KR100880701B1 - 증식성 질환 치료용 아데노바이러스 벡터 및 ｐ53 유전자의재조합 유전자 약제 - Google Patents

증식성 질환 치료용 아데노바이러스 벡터 및 ｐ53 유전자의재조합 유전자 약제 Download PDF

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Abstract

증식성 질환을 치료할 수 있는 아데노바이러스 벡터 및 유전자 p53의 재조합 유전자 약제의 한 종류는 아데노바이러스 벡터 및 인간 종양 억제 유전자 p53 발현 키트로부터 구성된 혼돈(confusion) 서열이다. 본 발명에서, 본 발명자들은 원핵 세포(대장균)에서 아데노바이러스 벡터와 인간 유전자 p53을 상동성 재조합한 다음, 아데노바이러스 벡터 및 인간 유전자 p53 발현 키트의 재조합 유전자 약제를 수득하였다. 인간 p53 유전자 발현 키트는 프로모터 p53cDNA-폴리아데닌 뉴클레오티드로 이루어진 특징적인 서열이다. 본 발명의 약제는 증식성 질환, 예를 들면 켈로이드(cheloid) 치료용 임상적 유전자 치료제의 제조에 사용될 수 있다.
아데노바이러스 벡터, 인간 종양 억제 유전자 p53, 증식성 질환, 재조합 유전자 약제

Description

증식성 질환 치료용 아데노바이러스 벡터 및 ｐ53 유전자의 재조합 유전자 약제 {RECOMBINANT GENE MEDICINE OF ADENOVIRUS VECTOR AND GENE p53 FOR TREATING PROLIFERATIVE DISEASES}
본 발명은 유전자 조작 기술, 특히 증식성 질환 치료용 인간 종양 억제 유전자 p53 및 아데노바이러스 벡터의 재조합 서열로 구성된 유전자 재조합 약제에 관한 것이다.
증식성 질환은 세포 증식증 및/또는 대사산물의 이상 발현에 의해 특성화되는 유전자성 질환이다. 이는 모든 인간 조직 및 기관, 예를 들면 피부, 골수 및 유선에서 기능장애를 일으킬 수 있는 양성 증식증이다. 반흔(scar)은 인간 상처 회복 과정의 피할 수 없는 산물이다. 어떠한 종류의 상처 회복이든 반흔은 생기게 된다. 반흔에는 정상 반흔 및 병적 반흔을 비롯한 두 가지 유형이 있다. 병적 반흔은 증식성 반흔 및 켈로이드(cheloid)를 포함하며, 양쪽 모두 신생물성 증식 및 기능장애를 일으킨다. 이는 의학 분야에서 가장 어려운 네가지 문제점들 중 하나이다. 켈로이드는 피부 증식 질환이다. 이는 대개 피부 손상시 발생하는 자발적으로 또는 비자발적으로 유발된 이상 콜라겐 축적에 의해 유발되는 과증식증이다. 이의 임상적 증상은 과발현, 본래의 손상 경계의 비대, 이웃 조직의 침범, 비후전(non- recession), 및 수술 후 재발을 포함한다. 켈로이드 형성시 p53 유전자 변이가 발생한다는 것이 많은 실험들에 의해 증명되었다. 그러나, 현재 켈로이드에 대한 유효하고 특이적인 치료법은 존재하지 않는다. 또한, 이는 정형외과 수술에서 가장 중요한 문제점들 중 하나이기도 하다.
증식성 질환에 대한 통상적인 약제는 (1) 코티코스테로이드, 이는 작은 병리학적 반흔에는 효과적이지만, 국소적인 피부 수축, 색소 감소 또는 탈색, 모세관확장증(telangiectasis), 심지어 피부 괴사 및 악취성궤양(elkosis)을 유발할 수 있으며, 또한, 고혈압, 골다공증, 소화기 천공, 기형종양, 심지어 쿠싱 반응(Cushing's response)을 심각하게 유발하며; (2) 트레티노인, 이는 반흔을 치료하는데 거의 사용하지 않으며; (3) 트라닐라스트(tranilast), 이는 6개월 이상을 투여해야 하는 것이며; 외과적 치료, 레이저 치료, 방사선 치료 및 압착 방법을 또한 증식성 질환을 치료하는데 사용할 수 있다.
병리학적 반흔에 상대 유전자의 연구를 개발하는데 있어 섬유아세포 파급-자가사멸(apoptosis) 및 콜라겐의 대사를 조절하는 일부 유전자를 클로닝하고 설명하였다. 따라서 증식성 질환에 대한 유전자 치료가 개시되었다.
삭제
본 명세서는 특정 유전자-조작 세포주에서 증촉되고 파급될 수 있으며 진핵성 세포에서 종양 억제 단백질을 발현할 수 있는 재조합체를 개시한다. 재조합체 벡터는 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스일 수 있다. 바람직한 벡터는 아데노바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터 서열을 포함하는 조합 벡터이다. 가장 바람직한 벡터는 아데노바이러스 벡터이다.
인간 종양 억제 유전자는 임의의 종양 억제 유전자일 수 있으며, 가장 바람직한 것이 p53이다.
아데노바이러스 벡터와 p53 유전자를 조합시킨 재조합체를 재조합체 p53 아데노바이러스라고 정의하며, 이는 하기 서열을 갖는다:
아데노바이러스 5의 우측 말단-
ATGTTTACCGCCACACTCGCAGGGTCTGCACCTGGTGCGGGTCTCATCGTACCTCAGCACCTTCCAGATC70TCTGACATGCGATGTCGACTCGACTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTATCTGAGGGGACTAGGGTGTGTTTAGGCGAAAAGCGGGGCTTCGGTTGTACGCGGTTAGGAGTCCCCTCAGGATATAGTAGTTTCGCTTTTGCATAGGGAGGGGGAAATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGCCATTTGACCATTCACCACATTGGTGTGCACCTCCAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCCG523CTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGCTGGGAGCGTCTTTCCACGACGGTGACACGCTTCCCTGGATTGGCAGCCAGACTGCTTTCCGGGTCACTGCC655ATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCCTAGCGTCGAGCCCCCTCTGAGTCAGGAAACATTTTCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAAAACAACGTTCTGTCCCCCTTGCCGTCCCAAGCAATGGATGATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGAACAATGGTTCACTGAAGACCCAGGTCCAGATGAAGCTCCCAGAATGCCAGAGGCTGCTCCCCCCGTGGCCCCTGCACCAGCAGCTCCTACACCGGCGGCCCCTGCACCAGCCCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCTGTCCCTTCCCAGAAAACCTACCAGGGCAGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGGCCAAGACCTGCCCTGTGCAGCTGTGGGTTGATTCCACACCCCCGCCCGGCACCCGCGTCCGCGCCATGGCCATCTACAAGCAGTCACAGCACATGACGGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATTTGCGTGTGGAGTATTTGGATGACAGAAACACTTTTCGACATAGTGTGGTGGTGCCCTATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAACTACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGACTCCAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCTCACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCCAACAACACCAGCTCCTCTCCCCAGCCAAAGAAGAAACCACTGGATGGAGAATATTTCACCCTTCAGATCCGTGGGCGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCGAGAGCTGAATGAGGCCTTGGAACTCAAGGATGCCCAGGCTGGGAAGGAGCCAGGGGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAAAAACTCATGTTCAAGACAGAAGGGCCTGACTCAGACTGA1837CATTCTCCACTTCTTGTTCCCCACTGACAGCCTCCCACCCCCATCTCTCCCTCCCCTGCCATTTTGGGTTTTGGGTCTTTGAACCCTTGCTTGCAATAGGTGTGCGTCAGAAGCACCCAGGACTTCCATTTGCTTTGTCCCGGGGCTCCACTGAACAAGTTGGCCTGCACTGGTGTTTTGTTGTGGGGAGGAGGATGGGGAGTAGGACATACCAGCTTAGATTTTAAGGTTTTTACTGTGAGGGATGTTTGGGAGATGTAAGAAATGTTCTTGCAGTTAAGGGTTAGTTTACAATCAGCCACATTCTAGGTAGGGGCCACTTCACCGTACTAACCAGGGAAGCTGTCCCTCACTGTTGAATTTTCTCTAACTTCAAGGCCCATATCTGTGAAATGCTGGATTTGCCCTACCTCGGAATGCTGGCATTTGCACCTACCTCACAGAGTGCATTGTGAGGGTT2297AATGAAATAATGTACATCTGGCCTTGAAACCACCTTTTATTACATGGGGTCTAGCGGGATCCACTAGTAACGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCGAGCATGCATCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGAGGGGGATCCCCACGCTAGAGCT2733GACTATAATAATAAAACGCCAACTTTGACCCGGAACGCGGAAAACACCTGAGAAAAACACCTGGGCGAGTCTCCACGTAAACGGTCAAAGTCCCCGCGGCCCTAGACAAATATTA2848- 아데노바이러스 5의 좌측 말단
상기 식 중:
1. 아데노바이러스 5의 우측 말단 및 아데노바이러스 5의 좌측 말단은 아데노바이러스 5의 유전자 전체 서열 (젠뱅크 번호(Genbank No): NC_001406)에 기재되어 있음
2. 1-70: 아데노바이러스의 우측 아암(arm) (70번째 염기는 아데노바이러스 유전자 서열 3328에 위치함)
3. 71-523：라우스 육종(Rous Sarcoma) 바이러스(RSV) LTR(프로모터)
4. 524-655: 5' 말단 비번역 영역
5. 656-1837: p53 유전자 코딩 서열
6. 1838-2733: 3' 말단 비번역 영역 (2298에서 출발하는 폴리 아데노신 테일(poly Adenosine tail))
2734-2848: 아데노바이러스의 좌측 아암 (2734에서의 염기가 아데노바이러스 5 유전자 서열의 452에 위치함).
이 재조합의 발현 카세트는 프로모터-p53cDNA-폴리 아데노신으로 구성된 특이적 서열이다. 그의 상류 서열은 임의의 진핵 세포 프로모터, 원핵 세포 프로모터 또는 바이러스 프로모터를 함유한다. 그의 하류 서열은 진핵 세포의 임의의 폴리 아데노신(polyA)을 함유한다.
본 발명의 재조합 DNA는 하기한 바와 같이 수득되었다. 재조합 바이러스 벡터를 상동성 재조합에 의해 원핵 세포에서 수득하였다. 먼저, 재조합 생성물 pGT-2를 대장균에서 아데노바이러스와 양쪽 말단 상에 아데노바이러스의 역 반복 서열을 포함하는 원형질 pGT-1의 상동성 재조합에 의해 구성하였다. 두번째로, 재조합 생성물 pGT-3을 대장균에서 pGT-2와 인공 서열 "아데노바이러스 우측 아암/프로모터-p53cDNA-폴리 아데노신/아데노바이러스 좌측 아암"의 상동성 재조합에 의해 구성하였다. 마지막으로, 엔도뉴클레아제(endonuclease) PacI를 사용하여 원핵 플라스미드 서열을 제거함으로써 재조합 p53 아데노바이러스를 수득하였다.
삭제
상기 방법들에 따르면, 아데노바이러스의 양측 상의 장 말단 반복(LTR)을 PCR에 의해 증폭시키고, 각각 PacI 제한 효소 부위를 도입시켰다. 양쪽 모두의 LTR 단편을 pUC18 벡터로 클로닝하고, pGT-1 재조합 서열을 생성하였다. 그 다음, 구성된 pGT-1 벡터 및 아데노바이러스 5 유전자 서열을 대장균 (BJ5183, 시바이오노 캄파니(SiBiono Company)에 의해 보존됨, 보존 번호(preserve no.): P-e012)으로 공동 형질감염시켰다. 그 다음, 아데노바이러스 5 유전자 서열을 pGT-1과 상동 조합시켰다. 그 다음, 양성 바이러스 클론을 증폭시키고, PCR에 의해 스크리닝하고, 제한 효소를 사용하여 시험하였다. 마지막으로, 아데노바이러스 5 전체 유전자 서열을 함유하는 재조합 벡터 pGT-2를 얻었다.
5' ATGGAGGAGCCGCAGTCAGATC 및 5' ATATCTGCAGAATTCCAGCAC를 프라이머로 사용하여, 인간 종양 억제 p53 유전자를 PCR에 의해 증폭시켰다. 그 다음, p53 유전자의 전체 서열(5' 및 3' 비번역 서열 포함)을 벡터 pUC19로 클로닝하고, DNA 시퀀싱(sequencing)에 의해 시험하였다. 다음으로, RSV(라우스 육종 바이러스) LTR 서열 및 아데노바이러스의 BGH 및 E1 서열의 PA 서열을 PCR에 의해 증폭시켰다. 링커(linker) 서열을 상기 각 서열의 한 측에 부착시키고, DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다. 다음의 PCR 반응에서, LTR 및 PA 서열을 p53의 각 5' 및 3' 말단에 각각 부착시켰다. 아데노바이러스 E1 섹션 및 그의 상류 서열을 p53의 외부측에 조합시켜 p53 유전자 발현 카세트를 구성하였다(도 1).
대장균 BJ5183을 p53 유전자 발현 카세트 및 재조합 벡터 pGT-2에 의해 공동 형질감염시키고, 여기서 상동성 재조합이 발생하였다. 그 다음, 양성 클론을 증식시키고, PCR 스크리닝하고, 제한 효소 분해를 통해 시험하였다. 생성되는 재조합 벡터는 pGT-3이었으며, 이는 대부분의 아데노바이러스 5 서열을 함유하였다(그의 E1 섹션 및 상류 서열의 일부는 p53 발현 카세트에 의해 치환되었음). 재조합 벡터 pGT-3을 PacI에 의해 선형화하고, pUC18로부터 유래한 서열을 제거하였다. 그 다음, pGT-3을 사용하여 293 세포(시바이오노 코퍼레이션(SiBiono Corp.)에 의해 보존됨, 보존 번호(preservation No.): E-393)를 형질감염시켰다. 재조합체를 세포에서 패킹하고, 아데노바이러스 시스 작용(cis-acting) 서열 및 LTR 프로모터를 함유하는 인간 종양 억제 유전자 p53 카세트를 생성하였다. 생성되는 재조합 p53 아데노바이러스 벡터는 높은 형질감염률을 갖고, 조작이 용이하며, 단일 프로모터에 의해 조절되었다.
이러한 재조합 p53 아데노바이러스는 하기 특징을 가진다:
이는 아데노바이러스 벡터 및 p53 유전자 인공 발현 카세트를 사용하여 구성되었으며,
1. 구조: 이는 다른 화학적 합성 약제, 허브 및 유전자 조작된 약제들과는 상이한 생존하는 재조합 아데노바이러스였다. 이는 높은 생물학적 활성을 가지며, 생체내에서 바로 발현될 수 있고, 임상적 적용에 매우 유효하였다. 아데노바이러스는 대형 유전자 단편을 운반할 수 있고, 높은 형질감염률을 가지며, 고 역가 바이러스 입자로 제조될 수 있고, 매우 광범위한 숙주 범위를 가지며, 매우 안전한 것으로 판명되었다. 그의 항원성은 특히 재구성된 후 크게 감소하였다. 따라서, 표적 유전자가 용이하게 안정화되고, 생체내에서 발현되었다. p53 인공 유전자 발현 카세트에서, p53 유전자의 발현은 아데노바이러스 벡터의 단일 프로모터에 의해 직접 조절되고, 폴리 아데노신 테일 신호를 첨가함으로써 무상 발현 카세트를 구성하였다.
2. 적용: 이 재조합 P53 아데노바이러스는 광범위 스펙트럼 항-종양 약제이다. 많은 악성 종양을 치료하는데 사용할 수 있다. II상 임상 시험에서 머리와 목의 편평상피 칼시노마 및 폐암 등에서 현저한 효과를 나타내었다. 재조합 P53 아데노바이러스는 특히 종양 재발을 방지하는데 효과적이다. I상 임상 및 수술 후-3년 연구에서 재조합 P53 아데노바이러스가 암 백신으로서 후두암 환자의 수술-후 재발을 억제하는 것을 나타내었다.
본 발명의 재조합 P53 아데노바이러스는 실험시 많은 악성 종양의 치료용 약제로서 제조할 수 있다. 그리고 종양신생 및 수술-후 종양 재발 방지용 약제로도 제조할 수 있다.
본 출원인들은 또한 재조합 P53 아데노바이러스가 비정상적 과증식 세포 발현 정상 p53 단백질을 유도할 수 있으며, 따라서 효과적으로 세포 재생을 억제하고 켈로이드를 포함하는 과증식성 질환을 회복시킨다는 것을 발견하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 그들의 벡터를 가진면서 잠재적으로 치료 유전자를 재조합하는 것이며, 따라서 과증식증을 치료하기 위한 아데노바이러스 벡터의 재조합 DNA와 p53 유전자를 제공하는 것이다. 재조합 생성물을 이후 과증식성 세포 발현 정상 P53 단백질을 유도하게 된다. 이런 방식으로 비정상 세포의 증식을 효과적으로 억제하고 켈로이드를 비롯한 과증식성 질환을 치유하는데 사용할 수 있다.
먼저, 본 발명의 재조합 약제를 특이적으로 유전자 조작된 세포에 형질감염시켰다. 그 다음, 세포를 성장시키고, 농축시키고, 임상 적용에 사용할 수 있는 재조합 p53 아데노바이러스 항증식증 주사 내에서 정제하였다.
본 발명에 사용된 293 세포(ATCC CRL-1573, 32번째 세대, 1997년 6월 13일, ATCC로부터 입수)를 아데노바이러스 5(Ad5) DNA에 의해 형질전환되고 Ad5 5' 말단으로부터의 11 %의 유전자(E1a 포함)를 함유하는 인간 배아 신장 내피 세포로부터 스크리닝하였다. 상기 세포는 아데노바이러스에 의한 감염에 대해 상당히 허용적이었으며, 아데노바이러스의 성장에 대해서도 허용적이었다.
본 발명의 주요한 공헌은 많은 이상 증식성 세포의 성장을 억제할 수 있는 인간 종양 억제 유전자 p53을 이용한다는 점에 있다. 억제 유전자를 E1- 아데노바이러스에 클로닝하고, 신체에 국부 주사하였다. 아데노바이러스는 p53 유전자가 증식성 조직에 들어가는 것을 돕는다. 발현된 p53 단백질은 이상 증식성 세포의 성장을 억제할 수 있거나 또는 심지어 이상 세포를 사멸시킬 수 있었다. 또한, 본 발명은 이러한 재조합 p53 아데노바이러스 생성물을 제조하는 방법을 제공하였으며, 이는 시험관내 P53 단백질의 불안정성(반감기 = 20 분)에 의해 유발되는 문제점을 해결하였다.
재조합 p53 아데노바이러스는 인간 종양 억제 유전자 p53을 운반하고, 이상 증식성 세포에서 바로 발현됨으로써 p53 단백질의 불안정성으로 인해 재조합 유전자 조작된 생성물이 시험관내 제조될 수 없는 문제점을 해결하였다. 증식성 질환의 치료에 아데노바이러스를 사용하여, P53 단백질을 연속적으로, 매우 유효하게 생체내에서 발현시킬 수 있었다. 나아가, 인산화, 접힘(folding) 및 중합을 비롯한 생체내 단백질 분자 변형은 진핵 세포의 경우와 동등하였다. 환자를 인간 종양 억제 인자 P53 단백질 생성에 대한 공급원으로 유효하게 사용하여 유전자를 증식성 조직에 직접 도입시켜 단백질을 발현시킴으로써 본 발명의 재조합 p53 아데노바이러스는 진핵 세포에서 p53 유전자의 발현을 도입시키는 데 사용될 수 있었다. 이 방법은 외래 p53 유전자를 인체에 성공적으로 도입시키고, 이를 증식성 조직에서 높게 발현될 수 있게 하였다. 이는 증식성 질환의 유전자 치료법을 가능하게 하였다.
도 1은 재조합 약제의 개략적 구성 과정이다.
도 2는 재조합 약제 생산에 대한 실험 프로토콜의 흐름도이다.
도 3은 여러 세대를 거친 후 재조합 유전자의 아가로오스 겔 전기영동의 안정성 시험도이며, 이는 5' CCACGACGGTGACACGCTTC 및 5' CAAGCAAGGGTTCAAAGAC를 프라이머로 사용하고, p53cDNA를 주형으로 사용하여 PCR에 의해 재조합 p53 아데노바이러스를 증폭시킴으로써 이루어졌다. 재조합 p53 아데노바이러스의 PCR 증폭은 1400 bp DNA 절편으로 얻었다. 1. DNA 마커; 2,3,4 p53 cDNA의 PCR 결과
도 4는 세포 293을 재조합 유전자(시바이오노 코퍼레이션에 의해 보존됨, 보존 번호: No-1, 하기와 동일함)에 의해 감염시킨 후 36 시간 경과 후 수득한 바이러스 DNA의 PCR 증폭의 아가로오스 겔 전기영동의 결과 분석도이다. DNA 절편은 2750 bp이다. 1. DNA 마커; 2, 재조합 p53 아데노바이러스의 PCR 결과
도 5는 Hep-2 및 H1299 세포를 재조합 아데노바이러스에 의해 감염시킨 후 36 시간 경과 후의 웨스턴 블롯(Western blot) 분석이다. Hep-2 세포 및 H1299 세포에서 재조합 p53 아데노바이러스에 의해 p53의 발현이 전달된다. 1. 단백질 마커; 2,3. 음성 대조군: 각각, SBN-1으로 감염시키지 않은 Hep-2 세포 및 H1299 세포; 4,5. 각각, SBN-1으로 감염시킨 Hep-2 세포 및 H1299 세포
도 6은 시험관내 인간 비대 반흔의 최초 배양된 섬유아세포이다. 연속상 섬유아세포가 규칙적으로 노듈형 또는 헬릭스형을 나타낸다. 섬유아세포는 스핀들형 또는 불규칙성이며, 광학 현미경에서 세포 외곽이 명백하다.
도 7은 S-P 염색 및 진공을 사용한 섬유아세포 세포의 특성화도이다. S-P 스테이닝 및 진공을 사용한 c 세포의 사이토림프가 브라운색이며, 핵은 블루색이다. 모든 연속상 세포는 위치 세포이기 때문에 섬유아세포이며 프로토콜라겐 III을 생성할 수 있다.
도 8은 시험관내 반흔 섬유아세포 세포에 대한 재조합 유전자의 사멸 효과의 현미경 사진이다. B, C, D는 재조합 아데노바이러스로 감염시킨 후 24h, 48h 및 72h에서 외상 섬유아세포의 구조 변화를 나타낸다. 세포의 부피가 증가하고, 스핀들형으로부터 다각형으로 변화되며, 사이토림프가 또한 증가하며, 핵분열이 감소하고, 해리 및 사태가 나타난다. 다만, 대조군 세포의 구조는 현저하게 변화가 없었다.
도 9는 시험관내 반흔 섬유아세포 세포에 대한 재조합 유전자의 사멸 효과의 전자 현미경 사진이다. 전송 전자 현미경(TEM)으로 얻은 9A, 9B, 9C는 재조합 약물 (MOI =200)에서 버블링 과정, 세포자가사멸 바디의 출현 및 세포자가사멸 캐스팅을 나타낸다. 도 9D는 콘드리오좀이 명백하게 증가되는 세포자가사멸의 다른 상황을 나타낸다.
도 10은 치료 전후 켈로이드 환자에 대한 재조합 유전자의 영향을 나타내는 사진을 포함한다. 치료 전후 켈로이드 환자에 대한 재조합 유전자의 영향을 나타내는 사진을 포함한다. 4주 동안의 유전자 요법 이후 외상의 크기가 현저하게 감소하였다.
실시양태의 상세한 설명
하기 실시양태는 본 발명의 추가의 설명이다. 본 발명의 실시는 이러한 실시양태로 제한되지 않는다.
실험 1:
도 1 및 도 2에 기재된 바와 같은 재조합 p53 아데노바이러스의 구성 및 시험.
1. 두 프라이머를 p53 cDNA의 공개된 전체 서열에 따라 고안하였다:
두 프라이머는 5' ATGGAGGAGCCGCAGTCAGATC 및 5' ATATCTGCA GAATTCCAGCAC였다. 링커 서열을 양 말단에 부착하였다. HeLa 세포 cDNA를 주형으로 사용하여 인간 p53 유전자를 PCR 증폭하였다. 실험 조건은 다음과 같았다: 제 1 주기에 대해, DNA를 4 분 동안 94 ℃에서 변성시키고, 1 분 동안 58 ℃에서 아닐링(annealing)한 다음, 2 분 동안 72 ℃에서 연장시켰다. 각각의 나머지 주기의 경우, DNA를 1 분 동안 94 ℃에서 변성시키고, 1 분 동안 58 ℃에서 아닐링한 다음, 2 분 동안 72 ℃에서 연장시켰다. 주기는 총 30 주기였다. 따라서, 다량의 p53 유전자 단편을 수득하 였다. 그 다음, 아가로오스 겔 전기영동을 사용하여 p53 유전자를 시험하였다. p53 유전자의 전체 서열을 겔로부터 회수하고, 정제하고, 제한 효소에 의해 절단하고, 동일한 효소에 의해 절단된 pUC19 벡터에 삽입하였다. 그 다음, 상기 단편을 시퀀싱하였다. 발현 섹션의 염기 서열을 예측된 아미노산 서열(젠뱅크 Acc XM_058834와 일치함)과 동일하게 시험하였다. 마지막으로, 상기 단편을 제한 효소에 의해 분절시키고, 재수집하였다.
2. LTR 및 PA 서열을 PCR 증폭시켰다. 그들의 프라이머는 각각 다음과 같았다:
5' TCTGACATGCGATGTCGACTCG，
5' CGGCAGTGACCCGGAAAGCAG
5' TCACAGAGTGCA TTGTGAGGG，
5' GCTCTAGCGTGGGGATCCC.
링커 서열을 5' 프라이머 및 3' 프라이머에 부착시켰다.
3. LTR 및 PA를 상기와 동일한 아닐링 조건 하에서 PCR 증폭시켰다. 증폭된 단편을 정제하고, 시퀀싱에 의해 시험하였다.
2. 아데노바이러스 E1 서열을 상기와 동일한 PCR 조건 하에서 별도로 PCR 증폭시켰다. Bam HI 및 Eco RI에 대한 효소 제한 부위를 양 말단 상에서 프라이머에 각각 연결하였다. 상기 단편을 증폭시킨 후 시험하였다.
4. 단계 1로부터의 단편 및 단계 2로부터의 두 단편을 각각 PCR 반응에 의해 연결시켰다. 실험 조건은 상기한 바와 같다. PCR 복제 생성물 LTR-p53-PA를 수득하 였다. 생성되는 서열을 시퀀싱에 의해 시험하였다.
5. 단계 3으로부터의 단편 및 단계 4로부터의 LTR-p53-PA를 T4 DNA 리가아제에 의해 연결하였다. 생성되는 서열은 p53 유전자 카세트였다.
6. 아데노바이러스의 양 말단으로부터의 역 말단 반복(Inverted terminal repeat; IRT) 서열을 상기와 동일한 실험 조건 하에서 PCR 증폭하였다. 시퀀싱에 의해 시험한 후, 생성되는 단편을 pUC18 벡터로 클로닝하였다. 따라서, 재조합 벡터 pGT-1을 수득하였다.
7. 대장균 BJ5183을 재조합 벡터 pGT-1 및 야생형(wild type) 아데노바이러스 5(ATCC-VR-5, 아데노바이러스 75, 역가: 10(6.75) TCID (50)/ml) DNA로 공동 형질감염시켰다. 그 다음, 4 ℃에서 1 분 동안 유지시킨 후, 형질감염된 세균에 42 ℃에서 50 초 동안 열 쇼크를 가하고, 4 ℃에서 1 분 동안 인큐베이션한 다음, 1 ml LB 배지와 합치고, 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 유전자 조작된 세균을 앰피실린을 함유하는 아가 배지에 스프레딩(spreading)하고, 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 단일 세포를 무균 이쑤시개에 의해 집고, LB 배지를 구비한 병에 넣고, 24 시간 동안 배양하였다. 플라스미드를 통상의 방법에 의해 추출하고, PacI에 의해 스크리닝하였다. 양성 클론은 pGT-2(Ad5의 전체 서열을 함유함)였다.
8. 대장균 BJ5183을 재조합 벡터 pGT-2 및 p53 유전자 카세트에 의해 공동 형질감염시켰다. 성장 조건, 스크리닝 및 특성화 방법은 앞서 기재하였다. 양성 클론은 아데노바이러스 전체 유전자 서열 및 삽입된 p53 발현 카세트를 함유하는 pGT-3이었다. pUC18로부터 유래된 벡터 서열을 클론이 PacI에 의해 선형화된 후 제 거하였다.
9. 양성 선형 플라스미드를 CsCl에 의해 정제한 다음, CaCl2를 사용하여 293 세포를 형질감염시키는 데 사용하였다. 세포를 7 일 후 수집하였다. 세포를 1000 rpm 15 분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하였다. 세포를 37 ℃-80 ℃에서 3 회 용균시켰다. 이를 다시 4000 rpm에서 30 분 동안 원심분리하였다. 침전물을 제거하였다. 상청액을 또다시 감염시켜 바이러스를 증폭시키고, 앞서 기재한 것과 동일한 방법으로 용균시켰다. 생성되는 상청액을 CsCl을 사용하여, 60000 rpm 4 ℃에서 16 시간 동안 밀도 구배 원심분리시켰다. 재조합 아데노바이러스의 밴드를 No. 7 바늘에 의해 추출하였다. DNA 단편을 N1H 완충제와 함께 첨가하고, 4 ℃에서 4 시간 동안 스펙트라(Spectra) MW6000 투석 백에서 투석하였다. DNA 용액을 0.25 μm 필터를 통과시킴으로써 멸균시켰다. 그 다음, DNA 용액을 패킹하고, -80 ℃에서 저장하였다. 생성되는 생성물의 일부를 프라그 시험법(plaque assay) 및 바이러스 역가 테스트에 사용하였다.
10. 재조합 아데노바이러스에 대한 구조 안정성 테스트. 바이러스 게놈 DNA를 수 세대 생식 후 수득하였다. 5' CCACGACGGTGACACGCTTC 및 5' CAAGCAAGGGT TCAAAGAC인 p53 양 말단으로부터의 프라이머를 사용하여 DNA 단편을 PCR 증폭시켰다. 아가로오스 겔 전기영동의 결과를 도 3에 나타낸다. 재조합 아데노바이러스의 양측에서의 아데노바이러스 아암을 프라이머: 5' TTT CTC AGG TGT TTT CCG C 및 5' CAT CGT ACC TCA GCA CCT TC로서 고안하였다. PCR 결과를 도 4에 나타내었다. 상기 결과는 많은 세대의 생식 후에도 재조합 p53 아데노바이러스의 구조가 안정하다는 것을 시사하였다.
11. Hep-2 및 H1299 세포에서의 p53 유전자 발현 시험. 재조합 아데노바이러스에 의해 형질감염된 후 36 시간 경과 후, Hep-2 및 H1299 세포를 통상의 방법에 의해 용균시켰다. P53 단백질 특이적 항체를 사용한 웨스턴 블롯의 결과를 도 5에 나타내었다.
실험 2:
섬유아세포 세포에 대한 재조합 아데노바이러스의 사멸 효과:
반흔 섬유아세포 세포의 시험관내 배양(도 6 참조): 반흔 피부를 수술로부터 수득하고, 각각 무균 조건에서 0.5-1 cm3의 크기를 갖는 작은 편으로 절단하였다. 그 다음, 즉시 피부 편을 1000 U/ml 앰피실린 및 스트렙토마이신을 갖는 배양 용액에 넣었다. 조직을 PBS(앰피실린 및 스트렙토마이신 함유)로 2 회 세척하여 지방 및 결합 조직을 제거하였다. 그 다음, 조직이 오일을 함유하지 않고 투명해질 때까지 D-Hank 용액으로 또다시 수 회 세척하였다. 다음으로, 각 편이 1 mm3의 크기가 될 때까지 피부 편을 또다시 절단하였다. 몇 방울의 혈청을 조직에 가하고, 편을 배양 병의 벽에 스프레딩하였다. 그 다음, 병을 조직을 갖는 면이 위를 향하도록 돌리고, 10 % FBS를 갖는 DMEM 배양 용액을 첨가하였다(주의: 조직 및 용액을 분리시켰음). 그 다음, 병을 37 ℃ 및 5 % CO2를 갖는 오븐에 놓고, 조직을 갖는 면을 위로 향하게 하였다. 6-8 시간 경과 후, 병을 온화하게 돌렸다. 그 다음, 병을 3-4 일 동안 두었다. 그 후, 용액을 3-4 일마다 바꾸었다. 새로운 세포는 10 일 후에 조직 편 주위에서 성장하고, 세포 군집이 출현하였다. 세포는 약 1 개월 후에 전체 병을 덮고, 단일 층 세포를 형성하였다.
S-P 염색 및 진공 방법을 사용한 세포 유형 특성화
샘플 제조: 세포를 트립신을 사용하여 분해시키고, 10000 세포/ml의 농도를 갖는 세포 현탁액으로 만들었다. 18×18 mm의 커버 슬립을 55 mm의 크기를 갖는 배지 디쉬에 놓았다. 두 방울의 세포 현탁액을 각 커버 슬립(cover slip)에 놓았다. 그리고, 커버 슬립을 CO2를 갖는 오븐에 6-8 시간 동안 둔 다음, PBS로 완전히 3 회 세척하였다. 다음으로, 커버 슬립을 순수 아세톤 중에 두고, 실온에서 15 분 동안 고정시키고, PBS로 3 회 세척하였다. 진공에서 S-P를 사용한 면역화학적 세포 염색(도 7 참조): 커버 슬립을 슬라이드의 상부에 세포 측이 위로 향하게 두었다. 50 μl의 마우스 항-인간(anti-human)을 각각의 슬라이드에 가하였다. 동일한 양의 PBS를 음성 대조군에 첨가하였다. 슬라이드를 66.7 kPa를 갖는 진공 오븐에 10 분 동안 두고, 또다시 PBS로 3 회 세척하였다. 각 슬라이드에 50 μl의 스트렙토마이신 바이오틴 단백질-페록시다아제 용액을 가하고, 진공 오븐에서 10 분 동안 둔 다음, PBS로 3 회 세척하고, 헤마톡실린으로 1 분 동안 재염색하고, 수 초 동안 1 % 알코올을 가하고, 알코올을 사용하여 탈수시키고, 디메틸벤젠을 가하고, 검으로 밀봉하고, 마지막으로 현미경 하에서 관찰하였다.
현미경에서 세포 변화 관찰(도 8 참조): 5 × 105 개의 반흔 섬유아세포 세포를 25 cm2 병에 접종시키고, 24 시간 동안 배양하였다. 그 다음, 배양 용액을 바 꾸고, 세포를 200MOI의 재조합 아데노바이러스로 감염시켰다. 24 시간, 48 시간 및 72 시간 후에 세포의 배위 변화를 현미경 하에서 관찰하였다.
전자 현미경에서의 세포 구조의 변화(도 9 참조): 5 × 105 개의 반흔 섬유아세포 세포를 25 cm2 병에 접종시키고, 24 시간 동안 배양하였다. 그 다음, 배양 용액을 바꾸고, 세포를 200MOI의 재조합 아데노바이러스로 48 시간 동안 감염시켰다. 세포를 트립신에 의해 분해시키고, 세포 현탁액을 아가로오스 튜브에서 수집하였다. 그 다음, 튜브를 2000 r/min에서 15 분 동안 원심분리하여 세포 덩어리를 형성시켰다. 그 다음, 세포를 2 %의 글루타르알데히드 및 1 %의 오스뮴 테트록시드(osmium tetroxide)를 사용하여 고정시켰다. 세포 덩어리를 아가에서 랩핑(wrapping)한 다음, 탈수시키고, 투과시키고, 에폭시 수지를 사용하여 랩핑하고, 얇게 슬라이싱(thin-slicing)하고, 염색시키고, 관찰하고, 투과 전자 현미경 하에서 사진을 찍었다.
실험 3:
반흔 유전자 치료법의 임상 연구에서 켈로이드에 대한 본 발명의 재조합 아데노바이러스의 치료 결과.
도 10A 및 10B에 도시한 바와 같이, 여성 켈로이드 환자는 여드름 후 왼쪽 가슴으로부터 잘라낸 반흔을 가졌다. 그러나, 신생물성 반흔은 수술 후 재생되었다. 국소 재생은 3 년 내에 발생하였다. 스테로이드 및 다른 통상의 치료는 어떠한 효과도 나타내지 않았다. 가슴의 반흔의 부피는 2×1×1 cm3이었다(도 10A 참조). 반흔의 크기는 4 주간 유전자 치료 후 현저하게 감소하였다. 자가 한정성(self-limited) 열 이외의 다른 뚜렷한 부작용은 나타나지 않았다. 임상 실험에 의해 켈로이드에 대한 재조합 아데노바이러스는 안전한 것으로 판명되었다.
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Claims (9)

  1. 아데노바이러스 벡터 및 p53 유전자 발현 카세트를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 포함하는, 임의의 종류의 반흔(scar) 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 재조합체의 아데노바이러스 벡터 및 p53 유전자 발현 카세트가 프로모터-p53cDNA-폴리 아데노신으로 구성된 특이적 서열인 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 유전자 발현 카세트의 상류(upstream)가 임의의 진핵 세포 프로모터, 원핵 세포 프로모터 또는 바이러스 프로모터이고, 하류(downstream)가 임의의 진핵 유전자 폴리 아데노신 잔기(폴리 A 테일)인 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 재조합체는
    1) 원핵 세포에서 아데노바이러스 및 플라스미드 pGT-1(아데노바이러스의 양 말단 상에 두 개의 역 말단 반복을 함유)의 상동성 재조합에 의해 재조합 pGT-2를 얻고,
    2) 원핵 세포에서 상기 pGT-2 및 인공 서열 "아데노바이러스의 우측 아암/프로모터-p53cDNA-폴리 A/아데노바이러스의 좌측 아암"의 상동성 재조합에 의해 재조합 pGT-3을 얻고, 및
    3) 엔도뉴클레아제(endonuclease) PacI을 사용하여 원핵 서열을 제거함으로써 재조합 p53 아데노바이러스를 얻는 것
    을 포함하는, 상동성 재조합에 의해 원핵 세포에서 얻는 것인 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 원핵 세포가 대장균(E. coli)인 약학 조성물.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 반흔이 병리학적 반흔인 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 병리학적 반흔이 켈로이드인 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 주사액인 약학 조성물.
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