CN113999299A - 人肌红蛋白的高效表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了人肌红蛋白的高效表达方法，具体地本发明通过对肌红蛋白的碱基序列进行密码子优化，获得了表达量高、可溶性表达且保持优异活性的重组人肌红蛋白。此外，本发明表达的重组肌红蛋白只有C端有(His)6标签，简化了纯化步骤，提高了回收率及纯度，能够获得高活性的重组肌红蛋白，为临床检测心肌损伤及预后提供诊断试剂原料，为急性心肌梗死等心脏疾病的快速诊断试剂盒的制备奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及人肌红蛋白的高效表达方法。
背景技术
人肌红蛋白(Human myoglobin,hMb)是一种含有血红素的蛋白质，其大量分布于骨骼肌和心肌中，相对分子质量17800，是国际公认的早期诊断急性心肌梗塞的生化标志物之一。由于肌红蛋白是心肌细胞胞浆蛋白,且相对分子质量小，当心肌坏死时，可直接快速进入血液循环，1～2h血清浓度升高，敏感性较高，且在血液中出现的时间早于其他生化标志物，因此可用于心肌梗塞的早期诊断，从而降低病死率。
有关Mb的检测方法有很多，如ELISA法、荧光免疫测定法、免疫比浊法等，目前国内的检测试剂盒多为进口或者进口原料组装，价格昂贵，很大程度上限制了肌红蛋白检测的推广和应用。现有的一些提取肌红蛋白的相关报道显示天然提取纯化方法存在以下问题：来源困难、提取步骤繁琐、质量和活性不稳定等；重组肌红蛋白虽然解决了天然纯化的部分问题，但也存在产率低、稳定性不好、活性低等问题。或者在N端设计TrxA标签表达蛋白，虽然提高目的蛋白的表达量和稳定性，但后续切除标签和纯化的工艺繁琐，不利于蛋白的大量工业化生产。
因此本领域技术人员致力于开发表达效率高、易于纯化的人肌红蛋白制备工艺。
发明内容
本发明提供了一种表达效率高、易于纯化的人肌红蛋白制备工艺。
本发明的第一方面，提供了一种分离的经密码子优化的多核苷酸，所述多核苷酸编码人肌红蛋白；并且所述多核苷酸选自下组：
(a)序列如SEQ ID NO.3所示的多核苷酸；
(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.3所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸；
(c)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
本发明的第二方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第一方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述表达载体中本发明第一方面所述的多核苷酸序列的3’端下游具有编码His×6标签的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述表达载体为载体为pET-28a(+)或pET-29a(+)。
本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第二方面所述的表达载体，或者在基因组中整合有本发明第一方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)。
在另一优选例中，所述宿主细胞为大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株。
本发明的第四方面，提供了一种制备人肌红蛋白的方法，包括步骤：
在适合表达的条件下，培养本发明第三方面所述的细胞，从而表达出人肌红蛋白；和分离所述人肌红蛋白。
在另一优选例中，所述培养为液体发酵培养。
在另一优选例中，培养细胞的温度为35-38℃。
在另一优选例中，培养细胞至OD600为0.6-0.8后，进行IPTG诱导，然后放置于15-20℃条件继续培养10-20小时。
本发明的第五方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒含有本发明第一方面所述的多核苷酸，或者本发明第二方面所述的表达载体，或者本发明第三方面所述的宿主细胞，或者根据本发明第四方面的方法所制备的人肌红蛋白。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为密码子优化筛选和连接不同载体表达蛋白的SDS-PAGE鉴定检测结果。
图2为大量表达产物纯化后电泳图。
具体实施方式
本发明对人肌红蛋白进行原核重组表达，经过大量的筛选测试发现，大部分人肌红蛋白密码子在大肠杆菌中表达存在产率低、包涵体表达、无法被人肌红蛋白抗体识别等问题。经过大量测试，意外获得了能够在大肠杆菌中进行大量表达人肌红蛋白的密码子序列，目的蛋白为可溶性蛋白，并且具有良好的活性。在此基础上制备了表达载体和重组菌株，从而获得了能够低成本制备人肌红蛋白的工艺。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
本发明克服了肌红蛋白传统天然纯化方法心肌组织来源困难、产率低、质量及活性难以稳定的缺陷，提供一种高效表达重组人肌红蛋白的基因工程菌及发酵培养方案。
通过对肌红蛋白的碱基序列做密码子优化，提高了表达产量，降低生产成本。此外，本发明表达的重组肌红蛋白只有C端有(His)6标签，简化了纯化步骤，提高了回收率及纯度，能够获得高活性的重组肌红蛋白，为临床检测心肌损伤及预后提供诊断试剂原料，为急性心肌梗死等心脏疾病的快速诊断试剂盒的制备奠定了基础。
本发明所述的人肌红蛋白的氨基酸序列和基因序列如下：
1)氨基酸序列：
MGLSDGEWKLVLNVWGKVEADIPGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKSEDEMKASEDLKKHGATVLTALGGILKKKGHHEAEIKPLAQSHATKHKIPVKYLEFISECIIQVLQSKHPGDFGADAQGAMNKALELFRKDMASNYKELGFKG(SEQ ID NO.1)
2)基因序列：
密码子序列1：
ATGGGGCTCAGCGACGGGGAATGGAAATTGGTGCTGAACGTCTGGGGGAAGGTGGAGGCTGACATCCCAGGCCATGGGCAGGAAGTCCTCATCAGGCTCTTTAAGGGTCACCCAGAGACTCTGGAGAAGTTTGACAAGTTCAAGCACCTGAAGTCAGAGGACGAGATGAAGGCATCTGAGGACTTAAAGAAGCATGGTGCCACTGTGCTCACCGCCCTGGGTGGCATCCTTAAGAAGAAGGGGCATCATGAGGCAGAGATTAAGCCCCTGGCACAGTCGCATGCCACCAAGCACAAGATCCCCGTGAAGTACCTGGAGTTCATCTCGGAATGCATCATCCAGGTTCTGCAGAGCAAGCATCCCGGGGACTTTGGTGCTGATGCCGAGGGGGCCATGAACAAGGCCCTGGAGCTGTTCCGGAAGGACATGGCCTCCAACTACAAGGAGCTGGGCTTCAAAGGC(SEQ ID NO.2)
密码子序列2：
ATGGGCCTGAGTGATGGCGAATGGAAACTGGTGCTGAATGTGTGGGGCAAAGTGGAAGCCGATATTCCGGGTCATGGTCAGGAAGTGCTGATTCGTCTGTTTAAAGGTCATCCGGAAACCTTAGAAAAATTTGATAAATTTAAACATCTGAAATCAGAAGATGAAATGAAAGCCAGCGAGGACCTGAAAAAACATGGCGCAACCGTGTTAACCGCCTTAGGCGGTATTCTGAAAAAAAAAGGCCATCATGAAGCCGAAATTAAACCGTTAGCACAGTCTCATGCCACCAAACATAAAATTCCGGTTAAATATCTGGAATTTATTAGCGAATGTATTATTCAGGTTCTTCAGAGCAAACATCCGGGTGATTTTGGTGCCGATGCACAGGGCGCAATGAATAAAGCACTGGAACTGTTTCGTAAAGATATGGCCTCTAATTATAAAGAACTGGGCTTTAAAGGT(SEQ ID NO.3)
材料和方法
1.生物材料
本实验中用到的宿主大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株(购自天根生化科技(北京)有限公司)、表达载体(购自金斯瑞生物科技股份有限公司)、肌红蛋白活性鉴定试剂盒(化学发光法，试剂盒购自广州市达瑞生物技术股份有限公司)。
2.载体构建
以NCBI提供的人肌红蛋白的基因SEQ ID NO:2为参考，进行大肠杆菌的同义密码子偏好性优化，获得优化后的密码子序列，人工合成后，构建表达载体，分别连接到载体pET-28a(+)和pET-29a(+)(载体中插入位点下游具有编码(His)×6标签基因)。
3.构建宿主大肠杆菌
取表达载体，转化至大肠杆菌感受态Rosetta(DE3)中获得宿主大肠杆菌。
4.目的基因表达和纯化
发酵培养上述得到的宿主大肠杆菌，获得菌体，菌体破碎后离心，菌液上清使用Ni-柱亲和层析，获得人肌红蛋白目的蛋白。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明优化获得的密码子序列，在大肠杆菌中能够进行大量表达，人肌红蛋白的表达量显著提高，目的蛋白表达含量可达50mg/L以上。
(2)本发明提供了大量表达并制备人肌红蛋白的方法。
(3)本发明优化获得的密码子序列在大肠杆菌中表达的人肌红蛋白主要为可溶性融合蛋白，因此纯化工艺简单。
(4)本发明原核重组表达的人肌红蛋白，经化学发光法活性检测，肌红蛋白的发光值最高可达到360万，说明该抗原性能较好，并且浓度与RLU值的线性良好，能够作为检测标准品使用。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1
1)以NCBI提供的人肌红蛋白的基因SEQ ID NO:2为参考，进行密码子优化，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成，载体为pET-28a(+)或pET-29a(+)(C端(His)6标签)，有利于快速分离纯化提供便利。
2)重组质粒导入宿主大肠杆菌
取1μL表达质粒，在冰浴条件下，加入到30μL大肠杆菌感受态Rosetta(DE3)中，冰浴放置20min，热激90s，立刻冰上放置2min，加入400μL不含抗生素的SOC培养基，37℃、220rpm振荡培养50min。
取100μL菌液均匀涂布到含100μg/mL卡那抗性的LB平板上，37℃培养箱培养过夜。
3)目的基因表达过程
挑取步骤2)中的单克隆，无菌操作接种于含100μg/mL卡那抗性的SB培养基中，37℃220rpm振荡培养至OD600在0.6-0.8之间，IPTG进行诱导，放置于18℃振荡培养过夜。
取等量不同表达质粒的菌液进行超声破碎，进行SDS-PAGE鉴定，以未诱导的菌液为对照，预测分子量为17.18KD。
结果显示：优化后密码子(SEQ ID NO.3)pET-28a(+)载体表达量明显高于其它优化密码子的载体。
泳道1-2：密码子优化后的pET-28a(+)载体导入大肠杆菌(菌株A-8)破碎的上清、沉淀。
泳道3-4：密码子优化后的和pET-29a(+)载体导入大肠杆菌(菌株C-6)破碎的上清、沉淀。
泳道5-6：密码子未优化的和pET-28a(+)载体导入大肠杆菌(菌株A-1)破碎的上清、沉淀。
实施例2大量表达产物纯化
将实施例1筛选出的高表达重组细胞株，无菌操作接种于含100μg/mL卡那抗性的SB培养基中，37℃220rpm振荡培养至OD600在0.6-0.8之间，IPTG进行诱导，放置于18℃振荡培养过夜。摇瓶培养1.5L菌液，离心收集菌体湿重为：30.21g。
称取约4g菌体，加入20ml Lysis Buffer在冰上重悬。超声破碎后离心，20000rpm，4℃离心30min，取上清，0.22μm针式过滤器过滤得到过滤后菌液。
滤后过Ni-柱亲和层析，用50mM Tris-HCl，50mM NaCl，200mM咪唑，pH7.0洗脱的蛋白即为目的蛋白洗脱后蛋白。
电泳图如图2所示。
经计算菌株A-8目的蛋白表达含量为55.5mg/L发酵液，纯度达到95％，该表达量较高；菌株C-6目的蛋白表达含量为30.25mg/L发酵液，纯度达到95％。
实施例3活性鉴定
根据达瑞试剂盒说明书，采用双抗体夹心法进行活性检测：
1.制备抗原抗体夹心复合物
样本、包被的肌红蛋白单克隆抗体的磁珠混合，经过洗涤后，加入吖碇盐标记的另外一株Mb单克隆抗体在温育条件下反应，抗体捕获样本中的抗原，形成抗原抗体夹心复合物。
2.检测读数：
温育结束后，去掉上清液，用清洗液清洗沉淀复合物，并吸干废液，除去未与磁性微粒结合的物质，加入两种激发液，使复合物产生化学发光信号，测量发光强度。
采用化学发光法进行检测，菌株A-8目的蛋白的检测结果如表1所示，肌红蛋白的发光值最高可达到360万，说明该抗原性能较好。浓度与RLU值的线性回归方程为：y＝3069.5x+21531,R2＝0.9962，说明线性良好(R2＞0.99)。
表1
菌株C-6目的蛋白的检测结果如表2所示，肌红蛋白的发光值最高可达到326万，说明该抗原性能较好。浓度与RLU值的线性回归方程为：y＝2891.8x+72189，R2＝0.9733，说明线性较差(R2＞0.97)。
表2
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 广州达安基因股份有限公司
<120> 人肌红蛋白的高效表达方法
<130> 020096
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 154
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Gly Leu Ser Asp Gly Glu Trp Lys Leu Val Leu Asn Val Trp Gly
1 5 10 15
Lys Val Glu Ala Asp Ile Pro Gly His Gly Gln Glu Val Leu Ile Arg
20 25 30
Leu Phe Lys Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys Phe Asp Lys Phe Lys
35 40 45
His Leu Lys Ser Glu Asp Glu Met Lys Ala Ser Glu Asp Leu Lys Lys
50 55 60
His Gly Ala Thr Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys Lys Lys
65 70 75 80
Gly His His Glu Ala Glu Ile Lys Pro Leu Ala Gln Ser His Ala Thr
85 90 95
Lys His Lys Ile Pro Val Lys Tyr Leu Glu Phe Ile Ser Glu Cys Ile
100 105 110
Ile Gln Val Leu Gln Ser Lys His Pro Gly Asp Phe Gly Ala Asp Ala
115 120 125
Gln Gly Ala Met Asn Lys Ala Leu Glu Leu Phe Arg Lys Asp Met Ala
130 135 140
Ser Asn Tyr Lys Glu Leu Gly Phe Lys Gly
145 150
<210> 2
<211> 462
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
atggggctca gcgacgggga atggaaattg gtgctgaacg tctgggggaa ggtggaggct 60
gacatcccag gccatgggca ggaagtcctc atcaggctct ttaagggtca cccagagact 120
ctggagaagt ttgacaagtt caagcacctg aagtcagagg acgagatgaa ggcatctgag 180
gacttaaaga agcatggtgc cactgtgctc accgccctgg gtggcatcct taagaagaag 240
gggcatcatg aggcagagat taagcccctg gcacagtcgc atgccaccaa gcacaagatc 300
cccgtgaagt acctggagtt catctcggaa tgcatcatcc aggttctgca gagcaagcat 360
cccggggact ttggtgctga tgccgagggg gccatgaaca aggccctgga gctgttccgg 420
aaggacatgg cctccaacta caaggagctg ggcttcaaag gc 462
<210> 3
<211> 462
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
atgggcctga gtgatggcga atggaaactg gtgctgaatg tgtggggcaa agtggaagcc 60
gatattccgg gtcatggtca ggaagtgctg attcgtctgt ttaaaggtca tccggaaacc 120
ttagaaaaat ttgataaatt taaacatctg aaatcagaag atgaaatgaa agccagcgag 180
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ccgggtgatt ttggtgccga tgcacagggc gcaatgaata aagcactgga actgtttcgt 420
aaagatatgg cctctaatta taaagaactg ggctttaaag gt 462
Claims (10)
1.一种分离的经密码子优化的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码人肌红蛋白；并且所述多核苷酸选自下组：
(a)序列如SEQ ID NO.3所示的多核苷酸；
(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.3所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸；
(c)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
2.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求1所述的多核苷酸。
3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体中权利要求1所述的多核苷酸序列的3’端下游具有编码His×6标签的多核苷酸序列。
4.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为载体为pET-28a(+)质粒载体。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求2所述的表达载体，或者在基因组中整合有权利要求1所述的多核苷酸。
6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichiacoli)。
7.一种制备人肌红蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：
在适合表达的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞，从而表达出人肌红蛋白；和分离所述人肌红蛋白。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述培养为液体发酵培养。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，培养细胞的温度为35-38℃。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有权利要求1所述的多核苷酸，或者权利要求2所述的表达载体，或者权利要求3所述的宿主细胞，或者根据权利要求1的方法所制备的人肌红蛋白。
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| B A SPRINGER AND S G SLIGAR: "High-level expression of sperm whale myoglobin in Escherichia coli.", 《PNAS》, pages 8961 * |
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