-18 SS- 6E1*deg-TMF

<400> 39

ggggagatct atgggtctca aggtgaacgt ctc 33

<210> 40 <211> 39 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer OTG17881 para reconstituir seqüência que codifica HPV-18 SS- E1*deg-TMF

<400> 40

gtgccttctg ggtctgcgcc ccaatggatt tgaccggtg 39

<210> 41 <211> 37 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer OTG17882 para reconstituir seqüência que codifica HPV-18 SS- E1*deg-TMF

<400> 41

ggtcaaatcc attggggcgc agacccagaa ggcacag 37

<210> 42 <211> 42 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer OTG17883 para reconstituir seqüência que codifica HPV-18 SS-El*deg-TMF

<400> 42

cagaatcaca ggcctcttgg tttatcgagc actagcatag tc 42

<210> 43 <211> 39 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer oTG17884 para reconstituir seqüência que codifica HPV-18 SS-El*deg-TMF

<400> 43

gctagtgctc gataaaccaa gaggcctgtg attctgtcc 39

<210> 44 <211> 32 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer OTG17885 para reconstituir seqüência que codifica HPV-18 SS-El*deg-TMF

<400> 44

gggggcggcc gctcagagcg accttacata gg 32

<210> 45 <211> 31 <212> DNA

<213> artificial sequence <220>

<223> Primer sense OTG17875 para reconstituir seqüência que codifica HPV- 18 SS-E2*deg-TMR

<400> 45

ggggagatct atggttcctc aggctctcct g 31

<210> 46 <211> 39 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer sense OTG17876 para reconstituir seqüência que codifica HPV-18 SS-E2*deg-TMR

<400> 46

gttttgggaa attccctatt cagacaccga aggaaaccc 39

<210> 47 <211> 43 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer anti-sense oTG17877 para reconstituir seqüência que codifica HPV-18 SS-E2*deg-TMR

<400> 47

gtttccttcg gtgtctgaat agggaatttc ccaaaacaca atg 43

<210> 48 <211> 39 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer anti-sense oTG17878 para reconstituir seqüência que codifica HPV-18 SS-E2*deg-TMR

<400> 48

gtgggataca tgacaatgta tgtattactg agtgcaggg 39

<210> 49 <211> 38 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer anti-sense oTG17879 para reconstituir seqüência que codifica HPV-18 SS-E2*deg-TMR

<400> 49

ctgcactcag taatacatac attgtcatgt atcccacc 38

<210> 50 <211> 29 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer anti-sense oTG17880 para HPV-18 SS-E2*deg-TMR

<400> 50

gggggcggcc gctcacagtc tggtctcac

reconstituir seqüência que codifica

29

<210> 51 <211> 36 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer oTG18962 para reconstituir seqüência que codifica SS-33E2*-TMR

<400> 51

cccaaaggat ccaccatggt accgcaagcc ctgcta

36 <210> 52 <211> 52 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer OTG18963 para reconstituir seqüência que codifica SS-33E2*-TMR

<400> 52

ttcccctctg tttcggtaag tttcctatag aggaaatatc agcacgcttg aa 52

<210> 53 <211> 52 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer OTG18964 para reconstituir seqüência que codifica SS-33E2*-TMR

<400> 53

ttcaagcgtg ctgatatttc ctctatagga aacttaccga aacagagggg aa 52

<210> 54 <211> 49 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer OTG18965 para reconstituir seqüência que codifica SS-33E2*-TMR

<400> 54

gataagtacc ggattcatga ccttatacgt actgctatcg gcaggcacg 49

<210> 55 <211> 49 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer OTG18966 para reconstituir seqüência que codifica SS-33E2*-TMR

<400> 55

cgtgcctgcc gatagcagta cgtataaggt catgaatccg gtacttatc 49

<210> 56 <211> 56 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Primer OTG18967 para reconstituir seqüência que codifica SS-33E2*-TMR <400> 56

aaaaccccgc atgcgcggcc gcaagctatc acaggcgggt ctctccacct gatttg 56

<210> 57 <211> 37 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer OTG18968 para reconstituir seqüência que codifica SS-52E2*-TMF

<400> 57

aaacccgaga tctaccatgg gtctcaaggt gaacgtc 37

<210> 58 <211> 46 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer OTG18969 para reconstituir seqüência que codifica SS-52E2*-TMF

<400> 58

cccaccggtc aaatccattg gggcgaatcg ataccggcac ggttaa 46

<210> 59 <211> 46 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer OTG18970 para reconstituir seqüência que codifica SS-52E2*-TMF

<400> 59

ttaaccgtgc cggtatcgat tcgccccaat ggatttgacc ggtggg 46

<210> 60 <211> 43 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer OTG18971 para reconstituir seqüência que codifica SS-52E2*-TMF

<400> 60

gttatacaag gtgtcatgtc attgggttta tcgagcacta gca 43

<210> 61 <211> 43 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220> <223> Primer OTG18972 para reconstituir seqüência que codifica SS-52E2*-TMF

<400> 61

tgctagtgct cgataaaccc aatgacatga caccttgtat aac 43

<210> 62 <211> 53 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer OTG18973 para reconstituir seqüência que codifica SS-52E2*-TMF

<400> 62

aagcttgcta gccaccggtg gggccgcggc cgctcagagc gaccttacat agg

53

Claims (58)

1. USO DE UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, que codifica pelo menos um polipeptídeo de papiloma vírus E2, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma droga destinada ao tratamento de um organismo hospedeiro que sofre de uma infecção de papiloma vírus persistente causada por pelo menos um papiloma vírus.

2. USO DE UM VETOR, que compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica pelo menos um polipeptídeo de papiloma vírus E2, caracterizado pelo fato de ser para a para preparação de uma droga destinada ao tratamento de um organismo hospedeiro que sofre de uma infecção de papiloma vírus persistente causada por pelo menos um papiloma vírus.

3. USO DE UMA PARTÍCULA VIRAL INFECCIOSA, que compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica pelo menos um polipeptídeo de papiloma vírus E2, caracterizado pelo fato de ser para a para preparação de uma droga destinada ao tratamento de um organismo hospedeiro que sofre de uma infecção de papiloma vírus persistente causada por pelo menos um papiloma vírus.

4. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a mencionada molécula de ácido nucléico, vetor ou partícula viral infecciosa é administrada após exposição ao pelo menos um papiloma vírus e antes da detecção/aparição de uma lesão associada a papiloma vírus.

5. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o mencionado pelo menos um polipeptídeo de papiloma vírus E2 origina-se a partir de um HR-HPV selecionado a partir do grupo que consiste de HPV-16, HPV-18, HPV-30, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66, HPV-68, HPV-70 e HPV-85.

6. USO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o mencionado pelo menos um polipeptídeo de papiloma vírus E2 origina-se a partir de HPV-16, HPV-18, HPV-33, HPV-52 ou qualquer de suas combinações.

7. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a mencionada molécula de ácido nucléico é modificada de forma a codificar um polipeptídeo E2 com defeito pelo menos para a atividade de ativação de transcrição e/ou replicação.

8. USO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o mencionado polipeptídeo E2 origina-se a partir de HPV-16 e compreende a seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N0 1, exceto pelo fato de que pelo menos o resíduo Glu na posição 39 (E39) e/ou o resíduo Ile na posição 73 (I73) é/são substituído(s) para qualquer resíduo de aminoácido diferente de Glu e Ile nas posições correspondentes 39 e 73.

9. USO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o resíduo Glu na posição 39 e/ou o resíduo Ile na posição 73 são substituídos com um resíduo Ala.

10. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a mencionada molécula de ácido nucléico é modificada de forma a codificar um polipeptídeo E2 apresentado por membrana.

11. USO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o mencionado polipeptídeo E2 apresentado por membrana é modificado por meio de fusão do mencionado polipeptídeo E2 de papiloma vírus para uma seqüência de secreção e de ancoragem de membrana.

12. USO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que as mencionadas seqüências de secreção e/ou de ancoragem de membrana originam-se a partir da glicoproteína de hidrofobia, glicoproteína de envelope de vírus HIV ou proteína de vírus F de sarampo ou são sintéticas.

13. USO, de acordo com uma das reivindicações 6 a 12, caracterizado pelo fato de que o mencionado vetor é selecionado a partir do grupo que consiste de: - um vetor que compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E2; um vetor que compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-18 E2; um vetor que compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-33 E2; e um vetor que compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-52 E2.

14. USO, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que a mencionada molécula de ácido nucléico codifica um polipeptídeo E2 que compreende a seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N0 2.

15. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o mencionado vetor ou partícula viral infecciosa compreende moléculas de ácido nucléico que codificam pelo menos dois polipeptídeos E2 originários de genótipos de papiloma vírus diferentes.

16. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o mencionado ácido nucléico, vetor ou partícula viral de infecção é utilizado em combinação com um ou mais polipeptídeos adicionais ou um ou mais ácidos nucléicos, vetores ou partículas infecciosas que codificam o(s) mencionado(s) polipeptídeo(s) adicional(is).

17. USO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o mencionado polipeptídeo adicional é um polipeptídeo HPV inicial selecionado a partir do grupo que consiste de E1, E2, E4, E5, E6 e E7.

18. USO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o mencionado polipeptídeo adicional de papiloma vírus origina-se do mesmo genótipo de papiloma vírus do polipeptídeo E2 codificado pela mencionada molécula de ácido nucléico.

19. USO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o mencionado polipeptídeo adicional de papiloma vírus origina-se de um genótipo de papiloma vírus diferente do polipeptídeo E2 codificado pela mencionada molécula de ácido nucléico.

20. USO, de acordo com uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que o mencionado polipeptídeo adicional de papiloma vírus é um polipeptídeo E1 modificado que compreende uma ou mais modificações em comparação com o polipeptídeo E1 nativo correspondente, de forma que seja defeituoso para o estímulo da replicação viral, com uma preferência especial por um polipeptídeo E1 modificado que compreende a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo HPV-16 E1 nativo, exceto pela substituição do resíduo Gly na posição 482 com um resíduo Asp.

21. USO, de acordo com uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que o mencionado polipeptídeo adicional de papiloma vírus é um polipeptídeo E6 modificado que é não oncogênico e alterado para ligação ao produto genético supressor de tumores celulares p53.

22. USO, de acordo com uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que o mencionado polipeptídeo adicional de papiloma vírus é um polipeptídeo E7 modificado que é não oncogênico e alterado para ligação ao produto genético supressor de tumores celulares Rb.

23. USO, de acordo com uma das reivindicações 17 a 22, caracterizado pelo fato de que o mencionado polipeptídeo adicional de papiloma vírus é selecionado a partir do grupo que consiste dos polipeptídeos que compreendem qualquer das seqüências de aminoácidos fornecidas em SEQ ID N0 3 a 5.

24. VETOR, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de papiloma vírus E1 e uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de papiloma vírus E2 em que a parte 3' da mencionada molécula de ácido nucléico que codifica E1 que, no contexto natural, é 100% idêntica à parte 5' da mencionada molécula de ácido nucléico que codifica E2 é modificada de forma a exibir um percentual de identidade de menos de 75% com a mencionada parte da mencionada molécula de ácido nucléico que codifica E2.

25. VETOR, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo E1 de papiloma vírus e uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo E2 de papiloma vírus em que a mencionada molécula de ácido nucléico que codifica E1 e a mencionada molécula de ácido nucléico que codifica E2 não compreendem uma porção de 40 ou mais nucleotídeos contíguos que exibem um percentual de identidade de 75% ou mais de 75%.

26. VETOR, caracterizado pelo fato de que compreende moléculas de ácido nucléico que codificam pelo menos dois polipeptídeos E2 de papiloma vírus em que as mencionadas moléculas de ácido nucléico que codificam E2 não compreendem uma porção de 40 ou mais nucleotídeos contíguos que exibem um percentual de identidade de 75% ou mais de 75%.

27. VETOR, de acordo com uma das reivindicações 24 a 26, caracterizado pelo fato de que a mencionada molécula de ácido nucléico que codifica E1 compreende a seqüência de nucleotídeos exibida em SEQ ID N0 6 ou SEQ ID N0 7.

28. VETOR, de acordo com uma das reivindicações 24 a 27, caracterizado pelo fato de que a(s) mencionada(s) molécula(s) de ácido nucléico que codifica(m) E2 codifica(m) um polipeptídeo E2 conforme definido em uma das reivindicações 5 a 12 e 14.

29. VETOR, de acordo com uma das reivindicações 24 a 28, caracterizado pelo fato de que o mencionado vetor é selecionado a partir do grupo que consiste de: um vetor que compreende (i) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E2 e que compreende adicionalmente (ii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-18 E2; um vetor que compreende (i) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E2, (ii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-18 E2 e (iii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-33 E2; um vetor que compreende (i) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E2, (ii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-18 E2 e (iii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-52 E2; um vetor que compreende (i) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E2, (ii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-33 E2 e (iii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-52 E2; - um vetor que compreende (i) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E2, (ii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-18 E2, (iii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-33 E2 e (iv) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-52 E2; - um vetor que compreende (i) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E2 e (ii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E1; um vetor que compreende (i) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E2, (ii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E1, (iii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-18 E2 e (iv) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-18 E1; - um vetor que compreende (i) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E2 e (ii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E6; um vetor que compreende (i) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E2 e (ii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E7; um vetor que compreende (i) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E2, (ii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E1, (iii) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E6 e (iv) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo HPV-16 E7; um vetor que compreende moléculas de ácido nucléico que codificam polipeptídeos HPV-16 E1, E2, E6 e E7 e polipeptídeos HPV-18 E1, E2, E6 e E7.

30. USO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o mencionado polipeptídeo HPV-16 E2 compreende a seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N0 2; e/ou o mencionado polipeptídeo HPV-18 E2 compreende a seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N0 29; e/ou o mencionado polipeptídeo HPV-33 E2 compreende a seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N0 30; e/ou o mencionado polipeptídeo HPV-52 E2 compreende a seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N0 31.

31. VETOR, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o mencionado polipeptídeo HPV-16 E2 compreende a seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N0 2; e/ou o mencionado polipeptídeo HPV-18 E2 compreende a seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N° 29; e/ou o mencionado polipeptídeo HPV-33 E2 compreende a seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N° 30; e/ou o mencionado polipeptídeo HPV-52 E2 compreende a seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N° 31.

32. USO, de acordo com uma das reivindicações 17 a 22, caracterizado pelo fato de que o mencionado polipeptídeo HPV-16 E1 compreende a seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N° 3; e/ou o mencionado polipeptídeo HPV-18 E1 compreende a seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N° 32; e/ou o mencionado polipeptídeo HPV-16 E6 compreende a seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N° 4; e/ou o mencionado polipeptídeo HPV-16 E7 compreende a seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N° 5.

33. VETOR, de acordo com a reivindicação 29 ou 31, caracterizado pelo fato de que o mencionado polipeptídeo HPV-16 E1 compreende a seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N° 3; e/ou o mencionado polipeptídeo HPV-18 E1 compreende a seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N°32; e/ou o mencionado polipeptídeo HPV-16 E6 compreende a seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N° 4; e/ou o mencionado polipeptídeo HPV-16 E7 compreende a seqüência de aminoácidos exibida em SEQ ID N° 5.

34. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que a mencionada molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo HPV-16 E2 compreende a seqüência de nucleotídeos exibida em SEQ ID N° 8; e/ou a mencionada molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo HPV-18 E2 compreende a seqüência de nucleotídeos exibida na SEQ ID N° 33; e/ou a mencionada molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo HPV-33 E2 compreende a seqüência de nucleotídeos exibida em SEQ ID N° 34 ou SEQ ID N° 35; e/ou a mencionada molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo HPV-52 E2 compreende a seqüência de nucleotídeos exibida em SEQ ID N° 36 ou SEQ ID N° 37; e/ou a mencionada molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídio HPV-16 E1 compreende a seqüência de nucleotídeos exibida em SEQ ID N° 7; e/ou a mencionada molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo HPV-18 E1 compreende a seqüência de nucleotídeos exibida em SEQ ID N° 38.

35. VETOR, de acordo com uma das reivindicações 29, 31 ou 33, caracterizado pelo fato de que a mencionada molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo HPV-16 E2 compreende a seqüência de nucleotídeos exibida em SEQ ID N° 8; e/ou a mencionada molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo HPV-18 E2 compreende a seqüência de nucleotídeos exibida na SEQ ID N° 33; e/ou a mencionada molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo HPV-33 E2 compreende a seqüência de nucleotídeos exibida em SEQ ID N° 34 ou SEQ ID N° 35; e/ou a mencionada molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo HPV-52 E2 compreende a seqüência de nucleotídeos exibida em SEQ ID N° 36 ou SEQ ID N° 37; e/ou a mencionada molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo HPV-16 E1 compreende a seqüência de nucleotídeos exibida em SEQ ID N° 7; e/ou a mencionada molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo HPV-18 E1 compreende a seqüência de nucleotídeos exibida em SEQ ID N° 38.

36. USO DE UM VETOR, de acordo com uma das reivindicações 24 a 29, 31, 33 e 35, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma droga destinada ao tratamento de um organismo hospedeiro que sofre de uma infecção de papiloma vírus persistente causada por pelo menos um papiloma vírus.

37. USO DE UMA PARTÍCULA VIRAL INFECCIOSA, que compreende o vetor conforme descrito na reivindicação 36, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma droga destinada ao tratamento de um organismo hospedeiro que sofre de uma infecção de papiloma vírus persistente causada por pelo menos um papiloma vírus.

38. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 23, 30, -32, 34, 36 e 37, caracterizado pelo fato de que o mencionado vetor é um vetor viral de varíola gerado a partir de uma varíola dos canários, varíola das aves ou vírus de vacina.

39. VETOR, de acordo com uma das reivindicações 24 a 29, -31, 33 e 35, caracterizado pelo fato de que o mencionado vetor é um vetor viral de varíola gerado a partir de uma varíola dos canários, varíola das aves ou vírus de vacina.

40. USO, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o mencionado vírus de vacina é a linhagem de Copenhague, linhagem de Wyeth, NYVAC ou linhagem de Ancara modificada (MVA).

41. USO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o mencionado vetor viral é derivado de um vírus de vacina de Copenhague, em que a mencionada molécula de ácido nucléico é inserida no gene timidino quinase.

42. USO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o mencionado vetor viral é derivado de um vírus de vacina de MVA e em que a mencionada molécula de ácido nucléico é inserida em exclusão III.

43. USO, de acordo com uma das reivindicações 40 a 42, caracterizado pelo fato de que a(s) mencionada(s) molécula(s) de ácido nucléico que codifica(m) E2 e/ou E7 é(são) colocada(s) sob o promotor H5R de vacina e a(s) molécula(s) de ácido nucléico que codifica(m) E1 e/ou E6 sob o controle do promotor p7.5K.

44. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 23, 30, -32, 34, 36 a 38 e 40 a 43, caracterizado pelo fato de que a mencionada molécula de ácido nucléico, vetor ou partícula viral infecciosa ou qualquer de suas combinações é compreendida em uma composição.

45. USO, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que a mencionada composição é formulada em uma forma apropriada para injeção.

46. USO, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a mencionada composição é formulada em uma forma apropriada para injeção intramuscular ou subcutânea.

47. USO1 de acordo com uma das reivindicações 1 a 23, 30, -32, 34, 36 a 38, 40 a 46, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento de uma infecção persistente causada por pelo menos um HR-HPV.

48. USO, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento de um organismo hospedeiro que sofre de uma infecção causada por pelo menos um dentre HPV16, HPV31, HPV33, HPV35, HPV52 e HPV58, em que a mencionada molécula de ácido nucléico codifica um polipeptídeo E2 originário de HPV-16.

49. USO, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento de um organismo hospedeiro que sofre de uma infecção causada por pelo menos um dentre HPV-18, HPV-39, HPV-45, HPV- -51, HPV-56, HPV-59, HPV-68, HPV-70 e HPV-85, em que a mencionada molécula de ácido nucléico codifica um polipeptídeo E2 originário de HPV-18.

50. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 23, 30, -32, 34, 36 a 38 e 40 a 49, caracterizado pelo fato de que a mencionada molécula de ácido nucléico, vetor, partícula viral infecciosa ou composição é utilizada para fornecer uma reação antiviral contra pelo menos um dos papiloma vírus infecciosos.

51. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 23, 30, -32, 34, 36 a 38 e 40 a 50, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma droga destinada a induzir ou ativar uma reação imunológica.

52. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 23, 30, -32, 34, 36 a 38 e 40 a 51, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma droga destinada a fornecer uma reação antiviral.

53. VETOR, de acordo com uma das reivindicações 24 a 31, -33 e 35, ou conforme definido em umas das reivindicações 2, 13-16, 38-44 e 50 caracterizado pelo fato de ser utilizado para o tratamento de infecção por papiloma vírus persistente.

54. PARTÍCULA VIRAL INFECCIOSA, conforme definida em uma da reivindicações 3, 15, 16, 37, 44 e 50, caracterizada pelo fato de ser utilizada para o tratamento de infecção por papiloma vírus persistente.

55. COMPOSIÇÃO, conforme definida em uma das reivindicações 44-46, caracterizada pelo fato de ser utilizada para o tratamento de infecção por papiloma vírus persistente.

56. VETOR, de acordo com uma das reivindicações 24 a 31, -33 e 35, ou conforme definido em umas das reivindicações 2, 13-16, 38-44 e 50 caracterizado pelo fato de ser utilizado para a indução ou ativação de uma reação imunológica.

57. PARTÍCULA VIRAL INFECCIOSA, conforme definida em uma da reivindicações 3, 15, 16, 37, 44 e 50, caracterizada pelo fato de ser utilizada para a indução ou ativação de uma reação imunológica.

58. COMPOSIÇÃO, conforme definida em uma das reivindicações 44-46 caracterizada pelo fato de ser utilizada para a indução ou ativação de uma reação imunológica.