JP3355049B2 - 組換え人ミオグロビンの製造方法 - Google Patents
組換え人ミオグロビンの製造方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、分子量１７，６００の
人ミオグロビンの製造に関する。さらに詳しくは、微生
物、例えばＥ．ｃｏｌｉ菌体内で効率的に生産されるよ
うに遺伝子の塩基配列を設計し、そのような遺伝子を人
工合成し、Ｅ．ｃｏｌｉに導入した後、その菌体からミ
オグロビンを分離精製することを特徴とするミオグロビ
ンの製造に関する。
人ミオグロビンの製造に関する。さらに詳しくは、微生
物、例えばＥ．ｃｏｌｉ菌体内で効率的に生産されるよ
うに遺伝子の塩基配列を設計し、そのような遺伝子を人
工合成し、Ｅ．ｃｏｌｉに導入した後、その菌体からミ
オグロビンを分離精製することを特徴とするミオグロビ
ンの製造に関する。
【０００２】本発明で得られるミオグロビンは、医化
学、生化学および薬学の研究用試薬として有用であり、
特に臨床化学検査におけるミオグロビン検査用の抗体の
調製用抗原およびキャリブレータとしての利用価値が高
い。
学、生化学および薬学の研究用試薬として有用であり、
特に臨床化学検査におけるミオグロビン検査用の抗体の
調製用抗原およびキャリブレータとしての利用価値が高
い。
【０００３】
【従来の技術】ミオグロビンは、プロトヘム１個を含む
ヘム蛋白で、生体内では筋肉組織において酸素貯蔵の役
割を担っている。ミオグロビンを微生物（酵母、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ等）に発現させた報告はいくつかあるが、人のミ
オグロビンをＥ．ｃｏｌｉに発現させた研究（Varadara
jan. R. Szabo, A, Boxer. S. G., (1985) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 82, 5661〜5684）では、ミオグロビン
はヘムのつかないアポ型で発現され、これまでＥ．ｃｏ
ｌｉでホロ型の人ミオグロビンを発現、製造した例は報
告されていない。
ヘム蛋白で、生体内では筋肉組織において酸素貯蔵の役
割を担っている。ミオグロビンを微生物（酵母、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ等）に発現させた報告はいくつかあるが、人のミ
オグロビンをＥ．ｃｏｌｉに発現させた研究（Varadara
jan. R. Szabo, A, Boxer. S. G., (1985) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 82, 5661〜5684）では、ミオグロビン
はヘムのつかないアポ型で発現され、これまでＥ．ｃｏ
ｌｉでホロ型の人ミオグロビンを発現、製造した例は報
告されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上記のように、Escher
ichia coli（E. coli）を用いて組換え型ミオグロビン
を発現させた場合は、人ミオグロビンはアポ型蛋白質と
してしか発現されず、生体内で実際に存在しているホロ
型蛋白質は発現されない。したがって、従来法では、菌
体からミオグロビンを一旦分離、精製し、しかる後にヘ
ムを構成しなければホロ型蛋白質とすることができなか
ったのである。
ichia coli（E. coli）を用いて組換え型ミオグロビン
を発現させた場合は、人ミオグロビンはアポ型蛋白質と
してしか発現されず、生体内で実際に存在しているホロ
型蛋白質は発現されない。したがって、従来法では、菌
体からミオグロビンを一旦分離、精製し、しかる後にヘ
ムを構成しなければホロ型蛋白質とすることができなか
ったのである。
【０００５】このように従来法においては、ホロ型蛋白
質を得るために行うミオグロビンの分離、精製自体容易
でないところ、更にヘムを再構成する操作が必要である
が、この操作は特に工業的スケールの大量生産において
不利である。したがって、当業界においては、特にミオ
グロビンを工業的に製造するという観点から、微生物菌
体内でホロ型の蛋白質として発現させ、ホロ型のミオグ
ロビンを直接製造する方法の開発が望まれている。
質を得るために行うミオグロビンの分離、精製自体容易
でないところ、更にヘムを再構成する操作が必要である
が、この操作は特に工業的スケールの大量生産において
不利である。したがって、当業界においては、特にミオ
グロビンを工業的に製造するという観点から、微生物菌
体内でホロ型の蛋白質として発現させ、ホロ型のミオグ
ロビンを直接製造する方法の開発が望まれている。
【０００６】本発明の目的は、このような技術の現状に
鑑み、Ｅ．ｃｏｌｉの発現系を工夫し、人ミオグロビン
をヘムのついたホロ蛋白質として菌体内で発現させ、こ
の大腸菌を用いて工業的スケールで人ミオグロビンを製
造するシステムを開発することとした。
鑑み、Ｅ．ｃｏｌｉの発現系を工夫し、人ミオグロビン
をヘムのついたホロ蛋白質として菌体内で発現させ、こ
の大腸菌を用いて工業的スケールで人ミオグロビンを製
造するシステムを開発することとした。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、種々の検討の結
果、本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて人ミオグロビ
ンをヘムのついたホロ型で効率的に分泌発現させる方法
を見出し、これらの知見をもとに、工業的スケールでの
人ミオグロビンの製造に係る本発明の完成に至った。
成するためになされたものであって、種々の検討の結
果、本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて人ミオグロビ
ンをヘムのついたホロ型で効率的に分泌発現させる方法
を見出し、これらの知見をもとに、工業的スケールでの
人ミオグロビンの製造に係る本発明の完成に至った。
【０００８】以下に、本発明の人ミオグロビンの製造方
法を説明する。人ミオグロビンの遺伝子配列は既に公知
である（Akaboshi. E., (1985), Gene, 33, 241〜24
9）。その構造遺伝子とアミノ酸配列を図５に示し、そ
の制限酵素地図を図６に示す。
法を説明する。人ミオグロビンの遺伝子配列は既に公知
である（Akaboshi. E., (1985), Gene, 33, 241〜24
9）。その構造遺伝子とアミノ酸配列を図５に示し、そ
の制限酵素地図を図６に示す。
【０００９】しかしながら、この人の遺伝子をEscheric
hia coli（E. coli）で発現させようとしても、一般的
には発現効率が低いし、上記のように、人ミオグロビン
の場合は、その遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで発現させてもホ
ロ型のミオグロビンは得られない。
hia coli（E. coli）で発現させようとしても、一般的
には発現効率が低いし、上記のように、人ミオグロビン
の場合は、その遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで発現させてもホ
ロ型のミオグロビンは得られない。
【００１０】そこで、Ｅ．ｃｏｌｉでホロ型のミオグロ
ビンを直接発現させるため、しかも、効率よく発現させ
るために、Ｅ．ｃｏｌｉの至適コドンを用いて人ミオグ
ロビンの遺伝子配列を設計した。さらに、クローニング
の為の制限酵素部位（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）を両端
に連結し、全長４８４塩基対とした。この人ミオグロビ
ン遺伝子（４８４塩基対）を化学合成法により調製し
た。これを、本発明で使用した発現ベクター（ｐＴＲＰ
ベクター）に組み込んで、これを用いＥ．ｃｏｌｉ Ｊ
Ｍ１０９（ＴＡＫＡＲＡ）を形質転換した。このように
して形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを３７℃で１６時間培
養した後、菌体を破砕し、得られた細胞質中に産生され
たミオグロビンを物理化学的方法および免疫学的方法に
より確認し、同定した。
ビンを直接発現させるため、しかも、効率よく発現させ
るために、Ｅ．ｃｏｌｉの至適コドンを用いて人ミオグ
ロビンの遺伝子配列を設計した。さらに、クローニング
の為の制限酵素部位（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）を両端
に連結し、全長４８４塩基対とした。この人ミオグロビ
ン遺伝子（４８４塩基対）を化学合成法により調製し
た。これを、本発明で使用した発現ベクター（ｐＴＲＰ
ベクター）に組み込んで、これを用いＥ．ｃｏｌｉ Ｊ
Ｍ１０９（ＴＡＫＡＲＡ）を形質転換した。このように
して形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを３７℃で１６時間培
養した後、菌体を破砕し、得られた細胞質中に産生され
たミオグロビンを物理化学的方法および免疫学的方法に
より確認し、同定した。
【００１１】本発明は、人ミオグロビン遺伝子配列を含
有する合成遺伝子を設計し、現実に作製することに成功
しただけでなく、特に発現がむつかしい合成遺伝子にあ
って、遺伝子組換え技術の面でも様々な工夫をこらして
その効率的発現に成功したものである。しかも更に、本
発明は、遺伝子組換え技術では従来得ることができなか
ったホロ型の人ミオグロビンの工業的製造にもはじめて
成功したものである。以下、本発明を実施例により詳し
く説明する。
有する合成遺伝子を設計し、現実に作製することに成功
しただけでなく、特に発現がむつかしい合成遺伝子にあ
って、遺伝子組換え技術の面でも様々な工夫をこらして
その効率的発現に成功したものである。しかも更に、本
発明は、遺伝子組換え技術では従来得ることができなか
ったホロ型の人ミオグロビンの工業的製造にもはじめて
成功したものである。以下、本発明を実施例により詳し
く説明する。
【００１２】
【実施例１】
【００１３】（１）人ミオグロビン遺伝子の設計 Ｅ．ｃｏｌｉで効率よく発現させるために、Ｅ．ｃｏｌ
ｉの至適コドンを用いて人ミオグロビンの遺伝子配列を
設計した（図１）。そして、発現ベクターに組み込むた
めに、Ｎ末端側にＥｃｏＲＩ、Ｃ末端側にＢａｍＨＩの
認識配列を導入し、全長４８４塩基対の遺伝子とした。
ｉの至適コドンを用いて人ミオグロビンの遺伝子配列を
設計した（図１）。そして、発現ベクターに組み込むた
めに、Ｎ末端側にＥｃｏＲＩ、Ｃ末端側にＢａｍＨＩの
認識配列を導入し、全長４８４塩基対の遺伝子とした。
【００１４】この人ミオグロビン遺伝子を含有する塩基
配列を、下記表１、表２に示される配列表の配列番号１
に示す。
配列を、下記表１、表２に示される配列表の配列番号１
に示す。
【００１５】
【表１】
【００１６】
【表２】
【００１７】（２）人ミオグロビンをＥ．ｃｏｌｉで発
現させるためのプラスミドの構築 人ミオグロビン遺伝子にＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ制限酵
素認識配列を付加した全長遺伝子４８４塩基を約９５ベ
ースの長さの６本のオリゴヌクレオチド（Ｆ１〜Ｆ６）
に分けて（図１）、それぞれをＤＮＡ自動合成機を用い
て合成し、図２に示す手順でＰＣＲにより全長遺伝子を
得た。発現ベクターとしては、トリプトファンプロモー
タを持つｐＴＲＰベクター（図３、図４）を用いた。こ
の発現ベクターをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断し、人
ミオグロビンの合成遺伝子を挿入してプラスミドｐＴＲ
Ｐ−ｈＭｂを作製した。ライゲーション反応は、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃、２時間行った。この反
応生成物を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９の形質転換
を行った。得られた形質転換菌のプラスミドをアルカリ
−ＳＤＳ法により分離し、制限酵素切断により目的遺伝
子が挿入されていることを確認した後、再度、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ＪＭ１０９の形質転換を行った。
現させるためのプラスミドの構築 人ミオグロビン遺伝子にＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ制限酵
素認識配列を付加した全長遺伝子４８４塩基を約９５ベ
ースの長さの６本のオリゴヌクレオチド（Ｆ１〜Ｆ６）
に分けて（図１）、それぞれをＤＮＡ自動合成機を用い
て合成し、図２に示す手順でＰＣＲにより全長遺伝子を
得た。発現ベクターとしては、トリプトファンプロモー
タを持つｐＴＲＰベクター（図３、図４）を用いた。こ
の発現ベクターをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断し、人
ミオグロビンの合成遺伝子を挿入してプラスミドｐＴＲ
Ｐ−ｈＭｂを作製した。ライゲーション反応は、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃、２時間行った。この反
応生成物を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９の形質転換
を行った。得られた形質転換菌のプラスミドをアルカリ
−ＳＤＳ法により分離し、制限酵素切断により目的遺伝
子が挿入されていることを確認した後、再度、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ＪＭ１０９の形質転換を行った。
【００１８】このようにしてプラスミドｐＴＲＰ−ｈＭ
ｂで形質転換した大腸菌ＪＭ１０９は、Escherichia co
li JM109／pTRP-hMbと命名し、これを工業技術院生命工
学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４５７４として寄
託した。
ｂで形質転換した大腸菌ＪＭ１０９は、Escherichia co
li JM109／pTRP-hMbと命名し、これを工業技術院生命工
学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４５７４として寄
託した。
【００１９】（３）形質転換菌の培養 プラスミドｐＴＲＰ−ｈＭｂで形質転換した大腸菌ＪＭ
１０９（ＦＥＲＭ Ｐ−１４５７４）を、アンピシリン
を１ｍｌ当り１２５μｇ含むＬＢ培地中で、３０℃で１
６時間培養した。このようにして得た菌体液を、アンピ
シリン１ｍｌあたり１２５μｇ含むＬＢ培地に３％接種
し、３７℃で１０時間培養した。
１０９（ＦＥＲＭ Ｐ−１４５７４）を、アンピシリン
を１ｍｌ当り１２５μｇ含むＬＢ培地中で、３０℃で１
６時間培養した。このようにして得た菌体液を、アンピ
シリン１ｍｌあたり１２５μｇ含むＬＢ培地に３％接種
し、３７℃で１０時間培養した。
【００２０】（４）ミオグロビンの精製と性質 ３７℃でミオグロビンを発現させると、１７．５Ｋの成
熟型ミオグロビンが可溶性で細胞質内に発現された。菌
体を３〜５倍量の１ｍＭ ＥＤＴＡ含有の５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）緩衝液に懸濁し、ダイノ
ミルにより菌を破砕した。１０，０００ｒｐｍ，３０ｍ
ｉｎ，４℃で遠心分離し、上清と沈澱に分けた。上清中
の夾雑蛋白をDEAE-celluloseカラムに通すことである程
度除去した後、Q-Sepharose big beads (Pharmacia)イ
オン交換クロマトグラフィーを行った。このクロマトグ
ラフィーの主画分を等電点電気泳動により最終精製を行
うことで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＢＢＲ染色で単一バン
ドとなる精製人ミオグロビンを得た。
熟型ミオグロビンが可溶性で細胞質内に発現された。菌
体を３〜５倍量の１ｍＭ ＥＤＴＡ含有の５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）緩衝液に懸濁し、ダイノ
ミルにより菌を破砕した。１０，０００ｒｐｍ，３０ｍ
ｉｎ，４℃で遠心分離し、上清と沈澱に分けた。上清中
の夾雑蛋白をDEAE-celluloseカラムに通すことである程
度除去した後、Q-Sepharose big beads (Pharmacia)イ
オン交換クロマトグラフィーを行った。このクロマトグ
ラフィーの主画分を等電点電気泳動により最終精製を行
うことで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＢＢＲ染色で単一バン
ドとなる精製人ミオグロビンを得た。
【００２１】
【発明の効果】本発明によれば、従来得ることのできな
かったヘムついたホロ型のミオグロビンを大腸菌で容易
に大量生産することができる。
かったヘムついたホロ型のミオグロビンを大腸菌で容易
に大量生産することができる。
【図１】本発明で設計した組換え人ミオグロビン遺伝子
の塩基配列を示した図である。
の塩基配列を示した図である。
【図２】本発明に係る発現プラスミドの構築図である。
【図３】本発明で使用した発現ベクターｐＴＲＰの塩基
配列（全塩基配列：２９２８ｂｐ）を示した図である。
配列（全塩基配列：２９２８ｂｐ）を示した図である。
【図４】同上続きを示した図である。
【図５】ヒトＭｂの構造遺伝子の塩基配列とアミノ酸配
列を示す。
列を示す。
【図６】ヒトＭｂ遺伝子の制限酵素地図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，82，5681−5684 Ｇｅｎｅ，1985年，33，241−249 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１で示される塩基配列
を有するヒトミオグロビン遺伝子を含有するＤＮＡをＥ
ｃｏＲＩとＢａｍＨＩで処理して得たプラスミドと、ｐ
ＴＲＰベクターをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで処理して得
たプラスミドとを、ライゲーション反応し、得られたプ
ラスミドｐＴＲＰ−ｈＭｂ。 - 【請求項２】 請求項１に記載のプラスミドｐＴＲＰ−
ｈＭｂで形質転換した大腸菌。 - 【請求項３】 エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＴＲＰ−ｈＭｂ（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４５７４）である請求項２に記載の大腸
菌。 - 【請求項４】 請求項２又は３のいずれかに記載の大腸
菌を培養し、培養物からホロ型ヒトミオグロビンを採取
することを特徴とするホロ型ヒトミオグロビンの製造方
法。
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| JP26812194A JP3355049B2 (ja) | 1994-10-07 | 1994-10-07 | 組換え人ミオグロビンの製造方法 |
| US08/536,941 US5888766A (en) | 1994-10-07 | 1995-09-29 | Method for producing recombinant human myoglobin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26812194A JP3355049B2 (ja) | 1994-10-07 | 1994-10-07 | 組換え人ミオグロビンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08103279A JPH08103279A (ja) | 1996-04-23 |
| JP3355049B2 true JP3355049B2 (ja) | 2002-12-09 |
Family
ID=17454186
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26812194A Expired - Fee Related JP3355049B2 (ja) | 1994-10-07 | 1994-10-07 | 組換え人ミオグロビンの製造方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5888766A (ja) |
| JP (1) | JP3355049B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108410899A (zh) * | 2018-05-23 | 2018-08-17 | 基蛋生物科技股份有限公司 | 一种重组人肌红蛋白的表达纯化方法 |
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|---|---|---|---|---|
| JPH11346781A (ja) | 1998-06-09 | 1999-12-21 | Agency Of Ind Science & Technol | アンモニア消去液状試薬 |
| WO2005041898A2 (en) * | 2003-10-30 | 2005-05-12 | Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education | Blood substitutes |
| US20060073117A1 (en) * | 2004-10-01 | 2006-04-06 | Stowers Institute For Medical Research | Methods and compositions for controlling hair follicle stem cell fate |
| EP4090678A4 (en) * | 2020-01-10 | 2024-01-10 | Intron Biotechnology Inc | METHOD FOR PREPARING PORCINE MYOGLOBIN USING ESCHERICHIA COLI |
| CN114945591A (zh) * | 2020-01-10 | 2022-08-26 | 尹特荣生物科技株式会社 | 一种利用大肠杆菌制备牛肌红蛋白的方法 |
| EP4256060A1 (en) * | 2020-12-02 | 2023-10-11 | Planeat Foods Pte. Ltd. | Method of producing globin polypeptide recombinantly and meat substitute food product |
| CN113265346B (zh) * | 2021-05-21 | 2023-03-28 | 江南大学 | 一种发酵生产猪肌红蛋白的基因工程菌及其应用 |
| CN113136349B (zh) * | 2021-05-28 | 2023-03-31 | 江南大学 | 一种高效表达不同来源肌红蛋白/血红蛋白毕赤酵母重组菌株的构建 |
| CN113999299A (zh) * | 2021-11-11 | 2022-02-01 | 广州达安基因股份有限公司 | 人肌红蛋白的高效表达方法 |
-
1994
- 1994-10-07 JP JP26812194A patent/JP3355049B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-09-29 US US08/536,941 patent/US5888766A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｇｅｎｅ，１９８５年，３３，２４１−２４９ |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，５６８１−５６８４ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108410899A (zh) * | 2018-05-23 | 2018-08-17 | 基蛋生物科技股份有限公司 | 一种重组人肌红蛋白的表达纯化方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5888766A (en) | 1999-03-30 |
| JPH08103279A (ja) | 1996-04-23 |
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