JP2002272496A - 生物学的サンプルの高特異性ホモシステインアッセイ - Google Patents

生物学的サンプルの高特異性ホモシステインアッセイ

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 尿、全血および血漿などの生物学的流体サン
プル中のホモシステイン濃度を、サンプル中に通常存在
するシステインによる妨害なしに測定する方法の提供。 【解決手段】 配列番号１０のアミノ酸配列を有するホ
モシステイナーゼまたはその変異体を生物学的流体のサ
ンプルと接触させて生成する硫化水素を測定することに
よりシステインによる妨害を減少させてホモシステイン
濃度を測定する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、例えば尿、全血及
び血漿のような生物学的流体中のホモシステインのアッ
セイに関する。特に本発明は1種以上のホモシステイナ
ーゼ酵素を含む酵素調製物の使用及びこれらの酵素を含
む診断キットに関する。本発明の好ましい実施において
は、ホモシステイン濃度は、それから生成される硫化水
素の測定によって決定される。
【０００２】
【従来の技術】K.S. McCullyら(American Journal of P
athology, 56, pp.111-128, 1969)は、血漿ホモシステ
インレベルの心臓血管疾患のリスクとの関連を最初に報
告した。McCulleyらは、高い血漿ホモシステイン濃度と
動脈硬化性疾患との間の相関を発見した。より最近の研
究によれば、それほど高くはない血漿ホモシステインレ
ベルでも虚血性心疾患、脳血管障害及び末梢血管障害の
有意に増加したリスクを示すものであると判断されてい
る。例えばJ. Selhubら、New England Journal of Medi
cine, 32, pp. 286-291, 1995及びS. Kangら、Annual R
eview of Nutrition, 12. pp.279-298, 1992を参照。
【０００３】心臓血管疾患のリスクを調べることに関し
て、高いホモシステインレベルが高いコレステロールレ
ベルよりも良好な予測指標であり得るという実質的な証
拠が存在する。例えば、ある研究においては、12%だけ
正常の上限より高い血漿ホモシステイン濃度が心筋梗塞
の3.4倍高いリスクと関連付けられている(M. Stampfer
ら、Journal of the American Medical Association, 2
68, pp. 877-881, 1992)。心臓血管疾患と診断される前
に血液が採取された別のケーススタディにおいて、271
名の群(後に心筋梗塞に罹患した)はその後に心筋梗塞に
罹患しなかった対照患者と比較して有意に高いホモシス
テインのレベルを示した(P. Uelandら、Cardiovascular
Disease, Hemostasis and Endothelial Function, 199
2, pp.183-236, Marcel Dekker, New Yorkを参照)。
【０００４】O. Nygardら, New England Journal of Me
dicine, 337(4). pp.230-236 (1997)は、総血漿ホモシ
ステインが冠状動脈疾患と確定診断された患者における
死亡率の強力な予測指標であることを報告している。
【０００５】ホモシステインが心臓血管疾患プロセスに
関与する分子メカニズムの詳細な理解はまだ得られてい
ない。例えば、酸素フリーラジカルの過剰生成、エラス
ターゼ活性化及び石灰沈着(すなわちプラーク形成)を生
じる作用にホモシステインが関与していることが示唆さ
れている。現在の理論の概観のためには、K. McCully,
Nature Medicine, 2(4), pp.386-389(1996)及びK.S. Mc
Cully, Annals of Clinical and Laboratory Science,
23(6)、pp.477-493(1993)を参照されたい。また循環ホ
モシステインの高いレベルは血液凝固プロセスに直接影
響を及ぼし得る(上記O. Nygardら及びそこに引用された
文献を参照)。
【０００６】A. Arakiら、Journal of Chromatography,
422, pp. 43-52 (1987)は、チオール特異的蛍光源との
反応を利用し、その後高圧液体クロマトグラフィー(HPL
C)でその他のチオール種を分離する、血漿中の遊離及び
タンパク質結合ホモシステインの検出方法を記載してい
る。N.P.B. Dudmanら、Clinical Chemistry, 42(12),p
p. 2028-2032 (1996)も参照。そのような方法の臨床応
用についての欠点としては、HPLCによって処理すること
ができるサンプルの数が本来的に限定されること、HPLC
の使用により高いスループットのスクリーニングが可能
でないこと、臨床研究室には適当なHPLC装置が存在しな
い可能性があること等が挙げられる。
【０００７】Shipchandlerらは最近(Clinical Chemistr
y, 41(7), pp.991-994, 1995を参照)、ホモシステイン
及びホモシスチン(ホモシステインのジスルフィドダイ
マー)の検出のための蛍光偏光イムノアッセイを記載し
ている。このアッセイは、システイン及びメチオニンに
対する交差反応性が殆どないことが判ったと記載されて
いる。このアッセイではホモシステインをS-アデノシル
ホモシステインに変換し、検出はS-アデノシルホモシス
テイン及びそのフルオレセイン類似体を認識するモノク
ローナル抗体の使用に基づいている。しかし、この検出
技術に伴うと思われる欠点としては、モノクローナル抗
体の製造に伴うコスト、抗体の「非特異性」、すなわち
例えばS-アデノシルメチオニンに対する交差反応性であ
る。その上、この方法は単一の供給者からしか入手する
ことができない特定の特許された装置によってしか実施
することができないようである。
【０００８】K-W. Thongら(Experimental Parasitolog
y, 63, pp.143-151, 1987)は、ホモシステインをα-ケ
トブチレート、硫化水素、及びアンモニアへ酵素的に変
換し、その後酢酸鉛で硫化水素を測定することを記載し
ている(K-W. Thongら、IRCSMedical Science, 13. pp.4
93-494及びpp. 495-496, 1985も参照)。しかし、関連す
る酵素(例えば、寄生生物Trichomonas vaginalisからの
もの)の臨床診断のための使用については示唆されてい
ない。その上、臨床においては、開示された方法はホモ
システインとシステインを区別せず、また生物学的サン
プル中のジスルフィド結合しているホモシステイン分子
あるいはタンパク質に結合されたものの部分を検出しな
い。
【０００９】細菌Pseudomonas ovalisからの微生物酵素
の使用を含むホモシステインの検出のための別の方法が
Yamaguchiら、Annual Report of Sapporo City Institu
te o f Public Health, No. 20, pp. 67-74, 1993に開示
されている。この著者はホモシステインレベルを測定す
る(例えばホモシスチン尿症患者について)間接的な方法
としてアミノ酸のメチオニンの検出に着目している。こ
れは例えばタンパク質とジスルフィド結合しやすい等、
ホモシステインが不安定であると考えられたからであ
る。
【００１０】ホモシステインの間接的な測定として、前
記方法は正確さに欠ける可能性があり、生成物の硫化水
素ではなく生成物のアンモニアを測定することは、生物
学的流体中のアンモニアの高バックグラウンドレベルを
考慮すると感度が低くなる可能性がある。一般的に可能
性のある問題として、混入デアミナーゼの存在によって
アンモニアアッセイが悪影響を受けることも指摘され
る。同様に、生成物α-ケトブチレートのアッセイは、
生物学的サンプル中の高バックグラウンドレベルを考え
ると、効果がないと考えられる(アッセイ方法について
は、Y. Tanら、Protein Expression and Purification,
9, pp. 233-245, 1997を参照)。
【００１１】本発明の実施に関連する別の文献は1997年
5月20日に発行されたSundrehagenの米国特許5,631,127
号である。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】患者におけるホモシス
テインレベルを測定するための正確な方法を開発し、そ
のようなアッセイを標準的医療実務として認められたも
のとすることが望まれている。また下記するように、例
えばホモシスチン尿症のような異常なホモシステイン代
謝を伴う疾患について、乳児を広範囲にスクリーニング
することを可能とすることに対する差し迫った必要が存
在する。
【００１３】心臓血管疾患におけるホモシステインの役
割について認識が高まっていること、及び心臓血管疾患
のリスクについて患者をスクリーニングするという公衆
衛生上の目標を考慮すると、患者におけるホモシステイ
ンレベルを正確に測定するために使用することができる
新規な分析方法について差し迫った必要性が存在する。
そのような方法は、高いホモシステイン濃度が特定の疾
病状態の原因である場合、及び高いホモシステイン濃度
が既存の疾病状態の検出可能な副産物である場合の両方
において有意な医学的利益をもたらすと考えられる。
【００１４】またそのような分析方法は、他の方法で発
病が検出できるようになる前に心臓血管疾患に対する患
者の感受性を予測することによって大きな利益が得られ
る。この点については、そのような方法を一般の集団、
及び特に全ての乳児の広範なスクリーニングに適用する
ことにより大きな利益が得られる。本発明は、臨床環境
における使用のための診断キットを含めそのような方法
を提供する。
【００１５】そのような改良された分析方法の設計に関
して、単一の段階/酵素アッセイにおいてホモシステイ
ンを測定するのに有用であるが、生物学的サンプル中に
通常存在するシステイン及びメチオニンの干渉濃度に対
して非反応性の酵素が開発できれば大きな価値がある。
下記のように、本発明はそのような特異性を有するホモ
システイナーゼ酵素を提供するものである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明は、生物学的流体
中のホモシステインの濃度の新規な測定方法を提供す
る。本発明の好ましい態様においては、生物学的流体は
患者からの尿、組織液、血液、血清、あるいは血漿サン
プルであり、本発明の方法は心臓血管疾患のリスクを調
べるために有効である。特に本発明は、関連する妨害物
質、特にシステイン及びメチオニンの検出を回避しつつ
生物学的流体中のホモシステイン濃度を測定するための
新規な方法を提供する。
【００１７】従って、例えばホモシステイン及びシステ
インを含む生物学的サンプル中に存在するホモシステイ
ンの量を測定するための方法が提供され、該方法は、ホ
モシステイン及びシステインから硫化水素を生成するこ
とができる酵素調製物に前記サンプルを接触させ、ホモ
システインから生成される硫化水素の量を測定すること
により前記サンプル中のホモシステインの量を測定する
ことを含む。最も好ましい態様においては、酵素調製物
は、システインから生成される硫化水素が無視し得るよ
うな、システインと比較してホモシステインに対する反
応性が十分である単一の酵素のみからなる。
【００１８】前記酵素調製物はホモシステイナーゼと呼
ばれる酵素を含むが、これは下記するように他の名称に
より言及されることもある。また用語「酵素調製物」
は、特記しない限り、単独及び複数のアリコートの両者
を包含し、すなわち1種以上の酵素の単一の量または複
数の量をアッセイ方法の間に加えることができ、その用
語を限定せずに使用する場合は、反応工程の間に必要な
酵素の全てを加えるのにアリコートあるいは段階をどの
ようにあるいはいくつ使用するかを示すものである。
【００１９】
【発明の実施の形態】本発明の好ましい形態によれば、
例えば体液のような生物学的サンプル中に存在するホモ
システインの総濃度は、遊離形態ではなく他の分子に共
有結合したホモシステイン分子を含むものと認識され
る。本発明の方法は、ホモシステインから誘導された硫
化水素の測定の前にこのホモシステインを放出させる段
階をさらに提供する。
【００２０】しかし、本発明の方法は関連物質(例えば
システイン)からの干渉がない遊離のホモシステインレ
ベルの正確な測定を提供するので、遊離のホモシステイ
ンだけが検出されるとしても、価値ある情報が臨床医に
提供されるということが指摘される。そのような情報
は、多くの用途のうち、例えば全新生児の試験におい
て、迅速な最初の診断手段として非常に有用であると考
えられる。
【００２１】本発明の別の態様は、ホモシステインを前
記生物学的サンプル中に存在し得るあらゆるシステイン
から区別するために方法を包含する。そのような方法の
代表的なものは、以下の通りである。 (I) 追加的な初期段階を方法に含めることによりホモシ
ステインから生成される硫化水素をシステインから生成
される硫化水素から区別する方法であって、(a) ホモシ
ステインを前記酵素調製物から保護する試薬に前記生物
学的サンプルを接触させ、(b) 前記酵素調製物により前
記サンプル中に存在するシステインから硫化水素を生成
させ、(c) 前記硫化水素を除去し、そして、(d) 前記ホ
モシステインを脱保護し、別の量の酵素調製物を加えて
それから硫化水素を生成する、前記方法、(II) (a) 前
記生物学的サンプル中に存在するホモシステインを、そ
れを単離され得る化合物に変換することができる別の酵
素調製物に接触させ、(b) 前記化合物を単離し、(c) 前
記化合物をそれがホモシステインに戻るように変換され
る条件下で酵素調製物または別の試薬に接触させ、そし
て、(d) そのように生成されたホモシステインを、それ
から硫化水素を生成することができる前記酵素調製物に
接触させる、追加の初期段階を含む方法、(III) システ
インを前記酵素調製物に対して非反応性にする薬剤で、
前記生物学的サンプルを前処理する方法、及び(IV) ホ
モシステインから生成される硫化水素をシステインから
生成される硫化水素から区別する方法であって、(a) 酵
素調製物により前記サンプル中に存在するホモシステイ
ン及びシステインの両方から硫化水素を生成し、前記酵
素がシステインから生成された硫化水素の量と等しいピ
ルベートもシステインから生成するものとし、(b) その
ようにして生成されたピルベートの量を測定し、(c) ホ
モシステインに由来する硫化水素の量からホモシステイ
ンの量を計算し、前記アッセイを行うために前記サンプ
ルを第1の部分と第2の部分に分割し、あるいは任意に分
割しないものとする、段階を含む前記方法。
【００２２】多数の患者のサンプルからのサンプルの迅
速な試験に容易に使用することができる、本発明の特に
好ましい態様においては、ホモシステイン及びシステイ
ンを含む生物学的サンプル中に存在するホモシステイン
の量を測定するための方法が提供され、該方法は、(a)
前記サンプルを部分1と部分2の2つの部分に分割し、(b)
部分1をホモシステインをホモシステイナーゼの基質で
ない物質に変換し得る第1の酵素調製物に接触させ、前
記第1の酵素調製物はシステインを基質として認識しな
いものとし、(c) ホモシステイン及びシステインの両方
から硫化水素を生成することができるホモシステイナー
ゼを含む第2の酵素調製物に部分1と部分2を独立して接
触させ、(d) 部分1と部分2において生成された硫化水素
の量を測定し、(e) 部分2の硫化水素測定値から部分1の
測定値を減じて、結果を2倍することによって前記生物
学的サンプル中のホモシステインの量を計算する、段階
を含む。
【００２３】本発明の医療上の実施のためには、生物学
的サンプル中におけるホモシステインの量の測定に使用
するための診断キットが提供され、該キットに含まれる
ホモシステイナーゼはいくつかのソースのうちの1つか
ら得られる。好ましい態様においては、前記診断キット
は、(a) Trichomonas vaginalisまたはPseudomonas(例
えば種ovailsまたはputida)からのホモシステイナー
ゼ、及び(b) ホモシステイナーゼ反応において生成され
る硫化水素の量を測定するために使用することができる
少なくとも1種の試薬、を含む。
【００２４】本発明の別の形態においては、1種以上の
遺伝子またはその他のポリヌクレオチド配列に由来す
る、ホモシステイナーゼをコードする(DNAまたはRNAの)
キメラヌクレオチド配列であって、その配列の発現によ
りキメラホモシステイナーゼが生成される配列が提供さ
れる。そのようなホモシステイナーゼは本発明の実施に
関して価値ある特性を有し、その好ましい例としては、
Trichomonas vaginalis及びPseudomonas putidaホモシ
ステイナーゼの両者に由来するアミノ酸配列を含むキメ
ラ酵素が挙げられる。
【００２５】このように本発明はホモシステインの臨床
的アッセイの設計において2つの基本的なアプローチを
提供するものであり、(1) ホモシステイナーゼ反応生成
物を検出するための新規なアッセイ法を使用して生物学
的サンプル中のホモシステインの検出を増強し、また
(2) 他の含硫アミノ酸と比較して、ホモシステインに対
して実質的に高められた反応性を有するホモシステイナ
ーゼ酵素を設計することによってそのようなアッセイの
感度をさらに増強するものである。
【００２６】上記(2)のアプローチに関しては、配列番
号10によってコードされるタンパク質の使用が代表的な
ものである。そのようなホモシステイナーゼ酵素は、シ
ステイン及びメチオニンに対して十分に非反応性であ
り、例えば、患者の組織液、尿、血液、血清、あるいは
血漿のサンプル中に存在するホモシステインの濃度を単
一の段階のアッセイにより測定し得るものであり、前記
サンプル中でのホモシステインに対する前記ホモシステ
イナーゼの反応から生成する1種以上の生成物の量を測
定し、前記測定はその中におけるシステインまたはメチ
オニンの濃度に実質的影響されないものである。
【００２７】好ましい形態においては、そのようなホモ
システイナーゼは、Pseudomonas、Clostridium、Aeromo
nasまたはTrichomonasからのホモシステイナーゼを模倣
するものであり、その例においては、そのような酵素の
1以上のペプチド配列は例えば、(a) Gly-Gly-Asn-Arg-L
eu-Ala-Gly-Gln-Glu(配列番号10の残基43〜51を参照)、
(b) Leuを含む(a)のサブセット、(c) Arg-Val-Cys-Lys-
Glu-Ala-His-Ser-Gln(配列番号10の残基168〜176を参
照)、(d) Gluを含む(c)のサブセット、(e) Gln-Met-Arg
-Met-Tyr-Gly-Ser-Met-Ile(配列番号10の残基304〜312
を参照)、及び(f) Tyrを含む(e)のサブセット、からな
る群から選択される、配列番号10の1以上の相同ペプチ
ド配列によって対応するように置換されている。
【００２８】好ましい形態においては、そのようなホモ
システイナーゼは、配列番号10の置換変異体、付加変異
体、欠失変異体、あるいは誘導体であり、前記変異体ま
たは誘導体は下記の特性、(a) 適当なアッセイにおいて
ホモシステインに対する配列番号10の活性の少なくとも
約10%の活性、及び／または(b) 適当なアッセイにおい
てシステイン(またはメチオニン)に対する配列番号10の
活性の約1000%未満の活性、の一方または両方を有す
る。
【００２９】本発明の別の形態は、従って、(1) そのよ
うな特異性を有するホモシステイナーゼをコードするヌ
クレオチド配列を含む精製され単離されたDNA分子であ
って、そのコード配列が宿主細胞においてそこから発現
を誘導することができる調節配列に機能可能なように結
合したもの、及び(2) 適切にトランスフェクトされた宿
主細胞を含むものである。
【００３０】本発明の別の好ましい態様は、ホモシステ
インとシステインを含む生物学的サンプル中に存在する
ホモシステインの量を測定するための方法であって、該
方法は、ホモシステイナーゼにより触媒された反応にお
いてホモシステインから生成された生成物の濃度を測定
することを含み、その生成物は前記サンプル中のシステ
インに対する前記ホモシステイナーゼの反応によっても
生成されるものであり、そのようにしなければ前記サン
プルがシステインの妨害濃度を含むものであり、(a) 前
記サンプルを、システインのγ-グルタミルシステイン
への変換を可能とする基質の存在下で、γ-グルタミル
システインシンセターゼとインキュベートし、(b) 段階
(a)から得られた混合物をホモシステイナーゼとインキ
ュベートし、(c) ホモシステイナーゼによって触媒され
る反応において、ホモシステインとシステインの両者か
ら生成され得る生成物の濃度を測定する段階を含み、
(1) ホモシステイナーゼとして配列番号10あるいはその
残基Met1からLeu396に対応するTrichomonas vaginalis
酵素を使用し、(2) 大腸菌γ-グルタミルシステインシ
ンセターゼを使用することが好ましい前記方法である。
また、システインtRNAシンセターゼの使用に基づく同様
の方法におけるように、診断キットも提供される。
【００３１】本発明の別の重要な特徴は、被検者の生物
学的流体中のホモシステイン濃度の単一の酵素によるア
ッセイにおいて使用するための診断キットを含み、該キ
ットは、(a) ホモシステイナーゼ酵素、及び(b) ホモシ
ステインに対するホモシステイナーゼの反応によって生
成される生成物硫化水素の量を測定するために使用する
ことができる少なくとも1種の試薬を含み、前記ホモシ
ステイナーゼがシステインに対して十分に非反応性であ
って、前記ホモシステイナーゼのシステインに対する反
応によって生成される硫化水素は前記キットを心臓血管
疾患のリスクを調べるために使用することを実質的に妨
げないものである。
【００３２】本発明のこの形態によれば、提供される典
型的な診断キットは、そこに含まれるホモシステイナー
ゼが、例えば、前記流体中のホモシステインとシステイ
ンの濃度がそれぞれ約20μM及び約300μMであるとき、
ホモシステインのアッセイにおいて生物学的サンプルに
接触させたときに前記ホモシステイナーゼの作用によっ
て生成される硫化水素の少なくとも約90%が前記ホモシ
ステインに由来するものであるという特性を有するもの
である。好ましくは、含まれるホモシステイナーゼは、
前記生物学的流体に接触させた際に前記ホモシステイナ
ーゼの作用により生成される硫化水素の少なくとも約99
%がホモシステインに由来するものであるという特性を
有する。例えば、そのような診断キットは、約1〜500μ
Mの範囲、あるいは必要に応じてさらに高い生物学的流
体中のホモシステイン濃度を正確に測定するために使用
することができ、典型的な例においては、前記流体はO
〜約1000μMのシステインも含む。
【００３３】そのようなキットの使用に関しては、本発
明の他のアッセイ方法と同様に、ジスルフィド還元剤、
例えばジチオトレイトール(DTT)を使用して、他の分子
(例えば遊離のシステイン、その他のホモシステイン分
子またはタンパク質SH基)にジスルフィド結合される生
物学的サンプル中のホモシステイン分子も検出できるよ
うにすることが一般に好ましい。
【００３４】本発明のさらに別の代表的な形態は、以下
直ぐに続く発明の詳細な説明に記載する。本発明の実施
は、病理学的プロセスにおけるホモシステインの役割に
関する任意の特定の理論に依るものではなく、またその
ようなものにより限定されるものでもないことも認識さ
れるべきである。
【００３５】血漿ホモシステインレベルの上昇は、血管
疾患の危険因子として認められている。ホモシステイン
のアテローム発生特性は、集合的にホモシスチン尿症と
呼ばれる遺伝病の稀な群との関連において最初に注目さ
れた。この病状は、典型的には正常血液におけるものよ
りも10倍(またはそれ以上)高いホモシステインの循環レ
ベルを特徴とする。このような状況下では、ホモシステ
インは尿においても検出される。早発性血管疾患はこの
状態に強く関連する。例えば、ホモシスチン尿症を未治
療のまま放置すると、約50%の患者が血栓塞栓症状を呈
し、30歳までの死亡率は約20%である(例えばS.H. Mudd
ら、American Journal of Human Genetics, 37, pp.1-3
1, 1985参照)。
【００３６】これまで75を越える疫学的及び臨床的研究
により総ホモシステインレベルと冠状動脈及び末梢動脈
疾患、卒中、及び静脈血栓との間の関係が明らかになっ
ていることから、例えば血漿中のホモシステインレベル
を正確に測定することができる診断的方法について明確
な医学上の必要性が存在する。 そのような方法が患者
の大きな集団、あるいは一般の集団もしくは新生乳児の
大量のスクリーニングに使用できるならば非常に有利で
あると考えられる。そのようなアッセイ方法の開発は、
主に2つの相関する困難によって阻害されてきた。 (1) ホモシステインの化学的及び生化学的性質は、アミ
ノ酸のメチオニン及びシステインを含むその他のスルフ
ヒドリル含有生体分子のものと密接に関連し、従ってホ
モシステインのための改良されたアッセイ方法はホモシ
ステインのみに対して反応するものでなければならな
い。 (2) ホモシステインは非常に反応性が高く、生理的条件
下で、遊離のホモシステイン分子以外に、例えばジスル
フィド結合したダイマー、遊離のシステインとジスルフ
ィド結合したヘテロダイマー、血漿タンパク質のシステ
イン残基にジスルフィド結合したコンジュゲート、その
他のタンパク質アミノ酸のR基(例えば、タンパク質リシ
ンのε-アミノ基)に結合したもの(多くの場合N-アシル
誘導体として)等の多くの形態で存在する。これらのコ
ンジュゲートした形態は、病理学的プロセスに関与し得
るホモシステインの総量の大きな部分を占める。血漿ホ
モシステイン濃度の正常範囲を越えた僅かな増加も統計
的に有意な疾患のリスクを与えることから(上記O. Nyga
rdら参照)、臨床的アッセイにより生物学的流体中の総
ホモシステイン含量を検出する能力が得られることは有
用である。これは、遊離のホモシステイン(またはホモ
システインを含むその他の形態の任意のもの)の再現可
能な検出であって、メチオニン及びシステインのような
その他の物質からの干渉がないものが臨床医に価値ある
情報を提供することを意味する。
【００３７】従って本発明は、患者サンプルの大規模な
スクリーニングを実施可能な条件下で上記の複雑さを克
服するホモシステインアッセイ方法の開発およびそのた
めの試薬の選択に関する。本発明の実施に有用なホモシステイナーゼ酵素 本発明の実施においては、生物学的サンプル中のホモシ
ステイン濃度は以下「ホモシステイナーゼ」として言及
する酵素により酵素的に測定する。「ホモシステイナー
ゼ」は、硫化水素をホモシステインから生成する反応を
触媒することができる酵素として定義される。代表的な
場合においては、アンモニアとα-ケトブチレートも生
成される。本明細書で記載するように、生成物の硫化水
素を検出するのが好ましいが、生成物のアンモニア及び
／またはα-ケトブチレートあるいはその他の生成物を
検出してもよい。本明細書で定義するホモシステイナー
ゼは、他のスルフヒドリル化合物が関与する他の反応を
触媒し得、文献において種々の名称が付されているかも
知れないが、ホモシステインからの硫化水素の生成を触
媒する特性を有するものであるならば、本発明の実施に
おいて一般に有用である。
【００３８】本発明の実施に好ましい第1のホモシステ
イナーゼは、細菌ソース、Pseudomonas putidaから得ら
れるL-メチオニン-α-デアミノ-γ-メルカプトメタンリ
アーゼ(メチオニンリアーゼ)である。該酵素は、S. Ito
ら、Journal of Biochemistry, 79, pp.1263-1272 (197
6)により精製され、約170 kDaの分子量を有すると測定
されている。S. Itoの研究によれば、この酵素はメチオ
ニンのα-γ脱離によりα-ケトブチレート、メタンチオ
ール及びアンモニアを生成する。ホモシステインを基質
とする場合は、α-ケトブチレート、硫化水素及びアン
モニアが反応生成物となる。相同な酵素がPseudomonas
ovalisから単離されている(H. Tanakaら、Biochemistr
y, 16, pp.100-106 (1977))。このPseudomonas酵素の組
換え生成の方法も開発されており(Y. Tanら, Protein E
xpression and Purification,9, pp.233-245, 1997を参
照)、組換え酵素を本発明の臨床的実施に使用すれば、
診断キットのコストとアッセイの再現性に関して利点が
得られると考えられる。Tanらの文献には、酵素コード
配列の単一コピーを含むpAC1-1と称するクローンの構築
が記載されている。コード配列の2つのコピーをタンデ
ムに含むpAC1-11と称される別のクローンも構築されて
いる。pAC1-lの構造と同様に、pT7-7プラスミドを使用
してpAC1-11を構築した。2つのコード配列がBamHI部位
で結合されており、第1の遺伝子はNdeIによりBamHI部位
に、第2のものはBamHIにより別のBamHI部位に結合され
ている。
【００３９】P. putida酵素の基質特異性も測定されて
いる。例えば、N. Esakiら、Methodsin Enzymology、14
3, pp.459-465 (1987)は、相対的活性尺度において、メ
チオニンに対する活性を100として、システインに対し
て10であり、ホモシステインに対して180であると報告
している。該酵素は3種の全てのスルフヒドリル含有ア
ミノ酸に対して反応性であることから、硫化水素のソー
スを適当に測定できる臨床的アッセイを確立する必要性
が強調される。システインと比較してホモシステインに
対する見かけ上10倍の前記酵素の優先性は、生物学的サ
ンプル中のシステインの濃度が高いかもしれないことを
考慮しておらず、実際これはホモシステインの濃度より
非常に高いことに注意されたい。適当な触媒活性を有す
るホモシステイナーゼ酵素は、当分野において知られる
通常のスクリーニング法及びアッセイを使用して他のPs
eudomonas種、あるいはその他の細菌から得ることがで
きる。
【００４０】本発明の実施において有用なホモシステイ
ナーゼのソースである生物の別の群は、Trichomonad寄
生生物及び関連する原生動物の種である。Trichomonad
は、泌尿生殖器の重要な寄生生物であって、耐気性(た
だし依然として嫌気性である)鞭毛原生動物である。Tri
chomonas vaginalisからのホモシステイナーゼを使用す
ることが本発明の実施に好ましい。
【００４１】Trichomonas種は、宿主組織において酸素
毒性に対抗するためにそのチオール代謝能力を使用する
と思われる。K-W Thongら、Experimental Parasitolog
y, 63, pp.143-151 (1987)及びそこに引用される文献を
参照。ホモシステイナーゼ活性(前記文献中ではホモシ
ステインデスルフラーゼ活性と称されている)の有意な
変動がTrichomonas種間で見られたが、酵素活性の許容
レベルについて入手可能な種をスクリーニングすること
は日常的な手段である。一般的には、以下に記載するア
ッセイにおける使用のためにはホモシステイナーゼは少
なくとも約1単位/精製タンパク質mgの比活性を有してい
ることが好ましいが、異なる酵素活性を有する酵素ある
いは酵素調製物のより多い、あるいはより少ない量を使
用するアッセイについて設計上の変更を加えることは関
連分野に熟知する者の技術の範囲内にあるものである。
高度に精製された活性なP. putida酵素は約20単位/mgの
比活性を有する(酵素活性の単位は標準条件下で1分あた
りに基質の1マイクロモルを変換し得るものとして表す
ことができる(上記Tanらを参照))。
【００４２】上記のK-W. Thongら(1987)によって報告さ
れた「ホモシステインデスルフラーゼ活性」は、Tricho
monasにおけるメチオニン代謝活性に係わるものと同じ
酵素から得られるものであるようであり、後にB.C. Loc
kwood及びG.H. Coombs (Biochemical Journal, 279, p
p.675-682, 1991)によりメチオニン-γ-リアーゼと命名
され、これにはこの酵素の精製についても記載されてい
る。上記したように、Trichomonas vaginalisからのメ
チオニン-γ-リアーゼ(ホモシステイナーゼ)の使用は、
本発明の実施において好ましいものである。
【００４３】T. vaginalis酵素の組換体の使用も好まし
い。1つの可能性のあるクローン化方法は、T. vaginali
s遺伝子がほとんどイントロンを有していない可能性が
あるというA. Marcosら、FEMS Microbiology Letters,
135, pp 259-264 (1996)の観察に従うものである。すな
わちゲノムライブラリーを構築し(D. E. Rileyら、Mole
cular and Biochemical Parasitology, 51, pp.161-16
4, 1992を参照)、Pseudomonas putida酵素に対応し、い
くらかの部分的保存配列を反映すると考えられるDNAフ
ラグメントでスクリーニングする。
【００４４】またLockwoodらは、Pseudomonas、Clostri
dium及びAeromonasの種を含むメチオニン-γ-リアーゼ
活性を有している細菌のその他の報告も記載している。
【００４５】そのような種は本発明の実施において有用
なホモシステイナーゼ活性のソースであると考えられ
る。有用なホモシステイナーゼ酵素を提供すると考えら
れる別の生物は、ある種の海藻(例えば、広範なメチオ
ニン関連代謝を有する種について記載するD.A. Gage
ら、Nature, 387, pp.891-897, (1997)を参照)、硫黄
菌、及び極端な環境条件下で生存する土壌微生物あるい
はその他の微生物である(例えばR.A. Kerr, Science, 2
76, pp.703-704, 1997及びE. Pennist, Science, 276,
pp.705-706, 1997参照)。ホモシステイナーゼ型酵素の
有用なソースであり得る微生物の別の例としては、歯周
疾患に関係する細菌、例えばシステインから揮発性硫黄
化合物を生成することができるものが挙げられる。この
点については、S. Perssonら、Oral Microbiology and
Immunology, 5(4), pp.195-201, 1990を参照。
【００４６】最後に、本発明の実施において有用である
「ホモシステイナーゼ」の定義に関して、硫化水素が必
ずそのような酵素の産物であることは、ここでは限定事
項とされるものではない。広くいえば、本発明は、極め
て大きい数のホモシステイン含有サンプルの経済的な分
析を可能とし、一方、干渉物質の検出を回避する、高ス
ループット診断法を提供するものである。
【００４７】従って、ホモシステインを代謝するその他
の酵素も、ホモシステインに類似する物質(例えばシス
テイン)からの妨害を回避できるような条件でその代謝
物を検出する方法が存在すれば、本発明の実施において
有用であると考えられる。以下の実施例は、干渉物質の
検出を避けつつ、ホモシステインを正確に測定するため
の広範な技術を記載するものである。従って、以下に記
載する方法は、ホモシステインに作用する多くのその他
の酵素を使用した検出方法に適合させることができるこ
とは当業者に理解されるであろう。キメラホモシステイ
ナーゼ上記したように、本発明の好ましい態様において
は、キメラホモシステイナーゼ酵素をコードする1以上
の遺伝子(あるいはcDNAまたはその他のイントロンのな
い配列のようなその他のポリヌクレオチド)に由来する
(DNAまたはRNAの)キメラヌクレオチド配列が提供され
る。
【００４８】そのようなホモシステイナーゼは本発明の
実施に関して非常に有用な特性を有し、その好ましい例
としては、Trichomonas vaginalis及びPseudomonas put
idaホモシステイナーゼの両者に対応するアミノ酸配列
を含むキメラ酵素が挙げられる。
【００４９】P. putidaホモシステイナーゼは種々の条
件下でT. vaginalis酵素より安定であると考えられる。
それによる1つのあり得る結果として(B. Lockwoodら、B
iochemical Journal、279、pp.675-682を参照(1991))、
精製の間のT. vaginalis酵素の回収は非常に低いもので
あった(「メチオニンγリアーゼ」に言及している679ペ
ージ表2を参照)。従って本発明の実施においては、この
高い安定性を利用するためにキメラ酵素にP. putida配
列を含めることが好ましい。
【００５０】上記したように、異なるホモシステイナー
ゼは、それらの種々の硫黄含有基質、例えばシステイ
ン、メチオニン及びホモシステインに対する異なるそれ
ぞれの反応性を有する。特定の反応条件の選択が特定の
環境下での見かけ上の反応性に影響を及ぼし得るが、T.
vaginalis酵素が基質としてのホモシステインに対して
P. putida酵素より高い反応性を有することが示されて
おり、基質としてのシステインまたはメチオニンに対し
てより大きい反応性を示し得る。この点については、そ
の表4においてLockwoodら、1991により報告された結果
は、T. vaginalis酵素についての相対的活性データが基
質としてのホモシステインに対して顕著な「優先性」を
示すことを明らかにしていることにおいて注目すべきも
のである(その678ページにおいて報告されているKmデー
タも参照)。これは、P. putida酵素に関して上記N. Esa
kiらよって報告されたデータと対照的である。
【００５１】このように、その成分種の両方からキメラ
タンパク質に与えられる機能上の特徴を利用するキメラ
分子として酵素を提供することにより、本発明の臨床診
断用途における使用のためのホモシステイナーゼの特性
が改良され得る。特に、P. putida酵素の安定性に実質
的に貢献するその領域を本発明のキメラホモシステイナ
ーゼに含ませ、さらに基質としてのホモシステインに対
する反応性を優先的に高めるT. vaginalis酵素の領域も
含ませることが好ましい。
【００５２】そのような酵素の設計に関しては、T. vag
inalisホモシステイナーゼが実際に2つの遺伝子から誘
導される2つのタンパク質種を含むとする最近の報告が
注目される(J.C. Mottramを参照、T. vaginalis mgl1遺
伝子、寄託番号AJ000486、NIDg2330884、及びT. vagina
lis mgl2 遺伝子、寄託番号AJ000487, NID g2330886と
して1997年7月17日にGene Bankへ配列を直接に寄託)。
その全配列は参考により直接記載したのと同様に全て本
明細書の一部とする。1998年2月26日に公開された国際
特許出願WO 98/07872及びA. McKieら、Journal of Biol
ogical Chemistry, 278, pp.5549-5556, 1998も参照。
【００５３】従って本発明は、Pseudomonas putidaホモ
システイナーゼのアミノ酸配列、及びTrichomonas vagi
nalisホモシステイナーゼのアミノ酸配列(mgl1またはmg
l2のどちらかあるいは両方に由来する)をコードするキ
メラヌクレオチド配列であって、それからホモシステイ
ナーゼ活性を有する機能的タンパク質が発現され得る配
列を含む精製され単離されたDNA分子を提供する。好ま
しい形態においては、ヌクレオチド構築物(または対応
するアミノ酸構築物)は主としてP. putidaのものに対応
し、従ってPseudomonas putidaホモシステイナーゼをコ
ードするヌクレオチド配列を含むDNA分子であって、そ
の酵素の1以上のアミノ酸をコードする1以上の部分配列
がTrichomonas vaginalisホモシステイナーゼの対応す
るアミノ酸をコードする1以上のヌクレオチド部分配列
によって対応するように置換された前記DNA分子が提供
される。本発明の実施において、以下、mgl1遺伝子によ
ってコードされるT. vaginalis酵素をT1タンパク質と称
し、mgl2遺伝子によりコードされるものをT2タンパク質
と称する。
【００５４】キメラポリペチド及びコードポリヌクレオ
チドの選択に関して、次の考察が注目される。すなわ
ち、T1及びT2タンパク質は非常に類似したDNA配列によ
ってコードされている。従って、一般的には、P. putid
aバックボーンへのmgl1コード部分配列の置換は同等なm
gl2部分配列置換により得られるものと実質的に同じ効
果を有し、実質的に同様な改善をもたらすと考えられ
る。
【００５５】しかし、T1及びT2配列が実質的に異なる部
分領域の数は限られており、同時にT1配列が刊行物に記
載されたP. putida配列と実質的な相同性を示す(T2配列
はそれ程ではない)点に注意すべきである。実際に、刊
行物に記載されたP. putida配列はT1配列に有意な相同
性を示す。
【００５６】従って、本発明の別の好ましい態様におい
ては、T. vaginalis酵素のコード配列の領域であって、
T2配列と対応するT1配列とが互いに非常に異なるが、T1
配列がP. putidaのそれに実質的に類似している前記領
域が特定される。理論に拘束されるものではないが、こ
れらのT2のコード部分領域が、ホモシステインに対する
キメラ種の高められた反応性を与え、それにより本発明
の診断的方法を容易にするアミノ酸配列ドメインをP. p
utidaコードポリヌクレオチドに挿入する唯一の機会を
与えるものと考えられる。
【００５７】従って本発明は、Pseudomonas putidaホモ
システイナーゼのコード配列を含むDNA分子であって、
前記酵素の1以上のアミノ酸をそれぞれコードするその1
以上の部分配列が、Trichomonas vaginalis ホモシステ
イナーゼの1以上の対応するアミノ酸のそれぞれをコー
ドする１以上のヌクレオチド部分配列によって対応する
ように置換されており、得られるアミノ酸置換体が、
(a) Pseudomonas putidaからのVal-Gly-Ser-Gln-Ala-Le
u-Val-Asp-Arg-Ile-Arg-Leu(配列番号2)またはその任意
のサブセットに対してTrichomonas vaginalis(T2)から
のCys-Ser-Arg-Ala-Asp-Ile-Ile-Ala-Lys-Val-Lys-Ser
(配列番号1)またはその任意のサブセット、(b) Pseudom
onas putidaからのGlu-Leu-Lys(配列番号4)またはその
任意のサブセットに対してTrichomonas vaginalis(T2)
からのAsp-Val-Asp(配列番号3)またはその任意のサブセ
ット、(c) Pseudomonas putidaからのAla-Leu-Gln-Leu
(配列番号6)またはその任意のサブセットに対してTrich
omonas vaginalis(T2)からのCys-His-Val-Val(配列番号
5)またはその任意のサブセット、(d) Pseudomonas puti
daからのGly-Leu-Glu-Asp-Ile-Asp-Asp-Leu-Leu-Ala(配
列番号8)またはその任意のサブセットに対してTrichomo
nas vaginalis(T2)からのCys-Glu-Asn-Val-Gln-Asp-Ile
-Ile-Asp-Asp(配列番号7)またはその任意のサブセッ
ト、及び(e) 上記の群(a)、(b)、(c)、及び(d)により与
えられる置換の1、2、3または4の任意の組合せ、からな
る群から選択される前記DNA分子を提供する。
【００５８】上記に挙げたTrichomonas vaginalis mgl2
(T2)アミノ酸部分配列に関して、それらがほぼ下記のア
ミノ酸配列位置に対応する点に留意する必要がある。Cy
s-Ser-Arg-Ala-Asp-Ile-Ile-Ala-Lys-Val-Lys-Ser(配列
番号1)、226〜237付近、Asp-Val-Asp(配列番号3)、318
〜320付近、Cys-His-Val-Val(配列番号5)、331〜335付
近、及びCys-Glu-Asn-Val-Gln-Asp-Ile-Ile-Asp-Asp(配
列番号7)、381〜390付近 本発明のこの態様の実施と関連して、上記に挙げたT. v
aginalis部分配列は、さらに保存的なアミノ酸置換を受
容するように修飾することができる。さらに、T. vagin
alis部分配列は上記に挙げたP. pulida配列を対応して
置換する必要はなく、例えば、T. vaginalis部分配列が
近傍(すなわちそこから約10のアミノ酸位置まで)に挿入
され、標的とされるP. putida配列が全体または一部と
して所定の位置に残存していてもよい。また、T. vagin
alis挿入物は、酵素安定性の低下によりホモシステイン
に対する増加した反応性の利益が減じられることがない
限り、上記の配列のN末端あるいはC末端に追加のアミノ
酸を導入するものであってもよい。
【００５９】適当なキメラをコードするポリヌクレオチ
ドの構築は当業者には自明であり、部位特異的もしくは
ループアウト突然変異誘発技術を使用し、あるいはPCR
技術を使用することができる。そのようなコードポリヌ
クレオチドの発現のための適当な宿主細胞は、例えば、
Y. Tanら, Protein Expression and Purification, 9,
pp.233-245, 1997に記載されている。システインに対す
る反応性を欠く1段階アッセイ用ホモシステイナーゼ また、本発明の実施によれば、システインに対して実質
的に非反応性、すなわちそのような反応性がいずれも十
分に低く、ヒト被験者からの組織液、尿、血液、血清も
しくは血漿サンプルまたはその他の生物学的流体もしく
はサンプル中に存在するホモシステインの量を単一の酵
素アッセイにおいて測定し得、サンプル中に同様に存在
するシステイン及び／またはメチオニンの濃度を補正す
る必要がない、新規なホモシステイナーゼ酵素も提供さ
れる。そのような生物学的サンプル中のシステイン及び
／またはメチオニンの濃度は一般にホモシステインの濃
度よりもずっと高く、特に一定の疾患症状においてそう
であることを考えれば、単純で迅速なホモシステインア
ッセイに対する公衆衛生上の広範な必要性に鑑みて、こ
れらの発見の意義は臨床医に直ちに理解されるであろ
う。そのような酵素はメチオニンと反応するかもしれな
いが、異なる検出可能な反応生成物(硫化水素)が得られ
るので、これは一般に無関係である。
【００６０】この点、配列番号10によって示される新規
なTrichomonas vaginalisホモシステイナーゼの活性は
注目に値する(下記にさらに説明する実施例8及び図2〜4
を参照)。システインと比較したホモシステインに対す
るこの酵素の相対活性は、生物学的試験サンプル中に存
在するどのようなシステインについても補正することな
くホモシステイン測定を容易に可能とする。
【００６１】本発明の好ましい例において、そのような
新規な酵素はPseudomonas、Clostridium、Aeromonasま
たはTrichomonasを含む種々の微生物で見られるホモシ
ステイナーゼを模倣するものであり、特に好ましいホモ
システイナーゼは、そのmgl1遺伝子(配列番号11)または
mgl2遺伝子から発現されるものを含むT. vaginalisから
誘導されるものである。
【００６２】図1(A及びB)は、2種のTrichomonas vagina
lisホモシステイナーゼ、すなわち本発明の新規なクロ
ーン(pAC2-1)から得られた第1のもの、及び公知のmgl1
遺伝子から得られた第2の酵素のアミノ酸配列を示す(ア
ミノ酸の比較については配列番号10及び12、コードDNA
の比較については配列番号9及び11も参照)。pAC2-1はmg
l1と比較して、アミノ酸位置47におけるPheからLeu、ア
ミノ酸位置172におけるAspからGlu、及びアミノ酸位置3
08におけるSerからTyrの3つの相違(突然変異)の存在を
特徴とすることが判るであろう。
【００６３】1以上のこれらの相違(突然変異)を含むア
ミノ酸置換を導入することにより形成された修飾ホモシ
ステイナーゼアミノ酸配列は特に本発明の実施において
有用である。従って、本発明の好ましい例は、(a) Gly-
Gly-Asn-Arg-Leu-Ala-Gly-Gln-Glu(配列番号10の残基43
〜51を参照)、(b) Leuを含む(a)のサブセット、(c) Arg
-Val-Cys-Lys-Glu-Ala-His-Ser-Gln(配列番号10の残基1
68〜176を参照)、(d) Gluを含む(c)のサブセット、(e)
Gln-Met-Arg-Met-Tyr-Gly-Ser-Met-Ile(配列番号10の残
基304〜312を参照)、及び(f) Tyrを含む(e)のサブセッ
ト、からなる群から選択される配列番号10の1以上のペ
プチド(部分)配列を含むホモシステイナーゼを提供する
ことを含む。
【００６４】また、本発明の好ましいホモシステイナー
ゼである配列番号10は、Trichomonas vaginalisゲノムD
NAから遺伝子として単離されたDNA配列(pAC2-1、配列番
号9を参照)から発現されたものであることが指摘され
る。これに対し、mgl1及びmgl2の報告された単離はcDNA
法を使用するものであるようである。従ってpAC2-1は新
規なホモシステイナーゼTrichomonas遺伝子を表わし得
るものである。
【００６５】代表的な例においては、ホモシステイナー
ゼがPseudomonas、Clostridium、AeromonasまたはTrich
omonas由来の酵素を模倣するものであり、その当初のポ
リペプチド配列の1以上のペプチド(部分)配列が、(a) G
ly-Gly-Asn-Arg-Leu-Ala-Gly-Gln-Glu(配列番号10の残
基43〜51を参照)、(b) Leuを含む(a)のサブセット、(c)
Arg-Val-Cys-Lys-Glu-Ala-His-Ser-Gln(配列番号10の
残基168〜176を参照)、(d) Gluを含む(c)のサブセッ
ト、(e) Gln-Met-Arg-Met-Tyr-Gly-Ser-Met-Ile(配列番
号10の残基304〜312を参照)、及び(f) Tyrを含む(e)の
サブセット、からなる群から選択される配列番号10の1
以上の相同ペプチド配列により対応するように置換され
ているものである。
【００６６】この点、用語「相同」の使用はそのような
相同性が完全に相同であることを示すことを意図するも
のではなく、一般に認められたモデルを使用したそのよ
うな配列の比較により、現在では有意に異なるとして
も、そのような配列が共通の祖先遺伝子またはそのサブ
セットから進化したものでありうることを意味する。同
様に、本明細書で使用する用語「変異」は、天然のも
の、実験的なもの等、どのような手段によって生起され
た修飾も包含するように広く理解されるべきものであ
る。
【００６７】従って、一般に好ましい例としては、第1
のTrichomonasホモシステイナーゼを模倣するものであ
って、その第2のTrichomonasホモシステイナーゼ(配列
番号10に記載したpAC2-1からのもの)のLeu47、Glu172及
びTyr308残基に対応するアミノ酸の1以上が対応して前
記Leu47、Glu172及びTyr308の1以上により置換されてい
るキメラホモシステイナーゼが挙げられる。
【００６８】本発明の別の例は、配列番号1Oの置換変異
体、付加変異体、欠失変異体またはその他の誘導体であ
って、それらの変異体または誘導体が下記の特性、(a)
適当なアッセイ(例えば実施例8に記載するような)にお
いてホモシステインに対する配列番号10の活性の少なく
とも約10%、好ましくは約25%、より好ましくは少なくと
も50%の活性、及び／または(b) 適当なアッセイ(例えば
実施例8に記載するような)においてシステインまたはメ
チオニンに対する配列番号10の活性の約1000%未満、好
ましくは500%未満、より好ましくは200%未満の活性、の
いずれかまたは両方を有するホモシステイナーゼにより
定義される。
【００６９】特性のそのような範囲は一般に、システイ
ンまたはメチオニンと比較して、ホモシステインについ
て酵素の十分に高められた活性を維持すると考えられ、
1段階法がやはり使用できるが、そのような相対的感受
性の正確な要件は各臨床用途において容易に決定できる
ことは理解されるであろう。例えばシステインは、少な
くとも非疾患患者に関しては、尿サンプルにおいて一般
に低い濃度であると考えられる。例えば適当な組換え法
により製造されたその他の生物からの変異体ホモシステ
イナーゼの条件については、上記の相対的指標が有用で
あると考えられる。配列番号10によって表される酵素
は、このホモシステイナーゼのホモシステインに対する
見かけ上の活性がシステイン及びメチオニンに対するよ
りも少なくとも約100倍高いことを考えれば、特に有用
な例である。
【００７０】ホモシステイナーゼが1段階アッセイ法に
おけるその有用性を改良するために修飾される代表的な
例においては、野生型T. vaginalisアミノ酸配列(mgl1
からのもの、配列番号11及び12を参照)は、そのPhe47、
Asp172、及びSer308の1以上が削除されるか、あるいは
(1) Phe47を、Leu、Ile、Val、Ala、Gly、Met及びTrpで
置換すること、(2) Asp172を、Glu、Gln、またはAsnで
置換すること、(3) Ser308を、Tyr、Phe、Met、Trp、Gl
n、Thr、またはAsnで置換すること、に従って変更され
るものであり(一般にはもちろん適当なコードDNAの修飾
による)、ここでは当分野で認識されているように、比
較的保存的なアミノ酸置換が提案され、その点における
それらの有効性は通常の実験によって測定することがで
きる。
【００７１】以下にさらに記載するように(実施例7を参
照)、ニッケル-NTAアフィニティ精製法(Qiagen Compan
y、ドイツより入手可能)を使用して、適当なホモシステ
イナーゼコードDNA配列でトランスフェクトした大腸菌
またはその他の宿主細胞からのホモシステイナーゼの精
製を容易にすることができる。これらの方法は、NTA樹
脂マトリックスに固定されたニッケルカチオンに対する
タンパク質イミダゾール基の選択的結合を利用するもの
である。本発明のこの態様の好ましい例においては、適
当なコードDNA(配列番号9及び10を参照)の修飾によっ
て、例えば、6つの連続ヒスチジン残基を含むアミノ末
端標識をホモシステイナーゼに導入し、それにより宿主
細胞材料からのその精製を容易にする。
【００７２】ホモシステイナーゼ配列番号10(図1ABも参
照)は、前記タンパク質の天然Met1のN-末端側に位置す
る1以上のヒスチジン残基を含む修飾されたホモシステ
イナーゼ酵素の代表的なものであり、この修飾された酵
素はシステイン及びメチオニンに対して十分に非反応性
であり、一段階アッセイにおいてそのような酵素を使用
することによって被検者の組織液、尿、血液、血清また
は血漿のサンプル中に存在するホモシステインの濃度を
測定し得る。そのようなアッセイにおいては、ホモシス
テインに対する前記修飾されたホモシステイナーゼの反
応から生じる1以上の生成物の量を測定し、そのような
測定はサンプル中のシステインまたはメチオニンの濃度
に実質的に影響されない。本開示のこの態様によれば、
本発明の実施において有用であるホモシステイナーゼ
は、天然ホモシステイナーゼMet1のN-末端側に位置する
1以上、好ましくは2〜15、最も好ましくは5〜8の連続し
たヒスチジン残基を含む。
【００７３】これまで述べてきた本発明の詳細な説明を
理解したならば、当業者は下記の説明が本発明のさらな
る例であることを認めるであろう。 １．ホモシステインおよびシステインを含む生物学的サ
ンプル中に存在するホモシステインの量を測定する方法
であって、ホモシステインおよびシステインから硫化水
素を生成することができる酵素調製物に該サンプルを接
触させ、そしてホモシステインから生成された硫化水素
の量を測定することによって該サンプル中に存在するホ
モシステインの量を決定することを含んでなる該方法。 ２．該生物学的サンプルが他の分子と共有結合したホモ
システイン分子を含み、かつ該方法が硫化水素の測定に
先立って該ホモシステイン分子をそこから解離させる工
程をさらに含む、上記１に記載の方法。 ３．該生物学的サンプルがタンパク質のアミノ酸Ｒ基と
結合したホモシステイン分子を含む、上記２に記載の方
法。 ４．該生物学的サンプルがタンパク質システイン残基、
遊離のシステイン分子または他のホモシステイン分子と
ジスルフィド結合したホモシステイン分子を含む、上記
２に記載の方法。 ５．硫化水素がシステインおよびホモシステインの両方
から生成され、そして該方法が以下の初期工程： （ａ）該生物学的サンプルを、ホモシステインを該酵素
調製物から保護する試薬と接触させ； （ｂ）該酵素調製物に該サンプル中のシステインから硫
化水素を生成させ； （ｃ）該硫化水素を除去し；そして （ｄ）該ホモシステインを脱保護し、そしてさらなる量
の酵素調製物を添加してそこから硫化水素を生成させ
る、ことをさらに含むことによってホモシステインより
生成された硫化水素がシステインより生成された硫化水
素から区別される、上記１に記載の方法。 ６．ホモシステインが酸処理によるラクトン形への変換
によって保護され、次に臭化物または穏やかな塩基を用
いて脱保護される、上記５に記載の方法。 ７．以下の初期工程をさらに含んでなる、上記１に記載
の方法： （ａ）該生物学的サンプル中に存在するホモシステイン
を、該ホモシステインを単離可能な化合物に変換するこ
とができるさらなる酵素調製物と接触させ； （ｂ）該化合物を単離し； （ｃ）該化合物を該化合物が変換されてホモシステイン
に戻る条件下で酵素調整物または他の試薬と接触させ；
そして （ｄ）そのようにして生じたホモシステインを、そこか
ら硫化水素を生成することができる該酵素調製物と接触
させる。 ８．以下の工程を含む、上記７に記載の方法： （ａ）該生物学的サンプル中に存在するホモシステイン
を、ホモシステインがS-アデノシルホモシステインに変
換される条件下で、それ自体がS-アデノシルホモシステ
インヒドロラーゼを含むさらなる酵素調製物と接触さ
せ； （ｂ）該S-アデノシルホモシステインを単離し； （ｃ）該S-アデノシルホモシステインを、S-アデノシル
ホモシステインが変換されてホモシステインに戻る条件
下で、さらなる量のS-アデノシルホモシステインヒドロ
ラーゼと接触させ；そして （ｄ）そのようにして生じたホモシステインをそこから
硫化水素を生成することができる該酵素調製物と接触さ
せる。 ９．システインを該酵素調製物に対して非反応性にする
作用物質を用いて該生物学的サンプルが前処理される、
上記１に記載の方法。 10. 該作用物質がシステインtRNAシンテターゼである、
上記９に記載の方法。 11. 該酵素調製物が原核細胞起源のホモシステイナーゼ
を含む、上記１に記載の方法。 12. 該ホモシステイナーゼがPseudomonas putidaに由来
する、上記11に記載の方法。 13. 該酵素調製物が真核細胞起源のホモシステイナーゼ
を含む、上記１に記載の方法。 14. 該ホモシステイナーゼが膣トリコモナス(Trichomon
as vaginalis)に由来する、上記13に記載の方法。 15. 該生物学的液体が尿、組織液、血液、血清および血
漿からなる群より選択される、上記１に記載の方法。 16. ホモシステインおよびシステインを含む生物学的サ
ンプル中に存在するホモシステインの量を測定する方法
であって、以下の工程： （Ａ）該サンプルを部分１および部分２の２つに分割
し； （Ｂ）部分１を、ホモシステインをホモシステイナーゼ
の基質ではない物質に変換できる第１酵素調製物と接触
させ、ここで該第１酵素調製物はシステインを基質とし
て認識せず； （Ｃ）部分１および部分２を、ホモシステインおよびシ
ステインの両方から硫化水素を生成することができるホ
モシステイナーゼを含む第２酵素調製物とそれぞれ独立
して接触させ； （Ｄ）部分１および部分２において生成された硫化水素
の量を測定し；そして （Ｅ）部分２の硫化水素測定値から部分１の硫化水素測
定値を引き算し、結果を２倍することにより該生物学的
サンプル中のホモシステインの量を計算する、ことを含
んでなる該方法。 17. 該第１酵素調製物がS-アデノシルホモシステインヒ
ドロラーゼを含み、そしてホモシステインがS-アデノシ
ルホモシステインに変換される、上記16に記載の方法。 18. 生物学的サンプル中に存在するホモシステインの量
を測定する方法であって、該サンプルをホモシステイン
からの検出可能量の硫化水素の生成を触媒することがで
きる酵素調製物と接触させる工程を含み、かつ該サンプ
ルが該測定に干渉する検出可能量の硫化水素を生成しう
る量のシステインをさらに含む該方法において、ホモシ
ステインに由来する硫化水素の独立した検出を可能とす
る１以上の付加的工程を含むことからなる改良。 19. 以下のものを含んでなる、生物学的サンプル中のホ
モシステインの量を測定するための診断キット： （ａ）膣トリコモナス、Pseudomonas ovalisまたはPseu
domonas putidaホモシステイナーゼ；および（ｂ）ホモ
システイナーゼ反応において形成される硫化水素の量を
測定するのに用いうる少なくとも１つの試薬。 20. ホモシステインがそこに共有結合しているかもしれ
ない他の分子からホモシステインを解離するのに有用な
さらなる試薬を含む、上記19に記載のキット。 21. ホモシステインを該ホモシステイナーゼと非反応性
の形に変換するのに有用なさらなる試薬を含む、上記19
に記載のキット。 22. ホモシステインをホモシステイナーゼと反応させる
のに先立ってホモシステインを該生物学的サンプルから
単離するのに有用なさらなる試薬を含む、上記19に記載
のキット。 23. システインを該ホモシステイナーゼと非反応性の形
に変換するのに有用なさらなる試薬を含む、上記19に記
載のキット。 24. ホモシステインおよびシステインを含む生物学的サ
ンプル中に存在するホモシステインの量を測定する方法
であって、以下の工程： （ａ）該サンプルを、ホモシステインから硫化水素およ
びα-ケト酪酸を生成することができ、さらにシステイ
ンから硫化水素およびピルベート(pyruvate)を生成する
ことができる酵素調製物と接触させ；そして（ｂ）該サ
ンプルまたはその複製物もしくは一部分を、該サンプル
またはその複製物もしくは一部分中のピルベートの量を
測定できる作用を有する酵素調製物と接触させ；そして
次に（ｃ）そのようにして測定されたピルベートの量を
該サンプル中で生成された硫化水素の量と比較すること
によって該サンプル中のホモシステインの量を計算す
る、ことを含んでなる該方法。 25. 該サンプル中のピルベートを測定することができる
該酵素調製物が乳酸デヒドロゲナーゼを含む、上記24に
記載の方法。 26. 該生物学的サンプルがタンパク質のアミノ酸Ｒ基に
結合したホモシステイン分子を含み、そして該方法がま
ず第１に該結合したホモシステイン分子を該方法での検
出に使用可能にする工程をさらに含む、上記25に記載の
方法。 27. 該生物学的サンプルがタンパク質システイン残基、
遊離のシステイン分子または他のホモシステイン分子に
ジスルフィド結合したホモシステイン分子を含み、そし
て該方法がまず第１に該結合したホモシステイン分子を
該方法における検出に使用可能にする工程をさらに含
む、上記25に記載の方法。 28. ホモシステインおよびシステインを含む生物学的サ
ンプル中に存在するホモシステインの量を測定する方法
であって、以下の工程： （ａ）該サンプルを部分１および部分２の２つに分割
し； （ｂ）部分１を、ホモシステインをホモシステイナーゼ
の基質ではない物質に変換できる第１酵素調製物と接触
させ、ここで該第１酵素調製物はシステインを基質とし
て認識せず、また該調製物はS-アデノシルホモシステイ
ンヒドロリアーゼまたはシスタチオニンβ-シンターゼ
からなる群より選択される酵素をさらに含み； （ｃ）部分１および部分２を、ホモシステインおよびシ
ステインの両方から硫化水素を生成することができるホ
モシステイナーゼを含む第２酵素調製物とそれぞれ独立
して接触させ； （ｄ）部分１および部分２において生成された硫化水素
の量を測定し；そして （ｅ）部分２の硫化水素測定値から部分１の硫化水素測
定値を引き算し、結果を２倍することにより該生物学的
サンプル中のホモシステインの量を計算する、ことを含
んでなる該方法。 29. 該ホモシステイナーゼが（ａ）Pseudomonas putid
a、もしくは（ｂ）膣トリコモナスに由来する、または
（ｃ）Pseudomonas putidaおよび膣トリコモナスの両方
に由来するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを
コードするキメラ遺伝子の発現によって産生されるキメ
ラ酵素である、上記24に記載の方法。 30. 該ホモシステイナーゼが（ａ）Pseudomonas putid
a、もしくは（ｂ）膣トリコモナスに由来する、または
（ｃ）Pseudomonas putidaおよび膣トリコモナスの両方
に由来するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを
コードするキメラ遺伝子の発現によって産生されるキメ
ラ酵素である、上記28に記載の方法。 31. 該生物学的液体が尿、組織液、血液、血清および血
漿からなる群より選択される、上記24に記載の方法。 32. 該生物学的液体が尿、組織液、血液、血清および血
漿からなる群より選択される、上記28に記載の方法。 33. 以下のものを含んでなる、生物学的サンプル中のホ
モシステインの量を測定するための診断キット： （ａ）膣トリコモナスもしくはPseudomonas putidaホモ
システイナーゼ、またはPseudomonas putidaおよび膣ト
リコモナスの両方に由来するヌクレオチド配列を含むポ
リヌクレオチドをコードするキメラ遺伝子の発現によっ
て産生されるキメラ酵素； （ｂ）ホモシステイナーゼ反応において形成される硫化
水素の量を測定するのに用いうる少なくとも１つの試
薬；および （ｃ）ホモシステイナーゼ反応において該サンプル中に
存在するシステインから形成されるピルベートの量を測
定するのに用いうる少なくとも１つの試薬。 34. 以下のものを含んでなる、生物学的サンプル中のホ
モシステインの量を測定するための診断キット： （ａ）膣トリコモナスもしくはPseudomonas putidaホモ
システイナーゼ、またはPseudomonas putidaおよび膣ト
リコモナスの両方に由来するヌクレオチド配列を含むポ
リヌクレオチドをコードするキメラ遺伝子の発現によっ
て産生されるキメラ酵素； （ｂ）ホモシステイナーゼ反応において形成される硫化
水素の量を測定するのに用いうる少なくとも１つの試
薬；および （ｃ）シスタチオニンβ-シンターゼ。 35. Pseudomonas putidaホモシステイナーゼのアミノ酸
配列および膣トリコモナスホモシステイナーゼのアミノ
酸配列をコードするキメラヌクレオチド配列を含む精製
され、単離されたDNA分子であって、ホモシステイナー
ゼ活性を有する機能性タンパク質がそこから発現されう
る該DNA分子。 36. Pseudomonas putidaホモシステイナーゼをコードす
るヌクレオチド配列を含む上記35に記載のDNA分子であ
って、該酵素の１以上のアミノ酸をコードする該配列の
１以上のサブ配列が膣トリコモナスホモシステイナーゼ
の対応するアミノ酸をコードする１以上のヌクレオチド
サブ配列によって対応的に置換されている該DNA分子。 37. 該膣トリコモナスホモシステイナーゼがmgl1遺伝子
またはmgl2遺伝子によってコードされる膣トリコモナス
ホモシステイナーゼである、上記36に記載のDNA分子。 38. 該膣トリコモナスホモシステイナーゼがmgl2遺伝子
によってコードされる膣トリコモナスホモシステイナー
ゼである、上記37に記載のDNA分子。 39. Pseudomonas putidaホモシステイナーゼをコードす
る配列を含む上記38に記載のDNA分子であって、それぞ
れ該酵素の１以上のアミノ酸をコードしている該配列の
１以上のサブ配列が、それぞれ該膣トリコモナスホモシ
ステイナーゼの対応する１以上のアミノ酸をコードして
いる１以上のヌクレオチドサブ配列によって対応的に置
換されており、そして該アミノ酸置換が以下のものから
なる群より選択される該DNA分子： （ａ）膣トリコモナス由来の Cys-Ser-Arg-Ala-Asp-Ile
-Ile-Ala-Lys-Val-Lys-Ser（配列番号１）またはその任
意のサブセットによる、Pseudomonas putida由来の Val
-Gly-Ser-Gln-Ala-Leu-Val-Asp-Arg-Ile-Arg-Leu（配列
番号２）またはその任意のサブセットの置換； （ｂ）膣トリコモナス由来の Asp-Val-Asp（配列番号
３）またはその任意のサブセットによる、Pseudomonas
putida由来の Glu-Leu-Lys（配列番号４）またはその任
意のサブセットの置換； （ｃ）膣トリコモナス由来の Cys-His-Val-Val（配列番
号５）またはその任意のサブセットによる、Pseudomona
s putida由来の Ala-Leu-Gln-Leu（配列番号６）または
その任意のサブセットの置換； （ｄ）膣トリコモナス由来の Cys-Glu-Asn-Val-Gln-Asp
-Ile-Ile-Asp-Asp（配列番号７）またはその任意のサブ
セットによる、Pseudomonas putida由来の Gly-Leu-Glu
-Asp-Ile-Asp-Asp-Leu-Leu-Ala（配列番号８）またはそ
の任意のサブセットの置換； （ｅ）上記のグループ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および
（ｄ）によってもたらされる置換のうち１つ、２つ、３
つまたは４つを含む任意の組み合わせ；および （ｆ）ヌクレオチド配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、
（ｄ）または（ｅ）に相補的なヌクレオチド配列。 40. 以下のものを含んでなる、生物学的サンプル中のホ
モシステインの量を測定するための診断キット： （ａ）上記35に記載のホモシステイナーゼ；および
（ｂ）ホモシステイナーゼ反応において形成される硫化
水素の量を測定するのに用いうる少なくとも１つの試
薬。 41. 以下のものを含んでなる、生物学的サンプル中のホ
モシステインの量を測定するための診断キット： （ａ）上記39に記載のホモシステイナーゼ；および
（ｂ）ホモシステイナーゼ反応において形成される硫化
水素の量を測定するのに用いうる少なくとも１つの試
薬。 42. 該キメラホモシステイナーゼをコードするDNA配列
が発現制御配列に機能しうる形で連結されている、上記
39に記載の組換えDNA分子。 43. 上記42に記載の組換えDNA分子を含むように改変さ
れた宿主細胞。 44. 患者の生物学的液体中のホモシステイン濃度を測定
する方法であって、該サンプル中における該ホモシステ
イン濃度の測定を可能とする該サンプル中の硫化水素お
よびピルベートの測定の両者が単一のキュベット中で実
施される条件下での、上記33に記載の診断キットの使用
を含む該方法。 45. 被験者の組織液、尿、血液、血清または血漿サンプ
ル中に存在するホモシステインの濃度が単一の酵素アッ
セイで測定できるほどシステインまたはメチオニンに対
して十分に非反応性であるホモシステイナーゼ酵素であ
って、該酵素アッセイにおいては該サンプル中のホモシ
ステインに対する該ホモシステイナーゼの反応から生じ
た１以上の生成物が測定され、そして該測定が該サンプ
ル中のシステインまたはメチオニンの濃度によって実質
的に影響を受けない、該ホモシステイナーゼ酵素。 46. 膣トリコモナスのホモシステイナーゼのアミノ酸配
列を実質的に模倣した(patterned on)、上記45に記載の
ホモシステイナーゼ酵素。 47. mgl1遺伝子（配列番号11）によってコードされる膣
トリコモナス酵素を模倣した、上記46に記載のホモシス
テイナーゼ。 48. mgl2遺伝子によってコードされる膣トリコモナス酵
素を模倣した、上記46に記載のホモシステイナーゼ。 49. 配列番号10またはその残基Met1からLeu396に対応す
るアミノ酸配列を有する、上記46に記載のホモシステイ
ナーゼ。 50. 以下のものからなる群より選択される、配列番号10
の１以上のペプチド配列を含むホモシステイナーゼ： （ａ）Gly-Gly-Asn-Arg-Leu-Ala-Gly-Gln-Glu; （ｂ）Leuを含む（ａ）のサブセット； （ｃ）Arg-Val-Cys-Lys-Glu-Ala-His-Ser-Gln（配列番
号10、残基168-176)；（ｄ）Gluを含む（ｃ）のサブセ
ット； （ｅ）Gln-Met-Arg-Met-Tyr-Gly-Ser-Met-Ile（配列番
号10、残基304-312)；および （ｆ）Tyrを含む（ｅ）のサブセット。 51. Pseudomonas、Clostridium、AeromonasまたはTrich
omonas 由来のホモシステイナーゼを模倣した、上記45
に記載のホモシステイナーゼ。52. Pseudomonas、Clost
ridium、AeromonasまたはTrichomonas に由来する上記4
5に記載のホモシステイナーゼであって、その１以上の
ペプチド配列が以下のものからなる群より選択される配
列番号10の１以上のペプチド配列によって対応的に置換
されている該ホモシステイナーゼ： （ａ）Gly-Gly-Asn-Arg-Leu-Ala-Gly-Gln-Glu（配列番
号10、残基43-51); （ｂ）Leuを含む（ａ）のサブセット； （ｃ）Arg-Val-Cys-Lys-Glu-Ala-His-Ser-Gln（配列番
号10、残基168-176)；（ｄ）Gluを含む（ｃ）のサブセ
ット； （ｅ）Gln-Met-Arg-Met-Tyr-Gly-Ser-Met-Ile（配列番
号10、残基304-312)；および （ｆ）Tyrを含む（ｅ）のサブセット。 53. Trichomonas ホモシステイナーゼを模倣したキメラ
ホモシステイナーゼであって、配列番号10のLeu47、Glu
172およびTyr308に対応するその１以上のアミノ酸がそ
れらによって対応的に置換されている該キメラホモシス
テイナーゼ。 54. 置換変異体、付加変異体、欠失変異体、または配列
番号10もしくはその残基Met1からLeu396の誘導体である
ホモシステイナーゼであって、該変異体または誘導体が
以下の特性の片方または両方を有する該ホモシステイナ
ーゼ： （ａ）実施例８のアッセイにおいて、ホモシステインに
対する配列番号10の活性の少なくとも約25%；および／
または（ｂ）実施例８のアッセイにおいて、システイン
に対する配列番号10の活性の約500%以下。 55. (a) 被験者の組織液、尿、血液、血清または血漿サ
ンプル中に存在するホモシステインの濃度が単一の酵素
アッセイで測定できるほどシステインまたはメチオニン
に対して十分に非反応性であって、該酵素アッセイにお
いては該サンプル中のホモシステインに対する該ホモシ
ステイナーゼの反応から生じた１以上の生成物が測定さ
れ、該測定は該サンプル中のシステインまたはメチオニ
ンの濃度によって実質的に影響を受けず；そして（ｂ）
配列番号12を模倣しているが、そのPhe47、Asp172およ
びSer308のうち１以上が欠失している、または以下の方
式： (1) Phe47をLeu、Ile、Val、Ala、Gly、MetおよびTrpで
置換； (2) Asp172をGlu、GlnまたはAsnで置換； (3) Ser308をTry、Phe、Met、Trp、Gln、ThrまたはAsn
で置換； により置換されている、上記45に記載のホモシステイナ
ーゼ酵素。 56. ホモシステインに対する比活性がシステインおよび
メチオニンに対する比活性よりも少なくとも約100倍大
きい、上記45に記載のホモシステイナーゼ。 57. 上記45に記載のホモシステイナーゼをコードするヌ
クレオチド配列を含む精製され、単離されたDNA分子で
あって、該コード配列が宿主細胞において発現を引き出
すことができる制御配列に機能しうる形で連結されてい
る、該DNA分子。 58. 上記57に記載のDNA分子を含む宿主細胞。 59. 配列番号10またはその残基Met1からLeu396によって
表されるホモシステイナーゼをコードするヌクレオチド
配列を含む、上記57に記載の精製され、単離されたDNA
分子。 60. 配列番号９もしくは配列番号９のヌクレオチド39か
ら1226までの断片、またはそれらの相補体であるヌクレ
オチド配列を含む、上記59に記載のDNA分子。 61. 配列番号９またはホモシステイナーゼをコードする
その断片に対応するRNA分子。 62. ホモシステインおよびシステインを含む生物学的サ
ンプル中に存在するホモシステインの量を測定する方法
であって、ホモシステイナーゼによって触媒される反応
においてホモシステインより生成される生成物の濃度を
測定することを含み、該生成物は該サンプル中のシステ
インに対する該酵素の反応によっても生成されうるもの
であり、該サンプルは他の方法においては干渉濃度であ
るシステインを含み、そして該方法は該サンプル中のホ
モシステイン濃度が単一の酵素アッセイで測定しうるほ
どシステインに対して十分に非反応性な形で該酵素を提
供する工程を含む、該方法。 63. 該生物学的サンプルがヒト被験者の組織液、尿、血
液、血清または血漿である、上記62に記載の方法。 64. 該生物学的サンプルがタンパク質のアミノ酸Ｒ基と
結合したホモシステイン分子を含み、そして該方法がま
ず第１に該結合したホモシステイン分子を該方法におけ
る検出に使用可能にする工程をさらに含む、上記63に記
載の方法。 65. 該生物学的サンプルがタンパク質のシステイン残
基、遊離のシステイン分子または他のホモシステイン分
子とジスルフィド結合したホモシステイン分子を含み、
そして該方法がまず第１に該結合したホモシステイン分
子を該方法における検出に使用可能にする工程をさらに
含む、上記63に記載の方法。 66. ホモシステインおよびメチオニンを含む生物学的サ
ンプル中に存在するホモシステインの量を測定する方法
であって、ホモシステイナーゼによって触媒される反応
においてホモシステインより生成される生成物の濃度を
測定することを含み、該生成物は該サンプル中のメチオ
ニンに対する該酵素の反応によっても生成されうるもの
であり、該サンプルは他の方法においては干渉濃度であ
るメチオニンを含み、そして該方法は該サンプル中のホ
モシステイン濃度が単一の酵素アッセイで測定しうるほ
どメチオニンに対して十分に非反応性な形で該酵素を提
供する工程を含む、該方法。 67. 該生物学的サンプルがヒト被験者の組織液、尿、血
液、血清または血漿である、上記65に記載の方法。 68. 以下のものを含んでなる、生物学的サンプル中のホ
モシステインの量を測定するための診断キット： （ａ）上記45に記載のホモシステイナーゼ；および （ｂ）ホモシステイナーゼ反応において形成される生成
物の量を測定するのに用いうる少なくとも１つの試薬。 69.（ｂ）の試薬がホモシステイナーゼ反応において形
成される硫化水素の量を測定するのに使用される、上記
68に記載の診断キット。 70. ホモシステイナーゼタンパク質の正常なMet1のＮ末
端側に位置する１以上のヒスチジン残基を含む改変され
たホモシステイナーゼ酵素であって、該酵素は被験者の
組織液、尿、血液、血清または血清サンプル中のホモシ
ステイン濃度が、該サンプル中のホモシステインに対す
る該改変ホモシステイナーゼの反応から生じる１以上の
生成物を測定する単一の酵素アッセイで測定しうるほど
システインまたはメチオニンに対して十分非反応性であ
り、該測定は該サンプル中のシステインまたはメチオニ
ンの濃度によって実質的に影響されない、該酵素。 71. ホモシステイナーゼタンパク質の正常なMet1のＮ末
端側に位置する約６個のヒスチジン残基を含む、上記70
に記載の改変されたホモシステイナーゼ酵素。 72. 上記70に記載のホモシステイナーゼ酵素をコードす
るDNA分子。 73. ホモシステインおよびシステインを含む生物学的サ
ンプル中に存在するホモシステインの量を測定する方法
であって、ホモシステイナーゼによって触媒される反応
においてホモシステインより生成される生成物の濃度を
測定することを含み、該生成物は該サンプル中のシステ
インに対する該ホモシステイナーゼの反応によっても生
成されうるものであり、該サンプルは他の方法において
は干渉濃度であるシステインを含み、そして該方法は以
下の工程： （ａ）システインからγ-グルタミルシステインへの変
換を可能とする基質の存在下で該サンプルをγ-グルタ
ミルシステインシンテターゼと共にインキュベートし； （ｂ）工程（ａ）で得られた混合物をホモシステイナー
ゼと共にインキュベートし；そして （ｃ）該ホモシステイナーゼによって触媒される反応に
おいてホモシステインおよびシステインの両方から生成
されうる生成物の濃度を測定する、を含む、該方法。 74. 測定される生成物が硫化水素またはアンモニアであ
る、上記73に記載の方法。 75. 該ホモシステイナーゼが膣トリコモナスに由来す
る、上記73に記載の方法。 76. 該ホモシステイナーゼがmgl1遺伝子（配列番号11）
によってコードされる膣トリコモナス酵素である、上記
75に記載の方法。 77. 該ホモシステイナーゼがmgl2遺伝子によってコード
される膣トリコモナス酵素である、上記75に記載の方
法。 78. 該ホモシステイナーゼが配列番号10またはその残基
Met1からLeu396に対応するアミノ酸配列を有する、上記
75に記載の方法。 79. 該ホモシステイナーゼがPseudomonas putidaに由来
する、上記73に記載の方法。 80. 該生物学的サンプルが組織液、尿、血液、血清また
は血漿からなる群より選択される、上記73に記載の方
法。 81. 該ホモシステイナーゼがPseudomonas、Clostridiu
m、AeromonasまたはTrichomonasに由来する、上記73に
記載の方法。 82. 該生物学的サンプルがタンパク質システイン残基、
遊離のシステイン分子または他のホモシステイン分子と
ジスルフィド結合したホモシステイン分子を含み、そし
て該方法がまず第１に該結合したホモシステイン分子を
ホモシステイナーゼとの反応に使用可能にする工程をさ
らに含む、上記73に記載の方法。 83. ジスルフィド結合したホモシステイン分子をホモシ
ステイナーゼとの反応に使用可能にする該工程が工程
（ａ）に先立つ時点で該サンプルをトリス-(2-カルボキ
シエチル）ホスフィンで処理することによって実施され
る、上記82に記載の方法。 84. 該γ-グルタミルシステインシンテターゼが大腸菌
(E. coli)に由来する、上記73に記載の方法。 85. 硫化水素の検出が、第二鉄および該硫化水素による
N,N-ジアルキル-p-フェニレンジアミンの酸化により生
成されるメチレンブルー型発色団の比色分析的検出によ
って実施される、上記74に記載の方法。 86. 該N,N-ジアルキル-p-フェニレンジアミンがN,N-ジ
メチル、N,N-ジエチル、N,N-ジ-n-プロピルまたはN,N-
ジ-n-ブチルである、上記85に記載の方法。 87. 以下のものを含んでなる、生物学的サンプル中のホ
モシステインの量を測定するための診断キット： （ａ）γ-グルタミルシステインシンテターゼ； （ｂ）ホモシステイナーゼ；および （ｃ）ホモシステイナーゼの該サンプルとの反応によっ
て形成される硫化水素またはアンモニアの量を測定する
のに用いうる少なくとも１つの試薬。 88. （ｃ）の試薬が硫化水素またはアンモニアを測定す
るのに使用される、上記87に記載のキット。 89. ホモシステインおよびシステインを含む生物学的サ
ンプル中に存在するホモシステインの量を測定する方法
であって、ホモシステイナーゼによって触媒される反応
においてホモシステインより生成される生成化合物の濃
度を測定することを含み、該生成化合物は該サンプル中
のシステインに対する該ホモシステイナーゼの反応によ
っても生成されうるものであり、該サンプルは他の方法
においては干渉濃度であるシステインを含み、そして該
方法は以下の工程： （ａ）適切な環境においてシステインをホモシステイナ
ーゼの基質ではない化合物に変換することができる酵素
と共に該サンプルをインキュベートし； （ｂ）１以上の生成化合物を生じさせるために工程
（ａ）で得られた混合物をホモシステイナーゼと共にイ
ンキュベートし；そして （ｃ）該生成化合物の濃度を測定することによって該サ
ンプル中のホモシステインの量を測定する、ことを含
む、該方法。 90. 該生成化合物が硫化水素またはアンモニアである、
上記89に記載の方法。 91. 工程（ａ）で用いられる酵素がγ-グルタミルシス
テインシンテターゼ、システインオキシダーゼ、シスタ
チオニンβ-シンテターゼまたはシステインtRNAシンテ
ターゼである、上記89に記載の方法。 92. 該生物学的サンプルがメチオニンを含む、上記73に
記載の方法。
【００７４】
【実施例】〔実施例1〕 二重酵素減算（double enzyma
tic subtraction）によるシステインを含むサンプル中
のホモシステインの検出 血漿サンプル中の遊離ホモシステインの濃度は、以下の
ように測定される。血液サンプル(0.1〜5.0 mL)を、抗
凝固剤としてEDTAを使用して、標準的なバキュテーナー
で集め、血漿を遠心分離によって調製する。
【００７５】生物学的サンプル中の遊離ホモシステイン
の測定が有用な予測情報を臨床医に提供すると考えられ
るが、ホモシステインの大きな部分が他の分子(例えば
遊離システイン、その他のホモシステイン分子及び利用
可能なタンパク質スルフヒドリル基)にジスルフィド結
合されて存在すると認められている。本発明の実施によ
れば、プロトコルにおいてジスルフィド還元剤(例えば
ジチオトレイトール、DTT)を使用して、ホモシステイン
分子のより広範なプールの検出を可能とすることが一般
に好ましい。
【００７６】150単位/mlのTrichomonas vaginalis酵素
のホモシステイナーゼストック溶液も調製する。酵素の
ストック溶液は一般に、1〜1O0O 単位/ml、好ましくは1
00〜200単位/mlの範囲であるが、正確な活性は、サンプ
ル中のホモシステインの濃度等の種々の因子に応じて実
施者により選択される。
【００７７】上記したように、同様の活性レベルでP. p
utida酵素を使用することも好ましい。
【００７８】バッファー中に適当に希釈した血漿サンプ
ルを2つの等容量、部分1と2に分割する。部分1に適当な
量のS-アデノシルホモシステインヒドロラーゼ(SAHH)及
び一定量のアデノシンを加える(SAHHは真核生物及び原
核生物ソースのいずれからも入手でき、T. vaginalisに
おいてこれをクローニングする方法はBagnara ら、Mole
cular and Biochemical Parasitology, 81 , pp.1-11,
1996に示されている)。十分なアデノシンの存在下で、
血漿ホモシステインをS-アデノシルホモシステインに変
換する。部分2は、SAHHと反応させない。
【００７９】そしてTrichomonas vaginalisホモシステ
イナーゼを部分1及び部分2のサンプルに加え、約10〜30
分反応させる。0.5〜1単位/mLの範囲のホモシステイナ
ーゼの終濃度が好ましいが、必要に応じ、正確な量を調
整することができる。部分1のサンプル中に残存するア
デノシンがヒドロリアーゼ反応が逆行することを阻害す
るので、これに留意して当初濃度を選択しなければなら
ない。必要な量は選択されるSAHHに依存し得るが、有用
な開始点は存在するホモシステインの濃度未満の濃度で
ある。 そして部分1及び部分2の両者中の硫化水素を測
定し、もとのサンプル中に存在したホモシステインの量
を、部分2の硫化水素測定値から部分1の硫化水素測定値
を減じ、この結果を二倍にすることによって計算する。
硫化水素測定は、O.1〜1.Oモルの範囲でサンプルに酢酸
鉛を添加し、該硫化物を沈殿させることにより行う。沈
殿は、標準的な分光光度計により360 nmあるいは不溶性
の沈殿物を測定することができるその他の適当な波長
(例えば可視領域)で測定する。この工程は容易に自動化
することができる。
【００８０】二重酵素減算法の実施において有用な別の
酵素は、シスタチオニンβ-シンターゼであり、これは
ホモシステインとセリンからのシスタチオニン体の生成
を触媒する。血清または血漿サンプルについては、反応
は血中のセリンの比較的高い濃度を利用してシスタチオ
ニンの方向に駆動され得る。この酵素の適当なソースと
しては、Trichomonas、Pseudomonas、あるいは例えば肝
臓等の哺乳動物組織から単離される材料が挙げられる。
S-アデノシルホモシステインヒドロラーゼについて上記
した範囲と同等の単位/mlが得られる量で酵素を使用し
得る。SAHHの使用について上記したように、不正確なデ
ータをもたらすこの酵素反応の逆行を防ぐように段階を
行うことが好ましい。反応は、外部からセリンを反応サ
ンプルに加えるか、シスタチオニンへの変換が終了した
ら酵素を不可逆的に阻害することにより、シスタチオニ
ンの方向に駆動し、維持することができる。適当な阻害
剤としては、活性部位に高アフィニティを有するセリン
類似体が挙げられる。
【００８１】二重酵素減算法に基づくさらに別の方法も
利用できる。最近発表された研究においては、酵素メチ
オニンtRNAシンセターゼ(メチオニンtRNAシンターゼ)
が、ホモシステインを反応体として受容できることが示
されている(H. Jakubowskyら、FEBS Letters, 317, pp.
237-246, 1993を参照)。従ってこの酵素を使用して上記
の結果を再現することが可能である。 〔実施例２〕 交互S-アデノシルホモシステインヒドロ
ラーゼ法 実施例1により生成されたS-アデノシルホモシステイン
を以下の操作にかける。その生成の後、単離し、S-アデ
ノシルホモシステインがホモシステインに変換されて戻
る条件でさらなる量のS-アデノシルホモシステインヒド
ロラーゼと接触させる。その後前記酵素調製物を用いて
そのように生成されたホモシステインをホモシステイナ
ーゼと接触させて、そこから硫化水素を生成する。 〔実施例３〕 直接酵素減算によるシステインを含むサ
ンプル中のホモシステインの検出 実施例1の最初の方法に従い、ホモシステインとシステ
インとを含む血漿サンプルを調製する。サンプルは部分
に分割せず、その代わり、存在するシステインがtRNAと
結合する条件下で、システインtRMAシンセターゼ酵素の
サンプルを加える。選択される酵素は真核生物あるいは
原核生物いずれの起源でもよく、その反応のための条件
は当分野において周知である。
【００８２】そしてシステインを枯渇させたサンプルを
上記したようにホモシステイナーゼと反応させ、硫化水
素測定からホモシステイン濃度を直接に測定する。
【００８３】直接酵素減算法の別の例を下記実施例10に
示すが、これは酵素γ-グルタミルシステインシンセタ
ーゼに基づくものであり、これは真核生物あるいは原核
生物起源のものであってよい。この酵素を使用するアッ
セイ系を記載する。
【００８４】システインを枯渇させるために有用な別の
酵素としては、システインオキシダーゼ及びシスタチオ
ニンβ-シンセターゼが挙げられる。 〔実施例４〕 他の生体分子に結合したホモシステイン
の検出方法 上記したように、ホモシステインは他の生体分子に結合
されて生物学的流体中に存在し、そのような形態で「保
存された」ホモシステインが病理的プロセスに関与する
と考えられる。従って、全ホモシステインを測定するこ
とが望ましく、これには(1)ホモシステインダイマー、
(2)ホモシステイン/システインヘテロダイマー、(3)ホ
モシステインがジスルフィド結合でタンパク質システイ
ンに結合したホモシステイン及びタンパク質のコンジュ
ゲート、および(4)ホモシステイン(そのN-アシル化形態
を含む)がタンパク質アミノ酸R基、特にタンパク質リシ
ンのε-アミノ基に結合した、ホモシステインとタンパ
ク質のコンジュゲートが含まれる。
【００８５】形態(1)〜(3)については、還元溶液を使用
して共有結合で結合したホモシステインを遊離させる。
1つの例においては、水素化ホウ素ナトリウムまたはナ
トリウムシアノ水酸化ホウ素ストック溶液を約0.1 M以
下に調製する。反応は、前記水酸化ホウ素を血漿サンプ
ル(実施例1の最初の工程に従って調製したもの)に加えp
H 6〜8で5〜10分間室温で行う。過剰の水酸化ホウ素を
分解し、その後サンプルを実施例1または3の酵素反応工
程に供することができる。あるいはサンプルを以下の方
法によりさらに操作することにより、水酸化ホウ素をHC
lで中和し得る。
【００８６】しかし、水素化ホウ素ナトリウムは一定の
環境下でホモシステイナーゼを変性させることが判った
ので、DTTの使用が好ましい。 〔実施例５〕 酸性条件下における操作 上記の形態(4)については、6N HClを上記タンパク質サ
ンプルで約50/50に希釈して用いることができる。沸騰
温度で1-2時間窒素下で還流した後、完全に乾燥するま
で真空下でサンプルから水を除去する。もしホモシステ
インが他のアミノ酸に結合しているならば、これによっ
て解放される。また、これによってホモシステインのラ
クトン化プロセスが完了する。乾燥した時点で、酢酸ナ
トリウム(1M)および無水酢酸(10M)を添加する。これを
沸騰温度でさらに１時間還流してアセチル化ホモシステ
インチオラクトンを生成する。
【００８７】上記無水物を蒸発させて除去し乾燥させ
る。エーテルを用いてN-アセチル化ホモシステインチオ
ラクトンを選択的に抽出する。次に、このエーテルを真
空下で35℃で蒸発させる。そこに生理学的に緩衝化され
た水（リン酸緩衝化生理食塩水pH 7.5)を添加し、これ
は次にチオラクトン環を開環する。この時点で、２つの
反応のどちらかが実施される。次にホモシステイナーゼ
を添加して10-30分間反応させ、その後上記のように硫
化水素を検出する。または、好ましくはブタ腎臓デアセ
チラーゼを添加してホモシステインを脱アシル化し、次
にホモシステイナーゼを添加する。 〔実施例６〕 システインを含むサンプル中のホモシス
テインを直接酵素的減法(subtraction) によって検出す
るための付加的方法 概して言えば、この付加的方法は以下の事実を利用する
ものである。すなわち、ホモシステイナーゼの作用でシ
ステインから生成されるピルビン酸は、血漿等の生物学
的サンプル中に存在するホモシステインおよびシステイ
ンの両者に対するホモシステイナーゼの作用で生成され
る硫化水素から独立して検出することができるという事
実である。したがって、ホモシステインの測定は単純な
引き算によって行なうことができる。この方法によれ
ば、ピルビン酸から検出可能な生成物を生成する任意の
数の酵素によってピルビン酸を酵素的に測定することが
できる。同様に、ロイシンデヒドロゲナーゼを用いて硫
化水素との関連においてα-ケト酪酸（ホモシステイン
から生成されるがシステインからは生成されない）を測
定することができる。
【００８８】この方法の２つの主要なプロセス、すなわ
ちピルビン酸の検出および硫化水素の検出は、１個のサ
ンプル中で同時に実施することができる。または、この
２つの検出は平行するサンプル中で別々に実施すること
ができる。どちらの場合にも適切な対照を用いて実施す
る。
【００８９】好ましい例においては、ピルビン酸の検出
に用いられる酵素は哺乳動物の乳酸デヒドロゲナーゼで
あり、そしてピルビン酸および全硫化水素の両方の測定
は標準的分光光度計を用いて１個のキュベット中で実施
される。実施例１の最初の手順にしたがってホモシステ
インおよびシステインの両方を含む血漿サンプルを調製
する。このサンプルは部分に分割しない。かわりに、こ
のサンプルにホモシステイナーゼ（膣トリコモナス(Tri
chomonas vaginalis)またはP. putida 由来）のサンプ
ルを、ホモシステインから硫化水素、アンモニアおよび
α-ケト酪酸が生成され、さらにシステインから硫化水
素、アンモニアおよびピルビン酸が生成される条件下で
添加する。酵素乳酸デヒドロゲナーゼのサンプル（先行
する実施例に用いたのと同等の濃度量（単位/ml)で）も
また、この酵素がシステインから生成されたピルビン酸
と反応する条件下で添加され、次にその反応を340 nmで
又はその付近で(NADH に対して）周知の方法によってモ
ニターする。
【００９０】サンプル中のホモシステインおよびシステ
インの両者の合計濃度は、先に記述したように（実施例
１参照）、沈降する発色した鉛塩を検出することができ
る任意の波長（可視域など）で、または例えば360 nmも
しくはこの近傍で、ホモシステイナーゼから生成された
全硫化水素を測定することによって比色的に測定するこ
とができる。硫化水素は、当分野で公知の他の発色性金
属塩の形成に基づいても検出することができる。(シス
テインおよびホモシステインから生成された)全硫化水
素を(システインのみから生成された)全ピルビン酸と比
較することによって、もとのサンプル中のホモシステイ
ン濃度が決定される。この方法もまた容易に自動化さ
れ、両方の検出波長を同時にモニターすることが可能で
ある。
【００９１】血液または血液由来の溶液中のピルビン酸
を検出するための乳酸デヒドロゲナーゼの使用は当技術
分野で認められている幾つかの方法の１つにしたがえば
よいが、特定の予防措置をここでも繰り返さなければな
らない。ピルビン酸は血液中および血液由来の物質中で
非常に不安定であって、重合することさえある。しがっ
て、ピルビン酸測定は、回収したサンプルのタンパク質
を含まない濾液を用いて、および当技術分野で公知のメ
タリン酸で処理した場合のみ回収したサンプルを用い
て、実施することが望ましい。 〔実施例７〕 大腸菌BL21 (DE3) pAC2-1クローンの作
製 膣トリコモナスのpAC2-1ホモシステイナーゼ遺伝子のク
ローニングを下記のように実施した。概して言えば、他
の微生物に適用可能と認められる組換え方法がトリコモ
ナスDNAの操作についても有用である。上述したように
多数のトリコモナス遺伝子はイントロンを欠くゆえに特
にそう言えるのである。有用な参照文献としてY. Tan
ら，Protein Expression and Purification, 9, pp. 23
3-245 (1997)および1996年12月19日に公表されたY. Tan
らの国際特許公開第96/40284号を挙げることができる。
【００９２】標準的手順(Wizard Minipreps, Promega,
Madison, WI)によって膣トリコモナスのゲノムDNAを単
離し、PCR反応の鋳型として用いた。PCR反応はPCR試薬
キット（Roche, Branchburg, NJ)に添付された方法にし
たがって実施した。mgl1遺伝子のヌクレオチド配列(J.
C. Mottramら，Gene Bank受託番号 AJ000486, NID g233
0884, 1997年7月17日提出）に基づいてオリゴヌクレオ
チドプライマーを設計した。
【００９３】使用した具体的プライマーは以下の通りで
ある：（センス）5'-ggattacata tgcatcatca tcatcatca
c atgagtggcc acgctatcga c-3'（配列番号13）（CATATG
NdeI部位を含む）；および（アンチセンス）5'-ggatta
ggat ccttagagga ctaagtcgag agcc-3'（配列番号14）
（GGATCC BamHI部位を含む）。使用した付加的試薬は、
制限エンドヌクレアーゼ、T4 DNAリガーゼ、およびBL21
(DE3)コンピテント細胞を含んでいた。これらは全てSt
ratagene (San Diego, CA)より購入した。GeneAmp PCR
試薬キットはRoche (Branchburg, NJ)より購入し、また
DNA精製キットはPromega (Madison, WI)より購入した。
PCR増幅用のオリゴヌクレオチドプローブは、IDT Inc.
(Coralville, IA) によって合成された。他の全ての試
薬はSigma (St. Louis, MO)から購入した。野生型膣ト
リコモナスはAmerican Type Culture Collection (Rock
ville, MD)より購入した。
【００９４】PCR反応の条件は以下の通りであった。す
なわち、94℃で１分間変性、50℃で２分間アニーリング
および72℃で２分間伸長を35サイクル実施した。これに
続いて72℃で10分間、最終伸長工程を実施した。標準的
プロトコールを用いて、PCR増幅産物（Kb-ラダーマーカ
ーによって同定される1.2K bpの単一バンドとして出現
した）を回収し、NdeIおよびBamHI制限酵素によって消
化し、次にpT7-7ベクターのNdeIおよびBamHIクローニン
グ部位に連結した(pT7-7 ベクターはHarvard Medical S
chool, Boston, MAのStan Tabor博士によって提供され
た；Current Protocols in Molecular Biology, F.A. A
usubelら（編), 1990, pp. 16.2.1-16.2.11, Greene Pu
blishing and Wiley-Interscience, New York収録のTab
or, S. 「T7 RNAポリメラーゼ／プロモーター系を用い
た発現(Expression using the T7 RNA polymerase/prom
oter system)」参照）。次に、得られたプラスミドを電
気的形質転換法によって大腸菌BL21 (DE3)細胞中に形質
転換した。
【００９５】37℃で１晩インキュベートした後、アンピ
シリン含有プレートからアンピシリン耐性コロニーを選
択した。選択したコロニーの細胞を5 mlのLB培地(Fishe
r)中で37℃で１晩増殖させた。α-ケト酪酸アッセイ
（メチル-2-ベンゾチアゾリンオンヒドラゾンの反応に
基づくK. Sodaら, Methods in Enzymology, 143, 459-4
65, 1981 の方法の改変法を使用）および／またはH2Sを
生成させ定量する脱チオメチル化アッセイ(A.E. Brauns
teinら，Biochimica et Biophysica Acta, 242, pp. 24
7-260, 1971参照）（これらのアッセイは両方とも以下
に直接記述する）における粗製培養抽出物の酵素活性に
基づいて適切なクローンを選択した。
【００９６】また、含有するプラスミド（これもpT7-7
に基づく発現ベクターpAC2-11)がホモシステイナーゼを
コードする配列を２コピー（これらはタンデムに存在す
る）含むという点でのみ異なっている大腸菌BL21 (DE3)
pAC2-1クローンの変異型をも構築した。大腸菌BL21 (D
E3) pAC2-11と称するこの特定のクローンは、本発明の
診断方法に用いるための組換えホモシステイナーゼの高
レベル発現をもたらす。すなわち、２コピーのコード配
列はpT7-7のNdeIとBsp106I 部位の間に配置されてい
た。第１のコピーはNdeIからBamHI の間に、第２のコピ
ーはBamHI からBsp106I の間に連結されていた。組換え
ホモシステイナーゼはpAC2-1またはpAC2-11クローンか
ら同じ方法によって精製することができる。α-ケト酪酸／ピルビン酸アッセイ このアッセイの第１工程において、10μM リン酸ピリド
キサールおよび異なる濃度(25μM ？25 mM)のDL-ホモシ
ステインまたはL-メチオニンまたはL-システインをそれ
ぞれ含む容量1 mlの100 mMリン酸緩衝液(pH 8.0)を、約
1-100 単位のホモシステイナーゼ("HCYase")酵素を供給
するのに十分な量（典型的には50μl )の粗細胞抽出物
（細胞を超音波処理し、遠心後上清を回収したもの）サ
ンプルと共に37℃で10分間インキュベートした。0.1 ml
の50% TCAを添加することによって反応を停止させた。
次に、Eppendorf 遠心機を用いて懸濁物を13k rpmで２
分間遠心した。上清の0.5 mlサンプルを、0.8 mlの1 M
酢酸ナトリウム(pH 5.2)に溶解した0.5 mlの0.05% 3-メ
チル-2-ベンゾチアゾリンオンヒドラゾン("MBTH")に添
加し、50℃で30分間インキュベートした。各サンプルに
ついて分光測光法によりOD320で反応生成物の量を測定
した。タンパク質の量はウシ血清アルブミンを標準とし
てBio-Rad 500-0006キット(Bio-Rad, Richmond, CA)を
用いて測定した。酵素の比活性をタンパク質1 mgあたり
の単位として計算した。ここで酵素の１単位とは、１分
間にホモシステインから1 μmolのα-ケト酪酸の形成を
触媒する量と定義される。当然ながら、このアッセイ方
法は１アッセイ試験あたり例えば1-100単位の酵素を供
給する精製ホモシステイナーゼサンプルに対しても用い
ることができる。脱チオメチル化スクリーニングアッセイ 上記のように、用いたアッセイはA.E. Braunsteinらの
方法(前掲)の改変法である。標準的反応混合物はリン酸
カリウム緩衝液(pH 7.5, 100 mM)、酢酸鉛(0.33 mM)、
および1-100単位のホモシステイナーゼを供給するのに
十分な粗細胞抽出物から成っていた。この混合物に、反
応混合物の全容量が1.5 mlとなるように異なる濃度(5μ
M -100μM)の基質DL-ホモシステインまたはL-システイ
ンまたはL-メチオニンを添加した。37℃で10分間インキ
ュベートした後、分光光度計を用いてOD360で硫化鉛の
測定を行なった。このアッセイ方法は例えば１アッセイ
試験あたり1-100単位の酵素を供給する精製ホモシステ
イナーゼサンプルに対しても用いることができる。
【００９７】生成物ホモシステイナーゼの精製 上記の初期アッセイスクリーニングを行なった後、DEAE
Sepharose Fast Flowクロマトグラフィー（pAC2-1クロ
ーンから得られた酵素活性プロフィールについては図３
参照）またはニッケル-NTAアフィニティークロマトグラ
フィー（pAC2-1クローンから得られた酵素活性プロフィ
ールについては図４参照）を含むプロトコールを用い
て、有望なクローン由来のホモシステイナーゼ("HCYase
s")を精製した。細胞増殖条件 特定のクローンに対応する冷凍大腸菌ストック10μl
を、10μg/mlのアンピシリンを含む5 mlのLB培地(Fishe
r)に播き、穏やかに振とうしながら(300 rpm) 30℃で１
晩培養した。次に、500 mlのフラスコに入れた２つの新
鮮な100 ml容量のLB培地中に培養物を分割し、300 rpm
で振とうしながら30℃で6 時間さらに培養した。次に全
培養物を800 mlのLB培地を含む各6 リットルの18個のフ
ラスコ中に分割した。300 rpmで37℃にて１晩増殖を継
続させ、約10というOD600を達成した。次に細菌を4000g
で遠心分離して増殖培地を新鮮なLB培地に交換し、そし
て再度37℃および300 rpmでさらに６時間インキュベー
ションを続けた。OD600が20に達した時、4 ℃で4000gで
10分間遠心することにより細菌を集菌した。上記方法の
広範な変法もまた有効であることが認められるであろ
う。クロマトグラフィーに先立つ前処理 細菌ペレットを、抽出液(20 mMリン酸カリウム、10μM
リン酸ピリドキサール及び0.01% β-メルカプトエタノ
ール、pH 9.0)に懸濁し、次にキャビテーター(cavitato
r)型ホモジナイザー（モデルHC 8000, Microfluidics C
orporation, Newton, MA)を用いて破壊した。冷却遠心
機(Sorvall製、Superspeed RC2-B)を用いて8000gで4 ℃
で30分間この懸濁物を遠心した。次に上清を回収し、50
℃で1 分間加熱し、限外濾過にかけた。限外濾過には、
10 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 8.3)を含む2.5 ft2圧力
カートリッジを用いた分取はかり装置(preparatory sca
ledevice)（モデルTFF PLHK 100k, Millipore, Bedford
MA)を用いた。限外濾過の間、pHは7.2に調節した。クロマトグラフィー条件 - 第１カラム 上記に由来する濃縮物（pH 7.2)を、40 mM KCl-PPM緩衝
液(40 mM塩化カリウム、10 mMリン酸カリウム、10μMリ
ン酸ピリドキサール、0.01% β-メルカプトエタノー
ル、pH 7.2)に溶解した充填容量2400 mlのDEAE Sepharo
seRFF(Pharmacia,Uppsala, Sweden)を含有する第１カラ
ム（直径100 mm x 30 cm)に加えた。上記タンパク質サ
ンプルのローディングの後、約10容量の40 mM KCl-PPM
緩衝液を用いて、OD280が0.1 以下に低下するまでカラ
ムを前洗浄した。次に、PPM緩衝液中で40-300 mM KClの
線勾配を用いてタンパク質を溶出し、溶出液を500 mlの
画分として回収した。ホモシステイナーゼを含む画分を
それらの黄色い色および活性アッセイによって同定し
た。クロマトグラフィー条件 - 第２カラム 80 mM KClおよび10 mMリン酸カリウムを含む溶液(pH 8.
3)を外液として24時間透析した後、回収した溶出液（約
2-5 mg/mlは、合計5-10 gのタンパク質の回収に相当す
る）を第２カラムに加えた。ローディング後、80 mM KC
lおよび10 mMリン酸カリウムを含む溶液(pH 8.3)４容量
を用いて（流速約6-8 ml/分で）、OD280が0.1 以下に低
下するまで第２カラム（DEAE SepharoseRFFを充填したP
harmaciaXK 50/30、容量500 ml、直径50 mm x 25 cm)を
前洗浄した。次に、10 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 8.
3)中で80-300 mM 塩化カリウムの線勾配を用いてホモシ
ステイナーゼを溶出した。溶出液を300 mlの画分として
回収し、そして黄色い色およびホモシステイナーゼ酵素
活性によって活性画分を同定することができた。この方
法で精製したホモシステイナーゼの酵素活性（ホモシス
テイン、システインおよびメチオニンに対する）の結果
は後述する実施例８で論じる（図３も参照されたい）。
【００９８】または、付加的な２段階戦略を用いること
ができる。第１段階では、分配(partitioning)材料はDE
AE SepharoseRFFで、ローディングおよび前洗浄は20 mM
リン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.2を用いて実施した。タ
ンパク質の溶出は20 mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.
2（溶液Ａ）から20 mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.
2、500 mM NaCl（溶液Ｂ）への線勾配(8 ml/分）を用い
て実施した。第２段階では、分配材料はフェニル Sepha
roseR6-FFで、ローディングおよび前洗浄は20mMリン酸
ナトリウム緩衝液(pH 7.2)に溶解した0.6 M NH4SO4を用
いて実施した。タンパク質の溶出は、0.6 M NH4SO4, 20
mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.2（溶液Ａ）から20
mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.2（溶液Ｂ）への線勾
配(5 ml/分）を用いて実施した。以下の精製結果はこの
付加的方法によって得られた。上記の細胞溶解物は、84
00単位のホモシステイナーゼを比活性（単位/mg) 5.2で
含んでいた。プレカラム(pre-column)操作の完了後、比
活性64で6,300単位を回収した（収率約75%)。DEAE Seph
aroseRFF工程（第１カラム）の完了後、5,040単位を比
活性172で回収した（収率60%)。フェニルSepharoseR6-F
F工程（第２カラム）の完了後には、4,200単位が比活性
300で残っていた（収率50%)。得られたホモシステイナーゼの分析 HPLC分析のため、L-6200A Intelligentポンプ（Hitach
i, Ltd.、東京、日本）をSupelco ProgelTM TSKカラム
(G3000 SWXL, 30cm x 7.8mm, Supelco, Bellefonte, P
A)と共に使用した。典型的には、20μlサイズのサンプ
ル（約0.1-0.5 mg/mlのタンパク質を含む）をカラムに
加え、0.12 M NaCl, 10 mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH
7.2)を含む溶液を用いて流速約1 ml/分で溶出した。分
光光度計(Hitachi U2000)を用いて波長280 nmでタンパ
ク質含有画分を同定した。ウシ血清アルブミン(MW 66,0
00)およびサツマイモ由来β-アミラーゼ(MW 200,000)(S
igma, St. Louis, MO)を分子量標準として用いた。得ら
れた保持時間は、BSA 8.88分、β-アミラーゼ7.82分、
および生成物ホモシステイナーゼ8.28分であった。
【００９９】非還元性7.5%または10%ポリアクリルアミ
ドを用いてあらかじめ形成したプレートを0.2 M Tris-
グリシン緩衝液(pH 8.3)中に入れ、0.1%のSDSの存在下
または不在下で、得られたタンパク質の電気泳動を実施
した。使用した分子量標準はKaleidoscope Prestained
Standards (Bio-Rad, Richmond, CA)であった。生成物
ホモシステイナーゼは0.1% SDSの存在下では約43 kDの
単一バンドとなり、0.1%SDSの不在下では約172 kDの単
一バンドとなった。
【０１００】次に、ACGT Inc. (Northbrook, IL)によっ
て、T7 DNAポリメラーゼおよびジデオキシヌクレオチド
終結反応法を用いて、適切なクローンのDNA配列決定が
実施された。プライマーウォーキング法(primer walkin
g method)が用いられ、そして配列はDNA分析器を用いて
分析された。Ni-NTA法を用いた、6xヒスチジンのタグを付けた(tagge
d）タンパク質としてのホモシステイナーゼの精製 大腸菌由来の組換えホモシステイナーゼを精製する別の
方法は、ニッケル-NTAアフィニティークロマトグラフィ
ーの使用を含む。この技術は、NTA樹脂マトリックス中
に固定されたニッケルカチオンに対するタンパク質ヒス
チジンイミダゾールの親和性を利用するものである。こ
の技術(Qiagen Company, Germany) を十分利用するため
には、６個の付加的ヒスチジン残基からなる配列がホモ
システイナーゼの天然のMet1のＮ末端側に（好ましくは
発現されるべきDNAコード配列を改変することによっ
て）付加される（上記実施例７および配列番号９および
10参照）。
【０１０１】この精製法にしたがって（さらなる情報に
ついては、Qiagenから入手可能なThe QIAexpressionis
t, A handbook for high level expression and purifi
cation of 6xHis-tagged proteins, 1997年3月、第３版
をも参照されたい）、大腸菌BL21 (DE3)、クローンpAC2
-1の稠密に増殖した培養物100 mlを遠心により集菌し、
得られたペレットを4 mlの溶菌緩衝液(300 mM NaCl, 10
mMイミダゾール, 50mM NaH2PO4, pH 8.0)に再懸濁し
た。次に、この細菌懸濁物を氷上で1 分間超音波処理し
た。
【０１０２】ベンチトップ遠心機セットを最大スピード
で20分間用いて細胞破砕物を除去した。次に、清澄な上
清を1 mlのNi-NTAスラリー(Qiagen)と混合し、氷上で60
秒間穏やかに振とうして吸着させた。次に混合物を使い
捨てポリプロピレンカラムに移し、通過画分を廃棄し
た。次に8 mlの洗浄緩衝液(300 mM NaCl, 20 mMイミダ
ゾール, 50 mM NaH2PO4, pH 8.0)を用いてNi-NTA樹脂ビ
ーズを洗浄した。その後、2 mlの溶出緩衝液(300 mM Na
Cl, 250 mMイミダゾール, 50 mM NaH2PO4, pH 8.0)を用
いて溶出することによって組換えタンパク質を最終的に
回収した。次に精製タンパク質を上記のように特徴づけ
た。この様式で精製したホモシステイナーゼの酵素活性
（ホモシステイン、システインおよびメチオニンに対す
る）の結果を以下の実施例８に記述する（図４も参照さ
れたい）。 〔実施例８〕 本発明のホモシステイナーゼの代表的触
媒特性 図２から４は、単一工程アッセイのための本発明のホモ
システイナーゼの大幅に増大した有用性を明示してい
る。図２に示す結果は、pAC2-1クローンを含む宿主大腸
菌細胞の粗溶解物の使用を反映し、３つの基質（ホモシ
ステイン、システインおよびメチオニン）のそれぞれが
別個のアッセイにおいて25 mMで存在した場合の、それ
ぞれに対する比活性（単位/mg)を示している。図３およ
び４に示す結果は（同様にpAC2-1クローンを含む大腸菌
について）、精製酵素調製物のホモシステイン、システ
インおよびメチオニンに対する相対活性を反映する。図
３に示すアッセイのためには、酵素を実施例７に記述し
たDEAE Sepharose Fast Flow法を用いて精製した。図４
のためには、ニッケル-NTAアガロースアフィニティー試
薬を含む実施例７の精製方法が用いられた（方法につい
ては、上記の「α-ケト酪酸／ピルビン酸アッセイ」と
題した項目を参照されたい）。
【０１０３】宿主大腸菌細胞由来の組換えホモシステイ
ナーゼを精製するには多数の方法を使用できることが十
分認識される。具体的に示すように、本発明の新規なホ
モシステイナーゼは、システインまたはメチオニンに対
して示された活性よりも典型的には100倍、そして時に
は約1000倍も高い活性をホモシステインに対して示す
（本発明のアッセイを用いた場合、例えば実施例１参
照）。 〔実施例９〕 単一工程／単一酵素臨床アッセイ 生物学的液体中のホモシステインについての多工程／多
酵素アッセイにおける処置は、ホモシステイナーゼ新規
種の基質特異性を利用するために、簡略化された単一工
程／単一酵素アッセイ用に容易に適合させられることが
直ちに認識されるであろう（本明細書では、「単一工程
アッセイ」および「単一酵素アッセイ」という用語は、
システインおよび／またはメチオニンの存在下でホモシ
ステインを正確に測定するために生物学的サンプルをた
だ１つの酵素に接触させればよいことを示すために相互
交換可能に使用される）。このような方法に適切なホモ
システイナーゼの濃度は、実施例１または本明細書のど
こかに記述された濃度と概して等しいか、または容易に
決定される。
【０１０４】本明細書の単一酵素診断法によれば、シス
テインおよび／またはメチオニンの混入濃度に由来する
干渉なしに、貴重な診断的情報を医師に提供するのに十
分な正確さで、全血、血漿、血清、尿または組織液、等
の生物学的サンプル中のホモシステイン濃度を測定する
ことができる。このような診断アッセイは迅速かつ正確
で、最小限の試薬しか必要としない。それゆえ臨床ラボ
において、また公衆衛生測定法として大規模スクリーニ
ング操作に適用できる。
【０１０５】代表的例においては、正常な血漿中のシス
テイン濃度は約30-120μM（マイクロモル）であるが、
ホモシステイン濃度は約5-15μM にすぎない。当技術分
野において認識されているように、血漿中のホモシステ
イン濃度が15μM レベルより上昇すると、患者の心臓血
管疾患への危険が重大に増大しうる。数百マイクロマル
までのホモシステインレベルを有する高リスク心臓血管
疾患患者が同定されている。同様に、システイン代謝障
害によって影響された患者は500 または1000μMまでも
システインレベルが上昇しうる。本発明の診断キット
は、０マイクロモル（典型的には10マイクロモル）から
約1000マイクロモルまたはそれ以上のシステインをも含
む生物学的液体中のホモシステイン濃度を例えば1-500
マイクロモルの範囲で測定するのに有用である。
【０１０６】本発明の好ましい実施によれば、ホモシス
テイナーゼが提供される。この酵素のホモシステインお
よびシステインに対する相対活性は以下の通りである。
すなわち、生成物硫化水素を検出することにより患者サ
ンプル中で測定されたホモシステインの見かけ濃度（こ
れはシステインからの寄与も反映している）は、実際の
ホモシステイン濃度の約150%、好ましくは約110%、そし
て最も好ましくは約102%よりも少ない。本発明のさらに
好ましい例においては、例えばpAC2-1から発現された新
規なトリコモナスホモシステイナーゼを用いて単一酵素
アッセイで測定したホモシステインの見かけ濃度は、シ
ステインからのわずか約1%の偽の寄与を反映するのみで
ある。
【０１０７】本発明の実施によれば、このような単一酵
素アッセイ法（ホモシステイナーゼとして例えば配列番
号10を用いる）は、ホモシステインおよびシステインの
両方（および場合によりメチオニン）の広範な天然濃度
（および濃度の比）に対して適用可能である。したがっ
て、このアッセイ法は健常な被験者および疾患、特に心
臓血管疾患の危険がある被験者の両方の体液化学を正確
に反映することができる。
【０１０８】したがって、本発明はその最も好ましい態
様において、被験者の生物学的液体中のホモシステイン
濃度を測定する単一酵素アッセイに用いるための診断キ
ットを提供する。このキットは以下のものを含み、
（ａ）ホモシステイナーゼ酵素；および（ｂ）ホモシス
テイナーゼのホモシステインに対する反応によって形成
される生成物硫化水素の量を測定するのに用いうる少な
くとも１つの試薬；ここで該ホモシステイナーゼは、該
酵素のシステインに対する反応によって生成される硫化
水素が心臓血管疾患へのリスクを評価するための該キッ
トの使用を実質的に妨げないほど、システインに対して
十分非反応性である。
【０１０９】本発明の診断キットはホモシステインおよ
びシステインの広範な濃度および相対濃度に対して有用
であるため、本発明の上首尾な実践の種々の例があるこ
とが期待される。代表的な例は以下の通りである： （１）最も一般的には、ホモシステインではなくシステ
インに帰される測定された硫化水素の画分は、資格のあ
る医師による結果の有効な解釈が必要ないほど十分小さ
くなければならない。一般に、有用な診断情報は、ホモ
システインに起因する生成された硫化水素の量が全体の
約半分である時に得られる。患者サンプルにおけるホモ
システインと比較して概して高いシステインの濃度を考
えると、このような酵素の特異性はなお明白である。し
かし好ましくは、あるアッセイで検出される全硫化水素
の画分のうち、ホモシステインに起因するものは少なく
とも90%、好ましくは95%、より好ましくは98%、そして
最も好ましくは99%以上である。例えば配列番号10によ
って表されるホモシステイナーゼを用いる本発明の実施
にしたがえば、99%というレベルは容易に獲得される。
【０１１０】（２）含有されるホモシステインの濃度が
約20マイクロモル以上である、心臓血管疾患の危険を明
示している患者サンプルのアッセイにおいて、300マイ
クロモルまたはそれ以上のシステイン濃度は検出される
硫化水素の全量に1%未満しか寄与しない。明らかに、そ
のような酵素はより大きいシステイン濃度を有する生物
学的サンプルについても非常に有用である。
【０１１１】（３）システイン：ホモシステインの濃度
比が例えば約15:1である、心臓血管疾患の危険を明示し
ている患者サンプルのアッセイにおいて、システインは
検出される硫化水素の全量に約1%未満しか寄与しない。
【０１１２】下記のことは公知ホモシステイナーゼと本
発明の新規酵素の特性の違いをさらに証拠づける。
【０１１３】膣トリコモナスから単離されたホモシステ
イナーゼ（これは２つ以上の遺伝子からの発現を表す場
合がある）は、ホモシステインに対して約0.5 mMという
Km値をもつことが報告された（前出のLockwoodら，1991
参照）。これに対して、pAC2-1クローンから発現された
新規酵素について測定されたKm値は（すべて37℃、pH8.
0で）、ホモシステイン、システインおよびメチオニン
に対してそれぞれ4.8mM, 3.45 mM および3.1 mMであ
る。
【０１１４】Kmの計算値は、10μMリン酸ピリドキサー
ルおよび異なる濃度(10 μMから1.6mM)のDL-ホモシステ
イン、L-メチオニンまたはL-システインをそれぞれ含む
容量1 mlの100 mMリン酸緩衝液(pH 8.0)中で、50μlの
酵素(300単位/ml)を用いて37℃、pH 8.0で10分間実施し
たアッセイから決定した。0.1 mlの50% TCAを添加して
反応を停止させた。次に、Eppendorf遠心機を用いて、
得られた懸濁物を13 krpmで2 分間遠心した。次に上清
の0.5 mlサンプルを、0.8 mlの1 M酢酸ナトリウム(pH
5.2)に溶解した0.5 ml容量の0.05% 3-メチル-2-ベンゾ
チアゾリンオンヒドラゾンに添加し、50℃で30分間イン
キュベートした。次に分光測光法によりOD 320で反応生
成物の量を測定した。図５に示すKcat（ターンオーバー
数）値は、標準的速度論式およびプロットを用いてVmax
値の計算から決定した。
【０１１５】pAC2-1クローンから発現された酵素の速度
論は野生型酵素のそれとは全く異なることが明らかであ
る。本発明の付加的態様は以下の認識を含む。すなわ
ち、向上した速度論的特性を提供するために膣トリコモ
ナス酵素のアミノ酸配列におけるある変化が記述された
が、当業者はこれを達成する他の可能性のある作用機構
を認めるであろう。その１例は、活性部位または非活性
部位における該酵素の共有結合修飾である。ホモシステ
イナーゼを改変するそのような他の方法は、もしそれが
本明細書に初めて開示されたような速度論的特性を有す
る酵素の生成をもたらすならば、本発明の実施の範囲内
にある。 〔実施例1０〕 γ-グルタミルシステインシンテターゼ
に基づくアッセイ技術 酵素γ-グルタミルシステインシンテターゼ（EC 6.3.2.
2、グルタミン酸-システインリガーゼとも呼ばれる）
は、生物学的サンプル中のホモシステインについてのア
ッセイの正確さを高めるために用いることができるもう
１つの酵素である。この酵素は、生きている細胞中で多
くの重要な機能を有するトリペプチドであるグルタチオ
ン（γ-L-グルタミル-L-システイニルグリシン）の合成
における第１段階であってかつ律速段階である段階を触
媒する。代謝経路においてグルタチオンが果たす重要な
役割を認めるならば、γ-グルタミルシステインシンテ
ターゼが基質システインの代替物としてホモシステイン
を受け入れることはまずないだろうと思われる。したが
ってこの酵素の使用は、干渉するシステインを除去する
ことにより生物学的サンプル中のホモシステインの高度
に特異的な測定（ホモシステイナーゼによる）に寄与す
る。好ましい例においては、アッセイは直接酵素的減法
（実施例３参照）を用いて実施される。パートＡ - 大腸菌γ-グルタミルシステインシンテター
ゼをコードするDNAの発現 本明細書の主な達成は、生物学的サンプル中のホモシス
テイン濃度の正確な測定をもたらす、感受性の高い、酵
素に基づくアッセイ法である。先に述べたように、多種
類の生物学的サンプルにおいて、システインの天然の濃
度はホモシステインの測定に干渉する。以下の記述する
ように、特に好ましい酵素に基づくホモシステインのア
ッセイは２つの酵素の使用を含む。すなわち、(1)ホモ
システインに対して高い特異性を有し、かつシステイン
に対して非常に低い特異性を有するホモシステイナーゼ
（pAC2-1から発現される膣トリコモナス酵素、配列番号
10等）、および(2)その使用がシステインからの干渉を
さらに減少させる、クローンGSH-I His（下記参照）等
に由来するγ-グルタミルシステインシンテターゼであ
る。
【０１１６】この多酵素アプローチの価値がいったん認
識されたならば、使用されたγ-グルタミルシステイン
シンテターゼ酵素は多様な供給源（例えば、ブタ肝臓、
小麦胚芽、ウシ水晶体、ラット肝臓、またはProteus mi
rabilisもしくは大腸菌Ｂを含む細菌）から提供されう
ることが直ちに理解されるであろう。γ-グルタミルシ
ステインシンテターゼ酵素はこのような供給源から公知
の方法によって精製することができる。または、例えば
大腸菌等の原核宿主細胞から、または組換え発現につい
て有用であると一般に認められている真核細胞から組換
えによって発現させることができる。適切な大腸菌株は
大腸菌BL21 (DE3)、HB 101およびJM 109を含む。
【０１１７】このアプローチの広範な有用性を認めるな
らば、本明細書の教示に基づいて臨床家には広範囲な特
定のアッセイ条件、酵素濃度、検出色素団、等が使用可
能であるということも直ちに明らかとなろう。例えば、
大腸菌γ-グルタミルシステインシンテターゼ (gsh I)
遺伝子のヌクレオチド配列がK. Watanabeら(NucleicAci
ds Research, 14(11), pp. 4393-4400, 1986およびそこ
に引用されている文献を参照されたい）によって報告さ
れている。518アミノ酸から成るオープンリーディング
フレームが推定され、普通でない(unusual)コドンであ
るTTGが翻訳開始点(Met1)であると決定された。該酵素
およびその機能もまた分子レベルで特徴づけられ、その
発現および精製方法が記述されている(Y. Inoueら，App
lied Microbiology and Biotechnology, 38, pp. 473-4
77, 1993)。
【０１１８】本発明の実施においては、大腸菌γ-グル
タミルシステインシンテターゼ遺伝子をクローン化する
ため、大腸菌HB 101のゲノムDNAを単離し、PCRの鋳型と
して用いた。プライマーは、コード配列を２つの重複す
る断片として増幅できるように選択された。選択された
プライマーは小さいほうの遺伝子断片に対応するGSH-1
およびGSH-2、ならびに大きいほうの遺伝子断片に対し
て同様に選択されたGSH-3およびGSH-4であった。また、
普通でない開始コドンTTG（下記のGSH-1、配列番号15参
照）をATGに置換した。
【０１１９】プライマーGSH-1からGSH-4までのヌクレオ
チド配列は以下の通りであった（ヌクレオチド番号は、
オープンリーディングフレームを含むとK. Watanabeら
によって報告されている単離された2098 bp HincII-Pst
I制限断片に基づいて、K. Watanabeらの第4396頁に使用
されているものと対応するように割り振った）： GSH-1（センス鎖）： 5'-atcgctag[ca tatg1]atcccg gacgtatcac ag-3' これはコードヌクレオチド第338-358 (K. Watanabeら）
を含み、配列中の[catatg1]はMet1をコードしてNdeI部
位をもたらす（配列番号15）； GSH-2（アンチセンス鎖）： 5'-atcaccatcc actggtgtaa tg-3' これはヌクレオチド第541-562 に対応している（配列番
号16）； GSH-3（センス鎖）： 5'-ctaccgattt tgcggaag-3' これはコードヌクレオチド第510-527 に対応している
（配列番号17）；およびGSH-4（アンチセンス鎖）： 5'-catgacggat cctcaggcgt gtttttccag-3' これはヌクレオチド第1877-1894に対応しており（1894
は終止コドン）、12個の付加的ヌクレオチドが結合され
ている（配列番号18）。得られたタンパク質のＮ末端に
オリゴ（６量体）ヒスチジンタグを付けるため（上記実
施例７も比較されたい）、プライマーGSH-1Hをコードす
る配列の5'末端に一連の連続ヒスチジンコドン(CAT/CA
C)を下記のように含ませた（次に、GSH-1の代わりにGSH
-1HをGSH-2と共に使用し、また上記のように普通でない
開始コドンを置換した）： GSH-1H : 5'-ATCGCTAG CAT ATG CAT CAT CAT CAT CAT CAC ATG
（もとのMet1）ATC CCG GACGTA TC-3' （配列番号19） 適切な発現プラスミドを構築するため、上記の小さい方
の断片をNdeIおよびEcoRIで消化し、大きい方の断片をE
coRIおよびBamHIで消化した。次に、両方の断片を、あ
らかじめNdeI/BamHIで消化したpT7-7プラスミド(NdeI
およびBamHI 部位を含む）との３者間連結(3-way ligat
ion)に用いて、プラスミドpGSH-IおよびpGSH-I-HIS（こ
れらはＮ末端のヒスチジンタグのコード配列において異
なっているのみである）を作製した。RE分析によって正
しいクローニングであることを確認した。次に該プラス
ミドを大腸菌BL21 (DE3)細胞中に形質転換し、タンパク
質少量調製物(miniprep)を調製して組換えタンパク質の
発現を確認した。
【０１２０】実施例７にpAC2-1膣トリコモナスホモシス
テイナーゼの精製について記述した方法を用いて、ニッ
ケル-NTAアフィニティークロマトグラフィーによって、
大腸菌BL21 (DE3)より十分なγ-グルタミルシステイン
シンテターゼを精製した。パートＢ - γ-グルタミルシステインシンテターゼおよ
びZn(OH)2トラッピングを用いたアッセイ法 本発明の実施よれば、γ-グルタミルシステインシンテ
ターゼを用いて生物学的サンプルからシステインを枯渇
させた後、いくつかの方法のうち任意の方法によって
（好ましくはホモシステイナーゼの使用を含む方法によ
って）、得られた１以上の反応生成物を検出して、該サ
ンプル中のホモシステイン濃度の測定を実施することが
できる。
【０１２１】有効なアッセイ法のさらなる例を以下に提
示する。この方法は、ホモシステイナーゼ反応において
生成される硫化水素を効率的に消費する反応においてin
situで生成されるメチレンブルーの比色検出を含む。
この方法は、色素分子メチレンブルー（メチルチオニン
クロリド）の可視域（740 nm等）における効率的な検出
を利用するものである。特に、メチレンブルーは硫化水
素の存在下で塩化第二鉄を用いたN,N-ジメチル-p-フェ
ニレンジアミン("NDPD")の酸化によって生成される。こ
の反応機構の変法においては、N,N-ジメチル-p-フェニ
レンジアミンの代わりにN,N-ジエチル-p-フェニレンジ
アミンが用いられ、その結果比色検出が約５倍まで増大
する。当技術分野において認められるように、第二鉄の
他の供給源も適切である。
【０１２２】本開示に照らして、当業者はサンプル中の
ホモシステインを検出するために多数の方法が使用でき
ることを認めるであろうが、この「メチレンブルー法」
は大量サンプルの迅速で、正確で、かつ経済的なスクリ
ーニングが要求される臨床環境で特に有用であることが
見いだされた。
【０１２３】この方法を説明する手順を以下の通り実施
した。すなわち、ヒト血清サンプルをリン酸緩衝化生理
食塩水で1:1に希釈し、次にAmicon 30k Centriprepを用
いて4,000 rpmで60分間4 ℃で遠心して限外濾過により
タンパク質を除去した。このタンパク質を除去され希釈
された血清を回収し、アッセイに使用するため1 mlアリ
コートに分割しEppendorf試験管に入れた。以下に記述
する方法で遊離のホモシステインを測定した。プロコー
ルの適切な時点に還元工程（例えば、5 mMβ-メルカプ
トエタノールの添加）を含むことにより、ジスルフィド
２量体（ホモシステインまたはシステイン／ホモシステ
インヘテロ２量体）として存在する、またはタンパク質
にジスルフィド結合したものとして見いだされる全血清
ホモシステインの画分も測定することが可能である。し
かし、タンパク質（γ-グルタミルシステインシンテタ
ーゼおよびホモシステイナーゼを含む）を不活性化する
そのような試薬の能力を考慮するならば、還元剤（下記
参照）としては例えばγ-グルタミルシステインシンテ
ターゼまたはホモシステイナーゼを不活性化することな
くホモシステインのジスルフィド結合を還元することが
できる特殊化された化合物を選択することが好ましい。
【０１２４】これらのプロトコールにおいては、アッセ
イの再現性を確かめる確認を最初に実施した。したがっ
て、第１試験においては、血清（1:1 に希釈し、タンパ
ク質を除去したもの）を入れた別個の試験管に最終濃度
が1 μM、5 μM、10μM、15μMおよび20μMとなるよう
に異なる量のホモシステインを添加した。ホモシステイ
ナーゼ（pAC2-1、配列番号10から発現された膣トリコモ
ナス酵素または野生型Pseudomonas putida酵素）の50μ
l アリコートを各試験管に添加し、(H2Sを保持するた
め）各試験管の蓋をきっちり閉めて37℃で20分間インキ
ュベートした。100 μlの1 M NaOHを混合しながら添加
して反応を停止し、その後直ちに0.3 mlのトラッピング
溶液（溶液Ａ）をさらに添加し、迅速に混合し、13,000
rpmで1 分間遠心した（溶液Ａは4 gのNaOH、2.94 gの
クエン酸三ナトリウムおよび10 gの酢酸亜鉛を1 Lの水
に溶解して調製した）。次に各試験管の上清を捨て、ペ
レットを0.15 mlの溶液Ｂ（6N HCl中に2.7% w/v FeCl3)
に溶解し、0.75 mlの溶液Ｃ（1N HCl中に0.2% w/v NDP
D)を添加した。内容物を完全に混合し、つぎに試験管の
蓋を閉じて室温で30分間インキュベートした。ホモシス
テイナーゼ反応で生成されたH2S を反映する生成物メチ
レンブルーの濃度を分光光度計の740 nmで読んだ。結果
の線形性は組換えPseudomonas putidaおよび膣トリコモ
ナス酵素の両方について良好であった。
【０１２５】類似した１組のアッセイを実施した。ここ
では、システイン濃度が１から20マイクロモルの間にな
るように血清を調節した。組換え産生した膣トリコモナ
ス酵素（配列番号10、クローンpAC2-1由来）および組換
え産生した野性型Pseudomonas putida酵素に対する結果
を比較すると、この実験は以下のことを示した。すなわ
ち、両酵素がホモシステインに対して示す高い活性にも
かかわらず、pAC2-1変異型はシステインに対してはるか
に低い活性を有し、そのため好ましいということであ
る。
【０１２６】以下の方法は、クローンpAC2-1由来の膣ト
リコモナス酵素および大腸菌Ｂ由来のγ-グルタミルシ
ステインシンテターゼの好ましい組み合わせの使用を示
す。アッセイの１例においては、密封可能なEppendorf
試験管中に、10 mM L-グルタミン酸、2 mM ATP、25 mM
MgCl2を含有するように1 mlのインキュベーション混合
物を調製し、100 mM Tris-HCl, pH 8.0を用いて緩衝化
し、そしてクローンGSH-I His由来の組換えγ-グルタミ
ルシステインシンテターゼ5 μgおよび例えば約50マイ
クロモルのホモシステインを送達するのに十分な量の生
物学的サンプルを該混合物に含ませた。試薬は下記のス
トック液から下記の順序で試験管に加えるのが好ましい
ことに注意されたい： (1) 700μlの水 (2) 100μlの1 M Tris, pH 8.0 (3) ホモシステイン／システイン含有サンプル（約50
μl)、または他の適切な量 (4) 100μlの100 mM L- グルタミン酸 (5) 20 μlの100 mM ATP (6) 10 μlの2.5 M MgCl2 および (7) 10 μlの0.5 mg/ml クローンGSH-I His由来組換え
γ-グルタミルシステインシンテターゼ 内容物を25℃で30分間インキュベートし、その後10μl
のホモシステイナーゼ酵素(4.5 mg/mlの膣トリコモナス
酵素、配列番号10、クローンpAC2-1由来）を添加し、バ
イアルを密封し、37℃で20分間さらにインキュベートし
た。100 μlの1M NaOHを混合しながら添加してH2S の生
成を停止させ、次に300 μlの溶液Ａを混合しながら添
加し、その後試験管を13,000 rpmで45秒間上記のように
遠心した。上清を全て注意深く除去した後、ペレットを
150 μlの溶液Ｂに再懸濁し、750μl の溶液Ｃを添加
し、室温で20分間さらにインキュベートした。メチレン
ンブルーの生成を可視域内で、最も好ましくは約650か
ら750 nmでモニターした。
【０１２７】文献はγ-グルタミルシステインシンテタ
ーゼが約45℃で至適に機能しうると報告しているが、本
発明の実施においてこの酵素は25℃で極めて良好に機能
することが見いだされたことをここに書き留める。
【０１２８】先に述べたように（実施例４参照）、生物
学的サンプル中に存在するホモシステインのかなりの画
分が他の生物学的分子に結合している可能性がある。そ
して、ホモシステインのこのような「保存」形態は、病
理学的プロセスに寄与すると考えられる。したがって、
ホモシステイン濃度を測定する場合、濃度はこれら他の
形態をも含むことが望ましい。全ホモシステイン濃度へ
の主要な寄与物は、(1)ホモシステイン２量体、(2) ホ
モシステイン／システインヘテロ２量体、および(3) ホ
モシステインとタンパク質のコンジュゲート（ここでホ
モシステインはジスルフィド結合によりタンパク質シス
テインに結合している）を含む。本発明の実施によれ
ば、ジスルフィド結合還元剤の適切な使用によって、こ
のような付加的ホモシステイン濃度の合計が正確に測定
される。全てのジスルフィド結合還元剤がこの機能に特
に適しているわけではない。なぜなら、それらはホモシ
ステイナーゼまたはγ-グルタミルシステインシンテタ
ーゼ中のジスルフィド結合を還元する能力を示し、チオ
ール交換反応に関与し、または酵素チオール基と直接反
応し、それによって酵素の活性を変更してしまうからで
ある。このようなあまり好ましくない作用物質の１つは
β-メルカプトエタノールである。
【０１２９】本発明の実施に潜在的に有用なジスルフィ
ド還元剤は、Molecular Probes Inc., Eugene, ORより
入手可能なトリス-(2-カルボキシエチル) ホスフィン("
TCEP")である。この還元剤は100 mMストック液として新
鮮に調製することができる（使用に際しては試験管サン
プル1 mlあたり10μlの割合）。そして、好ましくはホ
モシステインを含有する生物学的サンプル自体に添加す
る直前にバイアルに分注する。当業者によってこれ以外
にも適切な還元剤が認められるであろう。事実、DTTは
最も好ましい還元剤であり、アッセイ酵素に対して最小
限の作用しか引き起こさないことが見いだされている。
【０１３０】本発明のこの態様は、ホモシステインおよ
びシステインを含む生物学的サンプル中に存在するホモ
システインの量を測定する方法であって、ホモシステイ
ナーゼによって触媒される反応においてホモシステイン
より生成される生成物の濃度を測定することを含み、該
生成物は該サンプル中のシステインに対する該ホモシス
テイナーゼの反応によっても生成されうるものであり、
該サンプルは他の方法においては干渉濃度であるシステ
インを含む方法であって、以下の工程： （ａ）システインからγ-グルタミルシステインへの変
換を可能とする基質の存在下で該サンプルをγ-グルタ
ミルシステインシンテターゼと共にインキュベートし； （ｂ）工程（ａ）で得られた混合物をホモシステイナー
ゼと共にインキュベートし；そして （ｃ）ホモシステイナーゼによって触媒される反応にお
いてホモシステインおよびシステインの両方から生成さ
れうる生成物の濃度を測定する、を含んでなり、ジスル
フィド結合したホモシステイン分子をホモシステイナー
ゼとの反応に使用可能にする工程が、工程（ａ）に先立
ってサンプルをトリス-(2-カルボキシエチル) ホスフィ
ンで処理することによって実施される該方法によって代
表される。生成物アンモニアの検出を含む代替法 先に述べたように、ホモシステイナーゼ反応のアンモニ
ア生成物もまた生物学的サンプル中のホモシステインを
定量するのに用いることができる。しかし、システイン
濃度によって引き起こされる干渉（これは上記の方法に
より適切に処理される）に加えて、アンモニアを検出す
るのであればメチオニンによる干渉が起こりうる。この
場合、ホモシステイナーゼ反応の間にメタンチオールの
放出によってメチオニンもまた検出されうることを認識
することにより、補正をおおむね達成することができ
る。したがって、その濃度を測定し、次にこれを引き算
すればよい。生じたメタンチオールは、反応物としてN,
N-ジメチル〔またはジエチル]-p-フェニレンジアミンを
用いて、メチレンブルー（その変異型を含む）の生成に
よってODを約510 nmで測定することにより決定すること
ができる。Tanakaら，Journal of Applied Bioshemistr
y, 2, pp.439-444, 1980を参照されたい。当技術分野で
認められているように、アンモニアはグルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼの使用を含むアッセイにおいても測定する
ことが可能で、そのような方法は本発明の実施に適合さ
せることができる。 〔実施例1１〕 硫化水素の向上した検出法 硫化水素を検出する向上した方法が開発された。この方
法は上記実施例10に提示した方法と関連している。本発
明のこの態様による診断キットは下記のように作製され
る。以下の試薬／ストック液を調製する： (a) 緩衝液 - 309 mgのH3BO3 (f.w.61.83) を90 mlの
二重蒸留水に添加し、NaOHを用いてpHを7.5に調整し、
次に二重蒸留水を用いて容量を合計100 mlとして調製さ
れる50 mM ホウ酸緩衝液(pH 7.5)のストック液。 (b) 還元剤 - 15.4 mgのDL-ジチオトレイトール("DTT")
(Sigma, St. Louis, MO)を1 mlのホウ酸緩衝液(a)に溶
解し、100 mM溶液を得る。 (c) 発色試薬Ｉ - 33.25 mgのフェリシアン酸カリウム
K3Fe(CN)6 (Sigma)を1 NHCl, 1% (w/v) Triton X-100
(Sigma)を含む10 mlの溶液に溶解し、第二鉄の10mMスト
ック液を作製する。この溶液は使用前によく混合しなけ
ればならない。 (d) 発色試薬II - 52.5 mgのN,N-ジプロピル-フェニレ
ンジアミン("DPPDA") (和光純薬、日本国）を最終濃度
が100 mMとなるまで二重蒸留水に溶解する。 (e) 組換えホモシステイナーゼ - 配列番号10によって
表される酵素（大腸菌クローンpAC2-1，ATCC 98549に由
来する）は製品 HYaseTMとしてAntiCancer Inc.,San Di
ego, CAより購入することができる。この酵素の分子量
は172,000で、比活性は40単位/mgである。この酵素は使
用前にホウ酸緩衝液を用いて４単位/mlに希釈し、アッ
セイ中は0-4 ℃に保持し、そして各使用ごとに新鮮なも
のを調製しなければならない。 (f) DL-ホモシステイン - 2.7 mgのDL-ホモシステイン
(Sigma)を2 mlのホウ酸緩衝液に添加する（最終濃度 4
mM)。校正標準として毎日新鮮なものを調製し、使用中
には0-4 ℃に保持する。（注：一般にホモシステイナー
ゼはホモシステインの天然のＬ形光学異性体のみを使用
するが、D/L 混合物は上記Ｌ形異性体の経済的供給源で
ある。有効なＬ形異性体の濃度を提供するには、当然な
がら50%という補正係数の使用を必要とする。) 代表的なアッセイプロトコールは以下の通りである。す
なわち、0.1 mlの血漿を0.9 mlのホウ酸緩衝液に加え
る。次に、10 μlの100 mM DTT溶液を加え、よく混合
し、37℃で30分間インキュベートする。30μl のHYase
TM組換えホモシステイナーゼ（ホウ酸緩衝液を用いて前
もって４単位/mlに希釈してある）を混合しながら添加
し、37℃で１分間さらにインキュベートする。次に、20
0 μlの発色試薬Ｉおよび10μl の発色試薬IIを同時に
混合しながら添加し、サンプルを37℃で20分間インキュ
ベートする。次に、分光光度計を用いて677 nmでODを測
定することによって生成物であるメチレンブルー型の色
素団を検出する。次に、構築した校正曲線（標準として
ホモシステインおよび／またはそのジスルフィド結合し
た２量体、ホモシスチンを用いることができる）からL-
ホモシステインの血漿濃度を決定する。この代表的例を
提供するにあたっては、アッセイ試薬または試薬濃度の
選択においてかなりの変動が可能であることが当然なが
ら明らかである。そのような改変は当分野の技術の範囲
内であることが直ちに認められるであろう。 〔実施例1２〕 付加的方法 以下に本発明の実施に有用であると医師が考えるかもし
れない方法の更なる例およびそれらの変法を提供する。組換え細菌の増殖 各発酵作業(fermentation run)は、Master Cell Bank
(MCB)由来の、組換えホモシステイナーゼ（pAC2-1，配
列番号９および10参照）を含む１バイアルの組換え大腸
菌からスタートした。10μl のMCB 由来細菌を5 mlのLB
培地に播き、37℃で400 rpm で振とうしながら１晩増殖
させた。培養物を6 Lのフラスコに入れた800 mlのLB培
地に移し、37℃で400 rpmで振とうしながら１晩増殖さ
せた。この時点でOD600は約10であった。4000 rpmで20
分間遠心して細菌を回収した。次に、細菌を6 Lのフラ
スコに入れた800 mlのLB培地培養物中に移し、37℃で40
0 rpmで振とうしながら16時間増殖させた。4000 rpmで4
℃で20分間遠心することにより集菌した。前カラム処理 組換え大腸菌の90x 800 mlの培養物から得た細菌ペレッ
トを混ぜ合せ、キャビテーション型ホモジナイザー(Mic
rofluidics Corp., Newton, MA; モデルHC 8000)を用い
て破壊した。ホモジネートを２容量の20 mMリン酸カリ
ウム(pH 7.2)(10μM リン酸ピリドキサール、0.01% β-
メルカプトエタノールおよび20% エタノールを含む）に
懸濁した。50℃で1 分間、該ホモジネートの熱処理を実
施した。1% (w/v)ポリエチレンイミン(PEI)を懸濁液に
加え、20分間混合した。自動冷却遠心機(Sorvall, Supe
rspeed RC 2-B)を用いて4 ℃で12,000 rpmで40分間懸濁
物を遠心して、核酸を除去した。次に上清を回収し、ポ
リエチレングリコール8000(PEG 8000)と最終濃度が10-1
2% (w/v)となるように混合し、4 ℃で60分間攪拌した。
12,000 rpmで40分間遠心して沈殿物（混入タンパク質を
含む）を除去した。次に、3.0 M 塩化ナトリウムを最終
濃度が0.12 Mとなるように上清に添加した。この濃度は
組換えホモシステイナーゼを沈殿させた。12,000 rpmで
40分間遠心遠心することによりペレットを回収し、20 m
Mリン酸カリウム緩衝液(pH 7.6)(10μM リン酸ピリドキ
サールおよび0.01% β-メルカプトエタノールを含む）
に懸濁した。DEAE-Sepharose FFクロマトグラフィー 前カラム処理した酵素サンプルを、20 mM リン酸カリウ
ム(pH 7.2)を用いてあらかじめ平衡化したDEAE-Sepharo
se FFカラム(30 x 5 cm)(Pharmacia)に加えた。カラム
のローディング後、50 mM 塩化ナトリウム、20 mM リン
酸カリウム(pH7.2)を含む溶液約３容量を用いて、OD280
が0.1以下に低下するまでカラムを前洗浄した。次に、
同一緩衝液中の塩化ナトリウム濃度の線勾配0.05-0.5 M
を用いて、90分にわたって組換えホモシステイナーゼを
溶出した。フェニル-Sepharose 6 FFクロマトグラフィー 固体硫酸アンモニウム(79.3 mg/ml)を最終濃度が0.6 M
となるようにDEAE-Sepharose FFクロマトグラフィーの
活性画分に添加した。この上清をフェニル-Sepharose 6
FF カラム(20 x 2.6 cm) に加える前に、緩衝液Ａ（20
mMリン酸カリウム、pH 7.6中の0.6 M 硫酸アンモニウ
ムからなる）を用いてカラムを平衡化した。緩衝液Ｂ
（20 mMリン酸カリウム、pH 7.6、10μM リン酸ピリド
キサール、0.02% β-メルカプトエタノールおよび5.0%
エチレングリコールを含む）を用いて線形的に硫酸アン
モニウム勾配を減少させることによって結合タンパク質
を溶出した。DEAE-Sepharose FF カラム(20 x 1.6 cm)
によって活性画分を濃縮した。このカラムは硫酸アンモ
ニウムおよびポリエチレングリコールを除去した。精製
酵素を-80℃で保存した。組換えホモシステイナーゼの活性アッセイ α,γまたはα,β-脱離のケト生成物（ホモシステイン
に対するα-ケト酪酸）についての活性アッセイを、1.5
mlのEppendorf試験管中で、1 mlの50 mM リン酸緩衝液
(pH 8.0)（これも10μM リン酸ピリドキサールおよび20
mM ホモシステインを含む）を用いて37℃で10分間、酵
素の量を様々に変えて実施した。0.5 mlの4.5% TCAを添
加することによって反応を停止させた。得られた溶液0.
05 ml を0.45 mlの0.05% 3-メチル-2-ベンゾチアゾリン
オンヒドラゾン(MBTH)と混合し、1.0 M 酢酸ナトリウム
(pH 5.2)の1.0 mlサンプルに加え、50℃で30分間インキ
ュベートした。
【０１３１】分光光度計を用いてOD335で反応生成物の
量を測定した。ヒドラゾン生成物は吸光係数が7.6 x 10
3 l/mol x cmである。タンパク質の量はウシ血清アルブ
ミンを標準とするLowry Reagent Kit (Sigma)を用いて
測定した。タンパク質1 mgあたりの単位として比活性を
計算した。ここで酵素の１単位とは、１分間に1 μmol
のα-ケト酪酸の形成を触媒する量と定義される。
【０１３２】ホモシステインおよびシステインのそれぞ
れγおよびβ離脱反応についての活性アッセイを37℃で
30秒間実施した。その結果生じたH2Sを、メチレンブル
ー形成を用いてOD671で測定した。SDS-PAGEおよびPAGE NOVEX Kit (NOVEX Experimental Technology, San Dieg
o)に記載の方法にしたがって電気泳動を実施した。SDS-
PAGE用には12% Tris-Gelを用いた。クーマシーブリリア
ントブルーで染色した後、分子量標準(NOVEX mark 12 W
ide Range Protein Standard)を用いてタンパク質バン
ドの強度を推定した。分子量標準は以下のものを含んで
いた: ミオシン、200 kD; β- ガラクトシダーゼ、116.
3 kD; ホスホリラーゼｂ，97.4 kD; ウシ血清アルブミ
ン、66.3 kD; カルボニックアンヒドラーゼ、31.0 kD;
トリプシンインヒビター、21.5 kD; リゾチーム、14.4
kD;アプロチニン、6.0 kD。組換えホモシステイナーゼ
活性を検出するため、未変性ゲルを3.3 mM DL-ホモシス
テイン、0.33 mM 酢酸鉛、28.4 mM β-メルカプトエタ
ノールおよび100 mM Tris-HCl 緩衝液(pH 7.5)を含む反
応混合物中に浸漬することによって染色した。ホモシス
テイナーゼ活性を有するバンドはホモシステインをα-
ケト酪酸、アンモニアおよびH2S に変換する。硫化水素
は酢酸鉛と反応して暗褐色の沈殿物(Pb2S)を形成する。
次にクーマシーブルーを用いてタンパク質についてゲル
を染色した。
【０１３３】本開示をさらにサポートするものとして、
確認された生存力を有する生物学的物質を1997年9 月26
日にブダペスト条約に基づいてAmerican Type Culture
Collection, Rockville, MD, USAに寄託した。この物質
は大腸菌BL21 (DE3)、クローンpAC2-1として同定され、
ATCC番号 98549を与えられた。本特許が許可されたなら
ば、公衆の本物質の利用可能性に関する全ての制限は不
可逆的に除かれるであろう。
【０１３４】
【発明の効果】配列番号１０のアミノ酸配列を有するホ
モシステイナーゼまたはその変異体を、尿、全血および
血漿などの生物学的流体のサンプルと接触させて生成す
る硫化水素を測定することによりサンプル中に通常存在
するシステインによる妨害を減少させてホモシステイン
濃度を測定することができる。
【０１３５】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> ANTICANCER, INC. <120> HIGH SPECIFICITY HOMOCYSTEINE ASSAYS FOR BIOLOGICAL SAMPLES <130> PA02-052 <140> <141> <150> US08/899,776 <151> 1997-07-24 <150> US08/918,214 <151> 1997-08-25 <150> US08/941,921 <151> 1997-10-01 <150> US08/974,609 <151> 1997-11-19 <150> US09/061,337 <151> 1998-04-17 <160> 19 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Trichomonas vaginalis <400> 1 Cys Ser Arg Ala Asp Ile Ile Ala Lys Val Lys Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Pseudomonas putida <400> 2 Val Gly Ser Gln Ala Leu Val Asp Arg Ile Arg Leu 1 5 10 <210> 3 <211> 3 <212> PRT <213> Trichomonas vaginalis <400> 3 Asp Val Asp 1 <210> 4 <211> 3 <212> PRT <213> Pseudomonas putida <400> 4 Glu Leu Lys 1 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Trichomonas vaginalis <400> 5 Cys His Val Val 1 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Pseudomonas putida <400> 6 Ala Leu Gln Leu 1 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Trichomonas vaginalis <400> 7 Cys Glu Asn Val Gln Asp Ile Ile Asp Asp 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Pseudomonas putida <400> 8 Gly Leu Glu Asp Ile Asp Asp Leu Leu Ala 1 5 10 <210> 9 <211> 1240 <212> DNA <213> Trichomonas vaginalis <220> <221> CDS <222> (18)..(1226) <220> <221> mat#peptide <222> (39) <400> 9 aagaaggaga tatacat atg cat cat cat cat cat cac atg tct cac gag 50 Met His His His His His His Met Ser His Glu -7 -5 1 aga atg acc cca gca aca gca tgc atc cat gct aat cca cag aag gat 98 Arg Met Thr Pro Ala Thr Ala Cys Ile His Ala Asn Pro Gln Lys Asp 5 10 15 20 cag ttt gga gca gcc atc cca cca atc tac caa aca tca aca ttc gtt 146 Gln Phe Gly Ala Ala Ile Pro Pro Ile Tyr Gln Thr Ser Thr Phe Val 25 30 35 ttc gat aac tgc caa cag ggt gga aac aga ctc gct ggt cag gaa tcc 194 Phe Asp Asn Cys Gln Gln Gly Gly Asn Arg Leu Ala Gly Gln Glu Ser 40 45 50 ggc tac atc tac aca cgt ctc ggc aac cca aca gtt tca aac ctc gaa 242 Gly Tyr Ile Tyr Thr Arg Leu Gly Asn Pro Thr Val Ser Asn Leu Glu 55 60 65 ggc aag atc gcc ttc ctc gag aaa aca gaa gca tgc gtt gcc aca tct 290 Gly Lys Ile Ala Phe Leu Glu Lys Thr Glu Ala Cys Val Ala Thr Ser 70 75 80 tct ggc atg ggt gcc att gct gct aca gtt ttg aca atc ctc aag gcc 338 Ser Gly Met Gly Ala Ile Ala Ala Thr Val Leu Thr Ile Leu Lys Ala 85 90 95 100 gga gat cac tta atc tcc gat gag tgc ctt tat ggc tgc aca cat gct 386 Gly Asp His Leu Ile Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Gly Cys Thr His Ala 105 110 115 ctc ttt gag cac gca ttg aca aag ttc ggc atc cag gtc gac ttc atc 434 Leu Phe Glu His Ala Leu Thr Lys Phe Gly Ile Gln Val Asp Phe Ile 120 125 130 aac aca gcc atc cca ggc gag gtc aag aag cac atg aag cca aac aca 482 Asn Thr Ala Ile Pro Gly Glu Val Lys Lys His Met Lys Pro Asn Thr 135 140 145 aag att gtc tat ttc gag aca cca gcc aac cca aca ctc aag atc atc 530 Lys Ile Val Tyr Phe Glu Thr Pro Ala Asn Pro Thr Leu Lys Ile Ile 150 155 160 gac atg gag cgc gtc tgc aag gaa gcc cac agc cag gag ggc gtc tta 578 Asp Met Glu Arg Val Cys Lys Glu Ala His Ser Gln Glu Gly Val Leu 165 170 175 180 gtt atc gcc gat aac aca ttc tgc tca cca atg atc aca aac cca gtc 626 Val Ile Ala Asp Asn Thr Phe Cys Ser Pro Met Ile Thr Asn Pro Val 185 190 195 gac ttt ggc gtc gat gtt gtt gtc cac tct gca aca aag tac atc aac 674 Asp Phe Gly Val Asp Val Val Val His Ser Ala Thr Lys Tyr Ile Asn 200 205 210 ggc cac aca gat gtc gtc gct ggc ctt atc tgt ggc aag gct gac ctc 722 Gly His Thr Asp Val Val Ala Gly Leu Ile Cys Gly Lys Ala Asp Leu 215 220 225 ctt caa cag att cgt atg gtt ggt atc aag gat atc aca gga tct gtt 770 Leu Gln Gln Ile Arg Met Val Gly Ile Lys Asp Ile Thr Gly Ser Val 230 235 240 atc agc cca cac gac gct tgg ctc atc aca cgt ggc ctc tca aca ctc 818 Ile Ser Pro His Asp Ala Trp Leu Ile Thr Arg Gly Leu Ser Thr Leu 245 250 255 260 aac atc aga atg aag gct gag agc gag aac gcc atg aag gtc gct gag 866 Asn Ile Arg Met Lys Ala Glu Ser Glu Asn Ala Met Lys Val Ala Glu 265 270 275 tac ctc aaa tct cac cca gcc gtt gag aag gtt tac tac cca ggc ttc 914 Tyr Leu Lys Ser His Pro Ala Val Glu Lys Val Tyr Tyr Pro Gly Phe 280 285 290 gag gac cac gag ggc cac gat atc gct aag aag cag atg aga atg tac 962 Glu Asp His Glu Gly His Asp Ile Ala Lys Lys Gln Met Arg Met Tyr 295 300 305 ggt tca atg atc aca ttc atc ctc aag tcc ggc ttc gaa ggc gct aag 1010 Gly Ser Met Ile Thr Phe Ile Leu Lys Ser Gly Phe Glu Gly Ala Lys 310 315 320 aag ctc ctc gac aac ctc aag ctt atc aca ctt gca gtt tcc ctt ggt 1058 Lys Leu Leu Asp Asn Leu Lys Leu Ile Thr Leu Ala Val Ser Leu Gly 325 330 335 340 ggc tgc gag tcc ctc atc cag cac cca gct tca atg act cac gct gtc 1106 Gly Cys Glu Ser Leu Ile Gln His Pro Ala Ser Met Thr His Ala Val 345 350 355 gtt cca aag gag gag cgt gag gcc gct ggt att aca gat ggc atg atc 1154 Val Pro Lys Glu Glu Arg Glu Ala Ala Gly Ile Thr Asp Gly Met Ile 360 365 370 cgc ctt tct gtc ggt att gaa gat gcc gac gaa ctc atc gct gat ttc 1202 Arg Leu Ser Val Gly Ile Glu Asp Ala Asp Glu Leu Ile Ala Asp Phe 375 380 385 aaa cag ggc ctt gac gct ctt tta taaggatcct ctag 1240 Lys Gln Gly Leu Asp Ala Leu Leu 390 395 <210> 10 <211> 403 <212> PRT <213> Trichomonas vaginalis <400> 10 Met His His His His His His Met Ser His Glu Arg Met Thr Pro Ala -7 -5 1 5 Thr Ala Cys Ile His Ala Asn Pro Gln Lys Asp Gln Phe Gly Ala Ala 10 15 20 25 Ile Pro Pro Ile Tyr Gln Thr Ser Thr Phe Val Phe Asp Asn Cys Gln 30 35 40 Gln Gly Gly Asn Arg Leu Ala Gly Gln Glu Ser Gly Tyr Ile Tyr Thr 45 50 55 Arg Leu Gly Asn Pro Thr Val Ser Asn Leu Glu Gly Lys Ile Ala Phe 60 65 70 Leu Glu Lys Thr Glu Ala Cys Val Ala Thr Ser Ser Gly Met Gly Ala 75 80 85 Ile Ala Ala Thr Val Leu Thr Ile Leu Lys Ala Gly Asp His Leu Ile 90 95 100 105 Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Gly Cys Thr His Ala Leu Phe Glu His Ala 110 115 120 Leu Thr Lys Phe Gly Ile Gln Val Asp Phe Ile Asn Thr Ala Ile Pro 125 130 135 Gly Glu Val Lys Lys His Met Lys Pro Asn Thr Lys Ile Val Tyr Phe 140 145 150 Glu Thr Pro Ala Asn Pro Thr Leu Lys Ile Ile Asp Met Glu Arg Val 155 160 165 Cys Lys Glu Ala His Ser Gln Glu Gly Val Leu Val Ile Ala Asp Asn 170 175 180 185 Thr Phe Cys Ser Pro Met Ile Thr Asn Pro Val Asp Phe Gly Val Asp 190 195 200 Val Val Val His Ser Ala Thr Lys Tyr Ile Asn Gly His Thr Asp Val 205 210 215 Val Ala Gly Leu Ile Cys Gly Lys Ala Asp Leu Leu Gln Gln Ile Arg 220 225 230 Met Val Gly Ile Lys Asp Ile Thr Gly Ser Val Ile Ser Pro His Asp 235 240 245 Ala Trp Leu Ile Thr Arg Gly Leu Ser Thr Leu Asn Ile Arg Met Lys 250 255 260 265 Ala Glu Ser Glu Asn Ala Met Lys Val Ala Glu Tyr Leu Lys Ser His 270 275 280 Pro Ala Val Glu Lys Val Tyr Tyr Pro Gly Phe Glu Asp His Glu Gly 285 290 295 His Asp Ile Ala Lys Lys Gln Met Arg Met Tyr Gly Ser Met Ile Thr 300 305 310 Phe Ile Leu Lys Ser Gly Phe Glu Gly Ala Lys Lys Leu Leu Asp Asn 315 320 325 Leu Lys Leu Ile Thr Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Cys Glu Ser Leu 330 335 340 345 Ile Gln His Pro Ala Ser Met Thr His Ala Val Val Pro Lys Glu Glu 350 355 360 Arg Glu Ala Ala Gly Ile Thr Asp Gly Met Ile Arg Leu Ser Val Gly 365 370 375 Ile Glu Asp Ala Asp Glu Leu Ile Ala Asp Phe Lys Gln Gly Leu Asp 380 385 390 Ala Leu Leu 395 <210> 11 <211> 1191 <212> DNA <213> Trichomonas vaginalis <220> <221> CDS <222> (1)..(1188) <220> <221> mat#peptide <222> (1) <400> 11 atg tct cac gag aga atg acc cca gca aca gca tgc atc cat gct aat 48 Met Ser His Glu Arg Met Thr Pro Ala Thr Ala Cys Ile His Ala Asn 1 5 10 15 cca cag aag gat cag ttt gga gca gcc atc cca cca atc tac caa aca 96 Pro Gln Lys Asp Gln Phe Gly Ala Ala Ile Pro Pro Ile Tyr Gln Thr 20 25 30 tca aca ttc gtt ttc gat aac tgc caa cag ggt gga aac aga ttc gct 144 Ser Thr Phe Val Phe Asp Asn Cys Gln Gln Gly Gly Asn Arg Phe Ala 35 40 45 ggt cag gaa tcc ggc tac atc tac aca cgt ctc ggc aac cca aca gtt 192 Gly Gln Glu Ser Gly Tyr Ile Tyr Thr Arg Leu Gly Asn Pro Thr Val 50 55 60 tca aac ctc gaa ggc aag atc gcc ttc ctc gag aaa aca gaa gca tgc 240 Ser Asn Leu Glu Gly Lys Ile Ala Phe Leu Glu Lys Thr Glu Ala Cys 65 70 75 80 gtt gcc aca tct tct ggc atg ggt gcc att gct gct aca gtt ttg aca 288 Val Ala Thr Ser Ser Gly Met Gly Ala Ile Ala Ala Thr Val Leu Thr 85 90 95 atc ctc aag gcc gga gat cac tta atc tcc gat gag tgc ctt tat ggc 336 Ile Leu Lys Ala Gly Asp His Leu Ile Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Gly 100 105 110 tgc aca cat gct ctc ttt gag cac gca ttg aca aag ttc ggc atc cag 384 Cys Thr His Ala Leu Phe Glu His Ala Leu Thr Lys Phe Gly Ile Gln 115 120 125 gtc gac ttc atc aac aca gcc atc cca ggc gag gtc aag aag cac atg 432 Val Asp Phe Ile Asn Thr Ala Ile Pro Gly Glu Val Lys Lys His Met 130 135 140 aag cca aac aca aag att gtc tat ttc gag aca cca gcc aac cca aca 480 Lys Pro Asn Thr Lys Ile Val Tyr Phe Glu Thr Pro Ala Asn Pro Thr 145 150 155 160 ctc aag atc atc gac atg gag cgc gtc tgc aag gac gcc cac agc cag 528 Leu Lys Ile Ile Asp Met Glu Arg Val Cys Lys Asp Ala His Ser Gln 165 170 175 gag ggc gtc tta gtt atc gcc gat aac aca ttc tgc tca cca atg atc 576 Glu Gly Val Leu Val Ile Ala Asp Asn Thr Phe Cys Ser Pro Met Ile 180 185 190 aca aac cca gtc gac ttt ggc gtc gat gtt gtt gtc cac tct gca aca 624 Thr Asn Pro Val Asp Phe Gly Val Asp Val Val Val His Ser Ala Thr 195 200 205 aag tac atc aac ggc cac aca gat gtc gtc gct ggc ctt atc tgt ggc 672 Lys Tyr Ile Asn Gly His Thr Asp Val Val Ala Gly Leu Ile Cys Gly 210 215 220 aag gct gac ctc ctt caa cag att cgt atg gtt ggt atc aag gat atc 720 Lys Ala Asp Leu Leu Gln Gln Ile Arg Met Val Gly Ile Lys Asp Ile 225 230 235 240 aca gga tct gtt atc agc cca cac gac gct tgg ctc atc aca cgt ggc 768 Thr Gly Ser Val Ile Ser Pro His Asp Ala Trp Leu Ile Thr Arg Gly 245 250 255 ctc tca aca ctc aac atc aga atg aag gct gag agc gag aac gcc atg 816 Leu Ser Thr Leu Asn Ile Arg Met Lys Ala Glu Ser Glu Asn Ala Met 260 265 270 aag gtc gct gag tac ctc aaa tct cac cca gcc gtt gag aag gtt tac 864 Lys Val Ala Glu Tyr Leu Lys Ser His Pro Ala Val Glu Lys Val Tyr 275 280 285 tac cca ggc ttc gag gac cac gag ggc cac gat atc gct aag aag cag 912 Tyr Pro Gly Phe Glu Asp His Glu Gly His Asp Ile Ala Lys Lys Gln 290 295 300 atg aga atg tcg ggt tca atg atc aca ttc atc ctc aag tcc ggc ttc 960 Met Arg Met Ser Gly Ser Met Ile Thr Phe Ile Leu Lys Ser Gly Phe 305 310 315 320 gaa ggc gct aag aag ctc ctc gac aac ctc aag ctt atc aca ctt gca 1008 Glu Gly Ala Lys Lys Leu Leu Asp Asn Leu Lys Leu Ile Thr Leu Ala 325 330 335 gtt tcc ctt ggt ggc tgc gag tcc ctc atc cag cac cca gct tca atg 1056 Val Ser Leu Gly Gly Cys Glu Ser Leu Ile Gln His Pro Ala Ser Met 340 345 350 act cac gct gtc gtt cca aag gag gag cgt gag gcc gct ggt att aca 1104 Thr His Ala Val Val Pro Lys Glu Glu Arg Glu Ala Ala Gly Ile Thr 355 360 365 gat ggc atg atc cgc ctt tct gtc ggt att gaa gat gcc gac gaa ctc 1152 Asp Gly Met Ile Arg Leu Ser Val Gly Ile Glu Asp Ala Asp Glu Leu 370 375 380 atc gct gat ttc aaa cag ggc ctt gac gct ctt tta taa 1191 Ile Ala Asp Phe Lys Gln Gly Leu Asp Ala Leu Leu 385 390 395 <210> 12 <211> 396 <212> PRT <213> Trichomonas vaginalis <400> 12 Met Ser His Glu Arg Met Thr Pro Ala Thr Ala Cys Ile His Ala Asn 1 5 10 15 Pro Gln Lys Asp Gln Phe Gly Ala Ala Ile Pro Pro Ile Tyr Gln Thr 20 25 30 Ser Thr Phe Val Phe Asp Asn Cys Gln Gln Gly Gly Asn Arg Phe Ala 35 40 45 Gly Gln Glu Ser Gly Tyr Ile Tyr Thr Arg Leu Gly Asn Pro Thr Val 50 55 60 Ser Asn Leu Glu Gly Lys Ile Ala Phe Leu Glu Lys Thr Glu Ala Cys 65 70 75 80 Val Ala Thr Ser Ser Gly Met Gly Ala Ile Ala Ala Thr Val Leu Thr 85 90 95 Ile Leu Lys Ala Gly Asp His Leu Ile Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Gly 100 105 110 Cys Thr His Ala Leu Phe Glu His Ala Leu Thr Lys Phe Gly Ile Gln 115 120 125 Val Asp Phe Ile Asn Thr Ala Ile Pro Gly Glu Val Lys Lys His Met 130 135 140 Lys Pro Asn Thr Lys Ile Val Tyr Phe Glu Thr Pro Ala Asn Pro Thr 145 150 155 160 Leu Lys Ile Ile Asp Met Glu Arg Val Cys Lys Asp Ala His Ser Gln 165 170 175 Glu Gly Val Leu Val Ile Ala Asp Asn Thr Phe Cys Ser Pro Met Ile 180 185 190 Thr Asn Pro Val Asp Phe Gly Val Asp Val Val Val His Ser Ala Thr 195 200 205 Lys Tyr Ile Asn Gly His Thr Asp Val Val Ala Gly Leu Ile Cys Gly 210 215 220 Lys Ala Asp Leu Leu Gln Gln Ile Arg Met Val Gly Ile Lys Asp Ile 225 230 235 240 Thr Gly Ser Val Ile Ser Pro His Asp Ala Trp Leu Ile Thr Arg Gly 245 250 255 Leu Ser Thr Leu Asn Ile Arg Met Lys Ala Glu Ser Glu Asn Ala Met 260 265 270 Lys Val Ala Glu Tyr Leu Lys Ser His Pro Ala Val Glu Lys Val Tyr 275 280 285 Tyr Pro Gly Phe Glu Asp His Glu Gly His Asp Ile Ala Lys Lys Gln 290 295 300 Met Arg Met Ser Gly Ser Met Ile Thr Phe Ile Leu Lys Ser Gly Phe 305 310 315 320 Glu Gly Ala Lys Lys Leu Leu Asp Asn Leu Lys Leu Ile Thr Leu Ala 325 330 335 Val Ser Leu Gly Gly Cys Glu Ser Leu Ile Gln His Pro Ala Ser Met 340 345 350 Thr His Ala Val Val Pro Lys Glu Glu Arg Glu Ala Ala Gly Ile Thr 355 360 365 Asp Gly Met Ile Arg Leu Ser Val Gly Ile Glu Asp Ala Asp Glu Leu 370 375 380 Ile Ala Asp Phe Lys Gln Gly Leu Asp Ala Leu Leu 385 390 395 <210> 13 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:oligonucleotide primer developed based on the nucleotide sequence of the mgl1 gene. <400> 13 ggattacata tgcatcatca tcatcatcac atgagtggcc acgctatcga c 51 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:oligonucleotide primer developed based on the nucleotide sequence of the mgl1 gene. <400> 14 ggattaggat ccttagagga ctaagtcgag agcc 34 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primers selected to permit amplification of the encoding sequence in two overlapping fragments. <400> 15 atcgctagca tatgatcccg gacgtatcac ag 32 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primers selected to permit amplification of the encoding sequence in two overlapping fragments. <400> 16 atcaccatcc actggtgtaa tg 22 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primers selected to permit amplification of the encoding sequence in two overlapping fragments. <400> 17 ctaccgattt tgcggaag 18 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primers selected to permit amplification of the encoding sequence in two overlapping fragments. <400> 18 catgacggat cctcaggcgt gtttttccag 30 <210> 19 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:a series of consecutive histidine codons were included at the 5' end of the encoding sequence for primer GSH-1H. <400> 19 atcgctagca tatgcatcat catcatcatc acatgatccc ggacgtatc 49
【０１３６】
【配列表フリーテキスト】配列番号１３〜１９：合成DN
A
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1(A及びB)は、mgl1遺伝子によってコードさ
れるTrichomonas vaginalisホモシステイナーゼのアミ
ノ酸配列の、Trichomonas vaginalis pAC2-1クローンに
よってコードされるものとの比較を示す。
【図２】図2は、システイン、メチオニン及びホモシス
テインについてのpAC2-1クローンのホモシステイナーゼ
に対応する比活性(単位/粗大腸菌抽出物のmg)の比較を
示す。
【図３】図3は、システイン、メチオニン及びホモシス
テインについてのホモシステイナーゼ(pAC2-1クロー
ン、DEAE-Fast Flow法により精製したもの)の比活性の
比較を示す。
【図４】図4は、システイン、メチオニン及びホモシス
テインについてのホモシステイナーゼ(pAC2-1クロー
ン、ニッケルカチオンアフィニティ試薬を使用して精製
したもの)の比活性の比較を示す。
【図５】図5は、システイン、メチオニン及びホモシス
テインについてのホモシステイナーゼ(pAC2-1クローン)
の測定Kcat値を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０８／９７４，６０９ (32)優先日 平成９年11月19日(1997．11．19) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／０６１，３３７ (32)優先日 平成10年４月17日(1998．4．17) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 レンツ，マーティン アメリカ合衆国 92122 カリフォルニア 州，サンディエゴ，チャーマント ドライ ブ ナンバー925 7514番地 (72)発明者 ペリー，アンドリュー，ダブリュ. アメリカ合衆国 92003 カリフォルニア 州，ボンサール，ヴィア デ ラ レイナ 6423番地 (72)発明者 ホフマン，ロバート，エム. アメリカ合衆国 92037 カリフォルニア 州，ラホヤ，ソルダッド マウンテン ロ ード 5543番地 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA11 CA04 HA19 4B063 QA01 QQ38 QR49 QS02

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生物学的流体のサンプルが配列番号１０
    の位置１−３９６で示されるアミノ酸配列を有するホモ
    システイナーゼまたはその変異体と接触するとき、生成
    する硫化水素の量を測定することを含むホモシステイン
    のアッセイにおいて、システインによる妨害を減少させ
    るための該ホモシステイナーゼの使用。
  2. 【請求項２】 該変異体において位置４７のＬｅｕ、位
    置１７２におけるＧｌｕおよび位置３０８におけるＴｙ
    ｒの少なくとも１つが保持されている、請求項１の使
    用。
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