CN116891529B - 一种肌酸激酶同工酶抗体及ckmb检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，提供了一种肌酸激酶同工酶抗体，所述抗体至少包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。本发明还提供了一种CKMB检测试剂盒，包括上述肌酸激酶同工酶抗体。本发明的优点在于：(1)本发明肌酸激酶同工酶抗体，能够有效阻断CKMM、CKMB蛋白中的CK‑M亚基的酶学活性，是目前市场上首家能够完全替代罗氏CKMM阻断抗体的产品；(2)本发明CKMB试剂盒操作简单、可自动化、灵敏度高、特异性好，检测结果准确可靠，与市场上现售的CKMB检测试剂盒有很好的临床相关性。

Description

一种肌酸激酶同工酶抗体及CKMB检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种肌酸激酶同工酶抗体及CKMB检测试剂盒。
背景技术
肌酸激酶同工酶(Creatine Kinase Isoenzyme，CK)是一类重要的酶，在维持细胞内能量代谢平衡方面发挥着重要作用。肌酸激酶同工酶是二聚体酶，其结构由肌型亚单位(M)和脑型亚单位(B)两个亚基组成，根据其亚基组成不同，可分为CKMM、CKMB、CKBB和线粒体CK(MtCK)四种同工酶形式。CKMM主要存在于骨骼肌和心肌中，CKMB主要存在于心肌中，CKBB存在于脑组织和神经元中，线粒体CK主要分布于心肌、平滑肌和神经组织等高能耗组织中的线粒体内。
CKMB由两种不同的亚基组成，即M亚基和B亚基。相对于其他肌酸激酶同工酶，CKMB中含有一定比例的M亚基，这使得它在心肌组织中具有特异性。CKMB主要存在于心肌细胞中，参与肌酸磷酸化为肌酸磷酸二酯的反应。在正常情况下，CKMB在心肌细胞中的含量较低，但当心肌组织受到损伤时，CKMB会释放到血液中，成为心肌损伤的重要指标。
CKMB在心肌梗死的诊断中有着重要的应用价值。由于CKMB主要存在于心肌细胞中，一旦心肌细胞受到损伤，CKMB会快速释放到血液中，导致其在血清中的浓度升高。因此，通过检测血液中CKMB的水平，可以迅速判断心肌是否受到损伤。CKMB的升高通常在心肌梗死发作后数小时内就会出现，因此可以用于早期诊断。在心肌梗死发作后的3～6小时内，CKMB的峰值通常出现，随后逐渐恢复到正常水平。
在其他情况下，如心肌炎或心肌肥大，CKMB的升高相对较少，因此可以通过CKMB和其他心肌损伤指标的综合分析来明确诊断。另外CKMB的浓度变化可以用于监测心肌梗死患者的疗效。治疗有效时，CKMB的浓度会逐渐下降；反之，如果治疗无效或心肌损伤继续恶化，CKMB的浓度可能继续升高。
目前临床上针对血清中CKMB水平检测的试剂盒，有免疫抑制法、胶乳增强免疫比浊法、荧光层析法、免疫发光法等。其中免疫抑制法由于其检测灵敏度高、检测费用低的优点在临床上为主要的CKMB检测方法。免疫抑制法试剂盒中的主要抗体原料为罗氏CKMM阻断抗体，目前世界上还没有其他可替代抗体能够替换罗氏CKMM阻断抗体。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种新型肌酸激酶同工酶抗体以及基于该抗体制备的CKMB检测试剂盒，本发明抗体能够完全替代现有的罗氏CKMM阻断抗体，实现抗体原料的国产化，并且该抗体制备的CKMB试剂盒灵敏度高、特异性好，可实现临床上CKMB的定量、准确检测。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种肌酸激酶同工酶抗体，所述抗体至少包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
作为本发明的优选方式之一，所述抗体具体为抗体I、抗体II、抗体III中的一种或多种；
所述抗体I包括轻链和重链；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，重链氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示(含上述SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3)；
所述抗体II为只含所述重链的抗体；
所述抗体III为只含重链可变区VH的纳米抗体，或融合有蛋白标签的纳米抗体；所述重链可变区VH为所述重链的一部分，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示(含上述SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.3)。
作为本发明的优选方式之一，所述抗体I中：轻链包括轻链可变区VL和轻链恒定区CL；其中，轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链恒定区CL的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
作为本发明的优选方式之一，所述轻链可变区VL包括LCDR1、LCDR2、LCDR3三个可变区，氨基酸序列分别为SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.11所示。
作为本发明的优选方式之一，所述抗体I和抗体II中：重链包括重链可变区VH和重链恒定区CH；其中，所述重链可变区VH与抗体III的重链可变区VH相同，氨基酸序列如SEQID NO.6所示；重链恒定区CH的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
作为本发明的优选方式之一，所述重链可变区VH包括HCDR1、HCDR2、HCDR3三个可变区，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示。
作为本发明的优选方式之一，所述重链恒定区CH的亚型，为人源IgG、IgM、IgE、鼠源IgG、兔源IgG、羊IgG中的一种，人源IgG1为最优。
作为本发明的优选方式之一，所述抗体III中：与纳米抗体融合的蛋白标签可以为任一蛋白标签中的一种，例如Fc、GST、HIS、Flag、Myc、HA、SUMO等，Fc为最优。
作为本发明的优选方式之一，所述抗体能够结合CKMM、CKMB蛋白，并阻断M亚基的酶学活性。
一种CKMB检测试剂盒，包括上述肌酸激酶同工酶抗体。
作为本发明的优选方式之一，所述CKMB检测试剂盒具体包括试剂R1和试剂R2；
所述试剂R1包括：10～60ug/mL肌酸激酶同工酶抗体，1～3g/L醋酸镁，1～10g/L咪唑，1～5g/L葡萄糖，0.1～2g/L硫代硫酸钠，0.2～2g/L乙二胺四乙酸二钠，0.5～3g/L二磷酸腺苷，1～3g/L一磷酸腺苷，1～5g/L N-乙酰半胱氨酸，1～6g/L氧化型辅酶I，1～60mg/L二腺苷五磷酸，1～20ku/L己糖激酶，1～20ku/L葡萄糖6磷酸脱氢酶，0.1～1g/L防腐剂YK300；
所述试剂R2包括：1～8g/L CAPSO缓冲液，0.1～1g/L氢氧化钠，1～5g/L葡萄糖，20～80g/L肌酸磷酸，0.1～1g/L防腐剂YK300。
作为本发明的优选方式之一，还包括校准品。
作为本发明的优选方式之一，所述校准品包括：0.1～1g/L叠氮钠，0.5～20g/L牛血清白蛋白，30～200U/L肌酸激酶同工酶CKMB，1～5g/L pH值为7.5的Tris-Hcl缓冲液，5～50g/L甘油。其中，肌酸激酶同工酶CKMB可直接选择市售产品，例如，安徽千诚生物技术有限公司生产的“重组人CKMB抗原”，来源于HEK293细胞，人，纯度≥95％，货号：AG00801；也可采用现有市场的其他体外真核系统或原核系统表达并纯化的重组人CKMB蛋白。
作为本发明的优选方式之一，本发明试剂盒可在半自动、全自动生化分析仪上用于定量检测人体血液中肌酸激酶同工酶CKMB活性，其中血液包括全血、血清及血浆。
本发明方法学原理：利用本发明肌酸激酶同工酶抗体，令CKMM的酶活全阻断，CKMB的只阻断M亚基的酶活，保留B亚基的酶活，接着将测出来的酶活乘以2，即得目标CKMB酶活。
本发明检测原理：如图1所示。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明肌酸激酶同工酶抗体，能够有效阻断CKMM、CKMB蛋白中的CK-M亚基的酶学活性，是目前市场上首家能够完全替代罗氏CKMM阻断抗体的产品；
(2)本发明CKMB试剂盒操作简单、可自动化、灵敏度高、特异性好，检测结果准确可靠，与市场上现售的CKMB检测试剂盒有很好的临床相关性。
附图说明
图1是本发明检测原理图；
图2是试验例3中本发明检测试剂盒的线性范围相关性图；
图3是试验例3中本发明检测试剂盒和现售市场上使用罗氏抗体制备的试剂盒临床相关性比对图。
关于本发明涉及的SEQ ID NO.1～12详见序列表，需要说明的是，序列表记载的具体序列中，氨基酸“X”表示氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y中的任意一种。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例中的所使用的试剂产品及实验方法，未经特别说明的，均为本领域常规试剂或方法，不再赘述。
实施例1
本实施例的一种肌酸激酶同工酶抗体I，由轻链和重链构成，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，重链氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
具体地，轻链包括轻链可变区VL和轻链恒定区CL，轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链恒定区CL的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。其中，轻链可变区VL包括LCDR1、LCDR2、LCDR3三个可变区，氨基酸序列分别为SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.11所示。
具体地，重链包括重链可变区VH和重链恒定区CH，重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，重链恒定区CH的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。其中，重链可变区VH包括HCDR1、HCDR2、HCDR3三个可变区，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示；重链恒定区CH的亚型，选择人源IgG1。
此外，需要注意的是：本实施例重链可变区VH的HCDR1的SEQ ID NO.1序列中，“X”具体表示氨基酸“A”；HCDR3的SEQ ID NO.3序列中，5’端开始出现第一个“X”表示氨基酸“G”，第二个“X”表示氨基酸“S”。
基于彼此的包含关系，本实施例重链序列(SEQ ID NO.5)及重链可变区VH序列(SEQ ID NO.6)中的“X”也做相适应性选择。
实施例2
本实施例的一种肌酸激酶同工酶抗体II，由重链构成，重链序列如SEQ ID NO.5所示。
具体地，重链包括重链可变区VH和重链恒定区CH，重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，重链恒定区CH的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。重链可变区VH包括HCDR1、HCDR2、HCDR3三个可变区，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示；重链恒定区CH的亚型，选择人源IgG1。
本实施例中，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6序列中“X”的具体选择与实施例1相同。
实施例3
本实施例的一种肌酸激酶同工酶抗体III，为只含重链可变区VH的纳米抗体，重链可变区VH为上述实施例1中重链的一部分，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
具体地，重链可变区VH包括HCDR1、HCDR2、HCDR3三个可变区，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示。
本实施例中，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6序列中“X”的具体选择与实施例1相同。
实施例4
本实施例的一种肌酸激酶同工酶抗体III’，与实施例3基本相同，主要不同之处在于：纳米抗体上还融合有Fc蛋白标签。
实施例5
本实施例的一种上述实施例1、2、3中肌酸激酶同工酶抗体I、II、III的获得：
(1)CHO-K1-I/II/III稳定细胞株的构建
细胞复苏：取一支液氮冻存CHO细胞(约1x10E7细胞)，37℃水浴快速融化，300g，离心5min。用酒精棉擦拭冻存管后置于超净工作台，吸出上清，用20mL预温的CHO完全培养基重悬，并置于125mL摇瓶培养，37℃培养温度，5％CO2，120～130rpm转速。
质粒抽提：提前接种“含肌酸激酶同工酶抗体I/II/III稳转载体的DH5a菌株”(生物公司基因合成，肌酸激酶同工酶抗体I/II/III的氨基酸序列如实施例1、2或3所述)，并于37℃培养过夜，用商业化质粒抽提试剂盒抽提pXC17.4-I/II/III稳转质粒。
细胞转染：细胞活率大于95％、无明显细胞聚团、密度在2到3x 10E6时，取4x 10E7CHO细胞，300g、离心5min。去除上清，用Celetrix商业化电转液400uL重悬CHO细胞。pXC17.4-I/II/III稳转质粒使用25ug，分别消耗CHO细胞2x10E7。用Celetrix细胞电转仪1250V电压下进行电转。
细胞恢复及加压：转染后的细胞用CHO完全培养基重悬，并在37℃、5％ CO2培养箱中静置恢复24h。恢复后的细胞300g、离心5min。去除培养基后，加入CHO培养基，并添加25uMMSX，细胞密度为1x10E6。37℃、5％ CO2培养箱中静置8～10天，至细胞活率大于30％。
单克隆筛选：将细胞活率大于30％的细胞池用“康晟商业化单克隆培养基”稀释至2.5cell/mL，200uL/孔铺96孔板，共30块板。37℃、5％ CO2培养箱中静置培养至单克隆长满孔。将表达量高的单克隆转移至摇瓶扩大培养，将最终确定的单克隆构建CHO-K1工作细胞库(其内为CHO-K1-I/II/III工作细胞株)，并冻存于液氮罐中，用于后续抗体的表达。
(2)CHO-K1悬浮表达系统表达肌酸激酶同工酶抗体I/II/III
细胞复苏：从液氮罐中取出步骤(1)构建的CHO-K1-I/II/III工作细胞株，37℃水浴快速解冻后，用CHO细胞培养基重悬细胞，并放入细胞培养摇床中培养复苏48h。
细胞转接及流加培养：细胞恢复后，将细胞转接至发酵培养基中，密度0.5x10E6。培养至Day5，开始流加补料，到Day7降温培养。
上清收取：培养至Day15或细胞活率低于60％，将培养上清离心，去除细胞沉淀，保留上清。
(3)纯化肌酸激酶同工酶抗体I/II/III
①肌酸激酶同工酶抗体I/II的纯化：
亲和柱装填：计算所需商品化的Protein A填料，并将填料进行装柱，将装柱的填料用PBS平衡缓冲液进行清洗。
上样及清洗：将离心收集的细胞上清低流速上样，上样结束后用平衡缓冲液清洗10个柱体积，用pH5.0的预洗脱液A清洗10个柱体积。
洗脱与中和：将预洗脱液清洗后的填料，用pH3.2的柠檬酸洗脱液进行洗脱，洗脱后的蛋白用2M的Tris缓冲液进行中和，将中和后的抗体溶液测定蛋白浓度后透析换液至PBS中并分装保存。
②肌酸激酶同工酶抗体III的纯化：
阳离子柱装填：计算所需商品化的阳离子填料，并将填料进行装柱，将装柱的填料用20mM Tris PH 7.0平衡缓冲液进行清洗。
上样及清洗1：将离心收集的细胞上清低流速上样，上样结束后用平衡缓冲液清洗10个柱体积，用20mM Tris PH7.0 50mM NaCl的清洗液A清洗10个柱体积，用20mM TrisPH7.0 80mM NaCl的清洗液B清洗10个柱体积。
洗脱1：将清洗液清洗后的填料，用20mM Tris PH7.0 150mM NaCl的洗脱液进行洗脱，将洗脱后抗体溶液透析换液至20mM Tris PH8.5 20mM NaCl中。
阴离子柱装填：计算所需商品化的阴离子填料，并将填料进行装柱，将装柱的填料用20mM Tris PH8.5 20mM NaCl平衡缓冲液进行清洗。
上样及清洗2：洗脱1洗脱的抗体溶液低流速上样，上样结束后用平衡缓冲液清洗10个柱体积，用20mM Tris PH8.5 50mM NaCl的清洗液C清洗10个柱体积。
洗脱2：将清洗液清洗后的填料，用20mM Tris PH8.5 100mM NaCl的洗脱液进行洗脱，将洗脱后抗体溶液透析换液至PBS中并分装保存。
实施例6
本实施例的一种上述实施例4中肌酸激酶同工酶抗体III’的获得：
(1)CHO-K1-III’稳定细胞株的构建
细胞复苏：取一支液氮冻存CHO细胞(约1x10E7细胞)，37℃水浴快速融化，300g，离心5min。用酒精棉擦拭冻存管后置于超净工作台，吸出上清，用20mL预温的CHO完全培养基重悬，并置于125mL摇瓶培养，37℃培养温度，5％CO2，120～130rpm转速。
质粒抽提：提前接种“含肌酸激酶同工酶抗体III’稳转载体的DH5a菌株”(生物公司基因合成，肌酸激酶同工酶抗体III’的氨基酸序列如实施例4所述)，并于37℃培养过夜，用商业化质粒抽提试剂盒抽提pXC17.4-III’稳转质粒。
细胞转染：细胞活率大于95％、无明显细胞聚团、密度在2到3x 10E6时，取4x 10E7CHO细胞，300g、离心5min。去除上清，用Celetrix商业化电转液400uL重悬CHO细胞。pXC17.4-III’稳转质粒使用25ug，分别消耗CHO细胞2x10E7。用Celetrix细胞电转仪1250V电压下进行电转。
细胞恢复及加压：转染后的细胞用CHO完全培养基重悬，并在37℃、5％ CO2培养箱中静置恢复24h。恢复后的细胞300g、离心5min。去除培养基后，加入CHO培养基，并添加25uMMSX，细胞密度为1x10E6。37℃、5％ CO2培养箱中静置8～10天，至细胞活率大于30％。
单克隆筛选：将细胞活率大于30％的细胞池用“康晟商业化单克隆培养基”稀释至2.5cell/mL，200uL/孔铺96孔板，共30块板。37℃、5％ CO2培养箱中静置培养至单克隆长满孔。将表达量高的单克隆转移至摇瓶扩大培养，将最终确定的单克隆构建CHO-K1工作细胞库(其内为CHO-K1-III’工作细胞株)，并冻存于液氮罐中，用于后续抗体的表达。
(2)CHO-K1悬浮表达系统表达肌酸激酶同工酶抗体III’
细胞复苏：从液氮罐中取出步骤(1)构建的CHO-K1-III’工作细胞株，37℃水浴快速解冻后，用CHO细胞培养基重悬细胞，并放入细胞培养摇床中培养复苏48h。
细胞转接及流加培养：细胞恢复后，将细胞转接至发酵培养基中，密度0.5x10E6。培养至Day5，开始流加补料，到Day7降温培养。
上清收取：培养至Day15或细胞活率低于60％，将培养上清离心，去除细胞沉淀，保留上清。
(3)亲和纯化肌酸激酶同工酶抗体III’
亲和柱装填：计算所需商品化的Protein A填料，并将填料进行装柱，将装柱的填料用PBS平衡缓冲液进行清洗。
上样及清洗：将离心收集的细胞上清低流速上样，上样结束后用平衡缓冲液清洗10个柱体积，用pH5.0的预洗脱液A清洗10个柱体积。
洗脱与中和：将预洗脱液清洗后的填料，用pH3.2的柠檬酸洗脱液进行洗脱，洗脱后的蛋白用2M的Tris缓冲液进行中和，将中和后的抗体溶液测定蛋白浓度后透析换液至PBS中并分装保存。
实施例7
本实施例的一种CKMB检测试剂盒具体包括试剂R1、试剂R2和校准品。
试剂R1包括：10ug/mL肌酸激酶同工酶抗体(上述实施例制得)，1g/L醋酸镁，1g/L咪唑，2g/L葡萄糖，0.1g/L硫代硫酸钠，0.2g/L乙二胺四乙酸二钠，0.5g/L二磷酸腺苷，1g/L一磷酸腺苷，1g/L N-乙酰半胱氨酸，1g/L氧化型辅酶I，1mg/L二腺苷五磷酸，1ku/L己糖激酶，1ku/L葡萄糖6磷酸脱氢酶，0.1g/L防腐剂YK300。
试剂R2包括：1g/L CAPSO缓冲液，0.1g/L氢氧化钠，1g/L葡萄糖，20g/L肌酸磷酸，0.1g/L防腐剂YK300。
校准品包括：0.1g/L叠氮钠，0.5g/L牛血清白蛋白，30U/L肌酸激酶同工酶CKMB，1g/L pH值为7.5的Tris-Hcl缓冲液，5g/L甘油。其中，肌酸激酶同工酶CKMB选择市售安徽千诚生物技术有限公司生产的“重组人CKMB抗原”，来源于HEK293细胞，人，纯度≥95％，货号：AG00801。
制备方法：
(1)配制试剂R1：
按照试剂R1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1；
(2)配制试剂R2：
按照试剂R2的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R2；
(3)配制校准品：
按照校准品的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂校准品。
实施例8
本实施例的一种CKMB检测试剂盒具体包括试剂R1、试剂R2和校准品。
试剂R1包括：20ug/mL肌酸激酶同工酶抗体(上述实施例制得)，3g/L醋酸镁，8g/L咪唑，1g/L葡萄糖，0.2g/L硫代硫酸钠，0.79g/L乙二胺四乙酸二钠，1.3g/L二磷酸腺苷，3g/L一磷酸腺苷，5g/L N-乙酰半胱氨酸，2.5g/L氧化型辅酶I，13mg/L二腺苷五磷酸，3ku/L己糖激酶，3ku/L葡萄糖6磷酸脱氢酶，0.5g/L防腐剂YK300。
试剂R2包括：5g/L CAPSO缓冲液，0.8g/L氢氧化钠，5g/L葡萄糖，50g/L肌酸磷酸，0.5g/L防腐剂YK300。
校准品包括：0.5g/L叠氮钠，15g/L牛血清白蛋白，114U/L肌酸激酶同工酶CKMB，5g/L pH值为7.5的Tris-Hcl缓冲液，50g/L甘油。其中，肌酸激酶同工酶CKMB选择市售安徽千诚生物技术有限公司生产的“重组人CKMB抗原”，来源于HEK293细胞，人，纯度≥95％，货号：AG00801。
制备方法：
(1)配制试剂R1：
按照试剂R1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1；
(2)配制试剂R2：
按照试剂R2的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R2；
(3)配制校准品：
按照校准品的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂校准品。
实施例9
本实施例的一种CKMB检测试剂盒具体包括试剂R1、试剂R2和校准品。
试剂R1包括：60ug/mL肌酸激酶同工酶抗体(上述实施例制得)，2g/L醋酸镁，10g/L咪唑，5g/L葡萄糖，2g/L硫代硫酸钠，2g/L乙二胺四乙酸二钠，3g/L二磷酸腺苷，2g/L一磷酸腺苷，3g/L N-乙酰半胱氨酸，6g/L氧化型辅酶I，60mg/L二腺苷五磷酸，20ku/L己糖激酶，20ku/L葡萄糖6磷酸脱氢酶，1g/L防腐剂YK300。
试剂R2包括：8g/L CAPSO缓冲液，1g/L氢氧化钠，3g/L葡萄糖，80g/L肌酸磷酸，1g/L防腐剂YK300。
校准品包括：1g/L叠氮钠，20g/L牛血清白蛋白，200U/L肌酸激酶同工酶CKMB，3g/LpH值为7.5的Tris-Hcl缓冲液，35g/L甘油。中，肌酸激酶同工酶CKMB选择市售安徽千诚生物技术有限公司生产的“重组人CKMB抗原”，来源于HEK293细胞，人，纯度≥95％，货号：AG00801。
制备方法：
(1)配制试剂R1：
按照试剂R1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1；
(2)配制试剂R2：
按照试剂R2的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R2；
(3)配制校准品：
按照校准品的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂校准品。
试验例1
本试验例用于初步测试本发明肌酸激酶同工酶抗体I、II、III、III’对CKMM、CKMB、CKBB蛋白的酶学活性抑制效果。
利用分别添加有肌酸激酶同工酶抗体I、II、III、III’的“本发明CKMB检测试剂盒”和“对照试剂盒1”(不添加任何肌酸激酶同工酶抗体)、对照试剂盒2”(添加罗氏CKMM阻断抗体)对样本5000U/L-CKMM、样本5000U/L-CKMB、样本5000U/L-CKBB进行检测。其中，“本发明CKMB检测试剂盒”组成及制备参照实施例8；“对照试剂盒1”对应选择不添加肌酸激酶同工酶抗体、但其他成分与实施例8一致的试剂盒(可检测样本里的总CK)；“对照试剂盒2”选择用罗氏CKMM阻断抗体替代肌酸激酶同工酶抗体、但其他成分与实施例8一致的试剂盒。
检测仪器：全自动生化仪AU680。
检测方法为：测定主波长340nm，副波长405nm；先加入R1试剂200uL，37℃孵育30s；加入样本10uL，37℃反应60s；加入R2试剂50uL，37℃反应60s；反应类型速率法，反应5min，测定时间3min。具体参数见表1。
检测结果见表2。
表1、生化分析仪检测方法
校准方式 线性 反应方向 上升
主波长 340nm 副波长 405nm
反应类型 速率法 样本 10uL
反应温度 37℃ 试剂R1 200uL
校准方法： 2点定标 试剂R2 50uL
反应时间 5min R1:R2 4:1
延迟时间 2min 测定时间 3min
表2、抗体I、II、III、III’对应试剂盒对CKMM、CKMB、CKBB的检测结果
由表2可知：本发明本发明肌酸激酶同工酶抗体I、II、III、III’都能够对CKMM酶学活性有很好的抑制效果，表现出的性能与对照抗体相当。
试验例2
本试验例用于进一步测试本发明肌酸激酶同工酶抗体对不同浓度CKMM、CKMB、CKBB蛋白的酶学活性抑制情况。
分别利用“本发明CKMB检测试剂盒”(添加有本发明肌酸激酶同工酶抗体)和“对照试剂盒1”(不添加任何肌酸激酶同工酶抗体)、对照试剂盒2”(添加罗氏CKMM阻断抗体)对样本5000U/L-CKMM、2500U/L-CKMM、1250U/L-CKMM、625U/L-CKMM、312.5U/L-CKMM、样本5000U/L-CKMB、2500U/L-CKMB、1250U/L-CKMB、625U/L-CKMB、312.5U/L-CKMB、样本5000U/L-CKBB、2500U/L-CKBB、1250U/L-CKBB、625U/L-CKBB、312.5U/L-CKBB进行检测。其中，“本发明CKMB检测试剂盒”选择实施例8制备的试剂盒(抗体以实施例4肌酸激酶同工酶抗体III’为例)；“对照试剂盒1”对应选择不添加肌酸激酶同工酶抗体III’、但其他成分与实施例8一致的试剂盒(可检测样本里的总CK)；“对照试剂盒2”选择用罗氏CKMM阻断抗体替代肌酸激酶同工酶抗体III’、但其他成分与实施例8一致的试剂盒。
检测仪器：全自动生化仪AU680。
检测方法为：测定主波长340nm，副波长405nm；先加入R1试剂200uL，37℃孵育30s；加入样本10uL，37℃反应60s；加入R2试剂50uL，37℃反应60s；反应类型速率法，反应5min，测定时间3min。具体参数见表1。
检测结果见表3。
表3、本发明及对照试剂对CKMM、CKMB、CKBB的检测结果
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由表3可知：本发明肌酸激酶同工酶抗体，能够对酶活5000U/L以内的CKMM的抑制率在99.8％以上，能够对酶活5000U/L以内的CKMB的抑制率在50％左右，和罗氏CKMM抗体有着相当的抑制活性。
试验例3
本试验例用于测试本发明CKMB检测试剂盒(以实施例8试剂盒组成为例，肌酸激酶同工酶抗体采用实施例4抗体)的整体性能。
一、生化分析仪检测方法：
以贝克曼AU680生化分析仪为例：测定主波长340nm，副波长405nm；先加入R1试剂200uL，37℃孵育30s；加入样本10uL，37℃反应60s；加入R2试剂50uL，37℃反应60s；反应类型速率法，反应5min，测定时间3min。具体参数见上述表1。
试验结果计算公式：CKMB(U/L)＝ΔA/min×K；其中，ΔA/min：每分钟平均吸光度的变化；ε：毫摩尔消光系数＝6.3mmolL/L.cm；TV：总反应体积(μl)；SV：样本体积(μl)；L：比色杯光径(cm)。
取待测血清或血浆样本，同法测定样本的吸光度变化值，代入公式，即可算出待测样本中肌酸激酶同工酶CKMB的酶活。如果样本中的肌酸激酶同工酶CKMB酶活超出检测线性范围，需要对待测样本进行稀释后再检测，从而确保检测结果的准确性。
二、灵敏度检测：
5％牛血清白蛋白溶液为空白样本，按照上述生化分析仪检测方法反复测定20次以上，以空白均值加上两倍标准差作为最低检测限，结果显示本发明试剂盒的最低检测限为0.2U/L。
三、线性范围检测：
用接近酶活1500U/L的高值样本，用生理盐水按照1/1，1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64，1/128，1/256稀释，共配制成9个梯度稀释浓度的样本溶液，用所述生化分析仪检测方法测定每个稀释的样本浓度。每个浓度重复测定3次，分别求出测定结果的平均值。
以稀释浓度为自变量，以测定结果平均值为因变量求出线性回归方程，按照相应公式计算线性回归相关系数r。检测结果见表4，证明线性性能达到1500U/L，相关方程为y＝1.0157x-1.0136，相关系数R2＝0.9999，见图2。
表4、本发明试剂盒线性范围检测
稀释比例 理论浓度(U/L) 检测浓度(U/L) 回收率(％)
1/256 5.9 6 102.4
1/128 11.7 12 102.4
1/64 23.4 23 98.1
1/32 46.9 48 102.4
1/16 93.8 96 102.4
1/8 187.5 185 98.7
1/4 375.0 377 100.5
1/2 750.0 762 101.6
1/1 1500.0 1523 101.5
四、重复性和精密度：
肌酸激酶同工酶CKMB的活性为25U/L与114U/L的校准品作为样本，按所述生化分析仪检测方法进行测定，各浓度分别重复测定10次，分别计算测定均值和标准差，结果见表5。
表5、本发明CKMB试剂盒的重复性和精密度检测
由表5可知：本发明CKMB试剂盒的重复性及准确性都能达到临床应用的要求。
五、批间差：
按照本发明实施例8试剂配方及方法制备三批试剂盒，用三批试剂盒按所述生化分析仪检测方法对同一份血清样本进行重复测定，每个批次重复测定三次，分别计算每批3次测定的均值，结果见表6。
表6、本发明CKMB试剂盒的批间差检测
由表6可知：三个批次的CKMB试剂盒的批间差较小相对偏差小于5％。
六、临床样本检测
取211例临床血清，分别用本发明CKMB检测试剂盒、大千生物商品化CKMB检测试剂盒(产品号：70-3040，使用抗体为罗氏抗体)，按照所述生化分析仪检测方法对临床样本进行相关性检测，检测结果见图3。
由图3可知：本发明试剂盒能够检测出血液中的CKMB含量，并且和市场商品化CKMB检测试剂盒有R2>0.98的临床相关性。
综上可知，本发明肌酸激酶同工酶抗体，能够有效阻断CKMM、CKMB蛋白中的CK-M亚基的酶学活性，是目前市场上首家能够完全替代罗氏CKMM阻断抗体的产品；同时，本发明CKMB试剂盒操作简单、可自动化、灵敏度高、特异性好，检测结果准确可靠，与市场上现售的CKMB检测试剂盒有很好的临床相关性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种肌酸激酶同工酶抗体，其特征在于，所述抗体具体为抗体I、抗体II、抗体III中的一种或多种；
所述抗体I包括轻链和重链；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，重链氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述抗体II为只含所述重链的抗体；
所述抗体III为只含重链可变区VH的纳米抗体，或融合有蛋白标签的纳米抗体；所述重链可变区VH为所述重链的一部分，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
同时，所述抗体I和抗体II中：重链包括重链可变区VH和重链恒定区CH；所述重链可变区VH与抗体III的重链可变区VH相同，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；并且，所述重链可变区VH包括HCDR1、HCDR2、HCDR3三个可变区，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示；所述重链恒定区CH的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；此外，所述重链可变区VH的HCDR1的SEQ ID NO.1序列中，“X”具体表示氨基酸“A”；HCDR3的SEQ ID NO.3序列中，5’端开始出现第一个“X”表示氨基酸“G”，第二个“X”表示氨基酸“S”；所述重链序列SEQ ID NO.5及重链可变区VH序列SEQ ID NO.6中的“X”也做相适应性选择；
所述抗体能够结合CKMM、CKMB蛋白，并阻断M亚基的酶学活性。
2.根据权利要求1所述的肌酸激酶同工酶抗体，其特征在于，所述抗体I中：轻链包括轻链可变区VL和轻链恒定区CL；其中，轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链恒定区CL的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.根据权利要求2所述的肌酸激酶同工酶抗体，其特征在于，所述轻链可变区VL包括LCDR1、LCDR2、LCDR3三个可变区，氨基酸序列分别为SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.11所示。
4.根据权利要求1所述的肌酸激酶同工酶抗体，其特征在于，所述重链恒定区CH的亚型，为人源IgG、IgM、IgE、鼠源IgG、兔源IgG、羊IgG中的一种。
5.一种CKMB检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～4任一所述的肌酸激酶同工酶抗体。
6.根据权利要求5所述的CKMB检测试剂盒，其特征在于，所述CKMB检测试剂盒具体包括试剂R1和试剂R2；
所述试剂R1包括：10～60μg/mL肌酸激酶同工酶抗体，1～3g/L醋酸镁，1～10g/L咪唑，1～5g/L葡萄糖，0.1～2g/L硫代硫酸钠，0.2～2g/L乙二胺四乙酸二钠，0.5～3g/L二磷酸腺苷，1～3g/L一磷酸腺苷，1～5g/L N-乙酰半胱氨酸，1～6g/L氧化型辅酶I，1～60mg/L二腺苷五磷酸，1～20ku/L己糖激酶，1～20ku/L葡萄糖6磷酸脱氢酶，0.1～1g/L防腐剂YK300；
所述试剂R2包括：1～8g/L CAPSO缓冲液，0.1～1g/L氢氧化钠，1～5g/L葡萄糖，20～80g/L肌酸磷酸，0.1～1g/L防腐剂YK300。
7.根据权利要求6所述的CKMB检测试剂盒，其特征在于，还包括校准品；所述校准品包括：0.1～1g/L叠氮钠，0.5～20g/L牛血清白蛋白，30～200U/L肌酸激酶同工酶CKMB，1～5g/L pH值为7.5的Tris-Hcl缓冲液，5～50g/L甘油。
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