CN107216381A

CN107216381A - cTnI‑cTnC‑cTnT三聚体蛋白及其制备方法和cTnI检测试剂盒

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Publication number: CN107216381A
Application number: CN201710271182.XA
Authority: CN
Inventors: 郑忠亮
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-04-24
Filing date: 2017-04-24
Publication date: 2017-09-29
Anticipated expiration: 2037-04-24
Also published as: CN107216381B

Abstract

本发明公开了cTnI‑cTnC‑cTnT三聚体蛋白及其制备方法和cTnI检测试剂盒。该三聚体蛋白由cTnI蛋白、cTnC蛋白和cTnT蛋白依次连接形成。其制备方法是人工合成三聚体蛋白的编码基因，克隆到表达载体得到表达质粒，再将其转化到大肠杆菌，IPTG诱导表达；培养结束后培养液用Tris‑盐酸缓冲液搅拌振荡使细菌沉淀重悬，超声波破壁，离心取上清，依次过镍柱、强阴离子交换柱Q柱和Sephedex G200分子筛层析柱，得到纯化的活性蛋白。以该蛋白作为阳性标准品，制备了以稀土荧光微球为载体的时间分辨荧光定量检测试剂盒，用于检测样本中的cTnI，具有稳定、敏感、定量、简便、快速、结果可靠的特点。

Description

cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白及其制备方法和cTnI检测试剂盒

技术领域

本发明涉及cTn三聚体蛋白及其制备方法和cTnI检测试剂盒，具体是涉及一种肌钙蛋白三个亚基cTnI、cTnC和cTnT融合三聚体蛋白及其基因工程表达及一种检测这三种亚基蛋白的时间分辨荧光定量检测试剂盒。

背景技术

肌钙蛋白是由T、C、I三个亚基构成，和原肌球蛋白一起通过调节钙离子对横纹肌动蛋白ATP酶的活性来调节肌动蛋白和肌球蛋白相互作用。当心肌损伤后，心肌肌钙蛋白复合物释放到血液中，4～6小时后，开始在血液中升高，升高的肌钙蛋白I能在血液中保持很长时间6～10天。

肌钙蛋白在急性心肌梗死中的作用是巨大的，无论是溶栓、经皮冠状动脉介入术(PCI)、还是冠脉搭桥术(CABG)，都是风险极大的治疗手段，所以“冠心病，急性心肌梗塞”诊断的正确性就显得尤为重要。长期以来临床工作者一直致力于寻找一种高敏感性和高特异性血清诊断指标，以期提高诊断正确性。在近几十年中曾经有很多血清诊断指标在临床中得到应用，从天冬氨酸氨基转移酶(AST)到乳酸脱氢酶(LDH)，再到肌红蛋白、肌酸激酶(CK)、心肌肌酸激酶同工酶(CK-MB)和心肌肌酸激酶同工酶质量(CK-MB mass)，最后到心肌肌钙蛋白(cardiac troponin，cTn)。这一演变体现心肌损伤标志物检测的敏感度和特异度越来越高，目前高敏肌钙蛋白(hs-cTn)可以检出非常微小的心肌损伤。肌钙蛋白在临床实践中成为目前公认的高敏感性和高特异性指标为所有指南所推荐。

现阶段，临床上cTnI的检测方法有双抗夹心免疫化学发光法、放射性免疫法、酶联免疫法(ELISA)、免疫层析法等。

双抗夹心免疫化学发光法敏感度高、所需时间短等优点，但是不能检测正常人血中的cTnI。

放射性免疫法是通过将放射活性分子共价交联至cTnI抗体免疫反应后测定放射活性分子的放射信号来间接定量检测cTnI的一种超微量分析方法。具有特异性好、灵敏度高(可达ng和pg级)、操作简便、样品制备简单、精确定量等优点，但是该方法中操作人员会接触到放射性物质，可能会损害操作人员的身体，而且检测完成后怎样处置放射性材料也是个严重的问题。

cTnI的酶联免疫检测方法时双抗夹心ELISA方法，将一对cTnI单抗分别进行酶标板固化和酶标记，抗原抗体反应后，通过酵素呈色反应，即可显示特定抗原是否存在，并可根据呈色之深浅进行定量分析。具有特异性强、灵敏度高、操作简便、快速、样品能量大、不但能进行定性检测也能定量检测，但是耗时较长。

侧向层析法在疾病快速诊断、小分子快速检测等领域已得到了广泛的应用。其原理是将特异性的抗原或抗体包被到硝酸纤维素膜上，构成检测线，将二抗包被在距离检测线在2～3毫米的区域构成质控线。当样本中的目标分子与带有特定标记物的检测抗体结合后，从硝酸纤维素酶的上样端向吸水端层析。由于毛细管作用，复合物将沿着膜向前移动，但移动到检测线时，样品中的目标分子将被检测线中的捕获抗体捕捉而停留在检测线，多余的检测抗体则通过检测线后被质控线的二抗所捕捉。常用的标记物为胶体金颗粒、荧光微球等。

cTnI的胶体金免疫层析法通过静电吸附将cTnI抗体标记到胶体金颗粒表面，通过观察胶体金颗粒在检测线上的聚集显色判断检测结果。具有快速、简便、直观等优点，但同时存在着以存在依靠肉眼识别、灵敏度低、无法精确定量、标记通过静电吸附，标记产物不稳定等缺点。

cTnI的免疫荧光层析技术是将cTnI抗体共价结合于荧光微球表面的活性基团(-COOH、-NH₂)上，通过激发后检测线是否产生荧光来判断检测结果，延续了胶体金免疫层析方法的优势，同时具有高敏感度、完全定量、标记物稳定的优点。在医学、动植物检疫、食品安全监督各领域得到了日益广泛的应用。

在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。大部分背景荧光信号是短时存在的，因此将长衰减寿命的标记物与时间分辨荧光技术相结合，就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。

时间分辨荧光免疫分析(Timed-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)是一种灵敏的高端定量免疫检测技术,是以镧系稀土离子作为标记物来标记抗原或抗体,因镧系稀土离子Stokes位移大，避免了激发光和发射光的重叠而影响结果，而且镧系稀土离子荧光寿命长，可以通过延长检测时间来消除检测物质本底荧光的干扰，提高了灵敏度，另外稀土元素的荧光强度高，同样能够提高检测的灵敏度。常用的稀土荧光微球为铕(EU)荧光微球。

由于不同检测方法使用的质控品(阳性标准品)质量存在差异，导致检测结果出现几十倍或者更高的差异，给诊断准确性造成较大影响。Hytest公司从心肌组织中提纯获得一种cTnI-cTnC-cTnT三元复合体在2002年获得了NIST认证，但近年来的研究指出使用该三元复合物并没有使不同cTnI检测方法结果之间的可比性有所提高。

新近的研究表明可以使用原核表达的方法直接表达出患者血清中cTnI的主要存在形式，在扩增出的cTnI和cTnC基因之间加上57个碱基的Linker序列(19个中性氨基酸残基TS-(G₄S)₃-AC)，转化pET28a表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达，经NTA树脂亲和层析纯化，得到cTnI-cTnC融合蛋白。

我们前期的实验结果显示，cTnI和cTnC二聚体的偶联原核表达只能得到包涵体，蛋白不可溶，在实际使用中仍然存在困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白，具有抗原稳定性好的特性。而且该三聚体蛋白能够通过基因工程方式进行原核表达，获得具有活性的可溶性蛋白。

本发明的另一个目的是提供上述cTnI-cTnC-cTnT三聚体的制备方法。

本发明的再一目的是提供上述cTnI-cTnC-cTnT三聚体在作为阳性标准品制备检测cTnI的试剂盒中的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明提供的一种cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白，由cTnI蛋白、cTnC蛋白和cTnT蛋白依次连接形成。我们研究发现，该三联体并不需要用到其他的loop序列，只需利用这三个蛋白本身的N末端的loop结构即可。

优选地，上述cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还保护上述cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白的编码基因。

本发明提供的一种上述cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白的制备方法，其包括以下步骤：

人工合成cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白的编码基因，克隆到表达载体pET28a的多克隆位点BamH I/Xho I中，得到表达质粒pET28a-cTnI；

将表达质粒pET28a-cTnI转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达；

培养结束后培养液用Tris-盐酸缓冲液搅拌振荡使细菌沉淀重悬，超声波破壁，离心取上清，依次过镍柱、强阴离子交换柱Q柱和Sephedex G200分子筛层析柱，得到纯化的cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白。

镍柱也称为镍离子亲和层析柱，是以琼脂糖凝胶微球为基础，在其表面共价交联带有多个游离羧基的配体有机小分子化合物，由于多个羧基与Ni²⁺发生螯合，螯合后的Ni²⁺能与目标蛋白中His上的咪唑环发生特殊的相互作用，从而实现蛋白质的分离。优选使用美国GE公司HisTrap HPNi FFNTA型号的5mL规格的镍离子亲和层析柱。

强阴离子交换柱Q柱，优选使用美国GE公司HiTrap Q型号的5mL规格的预装柱。

Superdex G200凝胶过滤层析柱是美国GE公司Superdex 75/300GL型号的预装柱。

本发明还提供上述cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白作为抗原，制备的抗体。

本发明还提供了一种cTnI的检测试剂盒，包括cTnI阳性标准品，所述cTnI阳性标准品为以上任意所述的cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白。

本发明还提供了一种用于检测cTnI的免疫荧光试剂盒，其包括含冻干的荧光微球复合体的枪头、免疫荧光试纸卡、含样品缓冲液的冻存管，和以上所述cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白制备的阳性标准品；其中，

荧光微球复合体：将稀土荧光微球通过碳二亚胺和羟基硫代琥珀酰亚胺将羧基活化，然后以羧基化的稀土荧光微球作为标记载体，与cTnI单抗中-NH₂共价结合；

免疫荧光试纸卡包括cTnI检测试纸，检测试纸由吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫依次搭接贴于PVC衬板上构成，硝酸纤维素膜上的检测线位置包被有抗cTnI单抗，质控线位置包被有羊抗小鼠多抗；检测试纸固定在塑料底卡上并且表面用面卡压紧，面卡在对应检测试纸的样品垫和硝酸纤维素膜的部位分别预留加样孔和观察窗。

检测原理：将稀释好的样品与荧光检测抗体(荧光微球复合体，标记有小鼠源的cTnI单抗)混合后，加入到试纸卡一端的加样口，通过毛细作用向前移动，反应一段时间后，利用荧光扫描仪，扫描试纸卡的观察框，捕捉质控线和检测线被激发的荧光强度，如果样品中含有相应的cTnI抗原，包被在检测线上的抗体(抗cTnI单抗)和荧光标记物与样品中的抗原结合，形成免疫复合物，检测线和质控线均会产生荧光；如果待检样品中没有相应抗原，荧光标记物将不会与包被在检测线上的抗原或抗体结合，荧光标记物不会富集，则检测线上不会产生荧光，而质控线会出现荧光。

优选地，上述用于检测cTnI的免疫荧光试剂盒，其还包括干燥剂；全部试剂均封装在铝箔袋中，真空封口，4℃保存。

优选地，上述用于检测cTnI的免疫荧光试剂盒，所述样品缓冲液为含有质量体积比0.25％酪蛋白和40mM EDTA的PB缓冲液。

优选地，上述用于检测cTnI的免疫荧光试剂盒，还包括阳性标准品稀释液，所述阳性标准品稀释液为含有质量体积比6％BSA和浓度5mM葡萄糖的PB缓冲液。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明将cTnI、cTnC、cTnT进行融合表达，不需要增加额外的连接肽，得到的cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白，具有较好的抗原稳定性，为可溶的蛋白，而且用ELISA的方法检测也是具有活性的，因此可以用于标准品。

本发明提供的cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白的制备方法，能够得到cTnI活性蛋白含量40％以上的蛋白产物，为可溶性表达的蛋白，其他二聚体表达等都是包涵体。

以本发明的cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白为基础，稀释后得到含有不同浓度cTnI活性蛋白的标准品溶液，经ELISA法检测，误差小于5％，稳定性非常好。

本发明提供的检测试剂盒，通过采用稀土(镧系元素)荧光微球作为标记载体，标记载体稳定，标记通过共价键将微球和抗体连接，标记产物稳定；可避免样品本身的荧光影响，检测快速简便、敏感性高，可实现全定量检测；以本发明的cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白作为阳性对照，组装检测cTnI免疫荧光定量检测试剂盒，使试剂盒具有稳定、敏感、定量、简便、快速、结果可靠的特点。

附图说明

图1是实施例1中SDS-PAGE凝胶电泳检测表达纯化后的cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白结果，图中cTnTCI表示三聚体蛋白。

图2是实施例3中试纸条结构组成图。

图3是实施例4中cTnI活性蛋白(cTnI-cTnC-cTnT三聚体中的cTnI活性蛋白)在不同浓度下在荧光试纸卡上的层析曲线。

图4是实施例4中cTnI活性蛋白(cTnI-cTnC-cTnT三聚体中的cTnI活性蛋白)的标准曲线。

图5是实施例5中FN荧光层析和ELISA方法检测血液样本的准确度的相关性结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

以下实施例中，如无特殊说明，所用生物材料及试剂均为市售商品，未详细提及的实验步骤均为常规技术手段。

实施例1：cTnI融合蛋白的克隆、表达与纯化

①按氨基酸序列N端到C端的方向，人工化学合成“cTnI-cTnC-cTnT”三联体基因序列，如SEQ ID NO.2所示。

②将“cTnI-cTnC-cTnT”基因序列克隆到pET28a质粒表达载体的BamH I和Xhol I的多克隆插入位点，得到表达质粒pET28a-cTnI。

③将克隆得到的表达质粒pET28a-cTnI转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布平板，并过夜培养。

④第二天早上挑取单菌落接种到LB培养基中于37℃培养至菌液光吸收值(OD)达到1.0，加入1μg/mL的IPTG诱导表达。37℃培养4小时后离心收集细菌。

⑤在细菌中加入100mL的100mM的Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，搅拌振荡使细菌沉淀重悬，用超声波破壁后，16,000rpm转速下离心取上清。

⑥将上清依次通过镍柱、强阴离子交换柱Q柱和Sephedex G200分子筛层析柱。得到纯化的cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白，其中包含cTnI活性蛋白。纯化结果如图1所示。

实施例2：cTnI活性蛋白的ELISA法定量检测

①利用热电公司生产的BCA蛋白含量测定试剂盒测定纯化到的cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白的总蛋白含量，对三批纯化蛋白进行检测，并做误差分析。结果如表一所示。

②利用CloneTech公司生产的cTnI的ELISA试剂盒检测cTnI的活性蛋白含量。对以上三批纯化蛋白进行检测，并做误差分析。结果如表一所示。

表一、利用BCA法测定总蛋白含量和利用ELISA法测定cTnI活性蛋白含量

实施例3：免疫层析试剂盒的制备

(1)荧光微球标记抗体：

①取0.5mL微球，离心取沉淀，加入pH6.0的MES缓冲液洗涤两次。

②活化：在洗涤后的微球中分别加入114μL的50mM的碳二亚胺(EDAC)和114μL的50mM的羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)，室温震荡1h。

③离心微球，用PB缓冲液洗涤两次。

④加入适当量的小鼠源的cTnI单克隆抗体，室温震荡2h。

⑤离心微球，加入50mM的羟胺缓冲液淬灭反应，室温震荡5min；然后离心微球，加入50mM的羟胺缓冲液彻底淬灭反应，室温震荡30min

⑥离心微球，加入封闭液(0.5％酪蛋白，10mM PB)，室温震荡2h。

⑦加入400μL储存液(0.5％BSA，0.5％Tween-20，0.02％叠氮化钠，10mM PB)保存于4℃。

(2)枪头的制备：

将制备好的标记有cTnI单抗的荧光微球喷点于枪头中，每个2.5μL，-80℃冰箱冷冻过夜后，冷冻真空干燥2h后可用于组装试剂盒。

(3)包被膜的制备：

①包被

揭开PVC底板中间宽度25mm的保护膜，将硝酸纤维素膜(即NC膜)粘贴于此，即可用于T线(检测线)和C线(质控线)抗体的包被。

调整划线的位置，是T线距NC膜下缘(样品垫端)7mm，C线距NC膜下缘(吸水垫端)11mm，T线和C线间距为4mm。

检测线(T线)：用0.01M的PBS(pH7.4，包含3％甲醇)将抗cTnI单抗稀释到1mg/mL进行包被，划线浓度为1μL/cm，速度100mm/s。

质控线(C线)：用0.01M的PBS(pH7.4，包含3％甲醇)将羊抗小鼠多克隆抗体稀释到1mg/mL进行包被，划线浓度为1μL/cm，速度100mm/s。

②干燥

放入37℃烘箱，干燥30～40min。

(4)样品垫的制备：

将玻璃纤维膜裁剪至31mm×100mm，用枪头将1.91mL封闭液(0.01M PB缓冲液，包含3％BSA)均匀涂布于玻璃纤维膜表面，置37℃烘箱过夜干燥。

(5)检测试纸的组装与剪切

在已粘贴硝酸纤维素膜(包被有抗cTnI单抗检测区和羊抗小鼠质控区)的PVC底板(宽77mm)上下两端分别粘贴吸水垫和已处理好的样品垫，吸水垫在较窄一端，宽度为25mm，与包被膜交联2mm；样品垫在较宽一端，宽度为31mm，与包被膜交联2mm。

组装完成，切条机切成5mm宽度，即为免疫荧光试纸。具体组装方式如图2所示。

(6)试纸卡的制备

把一条免疫荧光试纸固定在塑料底卡上，试纸表面用面卡压紧，面卡在对应试纸条的样品垫和NC膜的部位分别预留加样孔和观察窗。即为免疫荧光试纸卡。

(7)试剂盒的制备

将免疫荧光试纸卡、含冻干荧光微球抗体复合物的枪头、含样品稀释液的冻存管、两包1g干燥剂共同放入铝箔袋，真空封口后4℃保存，即制备完成检测cTnI的免疫荧光试剂盒。

实施例4：检测cTnI标准品

连续稀释cTnI阳性标准品(本发明的cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白)，用稀释液(6％BSA，5mM葡萄糖，PB)将标准品进行10倍稀释，制成50000ng/L、25000ng/L、15000ng/L、5000ng/L、2000ng/L、500ng/L、50ng/L、10ng/L等浓度的样品。用含冻干荧光微球复合物的移液器取75μL样品溶液，加入到300μL的样品缓冲液(0.25％酪蛋白，40mMEDTA，PB)中，混匀后取75μL点加到试纸卡的加样孔中。室温静置20min，将试纸卡放到荧光扫描仪中读数。用检测线荧光值除以质控线荧光值为测量值。每个样品浓度进行测量三次，取平均值后，以测量值对样品浓度作图。检测线和质控线的峰形图如图3所示，峰形非常灵敏。标准品的线性结果如图4所示，线性也非常好。

实施例5：临床血样中cTnI的检测

采集医院cTnI的阳性和阴性样本，用本试剂盒(方法同上)和EISA两种方法进行检测，分别计算检出率。结果如表二所示，本免疫荧光定量检测试剂盒(表二中FN荧光层析)的检出率明显高于ELISA的方法。

表二、临床血样中cTnI的检测

	阴性	阳性	阴性符合率	阳性符合率
					ELISA	180	450	96.2％	96.8％
FN荧光层析	180	450	97.6％	98.2％

同时对血样进行准确度相关性的实验，以免疫荧光定量检测试剂盒的检测结果对ELISA的检测结果进行作图，如图5所示，点的分布主要分布在45度角直线附近，拟合得到相关曲线，得到两种方法的相关系数为0.9946，可见两种方法的检测结果非常一致。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉普诺金生物科技有限责任公司

<120> cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白及其制备方法和cTnI检测试剂盒

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 476

<212> PRT

<213> 人工序列（cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白）

<400> 1

Met Ala Asp Gly Ser Ser Asp Ala Ala Arg Glu Pro Arg Pro Ala Pro

1 5 10 15

Ala Pro Ile Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Arg Ala Tyr Ala Thr Glu

20 25 30

Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys Ile Ser Ala Ser Arg Lys Leu Gln

35 40 45

Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gln Ile Ala Lys Gln Glu Leu Glu Arg Glu

50 55 60

Ala Glu Glu Arg Arg Gly Glu Lys Gly Arg Ala Leu Ser Thr Arg Ala

65 70 75 80

Gln Pro Leu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Phe Ala Glu Leu Gln Asp Leu

85 90 95

Ala Arg Gln Leu His Ala Arg Val Asp Lys Val Asp Glu Glu Arg Tyr

100 105 110

Asp Ile Glu Ala Lys Val Thr Lys Asn Ile Thr Glu Ile Ala Asp Leu

115 120 125

Thr Gln Lys Ile Phe Asp Leu Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro Thr Leu

130 135 140

Arg Arg Val Arg Ile Ser Ala Asp Ala Met Met Gln Ala Leu Leu Gly

145 150 155 160

Ala Arg Ala Lys Glu Ser Leu Asp Leu Arg Ala His Leu Lys Gln Val

165 170 175

Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys Glu Asn Arg Glu Val Gly Asp Trp Arg

180 185 190

Lys Asn Ile Asp Ala Leu Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys Lys Lys Phe

195 200 205

Glu Ser Met Asp Asp Ile Tyr Lys Ala Ala Val Glu Gln Leu Thr Glu

210 215 220

Glu Gln Lys Asn Glu Phe Lys Ala Ala Phe Asp Ile Phe Val Leu Gly

225 230 235 240

Ala Glu Asp Gly Cys Ile Ser Thr Lys Glu Leu Gly Lys Val Met Arg

245 250 255

Met Leu Gly Gln Asn Pro Thr Pro Glu Glu Leu Gln Glu Met Ile Asp

260 265 270

Glu Val Asp Glu Asp Gly Ser Gly Thr Val Asp Phe Asp Glu Phe Leu

275 280 285

Val Met Met Val Arg Cys Met Lys Asp Asp Ser Lys Gly Lys Ser Glu

290 295 300

Glu Glu Leu Ser Asp Leu Phe Arg Met Phe Asp Lys Asn Ala Asp Gly

305 310 315 320

Tyr Ile Asp Leu Asp Glu Leu Lys Ile Met Leu Gln Ala Thr Gly Glu

325 330 335

Thr Ile Thr Glu Asp Asp Ile Glu Glu Leu Met Lys Asp Gly Asp Lys

340 345 350

Asn Asn Asp Gly Arg Ile Asp Tyr Asp Glu Phe Leu Glu Phe Met Lys

355 360 365

Gly Val Glu Gly Gly Tyr Leu Val Lys Ala Glu Gln Lys Arg Gly Lys

370 375 380

Arg Gln Thr Gly Arg Glu Met Lys Val Arg Ile Leu Ser Glu Arg Lys

385 390 395 400

Lys Pro Leu Asp Ile Asp Tyr Met Gly Glu Glu Gln Leu Arg Glu Lys

405 410 415

Ala Gln Glu Leu Ser Asp Trp Ile His Gln Leu Glu Ser Glu Lys Phe

420 425 430

Asp Leu Met Ala Lys Leu Lys Gln Gln Lys Tyr Glu Ile Asn Val Leu

435 440 445

Tyr Asn Arg Ile Ser His Ala Gln Lys Phe Arg Lys Gly Ala Gly Lys

450 455 460

Gly Arg Val Gly Gly Arg Ser Ala Gly Ser Ser Gly

465 470 475

<210> 2

<211> 1428

<212> DNA

<213> 人工序列（cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白编码基因）

<400> 2

atggcggatg ggagcagcga tgcggctagg gaacctcgcc ctgcaccagc cccaatcaga 60

cgccgctcct ccaactaccg cgcttatgcc acggagccgc acgccaagaa aaaatctaag 120

atctccgcct cgagaaaatt gcagctgaag actctgctgc tgcagattgc aaagcaagag 180

ctggagcgag aggcggagga gcggcgcgga gagaaggggc gcgctctgag cacccgcgct 240

cagccgctgg agttggccgg gctgggcttc gcggagctgc aggacttggc tcgacagctc 300

cacgcccgtg tggacaaggt ggatgaagag agatacgaca tagaggcaaa agtcaccaag 360

aacatcacgg agattgcaga tctgactcag aagatctttg accttcgagg caagtttaag 420

cggcccaccc tgcggagagt gaggatctct gcagatgcca tgatgcaggc gctgctgggg 480

gcccgggcta aggagtccct ggacctgcgg gcccacctca agcaggtgaa gaaggaggac 540

accgagaagg aaaaccggga ggtgggagac tggcgcaaga acatcgatgc actgagtgga 600

atggagggcc gcaagaaaaa gtttgagagc atggatgaca tctacaaggc tgcggtagag 660

cagctgacag aagagcagaa aaatgagttc aaggcagcct tcgacatctt cgtgctgggc 720

gctgaggatg gctgcatcag caccaaggag ctgggcaagg tgatgaggat gctgggccag 780

aaccccaccc ctgaggagct gcaggagatg atcgatgagg tggacgagga cggcagcggc 840

acggtggact ttgatgagtt cctggtcatg atggttcggt gcatgaagga cgacagcaaa 900

gggaaatctg aggaggagct gtctgacctc ttccgcatgt ttgacaaaaa tgctgatggc 960

tacatcgacc tggatgagct gaagataatg ctgcaggcta caggcgagac catcacggag 1020

gacgacatcg aggagctcat gaaggacgga gacaagaaca acgacggccg catcgactat 1080

gatgagttcc tggagttcat gaagggtgtg gagggcggct acctggtcaa ggcagaacag 1140

aagcgtggta agcggcagac ggggcgggag atgaaggtgc gcatcctctc cgagcgtaag 1200

aagcctctgg acattgacta catgggggag gaacagctcc gggagaaagc ccaggagctg 1260

tcggactgga tccaccagct ggagtctgag aagttcgacc tgatggcgaa gctgaaacag 1320

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ggggcaggga agggccgcgt tggaggccgc agtgctggaa gtagtgga 1428

Claims

1.一种cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白，其特征在于，由cTnI蛋白、cTnC蛋白和cTnT蛋白依次连接形成。

2.根据权利要求1所述的cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

3.权利要求1或2所述的cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白的编码基因。

4.权利要求1或2所述的cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.以权利要求1或2所述的cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白作为抗原，制备的抗体。

6.一种cTnI的检测试剂盒，包括cTnI阳性标准品，其特征在于，所述cTnI阳性标准品为权利要求1或2所述的cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白。

7.一种用于检测cTnI的免疫荧光试剂盒，其特征在于，包括含冻干的荧光微球复合体的枪头、免疫荧光试纸卡、含样品缓冲液的冻存管，和权利要求1或2所述cTnI-cTnC-cTnT三聚体蛋白制备的阳性标准品；其中，

8.根据权利要求7所述的用于检测cTnI的免疫荧光试剂盒，其特征在于，还包括干燥剂；全部试剂均封装在铝箔袋中，真空封口，4℃保存。

9.根据权利要求7所述的用于检测cTnI的免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述样品缓冲液为含有质量体积比0.25％酪蛋白和40mM EDTA的PB缓冲液。

10.根据权利要求7所述的用于检测cTnI的免疫荧光试剂盒，其特征在于，还包括阳性标准品稀释液，所述阳性标准品稀释液为含有质量体积比6％BSA和浓度5mM葡萄糖的PB缓冲液。