CN1966683B - 表达新型肿瘤抑制基因p53的重组腺病毒 - Google Patents

Abstract

本发明为一种表达新型肿瘤抑制基因p53的重组腺病毒的表达结构，其主要特征为1)野生型P53抑癌基因的第72位氨基酸由脯氨酸突变成为精氨酸，其他氨基酸组成及其排列顺序不变；2)该P53抑癌基因在其N-末端以内切酶Nhel和C-末端以内切酶BamH1片段拼接于穿梭质粒pDC315超强启动子mMCV的下游；和3)重组的腺病毒载体为以Ad35纤突结取代Ad5型腺病毒的纤突结的复制缺陷型腺病毒载体。该新型p53抑癌基因腺病毒具有感染力更强、感染组织/细胞谱更广、表达新型p53抑癌基因更强、其产物具有更强细胞凋亡生物功能。

Description

表达新型肿瘤抑制基因p53的重组腺病毒

技术领域

本发明涉及人新型肿瘤抑制基因p53的重组腺病毒备制方法，其备制的重组腺病毒表达一种具有野生型p53的细胞凋亡功能更强的新型肿瘤抑制基因p53蛋白，用于多种癌症的治疗。因此其所在的技术领域与生命医药和生物技术有关。

背景技术

P53基因是肿瘤抑制基因家族中的主要成员，是目前发现与人类肿瘤发生的相关性最高的基因。野生型p53基因在维持细胞正常生长、抑制恶性肿瘤细胞增生中起重要作用。环境中各种因素，如紫外线、放射性和化学物质以及机体自身产生的某些代谢产物等都可导致细胞DNA损伤。在正常生理情况下，这些细胞DNA能在某些基因产物作用下进行修复或被降解清除，防止其遗传下去而保持正常DNA的复制，进而保护细胞的正常功能运作。否则损伤的DNA会继续复制、随染色体分离，导致染色体组中出现大量的DNA突变和染色体畸变。这些突变进一步积聚将使正常细胞最终恶化，发展成癌细胞。

现有的大量的研究证明野生型p53蛋白质在细胞内发挥着“基因卫士”的生物功能作用，监视着细胞基因组的完整性和稳定性。在细胞DNA受到损伤时，p53迅速活化p21基因的转录，抑制多种原癌基因，如c-Fos、c-Jun、Rb和其他相关基因如IL-6、PCNA的转录，使细胞分裂停滞在G1期节点。同时，野生型p53蛋白质与复制因子(RPA)相互作用，参与DNA的复制和修复。更重要的是，野生型p53蛋白质能启动细胞程序性死亡过程，诱导细胞自杀，防止具有恶变倾向的细胞进一步分裂、增殖，从而防止癌症的发生。

p53基因突变是人类恶性肿瘤中最常见的遗传变异。据统计，大约有50％的人类肿瘤发生与p53基因突变有关，有30％-40％的乳腺癌、50％的肺癌和70％的结肠癌存在p53基因突变；几乎100％的小细胞性肺癌有p53基因突变。此外，动物实验表明，表达异常p53基因蛋白的小鼠100％的发生肿瘤。

由于p53基因如此重要的生物学功能及其与人类肿瘤发生和恶化程度有密切关系，自八十年代以来，科技家就开始了应用外源野生型p53的生物学功能，启动p53基因缺陷型肿瘤细胞的细胞程序性凋亡过程，诱导肿瘤细胞自杀死亡的实验研究和临床肿瘤基因治疗研究。现在众多的研究报告以及临床研究报告结果证明，野生型p53基因治疗安全、有效，而且毒副作用小。

临床研究结果表明，野生型p53基因对人头颈肿瘤、脑胶质细胞瘤、膀胱癌、卵巢癌、黑色素瘤和肺癌有较好疗效。同时研究还表明野生型p53基因具有抑制肿瘤组织内血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的作用，因而减少肿瘤组织内血管的形成，减少肿瘤组织的血供，起着进一步促进肿瘤细胞死亡的作用。

野生型p53基因的某些氨基酸位点在自然状态下存在多态性，例如第47位点存在脯氨酸/丝氨酸多态性.研究发现野生型p53此第47位点为脯氨酸，但在不足5％的非洲籍美国人为丝氨酸.已知47位点脯氨酸介导的激酶p38MAPK使邻近的46位点丝氨酸磷酸化可大大增加诱导细胞凋亡的能力；而47位点为丝氨酸的变异，则使p53诱导细胞凋亡的能力下降2-5倍以上.同样，野生型p53基因的72位点存在常见的脯氨酸(P72，下同/精氨酸(R72，下同)多态性，这种多态性对于野生型p53基因的细胞凋亡诱导功能上有很大的意义.P53基因为R72型的，其细胞凋亡能力比P72型的强2-15倍以上(Murphy M.et al：2003，3(3)：357-365，Nat.Genetics)，其机理被认为至少是由于R72型p53基因增加了在线粒体的聚集，能直接与促细胞凋亡蛋白BAK相互作用，破坏线粒体，使细胞缺乏能量而导致细胞凋亡有关。通过对p53基因的第72密码子多态变异体功能研究导致了检测这种多态性对于人类癌危险性和发展影响的许多研究。有些研究表明第p53基因为P72型的，因其细胞凋亡能力较低，与增加的患癌危险性相关；另一报告表明在易于患结肠癌的家族中，p53基因为P72纯合子的个体比为R72纯合子个体，其患癌的发病年龄较早，且倾向于多发肿瘤。上述研究结果为使用第72位点为精氨酸的野生型p53对肿瘤进行更有效的基因治疗奠定了基础。

毫无疑问，抗癌基因治疗的成败取决于整个表达结构三大元件的最佳组合。第一个元件为进入机体细胞内的腺病毒载体，要求安全、高效；第二个元件为治疗基因的有效性；第三个元件为驱动抗癌基因表达的启动子的强弱和组织/细胞特异性。

目前，将野生型p53基因导入体内的载体多为复制缺陷型腺病毒载体。这种载体具有感染能力强，靶细胞可以是处于分裂期或是非分裂期、转染细胞后腺病毒载体基因不整合进入人类基因组，可大量生产高滴定度腺病毒及其瞬时表达等特点，故复制缺陷型腺病毒载体是目前在肿瘤基因治疗中的首选载体，在肿瘤基因治疗中有着广阔的应用前景。但同时由于这种病毒载体自身的原因，如因其感染细胞须与细胞上的受体结合才能起作用，故其感染与细胞上受体数量呈正比。因此对某些组织细胞而言，由于受体数量少，尤其是肿瘤细胞表面CAR受体偏少，Ad5对它们的感染有限，故这种病毒难以感染并进入细胞内，有效发挥其携带基因的治疗作用。为了克服这种载体的缺陷，近年研究人员通过基因突变技术，使血清型5型腺病毒(Ad5)的纤突结基因突变或者利用血清Ad35型的纤突结(fiber knobs)替代Ad5型腺病毒的纤突结，使感染细胞的范围更广、感染效率更高，对各种造血细胞和肿瘤细胞的感染效率高于普通Ad5、外源基因表达量更多，包装系统高效且稳定。而且，使用的腺病毒数量呈至少一个数量级减少。因此，这应是新一代复制缺陷型的腺病毒载体。

重组腺病毒驱动治疗基因表达的启动子可以有多种来源的启动子。目前使用较多的是mCMV启动子，这是一种超强启动子，属一种突变型CMV启动子，比hCMV启动子的活性强若干倍，但没有组织/细胞的特异性，对某些毒性作用较大的治疗基因不大适合。因此，研究人员发展了一些组织/细胞特异性启动子，如与原发性肝癌有关的胎儿甲种球蛋白基因的启动子。此启动子仅在表达胎儿甲种球蛋白的原发性肝癌细胞内驱动治疗基因的表达，属于一种靶向性基因治疗。不过目前证明这种启动子活性较低，有待进一步研究。但无论如何，靶向性基因治疗是目前和将来癌症治疗研究的一个非常重要的发展方向。

综上所述，构建以新一代复制缺陷型腺病毒为表达载体、利用超强CMV启动子驱动表达R72型的肿瘤抑制基因p53的表达系统，为临床治疗恶性肿瘤提供一种新的、抗癌作用更强的肿瘤基因治疗的药物，将拥有巨大市场前景的、产生诱人的社会、经济效益。

发明内容

本发明的目的是以细胞凋亡功能更强的R72型肿瘤抑制基因p53为治疗基因，以新一代复制缺陷型腺病毒载体和超强启动子mMCV为调控元件，构建新一代抗癌作用更强的肿瘤基因p53表达系统，使其成为临床恶性肿瘤的基因治疗的新一代产品。本发明的表达新型抑癌基因p53腺病毒表达结构，其主要特征为1).野生型p53抑癌基因的第72位氨基酸由脯氨酸突变为精氨酸，其他氨基酸组成及其排列顺序不变；2).该p53抑癌基因在其N-末端以内切酶Nhe1和C-末端以内切酶BamH1片段拼接于穿梭质粒pDC315中超强启动子mMCV的下游；3).重组的腺病毒载体为以Ad35纤突结取代Ad5型的纤突结的复制缺陷型腺病毒载体；4).该新型p53抑癌基因腺病毒表达系统具有感染力强、感染组织/细胞谱广、新型p53抑癌基因表达强、具有更强细胞凋亡生物功能。

附图说明

附图1：人野生型肿瘤抑制因子p53基因的PCR产物：应用人工合成的特异性引物，以人正常组织cDNA为模板，进行PCR反应，其反应产物在1.5％琼脂糖电泳分离；纯化后进行克隆。第一泳道和第二泳道为PCR产物、第三泳道为φ174/BsuR1 DNA分子量标记物.PCR产物约为1200碱基对。

附图2：肿瘤抑制因子p53突变型R72的内切酶图谱：R72突变型肿瘤抑制因子p53在突变位点形成新的核苷酸内切酶Small位点。用内切酶Small分别消化R72突变型和野生型肿瘤抑制因子p53后，R72突变型产生二个DNA片断，野生型仅产生一个DNA片断。图示电泳第一泳道为1anda/Hind IIIDNA分子量标记物；第二泳道为1Kb DNA分子量标记物；第三泳道为野生型肿瘤抑制因子p53；第四泳道R72突变型肿瘤抑制因子p53。

附图3：表达R72型肿瘤抑制因子p53重组腺病毒的工艺流程图：叙述了从正常组织提取总核糖核酸、互补脱氧核糖核酸合成、人肿瘤抑制因子p53基因的克隆和突变、真核细胞表达质粒构建、腺病毒突变型人抑制因子p53穿梭质粒构建以及表达R72型肿瘤抑制因子p53重组腺病毒的整个工艺过程。

附图4：表达R72型肿瘤抑制因子p53重组腺病毒结构图：结构图中两端分别为腺病毒的左臂和右臂，表达盒由超强CMV启动子、R72型肿瘤抑制因子p53和SV40多聚腺嘌呤组成。

具体实施方式

实施例一：R72型肿瘤抑制因子p53的形成：其方法是采用基因突变技术，使野生型第72位脯氨酸密码子ccc(P72)突变成精氨酸密码子cgg(R72)，在突变区形成新的核苷酸内切酶Small位点。

1).人野生型肿瘤抑制因子p53基因的5’-末端的Nco1至第72位密码子片段扩增：

以人野生型P72肿瘤抑制因子p53基因的5’-末端的Nco1至突变区片段作为模板，用人工合成的引物进行PCR扩增。PCR引物设计如下：

引物1：

N-末端：5’-gccttccgggtcactg

aggagccg-3’

30mer                                    Nco1

引物2：ccg为精氨酸密码子

N-末端：5’-gaatgccagaggctgctccc

gtggcccctgca-3’

35mer

PCR扩增产物经tailing反应，加上腺嘌呤后，连接到T-easy载体，并转化细菌后，扩增，培养、抽提、纯化，经DNA测序确定。

2).人野生型肿瘤抑制因子p53基因第72密码子区至C-末端Nco1片断扩增：

以上述的片断区DNA为模板，用人工合成的下列引物进行PCR扩增。

PCR引物设计如下：

引物3：ccg为精氨酸密码子

N-末端：5’-agggccacgggagcagcctctggcattc-3’

32mer

引物4：

N-末端：5’-gtagatggcgcggacgcgggtg-3’

28mer                    Nco1

将PCR扩增的二个产物按1)的方法连接到T-easy载体，经DNA测序确定正确无误。

3).上述二个PCR片断产物的拼接，产生Nco1-Nco1片断：：

将上述1)和2)中含上述DNA片段的T-easy载体质粒DNA分别用Nco1和Small完全酶切，纯化后，再与经Nco1酶切的野生型p53基因cDNA进行拼接。转化细菌、质粒抽提和经酶切检测拼接方向正确后，构建成R72型的野生型p53基因表达质粒pCMV-neo-p53。

实施例二：构建含R72型p53抑癌基因的腺病毒穿梭质粒

1).PCR扩增R72型p53全长DNA片断：以R72型的野生型p53基因表达质粒pCMV-neo-p53为模板，用人工合成的引物进行PCR反应。

引物设计如下：

引物5(在N-末端引入内切酶位点Nhe1)：

N-末端：5’-tagctagctcactgccatggaggagccg-3’

28mer        Nhe1

引物6(在N-末端引入内切酶位点BamH1)：

N-末端：5’-ggcggatcctgtcagtgtgagtgagg-3’

26mer            BamH1

PCR扩增产物经tailing加上腺嘌呤后，连接到T-easy载体；转化细菌后，扩增、抽提、纯化，经DNA测序确定。

2).含R72抑癌基因p53的腺病毒穿梭质粒的构建

腺病毒穿梭质粒pDC315含有超强CMV启动子和病毒SV40的聚腺嘌呤核苷酸.为了构建含R72抑癌基因p53的腺病毒穿梭质粒，分别以内切酶Nhe1和BamH1消化上述1)的T-easy质粒DNA和腺病毒穿梭质粒pDC315.经琼脂糖电泳分离、纯化后，将含R72抑癌基因p53和腺病毒穿梭质粒的酶切片段进行拼接，转化感受态菌种，培养扩增，提取重组质粒DNA.最后再经酶切消化和DNA测序证实.

实施例三表达R72型抑癌基因p53的重组腺病毒

1).制备线性化含R72型的重组梭质粒pDC315-p53：取适量质粒DNA，经核苷酸内切酶LoxP消化、电泳分离、纯化LoxP酶切线性化质粒DNA，备用；

2).培养胚胎肾293细胞，用预混的腺病毒载体和线性化的穿梭质粒pDC315-p53共转染表达腺病毒E1区基因的胚胎肾293细胞。

3).筛选阳性克隆，分离、纯化，并鉴定重组腺病毒。

序列表

Individual Applicant

--------------------

Street：广州国际企业孵化器A区610房

City：广州市

State：广东省

Country：中国

PostalCode：510633

PhoneNumber：020-32290208

FaxNumber：020-38491559

EmailAddress：shangwu_w@yahoo.com

<110>LastName：王

<110>FirstName：尚武

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Application Project

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tcaggaaaca ttttcagacc tatggaaact acttcctgaa aacaacgttc tgtccccctt 120

gccgtcccaa gcaatggatg atttgatgct gtccccggac gatattgaac aatggttcac 180

tgaagaccca ggtccagatg aagctcccag aatgccagag gctgctcccc gggtggcccc 240

tgcaccagca gctcctacac cggcggcccc tgcaccagcc ccctcctggc ccctgtcatc 300

ttctgtccct tcccagaaaa cctaccaggg cagctacggt ttccgtctgg gcttcttgca 360

ttctgggaca gccaagtctg tgacttgcac gtactcccct gccctcaaca agatgttttg  420

ccaactggcc aagacctgcc ctgtgcagct gtgggttgat tccacacccc cgcccggcac  480

ccgcgtccgc gccatggcca tctacaagca gtcacagcac atgacggagg ttgtgaggcg  540

ctgcccccac catgagcgct gctcagatag cgatggtctg gcccctcctc agcatcttat  600

ccgagtggaa ggaaatttgc gtgtggagta tttggatgac agaaacactt ttcgacatag  660

tgtggtggtg ccctatgagc cgcctgaggt tggctctgac tgtaccacca tccactacaa  720

ctacatgtgt aacagttcct gcatgggcgg catgaaccgg aggcccatcc tcaccatcat  780

cacactggaa gactccagtg gtaatctact gggacggaac agctttgagg tgcatgtttg  840

tgcctgtcct gggagagacc ggcgcacaga ggaagagaat ctccgcaaga aaggggagcc  900

tcaccacgag ctgcccccag ggagcactaa gcgagcactg cccaacaaca ccagctcctc  960

tccccagcca aagaagaaac cactggatgg agaatatttc acccttcaga tccgtgggcg  1020

tgagcgcttc gagatgttcc gagagctgaa tgaggccttg gaactcaagg atgcccaggc  1080

tgggaaggag ccagggggga gcagggctca ctccagccac ctgaagtcca aaaagggtca  1140

gtctacctcc cgccataaaa aactcatgtt caagacagaa gggcctgact cagactgaca  1200

ggatccgcc                                                          1209

<212>PRT

<213>human p53人工序列

<400>2

MetGluGluProGlnSerAspProSerValGluProProLeuSerGlnGluThrPheSer

1           5              10              15            20

AspLeuTrpLysLeuLeuProGluAsnAsnValLeuSerProLeuProSerGlnAlaMet

            25             30             35             40

AspAspLeuMetLeuSerProAspAspIleGluGlnTrpPheThrGluAspProGlyPro

            45             50             55             60

AspGluAlaProArgMetProGluAlaAlaProArgValAlaProAlaProAlaAlaPro

            65             70             75             80

ThrProAlaAlaProAlaProAlaProSerTrpProLeuSerSerSerValProSerGln

            85             90             95             100

LysThrTyrGlnGlySerTyrGlyPheArgLeuGlyPheLeuHisSerGlyThrAlaLys

            105            110            115            120

SerValThrCysThrTyrSerProAlaLeuAsnLysMetPheCysGlnLeuAlaLysThr

            125            130            135            140

CysProValGlnLeuTrpValAspSerThrProProProGlyThrArgValArgAlaMet

            145            150            155            160

AlaIleTyrLysGlnSerGlnHisMetThrGluValValArgArgCysProHisHisGlu

            165            170            175            180

ArgCysSerAspSerAspGlyLeuAlaProProGlnHisLeuIleArgValGluGlyAsn

            185            190            195            200

LeuArgValGluTyrLeuAspAspArgAsnThrPheArgHisSerValValValProTyr

            205            210            215            220

GluProProGluValGlySerAspCysThrThrIleHisTyrAsnTyrMetCysAsnSer

            225            230            235            240

SerCysMetGlyGlyMetAsnArgArgProIleLeuThrIleIleThrLeuGluAspSer

            245            250            255            260

SerGlyAsnLeuLeuGlyArgAsnSerPheGluValHisValCysAlaCysProGlyArg

            265            270            275            280

AspArgArgThrGluGluGluAsnLeuArgLysLysGlyGluProHisHisGluLeuPro

            285            290            295            300

ProGlySerThrLysArgAlaLeuProAsnAsnThrSerSerSerProGlnProLysLys

            305            310            315            320

LysProLeuAspGlyGluTyrPheThrLeuGlnIleArgGlyArgGluArgPheGluMet

            325            330            335            340

PheArgGluLeuAsnGluAlaLeuGluLeuLysAspAlaGlnAlaGlyLysGluProGly

            345            350            355            360

GlySerArgAlaHisSerSerHisLeuLysSerLysLysGlyGlnSerThrSerArgHis

            365            370            375            380

LysLysLeuMetPheLysThrGluGlyProAspSerAspTer

            385            390

Claims (2)

1.一种表达新型肿瘤抑制基因p53的重组腺病毒，其主要特征为：

a、所述新型肿瘤抑制基因p53所编码蛋白的特征是将人野生型p53蛋白的第72位氨基酸由脯氨酸突变为精氨酸，其他氨基酸组成及其排列顺序不变；

b、所述新型肿瘤抑制基因p53以其N-末端拼接于mCMV启动子的下游和以其C-末端拼接于SV40多聚腺嘌呤的上游；

c、所述重组腺病毒载体是以Ad35纤突结取代Ad5型腺病毒纤突结的复制缺陷型腺病毒载体。

2.一种用于治疗多种癌症疾病的药物，其特征在于由权利要求1所述的重组腺病毒以及药学上可接受的载体或赋形剂组成。

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