CN100390292C

CN100390292C - 甲胎蛋白表达细胞的腺病毒载体及其使用方法

Info

Publication number: CN100390292C
Application number: CNB988043890A
Authority: CN
Inventors: A·S·里特尔; H·G·兰帕斯基; D·R·汉德森; E·R·舒尔
Original assignee: Cell Genesys Inc
Current assignee: Cell Genesys Inc
Priority date: 1997-03-03
Filing date: 1998-03-03
Publication date: 2008-05-28
Anticipated expiration: 2018-03-03
Also published as: CN1252840A; WO1998039465A2; US6585968B2; DE69839071T2; US20020164799A1; AU6679698A; CA2282706A1; DE69839071D1; US6254862B1; AU745560B2; WO1998039465A3; EP0972063A2; ATE385256T1; JP2002516568A; CA2282706C; KR20000075924A; EP0972063B1

Abstract

本发明提供了其复制特异于表达甲胎蛋白(AFP)之细胞的腺病毒载体及其使用方法。通过提供取决于AFP表达的转录起始调节，病毒复制被局限于表达AFP的靶细胞，尤其是肝癌细胞。腺病毒载体可被用于检测和监测样品中产生AFP之细胞的存在以及选择性地杀死产生AFP的恶性细胞。

Description

甲胎蛋白表达细胞的腺病毒载体及其使用方法

交叉参考的相关申请

本申请要求1997年3月3日提交的美国临时申请流水号60/039,597的权利。

技术领域

本发明涉及使用腺病毒载体转染细胞，更具体地涉及腺病毒载体在甲胎蛋白表达细胞、尤其是肝癌细胞中的细胞特异性复制。

发明背景

尽管进行了深入的医学研究并取得很多进展，癌症仍是美国第二大致死疾病。肝细胞癌(HCC或恶性肝癌)是世界上最常见的癌症之一，在亚洲尤其成问题。

肝细胞癌患者的治疗前景黯淡，即使在疗法和肝脏移植的可用性方面有所改善，但通过切除或移植除去肿瘤仅能治愈极少数患者。对大多数患者而言，最新的治疗仍不能令人满意，预后状况很差。

开发特异性更强的靶向形式的癌症疗法特别令人感兴趣，特别是对难以成功治愈的癌症、如肝癌更是如此。与导致相对非特异性和经常导致严重毒性的常规癌症疗法形成对照的是，特异性更强的疗法尝试选择性地抑制或杀死恶性细胞而使健康细胞完好无损。

如肝癌之类癌症的一个可能疗法是基因疗法，其中将所需基因导入恶性细胞。所需基因可编码一种蛋白质，经另一种化合物处理，该蛋白质可转变为毒性物质，或可编码能将前药转变为药物的酶。例如，导入编码胸苷激酶的单纯疱疹病毒基因(HSV-tk)使得细胞对丙氧鸟苷(GCV)条件性地敏感。或者，所需基因可编码直接有毒的化合物，如白喉毒素(DT)。为了使这些治疗变得特异于癌细胞，所需基因可处于在癌细胞中被特异性(即优先)激活的转录起始区域的控制之下。使用细胞特异性增强子和/或启动子可得到细胞或组织特异性表达，例见Huber等(1995)Adv.Drug Delivery Reviews 17：279-292。

已研制了大量病毒和非病毒(如脂质体)载体用于转移这些基因。在病毒中，已建议使用逆转录病毒，单纯疱疹病毒，腺相关病毒，仙台病毒，痘病毒和腺病毒进行基因转移，最新的研究致力于逆转录病毒或腺病毒载体。腺病毒是最易于生产和纯化的病毒，而逆转录病毒是不稳定的，难以生产和纯化，可整合至宿主基因组，有产生危险突变的可能性。另外，腺病毒具有实现高效转导的优点，并且不需要为了有效转导细胞而增殖细胞。有关腺病毒和腺病毒载体系统进展的一般背景文献可参见Graham等(1973)，病毒学，52：456-467；Takiff等(1981)柳叶刀，11：832-834；Berkner等(1983)核酸研究，11：6003-6020；Graham(1984)EMBO J 3：2917-2922；Bett等(1993)病毒学杂志，67：5911-5921；和Bett等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：8802-8806。

当用作基因转移载体时，腺病毒载体经常被设计为复制缺损型，因此被有意改造为不能在所需靶细胞中复制。在这些载体中，早期的腺病毒基因产物E1A和/或E1B被缺失，而由包装细胞系293反式提供，Graham等(1987)，病毒遗传学杂志(J.Genetic Virology)，36：59-72；Graham(1977)，病毒遗传学杂志，68：937-940。一般将需转导的基因插入腺病毒基因组中的E1A和E1B区域，Bett等(1994)。作为有效转导基因之载体的复制缺损型腺病毒载体被特别地描述于Stratford-Perricaudet(1990)，人体基因疗法，1：241-256；Rosenfeld(1991)科学252：431-434；Wang等(1991)实验医学生物学进展，309：61-66；Jaffe等(1992)Nat.Gen，1：372-378；Quantin等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：2581-2584；Rosenfeld等(1992)细胞68：143-155；Stratford-Perricaudet等(1992)J.Clin.Invest.90：626-630；Le Gal Le Salle等(1993)科学259：988-990；Mastrangeli等(1993)J.Clin.Invest.91：225-234；Ragot等(1993)自然361：647-650；Hayaski等(1994)生物化学杂志，269：23872-23875；Bett等(1994)。

实际上，基因疗法所用腺病毒载体的开发全部致力于将腺病毒仅用作导入所需基因的载体，而未将腺病毒自身用作效应物。腺病毒的复制被看成是不合乎需要的结果，这多半是由于宿主会产生免疫应答。在通过复制缺损型腺病毒治疗癌症时，宿主免疫应答在两个水平上限制重复给药的持续时间。首先，腺病毒送递载体自身的衣壳蛋白是免疫原性的。第二，病毒晚期基因经常在被转导的细胞中表达，引发细胞免疫。因此，基因转移载体和转移载体之病毒基因产物的免疫原性以及基因表达的瞬时特性限制了重复施用细胞因子、肿瘤抑制基因、核酶、自杀基因或可将前药转变为活性药物的基因的能力。需要在针对载体的特异性免疫学反应阻止进一步治疗之前能以最少次数的给药而基本上消除所有癌细胞的载体构建体。

一个完全独立的研究领域属于组织特异性调节蛋白的描述。甲胎蛋白(AFP)是癌胚蛋白，其表达主要局限于内胚层来源的发育中组织(卵黄襄，胎儿肝脏和胃肠)，但其表达水平因组织和发育阶段的不同而大不相同。AFP具有临床意义，因为大多数肝癌患者的AFP血清浓度升高，在晚期患者体内发现高水平的AFP。患者的血清AFP水平似乎受肝细胞癌而不是周围正常肝脏中AFP表达的调节。因此，AFP基因似乎被调节为肝癌细胞特异性表达。

人AFP基因的5’上游侧翼序列显示出具有细胞特异性增强子活性，Watanabe等(1987)，生物化学杂志，262：4812-4818；也见Sakai等(1985)生物化学杂志，260：5055-5060(描述了人AFP基因的克隆)，加拿大专利申请2,134,994。增强子是顺式作用的转录调节元件，已知它在确定基因表达的细胞特异性方面起重要作用。增强子的典型特征是能够长距离地和相对不依赖其各个基因的相关定向和位置地增强转录。启动子紧接转录起始位点的5’(上游)，一般包括富含AT、被称为TATA盒的区域。

已描述了几种使用细胞特异性AFP增强子治疗肝癌的基因疗法。Tamaoki和Nakabayashi描述了在产生AFP的细胞中使用AFP转录调节区域驱动表达，特别是将编码癌细胞毒素的基因与AFP转录调节区域连接。加拿大专利申请2,134,994。然而，该文献的整个焦点是如白喉毒素(DT)编码基因之类异源毒素基因的表达，有关腺病毒的描述只是腺病毒可用作该毒素基因的送递载体。Kaneko等和Kanai等描述了由腺病毒介导的肝癌基因疗法，该疗法使用AFP的5’上游区域将HSV-tk的基因表达局限于肝细胞癌的细胞，接着用核苷类似物GCV治疗。癌症研究，55：5283-5287(1995)；肝脏病学22(4Part 2)：摘要158A(1995)；肝脏病学23：1359-1368(1996)；肝脏病学22：摘要328(1995)。然而，这些腺病毒构建体是复制缺损型，这些文献的整个焦点是使用AFP 5’上游转录调节区域控制非腺病毒基因的表达。Wills等(1995)也描述了选择性表达HSV-tk的复制缺损型腺病毒载体。癌症基因疗法，2：191-197。除了HSV-tk基因外，Kanai等(1996)也报道了使用AFP增强子-启动子驱动lacZ基因和大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的表达。胃肠学(增刊)110：A1227。另外，其焦点和方法中必需使用复制缺损型腺病毒作为治疗用的基因送递载体，而腺病毒本身并不作为导致选择性生长抑制的因子。也见Arbuthnot等(1996)(描述了使用大鼠AFP基因的5’侧翼序列)，人体基因疗法，7：1503-1514。

标准的疗法很难治愈肝细胞癌，因此，开发此疾病的新疗法至关重要。本发明通过提供特异性地在产生AFP之细胞中复制的腺病毒载体来致力于此需求。

本文提及的所有文献都全文列入本文作为参考。

发明简述

本发明提供了特别地特异于AFP表达细胞、有复制能力的腺病毒载体及其使用方法。在优选的实施方案中，这些有复制能力的腺病毒载体含有一个或多个腺病毒增殖所必需的早期和/或晚期基因，并处于AFP转录调节元件(TRE)的转录控制之下。其中还可能存在受AFP-TRE细胞特异性启动子控制的转基因。本发明还提供了含有腺病毒死亡蛋白(ADP)多肽编码序列的非天然腺病毒载体，所述序列可受或不受细胞特异性的转录控制。

因此，一方面，本发明提供了含有腺病毒基因、优选为复制所必需的腺病毒基因的腺病毒载体，其中所述腺病毒基因处于甲胎蛋白转录反应元件(AFP-TRE)的转录控制之下。在一个实施方案中，AFP-TRE是人的。在一个实施方案中，AFP-TRE含有AFP特异性启动子和增强子(即得自AFP基因的启动子和增强子)。

在一些实施方案中，复制所必需的腺病毒基因是早期基因。在另一实施方案中，早期基因是E1A，在另一实施方案中，早期基因是E1B，在另一实施方案中，E1A和E1B都受AFP-TRE的转录控制，在另一实施方案中，E1A、E1B和E4都受AFP-TRE的转录控制。

在其它一些实施方案中，复制所必需的腺病毒基因是晚期基因。

在另一实施方案中，AFP-TRE含有增强子元件A，在另一实施方案中，AFP-TRE含有增强子元件B，在另一实施方案中，AFP-TRE含有增强子元件A和B。

在另一实施方案中，AFP-TRE含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其功能等同的变体。在另一实施方案中，AFP-TRE含有SEQ IDNO：1之约+1至约+600的核苷酸序列。在另一实施方案中，AFP-TRE含有SEQ ID NO：1之约+600至约+827的核苷酸序列。在另一实施方案中，AFP-TRE含有SEQ ID NO：1之约+1至约+300的核苷酸序列。

在另一实施方案中，AFP-TRE含有SEQ ID NO：2的核苷酸序列或其功能等同的变体。

在其它实施方案中，腺病毒载体还可含有转基因，其中所述转基因受AFP-TRE的转录控制。在一些实施方案中，该转基因是细胞毒性基因。

在其它实施方案中，腺病毒载体还可含有另一个受AFP-TRE转录控制的腺病毒基因，如复制所必需的腺病毒基因。在其它实施方案中，还可以再有一个腺病毒基因受第三个AFP-TRE的转录控制。

另一方面，本发明提供了含有本文所述腺病毒载体的宿主细胞。

另一方面，本发明提供了含有本文所述腺病毒载体、尤其是有效量的本文所述腺病毒载体的组合物。本文所述组合物也可另外含有药学上可接受的赋形剂。

在一些实施方案中，本发明提供了与亲水性聚合物(“掩蔽剂”)复合以产生隐蔽腺病毒的腺病毒载体。该亲水性聚合物与腺病毒的衣壳蛋白、特别是六邻体和尾丝蛋白(共价或非共价)结合。在优选的实施方案中，本发明的腺病毒载体与掩蔽剂复合以产生隐蔽的腺病毒载体。在进一步优选的实施方案中，掩蔽剂是与本发明的腺病毒载体共价相连的聚乙二醇(PEG)。

另一方面，本发明提供了含有本文所述腺病毒载体的试剂盒。

本发明的另一个实施方案是优先在允许AFP-TRE起作用的细胞中复制、尤其是在表达AFP或能表达AFP的哺乳动物细胞中复制的腺病毒。

另一方面，本发明提供了特异于允许AFP-TRE起作用的细胞、如表达AFP的细胞(特别是哺乳动物细胞)的腺病毒的增殖方法，所述方法包括将本文所述腺病毒载体与允许AFP-TRE起作用的细胞混合，籍此可增殖所述腺病毒。

另一方面，本发明提供了在允许AFP-TRE起作用的细胞、如表达AFP的细胞内赋予选择性细胞毒性的方法，所述方法包括将表达AFP的细胞与本文所述腺病毒载体接触，其中腺病毒载体进入细胞。

另一方面，本发明提供了允许AFP-TRE起作用的细胞的检测方法，所述方法包括将生物样品中的细胞与本文所述腺病毒载体接触并检测由AFP-TRE介导的表达(若有的话)。

另一方面，本发明提供了生物样品中表达甲胎蛋白之细胞的检测方法，所述方法包括将生物样品中的细胞与本文所述腺病毒载体接触并检测腺病毒载体的复制(若有的话)。

另一方面，本发明提供了治疗方法，其中将本文所述腺病毒载体施用于个体。

另一方面，本发明提供了非天然的腺病毒载体，该载体含有编码腺病毒死亡蛋白(ADP)多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，ADP编码序列受细胞特异性TRE、如AFP-TRE或前列腺细胞特异性TRE的转录控制。

图的简述

图1A图解说明了人AFP增强子和启动子区域的图谱(未按比例绘制)。图1A显示出启动子/增强子区域的一些特征，包括：增强子区域A和B；远侧沉默子(Sd)；近侧沉默子(Sp)和糖皮质激素效应元件(GRE)。数字表示相对于转录起始位点(以弯箭头表示)的核苷酸位置。图1B图解说明了用于构建AFP-TRE的两个5’AFP区域(实施例1中描述)。

图2(A)和(B)概述了AFP-TRE的报道基因分析实验。图2(A)图示了用于评估AFP-TRE之转录活性的萤光素酶报道基因质粒构建体CN236。图2(B)是表示800bp AFT-TRE的萤光素酶报道基因分析的条线图，检测800bp片段在产生AFP的Hep3B细胞中驱动萤光素酶表达的能力。pGL2-Luc是阴性对照，其中萤光素酶基因不与AFP-TRE序列相连。

图3图解说明了实施例1中所述多种腺病毒载体构建体。

图4图解说明了其中E1A和E1B受AFP-TRE控制的腺病毒载体，E1A和E1B的方向相反。

图5A和B图解说明了插入到Ad的腺病毒死亡蛋白(ADP)盒。图5A中下方的箭头表示引物的位置。图5B表示含有Y前导序列和ADP编码序列的退火片段。

图6(A)、6(B)和6(C)是表示CN733(含两个AFP-TRE)和CN702(对照)感染细胞中E1A水平之Western分析的灰度再现。图6(A)显示Huh-7(AFP⁺)细胞中E1A的表达；图6(B)显示Dld-1(AFP^-)细胞中E1A的表达。图6(C)中，Sk-Hep-1是所用的AFP^-细胞。

图7(A)-(C)图解表示CN733在产生AFP(Huh-7；图7(A))和不产生AFP(Sk-Hep-1，图7(B)；Dld-1，图7(C))的细胞中的生长。

图8(A)-(C)图解表示与对照CN702(实心方形)相比，CN732(图8(A)；实心菱形)、CN733(图8(B)；实心菱形)和CN734(图8(C)；实心菱形)在HepG2细胞中的生长。

图9(A)-(C)图解表示与对照CN702(实心菱形)相比，CN732(图9(A)；实心方形)、CN733(图9(B)；实心圆形)和CN734(图9(C)；实心圆形)在原发性肝细胞中的生长。

图10(A)-(B)比较了携有肝癌细胞系HepG2并用CN733(图9(A)；方形)或用对照缓冲液(圆形)治疗的小鼠的肿瘤体积。图10(A)表示在43天(6周)内测定肿瘤体积。图10(B)中，将单次肿瘤内施用CN733(“B”)与5次连续日剂量的CN733(“J”)相比较。

图11图解说明了接受CN733(三角形)或接受缓冲液(圆形)的携肿瘤小鼠体内的血清AFP水平。

图12图解说明了含腺病毒死亡蛋白(ADP)之编码序列的腺病毒载体CN751(实心方形)与对照CN702(实心圆形)、Rec700(实心三角形)和模拟感染(Xs)相比较的细胞毒性。

图13比较了CN751(实心方形)和CN702(实心圆形)的胞外病毒产量。

图14比较了用CN751(“H”)，CN702(“J”)或缓冲液(“B”)攻击的携LNCaP肿瘤异种移植物之小鼠的肿瘤体积。

图15图解说明了对腺病毒进行共价PEG化(pegylation)的方法，在此方法中，使用琥珀酰亚胺基(succinimidyl)琥珀酰胺使腺病毒与甲氧基-PEG共价连接。通过离子交换层析将PEG化腺病毒与反应成分分离开。

图16显示了PEG化腺病毒蛋白质之十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶(迁移率变动)的灰度再现。泳道1和2是未PEG化的CN706(对照)，泳道3至6是在不同pH和温度条件下PEG化的CN706(泳道3，pH7.6，室温(RT)；泳道4，pH7.6，4℃；泳道5，pH8.2，RT；泳道6，pH8.2，4℃)。

图17是与对照腺病毒CN706混合的PEG化腺病毒(PEG-706)的离子交换层析谱。

实施本发明的模式

我们发现并构建了有复制能力的腺病毒载体，所述载体可优先在表达甲胎蛋白(AFP)的细胞中复制，我们还开发了使用这些腺病毒载体的方法。本发明的腺病毒载体含有至少一个腺病毒基因，优选为可导致细胞毒性的腺病毒基因，优选为腺病毒复制所必需的腺病毒基因，优选为至少一个早期基因，所述基因处于由AFP基因转录所必需的转录因子和/或辅因子的结合特异性调节的转录反应元件(AFP-TRE)的转录控制之下。通过提供至少一个复制所需的腺病毒基因的细胞特异性转录，本发明提供了可用于因选择性复制而产生特异性细胞毒性作用的腺病毒载体，这对于需要有针对性地杀死细胞的癌症治疗特别有用。所述载体也可用于检测例如适当的生物(如临床)样品中产生AFP之细胞的存在情况。另外，通过使用AFP-TRE，腺病毒载体可任选地在靶细胞中选择性地产生一个或多个所需蛋白质。

我们发现本发明的腺病毒载体优先在产生AFP的细胞中复制(即其复制量比不产生AFP的细胞中的高很多)。通过将产生AFP的细胞中的复制水平(即滴度)与不产生AFP的细胞中的复制水平相比较即可显示出这种复制优先性。当本发明的腺病毒载体实际上以比野生型病毒显著更慢的速率在不产生AFP的细胞中复制时，这种复制优先甚至更加显著。AFP⁺细胞类型的滴度与AFP^-细胞类型的滴度的比较提供了重要的线索，即当与野生型腺病毒相比，AFP^-细胞中的复制降低以及AFP⁺细胞中有复制时，整个复制优先就更为增强。此方面对于需要将对非靶(即非癌细胞)的细胞毒损害最小化的癌症治疗而言特别有意义和有用。实施例1提供了有关这些实验和发现的更详细描述。

另外，我们发现本发明的腺病毒载体显著妨碍HepG2异种移植物在裸鼠中的生长(实施例5)。因此，本发明使用和利用了原先认为是腺病毒载体不合乎需要的一面，即其复制和可能相伴随的免疫原性。因病毒复制的细胞特异性需求，使得失去控制的感染的可能性大大降低。不希望受到任何特殊理论的束缚，发明人注意到腺病毒蛋白质的产生可用于激活和/或刺激免疫系统，一般性地和/或特异性地针对产生腺病毒蛋白质的靶细胞，在癌症治疗中应着重考虑这一点，因为癌症患者经常是中度至严重无免疫应答。

我们也发现与缺乏ADP编码序列的腺病毒载体相比，腺病毒载体中包括ADP编码序列可显著增强细胞毒性、细胞杀伤和病毒产生的水平。因此，本文包括并描述了含有ADP多肽编码序列的非天然腺病毒载体。ADP编码序列受或不受细胞特异性TRE，如AFP-TRE的转录控制(即受选择性的转录控制)。

一般技术

除非特别说明，本发明的操作利用的是分子生物学(包括重组技术)，微生物学，细胞生物学，生物化学和免疫学的常规技术，所述技术是本领域技术人员熟知的。这类技术完整解释于例如下列文献：“分子克隆：实验室手册”，第2版(Sambrook等，1989)；“寡核苷酸合成”(M.J.Gait编，1984)；“动物细胞培养”(R.I.Freshney编，1987)；“酶学方法”(Academic Press，Inc.)；“实验免疫学手册”(D.M.Wei & C.C.Blackwell编)；“哺乳动物细胞的基因转移载体”(J.M.Miller & M.P.Calos编，1987)；“分子生物学最新方法”(F.M.Ausubel等编，1987)；“PCR：聚合酶链反应”(Mullis等编，1994)；“免疫学最新方法”(J.E.Coligan等编，1991)。

有关腺病毒的技术，可特别参见Felgner和Ringold(1989)自然337：387-388；Berkner和Sharp(1983)核酸研究，11：6003-6020；Graham(1984)EMBO J.3：2917-2922；Bett等(1993)病毒学杂志67：5911-5921；Bett等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：8802-8806。

定义

本文所用的“甲胎蛋白转录反应元件”或“AFP-TRE”是多核苷酸序列，优选为DNA序列，它在允许AFP-TRE起作用的宿主细胞(如表达AFP的宿主细胞)中能增加可操作相连的多核苷酸序列的转录。根据已公开的报道，AFP-TRE对产生AFP之细胞的相关细胞蛋白质(转录因子和/或辅因子)，如AFP结合蛋白反应(例见美国专利5,302,698)，并含有AFP启动子和/或AFP增强子的至少一部分。本文还描述了测定AFP-TRE活性、从而测定给定细胞是否允许AFP-TRE起作用的方法。

如本文详述，AFP-TRE可含有任何数目的结构，包括但不限于AFP启动子；AFP增强子；AFP启动子和AFP增强子；AFP启动子和异源增强子；异源启动子和AFP增强子；上述多聚体。AFP-TRE的启动子和增强子成分可以是任何方向和/或与所需编码序列间隔任何距离，只要能得到所需的AFP细胞特异性转录活性即可。可使用本领域已知的多种方法(下文将更详细地描述)测定转录激活，但一般通过检测和/或定量测定受AFP-TRE控制(即与其可操作相连)的编码序列的mRNA或蛋白质产物进行测定。如本文所讨论，AFP-TRE的长度可以不同，其序列组成也可以不同。“转录激活”或“转录增加”是指靶细胞(即产生AFP的细胞)中的转录水平比基础水平高至少约2倍，优选至少约5倍，优选至少约10倍，更优选至少约20倍，更优选至少约50倍，更优选至少约100倍，更优选至少约200倍，甚至更优选至少约400倍至约500倍，甚至更优选至少约1000倍。基础水平一般指不产生AFP的细胞中的活性水平(如果有的话)，或在产生AFP的细胞中检测到的缺乏AFP-TRE的报道基因构建体的活性水平(如果有的话)。可任选地将转录终止子或转录“沉默子”置于AFP-TRE的上游，从而防止编码区段在PB-TRE的转录控制下进行不必要的通读转录。也可任选地将待置于PB-TRE转录控制下的编码区段的内源性启动子进行缺失。

AFP-TRE之“功能等同的”变体是与另一个AFP-TRE不同、但仍保留了增加可操作相连之多核苷酸转录的能力、尤其是AFP细胞特异性转录活性的AFP-TRE。AFP-TRE的差异可能是由例如单个或多个碱基突变、增加、缺失和/或碱基修饰引起的线性序列差异。也可以是由糖和/或AFP-TRE碱基之间连键的变化引起的差异。

“细胞特异性的TRE”相对于不同功能性的其它类型细胞而言，在特定的细胞类型中优先起作用。细胞特异性的TRE可以是或不是肿瘤细胞特异性的。

本文所用术语“靶细胞特异性的”指与腺病毒载体复制所必需的基因可操作相连或与转基因可操作相连的TRE序列可特异性地在该靶细胞中起作用，从而使复制在该靶细胞中进行或转基因多核苷酸在该靶细胞中表达。借助于靶细胞中存在而非靶细胞中不存在的某类转录因子可实现这一目的，所述转录因子可激活由可操作相连的转录控制序列驱动的转录。利用非靶细胞中天然存在的转录抑制因子的缺乏也可实现这一目的，所述因子阻止由可操作相连的转录控制序列驱动的转录。本文所用术语“靶细胞特异性的”欲包括细胞类型特异性，组织特异性以及给定靶细胞之癌状况的特异性。在后一种情况下，正常细胞癌状况的特异性是与正常的、非癌对应细胞相比较而言的特异性。

“腺病毒载体”或“腺病毒的载体”(可互换使用)是本领域众所周知的术语，一般包括含有全部或部分腺病毒基因组的多核苷酸。为了本发明的目的，腺病毒载体含有与多核苷酸可操作相连的AFP-TRE。可操作相连的多核苷酸可以是腺病毒基因或异源基因。本发明的腺病毒载体构建体可以是下列几种形式中的任一种，所述形式包括但不限于：裸露的DNA，被腺病毒外被包裹的DNA，被另一种病毒或病毒样形式(如单纯疱疹病毒和AAV)包装的DNA，被脂质体包裹的、与聚赖氨酸复合的、与合成的多阳离子分子复合的、与运铁蛋白缀合的和与如PEG之类化合物复合以免疫性地“隐蔽”分子和/或增加半寿期的和与非病毒蛋白质缀合的DNA。优选多核苷酸是DNA。本文所用的“DNA”不仅包括碱基A、T、C和G，也包括这些碱基的任何类似物或经修饰的形式，如甲基化核苷酸，核苷酸间的修饰，如不带电的连键和thioate类，糖类似物的使用和经修饰和/或可替换的骨架结构，如聚酰胺。为了本发明的目的，腺病毒载体在靶细胞中具有复制能力。

本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”指的是任何长度的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的聚合物形式。这些术语包括单链、双链或三链体DNA，基因组DNA，cDNA，RNA，DNA-RNA杂合体，或含有嘌呤和嘧啶碱基或其它天然的、经化学、生物化学修饰的非天然的或衍生化的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的骨架可含有糖和磷酸基团(通常存在于RNA或DNA中)，或经修饰的或取代的糖或磷酸基团。或者，多核苷酸的骨架可含有如氨基磷酸酯之类合成亚单位的聚合物，因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚体，Peyrottes等(1996)核酸研究，24：1841-8；Chaturvedi等(1996)核酸研究，24：2318-23；Schultz等(1996)核酸研究，24：2966-73。可用硫代磷酸酯键替代磷酸二酯键，Braun等(1988)免疫学杂志，141：2084-9；Latimer等(1995)分子免疫学32：1057-1064。另外，通过合成互补链和在适当条件下将链退火，或者通过使用DNA聚合酶，用适当引物从头合成互补链，即可由化学合成的单链多核苷酸产物得到双链多核苷酸。

下列是多核苷酸非限制性的例子：基因或基因片段，外显子，内含子，mRNA，tRNA，rRNA，核酶，cDNA，重组多核苷酸，分支多核苷酸，质粒，载体，任何序列的分离的DNA，任何序列的分离的RNA，核酸探针和引物。多核苷酸可含有经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物，uracyl，其它糖和连接基团，如氟核糖(fluororibose)和thioate，和核苷酸分支。核苷酸序列可被非核苷酸成分间插。聚合化之后，通过例如与标记成分缀合可进一步地修饰多核苷酸。此定义中包括的其它类型的修饰是帽结构，用类似物取代一个或多个天然核苷酸，使多核苷酸与蛋白质、金属离子、标记成分、其它多核苷酸或固体支持物结合之方式的导入。优选多核苷酸是DNA。本文所用的“DNA”不仅包括碱基A，T，C和G，也包括这些碱基的任何类似物或经修饰的形式，如甲基化核苷酸，核苷酸间的修饰，如不带电的连键和thioate，糖类似物的使用和经修饰和/或可替换的骨架结构，如聚酰胺。

多核苷酸或多核苷酸区域与另一个序列具有某一百分比(如80％，85％，90％或95％)的“序列同一性”是指：当进行序列对比时，两个相比较的序列有所述百分比的碱基相同。使用本领域已知的软件程序，如分子生物学最新方法(Ausubel等编，1987)，增刊30，第7.7.18节，表7.7.1所述程序，可进行序列对比和测定同源性或序列同一性的百分比。优选的序列对比程序是ALIGN Plus(Scientific andEducational Software，Pennsylvania)。

“受转录控制”是本领域众所周知的术语，该术语表示多核苷酸序列(通常为DNA序列)的转录取决于它与负责启动或促进转录之元件的可操作相连。如下文所述，“可操作相连”指的是并列，其中元件的排列使得它们能起作用。

术语“多肽”，“寡肽”，“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，指的是任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是线性的或分支的，可含有经修饰的氨基酸，可被非氨基酸间插，可被装配成含一个以上多肽链的复合物。该术语也包括经天然修饰或通过间插修饰的氨基酸聚合物；所述修饰如二硫键形成，糖基化，脂质化，乙酰化，磷酸化或任何其它的操作或修饰，如与标记成分缀合。此定义也包括例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其它修饰的多肽。

在多肽上下文中，“线性序列”或“序列”是多肽N末端至C末端方向的氨基酸顺序，其中序列中相邻的残基在多肽的一级结构中是邻接的。“部分序列”是部分多肽的线性序列，已知该序列在一个或两个方向含有另外的残基。

ADP多肽“片段”(“片段”也被称为“区域”)(或“ADP片段”或“ADP区域”)是含有ADP氨基酸序列的多肽，所述多肽具有ADP序列的至少5个邻接的氨基酸，更优选至少10个邻接的氨基酸，更优选至少约15个邻接的氨基酸，甚至更优选至少约25个邻接的氨基酸，甚至更优选至少约30个邻接的氨基酸，甚至更优选至少约40个邻接的氨基酸。ADP片段可被表征为具有ADP所具有的任何功能，包括本文所述那些功能。

“复制”和“增殖”可以互换使用，指的是本发明腺病毒载体复制或增殖的能力，此术语是本领域众所周知的。为了本发明的目的，复制包括产生腺病毒蛋白质，一般涉及腺病毒的再生。使用本领域的标准试验和本文所述试验可测定复制，所述试验如爆发集落试验、噬菌斑试验或一步生长曲线试验。“复制”和“增殖”包括直接或间接参与病毒制备过程的任何活性，包括但不限于病毒基因表达；病毒蛋白质、核酸或其它成分的产生；将病毒成分包装在完整的病毒中；和细胞裂解。

本文所用的“细胞毒性”是本领域众所周知的术语，指的是细胞的一个或多个平常的生化或生物功能异常受损(即抑制或升高)的状态。这些活性包括但不限于代谢；细胞复制；DNA复制；转录；翻译；和分子的摄取。“细胞毒性”包括细胞死亡和/或细胞裂解。本领域已知显示细胞毒性的试验，如染料排斥，³H-胸苷摄取和噬斑试验。本文所用术语“选择性的细胞毒性”指的是与腺病毒赋予不允许AFP-TRE起作用之细胞的细胞毒性相比较而言，由本发明的腺病毒载体赋予允许AFP-TRE起作用之细胞的细胞毒性。通过例如噬斑试验，或含靶细胞之肿瘤的变小或稳定化，或肿瘤细胞特征性标记物或组织特异性标记物(如癌标记物，例如AFP或前列腺特异性抗原)之血清水平的降低或稳定化可测定这种细胞毒性。

“异源基因”或“转基因”是不存在于野生型腺病毒中的任何基因。优选转基因在被腺病毒载体导入之前也不在靶细胞中表达或存在于靶细胞中。下文提供了优选的转基因例子。

“异源”启动子或增强子是不得自AFP基因5’侧翼序列或与该序列不相关的启动子或增强子。异源启动子或增强子的例子是白蛋白启动子或增强子，和其它病毒启动子和增强子，如SV40。

“内源性”启动子、增强子或TRE得自腺病毒。

术语“可操作相连”涉及多核苷酸元件在功能关系上的倾向性。如果TRE能启动编码序列的转录，TRE则与编码区段可操作相连。可操作相连意味着被连接的诸DNA序列一般是邻接的，当必需连接两个蛋白质编码区时，所述序列是邻接的并处于相同的阅读框内。然而，由于增强子一般在与启动子间隔几千个碱基时也起作用，而内含子序列的长度又是可变的，因此，一些多核苷酸元件在不邻接的情况下也可能是可操作相连的。

“宿主细胞”包括可以作为或已经用作本发明腺病毒载体之受体的细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，后代不必(在形态学或整套DNA上)与亲代细胞完全相同。宿主细胞包括在体内或体外被本发明的腺病毒载体转染或感染了的细胞。

“靶细胞”是允许AFP-TRE起作用的任何细胞。优选靶细胞是哺乳动物细胞，优选是表达AFP的哺乳动物细胞，更优选是表达AFP的人细胞。

本文所用的“瘤细胞”、“瘤”、“肿瘤”、“肿瘤细胞”、“癌症”和“癌细胞”(可以互换使用)指的是表现出相对自主性生长，从而表现出特征在于细胞增殖显著失控的异常生长表型的细胞。瘤细胞可以是良性的或恶性的。

本文所用的“允许AFP-TRE起作用的细胞”、其中AFP-TRE的功能“充分保留的”细胞、“其中AFP-TRE有功能的细胞”等是其中AFP-TRE当与例如报道基因可操作相连时可将报道基因的表达增加至少约2倍，优选至少约5倍，优选至少约10倍，更优选至少约20倍，更优选至少约50倍，更优选至少约100倍，更优选至少约200倍，甚至更优选至少约400至500倍，甚至更优选至少约1000倍的细胞，所述增加是相对于未与AFP-TRE相连的相同报道基因的表达而言的。测定表达水平(相对或绝对水平)的方法是本领域已知的，本文也有描述。

“非天然”或“重组”腺病毒载体可以互换使用，指的是自然界中不存在或含有按非天然方式排列的多核苷酸元件(或成分)的腺病毒载体。如本文所讨论，在含ADP编码序列之腺病毒载体的上下文中，该术语包含因涉及ADP序列的操作和/或不涉及ADP序列的操作而成为非天然或重组的腺病毒载体。例如，含有ADP编码序列的非天然腺病毒载体可能在进行任何操作之前已含有ADP编码序列，但因其它序列元件的插入和/或缺失而变为非天然的。例如，这种腺病毒载体可含有细胞特异性的TRE，该TRE可调节腺病毒载体中另外含有的早期基因和ADP编码序列的转录。另外例如，将ADP编码序列加入不含这种序列的腺病毒载体中也可产生非天然的腺病毒载体(见实施例5)。

“ADP编码序列”是编码ADP或其功能性片段的多核苷酸。在ADP的上下文中，ADP的“功能性片段”是因腺病毒的复制表现出细胞毒活性、尤其是细胞裂解的片段。测定细胞毒活性的方法是本领域已知的，并在下文中描述。

“编码”ADP多肽的多核苷酸是可被转录和/或翻译而产生ADP多肽或其片段的多核苷酸。据说该多核苷酸的反义链也编码此序列。

“ADP多肽”是含有ADP之氨基酸序列(例见SEQ ID NO：23)的至少一部分或一个区域、并显示出与ADP相关的功能(尤其是细胞毒性，更具体地为细胞裂解)的多肽。如本文所讨论，使用本领域已知的技术可测定这些功能。应理解可使用某些序列变异，因为例如保守的氨基酸取代可提供ADP多肽。

SEQ ID NO中“所示”的多核苷酸或多肽序列指的是SEQ ID NO中以相同的邻接序列形式存在的序列。该术语包含SEQ ID NO的部分或区域以及SEQ ID NO中所含的整个序列。

“生物样品”包括得自个体的多种样品类型，可用于诊断或监测试验。此定义包括来源于生物的血液和其它液体样品，如活检样品之类的实体组织样品，衍生于此的组织培养物或细胞及其后代。此定义也包括获得之后以任何方式处理过的样品，所述处理方式如用试剂处理，稳定化，或富集某种成分(如蛋白质或多肽)。术语“生物样品”包括临床样品，也包括培养中的细胞，细胞上清液，细胞裂解物，血清，血浆，生物流体和组织样品。

“个体”是脊椎动物，优选为哺乳动物，更优选为人。哺乳动物包括但不限于饲养动物，野生动物和宠物。

“有效量”是足以产生有利的或合乎需要的临床结果的量。有效的量可以一次施用，也可以多次施用。本发明中，腺病毒载体的有效量是足以减轻、改善、稳定化、逆转、延缓疾病状态进程的量。

本文所用的“治疗”是得到有利的或合乎需要的临床结果的方法。本发明中，有利的或合乎需要的临床结果包括但不限于下列可测或不可测的结果，如症状的减轻，疾病程度的减小，疾病的稳态(即不恶化)，防止疾病扩散(即转移)，延缓疾病的进程，改善或减轻疾病状态，和(部分或总体上)减轻疾病。“治疗”也指相对于未接受治疗之患者的预期存活期有所延长的存活期。

“减轻”疾病指的是相对于未施用本发明的腺病毒载体而言，疾病状态的程度和/或不理想的临床表现减轻和/或疾病进程的时间过程放慢或延长。

“隐蔽的腺病毒”是与亲水性聚合物(“掩蔽剂”)复合的腺病毒。腺病毒可以是任何腺病毒，包括腺病毒的天然分离物或如本申请所述经改造的腺病毒载体。优选掩蔽剂是低免疫原性的。可接受的亲水性聚合物的例子包括：聚乙烯/聚丙烯共聚物，聚丙烯酸类似物，如纤维素之类的糖聚合物，聚甲醛，聚(N-乙烯吡咯烷酮)，聚乙二醇(PEG)等。亲水性聚合物可通过与病毒衣壳蛋白、尤其是六邻体和尾丝衣壳蛋白共价或非共价结合而复合。优选的亲水性聚合物是PEG，优选的隐蔽腺病毒是与PEG共价连接的腺病毒(“共价PEG化的腺病毒”)。

对产生AFP的细胞具有复制特异性的腺病毒载体

本发明提供了腺病毒载体构建体，该构建体含有受AFP-TRE转录控制的腺病毒基因。优选腺病毒基因会导致细胞毒性(直接和/或间接)，更优选其会导致细胞死亡，甚至更优选所述基因是腺病毒复制所必需的。导致细胞毒性的基因的例子包括但不限于腺病毒死亡蛋白(ADP；下文讨论)。当腺病毒载体具有选择性(即优先)的复制能力而可在表达AFP之靶细胞中增殖时，这些细胞会优先被腺病毒的增殖杀死。通过例如在体外或体内将腺病毒载体与恶性和正常肝细胞的混合物混合，腺病毒载体将优先在靶细胞(即恶性肝细胞)中复制。一旦靶细胞因选择性细胞毒性的和/或细胞裂解性的复制而被损坏后，腺病毒载体的复制显著减少，因此降低了失控感染的可能性和不必要的旁侧细胞效应。可保持体外培养以监测混合物(如活检或其它适当的生物样品)中靶细胞(如产生AFP的瘤细胞)的存在和/或再现。为了进一步证实细胞毒性，也可以存在一个或多个具有细胞毒效应、并受选择性转录控制的转基因。在此实施方案中，靶细胞被损坏的把握性较大。另外，或或者，腺病毒载体中可包括能导致细胞毒性和/或细胞死亡的腺病毒基因(如ADP)，该基因可受或可不受选择性的转录控制。

本发明中所用的AFP-TRE得自包括但不限于人、大鼠和小鼠的哺乳动物细胞。啮齿类动物和人AFP 5’侧翼序列已描述于文献中，因此可用于本发明实践中，本文无需更详细地描述。大鼠的AFP 5’侧翼序列已被描述和表征。Wen等(1991)DNA细胞生物学，10：525-536；Wen等(1993)核酸研究21：1911-1918。大鼠AFP 5’侧翼区域含有3个上游增强子，表示为复合物1(-2800至-2400)，复合物2(-4500至-3500)和复合物3(-7000至-4900)。启动子区域包括-250至-1；如果增强子间隔较远，则需要由-178至-155的启动子元件，而如果增强子较靠近，则不需要上述元件，Wen等(1991和1993)。Groupp等(1994)报道了344bp的HincII片段上的最远端增强子元件(即复合物3)的活性，生物化学杂志，269：22178-22187。Arbuthnot等(1996)显示了包括最近端增强子和启动子(和与小鼠沉默子同源的区域)的序列-3127至+102在人肝癌细胞系HuH7，Hep3B和HepG2中的活性。

小鼠5’侧翼AFP序列已被描述和表征，Ghebranious等(1995)Mol.Reprod.Devel，42：1-6。与大鼠类似，小鼠5’侧翼AFP序列含有3个分开的增强子元件。发现在-838和-250之间存在一个沉默子，或与成年肝脏内的关闭相关的元件，Emerson等(1992)Devel Dynam，195：55-66。

优选AFP-TRE来源于人。Watanabe等(1987)描述了AFP特异性增强子活性的克隆和鉴定。整个5’AFP侧翼区(含有启动子，推定的沉默子和增强子元件)包含在自转录起始位点至上游约5kb的范围内。相对于AFP基因的转录起始(CAP)位点而言，人的AFP增强子区域位于约-3954至约-3335之间。人AFP启动子包含从约-174至约+29的区域。Ido等(1995，癌症研究，55：3105-3109)描述了特异于HCC的259bp启动子片段(-230+29)。AFP增强子含有被称为A和B的两个区域，相对于转录起始位点，它们位于-3954和-3335之间。启动子区域含有典型的TATA和CAAT盒。优选AFP-TRE含有至少一个增强子区域，更优选AFP-TRE含有这两个增强子区域。

Kaneko等(1995)使用了4.9kb的HindIII-HindIII片段。Kanai等(1995和1996)显示了含有0.2kb(BglII至HindIII)启动子区段的一个较短片段和含增强子A和B的一个区段(-4.0至-3.3kb；ApaI至BglII)的活性。

在一个实施方案中，AFP-TRE含有约0.6kb的增强子区域(-3954至-3335)和0.2kb的启动子区域(-174至+29)，如图1B所示，它们都特异于产生AFP的细胞。这两个遗传元件的并列产生了全功能性的AFP-TRE(实施例1)。因此，本发明也包括其中AFP-TRE含有SEQID NO：1(即SEQ ID NO：1之序列)的腺病毒载体。

在另一个实施方案中，AFP-TRE含有SEQ ID NO：1中从约+1至约+600的序列，因此，此实施方案含有增强子区域A和B。在另一个实施方案中，AFP-TRE含有SEQ ID NO：1中从约+600至约+827的序列，因此含有AFP启动子。增强子区域可被进一步划分(为区域A和B)；因此，其它实施方案包括：(a)含有SEQ ID NO：1中从约+1至约+300之核苷酸序列的AFP-TRE；(b)含有SEQ ID NO：1中从约+300至约+600之核苷酸序列的AFP-TRE。

在另一个实施方案中，AFP-TRE含有整个5.1kb的5’侧翼序列(SEQ ID NO：2)。

AFP-TRE也可含有多聚体。例如，AFP-TRE可含有至少两个、至少三个、至少四个或至少五个AFP启动子片段的串联系列。或者，AFP-TRE可具有一个或多个AFP启动子区域以及一个或多个AFP增强子区域。这些多聚体也可含有异源启动子和/或增强子序列。

AFP-TRE中可缺乏或不缺乏沉默子。沉默子(即负调节元件)的存在有助于在非允许(即不产生AFP)的细胞中关闭转录(进而停止复制)，因此，沉默子的存在可通过更有效地防止腺病毒载体在非靶细胞中复制而赋予更强的细胞特异性复制。或者，沉默子的缺乏有助于实现靶细胞中的复制，因此，因在靶细胞中能更有效地复制而可赋予增强的细胞特异性复制。AFP基因的5’侧翼区显示出含有两个沉默子元件，-1822至-951(远侧元件)和-402至-169(近侧元件)，Nakabayashi等(1991)，分子细胞生物学，11：5885-5893。Kanai等(1995)报道了缺乏沉默子之片段的活性比所述约5.0kb的天然5’侧翼区的报道活性要高。

本领域技术人员易于理解AFP-TRE是多核苷酸序列，同样，通过多种序列变换后仍可表现出功能。核苷酸取代、增加和缺失的方法是本领域已知的，易于使用的功能性试验(如CAT或萤光素酶报道基因试验)使得本领域技术人员可测定序列变体是否表现出所需的细胞特异性转录功能。因此，本发明也包括本文所述核酸序列的功能上保守的变体，其中包括核酸取代、增加和/或缺失。不愿受单一理论束缚的同时，本发明人注意到某些修饰可能会导致所得表达水平受到调制，包括增强的表达水平。在某些更具侵略性的肝癌形式中，或当需要更快速和/或更具侵略性的细胞杀伤模式时(例如，因个体呈无免疫应答状态)，就特别需要获得受调制的表达水平，优选为增强的表达水平。

至于如何测定AFP-TRE活性的例子，可使用本领域已知的方法产生多核苷酸序列或一套这样的序列，所述方法如化学合成，定点诱变，PCR和/或重组方法。将待测序列插入含适当报道基因的载体中，所述报道基因包括但不限于氯霉素乙酰转移酶(CAT)，β-半乳糖苷酶(由lacZ基因编码)，萤光素酶(由luc基因编码)，绿色荧光蛋白，碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。这种载体和检测可很容易得到，特别是商购获得。使用本领域已知的转染方法，如磷酸钙沉淀法，电穿孔法，脂质体(脂质转染法)和DEAE-葡聚糖法，用如此构建的质粒转染适当的宿主细胞，以检测报道基因在推定的AFP-TRE控制下的表达。适当的宿主细胞包括产生AFP的任何细胞类型，包括但不限于Hep3B，HepG2，HuH7，HuH1/C12和AFP-SK-Hep-1。不产生AFP的细胞，如LNCaP，HBL-100，Chang肝细胞，MCF-7，HLF，HLE，3T3和HeLa被用作对照。通过使用标准试验测定报道基因的表达水平可得到结果。产生AFP之细胞与对照之间表达的比较显示出转录激活的存在与否。实施例2描述了使用萤光素报道基因试验检测800bp推定的AFP-TRE(如上所述，与0.2kb启动子区域融合的0.6kb增强子区域)的实验。

通过转录增加或激活，靶细胞(即产生AFP的细胞)中的转录水平比基础水平增加至少约2倍，优选至少约5倍，优选至少约10倍，更优选至少约20倍，更优选至少约50倍，更优选至少约100倍，更优选至少约200倍，甚至更优选至少约400至500倍，甚至更优选至少约1000倍。通过测定和比较产生AFP的单个细胞系中的表达水平，可在多个AFP-TRE之间或之内作比较。应理解AFP-TRE的绝对转录活性取决于几个因素，如靶细胞的特性，AFP-TRE的送递方式和形式，和被选择性转录激活的编码序列。为了补偿所用的各个质粒大小，可将活性表示为每摩尔转染质粒的相对活性。或者，可使用标准的Northern分析和杂交技术测定转录水平(即mRNA水平)。通过共转染含有处于不同TRE[如巨细胞病毒(CMV)即早期启动子]控制下的不同报道基因的质粒来测定转染水平(即转染效率)。此分析也可显示负调节区域，即沉默子。

或者，可评估推定的AFP-TRE赋予表达AFP之细胞腺以病毒复制优先权的能力。为了进行此试验，将含复制所必需的、与推定AFP-TRE可操作相连的腺病毒基因的构建体转染至表达AFP的细胞中。将所述细胞中的病毒复制与例如被该构建体转染的不产生AFP的细胞中的病毒复制相比较。实施例1中更详细地描述了此类试验。

应理解为了实施本发明，不必使用具有最大活性或具有最小尺寸的AFP-TRE。可特别地通过预期的用途和所需的结果确定活性的需要程度。例如，如果本发明的腺病毒载体被用于监测细胞产生AFP的活性，则AFP-TRE低于最大程度的反应性即足以定量指示这种细胞的存在。类似地，如果用于治疗或减轻疾病状态，只要例如产生AFP的细胞不是特别恶性的和/或疾病的范围相对是受限的，则低于最大的反应性即足以得到所需结果。

腺病毒载体的容量部分确定了AFP-TRE的大小，它反过来取决于载体的预期形式(见下文)。一般优选其尽量小，因为这可以为插入其它所需的序列，如转基因(下文讨论)或其它调节序列提供潜在的空间。然而，如果不想插入其它序列，或如果腺病毒载体的维持和送递不受任何病毒包装限制，也可以使用较大的AFP-TRE，只要所得的腺病毒载体具有复制能力即可。

如果未缺失腺病毒序列，则腺病毒载体有总共达5％基因组大小或约1.8kb的额外序列时也能被包装。如果从腺病毒基因组中除去非必需序列，则再插入4.6kb也是可以耐受的(即总共为约1.8kb加上4.6kb，约6.4kb)。可被缺失的非必需腺病毒序列的例子是E3和E4(只要E4 ORF6被保留了即可)。

由于AFP特异性转录活性显示存在于5.1kb的5’侧翼片段中，因此AFP-TRE可能至少为约5.0kb大小。优选AFP-TRE含有约2.5kb的多核苷酸序列，更优选约为1kb，更优选约为0.8kb，甚至更优选约为0.5kb，甚至更优选约为0.3kb(约为一个AFP增强子元件的大小)。

根据本发明可制备多种具有复制能力的腺病毒载体，其中单个或多个腺病毒基因受AFP-TRE的控制。例如，可将AFP-TRE导入腺病毒载体中紧接复制基因的上游并与该基因可操作相连，所述复制基因如早期基因E1A，E1B或E4等，或晚期基因L1，L2，L3，L4或L5等。在一些实施方案中，腺病毒载体含有受AFP-TRE之转录控制的E1A基因。在其它实施方案中，腺病毒载体含有受AFP-TRE之转录控制的E1B基因。在其它实施方案中，腺病毒载体含有受AFP-TRE之转录控制的E4基因。在其它实施方案中，可以实施上述多种组合和变换。例如，在一些实施方案中，腺病毒载体含有受AFP-TRE之转录控制的E1A基因，和受AFP-TRE之转录控制的E1B基因(即“双AFP-TRE构建体”)。在其它实施方案中，腺病毒载体含有受AFP-TRE之转录控制的E1A基因，受第二个AFP-TRE之转录控制的E1B基因，受第三个AFP-TRE之转录控制的E4基因。此上下文中“第一个”，“第二个”，“第三个”等AFP-TRE指的是驱动各个基因的独立的AFP-TRE。所用AFP-TRE可以具有相同的序列组成，也可以不具有相同的序列组成。然而，如本文别处所述，也可以是单个AFP-TRE调节一个以上腺病毒基因的转录。

在一个实施方案中，通过制备下列构建体，使E1A和E1B受一个或多个AFP-TRE的控制。在野生型腺病毒中，E1A和E1B为串联方向。从腺病毒基因组中切下含有E1A编码区至E1B启动子的片段，重新以相反的方向插入(图4)。在此构型中，E1A和E1B启动子相邻，后面接着反方向的E1A编码区段(以使E1A或E1B启动子都不与E1A可操作相连)，后面接着与E1A方向相反的E1B。可将AFP-TRE插入E1A和E1B编码区之间(它们的方向相反)，以使这些区域受TRE的控制。如图4所示，适当的启动子序列被插入E1A和E1B区域的近侧，因此，AFP-TRE可驱动E1A和E1B二者。这种构型可防止例如当两个AFP-TRE插入完整的(天然)Ad基因组(E1A和E1B编码区的5’端各一个)时可能发生的环出事件。通过在E1A和E1B之间导入多克隆位点，即可插入其它类型的AFP，或肝脏特异性的TRE，或其它细胞特异性调节元件，优选为与疾病状态(如肿瘤)相关的调节元件。因此，此构建体可广泛用来细胞特异性地、瞬时地或以其它方式控制腺病毒基因E1A和E1B，从而为使腺病毒的复制取决于选定转录参数提供了方便而有力的方法。

根据本发明可制备多种其它有复制能力的腺病毒载体，其中除了具有单个或多个受AFP-TRE控制的腺病毒基因外，还具有受AFP-TRE控制的报道基因。

例如，可将AFP-TRE导入腺病毒载体中使其紧接早期基因(如E1A和E1B)的上游并与该基因可操作相连，此构建体也可含有驱动报道基因表达的第二个AFP-TRE。报道基因可编码的报道蛋白包括但不限于氯霉素乙酰转移酶(CAT)，β-半乳糖苷酶(lacZ基因编码)，萤光素酶，碱性磷酸酶，绿色荧光蛋白和辣根过氧化物酶。为检测生物样品中推定的前列腺细胞，可用其中报道基因(如萤光素酶)受AFP-TRE控制的被修饰腺病毒处理该生物样品。在允许AFP-TRE起作用的细胞(如表达AFP的细胞)中，AFP-TRE是有转录活性的，并会产生萤光素酶。利用这种产生作用可在如人类宿主或某生物样品中检测产生雄激素受体的细胞。或者，可构建这样的腺病毒载体，其中编码存活条件性地需要的产物的基因(如某抗生素抗性标记)受AFP-TRE的控制。当这种腺病毒载体导入生物样品后，允许AFP-TRE起作用的细胞(如表达AFP的细胞)将变为抗抗生素型。然后便可将抗生素加入培养基以杀死不产生雄激素受体的细胞。

为将非特异性复制减至最少，较优选去除内源性(即腺病毒)TRE。这样也将在腺病毒载体中提供更多插入空间，其特殊意义将体现在将腺病毒载体包装为病毒时(见下文)。更重要的是，缺失内源性TRE将预防重组事件的发生，以免因此缺失AFP-TRE及内源性TRE转录控制其各个腺病毒编码序列(这样将发生非特异性复制)。在一个实施方案中，本发明的腺病毒载体构建为腺病毒基因的内源性转录控制序列缺失，由AFP-TRE取代。但腺病毒载体中也可能保留内源性TRE，只要能保留足够的细胞特异性复制优先权即可。这些实施方案可以是除内源性TRE之外再提供一个AFP-TRE，较优选该AFP-TRE插在内源性TRE和复制基因编码区段之间。所需细胞特异性复制优选权的说明需比较分析腺病毒载体在表达AFP的细胞和不表达AFP的细胞中的复制。一般，较优选复制差异至少约2倍；较优选至少约5倍；较优选至少约10倍；较优选至少约50倍；更优选至少约100倍；更优选至少约200倍；更优选至少约400倍至500倍；更优选至少约1000倍。可接受的差异可由经验确定(用如实施例部分所述试验)，将取决于所用腺病毒载体的用途和/或所期望的结果。

适宜的靶细胞为任何允许AFP起作用的细胞类型。优选表达或产生、或者能表达或能产生AFP的细胞，包括但不限于表达AFP的肿瘤细胞，如肝细胞癌细胞，性腺和其他生殖细胞肿瘤(尤其是内皮窦肿瘤)，脑肿瘤细胞，卵巢肿瘤细胞，胰腺泡细胞癌(Kawamoto等(1992)肝胃肠道学39：282-286)，原发性胆囊肿瘤(Kat suragi等(1989)Rinsko Hoshasen34：371-374)，子宫内膜腺癌细胞(Koyama等(1996)日本癌症研究杂志87：612-617)，及以上各种肿瘤的转移灶(肺，肾上腺，骨髓，和/或脾脏)。一些病例中，胰腺癌和胃癌的肝脏转移病例产生AFP。尤其优选肝细胞癌及其任何转移病例的细胞。测量AFP的产生可用本领域的标准试验，如RIA，ELISA或Western印迹(免疫分析)测定AFP蛋白生产水平，或用Northern印迹测定AFP mRNA的生产水平。或者，可利用这些细胞转录活化AFP-TRE(即允许AFP起作用)的能力对其鉴别和/或定性。

腺病毒的任何血清型均可使用，如Ad2，Ad5，Ad12和Ad40。本文以Ad5为例进行说明。

一些实施方案中，将AFP-TRE与增殖必需的腺病毒基因结合使用，从而优选在表达AFP的靶细胞中获得复制能力。该基因优选早期基因，如E1A，E1B，E2，或E4(E3非病毒复制所必需)。更优选受控于AFP-TRE的早期基因为E1A和/或E1B和/或E4。可有不止一个早期基因受控于AFP-TRE。详见实施例1。

E1A基因紧随病毒转染之后(0-2小时)表达，优先于其他任何病毒基因。E1A蛋白充当着反式作用的阳性活化转录调节因子，并且是其他早期病毒基因E1B，E2，E3，E4，及启动子近侧主要晚期基因的表达所必需。不管如何命名，由主要晚期启动子驱动的启动子近侧基因均在Ad5转染后的早期表达。Flint(1982)生物化学与生物物理学报651：175-208；Flint(1986)病毒研究进展31：169-228；Grand(1987)生物化学杂志241：25-38。缺乏功能性E1A基因则不能进行病毒转染，因为不能产生病毒DNA复制必需的基因产物。Nevins(1989)病毒研究进展31：35-81。Ad5 E1A的转录起始位点在病毒基因组的498位，E1A蛋白的ATG起始位点在病毒基因组的560位。

E1B蛋白以反式起作用，是晚期mRNA从核送递至胞浆所必需的。E1B表达中的缺陷将导致晚期病毒蛋白表达不足及不能关闭宿主细胞的蛋白合成。E1B的启动子是作为Ad40和Ad5不同宿主范围差异的决定因子：临床上Ad40是肠道病毒，而Ad5导致急性结膜炎。Bailey，Mackay等(1993)病毒学193：631；Bailey等(1994)病毒学202：695-706)。Ad5的E1B启动子由Spl的单一高亲和性识别位点及一个TATA盒组成。

腺病毒中E2区编码有关腺病毒基因组复制的蛋白，包括72kDaDNA结合蛋白，80kD前体末端蛋白及病毒DNA聚合酶。Ad5的E2区从名为E2早期和E2晚期的两个启动子右方，这两个启动子分别位于76.0和72.0个图距单位处。E2晚期启动子在转染晚期有瞬时活性，且不依赖E1a反式激活蛋白，而E2早期启动子在病毒复制的早期具有决定性作用。

作图定位于Ad5中27050-27150的E2早期启动子其组成是：主要和次要转录起始位点(后者约占E2转录子的5％)，两个非规范TATA盒，两个E2F转录因子结合位点和一个ATF转录因子结合位点。

有关E2启动子结构的详细情况参见Swaminathan等，微生物和免疫流行话题(Curr.Topics in Micro.and Imm.)(1995)199第3部分：177-194。

E2晚期启动子与相反链上一个基因的编码序列重叠，故无法进行基因操作。而E2早期启动子仅与相反链上编码一个33kD蛋白的序列有少数几个碱基对重叠。值得注意的是，SpeI限制位点(Ad5的27082位)是上述33kD蛋白终止密码子的一部分，适宜地将主要E2早期转录起始位点和TATA结合蛋白位点与上游转录因子结合位点E2F和ATF分开。因而将带SpeI末端的AFP-TRE插入1链中的SpeI位点可破坏Ad5的内源性E2早期启动子，并允许E2转录子进行AFP限制性表达。

E4基因有很多转录产物。E4区编码的两段多肽可刺激病毒基因组DNA的复制和晚期基因的表达。开放读码框(ORF)3和6的蛋白产物与E1B的55kD蛋白及E2F-1和DP-1的异二聚体结合后均有此功能。ORF6蛋白发挥活性要求与E1B的55kD蛋白相互作用，而ORF3蛋白不用。缺乏ORF3和ORF6的功能性蛋白时，噬斑产生率比野生型病毒的10^-6少。为进一步将病毒复制限制在AFP生产细胞中，可缺失E4 ORF I-3，使病毒DNA复制和晚期基因合成依赖于E4 ORF6蛋白。将该突变体与其中的E1B区受AFP-TRE调节的序列组合，所获得的病毒中E1B功能和E4功能均依赖于AFP-TRE驱动的E1B。

有关于本发明的主要晚期基因有L1，L2，L3，L4，L5，它们编码腺病毒的病毒体蛋白。所有这些基因(主要编码结构蛋白)很可能是腺病毒复制所需。晚期基因均受控于主要晚期启动子(MLP)，该启动子位于Ad5的+5986至+6048。

除了借助于在允许AFP-TRE起作用的细胞(如表达AFP的细胞)中的优选复制能力提供选择性细胞毒性和/或细胞裂解活性，本发明的腺病毒载体可进一步包括一个受控于AFP-TRE的异源基因(转基因)。籍此，可向表达AFP的靶细胞中导入各种遗传能力，尤其是产生AFP的癌细胞。如，在某些例中，可能期望增强细胞毒活性的程度和/或效率(由如产生AFP的靶细胞相对难治或特别突出的侵犯性所致)。要达到这一点，只需将细胞特异性的复制性细胞毒活性与细胞特异性的表达如HSV-tk和/或胞嘧啶脱氨酶(cd)(使细胞能代谢5-氟胞嘧啶为化疗剂5-氟尿嘧啶(5-FU))的能力相结合。应用这些类型的转基因也可能提供旁侧效应。

其他可通过腺病毒载体转导的所需转基因包括细胞毒蛋白基因，如白喉毒素A链、蓖麻毒蛋白或相思豆毒蛋白基因[Palmiter等(1987)细胞50：435；Maxwell等(1987)分子细胞生物学7：1576；Behringer等(1988)基因开发2：453；Messing等(1992)神经元(Neuron)8：507；Piatak等(1988)生物化学杂志263：4937；Lamb等(1985)欧洲生物化学杂志148：265；Frankel等(1989)分子细胞生物学9：415]，能启动凋亡的因子的编码基因，反义转录物或核酶编码序列[可直接针对增殖所需蛋白(如结构蛋白或转录因子)的mRNA]；病毒或其它胞内增殖病原体的致病性蛋白；核酸酶(如RNase A)或蛋白酶(如awsin，木瓜蛋白酶，蛋白酶K，羧肽酶等)的基因工程化胞浆变体的基因，Fas基因等。其它目的基因包括细胞因子，抗原，跨膜蛋白等，如IL-1，-2，-6，-12，GM-CSF，G-CSF，M-CSF，IFN-α，-β，-γ，TNF-α，-β，TGF-α，-β，NGF等。阳性效应物基因可应用于较早期，此后有复制所致的细胞毒性。

如上所讨论，一些实施方案中，腺病毒载体中包含有E3区中编码的腺病毒死亡蛋白(ADP)。受控于主要晚期启动子(MLP)的ADP基因所编码蛋白(ADP)似乎对于加速宿主细胞裂解十分重要。Tollefson等(1996)病毒学杂志70(4)：2296；Tollefson等(1992)病毒学杂志66(6)：3633。如此，带ADP基因的腺病毒载体可提供更有力的腺病毒载体，有可能使治疗更有效和/或所需剂量更低。

因此，发明提供的腺病毒载体包括编码ADP的多核苷酸序列。ADP的DNA序列和氨基酸序列分别表示为SEQ ID NO：22和SEQID NO：23。简单说，ADP编码序列优选用本领域已知的技术(如PCR)从Ad2获得(因为该病毒株中ADP更全面地得到了鉴定)。优选地，还获得Y前导序列(它对于晚期基因的正确表达十分重要)并连至ADP编码序列。然后将ADP编码序列(带或不带Y前导序列)导入腺病毒基因组中，如导入E3区(在此ADP编码序列将由MLP或E3启动子驱动)。ADP编码序列也可插入腺病毒基因组的其它位置，如E4区。或者，ADP编码序列能够可操作相连于异源启动子(带或不带增强子)，包括但不限于其它病毒启动子，组织特异性启动子如AFP，癌胚抗原(CEA)，粘蛋白，大鼠probasin。实施例4所述ADP构建体中ADP编码序列插入于Ad5的E3区。

就ADP而言，对包含ADP编码序列的腺病毒载体的细胞毒特性、病毒产量、体内细胞毒特性进行了检测。病毒构建体CN751显示，与不含这些序列的对照载体相比，它有显著的体外杀细胞效应和病毒产量。而且，裸鼠体内LNCaP(一种前列腺癌细胞系)肿瘤异种移植物或小于或等于接受对照腺病毒载体或缓冲液的小鼠内的肿瘤大小(即生长受到抑制)，给药7天后CN751与对照处理组的肿瘤大小相比具有统计学上的显著性差异。总之，这些资料有力地暗示含ADP的腺病毒载体是一种有效的细胞毒性剂。

因此，本发明还提供非天然存在的腺病毒载体，其中包含ADP多肽的多核苷酸。当然这些载体可包含ADP编码序列的多个拷贝，而且，若是多拷贝形式，则各序列不必相同，只要有至少两个这样的序列产生ADP多肽便可。如上所讨论，“ADP多肽”是至少有一个涉及ADP的功能(尤其涉及细胞毒功能、优选细胞死亡)的多肽。“ADP多肽”包括上述ADP形式，及任何有ADP功能的多肽片段。因为ADP功能与细胞毒活性、特别是细胞裂解有关，可用本领域的常规方法如噬斑试验检测是否ADP多肽。

一些实施方案中，ADP多肽是SEQ ID NO：23中表示的多肽序列，包括SEQ ID NO：23完整序列。其它实施方案中，编码ADP多肽的多核苷酸表示于SEQ ID NO；22中，包括SEQ ID NO；22的完整序列。只要给出ADP的氨基酸序列，就能用本领域已知的方法设计编码全部或部分SEQ ID NO：23的多核苷酸，而无须参考SEQID NO：22。而且，只要给出工具，如由本领域的技术人员轻易制备的变性探针，就能获得并检测其他ADP序列形式，如来自其他腺病毒血清型的ADP序列。

ADP编码序列可受或不受细胞特异性、组织特异性和/或肿瘤特异性TRE的转录控制。一些实施方案中，ADP多肽编码序列受细胞特异性TRE(如AFP-TRE或前列腺细胞特异性TRE)的转录控制。前列腺细胞特异性TRE的实例有来自前列腺特异性抗原的(U.S.专利号5,698,443和5,648,478)，probasin(述于共同拥有的专利申请U.S.流水号60/039,762和U.S.流水号08/____(代理人文档号34802/2000700)和人激肽释放酶2(述于共同拥有的专利申请U.S.流水号60/____(代理人文档号34802/3000920)和U.S.流水号60/054,523)。细胞特异性TRE的其他实例有癌胚抗原和粘蛋白。本领域已有关于这些及其他TRE的功能性片段的描述。

一些实施方案中，本发明提供的腺病毒载体含处于第二个AFP-TRE转录控制下的另一个腺病毒基因。另一个受转录控制的腺病毒基因实例有ADP(上述)和复制所需基因如早期基因。例如，腺病毒载体可如此构建：第一个AFP-TRE调节一个早期基因如E1A或E1B的转录，第二个AFP-TRE调节另一个早期基因的转录。这些多重构建体可能更加理想，因为它们可提供不止一个有关复制的细胞特异性来源(见实施例)。CN733这种双构建体在携HuH7肿瘤异种移植物的裸鼠体内成功地抑制了肿瘤的生长(实施例4)。

本文所述任一个腺病毒载体可以各种形式使用，包括但不限于裸露的多核苷酸(一般为DNA)构建体；与促进进入细胞的制剂(如阳离子脂质体，或其他阳离子化合物如多聚赖氨酸)复合的多核苷酸构建体；包装进入感染性腺病毒颗粒(这可使腺病毒载体更具免疫原性)；包装入其他颗粒性病毒形式如HSV或AAV中；联合其他制剂(如PEG)以增强或减弱免疫应答；联合能促进体内转染的制剂如DOTMA^TM，DOTAP^TM，和多胺。这样，本发明还提供能优先在产生AFP的细胞中复制的腺病毒。“优先复制”指腺病毒在产生AFP的细胞中比在不产生AFP的细胞中复制更多。优选地，在产生AFP的细胞中比在不产生AFP的细胞中腺病毒复制水平显著更高；优选地，至少高2倍，优选至少高5倍，较优选至少高10倍，较优选至少高50倍，较优选至少高100倍，较优选至少高400倍至500倍，较优选至少高1000倍，较优选至少高1×10⁶倍。更优选地，腺病毒只在产生AFP的细胞中复制(即在不产生AFP的细胞中不复制或极低水平复制)。

若将腺病毒载体包装成腺病毒，则可选择腺病毒自身以进一步增强靶向。如，腺病毒尾丝介导与有助于特异性的细胞受体的初步接触。参见如Amberg等(1997)病毒学227：239-244。若某腺病毒血清型的特殊亚种表现出对某种靶细胞类型的嗜性和/或对非靶细胞类型的亲和力降低，则该亚种可用来进一步增强细胞特异性细胞毒作用和/或细胞裂解作用。

一些实施方案中，将包装的腺病毒载体与亲水性聚合物复合以产生隐蔽腺病毒。该亲水聚合物(共价或非共价)结合至腺病毒的衣壳蛋白，尤其是六邻体和尾丝蛋白。较优选的实施方案中，本发明的腺病毒载体与掩蔽剂复合而产生隐蔽的腺病毒载体。隐蔽的腺病毒有很多优点，因为(a)可掩盖腺病毒表面不受循环中的腺病毒中和抗体或调理素的作用，和(b)可通过减少体内非特异清除机制(即巨噬细胞等)而增加腺病毒颗粒的全身性循环时间。在体内，隐蔽腺病毒的全身性运送导致病毒颗粒的更长时间循环，免疫原性更弱，生物分布更广，被肝脏和脾脏清除得更少。对用亲水聚合物(尤其PEG)修饰蛋白和脂质已有进一步的研究，但他们未提及掩蔽剂与腺病毒或腺病毒构建体结合的任何其它应用。

因此，本发明提供了与掩蔽剂复合的腺病毒。优选地，掩蔽剂为PEG。制备隐蔽腺病毒的方法之一图示于图15(也参见实施例7)。优选的实施方案是含有本文所述腺病毒载体的隐蔽腺病毒，更优选的实施方案是含有本文所述腺病毒的PEG化腺病毒。本发明也提供制备和应用这些隐蔽腺病毒的方法，本文中有明确描述。

掩蔽剂可有各种分子量，只要能获得所需复合物和功能即可。多数商业化掩蔽剂通常为所称分子量的多分散型(即所提供的掩蔽剂分子量分布于所称分子量左右的一个范围)。根据本发明，可用于掩蔽腺病毒的掩蔽剂的标称重量约2000至50000；优选约2500至30,000；优选约3000至25,000；更优选约5000至20,000。优选标称分子量少于约20,000，更优选少于约10,000，更优选少于约7500，更优选少于约5000。优选地，掩蔽剂为PEG，标称分子量少于约5000Da。也包括不同分子量掩蔽剂的混合物。

掩蔽可以是共价或非共价结合。若是非共价结合，则可通过静电、疏水、或亲和相互作用。用于非共价结合的掩蔽剂可以是修饰的掩蔽剂(即掩蔽剂经合成或修饰而包含不常见于掩蔽剂中的特殊化学成分)。可用来静电吸附于腺病毒载体的掩蔽剂是包含或者经修饰或合成后包含可通过静电相互作用结合于腺病毒表面的带电部分。带阴性电荷的掩蔽剂包含磷酸基，硫酸基，羧基等。季胺基可用作使掩蔽剂静电地、非共价吸附于腺病毒的带正电荷部分。包含或者经修饰或合成后包含疏水基团如脂质(如磷脂酰乙醇胺等)及其他疏水基团(如苯基或烷基长链)的掩蔽剂可通过与病毒的稳定疏水区疏水相互作用而结合腺病毒载体。亲和性掩蔽剂可用结合腺病毒的任何小分子、肽或蛋白质制备。可用本领域已知的任何方法，优选经化学交联剂进行化学交联，使亲和性和疏水性部分结合于掩蔽剂上。

若掩蔽剂共价吸附，优选用化学交联剂使掩蔽剂共价结合于腺病毒上。交联剂任选能在掩蔽剂和腺病毒之间产生共价连接或桥的交联剂。直接交联(其中腺病毒、掩蔽剂和另外的交联剂分子相互作用)可用于产生共价隐蔽腺病毒，所用为本领域已知的在掩蔽剂和蛋白质之间产生交联的任何化学交联剂。掩蔽剂或腺病毒均可先于交联作用进行修饰，以便化学交联剂将与这两种分子作用(如，掩蔽剂可经修饰添加氨基，使它能通过可与氨基反应的交联剂与腺病毒交联)。

优选地，掩蔽剂或腺病毒通过与交联剂的反应首先激活，再从掩蔽剂或腺病毒中去除未反应的交联剂。活化反应优选导致每分子掩蔽剂结合一或两分子交联剂，更优选每分子掩蔽剂结合一分子交联剂。再将活化的掩蔽剂或腺病毒与腺病毒(若是掩蔽剂先被活化)或掩蔽剂(若腺病毒先被活化)在适当反应条件下混合以形成隐蔽腺病毒。优选地，将掩蔽剂活化后再与腺病毒反应。

掩蔽剂优选PEG。优选的活化PEG包括但不限于：亲核性交联PEG，如末端胺PEG，PEG氨基酸酯，PEG肼盐酸盐，巯基PEG等；羧基PEG包括琥珀酸PEG，羧甲基化PEG，PEG-丙酸，PEG氨基酸；巯基选择性PEG，如PEG-顺丁烯二酰亚胺，PEG-邻吡啶基-二硫化物等；异源功能性PEG，包括胺和酸PEG，NHS-顺丁烯二酰亚胺PEG和NHS-乙烯基砜PEG；PEG硅烷；生物素PEG；PEG的乙烯基衍生物，如烯丙基PEG，PEG的丙烯酸酯，PEG的甲基丙烯酸酯等；亲电活性PEG，包括PEG琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(PEG succinimidylsuccihate)，PEG琥珀酰亚胺基琥珀酰胺(PEG succinimidylsuccinamide)，PEG琥珀酰亚胺基丙酸酯(PEG succinimidylproprionate)，羧甲基化PEG的琥珀酰亚胺基酯，PEG2-NHS，氨基酸PEG的琥珀酰亚胺基酯，侧链被修饰的PEG NHS酯(如Innophase公司可提供的那些)，PEG-缩水甘油醚(环氧化物)，PEG-氧羰基咪唑，PEG-硝基苯基碳酸酯，PEG三氯苯基碳酸酯，PEGtreslate，PEG-醛，PEG的氰酸酯，PEG丙烯基醚和马来酸酐的共聚物，PEG乙烯基砜，以及本领域技术人员熟知的其他活化PEG。活化PEG较优选是PEG-N-羟基琥珀酰亚胺基琥珀酰胺或PEG琥珀酰亚胺基琥珀酸酯。更优选PEG-N-羟基琥珀酰亚胺基琥珀酰胺。

腺病毒载体向靶细胞的送递有多种方式，包括但不限于脂质体，本领域熟知的常规转染方法(如磷酸钙沉淀或电穿孔)，直接注射，及静脉内灌注。送递方法主要取决于特定腺病毒载体(包括其形态)以及靶细胞的类型和位置(即细胞在体外还是在体内)。

若使用包装的腺病毒，则腺病毒载体可在适当的生理学上可接受载体中以剂量约10⁴至约10¹⁴给予。感染复数通常范围是约0.001至100。若所给予的是多核苷酸构建体(即未包装成病毒)，则腺病毒载体的剂量可约0.01μg至约1000μg。腺病毒载体的给予可以是一次，也可以是多次，这取决于其目的用途和宿主的免疫应答能力，还可多重地同时注射给药。若不期望产生免疫应答，则可用各种免疫抑制剂减少免疫应答，以便能重复给药而不产生强免疫应答。若包装为另一种病毒形式，如HSV，给药量可根据该病毒的有关常识(可方便地得自如已公布的文献)而定，亦可凭经验确定。

本发明还提供了内含(即转化有)本文所述腺病毒载体的宿主细胞。原核和真核的宿主细胞都可使用，只要有在该宿主中维持所必需的序列(如适当的复制起始区)即可。为方便起见，还提供可选择标记。原核宿主细胞包括细菌细胞，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，和分枝杆菌。真核宿主细胞有酵母、昆虫、禽类、植物、C.elegans(线虫)和哺乳动物细胞。真菌(包括酵母)宿主细胞的实例有酿酒酵母，乳酸克鲁维酵母，假丝酵母属各个种(包括白假丝酵母)和，构巢曲霉，粟酒裂殖酵母，巴斯德毕赤酵母和Yarrowialipolytica。哺乳动物细胞的实例有COS细胞，小鼠L细胞，LNCaP细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，人胚肾(HEK)细胞和非洲绿猴细胞。非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞或其它两栖类细胞也可使用。宿主系统为本领域熟知，不必再在本文中详述。适宜的宿主细胞还包括产生AFP或产生任何已知能活化AFP-TRE的蛋白质(不管该蛋白质是天然的还是重组的)的任何细胞。

本发明还包括内含本文所述腺病毒载体的组合物，如药物组合物。这类组合物可体内给药，如当测量某个体内的转导程度和/或杀细胞效应时。优选地，这些组合物更进一步包含药物学上可接受的赋形剂。这些可包含有效量的本发明腺病毒载体于药物学上可接受的赋形剂中的组合物适于以单位剂量形式、无菌的胃肠道外溶液或悬浮液、无菌的非胃肠道外溶液或口服液或悬浮液，水包油或油包水乳液等全身性给药于个体。非胃肠道外和胃肠道外药物送递配方为本领域已知，可参见Remington’s药物科学，18版，MackPublishing(1990)。药物组合物还包括本发明腺病毒载体的冻干形式和/或重建形式(包括包装成病毒、如腺病毒的那些)。

本发明还包括内含本发明腺病毒载体的试剂盒。这些试剂盒可用于诊断和/或监控目的，优选监控目的，使用这些试剂盒的操作可由临床实验室、实验性实验室、医疗实践人员或私人自行完成。本发明之试剂盒可供人检测适当的生物样品(如活检样品)中AFP生产细胞的存在。

本发明之试剂盒含有适当包装形式的本文所述腺病毒载体。试剂盒可任选提供操作中有用的附加成分，包括但不限于缓冲液、发生剂、标记、反应表面、检测方式、对照样品、说明书和解释资料。

本发明腺病毒载体的制备

本发明腺病毒载体可用本领域内的常规重组技术制备。通常，将AFP-TRE插入目的腺病毒基因、优选一个或更多早期基因(尽管也可用晚期基因)的5’端。AFP-TRE可用寡核苷酸合成(若序列已知)或重组方法(如PCR和/或限制酶)制备。方便的限制位点，不管是天然腺病毒DNA序列中的还是用诸如寡核苷酸介导的诱变和PCR之类的方法导入的，均为AFP-TRE提供了插入位点。因此，可将用于与AFP-TRE退火(即将其插入)的方便限制位点用常规重组法(如PCR)加工到AFP-TRE的5’和3’末端。

用于制备本发明之腺病毒载体的多核苷酸可用本领域内常规方法如化学合成法获得，或经重组获得，和/或通过从生物来源中获得所需序列而得到。

应用两个质粒可方便地制备腺病毒载体，其中一个质粒提供腺病毒的左侧区，另一个质粒提供右侧区，而这两个质粒至少共同拥有约500nt的中间区可用于同源重组。如此，可按需要分别加工每个质粒，再共转染到感受态宿主内，提供适当的互补基因或适当的转录因子，以从CEA-TRE启动转录而使腺病毒增殖。常用适当的转导方式，如阳离子脂质体，将质粒导入合适的宿主细胞(如293细胞)中。或者，也可通过体外连接腺病毒基因组的右左两个部分来构建包含腺病毒基因组复制必需的所有部分的重组腺病毒衍生物。Berkner等(1983)核酸研究11：6003-6020；Bridge等(1989)病毒学杂志63：631-638。

为方便，可得到具有腺病毒必需部分的质粒。质粒pXC.1(Mckinnon(1982)基因19：33-42)含有野生型Ad5的左侧末端。pBHG10(Bett等(1994)美国国家科学院院报91：8802-8806；Microbix Biosystems公司，多伦多)可提供Ad5的右侧末端，其中E3区内有一个缺失。E3区内的这个缺失为插入3kb的AFP-TRE提供了空间而无须缺失病毒内源性增强子/启动子，Bett等(1994)。E3基因位于E4的相反链(r-链)上。pBHG11上有一个更大的E3缺失(另外又缺失了0.3kb)Bett等(1994)。

为操作早期基因，Ad5 E1A的转录起始点位于病毒基因组的498位，而E1A蛋白的ATG起始点位于560位。此区可用来插入AFP-TRE。用PCR可导入限制位点，其中所用引物可限于Ad5基因组，或可涉及带Ad5基因组DNA的质粒的一部分。如，用pBR322时，引物可用pBR322骨架中的EcoRI位点和Ad5 1339位的Xba1位点。经两步PCR，该区中心的重叠引物可导入一个30序列的改变而产生一个单一限制位点，这样即可在此位点插入AFP-TRE。实施例1详细描述了其中E1A受AFP-TRE控制的腺病毒载体。

可用相似的策略插入AFP-TRE以调节E1B。Ad5的E1B启动子含有一个SpI的高亲和性识别位点和一个TATA盒。此区从1636位延伸至1701位。在该区插入一个AFP-TRE后，即可提供E1B基因的细胞特异性转录。应用被处于AFP-TRE调节下的E1A修饰的左侧区作模板导入AFP-TRE以调节E1B，所得腺病毒载体将依赖于细胞特异性转录因子而表达E1A和E1B。实施例1更详细说明了这类构建体是如何制备的。

相似地，可将一个AFP-TRE插入E2基因的上游使其表达变成细胞特异性的。E2早期启动子(Ad5-图谱中27050位-27150位)由主要和次要转录起始点(后者占E2转录物的约5％)、两个非规范TATA盒、两个E2F转录因子结合位点和一个ATF转录因子结合位点组成。E2启动子结构详见Swaminathan等，微生物和免疫流行话题(1995)199(第3部分)：177-194。

E2晚期启动子与相反链上基因的编码序列有重叠，故不能进行基因改造。而E2早期启动子只与相反链上一个33kDa蛋白的编码序列有少数几个碱基对重叠。值得注意的是，SpeI限制位点(Ad5的27082位)是上述33KDa蛋白的终止密码子的一部分，并方便地将主要E2早期转录起始位点和TATA结合蛋白位点与上游转录因子结合位点E2F及ATF区分开。因而在1-链的SpeI位点插入带SpeI末端的PB-TRE将破坏Ad5的内源性E2早期启动子，并使得E2转录子进行AR限制性表达。

至于E4，需使用腺病毒基因组的右侧部分。E4转录起始点主要在35609位，TATA盒在35638位，而ORF1的第一个ATG/CTG在35532位。Virtanen等(1984)病毒学杂志51：822-831。用上述用于其它基因的任何策略，可在该转录起始点的上游导入一个AFP-TRE。为了构建E4区内的突变体，在W162细胞(Weinberg等(1983)美国国家科学院院刊80：5383-5386)内进行共转染和同源重组，该细胞可反式提供E4蛋白以弥补这些蛋白质合成中的缺陷。或者，这些构建体可体外连接而成。

制备含ADP的腺病毒载体所依据的原理如上述并为本领域内已知。如要导入ADP编码序列，则可进行重组插入，方法如实施例5和6所述。或者，可用已包含ADP编码序列的腺病毒载体构建内含其它附加元件和/或操作元件(如TRE或转基因)的重组载体。

将腺病毒多核苷酸包装进入腺病毒颗粒的方法为本领域内已知并述于各实施例中。

制备隐蔽腺病毒的方法依掩蔽剂和结合方式(共价或非共价)不同而变化。非共价结合有掩蔽剂的隐蔽腺病毒的制备是彻底混合腺病毒与掩蔽剂。在适宜于交联剂的条件下使各反应成分混合可达到共价交联。化学交联方案为本领域内熟知。任何所给化学交联剂的确切反应条件根据交联剂的化学特性及对PEG和腺病毒的修饰(若有的话)而变化，亦为本领域内技术人员所知。若掩蔽剂为PEG，则腺病毒对PEG的摩尔比优选介于1∶1×10⁶和1∶1×10⁷之间，更优选约1∶4×10⁶。就优选的活化PEG，即PEG-NHS-琥珀酰胺而言，活化的PEG在交联反应中的浓度优选为0.5-5mM，更优选约2mM。腺病毒在交联反应中用量优选为10⁶-10¹²，更优选约5×10⁹。使用优选的活化PEG时，交联反应的pH优选约pH7-9，更优选约pH7.5-8，而反应优选在约4℃至室温(约20℃)的温度范围内进行10至30分钟。

交联反应后，从反应组分中分离隐蔽腺病毒。分离方法为本领域技术人员已知的任何方法，包括层析法，如大小排阻层析，离子交换层析或疏水相互作用层析；电泳法；或过滤法，如透析、渗滤或超滤。

应用本发明腺病毒的方法

本发明载体应用广泛，根据不同需要或预期结果而用法不同。因此，本发明包括应用上述腺病毒载体的方法。

一个实施方案中，所供方法用于在允许AFP-TRE起作用的细胞(即靶细胞，优选表达AFP的细胞)中提供选择性细胞毒作用，该方法包括将本文所述腺病毒载体与细胞接触。细胞毒作用可用本领域的常规试验测量，如染料排斥法³H-胸苷掺入法和/或裂解法。

另一实施方案中，所供方法可用于对特异于允许AFP-TRE起作用的细胞(优选表达AFP的哺乳动物细胞)的腺病毒进行增殖。这些方法中将腺病毒载体与细胞混合，由此对该腺病毒进行增殖。

另一实施方案提供了在细胞混合物中杀死允许AFP-TRE起作用的细胞(如AFP表达细胞)的方法，该方法包括将细胞混合物与本发明的腺病毒载体进行混合。细胞混合物通常为正常细胞和产雄激素受体的癌细胞的混合物，可以是体外混合物或体内混合物。

本发明还包括在生物样品中检测允许AFP-TRE起作用的细胞(如表达AFP的细胞)的方法。这些方法特别可用于监控某一个体(即哺乳动物)的临床和/或生理学状况，不管是用于实验还是临床。这些方法中，使生物样品的细胞接触腺病毒载体，并检测腺病毒载体的复制。或者，可将样品与其中有报道基因受控于AFP-TRE的腺病毒接触。报道基因的表达显示存在允许AFP-TRE起作用的细胞，如AFP产生细胞。或者，可构建这样的腺病毒，其中有一个细胞存活条件性地需要的基因受控于AFP-TRE。该基因可编码如抗生素抗性。将腺病毒导入生物样品中，然后用抗生素处理样品。表达抗生素抗性的存活细胞其存在说明有允许AFP-TRE起作用的细胞，如产生(或能产生)AFP的细胞。适合的生物样品是其中AFP产生细胞可能存在或怀疑存在的样品。通常，哺乳动物中，适合的临床样品是其中疑有产AFP的癌细胞(如肝细胞癌细胞)的样品。这些细胞可经如针活检或其它外科过程获得。待接触的细胞可经处理以改善试验条件，如选择性富集和/或增溶。这些方法中，检测AFP产生细胞可用体外检测腺病毒增殖的试验(为本领域的标准试验)。这些标准试验的实例包括但不限于爆发试验(测病毒产量)和噬斑试验(测每个细胞的感染性颗粒)。检测增殖也可通过测量特异性腺病毒DNA的复制而进行，这也是标准试验。

本发明还提供修饰靶细胞的基因型的方法，包括将靶细胞与本文所述腺病毒载体接触，其中腺病毒载体进入细胞。

本发明进一步提供抑制肿瘤细胞(较优选表达AFP的肿瘤细胞)生长的方法，包括将肿瘤细胞与本发明的腺病毒载体接触，从而腺病毒载体进入肿瘤细胞并表现出对肿瘤细胞的选择性细胞毒作用。肿瘤细胞的生长可用本领域内已知的任何方法评估，包括但不限于测量肿瘤大小、用³H-胸苷掺入试验确定肿瘤细胞是否增殖，或计数肿瘤细胞。“抑制”肿瘤细胞生长指任一或所有以下状态：肿瘤生长减慢、推迟和停止，以及肿瘤萎缩。“抑制”肿瘤生长指的是与未接触即未转染本文所述腺病毒载体的肿瘤的生长相比，其生长状态减弱。

本发明还提供降低个体内肿瘤细胞标志水平的方法，包括给予该个体本发明的腺病毒载体。其中该腺病毒载体对产生该肿瘤细胞标志的细胞有选择性细胞毒作用。肿瘤细胞标志包括但不限于AFP，PSA，hK2和癌胚抗原。测量肿瘤细胞标志水平的方法为本领域内技术人员已知，包括但不限于用肿瘤细胞标志的特异性抗体进行的免疫学试验如酶联免疫吸附试验(ELISA)。一般说来，从待检验的个体采集生物学样品并对生物样品进行适当的试验，如ELISA。

本发明还提供治疗方法，其中将有效量的本文所述腺病毒载体施用于个体。应用腺病毒载体的治疗方法可用于肿瘤(如肝细胞癌)患者。还可用于AFP相关疾病(包括癌)的高危人群，如那些有此类病的家族史和/或有已切除或以其它形式(如化疗)治疗过的疾病的个体。决定是否适于施用本发明的腺病毒载体将特别依据可评估的临床参数，如血清学指标及组织活检样品的组织学检查。通常施用含腺病毒载体的药物组合物。药物组合物如上述。

腺病毒载体的用量取决于多种因素，如给药途径，个体的身体状况，疾病发展程度，所用的具体PB-TRE，及具体的载体构建体(即腺病毒基因受控于PB-TRE)。

若施用包装的腺病毒，则用量为约10⁴至约10¹⁴，优选约10⁴至约10¹²，更优选约10⁴至约10¹⁰。若施用多核苷酸构建体(即未包装成病毒)，则用量为约0.01μg至约100μg，优选0.1μg至约500μg，更优选约0.5μg至约200μg。可同时或先后施用不止一种腺病毒载体。通常是周期性给药，同时监控任何反应。可经如肿瘤内、静脉内或腹膜内给药。

本发明的腺病毒载体可单独使用或与其它活性剂(如化疗剂)联合使用，它们可促进达到所期望的目的。

以下实施例用于举例说明本发明，并非限制。

实施例

实施例1包含受AFP-TRE驱动转录的E1A和/或E1B的腺病毒载体

人胚肾细胞系293可有效表达Ad5的E1A和E1B基因，并显示腺病毒DNA的高转染效率。为进行这些实验，用一个Ad5左侧末端质粒和一个Ad5右侧末端质粒共转染293细胞。同源重组产生了具有在293细胞中复制所需的遗传元件的腺病毒，所述遗传元件可反式提供E1A和E1B蛋白，以弥补这些蛋白质合成中的缺陷。

将用于联合的质粒用阳离子脂质体如Lipofectin(DOTMA：DOPE^TM，Life echnologies)共转染进入293细胞，方法是合并两个质粒，然后将质粒DNA溶液(每质粒10μg溶于500μl不含血清或其他添加物的基本培养基(MEM))与于200μl相同缓冲液的4倍摩尔过量的脂质体混合。再将此DNA-脂质复合体加在细胞上，于37℃、5％CO₂温育16小时。然后将培养基换成含10％胎牛血清的MEM，于37℃、5％CO₂温育10天，期间换两次培养基。10天后将细胞和培养基均转移至试管中，冻融三次，用适当稀释度的裂解产物转染293细胞，以检测噬斑形式的单个病毒。

所获噬斑再经噬斑纯化两次，然后经PCR，偶尔经DNA测序鉴定病毒是否有所需序列。为进行进一步实验，用氯化铯梯度离心大量纯化病毒。

用上述程序产生3种肝细胞癌细胞特异性的有复制能力的腺病毒：CN732，其中含AFP-TRE驱动E1A基因的表达；CN733，其中含两个AFP-TRE驱动E1A和E1B基因的表达；CN734，其中含一个AFP-TRE驱动E1B表达。病毒经293细胞中的同源重组产生，并经噬斑纯化法克隆两次。经PCR和对插入序列与Ad基因组序列间的连接部分的测序，分析基因组DNA的结构，以确证这些病毒包含所需结构。病毒结构也可用Southern印迹确证。

表1列举了用于产生具所需特征的重组Ad5的Ad5右末端质粒和左末端质粒的几种组合。

表1含AFP-TRE的腺病毒载体

病毒名称左末端质粒右末端质粒

E1A-AFP CN732 CN219 BHG10

E1A/E1B-AFP CN733 CN224 BHG10

E1B-AFP CN734 CN234 BHG10

病毒构建

质粒pXC.1购自Microbix Biosystems公司(多伦多)。pXC.1含22-5790位(核苷酸)的Ad5序列。我们用寡核苷酸介导的诱变和连接PCR，在E1A起始密码子(Ad5 547)的5’端12bp处导入了一个AgeI位点。为此，将pXC.1经PCR扩增，所用引物为：

5’-TCGTCTTCAAGAATTCTCA(15.133A)(SEQ ID NO：3)，其中含一个EcoRI位点，

5’-TTTCAGTCACCGGTGTCGGA(15.134B)(SEQ ID NO：4)，其中含一个额外的A用以导入一个AgeI位点。由此产生的片段是从pBR322骨架中的EcoR1位点至Ad5 560。扩增pXC.1中从Ad 541至Ad 1339位核苷酸处的XbaI位点的第二个片段，扩增所用引物为：

5’-GCATTCTCTAGACACAGGTG(15.133B)(SEQ ID NO：5)，其中含一个XbaI位点，

5’-TCCGACACCGGTGACTGAAA(15.134A)(SEQ ID NO：6)，其中含一个额外的T用以导入一个AgeI位点。将这两种PCR扩增的DNA片段混合后，用引物15.133A和15.133B扩增，以产生从pXC.1中的EcoR1位点至XbaI位点的DNA片段。此DNA片段包含Ad序列左末端1317个碱基及Ad547位的AgeI位点。利用此DNA片段取代pXC.1的相应片段以产生CN95。

按上述寡核苷酸介导的诱变的方法，在Ad5 1682位插入一个G残基，便在E1B起始点上游产生了一个EagI位点。为简化在EagI位点插入一个AFP-TRE的过程，用EagI酶解、经绿豆核酸酶处理再重新连接，以去除CN95的内源性EagI位点，得到构建体CN114。引物如下：

5’-TCGTCTTCAAGAATTCTCA(15.133A)(SEQ ID NO：3)，含有一个EcoRI位点，

5’-GCCCACGGCCGCATTATATAC(9.4)(SEQ ID NO：7)，含一个EagI位点，

5’-GTATATAATGCGGCCGTGGGC(9.3)(SEQ ID NO：8)，含一个额外的G和EagI位点，

5’-CCAGAAAATCCAGCAGGTACC(24.020)(SEQ ID NO：9)，含一个KpnI位点。

以上引物被用于扩增1682位至Ad5 2048位的KpnI位点之间的片段。用引物15.133A和24.020共扩增这两个片段，产生的片段在Ad5 1682带有一个EagI位点，用来替代pXC.1中的相应EcoRI/KnpI位点，以构建CN124。

为构建CN732，从人类基因组DNA(Clontec，Palo Alto，CA)经PCR扩增人AFP增强子结构域A和B(包括在相对于AFP帽位点的-3954bp至-3335bp的区段内)。所用引物如下：

5’GTGACCGGTGCATTGCTGTGAACTCTGTA 3’(39.055B)(SEQ ID NO：10)

5’ATAAGTGGCCTGGATAAAGCTGAGTGG 3’(39.044D)(SEQ ID NO：11)、

用下述引物扩增自-174至+29的AFP启动子：

5’GTCACCGGTCTTTGTTATTGGCAGTGGT 3’(39.055J)(SEQ ID NO：12)

5’ATCCAGGCCACTTATGAGCTCTGTGTCCTT 3’(29.055M)(SEQ ID NO：13)

将增强子和启动子片段退火，再用引物39.055B和39.055J经重叠PCR产生融合构建体。此最小增强子/启动子片段经PinAI酶解，用E1A帽位点5’端的改造过的AgeI位点连接至CN124中，产生CN219。肝特异性病毒载体CN732由CN219和BHG10共转染293细胞而同源重组产生。

用以下两个PCR引物扩增上述增强子/启动子元件(-3954至-3335和-174至+29)，构建成CN733：

5’TATCGGCCGGCATTGCTGTGAACTCT 3’(39.077A)(SEQ ID NO：14)

5’TTACGGCCGCTTTGTTATTGGCAGTG 3’(39.077C)(SEQ ID NO：15)

PCR产物用EagI酶解，再连接进入相似切割的CN219。由此产生的质粒CN224包含两个相同的AFP调节元件，一个调节E1A基因的表达，另一个调节E1B基因的表达。由BHG10和CN224共转染293细胞而同源重组产生了CN733。

为得到CN734，用PinAI酶解CN224并重新连接载体，这样切除了其中调节E1A基因表达的AFP-TRE。将所得质粒CN234与BHG10共转染293细胞，产生了CN734。

体外病毒生长

CN732、CN733和CN734的生长选择性用噬斑试验分析，试验中单个感染性颗粒经多轮感染和复制后会产生一个肉眼可见的噬斑。将病毒贮存液稀释成相同的pfu/ml，然后感染单层细胞1小时。再去除接种物，用含半固体琼脂的培养基覆盖细胞，37℃温育10天(表4中为12天)。计数细胞单层中的噬斑，计算各细胞中的感染性病毒滴度。将数据转换为CN702(野生型)在293细胞中的滴度。4个代表性试验的结果示于表2-5。

表2733(E1A/E1B)的噬斑试验

表3CN732、CN733、CN734的噬斑试验数据

表4CN732、CN733、CN734噬斑形成率

表5CN732、CN733和CN734的噬斑试验

野生型病毒CN702在受检测的每种细胞系中均产生噬斑。以CN702产生的噬斑数为基线，对比CN733形成的噬斑。

由于293细胞系中存在反式互补作用，因此其中病毒的生长应不受E1区内变化的影响。正如所预期，CN702和CN733在293细胞上产生的噬斑数接近。

考虑表1的数据，在AFP阳性细胞系Hep3B和HepG2中，CN702产生的噬斑数类似于在293细胞中产生的。相反，CN733在AFP阳性细胞系比在293细胞中产生的噬斑数多近4倍。CN733在AFP阳性细胞系中形成噬斑的超正常水平说明在这些细胞中AFP增强子有活性。

在AFP阴性细胞系LNCaP和HBL100中，两种病毒的生长受阻，但受阻程度不同。野生型CN702病毒在LNCaP细胞中产生的噬斑是其在293细胞中所产生水平的约30％，CN702在HBL-100细胞中形成的噬斑为在293细胞中的0.02％。相对于CN702来说，CN733的噬斑形成在这些AFP阴性细胞系中更进一步减少。CN733在LNCaP细胞中产生噬斑的水平为在293细胞中的0.1％。在HBL100细胞中，CN733根本不产生噬斑。与CN702相比，CN733在AFP阴性细胞系中的生长至少降低100倍。此结果与前面的结果(其中Ad40的E1B启动子显示在肠和上皮结缔组织中的活性相差近100倍(Bailey等，1994))相当具有可比性，也与E1B基因的缺失突变体显示在p53+和p53-细胞中的Ad生长之间100倍的差异(Bischoff等，1996)有可比性。最后，比较AFP⁺细胞型与AFP^-细胞型中的滴度，得到一个关键启示，即由于AFP^-细胞中复制受阻以及AFP⁺细胞中的复制，总的复制优先权被增强了。

考虑表3的数据，有好几个发现。首先，CN732、CN733和CN734在Huh-7细胞中产生噬斑的能力均象CN702一样有效。相反，两个腺病毒(CN732和CN733)产生噬斑的能力在本实验所包括的非AFP生产细胞系中极大地降低。在非AFP生产性的肝细胞癌细胞系SR-Hep-1中，CN732和CN733在受检稀释度下未产生噬斑。此结果类似这两个病毒在HeLa、MCF-7和DLD-1细胞中的结果。CN702在DLD-1细胞中的噬斑形成能力超过CN733 4000倍以上。

根据表4的数据(其中滴度均转换成在293细胞中为1×10⁷)，CN732、CN733和CN734在HepG2细胞中的噬斑形成类似于野生型(CN702)。然而，在不表达AFP的细胞系中，这些病毒的噬斑形成远不如CN702。在所检测的稀释度下，CN732和CN733在SK-Hep-1、OVCAR-3和HBL-100中不产生噬斑，这显示出显著的滴度差异。这相当于在HBL-100和OVCAR-3中比野生型至少差10,000倍，在SK-Hep-1中比野生型差1,000倍。CN734在OVCAR-3和HBL-100细胞中比CN702的效率分别低25倍和200倍。

表5的数据暗示CN732、CN733和CN734在表达AFP的细胞中的噬斑形成能力与CN702相当。然而，在不表达AFP的细胞中却不如CN702。如，在受检稀释度下，CN732和CN733在HBL100细胞或OVCAR-3细胞中均不形成噬斑。CN734在受检细胞系中的噬斑形成差异不如CN732或CN733显著。它在DU145、HBL100和OVCAR-3中的噬斑形成能力比野生型分别低13倍、40倍和67倍。

噬斑试验数据表明，人腺病毒可用AFP-TRE修饰，使之有选择性地在AFP生产细胞中，尤其是在生产AFP的肿瘤细胞(如肝细胞癌细胞)中产生病毒。

E1A表达产物的Western分析

下一个实验中，我们检查了AFP-TRE对CN733感染的细胞中E1A蛋白累积的效应。我们推理，如果插入到CN733中的一个AFP调节区调节了E1A基因，则受感染细胞中E1A蛋白的水平也将受到影响。我们用Western印迹检验此假设。

评估Huh-7，SK-Hep-1和DLD-1细胞中CN733的E1A积累。用CN702或CN733以感染复数(MOI)10感染单层细胞，并在感染后不同时间点收获。对样品进行10％丙烯酰胺凝胶电泳，再电泳转移至硝酸纤维素膜上。E1A蛋白用ECL Western Detection system(Amersham，Arligton Heights，IL)按厂家说明进行检测。所用第一抗体为兔抗Ad2 E1A抗体(Santa Cruz Biotechnology，SantaCruz，CA)。结果示于图6(A)和6(B)。

E1A在CN702和CN733感染的Huh-7细胞中迅速累积。在CN702感染的Dld-1细胞中也检测到高水平的E1A。然而，在CN733感染的Dld-1细胞中几乎检测不到E1A蛋白。这个结果令人感兴趣，因为它暗示CN733在不产生AFP的细胞中较弱的噬斑形成能力可归因于它的E1A表达受限。这些数据与AFP-TRE影响CN733在非容许细胞型中的受控复制的假设一致。

用SK-Hep-1细胞作为非AFP生产细胞，重复该实验。感染后24小时之后获得数据。结果示于图6(C)。该实验的结论与前一个实验相同：E1A的表达受AFP-TRE的严格调节。

CN733的生长

对CN733在AFP产生细胞和非AFP产生细胞中的生长进行评估。用CN702或CN733以MOI 10感染Huh-7、SK-Hep-1和Dld-1单层细胞。感染后不同时间收获双份样品。冻融三次，在293细胞中测定滴度，以确定总病毒产量。CN702和CN733的病毒产率曲线图示于图7(A)-(C)。

CN702和CN733在Huh-7细胞中生长良好。Huh-7细胞生产的感染性CN702和CN733量相似。与之对比，CN733的生长在SK-Hep-1细胞中受严重限制。实验中CN702的滴度比CN733高约1000倍。在Dld-1细胞中有相似的结果。

在HepG2细胞中也进行了生长实验，以比较CN732、CN733和CN734的生长。HepG2单层细胞以感染复数(MOI)2进行感染，感染后不同时间收获细胞。在293细胞上测定样品的滴度，以确定病毒终产量。结果示于图8(A)-(C)。这些数据表明含AFP-TRE的腺病毒在此癌细胞系中生长良好。CN732、CN733和CN734均在感染后36小时达到高终滴度，此滴度类似于CN702。

另一项实验中，评估原代肝细胞(hNheps)中的增殖，此细胞为实验开始的3天前分离自一位供者(32岁，黑人男性)。单层细胞以MOI2感染，感染后不同时间进行收获，在293单层细胞上测定滴度。结果示于图9(A)-(C)。数据暗示CN732和CN733在hNheps中的生长不如CN702。CN732的生长比CN702推迟24小时。感染后36小时，感染性CN702比CN733多10倍多。CN733的生长推迟了36小时。感染后36小时，感染性CN702比CN733多几乎1000倍。CN734的生长类似于CN702。这些数据还暗示CN733有最受限制的表型，其次为CN732，再次CN734。综上所述，这些结果还说明AFP-TRE插入E1A基因的上游比AFP-TRE插入E1B区的上游能更有效地限制宿主范围。若两个AFP-TRE都有则更有效。

总之，上述实验说明有可能将腺病毒载体的宿主范围限制在AFP生产细胞上。正如噬斑试验和生长试验所证实的那样，含AFP-TRE的腺病毒载体在HepG2和Huh-7细胞中能很有效地增殖，但在非AFP生产细胞中很少增殖。

实施例2：质粒CN236的瞬时表达试验

以瞬时表达试验测定CN236中800bp的AFP-TRE驱动荧光素酶基因表达的能力。通过阳离子脂质(即lipofectin)法，用CN236或pGL2Luc转化不产AFP的Chang肝细胞和产AFP的Hep3B细胞。pGL2-Basic(Promega)是不包含AFP调节基因而只有该基因插入的骨架的构建体，因而它是试验中的阴性对照构建体。质粒载体pGL2-Luc(Promega)为阳性对照。细胞培养于补加10％胎牛血清(FCS)的DMEM中，48小时后分析荧光素酶活性。按生产商试剂盒(Packard Instruments)中的说明书测量荧光酶活性，用发光计定量。结果示于下表6中，均表示为相对光单位(RLU)。

细胞系	阴性对照	pGL2-Luc	CN236
细胞系	阴性对照	pGL2-Luc	CN236	Hep3B	0.017	4.118	7549
Chang肝细胞	0.29	2.94	7.0	Hep3B	0.017	4.118	7549

这些数据显示该DNA片段在AFP阳性肝细胞(Hep3B)中有活性，在AFP阴性肝细胞(Chang肝细胞)中无活性。

实施例3：检验腺病毒载体对HuH7肿瘤异种移植物的细胞毒性

开发AFP特异性腺病毒载体的一个特别有用的目标是治疗有AFP生产性肿瘤(如肝细胞癌)的病人。其可行性的一个原始指标是检测载体对Balb/c nu/nu小鼠皮下生长的HuH7肿瘤异种移植物的细胞毒性。小鼠均皮下注射于PBS中的1×10⁷个HuH7癌细胞。用常规试验(如ELI SA)分析血清AFP以检测肿瘤细胞的AFP生产量。

为此，通过直接肿瘤内、或静脉内或腹膜内注射约10⁸pfu(当所给为包装的病毒时)于0.1ml PBS+10％甘油中的病毒，将待检腺病毒导入小鼠，或从尾静脉静脉内注入。当给药为多核苷酸构建体(即未包装成病毒)时，给药量可以为0.1μg至100μg或更多。测量肿瘤大小，某些实验中还每周取血样。将肿瘤内注射腺病毒(如CN733)对肿瘤大小和血清AFP水平的影响与空白对照比较。

尽管极有可能是通过病灶内给予(即直接注射)进行基于本文所述病毒的治疗，但也有必要确定静脉内(IV)给予腺病毒载体能否影响肿瘤生长。若真如此，则可用该病毒治疗直接注射无法达到的肿瘤转移灶。为此，每3至5只携HuH7肿瘤的小鼠为一组，尾静脉注射10⁸pfu的腺病毒载体(如CN733)，或注射用于携带病毒的缓冲液作阴性对照。将静脉内注射腺病毒载体对肿瘤大小和血清AFP水平的影响与空白对照比较。

实施例4：检验腺病毒载体CN733对HepG2肿瘤异种移植物的细胞毒性

用一个HCC小鼠异种移植物模型评估CN733作为肝癌治疗性腺病毒的能力。将AFP产生性HCC细胞系HepG2皮下注射于Balb/cnu/nu小鼠的右侧。使肿瘤生长几周，然后每只小鼠肿瘤内注射于PBS、甘油中的1.5×10¹¹个CN733颗粒，或只注射缓冲液进行处理。共处理11只携HepG2肿瘤的小鼠，6只注射CN733，5只注射缓冲液。每周测量肿瘤直至实验结束。肿瘤体积的计算方法是肿瘤长度乘以其宽度的平方再除以2。图10(A)是每个治疗组平均肿瘤体积对时间的作图。

6周内，注射过缓冲液的HepG2肿瘤体积比原来大了5倍多。相比之下，CN733处理过的小鼠内肿瘤生长减弱。其中一个肿瘤甚至萎缩至其最大体积的3％。这些数据暗示CN733侵入了肿瘤并发挥了细胞毒性。

除了监控肿瘤生长，我们还收获了血样，并分析了AFP水平。结果示于图11。数据暗示血清AFP水平在接受CN733的小鼠体内比在接受缓冲液的对照小鼠体内上升得更慢。

在另一项实验中，比较了CN733不同给药方案的抗肿瘤活性。动物接受一次肿瘤内给药，所给为缓冲液(动物数n为8，肿瘤体积为919mm³)或1.5×10¹¹个CN73 3颗粒(n为8，体积为944mm³)。第三组动物连续5天每天接受1.5×10¹¹个CN733颗粒(n为8，体积为867mm³)。尽管小鼠全身有大量病毒，但小鼠未显示明显的毒性。注射后4周内每周用外用测径规测量肿瘤。接受一剂CN733和缓冲液的动物在处理后4周杀死，因为它们的肿瘤负载过大。接受5剂CN733的所有动物一直存活到研究结束。尽管这些动物全身有大量病毒，但它们并未显示治疗相关性毒性的明显特征。结果示于图10(B)。就平均水平而言，缓冲液处理组的肿瘤在处理后4周时比原体积增大了3倍。一剂CN733处理的肿瘤比原体积增大了近4倍。相比之下，5剂CN733处理的肿瘤仍保持原体积。8只小鼠中有5只(63％)的肿瘤对治疗有反应。有一只小鼠在研究结束时已没有可触摸的肿瘤。

Student T一检验的统计分析暗示缓冲液处理组动物与一剂CN733处理组动物在任何时间点均无显著性差异(p＞0.5)。然而，缓冲液处理组与5剂CN733处理组之间从注射后2周时开始有显著性差异(p＝0.045)，并持续整个4周(p＝0.034)。

数据暗示CN733对HepG2裸鼠异种移植物有明显抗肿瘤活性。连续5天每天给予1.5×10¹¹个CN733颗粒在部分动物体内可使肿瘤退化，订??剂量不足以杀伤肿瘤。

在第一个实验中，肿瘤对一剂CN733有反应，但第二个实验中没有。发明人注意到不同实验中的肿瘤表型(包括生长特点和AFP表达)经常变化。

总之，体内实验暗示CN733在较大肝癌异种移植物中具有显著的肿瘤杀伤力。5次肿瘤内给予病毒，致使8只动物中有4只肿瘤退化，注射后28天，1只痊愈。缓冲液处理组肿瘤平均增大3倍，而CN733处理组肿瘤保持原样。

实施例5：构建含腺病毒死亡蛋白(ADP)编码区的腺病毒载体

在AFP特异性病毒载体CN733(如实施例1所述)中，于E3区内产生一个缺失，以便在E1区中插入AFP-TRE。将Ad2的ADP编码序列重新导入Ad5的E3区内，如下：

用重叠PCR构建ADP盒。用PCR扩增Y前导序列，这是某些晚期基因正确表达所需的重要序列，所用引物如下：

5’GCCTTAATTAAAAGCAAACCTCACCTCCG...Ad2 28287bp(37.124.1)(SEQ ID NO：16)；和

5’GTGGAACAAAAGGTGATTAAAAAATCCCAG...Ad2 28622bp(37.146.1)(SEQ ID NO：17).

经PCR扩增ADP编码区，所用引物为：

5’CACCTTTTGTTCCACCGCTCTGCTTATTAC...Ad2 29195bp(37.124.3)(SEQ ID NO：18)和

5’GGCTTAATTAACTGTGAAAGGTGGGAGC...Ad2 29872bp(37.124.4)(SEQID NO：19).

将两片段退火，重叠产物用引物37.124.1和37.124.4经PCR扩增。产物的末端用Klenow片段补齐，并连接至经BamHI切割的pGEM-72(+)(CN241；Promega，Madison，WI)中。用PacI限制性核酸内切酶消化CN241，切出ADP盒，分别与载体CN247和CN248连接，产生质粒CN252和CN270。CN247在E3区内包含唯一的PacI位点，是按如下构建的。含全长Ad5基因组的质粒TG3602(Transgene，法国)经BamHI酶解并再连接产生CN221。该质粒的骨架(Ad5序列外)所含PacI位点需去除以便于完成后续操作。这只需用PacI酶解CN221，再用T4 DNA聚合酶补齐末端便可，结果产生CN246。用AscI酶和AvrII酶解CN246(以去除完整的E3区)。由来自BHG11的相似酶切片段取代该片段。由此产生的质粒CN247包含缺失的E3区和一个适于插入ADP盒片段(上述)的PacI位点。CN247连接ADP盒即产生CN252。

CN248(该构建体允许将ADP盒导入Ad，该ADP盒包含一个E4区内的缺失/取代)制备如下。用AvrII和AflII酶解CN108[该构建体包含从E3区内的唯一EcoRI位点开始的Ad5右末端序列(来自BHG10)]，造成E4区缺失。通过用下述引物PCR扩增ORF，重新导入病毒复制唯一所需的E4 ORF，即ORF6：

33.81.1(Ad5 33096)：

GCAGCTCACTTAAGTTCATGTCG(SEQ ID NO：20)

33.81.2(Ad5 34084)：

TCAGCCTAGGAAATATGACTACGTCCG(SEQ ID NO：21)

产生的质粒为CN203。CN203经EcoRI酶解再与穿梭质粒CN209连接产生CN208。在最后的克隆步骤中，CN208经AscI和AvrII酶解，并与相似切割的E4缺失/取代及ADP盒连接。

CN252和CN270均包含E3缺失。此外，如前文所述，CN270还在E4区缺乏某些序列。将(1)经BamHI酶解的适当制备的病毒DNA和(2)也经BamHI酶解的CN252或CN257体外连接，得到腺病毒载体。连接产物用于转染293细胞。如实施例1所述进行噬斑试验。

实施例6：对包含腺病毒死亡蛋白基因的E3缺失腺病毒CN571 的鉴定

构建腺病毒死亡蛋白突变体CN751，以检验该构建体是否有更强的细胞毒性。腺病毒死亡蛋白(ADP)为一种11.6KD的Asn糖基化膜内在肽，在病毒感染的晚期高水平表达，它可迁移至被感染细胞的核膜，造成宿主的高效裂解。腺病毒5(Ad5)E3区表达adp基因。

CN751的构建

CN751的构建分两部分。首先产生E3缺失的质粒，内含Ad5从21562位BamHI位点开始的3’端序列。将Ad2的adp插入此质粒中E3区的剩余部分内，产生CN252(该克隆步骤已由前述)。为构建第二部分，用EcoRI酶解纯化的CN702 DNA，经凝胶抽提分离其左末端片段，得到CN751所必需的5’Ad5序列。用EcoRI酶解CN252后，将CN702的左端片段与CN252连接。用此连接混合物以脂转染法转染293细胞，在37℃温育。10天后收获细胞，冻融三次，上清铺于293单层细胞上。挑取单个噬斑用于感染293单层细胞以产生足够的病毒进行检验。几天后，用基于PCR的试验筛选平板裂解产物，以检测候选病毒。其中一个阳性噬斑命名为CN751。

CN751的结构鉴定

CN751的结构用两种方法证实。一种方法是用引物37.124.1(5’GCCTTAATTAAAAGCAAACCTCACCTCCG Ad2 28287bp；SEQ IDNO：16)和37.124.4(5’GGCTTAATTAACTGTGAAAGGTGGGCTGC Ad229872bp；SEQ ID NO：19)经PCR筛选候选病毒，以检测adp盒的存在。CN751产生的一段延伸片段与预期产物一致(1065bp)。另一种方法是用Southern印迹分析CN751。病毒DNA经纯化、用PacI、SacI和AccI/XhoI酶解，并用同源于ADP编码区的一个序列探测。CN751的结构符合预想的模式。

体外定性CN751

用两个实验检查CN751的细胞毒性和病毒产量。第一个实验中，评估CN751在LNCaP细胞中的细胞毒性，方法是收集培养数天的上清，测量一种胞质酶-乳酸脱氢酶(LDH)的累积。胞外LDH水平与细胞裂解的程度相关。健康细胞释放酶量很少(若有的话)，而死亡细胞释放量非常大。选LDH作标志是因为它很稳定，也易于用简单方法进行检测。比较CN751与CN702(一种缺ADP基因的载体)和Rec 700(一种含ADP基因的载体)的细胞致死能力。

以MOI 1用CN702或Rec 700(adp+对照)或CN751感染单层LNCaP细胞，然后将细胞接种96孔板。从感染后1天至5天每天收获样品一次，用Promega的Cytotox 96试剂盒评价。该试验用到一个酶偶联反应，其中将一种四唑鎓盐转化为一种红色甲臜(formazan)产物，该产物可在平板读数仪上于490nm处读数。

因样品的吸收率对应于受染细胞释放的LDH水平，显示样品吸收值如何随时间变化的图表描述了所研究的病毒是如何有效地诱导细胞裂解的(图12)。每个数据点代表16份不同样品的平均值。结果暗示CN751的杀细胞效率高于CN702(adp-对照)，而类似于Rec 700(adp+对照)。CN751感染孔内的上清中LDH浓度从感染的2天后迅速增加，在4天后达到最高峰。相比之下，CN702感染细胞的上清中LDH浓度从2天后开始缓慢升高，持续至实验结束。很明显，CN751感染细胞的LDH释放量在3天后是CN702感染细胞释放量的2倍。这些数据显示，带ADP基因的腺病毒载体比缺ADP基因的腺病毒载体能更有效地杀细胞。

Ad载体不仅对有效杀细胞很重要，而且能产生会感染其他癌细胞的子代。可产生大量病毒的病毒载体比只能产生少量病毒的载体作为药物可能更有效。用病毒产生试验评价CN751能否诱导其子代从受感染细胞中有效释放。以MOI为5感染A549细胞。感染后不同时间收获上清，在293细胞上测定滴度，以确定病毒产量(图13)。数据暗示CN751感染细胞比CN702感染细胞能更有效地释放病毒。感染后48小时，CN751感染细胞释放病毒量比CN702感染细胞高10倍。感染后72小时，CN751感染细胞的病毒释放量多40倍。总之，病毒产量的数据证实含ADP基因的腺病毒载体释放更多的病毒。

CN751的体内鉴定

LNCaP裸鼠异种移植物用CN751(含ADP基因的载体)或CN702(缺该基因的载体)单剂量肿瘤内攻击1次(1×10⁴个病毒颗粒/mm³肿瘤)。第三组肿瘤只用缓冲液处理。连续六周每周监控肿瘤一次，将其相对体积对时间作图。结果示于图14。误差条代表每个样品组的标准误差。CN751处理动物(n为14)的起始平均肿瘤体积为320mm³，CN702处理组(n＝14)为322mm³，缓冲液处理组(n＝8)为343mm³。数据暗示CN751比CN702能更有效杀伤肿瘤细胞。总的说来，CN751攻击的肿瘤在实验全过程中体积不变，而14个肿瘤有9个(64％)退化。CN702处理组的肿瘤体积增至两倍大。缓冲液处理组的肿瘤长至起始体积的近5倍。Student T-检验显示CN751处理组与CN702处理组之间肿瘤大小的差异自实验的第9天(p＝0.016)开始直至实验结束(p＝0.003)时有统计学显著性。

实施例7：制备共价PEG化的腺病毒

用一系列实验，通过与PEG复合，改变腺病毒的表面衣壳。用PEG复合作用掩盖腺病毒表面的目的有：1)循环中存在的腺病毒中和抗体或调理素；2)通过降低体内的非特异性清除机制(即巨噬细胞等)，增加腺病毒颗粒的全身循环时间。

通过用N-羟基琥珀酰亚胺基琥珀酰胺(NHS)使PEG与病毒六邻体和尾丝蛋白共价结合，对野生型腺病毒CN706的表面衣壳进行修饰。PEG(Shearwater Polymers公司)的标称分子量为5000Da。将活化的PEG(约2mM)与于Tris-HCl缓冲液中的5×10⁹个腺病毒颗粒/ml反应(病毒颗粒与PEG的近似摩尔比为1∶4×10⁶)。使用pH、温度、反应时间的不同组合形式。反应完成后，在Q SepharoseXL(Pharmacia)层析柱上经阴离子交换层析分离未反应的活化PEG、未反应的腺病毒和PEG化腺病毒，层析液为50mM Tris，pH8.0中的0至1.5M的NaCl梯度。用此梯度层析10个柱体积以上。

PEG-CN706的鉴定

CN706的PEG化结果用SDS-PAGE检验。图16描述了CN706的PEG化作用，以及PEG化蛋白的迁移率变化。泳道1和2为未PEG化的CN706(对照)，泳道3至6为不同pH和温度条件下PEG化的CN706。泳道3至6显示CN706的六邻体蛋白上有第二条带出现，很可能是PEG化六邻体，并失去了尾丝蛋白带。因除了对应于PEG-六邻体蛋白条带外不再有其它与病毒有关的条带，故推测PEG化尾丝蛋白在SDS凝胶上处在非PEG化蛋白条带中。

图17是离子交换层析图谱，显示CN706表面特点的改变。CN706的PEG化使它较早地从用于捕捉病毒的Q Sepharose树脂中洗脱出来。这一结果很可能是由于PEG使病毒更显中性，从而降低了它结合离子交换基质的能力。预计病毒层析图谱会变宽，因为CN706可能发生不同百分比程度的PEG化。

PEG化CN706的感染能力的评估在293细胞上于体外噬斑试验中进行。表7描述了PEG-CN706的噬斑形成能力比CN706低5至10倍。这很可能归因于PEG化掩盖了病毒细胞，减弱了对病毒颗粒的识别和内吞作用。

表7 CN706和PEG-CN706的噬斑形成能力的比较

样品描述噬斑数(任意单位)

CN706 15±5

PEG-CN706 4±1

尽管为便于清楚理解，已通过图示和实施例对上述发明进行了详细描述，但对本领域的技术人员而言，很明显还可作一些改变和修饰。故这些描述和实施例均不应理解为限制本发明的范围，此范围由所附权利要求书描述。

序列表

(1)一般资料：

(i)申请人：Little，Andrew

Lamparski，Henry

Schuur，Eric

Henderson，Daniel

(ii)发明题目：特异于表达甲胎蛋白之细胞的腺病毒载体及其使用方法

(iii)序列数：23

(iv)通讯地址：

(A)收件人：MORRISON&FOERSTER

(B)街道：755 PAGE MILL ROAD

(C)城市：PALO ALTO

(D)州：CA

(E)国家：美国

(F)邮政编码：94304-1018

(v)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC可兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30

(vi)目前的申请资料：

(A)申请号：

(B)申请日：

(C)分类号：

(viii)代理人/代理资料：

(A)姓名：POLIZZI，CATHERINE M.

(B)登记号：40，130

(C)资料/文档号：34802-30004.00

(ix)通讯资料：

(A)电话：(415)813-5600

(B)传真：(415)494-0792

(C)电报：706141 MRSNFOERS SFO

(2)SEQ ID NO：1的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：822个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

GCATTGCTGT GAACTCTGTA CTTAGGACTA AACTTTGAGC AATAACACAC ATAGATTGAG 60

GATTGTTTGC TGTTAGCATA CAAACTCTGG TTCAAAGCTC CTCTTTATTG CTTGTCTTGG 120

AAAATTTGCT GTTCTTCATG GTTTCTCTTT TCACTGCTAT CTATTTTTCT CAACCACTCA 180

CATGGCTACA ATAACTGTCT GCAAGCTTAT GATTCCCAAA TATCTATCTC TAGCCTCAAT 240

CTTGTTCCAG AAGATAAAAA GTAGTATTCA AATGCACATC AACGTCTCCA CTTGGAGGGC 300

TTAAAGACGT TTCAACATAC AAACCGGGGA GTTTTGCCTG GAATGTTTCC TAAAATGTGT 360

CCTGTAGCAC ATAGGGTCCT CTTGTTCCTT AAAATCTAAT TACTTTTAGC CCAGTGCTCA 420

TCCCACCTAT GGGGAGATGA GAGTGAAAAG GGAGCCTGAT TAATAATTAC ACTAAGTCAA 480

TAGGCATAGA GCCAGGACTG TTTGGGTAAA CTGGTCACTT TATCTTAAAC TAAATATATC 540

CAAAACTGAA CATGTACTTA GTTACTAAGT CTTTGACTTT ATCTCATTCA TACCACTCAG 600

CTTTATCCAG GCCACTTATG AGCTCTGTGT CCTTGAACAT AAAATACAAA TAACCGCTAT 660

GCTGTTAATT ATTGGCAAAT GTCCCATTTT CAACCTAAGG AAATACCATA AAGTAACAGA 720

TATACCAACA AAAGGTTACT AGTTAACAGG CATTGCCTGA AAAGAGTATA AAAGAATTTC 780

AGCATGATTT TCCATATTGT GCTTCCACCA CTGCCAATAA CA 822

(2)SEQ ID NO：2的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：5224个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

GAATTCTTAG AAATATGGGG GTAGGGGTGG TGGTGGTAAT TCTGTTTTCA CCCCATAGGT 60

GAGATAAGCA TTGGGTTAAA TGTGCTTTCA CACACACATC ACATTTCATA AGAATTAAGG 120

AACAGACTAT GGGCTGGAGG ACTTTGAGGA TGTCTGTCTC ATAACACTTG GGTTGTATCT 180

GTTCTATGGG GCTTGTTTTA AGCTTGGCAA CTTGCAACAG GGTTCACTGA CTTTCTCCCC 240

AAGCCCAAGG TACTGTCCTC TTTTCATATC TGTTTTGGGG CCTCTGGGGC TTGAATATCT 300

GAGAAAATAT AAACATTTCA ATAATGTTCT GTGGTGAGAT GAGTATGAGA GATGTGTCAT 360

TCATTTGTAT CAATGAATGA ATGAGGACAA TTAGTGTATA AATCCTTAGT ACAACAATCT 420

GAGGGTAGGG GTGGTACTAT TCAATTTCTA TTTATAAAGA TACTTATTTC TATTTATTTA 480

TGCTTGTGAC AAATGTTTTG TTCGGGACCA CAGGAATCAC AAAGATGAGT CTTTGAATTT 540

AAGAAGTTAA TGGTCCAGGA ATAATTACAT AGCTTACAAA TGACTATGAT ATACCATCAA 600

ACAAGAGGTT CCATGAGAAA ATAATCTGAA AGGTTTAATA AGTTGTCAAA GGTGAGAGGG 660

CTCTTCTCTA GCTAGAGACT AATCAGAAAT ACATTCAGGG ATAATTATTT GAATAGACCT 720

TAAGGGTTGG GTACATTTTG TTCAAGCATT GATGGAGAAG GAGAGTGAAT ATTTGAAAAC 780

ATTTTCAACT AACCAACCAC CCAATCCAAC AAACAAAAAA TGAAAAGAAT CTCAGAAACA 840

GTGAGATAAG AGAAGGAATT TTCTCACAAC CCACACGTAT AGCTCAACTG CTCTGAAGAA 900

GTATATATCT AATATTTAAC ACTAACATCA TGCTAATAAT GATAATAATT ACTGTCATTT 960

TTTAATGTCT ATAAGTACCA GGCATTTAGA AGATATTATT CCATTTATAT ATCAAAATAA 1020

ACTTGAGGGG ATAGATCATT TTCATGATAT ATGAGAAAAA TTAAAAACAG ATTGAATTAT 1080

TTGCCTGTCA TACAGCTAAT AATTGACCAT AAGACAATTA GATTTAAATT AGTTTTGAAT 1140

CTTTCTAATA CCAAAGTTCA GTTTACTGTT CCATGTTGCT TCTGAGTGGC TTCACAGACT 1200

TATGAAAAAG TAAACGGAAT CAGAATTACA TCAATGCAAA AGCATTGCTG TGAACTCTGT 1260

ACTTAGGACT AAACTTTGAG CAATAACACA CATAGATTGA GGATTGTTTG CTGTTAGCAT 1320

ACAAACTCTG GTTCAAAGCT CCTCTTTATT GCTTGTCTTG GAAAATTTGC TGTTCTTCAT 1380

GGTTTCTCTT TTCACTGCTA TCTATTTTTC TCAACCACTC ACATGGCTAC AATAACTGTC 1440

TGCAAGCTTA TGATTCCCAA ATATCTATCT CTAGCCTCAA TCTTGTTCCA GAAGATAAAA 1500

AGTAGTATTC AAATGCACAT CAACGTCTCC ACTTGGAGGG CTTAAAGACG TTTCAACATA 1560

CAAACCGGGG AGTTTTGCCT GGAATGTTTC CTAAAATGTG TCCTGTAGCA CATAGGGTCC 1620

TCTTGTTCCT TAAAATCTAA TTACTTTTAG CCCAGTGCTC ATCCCACCTA TGGGGAGATG 1680

AGAGTGAAAA GGGAGCCTGA TTAATAATTA CACTAAGTCA ATAGGCATAG AGCCAGGACT 1740

GTTTGGGTAA ACTGGTCACT TTATCTTAAA CTAAATATAT CCAAAACTGA ACATGTACTT 1800

AGTTACTAAG TCTTTGACTT TATCTCATTC ATACCACTCA GCTTTATCCA GGCCACTTAT 1860

TTGACAGTAT TATTGCGAAA ACTTCCTAAC TGGTCTCCTT ATCATAGTCT TATCCCCTTT 1920

TGAAACAAAA GAGACAGTTT CAAAATACAA ATATGATTTT TATTAGCTCC CTTTTGTTGT 1980

CTATAATAGT CCCAGAAGGA GTTATAAACT CCATTTAAAA AGTCTTTGAG ATGTGGCCCT 2040

TGCCAACTTT GCCAGGAATT CCCAATATCT AGTATTTTCT ACTATTAAAC TTTGTGCCTC 2100

TTCAAAACTG CATTTTCTCT CATTCCCTAA GTGTGCATTG TTTTCCCTTA CCGGTTGGTT 2160

TTTCCACCAC CTTTTACATT TTCCTGGAAC ACTATACCCT CCCTCTTCAT TTGGCCCACC 2220

TCTAATTTTC TTTCAGATCT CCATGAAGAT GTTACTTCCT CCAGGAAGCC TTATCTGACC 2280

CCTCCAAAGA TGTCATGAGT TCCTCTTTTC ATTCTACTAA TCACAGCATC CATCACACCA 2340

TGTTGTGATT ACTGATACTA TTGTCTGTTT CTCTGATTAG GCAGTAAGCT CAACAAGAGC 2400

TACATGGTGC CTGTCTCTTG TTGCTGATTA TTCCCATCCA AAAACAGTGC CTGGAATGCA 2460

GACTTAACAT TTTATTGAAT GAATAAATAA AACCCCATCT ATCGAGTGCT ACTTTGTGCA 2520

AGACCCGGTT CTGAGGCATT TATATTTATT GATTTATTTA ATTCTCATTT AACCATGAAG 2580

GAGGTACTAT CACTATCCTT ATTTTATAGT TGATAAAGAT AAAGCCCAGA GAAATGAATT 2640

AACTCACCCA AAGTCATGTA GCTAAGTGAC AGGGCAAAAA TTCAAACCAG TTCCCCAACT 2700

TTACGTGATT AATACTGTGC TATACTGCCT CTCTGATCAT ATGGCATGGA ATGCAGACAT 2760

CTGCTCCGTA AGGCAGAATA TGGAAGGAGA TTGGAGGATG ACACAAAACC AGCATAATAT 2820

CAGAGGAAAA GTCCAAACAG GACCTGAACT GATAGAAAAG TTGTTACTCC TGGTGTAGTC 2880

GCATCGACAT CTTGATGAAC TGGTGGCTGA CACAACATAC ATTGGCTTGA TGTGTACATA 2940

TTATTTGTAG TTGTGTGTGT ATTTTTATAT ATATATTTGT AATATTGAAA TAGTCATAAT 3000

TTACTAAAGG CCTACCATTT GCCAGGCATT TTTACATTTG TCCCCTCTAA TCTTTTGATG 3060

AGATGATCAG ATTGGATTAC TTGGCCTTGA AGATGATATA TCTACATCTA TATCTATATC 3120

TATATCTATA TCTATATCTA TATCTATATC TATATCTATA TATGTATATC AGAAAAGCTG 3180

AAATATGTTT TGTAAAGTTA TAAAGATTTC AGACTTTATA GAATCTGGGA TTTGCCAAAT 3240

GTAACCCCTT TCTCTACATT AAACCCATGT TGGAACAAAT ACATTTATTA TTCATTCATC 3300

AAATGTTGCT GAGTCCTGGC TATGAACCAG ACACTGTGAA AGCCTTTGGG ATATTTTGCC 3360

CATGCTTGGG CAAGCTTATA TAGTTTGCTT CATAAAACTC TATTTCAGTT CTTCATAACT 3420

AATACTTCAT GACTATTGCT TTTCAGGTAT TCCTTCATAA CAAATACTTT GGCTTTCATA 3480

TATTTGAGTA AAGTCCCCCT TGAGGAAGAG TAGAAGAACT GCACTTTGTA AATACTATCC 3540

TGGAATCCAA ACGGATAGAC AAGGATGGTG CTACCTCTTT CTGGAGAGTA CGTGAGCAAG 3600

GCCTGTTTTG TTAACATGTT CCTTAGGAGA CAAAACTTAG GAGAGACACG CATAGCAGAA 3660

AATGGACAAA AACTAACAAA TGAATGGGAA TTGTACTTGA TTAGCATTGA AGACCTTGTT 3720

TATACTATGA TAAATGTTTG TATTTGCTGG AAGTGCTACT GACGGTAAAC CCTTTTTGTT 3780

TAAATGTGTG CCCTAGTAGC TTGCAGTATG ATCTATTTTT TAAGTACTGT ACTTAGCTTA 3840

TTTAAAAATT TTATGTTTAA AATTGCATAG TGCTCTTTCA TTGAAGAAGT TTTGAGAGAG 3900

AGATAGAATT AAATTCACTT ATCTTACCAT CTAGAGAAAC CCAATGTTAA AACTTTGTTG 3960

TCCATTATTT CTGTCTTTTA TTCAACATTT TTTTTAGAGG GTGGGAGGAA TACAGAGGAG 4020

GTACAATGAT ACACAAATGA GAGCACTCTC CATGTATTGT TTTGTCCTGT TTTTCAGTTA 4080

ACAATATATT ATGAGCATAT TTCCATTTCA TTAAATATTC TTCCACAAAG TTATTTTGAT 4140

GGCTGTATAT CACCCTACTT TATGAATGTA CCATATTAAT TTATTTCCTG GTGTGGGTTA 4200

TTTGATTTTA TAATCTTACC TTTAGAATAA TGAAACACCT GTGAAGCTTT AGAAAATACT 4260

GGTGCCTGGG TCTCAACTCC ACAGATTCTG ATTTAACTGG TCTGGGTTAC AGACTAGGCA 4320

TTGGGAATTC AAAAAGTTCC CCCAGTGATT CTAATGTGTA GCCAAGATCG GGAACCCTTG 4380

TAGACAGGGA TGATAGGAGG TGAGCCACTC TTAGCATCCA TCATTTAGTA TTAACATCAT 4440

CATCTTGAGT TGCTAAGTGA ATGATGCACC TGACCCACTT TATAAAGACA CATGTGCAAA 4500

TAAAATTATT ATAGGACTTG GTTTATTAGG GCTTGTGCTC TAAGTTTTCT ATGTTAAGCC 4560

ATACATCGCA TACTAAATAC TTTAAAATGT ACCTTATTGA CATACATATT AAGTGAAAAG 4620

TGTTTCTGAG CTAAACAATG ACAGCATAAT TATCAAGCAA TGATAATTTG AAATGAATTT 4680

ATTATTCTGC AACTTAGGGA CAAGTCATCT CTCTGAATTT TTTGTACTTT GAGAGTATTT 4740

GTTATATTTG CAAGATGAAG AGTCTGAATT GGTCAGACAA TGTCTTGTGT GCCTGGCATA 4800

TGATAGGCAT TTAATAGTTT TAAAGAATTA ATGTATTTAG ATGAATTGCA TACCAAATCT 4860

GCTGTCTTTT CTTTATGGCT TCATTAACTT AATTTGAGAG AAATTAATTA TTCTGCAACT 4920

TAGGGACAAG TCATGTCTTT GAATATTCTG TAGTTTGAGG AGAATATTTG TTATATTTGC 4980

AAAATAAAAT AAGTTTGCAA GTTTTTTTTT TCTGCCCCAA AGAGCTCTGT GTCCTTGAAC 5040

ATAAAATACA AATAACCGCT ATGCTGTTAA TTATTGGCAA ATGTCCCATT TTCAACCTAA 5100

GGAAATACCA TAAAGTAACA GATATACCAA CAAAAGGTTA CTAGTTAACA GGCATTGCCT 5160

GAAAAGAGTA TAAAAGAATT TCAGCATGAT TTTCCATATT GTGCTTCCAC CACTGCCAAT 5220

AACA 5224

(2)SEQ ID NO：3的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：19个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

TCGTCTTCAA GAATTCTCA 19

(2)SEQ ID NO：4的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

TTTCAGTCAC CGGTGTCGGA 20

(2)SEQ ID NO：5的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

GCATTCTCTA GACACAGGTG 20

(2)SEQ ID NO：6的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

TCCGACACCG GTGACTGAAA 20

(2)SEQ ID NO：7的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：21个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

GCCCACGGCC GCATTATATA C 21

(2)SEQ ID NO：8的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：21个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

GTATATAATG CGGCCGTGGG C 21

(2)SEQ ID NO：9的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：21个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：

CCAGAAAATC CAGCAGGTAC C 21

(2)SEQ ID NO：10的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：

GTGACCGGTGCATTGCTGTGAACTCTGTA 29

(2)SEQ ID NO：11的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：

ATAAGTGGCCTGGATAAAGCTGAGTGG 27

(2)SEQ ID NO：12的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：28个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：

GTCACCGGTC TTTGTTATTG GCAGTGGT 28

(2)SEQ ID NO：13的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：

ATCCAGGCCA CTTATGAGCT CTGTGTCCTT 30

(2)SEQ ID NO：14的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：26个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：

TATCGGCCGG CATTGCTGTG AACTCT 26

(2)SEQ ID NO：15的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：26个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：

TTACGGCCGC TTTGTTATTG GCAGTG 26

(2)SEQ ID NO：16的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：

GCCTTAATTA AAAGCAAACC TCACCTCCG 29

(2)SEQ ID NO：17的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：

GTGGAACAAA AGGTGATTAA AAAATCCCAG 30

(2)SEQ ID NO：18的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：

CACCTTTTGT TCCACCGCTC TGCTTATTAC 30

(2)SEQ ID NO：19的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：28个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：

GGCTTAATTA ACTGTGAAAG GTGGGAGC 28

(2)SEQ ID NO：20的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：

GCAGCTCACT TAAGTTCATG TCG 23

(2)SEQ ID NO：21的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：

TCAGCCTAGGAAATATGACTACGTCCG 27

(2)SEQ ID NO：22的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：307个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：2..304

(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：

G ATG ACC GGC TCA ACC ATC GCG CCC ACA ACG GAC TAT CGC AAC ACC 46

Met Thr Gly Ser Thr Ile Ala Pro Thr Thr Asp Tyr Arg Asn Thr

1 5 10 15

ACT GCT ACC GGA CTA ACA TCT GCC CTA AAT TTA CCC CAA GTT CAT GCC 94

Thr Ala Thr Gly Leu Thr Ser Ala Leu Asn Leu Pro Gln Val His Ala

20 25 30

TTT GTC AAT GAC TGG GCG AGC TTG GAC ATG TGG TGG TTT TCC ATA GCG 142

Phe Val Asn Asp Trp Ala Ser Leu Asp Met Trp Trp Phe Ser Ile Ala

35 40 45

CTT ATG TTT GTT TGC CTT ATT ATT ATG TGG CTT ATT TGT TGC CTA AAG 190

Leu Met Phe Val Cys Leu Ile Ile Met Trp Leu Ile Cys Cys Leu Lys

50 55 60

CGC AGA CGC GCC AGA CCC CCC ATC TAT AGG CCT ATC ATT GTG CTC AAC 238

Arg Arg Arg Ala Arg Pro Pro Ile Tyr Arg Pro Ile Ile Val Leu Asn

65 70 75

CCA CAC AAT GAA AAA ATT CAT AGA TTG GAC GGT CTG AAA CCA TGT TCT 286

Pro His Asn Glu Lys Ile His Arg Leu Asp Gly Leu Lys Pro Cys Ser

80 85 90 95

CTT CTT TTA CAG TAT GAT TAA 307

Leu Leu Leu Gln Tyr Asp

100

(2)SEQ ID NO：23的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：101个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：

Met Thr Gly Ser Thr Ile Ala Pro Thr Thr Asp Tyr Arg Asn Thr Thr

1 5 10 15

Ala Thr Gly Leu Thr Ser Ala Leu Asn Leu Pro Gln Val His Ala Phe

20 25 30

Val Asn Asp Trp Ala Ser Leu Asp Met Trp Trp Phe Ser Ile Ala Leu

35 40 45

Met Phe Val Cys Leu Ile Ile Met Trp Leu Ile Cys Cys Leu Lys Arg

50 55 60

Arg Arg Ala Arg Pro Pro Ile Tyr Arg Pro Ile Ile Val Leu Asn Pro

65 70 75 80

His Asn Glu Lys Ile His Arg Leu Asp Gly Leu Lys Pro Cys Ser Leu

85 90 95

Leu Leu Gln Tyr Asp

100

Claims

1.一种能复制的腺病毒载体，所述载体含有受甲胎蛋白转录调节元件之转录控制的病毒复制所必需的第一个和第二个腺病毒基因，其中所述第一个腺病毒基因在第一个甲胎蛋白转录调节元件的控制之下，所述第二个腺病毒基因在第二个甲胎蛋白转录调节元件的控制之下，其中所述甲胎蛋白转录调节元件是相同的或不同的。

2.权利要求1的腺病毒载体，其中病毒复制所必需的每个所述腺病毒基因是早期基因或晚期基因。

3.权利要求2的腺病毒载体，其中所述腺病毒基因是E1A、E1B、E4或腺病毒死亡蛋白基因。

4.权利要求1-3中任一项的腺病毒载体，其中病毒复制所必需的所述腺病毒基因在相同的甲胎蛋白转录调节元件控制之下。

5.权利要求1-3中任一项的腺病毒载体，其中病毒复制所必需的每一所述腺病毒基因在不同的甲胎蛋白转录调节元件控制之下。

6.权利要求1-3中任一项的腺病毒载体，其中至少一种甲胎蛋白转录调控元件含有AFP基因的增强子。

7.权利要求6的腺病毒载体，其中所述增强子含有SEQ ID NO：1之+1至+300位的核苷酸。

8.权利要求6的腺病毒载体，其中所述增强子含有SEQ ID NO：1之+300至+600位的核苷酸。

9.权利要求6的腺病毒载体，其中所述增强子含有SEQ ID NO：1之+1至+600位的核苷酸。

10.权利要求1-3中任一项的腺病毒载体，其中至少一个甲胎蛋白转录调节元件含有AFP基因的启动子。

11.权利要求10的腺病毒载体，其中所述启动子含有SEQ ID NO：1之+600至+827位的核苷酸。

12.权利要求1-3中任一项的腺病毒载体，其中至少一个甲胎蛋白转录调节元件含有AFP启动子和AFP增强子。

13.权利要求12的腺病毒载体，其中所述甲胎蛋白转录调节元件含有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。

14.权利要求1-3中任一项的腺病毒载体，还含有第三个甲胎蛋白转录调节元件转录控制下的额外的腺病毒基因。

15.权利要求14的腺病毒载体，其中受转录控制的所述腺病毒基因是E1A，E1B和E4。

16.含有权利要求1-15中任一项所述腺病毒载体和药物学上可接受的赋形剂的组合物。

17.含有权利要求1-15中任一项所述腺病毒载体的宿主细胞。

18.特异于允许甲胎蛋白转录调节元件起作用的细胞增殖腺病毒的体外方法，所述方法包括将权利要求1-15中任一项所述的腺病毒与允许甲胎蛋白转录调节元件起作用的细胞混合，籍此增殖所述腺病毒。

19.权利要求1-15中任一项的腺病毒载体在制备可用于治疗具有表达甲胎蛋白之肿瘤的个体中的癌症或肿瘤的药物中的用途。

20.含有权利要求1-15中任一项的腺病毒载体的腺病毒，其中腺病毒与掩蔽剂复合。

21.权利要求20的腺病毒，其中掩蔽剂是聚乙二醇，并且与腺病毒共价或非共价结合。

22.权利要求21的腺病毒，其中聚乙二醇的分子量为2500至30,000。

23.权利要求21的腺病毒，其中聚乙二醇的分子量为3000至20,000。

24.权利要求21的腺病毒，其中聚乙二醇的分子量为5000至10,000。

25.权利要求21-24中任一项的腺病毒，其中聚乙二醇是通过使用N-羟基琥珀酰亚胺基活性酯而共价结合的。

26.权利要求25的腺病毒，其中N-羟基琥珀酰亚胺基活性酯选自琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺和琥珀酰亚胺基丙酸酯。

27.权利要求25的腺病毒，其中N-羟基琥珀酰亚胺基活性酯是琥珀酰亚胺基琥珀酸酯。