JPH08140679A - 微生物によるラットβ２−マイクログロブリン生産 - Google Patents
微生物によるラットβ２−マイクログロブリン生産Info
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- JPH08140679A JPH08140679A JP6286540A JP28654094A JPH08140679A JP H08140679 A JPH08140679 A JP H08140679A JP 6286540 A JP6286540 A JP 6286540A JP 28654094 A JP28654094 A JP 28654094A JP H08140679 A JPH08140679 A JP H08140679A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 高純度ラット・β2−マイクログロブリンを
大量かつ容易に製造する。 【構成】 プロモーター、翻訳開始信号、および停止信
号を含むプラスミドにラット・β2−マイクログロブリ
ンをコードするＤＮＡを、配列を一部改変したリンカー
と共に組み込んだプラスミド、該プラスミドによる形質
転換体微生物、ならびに該形質転換体微生物を用いるラ
ット・β2−マイクログロブリンの製造方法。 【効果】 高純度ラット・β2−マイクログロブリンが
大量かつ容易に製造される。
大量かつ容易に製造する。 【構成】 プロモーター、翻訳開始信号、および停止信
号を含むプラスミドにラット・β2−マイクログロブリ
ンをコードするＤＮＡを、配列を一部改変したリンカー
と共に組み込んだプラスミド、該プラスミドによる形質
転換体微生物、ならびに該形質転換体微生物を用いるラ
ット・β2−マイクログロブリンの製造方法。 【効果】 高純度ラット・β2−マイクログロブリンが
大量かつ容易に製造される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＤＮＡ組換え技術によ
り作製された、ラットβ2−マイクログロブリンをコー
ドするＤＮＡ、該ＤＮＡよりなるプラスミド、該プラス
ミドで形質転換された微生物、該微生物を培養してラッ
トβ2−マイクログロブリンを生産する方法に関するも
のである。
り作製された、ラットβ2−マイクログロブリンをコー
ドするＤＮＡ、該ＤＮＡよりなるプラスミド、該プラス
ミドで形質転換された微生物、該微生物を培養してラッ
トβ2−マイクログロブリンを生産する方法に関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】β2−マイクログロブリン（以下β2−
ｍ）は種々の細胞で産生され、体液や分泌液中に広く存
在する低分子蛋白である。尿細管障害により尿中β2−
ｍ濃度が上昇するため、早くから測定法の開発が進めら
れてきた。また、β2−ｍのアミノ酸配列とＩｇＧ1の構
造の一部との類似性（ピーターソン，ピー・エイ(Peter
som,P.A.)ら:プロシーディングス・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・ユーエスエイ（Proc.Nat.Acad.Sci.
USA.），６９，１６９７，（１９７２））や、ＨＬＡの
共通フラグメントとの同一性が判明しており（ナカム
ロ，ケイ（Nakamuro,K.）ら：７０，２８６３，（１９
７３））、免疫学的にも注目されるようになった。ま
た、エイズ患者は尿中のβ2−ｍ濃度が上昇するとの報
告があり、エイズ発病の前兆となるとも考えられる（バ
ーラ，アール・ビー（Bhalla,R.B.）ら：クリニカル・
ケミストリー（Clin. Chem.），３１，１４１１，（１
９８５））。
ｍ）は種々の細胞で産生され、体液や分泌液中に広く存
在する低分子蛋白である。尿細管障害により尿中β2−
ｍ濃度が上昇するため、早くから測定法の開発が進めら
れてきた。また、β2−ｍのアミノ酸配列とＩｇＧ1の構
造の一部との類似性（ピーターソン，ピー・エイ(Peter
som,P.A.)ら:プロシーディングス・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・ユーエスエイ（Proc.Nat.Acad.Sci.
USA.），６９，１６９７，（１９７２））や、ＨＬＡの
共通フラグメントとの同一性が判明しており（ナカム
ロ，ケイ（Nakamuro,K.）ら：７０，２８６３，（１９
７３））、免疫学的にも注目されるようになった。ま
た、エイズ患者は尿中のβ2−ｍ濃度が上昇するとの報
告があり、エイズ発病の前兆となるとも考えられる（バ
ーラ，アール・ビー（Bhalla,R.B.）ら：クリニカル・
ケミストリー（Clin. Chem.），３１，１４１１，（１
９８５））。
【０００３】さらにβ2−ｍの生物学的役割の解明のた
め、ヒト以外の動物についての研究が必要となり、様々
な動物からβ2−ｍが単離された。
め、ヒト以外の動物についての研究が必要となり、様々
な動物からβ2−ｍが単離された。
【０００４】ラットβ2−マイクログロブリン（以下ｒ
β2−ｍ）をコードするＤＮＡの配列は、マウキシオ
ン，エフ（Mauxion,F.）らによって報告されている（ヌ
クレイック・リサーチ（Nucleic Acids Research），１
５，７６３８，（１９８７））。また、尿から単離さ
れ、性質や他の動物種との比較が報告されている。（レ
ーグドベルグ，エル（Loegdberg,L.）ら：モレキュラー
・イミュノロジー（Molecular Immunology），１６，５
７７，（１９７９））この場合のｒβ2−ｍは腎障害を
起こしたラットの尿で １匹あたり６４０μg/日であ
り、精製後の収率は７．５％となっている。
β2−ｍ）をコードするＤＮＡの配列は、マウキシオ
ン，エフ（Mauxion,F.）らによって報告されている（ヌ
クレイック・リサーチ（Nucleic Acids Research），１
５，７６３８，（１９８７））。また、尿から単離さ
れ、性質や他の動物種との比較が報告されている。（レ
ーグドベルグ，エル（Loegdberg,L.）ら：モレキュラー
・イミュノロジー（Molecular Immunology），１６，５
７７，（１９７９））この場合のｒβ2−ｍは腎障害を
起こしたラットの尿で １匹あたり６４０μg/日であ
り、精製後の収率は７．５％となっている。
【０００５】ｒβ2−ｍの用途としては、動物におい
て、腎疾患、悪性腫瘍、自己免疫疾患、免疫不全の場合
にその血中レベルが上昇することから、かかる疾患に関
する動物用診断試薬として（標準試薬あるいは免疫用抗
原等として）の用途がある。しかしながら、上記のごと
く、従来の方法ではこの有用蛋白を大量、かつ容易に製
造することは困難であった。
て、腎疾患、悪性腫瘍、自己免疫疾患、免疫不全の場合
にその血中レベルが上昇することから、かかる疾患に関
する動物用診断試薬として（標準試薬あるいは免疫用抗
原等として）の用途がある。しかしながら、上記のごと
く、従来の方法ではこの有用蛋白を大量、かつ容易に製
造することは困難であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ｒβ2−ｍ
遺伝子からなるプラスミドを構築し、これによる形質転
換体微生物を得、該形質転換体微生物を培養してｒβ2
−ｍを容易に高純度でかつ大量に製造することを目的と
する。
遺伝子からなるプラスミドを構築し、これによる形質転
換体微生物を得、該形質転換体微生物を培養してｒβ2
−ｍを容易に高純度でかつ大量に製造することを目的と
する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明者らは鋭意研究を行い、ｒβ2−ｍを製造す
るのに使用可能なｒβ2−ｍをコードするＤＮＡ、これ
を含む組換えプラスミド、形質転換された微生物を取得
し、この微生物を培養し、ｒβ2−ｍを分離精製するこ
とに成功し、本発明を完成するに至った。
に、本発明者らは鋭意研究を行い、ｒβ2−ｍを製造す
るのに使用可能なｒβ2−ｍをコードするＤＮＡ、これ
を含む組換えプラスミド、形質転換された微生物を取得
し、この微生物を培養し、ｒβ2−ｍを分離精製するこ
とに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち、本発明は、（１） プロモータ
ー、翻訳開始信号、および停止信号を含むプラスミドに
ラット・β2−マイクログロブリンをコードするＤＮＡ
を、配列を一部改変したリンカーと共に組み込んだプラ
スミド、（２） ｐＫＣＲＢ３である（１）記載のプラ
スミド、（３） （１）または（２）プラスミドで形質
転換して得られる形質転換体微生物、（４） エシェリ
ヒア・コリ（Escherichia coli）である（３）記載の形
質転換体微生物、（５） エシェリヒア・コリＦＥＲＭ
Ｐ−１４６１０である（３）記載の形質転換体微生
物、（６） （３）記載の形質転換体微生物を培養し、
培養物からラット・β2−マイクログロブリンを単離す
ることを特徴とする、ラット・β2−マイクログロブリ
ンの製造方法、（７） 形質転換体微生物がエシェリヒ
ア・コリである（６）記載の方法、および、（８） 形
質転換体微生物がエシェリヒア・コリＦＥＲＭ Ｐ−１
４６１０である（６）記載の方法を提供する。以下に本
発明を詳細に説明する。
ー、翻訳開始信号、および停止信号を含むプラスミドに
ラット・β2−マイクログロブリンをコードするＤＮＡ
を、配列を一部改変したリンカーと共に組み込んだプラ
スミド、（２） ｐＫＣＲＢ３である（１）記載のプラ
スミド、（３） （１）または（２）プラスミドで形質
転換して得られる形質転換体微生物、（４） エシェリ
ヒア・コリ（Escherichia coli）である（３）記載の形
質転換体微生物、（５） エシェリヒア・コリＦＥＲＭ
Ｐ−１４６１０である（３）記載の形質転換体微生
物、（６） （３）記載の形質転換体微生物を培養し、
培養物からラット・β2−マイクログロブリンを単離す
ることを特徴とする、ラット・β2−マイクログロブリ
ンの製造方法、（７） 形質転換体微生物がエシェリヒ
ア・コリである（６）記載の方法、および、（８） 形
質転換体微生物がエシェリヒア・コリＦＥＲＭ Ｐ−１
４６１０である（６）記載の方法を提供する。以下に本
発明を詳細に説明する。
【０００９】本発明においては、ｒβ2−ｍ ＤＮＡは
以下に示すような方法で得られる。例えば、ラットｒβ
2−ｍ産生細胞（肝臓由来）からポリ(Ａ)ＲＮＡを調製
し、これを鋳型としてＤＮＡを合成するか、または、ラ
ット肝臓等のライブラリーからＰＣＲ法（ムリス，ケイ
（Mullis,K.）ら：メソッヅ・イン・エンザイモロジー
（Methods in Enzymology）（Academic Press,San Dieg
o），１５５，（１９８７））に従い目的のＤＮＡを
得、これを適当なプラスミドに接続して宿主細胞内で増
幅させ、目的のＤＮＡを有するクローンから単離する方
法、例えばホスホアミダイト法（シンハ，エヌ・ディー
（Shinha,N.D.)ら：テトラヒドロン・レターズ（Tetrah
edron Lett.），２４，５８４３，（１９８３））によ
り、ＤＮＡ配列に従って核酸の化学合成を行う方法、お
よびこれらの方法の組合わせなどがある。
以下に示すような方法で得られる。例えば、ラットｒβ
2−ｍ産生細胞（肝臓由来）からポリ(Ａ)ＲＮＡを調製
し、これを鋳型としてＤＮＡを合成するか、または、ラ
ット肝臓等のライブラリーからＰＣＲ法（ムリス，ケイ
（Mullis,K.）ら：メソッヅ・イン・エンザイモロジー
（Methods in Enzymology）（Academic Press,San Dieg
o），１５５，（１９８７））に従い目的のＤＮＡを
得、これを適当なプラスミドに接続して宿主細胞内で増
幅させ、目的のＤＮＡを有するクローンから単離する方
法、例えばホスホアミダイト法（シンハ，エヌ・ディー
（Shinha,N.D.)ら：テトラヒドロン・レターズ（Tetrah
edron Lett.），２４，５８４３，（１９８３））によ
り、ＤＮＡ配列に従って核酸の化学合成を行う方法、お
よびこれらの方法の組合わせなどがある。
【００１０】以下、ラット肝臓ライブラリーからｒβ2
−ｍ ＤＮＡを単離する方法を具体的に説明する。ま
ず、ＰＣＲ用プライマーを合成する。β−シアノエチル
ホスホアミダイト法により、ＤＮＡ合成機（アプライド
・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製等）を
用いて合成する。次に、ラット肝臓ライブラリーのフェ
ノール・クロロホルム処理を行い、エタノールを加えて
沈澱を集める。これをイオン交換水等に溶解し、パーキ
ン−エルマー（Perkin-Elmer）社のＰＣＲ用キット等を
用いてＰＣＲを行う。増幅したＤＮＡはアガロース電気
泳動を行い、目的の大きさのＤＮＡを回収するなどによ
り粗精製を行った後、もう一度ＰＣＲを行う。このよう
にして得られたｒβ2−ｍ ＤＮＡの配列確認のためシ
ーケンスを行う。
−ｍ ＤＮＡを単離する方法を具体的に説明する。ま
ず、ＰＣＲ用プライマーを合成する。β−シアノエチル
ホスホアミダイト法により、ＤＮＡ合成機（アプライド
・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製等）を
用いて合成する。次に、ラット肝臓ライブラリーのフェ
ノール・クロロホルム処理を行い、エタノールを加えて
沈澱を集める。これをイオン交換水等に溶解し、パーキ
ン−エルマー（Perkin-Elmer）社のＰＣＲ用キット等を
用いてＰＣＲを行う。増幅したＤＮＡはアガロース電気
泳動を行い、目的の大きさのＤＮＡを回収するなどによ
り粗精製を行った後、もう一度ＰＣＲを行う。このよう
にして得られたｒβ2−ｍ ＤＮＡの配列確認のためシ
ーケンスを行う。
【００１１】まず、ｒβ2−ｍ ＤＮＡを適当な制限酵
素で切断する（例えばＡｆａIとＡｖａII）。次に、微
生物でのｒβ2−ｍ発現量を上げるため、またこの後の
プラスミドへの導入を行うため、制限酵素サイトを有
し、ＤＮＡ配列を天然のものとは変えたリンカーＤＮＡ
を合成する。シークエンス用のプラスミドは公知のｐＵ
Ｃ１９、Ｍ１３などを用い、合成リンカー、制限酵素で
切断したｒβ2−ｍ ＤＮＡをＤＮＡリガーゼにより組
み込み、大腸菌、ファージに導入する。プラスミドの導
入は、ハナハン，ディー（Hanahan,D.）らの方法（ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Bi
ol.），１６６，５５７，（１９８３））などにより行
う。形質転換株の選択にはアンピシリン耐性のマーカー
を利用できる。組換えプラスミドの選別は、ｌａｃＺ欠
損細胞を宿主として用い、β−ガラクトシターゼのα−
相補性で選択する方法や、プラスミドを抽出し（バーン
ビオム，エイチ・シー（Birnboim,H.C.）ら：ヌクレイ
ック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.），
５，５８３，（１９７８））制限酵素で処理した場合の
ＤＮＡ断片の大きさを調べる等の方法がある。
素で切断する（例えばＡｆａIとＡｖａII）。次に、微
生物でのｒβ2−ｍ発現量を上げるため、またこの後の
プラスミドへの導入を行うため、制限酵素サイトを有
し、ＤＮＡ配列を天然のものとは変えたリンカーＤＮＡ
を合成する。シークエンス用のプラスミドは公知のｐＵ
Ｃ１９、Ｍ１３などを用い、合成リンカー、制限酵素で
切断したｒβ2−ｍ ＤＮＡをＤＮＡリガーゼにより組
み込み、大腸菌、ファージに導入する。プラスミドの導
入は、ハナハン，ディー（Hanahan,D.）らの方法（ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Bi
ol.），１６６，５５７，（１９８３））などにより行
う。形質転換株の選択にはアンピシリン耐性のマーカー
を利用できる。組換えプラスミドの選別は、ｌａｃＺ欠
損細胞を宿主として用い、β−ガラクトシターゼのα−
相補性で選択する方法や、プラスミドを抽出し（バーン
ビオム，エイチ・シー（Birnboim,H.C.）ら：ヌクレイ
ック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.），
５，５８３，（１９７８））制限酵素で処理した場合の
ＤＮＡ断片の大きさを調べる等の方法がある。
【００１２】ＤＮＡ配列の決定は、ジデオキシ法（サン
ガー，エフ（Sanger,F.）ら：プロシーディングス・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・ユーエスエイ（Pr
oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.），７４，５４６３，１９７
７）などがあり、市販のシーケンス反応キットもでてい
る。
ガー，エフ（Sanger,F.）ら：プロシーディングス・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・ユーエスエイ（Pr
oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.），７４，５４６３，１９７
７）などがあり、市販のシーケンス反応キットもでてい
る。
【００１３】微生物を培養してｒβ2−ｍを製造する方
法を以下に説明する。上記の方法で得られたｒβ2−ｍ
ＤＮＡを含むプラスミドｐＵＣＲＢ１からＤＮＡ部分
を常法により切り出し、発現用プラスミドに組み込み、
形質転換を行う。発現用プラスミドとしては、例えば
ｐＫＫ２２３−３（ファルマシア（Pharmacia）社製）
のようにプロモーター、ＳＤ配列を持つものを使用す
る。また、ｒβ2−ｍ生産量を向上させるためプラスミ
ドのコピー数を増やす目的で、複製開始点をｐＵＣ１９
などのマルチコピー型のものに換えることもできる。宿
主としてはエシェリヒア・コリＨＢ１０１株やＪＭ１０
９株などが挙げられる。
法を以下に説明する。上記の方法で得られたｒβ2−ｍ
ＤＮＡを含むプラスミドｐＵＣＲＢ１からＤＮＡ部分
を常法により切り出し、発現用プラスミドに組み込み、
形質転換を行う。発現用プラスミドとしては、例えば
ｐＫＫ２２３−３（ファルマシア（Pharmacia）社製）
のようにプロモーター、ＳＤ配列を持つものを使用す
る。また、ｒβ2−ｍ生産量を向上させるためプラスミ
ドのコピー数を増やす目的で、複製開始点をｐＵＣ１９
などのマルチコピー型のものに換えることもできる。宿
主としてはエシェリヒア・コリＨＢ１０１株やＪＭ１０
９株などが挙げられる。
【００１４】形質転換株は、アンピシリンを含む培地
（例えばＬ培地等）で培養し、耐性のある菌株を選択
し、さらにｒβ2−ｍ生産は、ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（レムリ，ユー・ケイ（Laemmli,U.
K.）：ネイチャー（Nature），２２７，６８０，（１９
７０））したゲルから、電気的にニトロセルロースフィ
ルター等に転写を行い（バーネット，ダブリュー・エヌ
（Burnette,W.N.）：アナリティカル・バイオレミスト
リー（Anal.Biochem.），１１２，１９５，（１９８
１））、エンザイムイムノアッセイ（バクル，ピー（Bu
cle,P.）ら：ジーン（Gene），１６，１４９，（１９８
１））を行うことにより確認できる。
（例えばＬ培地等）で培養し、耐性のある菌株を選択
し、さらにｒβ2−ｍ生産は、ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（レムリ，ユー・ケイ（Laemmli,U.
K.）：ネイチャー（Nature），２２７，６８０，（１９
７０））したゲルから、電気的にニトロセルロースフィ
ルター等に転写を行い（バーネット，ダブリュー・エヌ
（Burnette,W.N.）：アナリティカル・バイオレミスト
リー（Anal.Biochem.），１１２，１９５，（１９８
１））、エンザイムイムノアッセイ（バクル，ピー（Bu
cle,P.）ら：ジーン（Gene），１６，１４９，（１９８
１））を行うことにより確認できる。
【００１５】このように形質転換した大腸菌としては、
平成６年１０月３１日に、ＦＥＲＭＰ−１４６１０の受
託番号の下、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託
されたエシェリヒア・コリ等が挙げられる。かかる菌株
を適当な培地で培養することにより菌体内にｒβ2−ｍ
を生成させることができる。培地は例えば、Ｌ培地、Ｍ
９培地などが使用可能で、これに通常使用されている炭
素源、窒素源、無機塩、その他の栄養源を添加できる。
培養は、ｐＨ７付近、３７℃前後で通気、攪拌条件下で
行うのが妥当である。対数増殖期後期に誘導剤を加える
と細胞内にｒβ2−ｍが蓄積し始める。菌体が増殖しな
くなったら集菌し、超音波破砕、浸透圧ショックなどの
方法により細胞内からｒβ2−ｍを抽出できる。
平成６年１０月３１日に、ＦＥＲＭＰ−１４６１０の受
託番号の下、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託
されたエシェリヒア・コリ等が挙げられる。かかる菌株
を適当な培地で培養することにより菌体内にｒβ2−ｍ
を生成させることができる。培地は例えば、Ｌ培地、Ｍ
９培地などが使用可能で、これに通常使用されている炭
素源、窒素源、無機塩、その他の栄養源を添加できる。
培養は、ｐＨ７付近、３７℃前後で通気、攪拌条件下で
行うのが妥当である。対数増殖期後期に誘導剤を加える
と細胞内にｒβ2−ｍが蓄積し始める。菌体が増殖しな
くなったら集菌し、超音波破砕、浸透圧ショックなどの
方法により細胞内からｒβ2−ｍを抽出できる。
【００１６】こうして得られたｒβ2−ｍは、その性質
を利用して、公知の各種の精製操作により精製できる。
例えば溶解度法、クロマトグラフィー法、ゲルろ過、及
びそれらの組み合わせなどがある。上記の方法で、ｒβ
2−ｍを容易に高純度でかつ大量に製造できる。
を利用して、公知の各種の精製操作により精製できる。
例えば溶解度法、クロマトグラフィー法、ゲルろ過、及
びそれらの組み合わせなどがある。上記の方法で、ｒβ
2−ｍを容易に高純度でかつ大量に製造できる。
【００１７】
【実施例】以下に、実施例により本発明をさらに具体的
に説明するが、これに限定されるものではない。
に説明するが、これに限定されるものではない。
【００１８】実施例１ ｒβ2−ｍ ＤＮＡ調製 ＤＮＡ合成機（アプライド・バイオシステムズ（Applie
d Biosystems）社製、３８１Ａ）にて、表１に示すＰＣ
Ｒ用プライマー（プライマー１および２）を合成した。
d Biosystems）社製、３８１Ａ）にて、表１に示すＰＣ
Ｒ用プライマー（プライマー１および２）を合成した。
【００１９】
【表１】
【００２０】ラット・肝臓５'−ストレッチｃＤＮＡ／
λｇｔ１１（クローンテック（CLONTECH）社製、インデ
ィペンデント・クローン（Independent Clones）１．７
×１０６）に水２００μｌ加えて溶解し、フェノール−
クロロホルム（１：１）処理を行った。エタノール沈澱
によりＤＮＡを回収した。こうして得られたＤＮＡの１
／１００量から、ＰＣＲ用プライマー各２０ｐｍｏｌ、
ＰＣＲ用キット（パーキン−エルマー（Perkin-Elmer）
社製）を用いて、プログラマブルテンプコントロールシ
ステム（アステック（ASTEC）社製 ＰＣ−７００）に
より増幅した。得られた反応液をアガロース電気泳動に
より約３６０ｂｐ断片を回収し、もう一度ＰＣＲを行っ
た。得られた反応液のフェノール−クロロホルム処理、
エタノール沈澱を行った。回収したＤＮＡを３３ｍＭ
Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７.９），１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２，０.５ｍＭ ジチオスレイトール（以下ＤＴ
Ｔ），６６ｍＭ 酢酸カリウム，０．０１％ ＢＳＡ
４００μｌに溶解し、制限酵素 ＡｆａI、ＡｖａII
（宝酒造社製）各２０単位加え、３７℃、４時間消化を
行った。この反応液からポリアクリルアミドゲル電気泳
動により、ｒβ2−ｍ ＤＮＡの ＡｆａI−ＡｖａII断
片約２６０ｂｐを得た。
λｇｔ１１（クローンテック（CLONTECH）社製、インデ
ィペンデント・クローン（Independent Clones）１．７
×１０６）に水２００μｌ加えて溶解し、フェノール−
クロロホルム（１：１）処理を行った。エタノール沈澱
によりＤＮＡを回収した。こうして得られたＤＮＡの１
／１００量から、ＰＣＲ用プライマー各２０ｐｍｏｌ、
ＰＣＲ用キット（パーキン−エルマー（Perkin-Elmer）
社製）を用いて、プログラマブルテンプコントロールシ
ステム（アステック（ASTEC）社製 ＰＣ−７００）に
より増幅した。得られた反応液をアガロース電気泳動に
より約３６０ｂｐ断片を回収し、もう一度ＰＣＲを行っ
た。得られた反応液のフェノール−クロロホルム処理、
エタノール沈澱を行った。回収したＤＮＡを３３ｍＭ
Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７.９），１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２，０.５ｍＭ ジチオスレイトール（以下ＤＴ
Ｔ），６６ｍＭ 酢酸カリウム，０．０１％ ＢＳＡ
４００μｌに溶解し、制限酵素 ＡｆａI、ＡｖａII
（宝酒造社製）各２０単位加え、３７℃、４時間消化を
行った。この反応液からポリアクリルアミドゲル電気泳
動により、ｒβ2−ｍ ＤＮＡの ＡｆａI−ＡｖａII断
片約２６０ｂｐを得た。
【００２１】また、ＤＮＡ合成機を用いて、表２に示す
リンカー４本（ＲＢ ａ、ｂ、ｃおよびｄ）を合成し
た。
リンカー４本（ＲＢ ａ、ｂ、ｃおよびｄ）を合成し
た。
【００２２】
【表２】
【００２３】リンカー ＲＢａおよびｂは ｒβ2−ｍ
生産を高めるため、ｒβ2−ｍのアミノ酸配列を変えな
い範囲でＤＮＡ配列を変えた。合成リンカーＲＢａと
ｂ、ＲＢｃとｄそれぞれ２０ｐｍｏｌをアニーリング
（９０℃→６５℃→３７℃→室温各５分間）させた。
生産を高めるため、ｒβ2−ｍのアミノ酸配列を変えな
い範囲でＤＮＡ配列を変えた。合成リンカーＲＢａと
ｂ、ＲＢｃとｄそれぞれ２０ｐｍｏｌをアニーリング
（９０℃→６５℃→３７℃→室温各５分間）させた。
【００２４】プラスミドは、ｐＵＣ１９ ２μｇを１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２，１ｍＭ ＤＴＴ，５０ｍＭ ＮａＣｌ ４０
０μｌに溶解し、ＥｃｏＲI（宝酒造社製）１０単位加
え、３７℃，４時間消化した後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ
ＤＴＴ，１００ｍＭ ＮａＣｌ ４００μｌにＨｉｎ
ｄIII １０単位加え、３７℃，４時間消化を行った。
この反応液からアガロース電気泳動により、ｐＵＣ１９
ＥｃｏＲI−ＨｉｎｄIII断片約２６４０ｂｐを得た。
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２，１ｍＭ ＤＴＴ，５０ｍＭ ＮａＣｌ ４０
０μｌに溶解し、ＥｃｏＲI（宝酒造社製）１０単位加
え、３７℃，４時間消化した後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ
ＤＴＴ，１００ｍＭ ＮａＣｌ ４００μｌにＨｉｎ
ｄIII １０単位加え、３７℃，４時間消化を行った。
この反応液からアガロース電気泳動により、ｐＵＣ１９
ＥｃｏＲI−ＨｉｎｄIII断片約２６４０ｂｐを得た。
【００２５】合成リンカーＲＢａおよびｂ、ＲＢｃおよ
びｄ 各２０ｐｍｏｌ、ｒβ2−ｍＤＮＡ ＡｆａI−Ａ
ｖａII １０ｎｇ、ｐＵＣ１９ ＥｃｏＲI−ＨｉｎｄI
II断片２０ｎｇを宝酒造社製ライゲーションキットを用
いて１６℃，３時間ライゲーション反応を行い、この反
応溶液をＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造社製）に
加えて、０℃，３０分間、４２℃，９０秒間、０℃，２
分間反応を行った。次に、ＳＯＣ培地８００μｌを加え
て、３７℃，１時間振盪し、１００μｇ／ｍｌアンピシ
リンを含むＬ培地（１．０％トリプトン，１．０％ Ｎ
ａＣｌ，０．５％ 酵母エキス）に５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（以下Ｘ
−ｇａｌ），イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド（以下ＩＰＴＧ）を加えた寒天プレートにまい
て、３７℃で一晩培養した。
びｄ 各２０ｐｍｏｌ、ｒβ2−ｍＤＮＡ ＡｆａI−Ａ
ｖａII １０ｎｇ、ｐＵＣ１９ ＥｃｏＲI−ＨｉｎｄI
II断片２０ｎｇを宝酒造社製ライゲーションキットを用
いて１６℃，３時間ライゲーション反応を行い、この反
応溶液をＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造社製）に
加えて、０℃，３０分間、４２℃，９０秒間、０℃，２
分間反応を行った。次に、ＳＯＣ培地８００μｌを加え
て、３７℃，１時間振盪し、１００μｇ／ｍｌアンピシ
リンを含むＬ培地（１．０％トリプトン，１．０％ Ｎ
ａＣｌ，０．５％ 酵母エキス）に５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（以下Ｘ
−ｇａｌ），イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド（以下ＩＰＴＧ）を加えた寒天プレートにまい
て、３７℃で一晩培養した。
【００２６】アンピシリン耐性でかつβ−ガラクトシタ
ーゼ活性が誘導されていない株からプラスミドを抽出
し、ＥｃｏＲI−ＨｉｎｄIII，ＴｔｈＨＢ８I（宝酒造
社製）を用いてＤＮＡ断片の大きさを調べ、目的のＤＮ
Ａの挿入された株をえた。（ＪＭ１０９／ｐＵＣＲＢ
２）
ーゼ活性が誘導されていない株からプラスミドを抽出
し、ＥｃｏＲI−ＨｉｎｄIII，ＴｔｈＨＢ８I（宝酒造
社製）を用いてＤＮＡ断片の大きさを調べ、目的のＤＮ
Ａの挿入された株をえた。（ＪＭ１０９／ｐＵＣＲＢ
２）
【００２７】この株から大量にプラスミドを抽出し、セ
ファロース４Ｂ（ファルマシア（Pharmacia）社製）で
精製し、シーケンスを行った。シーケンス反応は、ファ
ルマシア社製オート・リード・シークエンシング・キッ
ト（Auto Read Sequencing Kit）を用い、Ａ．Ｌ．Ｆ．
シークエンサーにてシーケンスを行ったところマウクシ
オン，エフ（Mauxion,F.）らの報告と一致した（配列
表：１）。
ファロース４Ｂ（ファルマシア（Pharmacia）社製）で
精製し、シーケンスを行った。シーケンス反応は、ファ
ルマシア社製オート・リード・シークエンシング・キッ
ト（Auto Read Sequencing Kit）を用い、Ａ．Ｌ．Ｆ．
シークエンサーにてシーケンスを行ったところマウクシ
オン，エフ（Mauxion,F.）らの報告と一致した（配列
表：１）。
【００２８】実施例２ ｒβ２−ｍ 発現用プラスミド
構築 図１を参照して説明する。実施例１で得た ｐＵＣＲＢ
２プラスミド５μｇを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭＤＴＴ，５
０ｍＭ ＮａＣｌ ４００μｌに溶解し、ＡｆａI、Ｈ
ｉｎｄIII各２０単位加え、３７℃，４時間消化を行っ
た。この反応液からポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より、ｒβ2−ｍ ＤＮＡのＡｆａI−ＨｉｎｄIII断片
約２７０ｂｐを得た。
構築 図１を参照して説明する。実施例１で得た ｐＵＣＲＢ
２プラスミド５μｇを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭＤＴＴ，５
０ｍＭ ＮａＣｌ ４００μｌに溶解し、ＡｆａI、Ｈ
ｉｎｄIII各２０単位加え、３７℃，４時間消化を行っ
た。この反応液からポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より、ｒβ2−ｍ ＤＮＡのＡｆａI−ＨｉｎｄIII断片
約２７０ｂｐを得た。
【００２９】ｒβ2−ｍ発現用プラスミドｐＫＣＲＢ３
は以下のようにして構築した（図４）。ｐＵＣ１９ ２
μｇを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１
０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＤＴＴ，５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ ４００μｌに溶解してＰｖｕII（宝酒造社製）１
０単位加え、３７℃，４時間消化した後、１０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，
１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール，１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ ４００μｌにＳｓｐI（ニッポンジーン社製）
１０単位加え、３７℃，４時間消化を行った。この反応
液からアガロース電気泳動により ｐＵＣ１９ Ｓｓｐ
I−ＰｖｕII断片１,８７３ｂｐを得た。また、ｐＫＫ２
２３−３（ファルマシア社製）５μｇを１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，
１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール，１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ ４００μｌに溶解してＳｓｐI３０単位加え、
３７℃，４時間消化を行った。次に、０．１Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）４００μｌにアルカリホスフ
ァターゼ（宝酒造社製）２単位加えて、５５℃，３０分
間反応させ、この反応液からポリアクリルアミドゲル電
気泳動により、ｐＫＫ２２３−３ ＳｓｐI断片６２０
ｂｐを得た。
は以下のようにして構築した（図４）。ｐＵＣ１９ ２
μｇを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１
０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＤＴＴ，５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ ４００μｌに溶解してＰｖｕII（宝酒造社製）１
０単位加え、３７℃，４時間消化した後、１０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，
１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール，１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ ４００μｌにＳｓｐI（ニッポンジーン社製）
１０単位加え、３７℃，４時間消化を行った。この反応
液からアガロース電気泳動により ｐＵＣ１９ Ｓｓｐ
I−ＰｖｕII断片１,８７３ｂｐを得た。また、ｐＫＫ２
２３−３（ファルマシア社製）５μｇを１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，
１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール，１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ ４００μｌに溶解してＳｓｐI３０単位加え、
３７℃，４時間消化を行った。次に、０．１Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）４００μｌにアルカリホスフ
ァターゼ（宝酒造社製）２単位加えて、５５℃，３０分
間反応させ、この反応液からポリアクリルアミドゲル電
気泳動により、ｐＫＫ２２３−３ ＳｓｐI断片６２０
ｂｐを得た。
【００３０】ｐＫＫ２２３−３ ＳｓｐI断片 １０ｎ
ｇ、ｐＵＣ１９ ＳｓｐI−ＰｖｕII断片 ２０ｎｇを
宝酒造社製ライゲーションキットを用いて１６℃，３時
間ライゲーション反応を行い、この反応溶液をＪＭ１０
９コンピテントセル（宝酒造社製）に加えて、０℃，３
０分間、４２℃，９０秒間、０℃，２分間反応を行っ
た。次に、ＳＯＣ培地８００μｌを加えて、３７℃，１
時間振盪し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬ培
地寒天プレートにまいて、３７℃で一晩培養した。
ｇ、ｐＵＣ１９ ＳｓｐI−ＰｖｕII断片 ２０ｎｇを
宝酒造社製ライゲーションキットを用いて１６℃，３時
間ライゲーション反応を行い、この反応溶液をＪＭ１０
９コンピテントセル（宝酒造社製）に加えて、０℃，３
０分間、４２℃，９０秒間、０℃，２分間反応を行っ
た。次に、ＳＯＣ培地８００μｌを加えて、３７℃，１
時間振盪し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬ培
地寒天プレートにまいて、３７℃で一晩培養した。
【００３１】アンピシリン耐性株からプラスミドを抽出
し、ＨｉｎｄIII−ＳｓｐIを用いてＤＮＡ断片の大きさ
を調べ、ＤＮＡの挿入された株を得た（ＪＭ１０９／ｐ
ＫＣ１）。 ｐＫＣ１ ２μｇを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ
ＤＴＴ，１００ｍＭ ＮａＣｌ ４００μｌに溶解し
てＥｃｏＲI（宝酒造社製）１０単位加え、３７℃，４
時間消化した後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＤＴＴ，５
０ｍＭ ＮａＣｌ ４００μｌにＨｉｎｄIII（宝酒造
社製）１０単位加え、３７℃，４時間消化を行った。こ
の反応液からアガロースゲル電気泳動により、ｐＫＣ１
ＥｃｏＲI−ＨｉｎｄIII断片 ２４６３ｂｐを得た。
し、ＨｉｎｄIII−ＳｓｐIを用いてＤＮＡ断片の大きさ
を調べ、ＤＮＡの挿入された株を得た（ＪＭ１０９／ｐ
ＫＣ１）。 ｐＫＣ１ ２μｇを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ
ＤＴＴ，１００ｍＭ ＮａＣｌ ４００μｌに溶解し
てＥｃｏＲI（宝酒造社製）１０単位加え、３７℃，４
時間消化した後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＤＴＴ，５
０ｍＭ ＮａＣｌ ４００μｌにＨｉｎｄIII（宝酒造
社製）１０単位加え、３７℃，４時間消化を行った。こ
の反応液からアガロースゲル電気泳動により、ｐＫＣ１
ＥｃｏＲI−ＨｉｎｄIII断片 ２４６３ｂｐを得た。
【００３２】合成リンカーＲＢａおよびｂ ２０ｐｍｏ
ｌ、ｒβ2−ｍ ＤＮＡ ＡｆａI−ＨｉｎｄIII断片
１０ｎｇ、ｐＫＣ１ ＥｃｏＲI−ＨｉｎｄIII断片 ２
０ｎｇを宝酒造社製ライゲーションキットを用いて１６
℃，３時間ライゲーション反応を行い、プラスミドｐＫ
ＣＲＢ３を得た。この反応溶液をＪＭ１０９コンピテン
トセル（宝酒造社製）に加えて、０℃，３０分間、４２
℃，９０秒間、０℃，２分間反応を行った。次に、ＳＯ
Ｃ培地８００μｌを加えて、３７℃，１時間振盪し、１
００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬ培地寒天プレート
にまいて、３７℃で一晩培養した。アンピシリン耐性株
からプラスミド（ｐＫＣＲＢ３）を抽出し、ＡｆａI−
ＨｉｎｄIIIを用いてＤＮＡ断片の大きさを調べた。ｐ
ＫＣＲＢ３の挿入された株（ＪＭ１０９／ｐＫＣＲＢ
３）を得た。この株は、平成６年１０月３１日より、工
業技術院生命工学工業研究所に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ
−１４６１０の下に寄託されている。
ｌ、ｒβ2−ｍ ＤＮＡ ＡｆａI−ＨｉｎｄIII断片
１０ｎｇ、ｐＫＣ１ ＥｃｏＲI−ＨｉｎｄIII断片 ２
０ｎｇを宝酒造社製ライゲーションキットを用いて１６
℃，３時間ライゲーション反応を行い、プラスミドｐＫ
ＣＲＢ３を得た。この反応溶液をＪＭ１０９コンピテン
トセル（宝酒造社製）に加えて、０℃，３０分間、４２
℃，９０秒間、０℃，２分間反応を行った。次に、ＳＯ
Ｃ培地８００μｌを加えて、３７℃，１時間振盪し、１
００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬ培地寒天プレート
にまいて、３７℃で一晩培養した。アンピシリン耐性株
からプラスミド（ｐＫＣＲＢ３）を抽出し、ＡｆａI−
ＨｉｎｄIIIを用いてＤＮＡ断片の大きさを調べた。ｐ
ＫＣＲＢ３の挿入された株（ＪＭ１０９／ｐＫＣＲＢ
３）を得た。この株は、平成６年１０月３１日より、工
業技術院生命工学工業研究所に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ
−１４６１０の下に寄託されている。
【００３３】実施例３ ｒβ2−ｍ の発現 実験例２で得たＪＭ１０９／ｐＫＣＲＢ３を１００μｇ
／ｍｌアンピシリンを含むＬ培地 ５ｍｌに植菌し、３
７℃で培養して、培養液の吸光度を分光光度計（日立
（HITACHI）社製，Ｕ−２０００）で測定し、ＯＤ660＝
０．２〜０．３になったところでＩＰＴＧを２ｍＭとな
るように添加し、一晩培養した。得られた培養液１．５
ｍｌをマイクロチューブに移し、微量高速遠心機（トミ
ー（TOMY）社製ＭＣ−１５０）にて１５０００ｒｐｍで
１分間遠心して菌体を回収した。
／ｍｌアンピシリンを含むＬ培地 ５ｍｌに植菌し、３
７℃で培養して、培養液の吸光度を分光光度計（日立
（HITACHI）社製，Ｕ−２０００）で測定し、ＯＤ660＝
０．２〜０．３になったところでＩＰＴＧを２ｍＭとな
るように添加し、一晩培養した。得られた培養液１．５
ｍｌをマイクロチューブに移し、微量高速遠心機（トミ
ー（TOMY）社製ＭＣ−１５０）にて１５０００ｒｐｍで
１分間遠心して菌体を回収した。
【００３４】この菌体をレムリのサンプルバッファーに
懸濁した後、１００℃で１０分間加熱し、レムリの方法
でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動したゲルか
ら、電気的にニトロセルロースフィルターに転写を行っ
た。このフィルターにｒβ2−ｍに対する抗体と、ＨＲ
Ｐ標識プロテインＡを反応させたところ、分子量約１
２，０００の位置にバンドを検出し、ＪＭ１０９／ｐＫ
ＣＲＢ３がｒβ2−ｍを生産していることがわかった。
懸濁した後、１００℃で１０分間加熱し、レムリの方法
でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動したゲルか
ら、電気的にニトロセルロースフィルターに転写を行っ
た。このフィルターにｒβ2−ｍに対する抗体と、ＨＲ
Ｐ標識プロテインＡを反応させたところ、分子量約１
２，０００の位置にバンドを検出し、ＪＭ１０９／ｐＫ
ＣＲＢ３がｒβ2−ｍを生産していることがわかった。
【００３５】実施例４ ｒβ2−ｍ の生産 実験例２で得た菌株を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを
含むＬ培地寒天プレートにまいて、３７℃で一晩培養し
た。次に、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬ培地
に植えて、３７℃で８時間振盪培養し、このうち１００
μｌを１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む表３の組成
の培地１００ｍｌに植え、３７℃で一晩培養した。１０
０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む表３の組成の培地６０
０ｍｌ（最終容量）に全量加えて３７℃で振盪し、培養
液の吸光度を分光光度計で測定して対数増殖期の後期に
ＩＰＴＧを２ｍＭとなるように加えた。１０〜１５時間
培養を続け、培養液を遠心管に移して高速冷却遠心機
（ＴＯＭＹ社製，ＲＳ−２０ＩＶ）で菌体を集めた。
含むＬ培地寒天プレートにまいて、３７℃で一晩培養し
た。次に、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬ培地
に植えて、３７℃で８時間振盪培養し、このうち１００
μｌを１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む表３の組成
の培地１００ｍｌに植え、３７℃で一晩培養した。１０
０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む表３の組成の培地６０
０ｍｌ（最終容量）に全量加えて３７℃で振盪し、培養
液の吸光度を分光光度計で測定して対数増殖期の後期に
ＩＰＴＧを２ｍＭとなるように加えた。１０〜１５時間
培養を続け、培養液を遠心管に移して高速冷却遠心機
（ＴＯＭＹ社製，ＲＳ−２０ＩＶ）で菌体を集めた。
【００３６】
【表３】
【００３７】実施例５ ｒβ2−ｍ の精製 実施例４で得られた菌体を ｐｐバッファー（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）１００ｍｌに１ｍｇ／ｍｌリゾチーム，０．１ｍＭ
（ρ−アミジノフェニル）メタンスルホニルフルオラ
イド塩酸塩を加えた溶液に懸濁し、０℃で３０分間反応
した後ｐｐバッファー５０ｍｌを加えて超音波破砕を行
った（日本精機製作所製，ＵＳ−６００）。高速冷却遠
心機にて９０００ｒｐｍ，１０分間遠心して上清を除
き、ｐｐバッファー１５０ｍｌに懸濁して再び超音波破
砕装置にかけ、遠心を行った。得られた沈澱を１Ｍシュ
ークロース４００ｍｌに懸濁し、８０００ｒｐｍ，４０
分間遠心した。得られた沈澱を２％トライトンＸ−１０
０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．５）４００ｍｌ
に懸濁し、４℃で一晩置いてから８０００ｒｐｍ，４０
分間遠心した。得られた沈澱を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）４００ｍｌに懸濁し、８０００ｒｐ
ｍ，４０分間遠心した。得られた沈澱を可溶化液（６Ｍ
塩酸グアニジン，０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ
８．０）に溶解し、分光光度計にて吸光度を測定した。
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）１００ｍｌに１ｍｇ／ｍｌリゾチーム，０．１ｍＭ
（ρ−アミジノフェニル）メタンスルホニルフルオラ
イド塩酸塩を加えた溶液に懸濁し、０℃で３０分間反応
した後ｐｐバッファー５０ｍｌを加えて超音波破砕を行
った（日本精機製作所製，ＵＳ−６００）。高速冷却遠
心機にて９０００ｒｐｍ，１０分間遠心して上清を除
き、ｐｐバッファー１５０ｍｌに懸濁して再び超音波破
砕装置にかけ、遠心を行った。得られた沈澱を１Ｍシュ
ークロース４００ｍｌに懸濁し、８０００ｒｐｍ，４０
分間遠心した。得られた沈澱を２％トライトンＸ−１０
０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．５）４００ｍｌ
に懸濁し、４℃で一晩置いてから８０００ｒｐｍ，４０
分間遠心した。得られた沈澱を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）４００ｍｌに懸濁し、８０００ｒｐ
ｍ，４０分間遠心した。得られた沈澱を可溶化液（６Ｍ
塩酸グアニジン，０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ
８．０）に溶解し、分光光度計にて吸光度を測定した。
【００３８】この溶液に２−メルカプトエタノールを
０．１Ｍとなるように加えて還元し、リフォールディン
グバッファー（Refolding buffer）（１Ｍ尿素，５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１５％グリ
セロール，１ｍＭ 還元型グルタチオン，０．１ｍＭ
酸化型 グルタチオン，ｐＨ８．５）に懸濁した。室温
で約２０時間放置した後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．５），０．１ｍＭ ＥＤＴＡで透析を行っ
た。透析後の溶液をＰＲＯＴＥＩＮ−ＰＡＫ Ｇ−ＤＥ
ＡＥ（ウォーターズ（Waters）社製）で精製し、バイオ
ラッド・ラボラトリーズ社のプロテインアッセイ試薬に
より蛋白量を測定したところ、約２０ｍｇであった。得
られた精製物は、レムリの方法でＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行ったところ単一バンドであるこ
とが確認された。
０．１Ｍとなるように加えて還元し、リフォールディン
グバッファー（Refolding buffer）（１Ｍ尿素，５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１５％グリ
セロール，１ｍＭ 還元型グルタチオン，０．１ｍＭ
酸化型 グルタチオン，ｐＨ８．５）に懸濁した。室温
で約２０時間放置した後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．５），０．１ｍＭ ＥＤＴＡで透析を行っ
た。透析後の溶液をＰＲＯＴＥＩＮ−ＰＡＫ Ｇ−ＤＥ
ＡＥ（ウォーターズ（Waters）社製）で精製し、バイオ
ラッド・ラボラトリーズ社のプロテインアッセイ試薬に
より蛋白量を測定したところ、約２０ｍｇであった。得
られた精製物は、レムリの方法でＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行ったところ単一バンドであるこ
とが確認された。
【００３９】
【発明の効果】本発明によれば、高純度ラット・β2−
マイクログロブリンを大量かつ容易に製造する方法が提
供される。また、そのためのプラスミド、および該プラ
スミドにより形質転換された微生物も提供される。
マイクログロブリンを大量かつ容易に製造する方法が提
供される。また、そのためのプラスミド、および該プラ
スミドにより形質転換された微生物も提供される。
【００４０】
【００４１】配列番号：１ 配列の長さ：６０４ 配列の型：核酸 配列 cggcacg ATG GCT CGC TCG GTG ACC GTG ATC TTT CTG GTG CTT GTC TCT CTG 52 Met Ala Arg Ser Val Thr Val Ile Phe Leu Val Leu Val Ser Leu -20 -15 -10 GCC GTC GTG CTT GCC ATT CAG AAA ACT CCC CAA ATT CAA GTG TAC TCT CGC 103 Ala Val Val Leu Ala Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln Val Tyr Ser Arg -5 1 5 10 CAT CCA CCG GAG AAT GGG AAG CCC AAC TTC CTC AAC TGC TAC GTG TCT CAG 154 His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gln 15 20 25 TTC CAC CCA CCT CAG ATA GAA ATT GAG CTA CTG AAG AAT GGA AAG AAG ATA 205 Phe His Pro Pro Gln Ile Glu Ile Glu Leu Leu Lys Asn Gly Lys Lys Ile 30 35 40 45 CCA AAT ATC GAG ATG TCA GAT CTG TCC TTC AGC AAG GAC TGG TCT TTC TAC 256 Pro Asn Ile Glu Met Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr 50 55 60 ATC CTG GCT CAC ACT GAA TTC ACA CCC ACC GAG ACC GAT GTA TAT GCT TGC 307 Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Thr Asp Val Tyr Ala Cys 65 70 75 80 AGA GTT AAA CAC GTC ACT CTG AAG GAG CCC AAA ACC GTC ACC TGG GAC CGA 358 Arg Val Lys His Val Thr Leu Lys Glu Pro Lys Thr Val Thr Trp Asp Arg 85 90 95 GAC ATG TAA tcaagctcta tggagctctg aatcatctgg accagtttaa ctccagatcc 417 Asp Met *** ggtttctaat atgctataca atttatccac aaagtaaaga atagcaatga gcacaccatc 477 ttcttcatat cttaccttaa atattttatg catgttttaa aaaaaattgg agactaatat 537 cctagatttc cggaataata aagcttcaat gagtgttttg atcagaataa taaatatggt 597 taagaac 604
【図１】 ｐＫＣＲＢ３の構築を示すスキーム図であ
る。
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (8)
- 【請求項１】 プロモーター、翻訳開始信号、および停
止信号を含むプラスミドにラット・β2−マイクログロ
ブリンをコードするＤＮＡを、配列を一部改変したリン
カーと共に組み込んだプラスミド。 - 【請求項２】 ｐＫＣＲＢ３である請求項１記載のプラ
スミド。 - 【請求項３】 請求項１または２記載のプラスミドで形
質転換して得られる形質転換体微生物。 - 【請求項４】 エシェリヒア・コリ（Escherichia col
i）である請求項３記載の形質転換体微生物。 - 【請求項５】 エシェリヒア・コリＦＥＲＭ Ｐ−１４
６１０である請求項３記載の形質転換体微生物。 - 【請求項６】 請求項３記載の形質転換体微生物を培養
し、培養物からラット・β2−マイクログロブリンを単
離することを特徴とする、ラット・β2−マイクログロ
ブリンの製造方法。 - 【請求項７】 形質転換体微生物がエシェリヒア・コリ
である請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 形質転換体微生物がエシェリヒア・コリ
ＦＥＲＭ Ｐ−１４６１０である請求項６記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6286540A JPH08140679A (ja) | 1994-11-21 | 1994-11-21 | 微生物によるラットβ２−マイクログロブリン生産 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6286540A JPH08140679A (ja) | 1994-11-21 | 1994-11-21 | 微生物によるラットβ２−マイクログロブリン生産 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08140679A true JPH08140679A (ja) | 1996-06-04 |
Family
ID=17705742
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6286540A Pending JPH08140679A (ja) | 1994-11-21 | 1994-11-21 | 微生物によるラットβ２−マイクログロブリン生産 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08140679A (ja) |
-
1994
- 1994-11-21 JP JP6286540A patent/JPH08140679A/ja active Pending
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