CN115925960A - 能与肌酸激酶同工酶特异性结合的抗体或抗原结合片段及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了能与肌酸激酶同工酶特异性结合的抗体或抗原结合片段及其应用。本发明公开了一对能与肌酸激酶同工酶(CK‑MB)特异性结合的抗体或抗原结合片段，均与CK‑MB抗原具有很好的亲和力，可形成双抗体夹心结构，可以用于CK‑MB的检测以及诊断CK‑MB相关疾病的测定试剂盒开发。

Description

能与肌酸激酶同工酶特异性结合的抗体或抗原结合片段及其应用

技术领域

本发明属于体外诊断与抗体技术领域，具体涉及能与肌酸激酶同工酶(CK-MB)特异性结合的抗体或抗原结合片段及其应用。

背景技术

急性心肌梗死(AMI)是由冠状动脉阻塞或痉挛导致急性、持续性缺血氧的心肌坏死。AMI发病时常伴有严重的胸骨后疼痛，冠状动脉硬化，心肌细胞会迅速坏死，血清心肌酶量增高，心律不齐、休克，发病时如果治疗不及时会危及生命。

AMI可以通过心肌损伤标志物对其进行诊断，在患者发病早期，心肌细胞损伤较少时通过血液检测，早发现早治疗，可以及时挽救患者生命。能够作为AMI早期诊断的标志物有肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌红蛋白(MYO)。肌酸激酶(CK)具有四周同工酶：杂化型(MB)、肌肉型(MM)、脑型(BB)、线粒体型(MiMi)，MB型主要存在与心肌细胞中，MM型主要存在于骨骼肌肉组织中，BB型主要存在于脑组织、胃肠道及子宫平滑肌中，MiMi型主要存在于心肌和骨骼肌线粒体中。当心肌梗塞发生时，血清中的肌酸激酶水平在发病时6小时后迅速提高，24小时后达到一定峰值，其中CK-MB的活性可增高至正常水平的10～25倍。CK-MB作为心肌损伤标志物，具有较高的灵敏度、特异性及诊断准确率。

目前临床上有较多的方法检测CK-MB，如酶联免疫法、免疫抑制法、电泳法、免疫分析法、化学发光法等，这些方法上的弊端有检测中期长、原料用量大、仪器设备成本高等。

由于AMI发病快，患者需要快速进行诊断，便于尽快治疗。免疫层析胶体金法具有快速检测、便携、易于操作等特点，广泛应用在传染病、毒品、早孕等方面，但是该方法检测灵敏度低、无法精准定量。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一对能与CK-MB特异性结合的抗体或抗原结合片段，能够特异性识别CK-MB，且形成双抗夹心模式，具有较好的亲和力、特异性及活性。

一对能与CK-MB特异性结合的抗体或抗原结合片段，包括：

抗体B4-3：

轻链可变区CDR1序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

轻链可变区CDR2序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

轻链可变区CDR3序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

重链可变区CDR1序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；

重链可变区CDR2序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；

重链可变区CDR3序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；

以及，

抗体H6-4：

轻链可变区CDR1序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；

轻链可变区CDR2序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；

轻链可变区CDR3序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；

重链可变区CDR1序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；

重链可变区CDR2序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；

重链可变区CDR3序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。

作为优选，所述抗体B4-3和H6-4为单克隆抗体。

作为优选，所述抗体B4-3和H6-4为鼠源抗体。

本发明的第二个目的是提供一种核酸，所述核酸编码上述抗体或抗原结合片段。

本发明的第三个目的是提供一种载体，所述载体包括上述核酸。

本发明的第四个目的是提供一种细胞，所述细胞包括上述载体。

本发明的第五个目的是提供上述抗体或抗原结合片段在制备肌酸激酶同工酶相关疾病的早期检测产品中的应用。

作为优选，所述肌酸激酶同工酶相关疾病为急性心肌梗死(AMI)疾病。

本发明的第六个目的是提供一种检测试剂盒，包含上述抗体或抗原结合片段。

作为优选，所述抗体B4-3作为标记抗体，所述抗体H6-4作为包被抗体。

本发明的有益效果：

本发明的两株抗人CK-MB单克隆抗体对CK-MB抗原具有较好的亲和力和特异性，且能够与CK-MB抗原形成双抗体夹心模式，可以用于人血清中的CK-MB蛋白含量的检测，开发胶体金法、乳胶法、酶联免疫法或免疫荧光层析法检测试剂盒。

附图说明

图1为CK-MB免疫原表达纯化后的SDS-PAGE图。

图2为本发明两株抗CK-MB单克隆抗体纯化后的SDS-PAGE图；其中标记1：B4-3，2：H6-4，M：Marker，蛋白标准分子量。

图3为CK-MB校准品标准曲线，其中A为曲线图像，B为对应的曲线参数。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案、实验方法及优点更加明确，下面将结合本发明的实施例及图片，对本发明实施的技术方案进一步详细说明。实施例中如有问标注条件之处，按照实验常规条件或生产厂商说明书的条件进行。所用未注明生产厂商的实绩或实验设备，均为市售购买获得的常规产品。本发明实施例张使用的科学术语与所属领域的一般技术员通常理解的含义相同，若有特殊之处会标识说明。

本发明提供一对能与CK-MB特异性结合的抗体或抗原结合片段，包括：

抗体B4-3：

轻链可变区CDR1序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，具体为：

ArgThrSerGluSerValGluTyrTyrGlyThrSerLeuMetGln

轻链可变区CDR2序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，具体为：

GlyAlaSerAsnValGluSer

轻链可变区CDR3序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，具体为：

GlnGlnSerArgLysAlaProTrp

重链可变区CDR1序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，具体为：

SerPheAlaMetSer

重链可变区CDR2序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，具体为：

ThrIleAsnArgGlyGlyTyrSerThrTyrTyrProAspSerValLysGly

重链可变区CDR3序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，具体为：

HisLeuGluTyrGlyAsnTyrValAspTyrGluLeuAspTyr

以及，

抗体H6-4：

轻链可变区CDR1序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，具体为：

LysSerSerGlnSerLeuPheAspSerArgThrArgLysAsnTyrLeuAla

轻链可变区CDR2序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，具体为：

TrpAlaSerThrArgGluSer

轻链可变区CDR3序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，具体为：

LysGluSerTyrAsnLeuTyrThr

重链可变区CDR1序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，具体为：

ThrTyrAlaMetSer

重链可变区CDR2序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，具体为：

SerIleIleSerGlyGlyTyrThrTyrTyrProAspSerValLysGly

重链可变区CDR3序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，具体为：

GlyValAspPheAspVal

实施例1：CK-MB免疫原的制备

本发明CK-MB免疫原氨基酸序列为美国国家生物技术信息中心(NCBI)公布的序列，其氨基酸序列号为EAW57337.1(SEQ ID NO:1)。选取CK-MB全氨基酸片段，由通用生物系统(安徽)有限公司对氨基酸序列分析及密码子优化，在基因序列C端引入6个组氨酸(His)，并构建到pET 22b表达载体中，优化后的基因序列为SEQ ID NO:2。

SEQ ID NO:1具体如下：

MetProPheGlyAsnThrHisAsnLysPheLysLeuAsnTyrLysProGluGluGluTyrProAspLeuSerLysHisAsnAsnHisMetAlaLysValLeuThrLeuGluLeuTyrLysLysLeuArgAspLysGluThrProSerGlyPheThrValAspAspValIleGlnThrGlyValAspAsnProGlyHisProPheIleMetThrValGlyCysValAlaGlyAspGluGluSerTyrGluValPheLysGluLeuPheAspProIleIleSerAspArgHisGlyGlyTyrLysProThrAspLysHisLysThrAspLeuAsnHisGluAsnLeuLysGlyGlyAspAspLeuAspProAsnTyrValLeuSerSerArgValArgThrGlyArgSerIleLysGlyTyrThrLeuProProHisCysSerArgGlyGluArgArgAlaValGluLysLeuSerValGluAlaLeuAsnSerLeuThrGlyGluPheLysGlyLysTyrTyrProLeuLysSerMetThrGluLysGluGlnGlnGlnLeuIleAspAspHisPheLeuPheAspLysProValSerProLeuLeuLeuAlaSerGlyMetAlaArgAspTrpProAspAlaArgGlyIleTrpHisAsnAspAsnLysSerPheLeuValTrpValAsnGluGluAspHisLeuArgValIleSerMetGluLysGlyGlyAsnMetLysGluValPheArgArgPheCysValGlyLeuGlnLysIleGluGluIlePheLysLysAlaGlyHisProPheMetTrpAsnGlnHisLeuGlyTyrValLeuThrCysProSerAsnLeuGlyThrGlyLeuArgGlyGlyValHisValLysLeuAlaHisLeuSerLysHisProLysPheGluGluIleLeuThrArgLeuArgLeuGlnLysArgGlyThrGlyGlyValAspThrAlaAlaValGlySerValPheAspValSerAsnAlaAspArgLeuGlySerSerGluValGluGlnValGlnLeuValValAspGlyValLysLeuMetValGluMetGluLysLysLeuGluLysGlyGlnSerIleAspAspMetIleProAlaGlnLys

SEQ ID NO:2具体如下：

ATGCCATTCGGCAATACCCACAACAAATTCAAACTGAACTATAAACCTGAAGAAGAATACCCGGACCTGTCCAAACATAACAACCACATGGCCAAAGTTCTGACCCTGGAACTGTATAAAAAACTGCGTGACAAAGAAACTCCGAGCGGTTTTACCGTAGATGACGTGATCCAGACCGGCGTTGATAATCCGGGTCACCCGTTCATCATGACCGTGGGCTGTGTTGCCGGCGATGAAGAATCCTACGAAGTTTTCAAAGAACTGTTCGACCCGATTATTTCTGACCGTCATGGTGGTTACAAACCTACCGATAAACACAAAACCGACCTGAACCACGAAAACCTGAAAGGTGGTGATGATCTGGATCCGAACTATGTGCTGTCCAGCCGTGTTCGTACCGGCCGTTCTATTAAGGGTTACACCCTGCCGCCGCACTGCTCTCGTGGTGAGCGCCGTGCGGTTGAAAAACTGAGCGTAGAAGCGCTGAACAGCCTGACCGGTGAATTTAAAGGCAAATATTACCCGCTGAAGTCTATGACCGAAAAGGAGCAACAACAGCTGATCGACGACCACTTCCTGTTCGACAAACCGGTTAGCCCACTGCTGCTGGCTTCCGGCATGGCCCGTGATTGGCCGGATGCACGTGGCATCTGGCACAACGACAACAAAAGCTTTCTGGTATGGGTGAACGAAGAAGATCATCTGCGTGTCATCTCCATGGAAAAAGGTGGTAACATGAAAGAGGTTTTCCGTCGTTTCTGCGTGGGTCTGCAAAAAATCGAGGAAATCTTTAAGAAAGCGGGCCATCCGTTTATGTGGAACCAGCATCTGGGTTACGTTCTGACTTGCCCGTCTAACCTGGGCACTGGTCTGCGTGGCGGTGTTCATGTGAAACTGGCGCATCTGAGCAAACACCCGAAGTTCGAGGAAATCCTGACGCGTCTGCGTCTGCAGAAACGCGGCACGGGCGGTGTTGACACGGCAGCTGTTGGCTCCGTCTTCGACGTTTCCAACGCAGACCGCCTGGGTTCCAGCGAGGTGGAACAGGTGCAGCTGGTCGTGGACGGTGTAAAACTGATGGTGGAAATGGAAAAAAAGCTGGAAAAAGGCCAGTCTATTGACGACATGATCCCGGCTCAGAAA

将合成好且验证正确的CK-MB表达质粒转化至E.coli BL21(DE3)表达感受态宿主细胞中，涂布到含有100ug/ml氨苄青霉素LB培养基平板，置于37℃培养箱中培养12hr以上。挑取阳性单克隆菌株加入到LB培养基(5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g氯化钠)中，恒温震荡摇床37℃培养过夜。按照1:100的比例将种子液接种至1L的LB培养基中，37℃恒温震荡摇床250rpm培养菌液吸光值OD₆₀₀至0.6-0.8范围内，将摇床温度设置成16℃，转速250rpm。加入终浓度为0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，表达时间为18-20hr(一般为表达过夜)。诱导表达结束后，将菌液进行离心(8000rpm，5min)，利用超声破碎方法对菌体破碎处理，12000rpm离心30min取上清，经His亲和层析柱，优选Cytiva的Ni Sepharose6Fast Flow。根据制造商的使用说明书进行纯化处理，优化了纯化过程中洗杂的方法，将洗杂的咪唑浓度改为40mM，可以提高CK-MB免疫原的得率。

纯化过程中使用的缓冲液：

平衡缓冲液：20mM Tris+500mM NaCl+5mM咪唑；

洗杂缓冲液：20mM Tris+500mM NaCl+40mM咪唑；

洗脱缓冲液：20mM Tris+500mM NaCl+500mM咪唑；

纯化后的CK-MB免疫原透析至50mM Tris+150mM NaCl+1mM DTT+1mM EDTA，pH＝8.0透析液中，样品与透析液的比例为1:50，透析3次，每次大于8hr。透析结束后，收集的CK-MB蛋白进行SDS-PAGE鉴定，结果如图1所示。

实施例2：CK-MB免疫小鼠及杂交瘤细胞筛选

选择6-8周龄的Balb/c雌鼠，将纯化后的CK-MB免疫原与弗氏完全佐剂按1:1比例在注射器内完全乳化，进行皮下免疫，每只小鼠的注射量为500ul乳化剂，50ug免疫原。之后每隔14天免疫一次，每只小鼠的CK-MB抗原用量为25ug，通过皮下和腹腔交替免疫；免疫第4次的第10天进行细胞融合实验。

在做细胞融合实验前把小鼠髓瘤细胞SP2/0用含10％胎牛血清的DMEM完全培养基进行扩大传代培养，融合前确保SP2/0处于增值期，通过显微镜观察确保无污染。

将免疫结束的Balb/c雌鼠处死，用75％的酒精浸泡5min，无菌操作取出脾脏，置于不锈钢网上碾磨成脾细胞悬浮液。将SP2/0细胞与脾细胞进行计数，按照细胞数量1:5比例混合，用BTX ECM2001细胞融合系统将SP2/0细胞与脾细胞进行电融合。融合后的细胞铺至96孔细胞板中，每孔200ul，铺板15块，置于CO₂培养箱中培养。融合细胞培养7天后更换成HAT选择性培养基，继续培养7-10天，在HAT选择性培养基中只有融合成功的细胞才能正常生长；取细胞上清进行酶联免疫(Elisa)检测，挑取阳性值最高的孔中的细胞进行后续单克隆细胞筛选，通过有限稀释法如此重复筛选3-5次，直至Elisa检测孔全为阳性时表明单克隆细胞筛选成功。得到6株抗CK-MB杂交瘤细胞株，经过双抗体夹心法进行验证，B4-3和H6-4两株细胞生产出的抗体具有很好的配对，检测时亲和力和特异性也较好。

实施例3：重组抗体表达纯化

(1)杂交瘤细胞测序

将B4-3和H6-4两株杂交瘤细胞株送到细胞测序公司，对细胞中的抗体基因进行测序，得到两株细胞中抗体轻链和重链的基因序列，经软件分析得到氨基酸序列，如：

B4-3轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:15；

B4-3重链氨基酸序列为SEQ ID NO:16；

H6-4轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:17；

H6-4重链氨基酸序列为SEQ ID NO:18。

SEQ ID NO:15具体如下：

AspIleValValThrGlnSerProAlaSerLeuAlaValSerLeuGlyGlnSerValThrIleSerCysArgThrSerGluSerValGluTyrTyrGlyThrSerLeuMetGlnTrpTyrGlnGlnLysProArgGlnProProLysLeuLeuIleAsnGlyAlaSerAsnValGluSerGlyValProAlaArgPheSerGlySerGlySerGlyThrGluPheSerLeuAsnIleHisProValGluGluAspAspIleAlaValTyrPheCysGlnGlnSerArgLysAlaProTrpThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuAspIleLysArgThrValAlaAlaProSerValPheIlePheProProSerAspGluGlnLeuLysSerGlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGluAlaLysValGlnTrpLysValAspAsnAlaLeuGlnSerGlyAsnSerGlnGluSerValThrGluGlnAspSerLysAspSerThrTyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLysHisLysValTyrAlaCysGluValThrHisGlnGlyLeuSerSerProValThrLysSerPheAsnArgGlyGluCys

SEQ ID NO:16具体如下：

GluValIleLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValLysProGlyGlySerLeuLysLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerPheAlaMetSerTrpValArgGlnThrProGluLysArgLeuGluTrpValAlaThrIleAsnArgGlyGlyTyrSerThrTyrTyrProAspSerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaArgAsnThrLeuTyrLeuGluMetSerSerLeuArgPheGluAspThrAlaMetTyrTyrCysAlaArgHisLeuGluTyrGlyAsnTyrValAspTyrGluLeuAspTyrTrpGlyGlnGlyThrSerValThrValSerSerAlaLysThrThrProProSerValTyrProLeuAlaProGlySerAlaAlaGlnThrAsnSerMetValThrLeuGlyCysLeuValLysGlyTyrPheProGluProValThrValThrTrpAsnSerGlySerLeuSerSerGlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerAspLeuTyrThrLeuSerSerSerValThrValProSerSerThrTrpProSerGluThrValThrCysAsnValAlaHisProAlaSerSerThrLysValAspLysLysIleValProArgAspCysGlyCysLysProCysIleCysThrValProGluValSerSerValPheIlePheProProLysProLysAspValLeuThrIleThrLeuThrProLysValThrCysValValValAspIleSerLysAspAspProGluValGlnPheSerTrpPheValAspAspValGluValHisThrAlaGlnThrGlnProArgGluGluGlnPheAsnSerThrPheArgSerValSerGluLeuProIleMetHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluPheLysCysArgValAsnSerAlaAlaPheProAlaProIleGluLysThrIleSerLysThrLysGlyArgProLysAlaProGlnValTyrThrIleProProProLysGluGlnMetAlaLysAspLysValSerLeuThrCysMetIleThrAspPhePheProGluAspIleThrValGluTrpGlnTrpAsnGlyGlnProAlaGluAsnTyrLysAsnThrGlnProIleMetAspThrAspGlySerTyrPheValTyrSerLysLeuAsnValGlnLysSerAsnTrpGluAlaGlyAsnThrPheThrCysSerValLeuHisGluGlyLeuHisAsnHisHisThrGluLysSerLeuSerHisSerProGlyLys

SEQ ID NO:17具体如下：

AspIleValLeuSerGlnSerProSerSerLeuAlaValSerThrGlyGluLysValThrMetSerCysLysSerSerGlnSerLeuPheAspSerArgThrArgLysAsnTyrLeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnSerProLysLeuLeuIleTyrTrpAlaSerThrArgGluSerGlyValProAspArgPheThrGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrValSerSerValGlnAlaGluAspLeuAlaIleTyrTyrCysLysGluSerTyrAsnLeuTyrThrPheGlyGlyGlyThrArgLeuGluIleLysArgAlaAspAlaAlaProThrValSerIlePheProProSerSerGluGlnLeuThrSerGlyGlyAlaSerValValCysPheLeuAsnAsnPheTyrProLysAspIleAsnValLysTrpLysIleAspGlySerGluArgGlnAsnGlyValLeuAsnSerTrpThrAspGlnAspSerLysAspSerThrTyrSerMetSerSerThrLeuThrLeuThrLysAspGluTyrGluArgHisAsnSerTyrThrCysGluAlaThrHisLysThrSerThrSerProIleValLysSerPheAsnArgAsnGluCys

SEQ ID NO:18具体如下：

GluMetLysLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValLysProGlyGlySerLeuLysLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerThrTyrAlaMetSerTrpValArgGlnThrProGluLysArgLeuGluTrpValAlaSerIleIleSerGlyGlyTyrThrTyrTyrProAspSerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaArgAsnIleLeuTyrLeuGlnMetSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaMetTyrPheCysAlaArgGlyValAspPheAspValTrpGlyAlaGlyThrSerValThrValSerSerAlaLysThrThrProProSerValTyrProLeuAlaProGlySerAlaAlaGlnThrAsnSerMetValThrLeuGlyCysLeuValLysGlyTyrPheProGluProValThrValThrTrpAsnSerGlySerLeuSerSerGlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerAspLeuTyrThrLeuSerSerSerValThrValProSerSerThrTrpProSerGluThrValThrCysAsnValAlaHisProAlaSerSerThrLysValAspLysLysIleValProArgAspCysGlyCysLysProCysIleCysThrValProGluValSerSerValPheIlePheProProLysProLysAspValLeuThrIleThrLeuThrProLysValThrCysValValValAspIleSerLysAspAspProGluValGlnPheSerTrpPheValAspAspValGluValHisThrAlaGlnThrGlnProArgGluGluGlnPheAsnSerThrPheArgSerValSerGluLeuProIleMetHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluPheLysCysArgValAsnSerAlaAlaPheProAlaProIleGluLysThrIleSerLysThrLysGlyArgProLysAlaProGlnValTyrThrIleProProProLysGluGlnMetAlaLysAspLysValSerLeuThrCysMetIleThrAspPhePheProGluAspIleThrValGluTrpGlnTrpAsnGlyGlnProAlaGluAsnTyrLysAsnThrGlnProIleMetAspThrAspGlySerTyrPheValTyrSerLysLeuAsnValGlnLysSerAsnTrpGluAlaGlyAsnThrPheThrCysSerValLeuHisGluGlyLeuHisAsnHisHisThrGluLysSerLeuSerHisSerProGlyLys

(2)重组抗体载体构建

B4-3和H6-4的重组抗体质粒构建以pcDNA3.1真核表达载体为基础，分别构建轻链和重链的表达质粒，基因两端分别带有NheI和XhoI酶切位点。由通用生物系统(安徽)有限公司对氨基酸序列分析及密码子优化，将B4-3和H6-4的轻链和重链基因合成并构建到pcDNA3.1真核表达载体中。基因合成并验证成功后将构建好的B4-3和H6-4抗体表达质粒转化到TOP10大肠杆菌中，进行扩大培养，按照去内毒素质粒抽提试剂盒说明书，抽取高浓度、高纯度的质粒，用于后续重组抗体表达。

(3)瞬转表达重组抗体

表达B4-3和H6-4重组抗体使用的哺乳动物细胞为HEK-293，培养基为KOP-293(珠海凯瑞生物)。HEK-293的培养条件为37℃、120rpm，待细胞密度培养至2×10⁶、活率＞95％时进行表达质粒转染；转染时轻链与重链质粒的质量比为3:2，每100ml细胞悬浮液中加入质粒总量为100ug、转染试剂TA-293的体积为500ul，将转染试剂加入到配比好的质粒中，混匀后室温静置10min，然后加入到HEK-293细胞悬液中，加入过程中摇动细胞悬液缓慢加入转染试剂和质粒混合液，置于37℃、120rpm培养摇床中继续培养。转染24hr每100ml细胞悬液中加入600μl细胞蛋白表达增强剂(KE-293，恺瑞生物)、2ml瞬时转染营养添加剂(KT-Feed 50×，恺瑞生物)，转染后第6天结束表达，细胞悬液进行离心(8000rpm，15min)，保留细胞上清用于抗体纯化。

(4)重组抗体纯化

重组抗体纯化使用的是AT ProteinADiamondPlus(博格隆)亲和层析填料，将收集后的细胞上清，上样到纯化柱中进行纯化。纯化后B4-3和H6-4重组抗体进行SDS-PAGE验证，结果如图2所示，两株抗体的重链分子量均在50KD左右，轻链分子量均在25KD左右。

实施例4：CK-MB免疫荧光层析试纸条检测

本发明以荧光微球作为标记介子，采用双抗体夹心法免疫技术，配套专用的读数仪，制备CK-MB荧光检测试纸条。建立校准曲线，实现对CK-MB的定量检测，该方法操作简单，具有很好的准确度和稳定性。

将荧光微球活化后加入CK-MB重组抗体(B4-3)进行标记反应，反应结束经过离心、封闭、超声后，重悬至保存缓冲液中，即得到CK-MB标记后的重组抗体免疫微球；标记后的荧光免疫微球按照适量浓度喷涂至聚酯膜上，加烘后使用。将T线上重组抗体(H6-4)与质控线C线的羊抗鼠多抗均匀的划至硝酸纤维素膜(NC)上，加烘后使用。在不干胶的试纸条底板上依次粘贴样品垫、荧光微球聚酯膜、NC膜及吸水纸，组装完后将大板切割成窄条，并装入的适配荧光读数仪的卡壳中，即可用于检测CK-MB相关样品。

CK-MB免疫荧光试纸条绘制校准曲线，使用的校准品浓度梯度为：0.25ng/ml、0.5ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/m l、18ng/ml、35ng/ml、60ng/ml、100ng/ml，将校准品加入到检测孔中，反应后使用荧光读数仪测定T线和C线荧光值，每个标准品的浓度检测5次，具体数值如表1所示。用校准品浓度和T/C值进行拟合曲线，R²＝0.9969，见图3。

表1CK-MB校准品检测

为验证CK-MB试剂盒定量检测的准确度和特异性，收集不同时间段的CK-MB临床血清样品，血清样本中的CK-MB浓度均经过Leadman试剂进行定量检测，共收集到60例CK-MB阳性临床血清标本，用本发明试剂盒与Leadman测定的CK-MB浓度进行对比，如表2。

表2CK-MB临床标本检测

根据表2结果，本发明对CK-MB检测与Leadman具有很好的一致性，说明本发明建立的免疫荧光层析法检测CK-MB蛋白的准确度良好。

以上所述的具体实施例对本发明作了详细说明，但本发明不限于实施例；本发明的CK-MB重组配对抗体实施例应用于免疫荧光层析检测，但并不限制于该方法。

Claims (10)

1.一对能与CK-MB特异性结合的抗体或抗原结合片段，包括：

抗体B4-3：

轻链可变区CDR1序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

轻链可变区CDR2序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

轻链可变区CDR3序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

重链可变区CDR1序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；

重链可变区CDR2序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；

重链可变区CDR3序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；

以及，

抗体H6-4：

轻链可变区CDR1序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；

轻链可变区CDR2序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；

轻链可变区CDR3序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；

重链可变区CDR1序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；

重链可变区CDR2序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；

重链可变区CDR3序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。

2.根据权利要求1所述的一对能与CK-MB特异性结合的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体B4-3和H6-4为单克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的一对能与CK-MB特异性结合的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体B4-3和H6-4为鼠源抗体。

4.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1-3任一项所述抗体或抗原结合片段。

5.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求4所述核酸。

6.一种细胞，其特征在于，所述细胞包括权利要求5所述载体。

7.权利要求1-3任一项所述抗体或抗原结合片段在制备肌酸激酶同工酶相关疾病的早期检测产品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肌酸激酶同工酶相关疾病为急性心肌梗死AMI疾病。

9.一种检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述抗体或抗原结合片段。

10.根据权利要求9所述的一种检测试剂盒，其特征在于，所述抗体B4-3作为标记抗体，所述抗体H6-4作为包被抗体。

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