CN110878116B - 一种稳定的重组心肌肌钙蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

一种稳定的重组心肌肌钙蛋白及其编码基因和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110878116B
CN110878116B CN201811032801.0A CN201811032801A CN110878116B CN 110878116 B CN110878116 B CN 110878116B CN 201811032801 A CN201811032801 A CN 201811032801A CN 110878116 B CN110878116 B CN 110878116B
Authority
CN
China
Prior art keywords
recombinant
cardiac troponin
gene
glu
ctni
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811032801.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110878116A (zh
Inventor
沈林
戈军
余琼林
肖长河
陈远超
靳启航
杨斌
梁听
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hunan Luyang Biotechnology Co ltd
Hunan Yonghe Sunshine Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Hunan Luyang Biotechnology Co ltd
Hunan Yonghe Sunshine Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hunan Luyang Biotechnology Co ltd, Hunan Yonghe Sunshine Biotechnology Co ltd filed Critical Hunan Luyang Biotechnology Co ltd
Priority to CN201811032801.0A priority Critical patent/CN110878116B/zh
Publication of CN110878116A publication Critical patent/CN110878116A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110878116B publication Critical patent/CN110878116B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4716—Muscle proteins, e.g. myosin, actin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4712—Muscle proteins, e.g. myosin, actin, protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/325—Heart failure or cardiac arrest, e.g. cardiomyopathy, congestive heart failure

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了一种稳定的重组心肌肌钙蛋白及其编码基因和应用，属于分子生物学领域。所述重组心肌肌钙蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的重组心肌肌钙蛋白具有良好的稳定性，在42℃条件下放置1天的失活率为12％，显著低于常规市售人源血清来源的cTnI和现有技术公开的心肌肌钙蛋白。

Description

一种稳定的重组心肌肌钙蛋白及其编码基因和应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种稳定的重组心肌肌钙蛋白及其编码基因和应用。
背景技术
心肌肌钙蛋白(cTn)是心肌细胞收缩的调节蛋白，它由三种不同基因的亚基组成：原肌凝蛋白亚单位TnT(39kDa)、肌动球蛋白-ATP酶抑制亚单位TnI(26.5kDa)、钙结合亚单位TnC(18kDa)。cTnI的检测是三者中灵敏度最高的，因此检测要求精度也是最高的，常规手段在该项目的检测中很难做大很高的准确性和精准度。
cTnI具有非常重要的临床意义，主要表现在：(1)cTnI不受骨骼肌受损伤的影响，且在患者发病后出现较早，持续时间长，具有其独特的心肌特异性和诊断窗口期较长的优势，是目前诊断心肌损伤较好的确定标志物。(2)cTnI的释放与心肌梗死面积呈线性相关，AMI后9h相关性最好，AMI后9h cTnI的浓度可估计心肌梗死的面积。心肌梗死的面积与心室功能的减弱和室性心率失常的发生有密切的关系，估计心肌梗死的面积对后续病情评估预后有很大帮助。(3)cTnI对检测微小心肌损伤具有较高的敏感性和特异性，可用于心脏围手术期的监测，已有研究表明，cTnI对术后微小心肌损伤的预测价值最高。(4)cTnI具有唯一的心肌特异性，可鉴别骨骼肌损伤或慢性肾衰患者是否伴有心肌损伤。
因为cTnI具有非常重要的临床意义，所以在临床应用中也会出现多种对cTnI检测的平台，例如：临床生化检测、胶体金免疫层析检测、荧光免疫层析检测、化学发光检测等。但是无论哪种检测平台使用过程中，都必须要配套稳定性好、能够溯源的校准品和质控品，才能获得可靠准确的检测值。
SRM 2921作为目前唯一的国际标准物质，这是天然的cTnI-C-T的三重复合物。以SRM 2921为校准品，可使检测间有了一些溯源性，但是并没有任何生产厂商考虑使用该物质进行溯源，这是因为通过免疫学检测方法与抗-cTnI单克隆抗体一起对SRM 2921进行检测时，发现SRM 2921cTnI物质正在发生降解。除此之外，目前市场上存在的cTnI校准品和质控品都是通过临床血清处理后进行制备，众所周知血清成分复杂，含有大量酶类物质，会对cTnI产生降解反应，使其在短时间内浓度不断下降，再加之其获得方法不容易实现，以及法律法规对人源血制品的管控，都证明了其市场应用的限制性。
由于天然的cTnI不易获得，且容易降解，使cTnI的检测和溯源一直备受病垢，大量的研究人员也将重点转移至cTnI重组蛋白上，但是经过长时间的研究发现，单纯的cTnI基本上不会产生免疫反应，必须以复合物的形式存在才能发生免疫反应。2002年，Shi等人在专利US6475785B1中提供了制备重组cTnI-C复合物的方法，其能够产生免疫反应，但稳定性较差的问题。
发明内容
有鉴于背景技术中存在的问题，本发明在专利US6475785B1的基础上，采用蛋白质定向进化技术-易错PCR技术对cTnI-C复合物进行改造，最终获得了稳定性提高且不降低活性的cTnI-C复合物突变体。
本发明提供了一种稳定的重组心肌肌钙蛋白，所述重组心肌肌钙蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明提供了编码上述重组心肌肌钙蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQID No.2所示。
本发明提供了用于扩增上述基因的引物对，所述引物对包括上游引物ICH-001和下游引物ICH-002；所述上游引物ICH-001的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述下游引物ICH-002的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
本发明提供了含有上述基因的重组载体。
本发明提供了含有上述基因或上述重组载体的重组菌。
本发明还提供了一种制备权利要求1所述重组心肌肌钙蛋白的方法，包括如下步骤：(1)构建表达权利要求2所述基因的重组菌；(2)对所述步骤(1)中的重组菌进行诱导表达，得到权利要求1所述重组心肌肌钙蛋白。
本发明还提供了上述重组心肌肌钙蛋白、上述编码基因、上述引物对、上述重组载体或上述重组菌在制备心肌损伤诊断试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种用于心肌损伤诊断的试剂盒，所述试剂盒包括上述重组心肌肌钙蛋白和抗cTnI抗体单克隆抗体。
有益效果：
本发明在专利US6475785B1的基础上，采用蛋白质定向进化技术-易错PCR技术对cTnI-C复合物进行改造，通过热破坏，筛选得到了一种具有良好热稳定性的重组心肌肌钙蛋白。本发明提供的重组心肌肌钙蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其具有良好的稳定性，在42℃条件下放置1天，失活率为12％，显著低于市售人源血清来源的cTnI和专利US6475785B1中序列表达得到的纯化蛋白。
基于所述重组心肌肌钙蛋白良好的热稳定性，本发明将所述重组心肌肌钙蛋白和抗cTNI单克隆抗体应用于心肌损伤诊断试剂盒的制备，可显著提高试剂盒在诊断过程中的热稳定性。所述重组心肌肌钙蛋白能基于免疫学原理与抗-cTnI单克隆抗体特异性结合，在试剂盒中作为阳性样品使用。
具体实施方式
本发明提供了一种稳定的重组心肌肌钙蛋白，所述重组心肌肌钙蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明通过热稳定性实验和免疫活性实验确定所述重组心肌肌钙蛋白具有良好的热稳定性和免疫活性。
本发明提供了上述重组心肌肌钙蛋白的制备方法，将编码上述重组心肌肌钙蛋白的基因插入载体中，得到重组载体，将所述重组载体导入宿主菌中，构建得到重组菌，再利用重组菌诱变表达，得到重组心肌肌钙蛋白。
在本发明中，所述编码上述重组心肌肌钙蛋白的基因核苷酸序列优选如SEQ IDNo.2所示。SEQ ID No.2所示核苷酸序列的基因能通过人工合成的方式获得。获得SEQ IDNo.2所示核苷酸序列的基因后，本发明利用普通PCR法对所述基因进行扩增。
在本发明中，所述表达质粒pBV-ICH优选以上述编码基因为扩增模板，利用上游引物ICH-001和下游引物ICH-002对所述扩增模板进行PCR扩增。所述上游引物ICH-001的核苷酸序列5’至3’为atggcttatgccacggagccg(SEQ ID No.5)；所述下游引物ICH-002的核苷酸序列5’至3’为atggtgatgatgatgatggctgccgccctccacacccttc(SEQ ID No.6，下划线为BamHI位点)。作为扩增模板的编码基因的原始来源委托基因合成公司完成。在本发明实施例中，所述编码基因委托华大基因公司完成。
在本发明中，每100μL反应体系优选为：PCR缓冲液10μL，dNTPs混合物2μL，10μmol/L的上游引物2μL，10μmol/L的下游引物2μL，模板pBV-ICH 10～100ng，rTaq DNA聚合酶1μL，补加双蒸水至100μL；所述PCR缓冲液包括20mmol/L的MgCl2，200mmol/L的KCl，50mmol/L的Tris-HCl，所述PCR缓冲液的pH为8.3；所述dNTPs混合物包括10mmol/L的dATP，10mmol/L的dGTP，10mmol/L的dTTP和10mmol/L的dCTP。
在本发明中，所述普通PCR法的反应程序优选按照如下步骤进行：95℃预变性5min，再按如下参数循环反应30次：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s；最后72℃延伸10min。
在本发明中，所述重组载体的构建方法优选包括以下步骤：将上述普通PCR法扩增得到的扩增产物经EcoRI和BamHI酶切后插入到相同酶切后的pBV220载体中，构建得到重组载体。
在本发明中，所述重组菌的构建方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的重组菌的制备方法即可。所述重组菌优选由上述重组载体转化E.coli TOP10感受态细胞得到。
得到所述重组菌后，本发明对所述重组菌诱导表达，得到上述重组心肌肌钙蛋白。在本发明中，所述重组菌在表达前优选进行前处理操作。所述前处理包括第一次冰浴，热激和第二次冰浴。所述第一次冰浴的时间优选为28～32min，更优选为30min。所述热激的温度优选为40～43℃，更优选为42℃。所述热激的时间优选为80～100s，更优选为90s。所述第二次冰浴的时间优选为2～4min，更优选为3min。前处理后，本发明优选将感受态细胞接种于LB培养基中震荡培养1h。所述LB培养基的组成和用量优选为：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，所述震荡培养的温度优选为30～34℃，更优选为32℃，所述震荡的频率优选为150～180rpm，更优选为170rpm。
震荡培养结束后，本发明优选将培养物离心，离心上述培养物，剩余200μL上清并吹吸混匀后涂布于含100mg/mL氨苄青霉素的LB平板，32℃恒温培养过夜，获得单菌落。本发明优选将单菌落接种入含有100mg/mL氨苄青霉素的20mLLB培养基的小摇瓶中，32℃、170rpm振荡培养过夜。将过夜培养的发酵液再次接种于含有100mg/mL氨苄青霉素的2000mlLB培养基的大摇瓶中，当OD600至0.6左右时，将温度调至42℃进行诱导培养5h。诱导培养结束后，进行5000rpm离心5min，弃去上清液，收集菌体沉淀，加20mL 20mM TrisHCl(pH8.0)重悬菌体后，在冰浴上进行超声破碎，破碎完成后12000rpm，4℃离心20min，收集超声破碎上清液。本发明使用Ni亲和层析柱(3cm×10cm)用平衡液平衡后，20mL的超声破碎上清液经0.45μm滤膜过滤后，缓慢过柱，然后用冲洗液洗去未结合的杂质，最后用洗脱液洗脱蛋白，经过交换缓冲液除盐后，获得cTnI-C复合物蛋白。
本发明还提供了上述重组心肌肌钙蛋白、编码基因、引物对、重组载体或重组菌的应用。将本发明提供的重组心肌肌钙蛋白和/或编码上述重组心肌肌钙蛋白基因的制备，可显著提高重组心肌肌钙蛋白的热稳定性。
下面结合实施例对本发明提供的一种稳定的重组心肌肌钙蛋白及其编码基因和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
cTnI-C复合物基因的克隆
根据专利US6475785B1中公布的cTnI-C复合物核苷酸序列(SEQ ID No.3)，交由华大基因进行合成，基因名称为ICH，其核苷酸序列5’端带有EcoRI酶切位点，3’端带有6个组氨酸、终止密码子和BamHI酶切位点。其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
将ICH基因片段和T载体pMD18T(宝生物工程(大连)有限公司)按以下体系使用NEB公司的T4连接酶进行连接反应：
Figure BDA0001790158470000051
Figure BDA0001790158470000061
将混匀后的连接反应液，放置于25℃反应30min，4℃备用或直接用于转化反应。
将10μL连接反应液加入100μL E.coli Top10感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司，目录号CB104)中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴热激90s，再冰浴3min，加LB培养基至1mL，置于37℃、170rpm摇床中振荡培养1h，取200μL上述培养物涂布于含100mg/mL氨苄青霉素的LB平板，经37℃恒温培养过夜。挑取菌落扩大培养后使用E.Z.N.A Plasmid MiniKit试剂盒(Omega Bio-Tek公司)提取质粒，经EcoRI和BamHI酶切电泳鉴定，将正确克隆送往测序，核苷酸测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成，经核对与专利US6475785B1中公布的cTnI-C复合物核苷酸序列(SEQ ID No.3)一致，将该测序构建体命名为pMD18T-ICH。
实施例2
重组表达构建体pBV-ICH的构建
对实施例1中测序构建体pMD18T-ICH进行EcoRI和BamHI(宝生物工程(大连)有限公司)双酶切反应以回收ICH目的基因片段：
Figure BDA0001790158470000062
混匀完毕后的酶切反应液，放置于37℃保温过夜后，用实施例1中的方法纯化回收。pBV220表达载体以同样的方式进行EcoRI和BamHI双酶切反应，纯化回收线性pBV220表达载体片段。
纯化后的ICH目的基因片段和线性pBV220表达载体片段按以下体系进行连接反应：
Figure BDA0001790158470000071
将混匀后的连接反应液，放置于25℃反应30min，4℃备用或直接用于转化反应。
将10μL连接反应液加入100μL E.coli Top10感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司，目录号CB104)中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴热激90s，再冰浴3min，加SOC培养基至1mL，置于32℃、170rpm摇床中振荡培养1h，取200μL菌液涂布于含100mg/mL氨苄青霉素的LB平板，32℃温育过夜。挑取菌落扩大培养后使用E.Z.N.A Plasmid Mini Kit试剂盒(Omega Bio-Tek公司)提取质粒，经EcoRI和BamHI酶切电泳鉴定，将正确克隆送往测序，核苷酸测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成，经核对与专利US6475785B1中公布的cTnI-C复合物核苷酸序列(SEQ ID No.3)一致，将获得的构建体命名为pBV-ICH。
实施例3
易错PCR随机突变ICH基因
按如下体系配制易错PCR反应溶液：
Figure BDA0001790158470000072
Figure BDA0001790158470000081
其中：
10×PCR缓冲液：20mmol/L MgCl2，200mmol/L KCl，50mmol/L Tris-HCl，pH 8.3；
50×dNTPs混合物：含有dATP、dGTP、dTTP、dCTP各10mmol/L；
10×MgCl2溶液：70mmol/L，溶于灭菌水；
MnCl2溶液：1mmol/L，溶于灭菌水；
rTaq DNA聚合酶：购自宝生物工程(大连)有限公司，目录号DR001。
易错PCR反应条件为：95℃预变性5min，再按如下参数循环反应20次：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s；最后72℃延伸10min
PCR产物经1％低融点琼脂糖凝胶电泳后，切出含目的片段的胶块并放入1.5mLEppendorf管中，使用E.Z.N.A Gel Extraction Kit试剂盒(Omega Bio-Tek公司)进行回收，取50μL预热至55℃的无菌水进行洗脱，取3μL进行电泳检测，-20℃保存备用。
实施例4
ICH突变体库的构建
取实施例3中纯化后的易错PCR产物片段按以下体系进行EcoRI和BamHI双酶切反应：
Figure BDA0001790158470000082
加双蒸水至50μL；
混匀完毕后的酶切反应液，放置于37℃温育3h后，使用E.Z.N.A Cycle Pure Kit试剂盒(Omega Bio-Tek公司)对酶切片段进行直接回收，取50μL预热至55℃的无菌水进行洗脱，取3μL进行电泳检测，-20℃保存备用或直接用于连接反应。pBV220表达载体以同样的方式进行EcoRI和BamHI双酶切反应，纯化回收线性pBV220表达载体片段。
纯化后的易错PCR产物片段和线性pBV220表达载体片段按以下体系进行连接反应：
Figure BDA0001790158470000091
将混匀后的连接反应液，放置于25℃反应30min，4℃备用或直接用于转化反应。
将10μL连接反应液加入100μL E.coli Top10感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴热激90s，再冰浴3min，加LB培养基至1mL，置于32℃、170rpm摇床中振荡培养1h，离心上述培养物，剩余200μL上清并吹吸混匀后涂布于含100mg/mL氨苄青霉素的LB平板，32℃恒温培养过夜。
实施例5
cTnI-C变体的筛选
原理：
cTnI-C变体的高通量筛选是基于酶联免疫荧光(ELFA)技术而建立的，使用肌钙蛋白I测定试剂盒(酶联免疫荧光法)检测经过破菌、粗存和热破环处理的cTnI-C变体，通过荧光分析后，与对照未突变的cTnI-C复合物进行比较，筛选热稳定性提高的cTnI-C变体。
试剂：
肌钙蛋白I测定试剂盒(酶联免疫荧光法)(VIDAS Troponin I Ultra)，购自梅里埃诊断产品(上海)有限公司。
细胞裂解液：0.2mg/mL溶菌酶，50mmol/L Tris，pH8.0。
平衡液：50mmol/L Tris-HCl pH 8.0,150mmol/L NaCl。
冲洗液：平衡液+50mmol/L imidazole。
洗脱液：平衡液+400mmol/L imidazole。
Ni亲和填料：IDA，购自西安保赛生物，按10％的重量体积比加入平衡液。
初级筛选：
1)吸取300μL含有氨苄抗性LB液体培养基加至96深孔板，并用灭菌牙签挑取实施例4所得单菌落至各个孔中轻微晃动(分别在94、95、96号孔中挑入含有表达对照未突变的cTnI-C复合物的单菌落作为筛选对照)，再在已画有方格并标有序号的新鲜LB平板上进行保种，平板置于32℃培养过夜。
2)将96深孔板固定于32℃摇床中，170rpm振荡24h。
3)培养结束后，再向各孔中加入300μL含有氨苄抗性LB液体培养基，再固定于42℃摇床中，170rpm振荡诱导培养5h。
4)诱导培养结束后，取出96深孔板。吸取100μL诱导后的菌液至另一深孔板中，2500g离心10min，弃去培养基上清，加盖置于-80℃放置15min。
5)再加入200μL预冷的细胞裂解液，加盖放置于4℃冰箱中10min，再固定于微孔板振荡器上，室温200rpm振荡10min，充分裂解菌体。并置于42℃条件下，放置24h，进行热破坏。
6)充分裂解并热破坏后，2500g离心10min，吸取100μL上清至含有400μL平衡液的96孔板中，再加入100μL Ni亲和填料，置于4℃冰箱中反应10min。
7)2500g离心10min，去除上清液，并加入500μL冲洗液，离心后去除上清液，该步骤重复3遍。
8)向离心后的沉淀加入300μL洗脱液，并振荡反应10min。
9)2500g离心10min，收集上清液，并用肌钙蛋白I测定试剂盒(酶联免疫荧光法)完成检测，并筛选出反应较高的样品。
次级筛选：
1)初级筛选获得的热稳定性提高的初级变体单菌落接种入含有20mL LB培养基的小摇瓶中，32℃、170rpm振荡培养。
2)当OD600至0.6左右时，将温度调至42℃进行诱导培养5h。
3)诱导培养结束后，取1mL菌液进行5000rpm离心5min，弃去上清液，置于-80℃放置15min。
4)再加入1mL预冷的细菌裂解液，室温振荡5min，充分裂解菌体，并置于42℃条件下，放置24h，进行热破坏。
5)充分裂解并热破坏后，然后5000rpm离心5min，吸取100μL上清至含有400μL平衡液的96孔板中，再加入100μL Ni亲和填料，置于4℃冰箱中反应10min。
6)5000rpm离心5min，去除上清液，并加入500μL冲洗液，离心后去除上清液，该步骤重复3遍。
7)向离心后的沉淀加入300μL洗脱液，并振荡反应10min。
8)5000rpm离心5min，收集上清液，并用肌钙蛋白I测定试剂盒(酶联免疫荧光法)完成检测。
9)将吸收值与初级筛选吸收值进行核对比较，获得较对照未突变的cTnI-C复合物热稳定性提高的ICH变体。
将热稳定性提高的ICH变体的编码基因进行DNA序列测定，证实获得了一种具有提高的热稳定性的ICH变体，即E40G突变体。
实施例6
ICH变体基因的扩增
以含E40G突变体基因的表达质粒为模板，ICH-001和ICH-002为上下游引物，进行PCR扩增，反应如下：
Figure BDA0001790158470000111
其中：
10×PCR缓冲液：20mmol/L MgCl2，200mmol/L KCl，50mmol/L Tris-HCl，pH 8.3；
50×dNTPs混合物：含有dATP、dGTP、dTTP、dCTP各10mmol/L；
rTaq DNA聚合酶：购自宝生物工程(大连)有限公司，目录号DR001。
易错PCR反应条件为：95℃预变性5min，再按如下参数循环反应30次：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s；最后72℃延伸10min
PCR产物经1％低融点琼脂糖凝胶电泳后，切出含目的片段的胶块并放入1.5mLEppendorf管中，使用E.Z.N.A Gel Extraction Kit试剂盒(Omega Bio-Tek公司)进行回收，取50μL预热至55℃的无菌水进行洗脱，取3μL进行电泳检测，-20℃保存备用。
实施例7
ICH变体重组菌构建及发酵表达
取实施例6中纯化后的ICH变体PCR产物片段按以下体系进行EcoRI和BamHI双酶切反应：
Figure BDA0001790158470000121
混匀完毕后的酶切反应液，放置于37℃温育3h后，使用E.Z.N.A Cycle Pure Kit试剂盒(Omega Bio-Tek公司)对酶切片段进行直接回收，取50μL预热至55℃的无菌水进行洗脱，取3μL进行电泳检测，-20℃保存备用或直接用于连接反应。pBV220表达载体以同样的方式进行EcoRI和BamHI双酶切反应，纯化回收线性pBV220表达载体片段。
纯化后的酶切PCR产物片段和线性pBV220表达载体片段按以下体系进行连接反应：
Figure BDA0001790158470000122
Figure BDA0001790158470000131
将混匀后的连接反应液，放置于25℃反应30min，4℃备用或直接用于转化反应。
将10μL连接反应液加入100μL E.coli Top10感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴热激90s，再冰浴3min，加LB培养基至1mL，置于32℃、170rpm摇床中振荡培养1h，离心上述培养物，剩余200μL上清并吹吸混匀后涂布于含100mg/mL氨苄青霉素的LB平板，32℃恒温培养过夜。
挑取LB平板上的单菌落，将单菌落接种入含有100mg/mL氨苄青霉素的20mL LB培养基的小摇瓶中，32℃、170rpm振荡培养过夜。将过夜培养的发酵液再次接种于含有100mg/mL氨苄青霉素的2000ml LB培养基的大摇瓶中，当OD600至0.6左右时，将温度调至42℃进行诱导培养5h。
实施例8
ICH变体的纯化
2000ml发酵菌液经8000rpm，4℃离心20min，收集菌体沉淀，加20mL 20mmol/LTrisHCl(pH8.0)重悬菌体后，在冰浴上进行超声破碎，破碎完成后12000rpm，4℃离心20min，收集超声破碎上清液。
取Ni亲和层析柱(3cm×10cm)(填料购自西安保赛恒成生物工程有限公司，Chelating Bio-sep FF(NTA))，用平衡液平衡后。20mL含ICH变体的超声破碎上清液经0.45μm滤膜过滤后，缓慢过柱(AKTA-Prime，0.3MPa，2mL/min)，然后用冲洗液洗去未结合的杂质，最后用洗脱液洗脱蛋白。
将收获的ICH变体蛋白透析至20mmol/L TrisHCl(pH8.0)缓冲液中，超滤浓缩后采用BCA蛋白浓度测定试剂盒(Pierce Biotechnology)进行蛋白浓度定量，调整浓度至10mg/ml，小瓶分装，冷冻干燥，-20℃保存。
实施例9
变体的热稳定性测定
取专利US6475785B1中的序列所表达的纯化蛋白作为对照组1，取市售人源血清来源cTnI作为对照组2，与E40G突变体同时进行热稳定性研究，分别在25℃放置30天、37℃放置7天、42℃放置1天，与2～8℃保存测试结果进行比较，结果见表1。
表1 热稳定实验结果
2-8℃ 25℃，30d 37℃，7d 42℃，1d
对照组1 100％ 72％ 44％ 32％
对照组2 100％ 14％ 5.2％ ND
E40G突变体 100％ 96％ 92％ 88％
表1结果表明：本发明通过蛋白质工程技术对未突变的cTnI-C复合物进行改造、筛选获得的ICH变体E40G热稳定性优良，在25℃、37℃以及42℃条件下的保存率均显著高于市售人源血清来源的cTnI和专利US6475785B1中未突变的cTnI-C复合物。本发明提供的重组心肌肌钙蛋白对于临床应用具有很大的促进作用，并可以解决溯源稳定性的问题，带来可预见的巨大经济效益。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 湖南永和阳光生物科技股份有限公司
湖南麓阳生物科技有限公司
<120> 一种稳定的重组心肌肌钙蛋白及其编码基因和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Tyr Ala Thr Glu Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys Ile Ser
1 5 10 15
Ala Ser Arg Lys Leu Gln Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gln Ile Ala Lys
20 25 30
Gln Glu Leu Glu Arg Glu Ala Gly Glu Arg Arg Gly Glu Lys Gly Arg
35 40 45
Ala Leu Ser Thr Arg Cys Gln Pro Leu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Phe
50 55 60
Ala Glu Leu Gln Asp Leu Cys Arg Gln Leu His Ala Arg Val Asp Lys
65 70 75 80
Val Asp Glu Glu Ala Cys Met Asp Asp Ile Tyr Lys Ala Ala Val Glu
85 90 95
Gln Leu Thr Glu Glu Gln Lys Asn Glu Phe Lys Ala Ala Phe Asp Ile
100 105 110
Phe Val Leu Gly Ala Glu Asp Gly Cys Ile Ser Thr Lys Glu Leu Gly
115 120 125
Lys Val Met Arg Met Leu Gly Gln Asn Pro Thr Pro Glu Glu Leu Gln
130 135 140
Glu Met Ile Asp Glu Val Asp Glu Asp Gly Ser Gly Thr Val Asp Phe
145 150 155 160
Asp Glu Phe Leu Val Met Met Val Arg Cys Met Lys Asp Asp Ser Lys
165 170 175
Gly Lys Ser Glu Glu Glu Leu Ser Asp Leu Phe Arg Met Phe Asp Lys
180 185 190
Asn Ala Asp Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Glu Leu Lys Ile Met Leu Gln
195 200 205
Ala Thr Gly Glu Thr Ile Thr Glu Asp Asp Ile Glu Glu Leu Met Lys
210 215 220
Asp Gly Asp Lys Asn Asn Asp Gly Arg Ile Asp Tyr Asp Glu Phe Leu
225 230 235 240
Glu Phe Met Lys Gly Val Glu
245
<210> 2
<211> 743
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggcttatg ccacggagcc gcacgccaag aaaaaatcta agatctccgc ctcgagaaaa 60
ttgcagctga agactctgct gctgcagatt gcaaagcaag agctggagcg agaggcgggt 120
gagcggcgcg gagagaaggg gcgcgctctg agcacccgct gccagccgct ggagttggcc 180
gggctgggct tcgcggagct gcaggacttg tgccgacagc tccacgcccg tgtggacaag 240
gtggatgaag agcatgcatg gatgacatct acaaggctgc ggtagagcag ctgacagaag 300
agcagaaaaa tgagttcaag gcagccttcg acatcttcgt gctgggcgct gaggatggct 360
gcatcagcac caaggagctg ggcaaggtga tgaggatgct gggccagaac cccacccctg 420
aggagctgca ggagatgatc gatgaggtgg acgaggacgg cagcggcacg gtggactttg 480
atgagttcct ggtcatgatg gttcggtgca tgaaggacga cagcaaaggg aaatctgagg 540
aggagctgtc tgacctcttc cgcatgtttg acaaaaatgc tgatggctac atcgacctgg 600
atgagctgaa gataatgctg caggctacag gcgagaccat cacggaggac gacatcgagg 660
agctcatgaa ggacggagac aagaacaacg acggccgcat cgactatgat gagttcctgg 720
agttcatgaa gggtgtggag tag 743
<210> 3
<211> 743
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggcttatg ccacggagcc gcacgccaag aaaaaatcta agatctccgc ctcgagaaaa 60
ttgcagctga agactctgct gctgcagatt gcaaagcaag agctggagcg agaggcggag 120
gagcggcgcg gagagaaggg gcgcgctctg agcacccgct gccagccgct ggagttggcc 180
gggctgggct tcgcggagct gcaggacttg tgccgacagc tccacgcccg tgtggacaag 240
gtggatgaag agcatgcatg gatgacatct acaaggctgc ggtagagcag ctgacagaag 300
agcagaaaaa tgagttcaag gcagccttcg acatcttcgt gctgggcgct gaggatggct 360
gcatcagcac caaggagctg ggcaaggtga tgaggatgct gggccagaac cccacccctg 420
aggagctgca ggagatgatc gatgaggtgg acgaggacgg cagcggcacg gtggactttg 480
atgagttcct ggtcatgatg gttcggtgca tgaaggacga cagcaaaggg aaatctgagg 540
aggagctgtc tgacctcttc cgcatgtttg acaaaaatgc tgatggctac atcgacctgg 600
atgagctgaa gataatgctg caggctacag gcgagaccat cacggaggac gacatcgagg 660
agctcatgaa ggacggagac aagaacaacg acggccgcat cgactatgat gagttcctgg 720
agttcatgaa gggtgtggag tag 743
<210> 4
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ala Tyr Ala Thr Glu Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys Ile Ser
1 5 10 15
Ala Ser Arg Lys Leu Gln Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gln Ile Ala Lys
20 25 30
Gln Glu Leu Glu Arg Glu Ala Glu Glu Arg Arg Gly Glu Lys Gly Arg
35 40 45
Ala Leu Ser Thr Arg Cys Gln Pro Leu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Phe
50 55 60
Ala Glu Leu Gln Asp Leu Cys Arg Gln Leu His Ala Arg Val Asp Lys
65 70 75 80
Val Asp Glu Glu Ala Cys Met Asp Asp Ile Tyr Lys Ala Ala Val Glu
85 90 95
Gln Leu Thr Glu Glu Gln Lys Asn Glu Phe Lys Ala Ala Phe Asp Ile
100 105 110
Phe Val Leu Gly Ala Glu Asp Gly Cys Ile Ser Thr Lys Glu Leu Gly
115 120 125
Lys Val Met Arg Met Leu Gly Gln Asn Pro Thr Pro Glu Glu Leu Gln
130 135 140
Glu Met Ile Asp Glu Val Asp Glu Asp Gly Ser Gly Thr Val Asp Phe
145 150 155 160
Asp Glu Phe Leu Val Met Met Val Arg Cys Met Lys Asp Asp Ser Lys
165 170 175
Gly Lys Ser Glu Glu Glu Leu Ser Asp Leu Phe Arg Met Phe Asp Lys
180 185 190
Asn Ala Asp Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Glu Leu Lys Ile Met Leu Gln
195 200 205
Ala Thr Gly Glu Thr Ile Thr Glu Asp Asp Ile Glu Glu Leu Met Lys
210 215 220
Asp Gly Asp Lys Asn Asn Asp Gly Arg Ile Asp Tyr Asp Glu Phe Leu
225 230 235 240
Glu Phe Met Lys Gly Val Glu
245
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggcttatg ccacggagcc g 21
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggtgatga tgatgatggc tgccgccctc cacacccttc 40

Claims (7)

1.一种稳定的重组心肌肌钙蛋白，其特征在于，所述重组心肌肌钙蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.编码权利要求1所述重组心肌肌钙蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.含有权利要求2所述基因的重组载体。
4.含有权利要求2所述基因或权利要求3所述重组载体的重组菌。
5.一种制备权利要求1所述重组心肌肌钙蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建表达权利要求2所述基因的重组菌；
(2)对所述步骤(1)中的重组菌进行诱导表达，得到权利要求1所述重组心肌肌钙蛋白。
6.权利要求1所述重组心肌肌钙蛋白、权利要求2所述编码基因、权利要求3所述重组载体或权利要求4所述重组菌在制备心肌损伤诊断试剂盒中的应用。
7.一种用于心肌损伤诊断的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述重组心肌肌钙蛋白和抗cTnI单克隆抗体。
CN201811032801.0A 2018-09-05 2018-09-05 一种稳定的重组心肌肌钙蛋白及其编码基因和应用 Active CN110878116B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811032801.0A CN110878116B (zh) 2018-09-05 2018-09-05 一种稳定的重组心肌肌钙蛋白及其编码基因和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811032801.0A CN110878116B (zh) 2018-09-05 2018-09-05 一种稳定的重组心肌肌钙蛋白及其编码基因和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110878116A CN110878116A (zh) 2020-03-13
CN110878116B true CN110878116B (zh) 2021-03-30

Family

ID=69727507

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811032801.0A Active CN110878116B (zh) 2018-09-05 2018-09-05 一种稳定的重组心肌肌钙蛋白及其编码基因和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110878116B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6475785B1 (en) * 1997-12-18 2002-11-05 Spectral Diagnostics, Inc. Single-chain polypeptides comprising troponin I N-terminal fragments and troponin C
CN1680450A (zh) * 2004-04-08 2005-10-12 北京大学第一医院 一种融合蛋白及其编码基因与应用
CN103694355A (zh) * 2013-12-11 2014-04-02 深圳市菲鹏生物股份有限公司 抗人心肌肌钙蛋白i的重组抗体及其构建方法和应用
CN107216381A (zh) * 2017-04-24 2017-09-29 郑忠亮 cTnI‑cTnC‑cTnT三聚体蛋白及其制备方法和cTnI检测试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6475785B1 (en) * 1997-12-18 2002-11-05 Spectral Diagnostics, Inc. Single-chain polypeptides comprising troponin I N-terminal fragments and troponin C
CN1680450A (zh) * 2004-04-08 2005-10-12 北京大学第一医院 一种融合蛋白及其编码基因与应用
CN103694355A (zh) * 2013-12-11 2014-04-02 深圳市菲鹏生物股份有限公司 抗人心肌肌钙蛋白i的重组抗体及其构建方法和应用
CN107216381A (zh) * 2017-04-24 2017-09-29 郑忠亮 cTnI‑cTnC‑cTnT三聚体蛋白及其制备方法和cTnI检测试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
troponin C slow, partial [synthetic construct];GenBank: AAX37085.1;《GenBank》;20160726;1-2 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110878116A (zh) 2020-03-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2016188449A1 (zh) 一种针对cd47的单域抗体
AU2016294206B2 (en) Novel endos mutant enzyme
CN110003335B (zh) Cd47单域抗体、核酸及试剂盒
CN113087804B (zh) 一种二价植物免疫融合蛋白及其生产方法和应用
CN113817707B (zh) 一种突变重组逆转录酶及其制备方法和应用
CN111675758B (zh) 一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗
JP4486009B2 (ja) Ｄｎａリガーゼ変異体
CN101302526A (zh) 重组可溶性溶血链球菌溶血素o基因、重组蛋白及其制备方法
CN109402092B (zh) 一种海洋环境来源的几丁质酶及其基因
CN111349159A (zh) 一种抗人血清白蛋白的纳米抗体及其应用
CN108059676B (zh) 一种抗人神经生长因子scFv抗体及制备方法
CN110878116B (zh) 一种稳定的重组心肌肌钙蛋白及其编码基因和应用
CN110317813B (zh) 三疣梭子蟹C型凝集素PtCLec2基因及其编码蛋白和应用
CN103360497A (zh) 一种新型抗肿瘤融合蛋白疫苗及其制备方法和应用
CN107253988B (zh) 一种人源程序性死亡因子配体pd-l2蛋白的制备方法
CN110105433B (zh) 乳酸菌抗菌肽及高效表达及抗菌抗癌活性的应用
CN108165539A (zh) 一种梨S7-RNase蛋白的体外表达方法及其多克隆抗体的制备方法
CN108864273B (zh) 一种模拟人源性抗菌肽及其制备方法
CN111269296B (zh) 一种nLsA蛋白及其结构基因和应用
JPWO2020045472A5 (zh)
CN116496392B (zh) 抗新型冠状病毒n蛋白单域抗体、融合蛋白及其编码基因和应用
CN112979769B (zh) 一种氨基酸序列、蛋白质及其制备方法和应用
CN110003334B (zh) 多肽、cd19单域抗体及其制备方法、核苷酸序列及试剂盒
CN110003330B (zh) TNF-α单域抗体、核酸分子及试剂盒
CN115094047B (zh) 一种直扩型Bst DNA聚合酶及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant