JP2686819B2 - α―フェトプロテイン遺伝子のエンハンサーに結合する蛋白質をコードするＤＮＡ - Google Patents
α―フェトプロテイン遺伝子のエンハンサーに結合する蛋白質をコードするＤＮＡInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、α−フェトプロティンエンハンサーに特異
的に結合し、該α−フェトプロティン遺伝子の転写を促
進させる蛋白質をコードするDNAに関する。
的に結合し、該α−フェトプロティン遺伝子の転写を促
進させる蛋白質をコードするDNAに関する。
このDNAは動物細胞における遺伝子の大量発現系に有
用である。
用である。
従来技術 真核細胞の遺伝情報の調節は、転写（transcriptio
n）RNAプロセッシング（processing）蛋白質への翻訳及
び翻訳後のプロセッシングの各段階で行われているが、
このうち転写レベルでの調節は遺伝情報の発現に最も強
い影響を及ぼしている。
n）RNAプロセッシング（processing）蛋白質への翻訳及
び翻訳後のプロセッシングの各段階で行われているが、
このうち転写レベルでの調節は遺伝情報の発現に最も強
い影響を及ぼしている。
ところで、RNAポリメラーゼIIによって転写される遺
伝子の５′側には転写を制御するプロモーター及びプロ
モーター活性を調節するエンハンサーが存在する例もみ
られる。そして、最近、これらプロモーターやエンハン
サーの特異的な塩基配列を認識して結合する核内因子が
発見され、これらの因子の結合によりプロモーターの活
性が制御されることが明らかとなった。
伝子の５′側には転写を制御するプロモーター及びプロ
モーター活性を調節するエンハンサーが存在する例もみ
られる。そして、最近、これらプロモーターやエンハン
サーの特異的な塩基配列を認識して結合する核内因子が
発見され、これらの因子の結合によりプロモーターの活
性が制御されることが明らかとなった。
上記因子に関しては、プロモーター領域に存在するTA
TAボックス、CAATボックス、GCボックスに結合し、RNA
ポリメラーゼIIによる転写を促進させる蛋白質の研究が
進められており、CAATボックス結合因子とGCボックス結
合因子に関してはcDNAがクローニングされている。
TAボックス、CAATボックス、GCボックスに結合し、RNA
ポリメラーゼIIによる転写を促進させる蛋白質の研究が
進められており、CAATボックス結合因子とGCボックス結
合因子に関してはcDNAがクローニングされている。
一方、エンハンサー領域に結合する因子についても研
究が行われており、例えば、免疫グロブリンのκ鎖遺伝
子エンハンサーに結合するＢ細胞の特異的な因子OTF−
２（Octamer transcription factor−２）〔Michael et
al.「ネイチャー（Nature）」366,544−551,（198
8）〕や同一エンハンサー配列を認識するが他の組織に
も汎在するOTF−１等〔R.A.Sturm.、G.Das and W.Herr
「ジーン アンド ディベロップメント」（Gene＆Deve
lopment）２,1582（1988）〕のcDNAが単離されている。
究が行われており、例えば、免疫グロブリンのκ鎖遺伝
子エンハンサーに結合するＢ細胞の特異的な因子OTF−
２（Octamer transcription factor−２）〔Michael et
al.「ネイチャー（Nature）」366,544−551,（198
8）〕や同一エンハンサー配列を認識するが他の組織に
も汎在するOTF−１等〔R.A.Sturm.、G.Das and W.Herr
「ジーン アンド ディベロップメント」（Gene＆Deve
lopment）２,1582（1988）〕のcDNAが単離されている。
ヒトα−フェトプロティン遺伝子では、転写開始点の
５′側3.5Kbの位置にエンハンサー活性を示す領域の存
在が確認されており、このエンハンサー領域に結合する
因子が発見され、AFP−１と称せられている〔Sawadaish
i et al.「モレキュラー アンド セルラー バイオロ
ジー（Molecular and Cellular Biology）」vol.8,5719
−5187（1988）〕。
５′側3.5Kbの位置にエンハンサー活性を示す領域の存
在が確認されており、このエンハンサー領域に結合する
因子が発見され、AFP−１と称せられている〔Sawadaish
i et al.「モレキュラー アンド セルラー バイオロ
ジー（Molecular and Cellular Biology）」vol.8,5719
−5187（1988）〕。
しかし、AFP−１の構造、物理化学的性質及びそれを
コードする遺伝子は未だ明らかにされていない。
コードする遺伝子は未だ明らかにされていない。
発明が解決しようとする課題 本発明者らは、α−フェトプロティン遺伝子のエンハ
ンサー領域に存在するTTAATAATTA構造を中心とする領域
に特異的に結合する核内因子の研究を進めた結果、この
因子をコードする遺伝子DNAを得るとともに該DNAの塩基
配列を明らかにし、本発明をなすに到つた。
ンサー領域に存在するTTAATAATTA構造を中心とする領域
に特異的に結合する核内因子の研究を進めた結果、この
因子をコードする遺伝子DNAを得るとともに該DNAの塩基
配列を明らかにし、本発明をなすに到つた。
したがって、本発明は、α−フェトプロティン遺伝子
エンハンサー領域に結合する蛋白質をコードする、新規
な塩化配列で表わされるDNAを提供することを課題とす
る。
エンハンサー領域に結合する蛋白質をコードする、新規
な塩化配列で表わされるDNAを提供することを課題とす
る。
課題を解決するための手段 本発明に係るα−フェトプロティン遺伝子のエンハン
サー領域に結合する蛋白質は、第１図に示したアミノ酸
配列を一次配列の中に有する蛋白質であって、細胞核内
に存在し、α−フェトプロティン生産細胞より抽出され
る。
サー領域に結合する蛋白質は、第１図に示したアミノ酸
配列を一次配列の中に有する蛋白質であって、細胞核内
に存在し、α−フェトプロティン生産細胞より抽出され
る。
したがって、本発明では、肝臓由来の細胞であって、
α−フェトプロティンを生産する細胞より目的とする遺
伝子DNAを得ることができる。
α−フェトプロティンを生産する細胞より目的とする遺
伝子DNAを得ることができる。
α−フェトプロテイン生産細胞としては、株化したヒ
ト肝癌細胞HuH−７等の細胞を例示し得る。
ト肝癌細胞HuH−７等の細胞を例示し得る。
本発明においては、如上のα−フェトプロティン生産
細胞を培養し、得られた増殖細胞を回収した後、粉砕し
てmRNAを抽出し、得られた抽出RNA画分より、オリゴ（d
T）セルロースを用いてポリ（Ａ）RNAを常法にしたがっ
て回収する。
細胞を培養し、得られた増殖細胞を回収した後、粉砕し
てmRNAを抽出し、得られた抽出RNA画分より、オリゴ（d
T）セルロースを用いてポリ（Ａ）RNAを常法にしたがっ
て回収する。
なお、上記mRNAの抽出はグアニジンチオシアネート塩
化セシウム法〔J.M.Chirgwin et al.,「バイオケミスト
リー（Biochemistry）18,5294,（1979）〕等の方法を採
用して行うとよい。
化セシウム法〔J.M.Chirgwin et al.,「バイオケミスト
リー（Biochemistry）18,5294,（1979）〕等の方法を採
用して行うとよい。
次いで、上述のようにして回収したポリ（Ａ）RNAを
鋳型として逆転写酵素を用いてcDNAを合成し、さらに、
このcDNAを２本鎖cDNAになした後、λファージにパッケ
ージングして組換えファージを作製する。
鋳型として逆転写酵素を用いてcDNAを合成し、さらに、
このcDNAを２本鎖cDNAになした後、λファージにパッケ
ージングして組換えファージを作製する。
ここで用いるλファージとしては市販のパッケージン
グシステム、例えばパッカージーンパッケージングシス
テム（プロメガ社製）等が使用できる。
グシステム、例えばパッカージーンパッケージングシス
テム（プロメガ社製）等が使用できる。
次に、上述のようにして作製した組換え体をホストで
ある大腸菌、例えばE.colu Y 1090（ｒ−）に導入し、
さらに、この大腸菌をアガロースプレート上で増殖させ
てcDNAライブラリーを作製する。このようにして作製し
たcDNAライブラリーよりα−フェトプロティン遺伝子の
エンハンサー領域のDNAをプローブとしてスクリーニン
グすることにより、目的とするα−フェトプロティン遺
伝子エンハンサー領域に結合する蛋白質をコードするDN
Aを得ることができる。
ある大腸菌、例えばE.colu Y 1090（ｒ−）に導入し、
さらに、この大腸菌をアガロースプレート上で増殖させ
てcDNAライブラリーを作製する。このようにして作製し
たcDNAライブラリーよりα−フェトプロティン遺伝子の
エンハンサー領域のDNAをプローブとしてスクリーニン
グすることにより、目的とするα−フェトプロティン遺
伝子エンハンサー領域に結合する蛋白質をコードするDN
Aを得ることができる。
以下実施例により本発明を詳しく説明する。
実施例 本例ではヒト肝癌細胞由来の株化細胞HuH−７よりα
−フェトプロティン遺伝子エンハンサー結合蛋白質をコ
ードするDNAの調製を示す。
−フェトプロティン遺伝子エンハンサー結合蛋白質をコ
ードするDNAの調製を示す。
α−フェトプロティン生産細胞の培養 原料細胞としてヒト肝臓由来の細胞であって、α−フ
ェトプロティン遺伝子の生産能を有する株化ヒト肝癌細
胞HuH−７を用い、下記条件で培養を行った。
ェトプロティン遺伝子の生産能を有する株化ヒト肝癌細
胞HuH−７を用い、下記条件で培養を行った。
なお、上記細胞株は、岡山大学医学部附属癌源研究施
設、病理研究部門、佐藤二郎教授の研究室より分譲可能
である。
設、病理研究部門、佐藤二郎教授の研究室より分譲可能
である。
培養条件： 培地としては、ラクトアルブミンの加水分解物（ギブ
ゴ）を３％（wt）添加したRPMI−1640培地あるいは牛胎
児血清を５〜10％（V/V）を加えたRPMIP−1640培地を用
いた。この培養液は適宜交換し、培養は５％炭酸ガスを
含む空気を満たした培養器内で行った。
ゴ）を３％（wt）添加したRPMI−1640培地あるいは牛胎
児血清を５〜10％（V/V）を加えたRPMIP−1640培地を用
いた。この培養液は適宜交換し、培養は５％炭酸ガスを
含む空気を満たした培養器内で行った。
上記培養細胞からポリ（Ａ）RANの調製 培養細胞２×108個からグアニジンイソチオシアネー
ト塩化セシウム法〔「バイオケミストリー」（Biochemi
stry）18,5294,（1979）〕を用い、下記手順によりトー
タルRNAを抽出した。
ト塩化セシウム法〔「バイオケミストリー」（Biochemi
stry）18,5294,（1979）〕を用い、下記手順によりトー
タルRNAを抽出した。
細胞に20mlの6Mグアニジンイソチオシアネート、5mM
クエン酸ナトリウム、0.1M 2−メルカプトエタノール、
0.5N−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム溶液を添加
し、ホモジナイズしたのち、このホモジネート10ml当り
4gの塩化セシウムを溶解した。5.7M塩化セシウム、0.1M
EDTA（pH7.5）2.5mlをポリアロマー遠心管に入れ、そ
の上からホモジネート10mlを重層したのち、日立超遠心
ローターRPS 40Tによって34,000rpmで18時間、20℃で遠
心を行った。遠心後、沈渣を1mlの10mMトリス−HCl（pH
7.4）、5mM EDTA、１％SDSに溶解し、この溶液に等量の
クロロホルム:n−ブタノール（4:1、v/v）を加え、十分
混合したのち、遠心分離して、水層を得た。この水層に
1/10量の3M酢酸ナトリウム（pH5.5）と2.5倍量のエタノ
ールを加え混合し、−70℃に２時間以上放置後遠心して
沈澱を得た。沈澱を70％エタノールで洗った後乾固し、
これをトータルRNAとした。
クエン酸ナトリウム、0.1M 2−メルカプトエタノール、
0.5N−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム溶液を添加
し、ホモジナイズしたのち、このホモジネート10ml当り
4gの塩化セシウムを溶解した。5.7M塩化セシウム、0.1M
EDTA（pH7.5）2.5mlをポリアロマー遠心管に入れ、そ
の上からホモジネート10mlを重層したのち、日立超遠心
ローターRPS 40Tによって34,000rpmで18時間、20℃で遠
心を行った。遠心後、沈渣を1mlの10mMトリス−HCl（pH
7.4）、5mM EDTA、１％SDSに溶解し、この溶液に等量の
クロロホルム:n−ブタノール（4:1、v/v）を加え、十分
混合したのち、遠心分離して、水層を得た。この水層に
1/10量の3M酢酸ナトリウム（pH5.5）と2.5倍量のエタノ
ールを加え混合し、−70℃に２時間以上放置後遠心して
沈澱を得た。沈澱を70％エタノールで洗った後乾固し、
これをトータルRNAとした。
トータルRNAからポリ（Ａ）RNAを調製するには以下に
述べる様にオリゴ（dT）セルロースを用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーを行った。オリゴ（dT）セルロ
ース50mgを10mMトリス−HCl（pH7.5）、0.5M NaCl、1mM
EDTA、0.1％SDS溶液で平衡化し、これに同緩衝液に溶
解したトータルRNA 390μｇを吸着させた。非吸着RNAを
同上緩衝液で洗い、次に、吸着したRNAを10mMトリス−H
Cl（pH7.5）、1mM EDTA、0.05％SDSで溶出させた。この
溶出液に1/10量の3M酢酸ナトリウム（pH5.5）と2.5倍容
量のエタノールを加えて混合したのちに−70℃に２時間
以上放置した。遠心分離によって沈澱を集め、70％エタ
ノールで洗ったのちに滅菌蒸留水に溶解してポリ（Ａ）
RNAとした。
述べる様にオリゴ（dT）セルロースを用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーを行った。オリゴ（dT）セルロ
ース50mgを10mMトリス−HCl（pH7.5）、0.5M NaCl、1mM
EDTA、0.1％SDS溶液で平衡化し、これに同緩衝液に溶
解したトータルRNA 390μｇを吸着させた。非吸着RNAを
同上緩衝液で洗い、次に、吸着したRNAを10mMトリス−H
Cl（pH7.5）、1mM EDTA、0.05％SDSで溶出させた。この
溶出液に1/10量の3M酢酸ナトリウム（pH5.5）と2.5倍容
量のエタノールを加えて混合したのちに−70℃に２時間
以上放置した。遠心分離によって沈澱を集め、70％エタ
ノールで洗ったのちに滅菌蒸留水に溶解してポリ（Ａ）
RNAとした。
cRNAの合成 cRNAの合成はファルマシア社製のcDNA合成キットを用
いて行った。
いて行った。
2.5μｇのポリ（Ａ）RANと0.4μｇのランダムプライ
マー〔dp（Ｎ）６、宝酒造〕を第一鎖合成反応液に加
え、以後はファルマシア社のプロトコールにしたがって
反応を行った。二本鎖cDNAの両末端にプロトコールにし
たがって、EcoR Iアダプターを連結した。2.5μｇのポ
リ（Ａ）RNAから二本鎖DNA2.3μｇが得られた。
マー〔dp（Ｎ）６、宝酒造〕を第一鎖合成反応液に加
え、以後はファルマシア社のプロトコールにしたがって
反応を行った。二本鎖cDNAの両末端にプロトコールにし
たがって、EcoR Iアダプターを連結した。2.5μｇのポ
リ（Ａ）RNAから二本鎖DNA2.3μｇが得られた。
組換えDNAの作製と組換え体ファージの作製 組換えDNAの作製は、ペロメガ社製のプロトクローン
λgtllシステムを用い、プロトコールにしたがって行っ
た。得られた組換えDNAは、プロメガ社製のパッカージ
ーンパッケージングシステムを用いて組換え体ファージ
としホスト大腸菌Y1090（r-）に導入した。この組換え
体ファージをアガロースプレート上で増殖させ、λgtll
cDNAライブラリーを作製した。このライブラリーのcom
plexityは６×106であった。
λgtllシステムを用い、プロトコールにしたがって行っ
た。得られた組換えDNAは、プロメガ社製のパッカージ
ーンパッケージングシステムを用いて組換え体ファージ
としホスト大腸菌Y1090（r-）に導入した。この組換え
体ファージをアガロースプレート上で増殖させ、λgtll
cDNAライブラリーを作製した。このライブラリーのcom
plexityは６×106であった。
cDNAの作製とλgtll発現ベクター作製の工程は第３図
に示した。
に示した。
スクリーニング 上記λgtll cDNAライブラリーのスクリーニングはす
でに発表されている方法に従って行った〔Cell.52,415
（1988）〕。スクリーニング用のプローブはヒトα−フ
ェトプロティン遺伝子の５′側上流に位置するエンハン
サー領域〔Molecular and Cellular Biology ８,5179
（1988）〕のDNAを材料として作製した（第４図参
照）。エンハンサーを含む領域より、制限酵素HgiA Iと
BstN Iによってエンハンサー活性をもつDNAフラグメン
トを切り出し、この末端をDNAポリメラーゼKlenowフラ
グメント用いて補填した。一方、pUC18プラスミドをBam
H Iによって切断し、この末端も同様に補填した。この
両者をT4DNAリガーゼ（宝酒造）によって接続し、組換
え体プラスミドpAFE（HgiA I/BstN I）１を作製した。
でに発表されている方法に従って行った〔Cell.52,415
（1988）〕。スクリーニング用のプローブはヒトα−フ
ェトプロティン遺伝子の５′側上流に位置するエンハン
サー領域〔Molecular and Cellular Biology ８,5179
（1988）〕のDNAを材料として作製した（第４図参
照）。エンハンサーを含む領域より、制限酵素HgiA Iと
BstN Iによってエンハンサー活性をもつDNAフラグメン
トを切り出し、この末端をDNAポリメラーゼKlenowフラ
グメント用いて補填した。一方、pUC18プラスミドをBam
H Iによって切断し、この末端も同様に補填した。この
両者をT4DNAリガーゼ（宝酒造）によって接続し、組換
え体プラスミドpAFE（HgiA I/BstN I）１を作製した。
pAFE（HgiA I/BstN I）１を制限酵素Xba IとPst Iに
よって加水分解し、エクソヌクレアーゼIIIとマングビ
ーンヌクレアーゼ（宝酒造）を用いて削除反応を行った
のち、末端をDNAポリメラーゼKlenowフラグメントを用
いて補填し、この末端にXho Iリンカーを挿入して閉環
した。
よって加水分解し、エクソヌクレアーゼIIIとマングビ
ーンヌクレアーゼ（宝酒造）を用いて削除反応を行った
のち、末端をDNAポリメラーゼKlenowフラグメントを用
いて補填し、この末端にXho Iリンカーを挿入して閉環
した。
生じたプラスミドを大腸菌DH5に導入して得られたデ
リション・ミュータントの中から望ましい塩基配列を持
つクローンを選択し、これをpAFE（HgiA I/Xho I）１と
名づけた。pAFE（HgiA I/Xho I）１を制限酵素Nla IVと
Xho Iによって加水分解し、エンハンサーを含むフラグ
メントをアガロース電気泳動によって分離した。このNa
l IV/Xho Iフラグメントの末端をDNAポリメラーゼKleno
wフラグメントによって補填し、T4DNAリガーゼを用いて
連結したのち、Hinc IIで加水分解したpUC18プラスミド
とT4リガーゼを用いて連結した。生じた組換えプラスミ
ドを大腸菌DN5α（BRL社）に導入し、組換え体の中から
望ましいクローンを選択した。このクローンに含まれる
組換えプラスミドには上記Nla IV/Xho Iフラグメントが
６個連結されてHinc IIサイトに挿入されていた。この
プラスミドをpAFE（Nla IV/Xho I）６と名づけた。pAFE
（Nla IV/Xho I）６を制限酵素Sma IとHinc II（宝酒
造）によって切断し、エンハンサーを含むSma I/Hinc I
Iフラグメントを分離したのち、T4ポリヌクレチオドキ
ナーゼと５′〔γ・32P〕ATPを用いて標識し、これをス
クリーニング用プローブとして使用した。３×105個の
プラークをスクリーニングしてプローブと特異的に結合
するクローンを単離し、これをλ２と名づけた。λ２の
プラークを含むアガロースをプレートから切り出し、50
mMトリス−HCl（pH7.5）、0.1M NaCl、8.1mM MgSO4、0.
1％ゼラチンに懸濁してファージを溶出したのち、クロ
ロホルムを一滴加えて４℃に保存した。
リション・ミュータントの中から望ましい塩基配列を持
つクローンを選択し、これをpAFE（HgiA I/Xho I）１と
名づけた。pAFE（HgiA I/Xho I）１を制限酵素Nla IVと
Xho Iによって加水分解し、エンハンサーを含むフラグ
メントをアガロース電気泳動によって分離した。このNa
l IV/Xho Iフラグメントの末端をDNAポリメラーゼKleno
wフラグメントによって補填し、T4DNAリガーゼを用いて
連結したのち、Hinc IIで加水分解したpUC18プラスミド
とT4リガーゼを用いて連結した。生じた組換えプラスミ
ドを大腸菌DN5α（BRL社）に導入し、組換え体の中から
望ましいクローンを選択した。このクローンに含まれる
組換えプラスミドには上記Nla IV/Xho Iフラグメントが
６個連結されてHinc IIサイトに挿入されていた。この
プラスミドをpAFE（Nla IV/Xho I）６と名づけた。pAFE
（Nla IV/Xho I）６を制限酵素Sma IとHinc II（宝酒
造）によって切断し、エンハンサーを含むSma I/Hinc I
Iフラグメントを分離したのち、T4ポリヌクレチオドキ
ナーゼと５′〔γ・32P〕ATPを用いて標識し、これをス
クリーニング用プローブとして使用した。３×105個の
プラークをスクリーニングしてプローブと特異的に結合
するクローンを単離し、これをλ２と名づけた。λ２の
プラークを含むアガロースをプレートから切り出し、50
mMトリス−HCl（pH7.5）、0.1M NaCl、8.1mM MgSO4、0.
1％ゼラチンに懸濁してファージを溶出したのち、クロ
ロホルムを一滴加えて４℃に保存した。
溶原菌抽出液の作製 上記保存ファージをすでに発表されている方法（DNA
クローニング、VOL.1、D.M.グローバー編集IRLPress出
版、1985年、p49）に従ってY1089大腸菌に感染させ溶原
菌を作製した。次に溶原菌よりSinghらの方法（Cell.5
2,415 1988）に従って抽出液を作製した。コントロール
としてcDNAを含まないλgtllファージをY1089に感染さ
せ、この溶原菌からも同様に抽出液を作製した。
クローニング、VOL.1、D.M.グローバー編集IRLPress出
版、1985年、p49）に従ってY1089大腸菌に感染させ溶原
菌を作製した。次に溶原菌よりSinghらの方法（Cell.5
2,415 1988）に従って抽出液を作製した。コントロール
としてcDNAを含まないλgtllファージをY1089に感染さ
せ、この溶原菌からも同様に抽出液を作製した。
ゲルシフトアッセイ ゲルシフトアッセイは、上記溶原菌抽出液とで述べ
たpAFE（HgiA I/BstN I）１からSma IとHinc IIによっ
て切り出したエンハンサーDNAフラグメントの５′末端
を32P標識して作製したプローブとを用いて既存の方法
（Nature 319,154,1988）に従って行った。
たpAFE（HgiA I/BstN I）１からSma IとHinc IIによっ
て切り出したエンハンサーDNAフラグメントの５′末端
を32P標識して作製したプローブとを用いて既存の方法
（Nature 319,154,1988）に従って行った。
第５図に結果を示すように、λ２の感染した溶原菌の
抽出液を用いた場合にシフトした二本のバンド（a,b）
が検出され、このバンドはcDNAを持たないλgtllの溶原
菌抽出物では検出されなかったことからλ２にクローン
されたcDNAにコードされる蛋白質がプローブに結合する
性質を持つことが示された。
抽出液を用いた場合にシフトした二本のバンド（a,b）
が検出され、このバンドはcDNAを持たないλgtllの溶原
菌抽出物では検出されなかったことからλ２にクローン
されたcDNAにコードされる蛋白質がプローブに結合する
性質を持つことが示された。
フットプリント法によるDNA塩基配列上の蛋白質結
合部位の同定 10mMトリス−HCl（pH7.5）、50mM NaCl、1mM DTT、0.
5mM EDTA、2.5mM MgCl2、３μg poly（dI−dC）.poly
（dI−dC）、５％グリセロールを含む75μの反応液中
で16μｇの蛋白質を含むλ２溶原菌抽出液とで述べた
pAFE（HgiA I−BstN I）１から作製したSma I/Hinc II
プローブを混合し、室温に30分放置した。このプローブ
は片方の５′末端のみが32Pによって標識されている。
この反応液に40ng/μのD Nase Iを１μ加え、室温
で１分間反応させたのち、0.5M EDTAを2.3μ加えて反
応を止めた。この反応液をゲルシフトアッセイ用の５％
ポリアクリルアミドゲルに供与し、11V/cmでブロモフェ
ノールブルーが下端近くへ移動するまで電気泳動を行っ
た。
合部位の同定 10mMトリス−HCl（pH7.5）、50mM NaCl、1mM DTT、0.
5mM EDTA、2.5mM MgCl2、３μg poly（dI−dC）.poly
（dI−dC）、５％グリセロールを含む75μの反応液中
で16μｇの蛋白質を含むλ２溶原菌抽出液とで述べた
pAFE（HgiA I−BstN I）１から作製したSma I/Hinc II
プローブを混合し、室温に30分放置した。このプローブ
は片方の５′末端のみが32Pによって標識されている。
この反応液に40ng/μのD Nase Iを１μ加え、室温
で１分間反応させたのち、0.5M EDTAを2.3μ加えて反
応を止めた。この反応液をゲルシフトアッセイ用の５％
ポリアクリルアミドゲルに供与し、11V/cmでブロモフェ
ノールブルーが下端近くへ移動するまで電気泳動を行っ
た。
片方のガラス板を除き、ゲルをサランラップで包んだ
のちＸ線フイルムを密着させオートラジオグラフィーを
作製した。
のちＸ線フイルムを密着させオートラジオグラフィーを
作製した。
蛋白質と結合したDNAのバンドと結合していないDNAの
バンドに相当する位置のゲルを切り出し、0.5mlの0.5M
酢酸アンモニウム、0.1％SDS、1mM EDTAで室温において
一夜抽出した。遠心して上清を取り、ゲル片は同溶出液
0.5mlで２回洗い、洗液と上清を合わせた。これに５μ
ｇのトランスファーRNAを加えたのち等量のフェノー
ル：クロロホルム（1:1）で抽出し、水層に２倍量のエ
タノールを加えて−70℃に30分以上保存した。DNAを遠
心分離によって集め、70％エタノールで１回洗ったの
ち、減圧乾固した。このDNAを10μの80％ホルムアミ
ド、10mM NaOH、1mM EDTA、0.1％キシレンシアノール、
0.1％プロモフェノールブルーに溶解し、90℃で３分加
熱したのち３〜４μを塩基配列決定用の7M尿素を含む
８％ポリアクリルアミドゲルに供与した。サイズマーカ
ーとしてプローブDNAをマキサム−ギルバート法によっ
てアデニンとグアニンの位置で化学的に切断したもの
（Methods in Enzymology vol.65,499,1980）を供に泳
動した。
バンドに相当する位置のゲルを切り出し、0.5mlの0.5M
酢酸アンモニウム、0.1％SDS、1mM EDTAで室温において
一夜抽出した。遠心して上清を取り、ゲル片は同溶出液
0.5mlで２回洗い、洗液と上清を合わせた。これに５μ
ｇのトランスファーRNAを加えたのち等量のフェノー
ル：クロロホルム（1:1）で抽出し、水層に２倍量のエ
タノールを加えて−70℃に30分以上保存した。DNAを遠
心分離によって集め、70％エタノールで１回洗ったの
ち、減圧乾固した。このDNAを10μの80％ホルムアミ
ド、10mM NaOH、1mM EDTA、0.1％キシレンシアノール、
0.1％プロモフェノールブルーに溶解し、90℃で３分加
熱したのち３〜４μを塩基配列決定用の7M尿素を含む
８％ポリアクリルアミドゲルに供与した。サイズマーカ
ーとしてプローブDNAをマキサム−ギルバート法によっ
てアデニンとグアニンの位置で化学的に切断したもの
（Methods in Enzymology vol.65,499,1980）を供に泳
動した。
電気泳動終了後オートラジオグラフィーを行った結果
を第６図に示す。図のように蛋白質と結合していないDN
Aと比べ、蛋白質と結合していたDNAではTTAATAATTAを中
心とする15塩基対がDNase Iの分解から保護されている
ことが示された。
を第６図に示す。図のように蛋白質と結合していないDN
Aと比べ、蛋白質と結合していたDNAではTTAATAATTAを中
心とする15塩基対がDNase Iの分解から保護されている
ことが示された。
λ２ファージにクローンされたcDNAの塩基配列 λ２ファージのDNAを一般的な方法（Molecular Cloni
ng、a laboratory manual、p76,1982）に従って調製
し、EcoR Iによって加水分解したのちアガロース電気泳
動によってインサートDNAを分離した。
ng、a laboratory manual、p76,1982）に従って調製
し、EcoR Iによって加水分解したのちアガロース電気泳
動によってインサートDNAを分離した。
このDNAの塩基配列をジデオキシ法（Methods in Enzy
mology 65,560,1980）及びMaxam−Gilbert法（Methods
in Enzymology 65,499,1980）を用いて決定した結果を
第７図に示す。
mology 65,560,1980）及びMaxam−Gilbert法（Methods
in Enzymology 65,499,1980）を用いて決定した結果を
第７図に示す。
次に、上述のλ2DNAにコードされた蛋白質が結合する
DNA領域がエンハンサー活性を持つことを下記に示すキ
ヤットアッセイにより確認した。
DNA領域がエンハンサー活性を持つことを下記に示すキ
ヤットアッセイにより確認した。
キヤットアッセイ 実施例においてで述べたpAFE（HgiA I/Xho I）１よ
り分離したNla IV/Xho Iフラグメントを、キヤットアッ
セイ用ベクターpAF1.0CATのCla1サイトに平滑末端ライ
ゲーションによって挿入し、pAF1.0E25CATを作製した
（第８図参照）。
り分離したNla IV/Xho Iフラグメントを、キヤットアッ
セイ用ベクターpAF1.0CATのCla1サイトに平滑末端ライ
ゲーションによって挿入し、pAF1.0E25CATを作製した
（第８図参照）。
pAF1.0CATにはα−フェトプロテイン遺伝子のプロモ
ーター領域のDNA1kbと大腸菌のクロラムフェニコール・
アセチルトランスフェラーゼの構造遺伝子、そしてSV40
のポリ（Ａ）付加シグナルおよびｔ−抗原遺伝子イント
ロンが含まれている。このベクターはエンハンサー活性
をもつDNAフラグメントの検索に用いられる（J.Biol.Ch
em.262,4812,1987）。キヤットプラスミドのHuH−７細
胞への導入とキヤットアッセイは既存の方法（Mol.Cel
l.Biol.２,1044,1982）を基本として次のように行っ
た。
ーター領域のDNA1kbと大腸菌のクロラムフェニコール・
アセチルトランスフェラーゼの構造遺伝子、そしてSV40
のポリ（Ａ）付加シグナルおよびｔ−抗原遺伝子イント
ロンが含まれている。このベクターはエンハンサー活性
をもつDNAフラグメントの検索に用いられる（J.Biol.Ch
em.262,4812,1987）。キヤットプラスミドのHuH−７細
胞への導入とキヤットアッセイは既存の方法（Mol.Cel
l.Biol.２,1044,1982）を基本として次のように行っ
た。
75cm2の培養フラスコに８×106程度の細胞を培養し、
これに20〜30μｇのキヤットプラスミドDNAをリン酸カ
ルシウム法によって導入した。３％ラクトアルブミン加
水分解物を含むRPM I−1640培地で２日間培養したのち
細胞をPBSで洗い、ポリスマンを用いて細胞をはがし
た。細胞を低速遠心（800rpm,5min）によって集め、40m
Mトリス−HCl（pH7.5）、1mM EDTA、150mM NaClで一度
洗ったのち100μの250mMトリス−HCl（pH7.5）に懸濁
した。凍結融解を５回繰り返して細胞を破砕し、エッペ
ンドルフ遠心機で12,000rpm、５分間遠心して上清を得
た。これを65℃、10分間熱処理し、エッペンドルフ遠心
機で12,000rpm、５分間遠心して得た上清を細胞抽出液
とした。
これに20〜30μｇのキヤットプラスミドDNAをリン酸カ
ルシウム法によって導入した。３％ラクトアルブミン加
水分解物を含むRPM I−1640培地で２日間培養したのち
細胞をPBSで洗い、ポリスマンを用いて細胞をはがし
た。細胞を低速遠心（800rpm,5min）によって集め、40m
Mトリス−HCl（pH7.5）、1mM EDTA、150mM NaClで一度
洗ったのち100μの250mMトリス−HCl（pH7.5）に懸濁
した。凍結融解を５回繰り返して細胞を破砕し、エッペ
ンドルフ遠心機で12,000rpm、５分間遠心して上清を得
た。これを65℃、10分間熱処理し、エッペンドルフ遠心
機で12,000rpm、５分間遠心して得た上清を細胞抽出液
とした。
細胞抽出液中の蛋白質濃度をバイオラッド社のプロテ
イン・アッセイ・キットを用いて測定し、50〜200μｇ
の蛋白質を次のキヤット アッセイに使用した。キヤッ
ト アッセイの典型的な反応液180μ中には250mMトリ
ス−HCl（pH7.5）、0.1μCi〔14C〕クロラムフェニコー
ル（アマシャム）、0.4mMアセチルCoA、50μｇ〜200μ
ｇ細胞抽出蛋白質が含まれていた。この反応液を37℃で
60分〜180分間インキュベートし、酢酸エチルを1ml加え
てクロラムフェニコールとそのアセチル化物を抽出し
た。酢酸エチル層を回収し、減圧乾固したのち、20μ
の酢酸エチルに再溶解し、その一部または全部をシリカ
ゲルプレート（メルク社）に供与して、クロロホルム：
メタノール（96:4）を用いて展開した。展開後シリカゲ
ールプレートを室温で乾燥し、サランラップに包んでオ
ートラジオグラフィーを行った。第９図に示すように、
α−フェトプロテイン遺伝子上流のエンハンサー領域の
DNAを含むキヤットプラスミドpAF1.0E24CATを用いた場
合にはpAF1.0CATに比較して高い活性が認められ、Nla I
V/Xho Iフラグメントにエンハンサー活性の存在するこ
とがわかった。
イン・アッセイ・キットを用いて測定し、50〜200μｇ
の蛋白質を次のキヤット アッセイに使用した。キヤッ
ト アッセイの典型的な反応液180μ中には250mMトリ
ス−HCl（pH7.5）、0.1μCi〔14C〕クロラムフェニコー
ル（アマシャム）、0.4mMアセチルCoA、50μｇ〜200μ
ｇ細胞抽出蛋白質が含まれていた。この反応液を37℃で
60分〜180分間インキュベートし、酢酸エチルを1ml加え
てクロラムフェニコールとそのアセチル化物を抽出し
た。酢酸エチル層を回収し、減圧乾固したのち、20μ
の酢酸エチルに再溶解し、その一部または全部をシリカ
ゲルプレート（メルク社）に供与して、クロロホルム：
メタノール（96:4）を用いて展開した。展開後シリカゲ
ールプレートを室温で乾燥し、サランラップに包んでオ
ートラジオグラフィーを行った。第９図に示すように、
α−フェトプロテイン遺伝子上流のエンハンサー領域の
DNAを含むキヤットプラスミドpAF1.0E24CATを用いた場
合にはpAF1.0CATに比較して高い活性が認められ、Nla I
V/Xho Iフラグメントにエンハンサー活性の存在するこ
とがわかった。
第１図は、上記DNAがコードする、α−フェトプロティ
ン遺伝子エンハンサーに結合する蛋白質のアミノ酸配列
を示し、第２図は、本発明によるDNAの塩基配列を示
す。 第３図は、mRNAよりcDNAを得て、λgtll発現ベクターに
組み込むための手順を示し、図中の↓印はcDNAが組み込
まれるlacZ遺伝子の挿入位置を示す。 第４図はヒトα−フェトプロティン遺伝子５′上流に存
在するエンハンサー領域の制限酵素地図を表したもの
で、イニシエーションサイトの上流−3.3kbから−3.7kb
の領域は拡大して示されている。 HiとHaはそれぞれ制限酵素Hind IIIとHae IIIの認識部
位を示す。 第５図は、λ２とλgtllの溶原菌抽出液を用いたゲルシ
フトアッセイの模式図を示したものであり、図にみられ
るとおりコントロールは抽出液を加えない場合のパター
ン。λ２溶原菌の抽出液を用いた場合にのみ、二本のシ
フトしたバンド（a,b）が見られる。 第６図は、λ２溶原菌抽出液を用いたDNase Iフットプ
リントの模式図を表わす。Ｇ＋ＡはMaxam−Gilbert法の
化学的切断によって作製したサイズマーカー、レーン１
はタンパク質と結合していないDNAのバンドから抽出さ
れたDNA、２と３はそれぞれタンパク質と結合してシフ
トしたバンドａとｂの位置から抽出したDNAをそれぞれ
表わす。 ＡはSma Iサイトの５′末端が標識された場合、ＢはHin
c IIサイトの５′末端が標識された場合のパターン、Ｃ
はＡとＢの結果をまとめたものを示す。 第７図は、λ２にクローンされたcDNAの塩基配列とそれ
にコードされたタンパク質のアミノ酸配列を示す。 第８図は、キヤットプラスミドpAF1.0E25CATの構築を表
し、pAF1.0E25CATはpAF1.0CATのCla Iサイトにエンハン
サー領域のNla IV/Xho Iフラグメント（31bp）を挿入す
ることによって構築したことを示す。 第９図は、ヒト肝癌細胞培養株HuH−７株を用いたキヤ
ットアッセイを示す。
ン遺伝子エンハンサーに結合する蛋白質のアミノ酸配列
を示し、第２図は、本発明によるDNAの塩基配列を示
す。 第３図は、mRNAよりcDNAを得て、λgtll発現ベクターに
組み込むための手順を示し、図中の↓印はcDNAが組み込
まれるlacZ遺伝子の挿入位置を示す。 第４図はヒトα−フェトプロティン遺伝子５′上流に存
在するエンハンサー領域の制限酵素地図を表したもの
で、イニシエーションサイトの上流−3.3kbから−3.7kb
の領域は拡大して示されている。 HiとHaはそれぞれ制限酵素Hind IIIとHae IIIの認識部
位を示す。 第５図は、λ２とλgtllの溶原菌抽出液を用いたゲルシ
フトアッセイの模式図を示したものであり、図にみられ
るとおりコントロールは抽出液を加えない場合のパター
ン。λ２溶原菌の抽出液を用いた場合にのみ、二本のシ
フトしたバンド（a,b）が見られる。 第６図は、λ２溶原菌抽出液を用いたDNase Iフットプ
リントの模式図を表わす。Ｇ＋ＡはMaxam−Gilbert法の
化学的切断によって作製したサイズマーカー、レーン１
はタンパク質と結合していないDNAのバンドから抽出さ
れたDNA、２と３はそれぞれタンパク質と結合してシフ
トしたバンドａとｂの位置から抽出したDNAをそれぞれ
表わす。 ＡはSma Iサイトの５′末端が標識された場合、ＢはHin
c IIサイトの５′末端が標識された場合のパターン、Ｃ
はＡとＢの結果をまとめたものを示す。 第７図は、λ２にクローンされたcDNAの塩基配列とそれ
にコードされたタンパク質のアミノ酸配列を示す。 第８図は、キヤットプラスミドpAF1.0E25CATの構築を表
し、pAF1.0E25CATはpAF1.0CATのCla Iサイトにエンハン
サー領域のNla IV/Xho Iフラグメント（31bp）を挿入す
ることによって構築したことを示す。 第９図は、ヒト肝癌細胞培養株HuH−７株を用いたキヤ
ットアッセイを示す。
Claims (2)
- 【請求項１】α−フェトプロティン遺伝子エンハンサー
に特異的に結合する蛋白質であって、第１図に示される
アミノ酸配列をもった蛋白質をコードするDNA。 - 【請求項２】DNAは添付の第２図に示した塩基配列で表
わされる請求項（１）に記載のDNA。
Priority Applications (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1112519A JP2686819B2 (ja) | 1989-05-01 | 1989-05-01 | α―フェトプロテイン遺伝子のエンハンサーに結合する蛋白質をコードするＤＮＡ |
| CA002032167A CA2032167C (en) | 1989-05-01 | 1990-04-27 | Dna coding for protein binds to enhancer of.alpha.-fetoprotein gene |
| ES90906374T ES2086402T3 (es) | 1989-05-01 | 1990-04-27 | Codificacion de adn para una proteina capaz de unirse al potenciador del gen de la alfa-fetoproteina. |
| DE69025856T DE69025856T2 (de) | 1989-05-01 | 1990-04-27 | Für ein protein mit der fähigkeit zur zusammenwirkung mit dem enhancer des alpha-fetoproteingens kodierende dna |
| US08/022,411 US5302698A (en) | 1989-05-01 | 1990-04-27 | DNA coding for protein binds to enhancer of α-fetoprotein gene |
| AU55203/90A AU630189B2 (en) | 1989-05-01 | 1990-04-27 | Dna coding for protein capable of combining with enhancer of alpha-fetoprotein gene |
| PCT/JP1990/000557 WO1990013655A1 (en) | 1989-05-01 | 1990-04-27 | DNA CODING FOR PROTEIN CAPABLE OF COMBINING WITH ENHANCER OF α-FETOPROTEIN GENE |
| DK90906374.5T DK0427863T3 (da) | 1989-05-01 | 1990-04-27 | DNA, som koder for protein, som kan kombinere med forstærker for alfa-fetoprotein-gen |
| EP90906374A EP0427863B1 (en) | 1989-05-01 | 1990-04-27 | Dna coding for protein capable of combining with enhancer of alpha-fetoprotein gene |
| AT90906374T ATE135408T1 (de) | 1989-05-01 | 1990-04-27 | Für ein protein mit der fähigkeit zur zusammenwirkung mit dem enhancer des alpha- fetoproteingens kodierende dna |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1112519A JP2686819B2 (ja) | 1989-05-01 | 1989-05-01 | α―フェトプロテイン遺伝子のエンハンサーに結合する蛋白質をコードするＤＮＡ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02291267A JPH02291267A (ja) | 1990-12-03 |
| JP2686819B2 true JP2686819B2 (ja) | 1997-12-08 |
Family
ID=14588679
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1112519A Expired - Lifetime JP2686819B2 (ja) | 1989-05-01 | 1989-05-01 | α―フェトプロテイン遺伝子のエンハンサーに結合する蛋白質をコードするＤＮＡ |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5302698A (ja) |
| EP (1) | EP0427863B1 (ja) |
| JP (1) | JP2686819B2 (ja) |
| AT (1) | ATE135408T1 (ja) |
| AU (1) | AU630189B2 (ja) |
| CA (1) | CA2032167C (ja) |
| DE (1) | DE69025856T2 (ja) |
| DK (1) | DK0427863T3 (ja) |
| ES (1) | ES2086402T3 (ja) |
| WO (1) | WO1990013655A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| JPH0673457B2 (ja) * | 1990-11-07 | 1994-09-21 | 雪印乳業株式会社 | α―フェトプロティン遺伝子のエンハンサーに結合する蛋白質をコードするＤＮＡ |
| US5965528A (en) | 1991-09-27 | 1999-10-12 | Mcgill University | Recombinant human alph-fetoprotein as an immunosuppressive agent |
| US6288034B1 (en) * | 1995-01-24 | 2001-09-11 | Martinex R & D Inc. | Recombinant human alpha-fetoprotein as an immunosuppressive agent |
| US6268212B1 (en) | 1993-10-18 | 2001-07-31 | Amgen Inc. | Tissue specific transgene expression |
| US20020068049A1 (en) * | 1998-09-10 | 2002-06-06 | Henderson Daniel R. | Tissue specific adenoviral vectors |
| US6254862B1 (en) | 1997-03-03 | 2001-07-03 | Calydon, Inc. | Adenovirus vectors specific for cells expressing alpha-fetoprotein and methods of use thereof |
| US6676935B2 (en) | 1995-06-27 | 2004-01-13 | Cell Genesys, Inc. | Tissue specific adenoviral vectors |
| US7011976B1 (en) | 1997-03-03 | 2006-03-14 | Calydon, Inc. | Adenovirus vectors specific for cells expressing alpha-fetoprotein and methods of use thereof |
| US7208576B2 (en) * | 1999-01-06 | 2007-04-24 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Non-glycosylated human alpha-fetoprotein, methods of production, and uses thereof |
| US6911200B2 (en) * | 2000-03-24 | 2005-06-28 | Cell Genesys, Inc. | Methods of treating neoplasia with combination of target-cell specific adenovirus, chemotherapy and radiation |
| US20100304873A1 (en) * | 2009-05-28 | 2010-12-02 | Lipa Markowitz | Bowling Ball and Football Game Controller |
-
1989
- 1989-05-01 JP JP1112519A patent/JP2686819B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-04-27 AT AT90906374T patent/ATE135408T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-04-27 US US08/022,411 patent/US5302698A/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-04-27 CA CA002032167A patent/CA2032167C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-04-27 ES ES90906374T patent/ES2086402T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-27 WO PCT/JP1990/000557 patent/WO1990013655A1/ja active IP Right Grant
- 1990-04-27 AU AU55203/90A patent/AU630189B2/en not_active Ceased
- 1990-04-27 DK DK90906374.5T patent/DK0427863T3/da active
- 1990-04-27 EP EP90906374A patent/EP0427863B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-27 DE DE69025856T patent/DE69025856T2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2086402T3 (es) | 1996-07-01 |
| JPH02291267A (ja) | 1990-12-03 |
| DK0427863T3 (da) | 1996-07-29 |
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