CN1268978A - 用于生物样品的高特异性同型半胱氨酸分析法 - Google Patents

用于生物样品的高特异性同型半胱氨酸分析法 Download PDF

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Abstract

本发明新的方法包括使用特定的同型半胱氨酸酶,其中该酶使得能测定生物样品中的同型半胱氨酸浓度,而没有来自通常存在于这些样品中的半胱氨酸和/或甲硫氨酸浓度的干扰。还提供了一种用于测定生物样品中的同型半胱氨酸的量的诊断试剂盒,包含(a)具有上述特性的同型半胱氨酸酶,和(b)至少一种能被用来测定在同型半胱氨酸酶反应中形成的产物的量的试剂。在另一个方面,提供为包含来自或模仿多于一种同型半胱氨酸酶的氨基酸亚序列的通常从编码它的嵌合多核苷酸产生的嵌合分子形式的同型半胱氨酸酶。同型半胱氨酸分析法中的其它改进包括使用γ－谷氨酰半胱氨酸合成酶以进一步限制任何来自存在于生物样品中的半胱氨酸的干扰。

Description

用于生物样品的高特异 性同型半胱氨酸分析法
本申请涉及生物液体，如尿、全血和血浆中的同型半胱氨酸的分析法。更具体地说，本发明涉及包含一种或多种同型半胱氨酸酶的酶制剂的用途和包含这些酶的诊断试剂盒。在本发明的优选的实例中，同型半胱氨酸的浓度通过测定从中产生的硫化氢来确定。
K.S.McCully等(美国病理学杂志，56，pp.111-128，1969)首先报道了血浆同型半胱氨酸水平与心血管疾病危险的关系。McCully等确定了升高的血浆同型半胱氨酸浓度与动脉硬化疾病之间的相互关系。最近的研究证实甚至中等升高的血浆同型半胱氨酸水平是显著增加的患冠心病疾病、脑血管疾病和外周血管疾病的危险的指标。参见例如J.Selhub等，新英格兰医学杂志，32，pp.286-291，1995，和S.Kang等，营养年鉴，12，pp.279-298，1992。
在分析患心血管疾病的危险方面，有许多证据表明升高的同型半胱氨酸水平比升高的胆固醇水平可能是更好的危险指标。例如，在一个研究中，高于正常值高限仅12％的血浆同型半胱氨酸浓度与增加3.4倍的心肌梗死危险相关(M.Stampfer等，美国医学协会杂志，268，pp.877-881，1992)。在诊断出心血管疾病之前抽血的另一研究中，一组271名男性(后来患有心肌梗死)显示比后来未患有心肌梗死的对照病人明显更高水平的同型半胱氨酸(参见P.Ueland等，心血管疾病，止血和内皮功能，1992，p.183-236，MarcelDekker，纽约)。
O.Nygard等，新英格兰医学杂志，337(4)，pp.230-236(1997)报道总的血浆同型半胱氨酸是患有证实的冠状动脉疾病的病人的死亡率的有力的指标。
仍未获得对其中同型半胱氨酸参与心血管疾病过程的分子机理的进一步的认识。提出同型半胱氨酸参与导致例如氧游离基的过度产生、弹性蛋白酶活化和钙沉积(即斑的形成)的反应。对于目前理论的综述，参见K.McCully，天然药物，2(4)，pp.386-389(1996)和K.S.McCully，临床和实验室科学手册，23(6)，pp.477-493(1993)。循环的升高的同型半胱氨酸水平还可直接影响凝固过程(参见上面的O.Nygard等和该文引用的参考文献)。
因此，需要开发准确的确定病人的同型半胱氨酸水平的方法，以及使得该分析方法成为标准医学实践认同的部分。如下所描述的，还非常需要能获得对涉及异常同型半胱氨酸代谢的婴儿疾病的广泛的筛选，如高胱氨酸尿。
A.Araki等，色谱学杂志，422，pp.43-52(1987)描述了利用与硫醇特异性荧光剂反应，接着用高压液相色谱(HPLC)检测以分离其它硫醇种类的用于血浆中游离和与蛋白质结合的同型半胱氨酸的检测方法。还参见N.P.B.Dudman等，临床化学，42(12)，pp.2028-2032(1996)。用于临床应用的这些方法的缺点可能包括可被HPLC处理的样品数的固有的限制，以及HPLC的使用可能不允许高生产率的筛选和在临床实验室可能不存在适宜的HPLC仪器。
Shipchandler等(参见临床化学，41(7)，pp.991-994，1995)最近描述了用于同型半胱氨酸和同型胱氨酸(同型半胱氨酸的二硫键二聚体)的荧光极化免疫分析法。该分析法被报道证实了与半胱氨酸和甲硫氨酸的极小的交叉反应。该分析法包括将同型半胱氨酸转化为S-腺苷同型半胱氨酸，并且检测是基于使用识别S-腺苷同型半胱氨酸的单克隆抗体，以及还有其荧光素类似物。然而，该检测方法的可能的缺点可包括与单克隆抗体生产相关的成本和抗体的“非特异性”，即例如与S-腺苷甲硫氨酸的交叉反应。此外，表明该方法仅可用仅可从一个来源获得的特定的专利仅器来进行。
K-W.Thong等(实验寄生虫学，63，pp.143-151，1987)描述了将同型半胱氨酸酶促转化为α-丁酮酸、硫化氢和氨，接着用乙酸铅测定硫化氢(还参见K-W.Thong等IRCS医药科学，13，pp.493-494，和pp.495-496，1985)。然而，没有提议使用用于临床诊断的所涉及的酶(例如来自寄生虫阴道毛滴虫)。此外，在临床角度上，公开的方法未将同型半胱氨酸与半胱氨酸区分，它未计算在生物样品中被二硫键键合或与蛋白结合的同型半胱氨酸部分。
包括使用来自细菌卵状假单胞菌的微生物酶的另一种检测同型半胱氨酸的方法公开在Yamaguchi等，Sapporo公共健康城市协会年报，No.20，pp.67-74，1993。由于同型半胱氨酸被认为不稳定，例如易于与蛋白形成二硫键，因此作者集中在检测氨基酸甲硫氨酸作为测定同型半胱氨酸水平(如对于高胱氨酸尿)的一个间接的方法。
作为对同型半胱氨酸的一种间接的测定，该方法可能是不甚准确的，并且由于生物样品中的高本底水平的氨，代替产物硫化氢测定产物氨可能不甚敏感。还注意到氨分析法受污染的脱氨酶存在的不利影响，这可能是一个普遍存在的问题。类似地，由于生物样品中的高本底水平，预期产物α-丁酮酸的分析是不甚有效的(对于分析方法，参见Y.Tan等，蛋白质的表达和纯化，9，pp.233-245，1997)。
相对于本发明实例的另一个参考文献是1997年5月20日提出的Sundrehagen的美国专利5,631,127。
随着增加的心血管疾病中的同型半胱氨酸的作用的了解以及筛选病人患有心血管疾病的危险的公共健康目标，非常需要可被用于准确测定病人的同型半胱氨酸水平的新的分析方法。期望这些方法在升高的同型半胱氨酸浓度是特定疾病状态的原因的那些情况和升高的同型半胱氨酸浓度是出现的疾病状态的可检测的副产物的情况中提供显著的医疗益处。
这些分析方法还通过在可通过其它方法检测其发生之前预测病人对心血管疾病的敏感性来提供很大的益处。在这方面，通过使该个方法适宜于一般人群，尤其是所有婴幼儿的广泛筛选实现很大的益处。
在这些改进的分析方法的设计方面，开发可用于一步/酶分析中测定同型半胱氨酸的，但基本上对生物样品中普遍存在的干扰浓度的半胱氨酸和甲硫氨酸是无活性的酶是很有价值的。如上所述，本发明提供具有该特异性的同型半胱氨酸酶。
本发明提供新的测定生物样品中的同型半胱氨酸浓度的方法。在本发明的优选具体实施方案中，生物样品为尿、组织液、血液、血清或来自病人的血浆样品，本发明的方法还可用于分析心血管疾病的危险。具体地说，本发明提供新的测定生物液体中的同型半胱氨酸浓度，同时避免测定相关的但为干扰性物质，最具体地为半胱氨酸和甲硫氨酸的方法。
因此，提供测定存在于包含例如同型半胱氨酸和半胱氨酸的生物样品中的同型半胱氨酸的量的方法，包括将实施样品与能从同型半胱氨酸和半胱氨酸产生硫化氢的酶制剂接触，通过测定从同型半胱氨酸产生的硫化氢的量来确定所述样品中同型半胱氨酸的量。在最优选的具体实施方案中，酶制剂仅由一种相对于半胱氨酸，其对同型半胱氨酸的活性足以使得从半胱氨酸产生的硫化氢可被忽略的酶组成。
所述酶制剂包含一种被称为同型半胱氨酸酶的并如下所述可能被称为其它名称的酶。此外，除非另有说明，术语“酶制剂”还应被理解包括一个或多个等份试样，即在分析方法的过程中可加入一种或多种酶的单剂量或多剂量，并且在患有过程中，术语的使用不局限于如何，多少次，等份试样和步骤被用来加入所有必需的酶。
根据本发明的一个优选的方面，认识到存在于生物样品，例如体液中的同型半胱氨酸的总浓度包括不以游离形式存在，而代之以与其它分子共价结合的同型半胱氨酸分子。本发明的方法提供其它用于在测定同型半胱氨酸来源的硫化氢之前释放这些同型半胱氨酸的步骤。
然而，应注意由于本发明的方法提供不存在来自相关物质的干扰(例如半胱氨酸)的准确的对游离同型半胱氨酸水平的测定，尽管仅检测游离同型半胱氨酸，但对临床医生提供有价值的信息。在许多用途中，期望这些信息作为快速初级诊断工具极为有用，例如在所有新生婴儿的检测中。
本发明另外的具体实施方案包括区分同型半胱氨酸与在所述生物样品中可能存在的任何半胱氨酸的方法。这些方法的代表为：
(I)一种方法，其中从同型半胱氨酸所的硫化氢区别于从半胱氨酸产生的硫化氢，所述方法包括如下的另外的起始步骤：
(a)将所述生物样品与保护同型半胱氨酸免于所述酶制剂作用的试剂接触；
(b)让所述酶制剂从存在于所述样品中的半胱氨酸产生硫化氢；
(c)除去所述硫化氢；和
(d)脱保护所述同型半胱氨酸，并加入另外量的酶制剂以从中产生硫化氢；和
(II)一种方法，包括另外的起始步骤：
(a)将存在于所述生物样品中的同型半胱氨酸与能将其转化为可被分离的化合物的其它酶制剂接触；
(b)分离所述化合物；
(c)在所述化合物被转回为同型半胱氨酸的条件下，将所述化合物与酶制剂或其它试剂接触；和
(d)将如此产生的同型半胱氨酸与能从中产生硫化氢的所述酶制剂接触：
(III)一种方法，其中所述生物样品被用使得半胱氨酸对所述酶制剂为非活性的试剂预处理；和
(IV)一种方法，其中从中产生的硫化氢区别于从半胱氨酸产生的硫化氢，包括步骤：
(a)让酶制剂从存在于所述样品中的同型半胱氨酸和半胱氨酸产生分硫化氢，其中所述酶还从半胱氨酸以等于从中产生的硫化氢的量产生丙酮酸；
(b)测定如此产生的丙酮酸的量，和
(c)计算硫化氢的量从中产生的同型半胱氨酸的量，其中所述样品被或任选不被分成第一部分和第二部分以进行所述分析。
在很容易适宜于来自大量病人样本的样品的快速检测的本发明尤其优选的具体实施方案中，提供一种测定存在于包含同型半胱氨酸和半胱氨酸的生物样品中的同型半胱氨酸的量的方法，包括步骤：
(a)将所述样品分成2份，份1或1份2；
(b)将份1与能将同型半胱氨酸转化为不为同型半胱氨酸底物的底物的第一种酶制剂接触，其中所述第一种酶制剂不将半胱氨酸认作底物；
(c)独立地将份1和份2与包含能从同型半胱氨酸和半胱氨酸产生硫化氢的同型半胱氨酸酶的第二种酶制剂接触；
(d)测定份1和份2产生的硫化氢的量；和
(e)通过从份2的硫化氢的测定量减去份1的硫化氢的测定量计算所述生物样品中的同型半胱氨酸的量，并将结果乘以2。
对于本发明的临床实践，提供了用于测定生物样品中的同型半胱氨酸的量的诊断试剂盒，并且其中同型半胱氨酸包括从几种来源的一种获得的那些。在一个优选的具体实施方案中，诊断试剂盒包含：
(a)来自阴道毛滴虫或假单胞菌属(例如卵状假单胞菌或恶臭假单胞菌)的同型半胱氨酸酶，和
(b)至少一种能被用来测定在同型半胱氨酸酶反应中形成的硫化氢的量的试剂。
在本发明的另一个方面，提供来自多于一个基因或其它多核苷酸的编码同型半胱氨酸酶的嵌合核苷酸序列(无论DNA或RNA)，其中该序列的表达导致嵌合同型半胱氨酸酶的产生。对于本发明的实践，该同型半胱氨酸酶具有有价值的特性，并且其优选的实例包括包含来自阴道毛滴虫或恶臭假单胞菌同型半胱氨酸酶的的氨基酸序列的嵌合酶。
因此，本发明提供两种设计用于同型半胱氨酸的临床分析的基本方法：(1)使用新的分析方法以检测同型半胱氨酸酶的反应产物的增强生物样品中的同型半胱氨酸的检测，和(2)通过设计与其它含硫氨基酸相比具有显著增加的对同型半胱氨酸的活性的同型半胱氨酸酶进一步增强该分析方法的敏感性。
对于上面方法(2)，由SEQ ID NQ：10编码的蛋白质的使用是具有代表性的。该同型半胱氨酸酶对半胱氨酸或甲硫氨酸为非活性的足以使例如在个体组织液、尿、血液、血清或血浆中存在的同型半胱氨酸的浓度可在一个分析步骤中测定，其中测定了两种实施同型半胱氨酸酶对所述样品中的同型半胱氨酸的反应的一种或多种产物的量，并且其中所述测定基本上不受其中的半胱氨酸或甲硫氨酸的浓度的影响。
在一个优选的方面，该同型半胱氨酸酶被模仿来自下面的同型半胱氨酸酶：
假单胞菌属、梭状芽孢杆菌属、气单胞菌属或毛滴虫属，在其一个实例中，该酶的一个或多个肽序列对应地被SEQIDNO：10的一个或多个同源肽序列取代，例如选自下面的那些：
(a)Gly-Gly-Asn-Arg-Leu-Ala-Gly-Gln-Glu(参见SEQIDNO：10的残基43-51)；
(b)包含Leu的(a)的子集；
(c)Arg-Val-Cys-Lys-Glu-Ala-His-Ser-Gln(参见SEQIDNO：10的残基168-176)；
(d)包含Glu的(c)的子集；
(e)Gln-Met-Arg-Met-Tyr-Gly-Ser-Met-Ile(参见SEQIDNO：10的残基304-312)；
(f)包含Tyr的(e)的子集。
在一个优选的方面，该同型半胱氨酸酶为SEQIDNO：10的置换变异体，插入变异体、缺失变异体或衍生物，其中所述变异体或衍生物具有一种或两种下面的特性：
(a)在适宜的分析中，SEQIDNO：10对同型半胱氨酸活性的至少约10％；和/或
(b)在适宜的分析中，不超过SEQIDNO：10对同型半胱氨酸活性的约1000％。
本发明的其它方面包括(1)包含编码具有该特异性的同型半胱氨酸酶的核苷酸序列的纯化和分离的DNA分子，以及其中所述编码序列可操作性地与能指导在宿主细胞中表达的控制序列相连；和(2)适宜转染的宿主细胞。
本发明另一个优选的具体实施方案为用于测定存在于包含同型半胱氨酸和半胱氨酸的生物样品中的同型半胱氨酸的量的方法，该方法包括测定从在由同型半胱氨酸酶催化的反应中的同型半胱氨酸产生的产物的浓度，其中该产物也可通过所述同型半胱氨酸酶对所述样品中的半胱氨酸反应而产生，并且其中所述样品包含其它干扰浓度的半胱氨酸，所述方法包括步骤：
(a)在存在允许半胱氨酸转化为γ-谷氨酰半胱氨酸时，将所述样品与γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶一起保温；
(b)将从步骤(a)产生的混合物与同型半胱氨酸酶一起保温，和
(c)测定能从由同型半胱氨酸酶催化的反应中的同型半胱氨酸和半胱氨酸产生的产物的浓度，并且其中优选(1)使用作为同型半胱氨酸酶的对应于SEQIDNO：10的阴道毛滴虫酶，或其残基Met1至Leu396，和(2)使用大肠杆菌γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶。还提供了诊断试剂盒，其为基于使用半胱氨酸tRNA合成酶的类似方法。
本发明的其它重要的特征包括用于个体生物样品中的同型半胱氨酸的单个酶分析中的诊断试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)同型半胱氨酸酶；和
(b)至少一种能被用来测定由同型半胱氨酸酶对同型半胱氨酸反应形成的产物硫化氢的量的试剂；其中所述同型半胱氨酸酶对半胱氨酸为非活性的足以使由所述同型半胱氨酸酶对半胱氨酸反应产生的任何硫化氢基本上不干扰评价心血管疾病危险的所述试剂盒的使用。
根据本发明的这一方面，一般性的提供一种诊断试剂盒，其中包括的同型半胱氨酸酶具有这一特性，即当例如在所述液体中同型半胱氨酸和半胱氨酸的浓度分别为约20umol和约300umol时，至少90％的在对同型半胱氨酸的分析中在接触生物样品时通过所述同型半胱氨酸酶作用产生的硫化氢是由所述同型半胱氨酸产生的。优选地，包括的同型半胱氨酸酶具有这一特性，即至少约99％的在接触所述生物液体时通过所述同型半胱氨酸酶作用产生的硫化氢来自同型半胱氨酸。例如可使用这些诊断试剂盒来准确地测定生物液体中范围为约1-500umol，或如需要更高的同型半胱氨酸浓度，其中在一个典型实例中，所述液体还包含0-约1000umol半胱氨酸。
对于这些试剂盒的使用以及本发明的其它分析方法，通常优选包括使用二硫化物还原剂，如二硫苏糖醇(“DTT”)，这样还可检测生物样品中的与其它分子(如游离半胱氨酸，其它同型半胱氨酸分子或蛋白质SH)经二硫键结合的同型半胱氨酸分子。
根据紧接的对本发明的详细描述描述了本发明其它代表性的实例和另外的方面。还应认识到不应将本发明的实例看作依赖于或受任何涉及同型半胱氨酸在病理学过程中的作用的具体理论的限制。
图1(A和B面)提供由mgl1基因编码的阴道毛滴虫同型半胱氨酸酶的氨基酸序列与由阴道毛滴虫pAC2-1克隆编码的氨基酸序列的比较。
图2显示对应于半胱氨酸、甲硫氨酸和同型半胱氨酸的pAC2-1克隆的同型半胱氨酸酶的比较性比活(单位/mg粗大肠杆菌提取物)。
图3显示对半胱氨酸、甲硫氨酸和同型半胱氨酸(pAC2-1克隆，使用DEAE--Fast Flow方法纯化)的同型半胱氨酸酶的比较性比活。
图4显示对半胱氨酸、甲硫氨酸和同型半胱氨酸(pAC2-1克隆，使用镍阳离子亲合试剂纯化)的同型半胱氨酸酶的比较性比活。
图5显示测定的对半胱氨酸、甲硫氨酸和同型半胱氨酸(pAC2-1克隆)的Kcat值。
升高的血浆同型半胱氨酸水平被认为是血管疾病的一个危险因素。同型半胱氨酸的动脉硬化特性被首先注意与极小组的总称为高胱氨酸尿的遗传疾病相关。该疾病状态的特征在于通常比正常血液高10倍(或更高)的循环同型半胱氨酸水平。在这些情况下，在尿中还检测到同型半胱氨酸。早期血管疾病与这种情况极为相关。例如，如果高胱氨酸尿未经处理地被留下，约50％的病人患有血栓栓塞疾病，30岁年龄的死亡率为约20％(参见例如S.H.Mudd等，美国人类遗传学杂志，37，pp.1-31，1985)。
由于多于75个流行病学或临床研究目前已显示总的同型半胱氨酸水平与冠状动脉和外周动脉疾病、中风和静脉血栓形成之间的相互关系，医学上显著需要可准确测定例如血浆中的同型半胱氨酸水平的诊断方法。如果该方法可适宜于大量病人或常规人群或新生婴儿的大规模筛选，它还将是高等有利的。该分析方法的开发原则上受两个相互关联的困难的制约：
(1)同型半胱氨酸的化学和生化特性与其它包含巯基的生物分子的那些密切相关，包括氨基酸甲硫氨酸和半胱氨酸，因此改进的用于同型半胱氨酸的分析方法必须是对同型半胱氨酸独特反应的。
(2)同型半胱氨酸是高活性的，并且在生理条件下除开同型半胱氨酸外还以许多形式存在，例如为二硫键连接的二聚体，与游离半胱氨酸经二硫键连接的异源二聚体，为与血浆蛋白的半胱氨酸残基经二硫键连接的结合物和与其它蛋白质氨基酸的R基团(例如与蛋白质赖氨酸的ε氨基)结合(通常作为N-酰基衍生物)。这些结合形式极显著地导致可能参与病理学过程的同型半胱氨酸的总量。还在仅在正常范围之外的较少增加的条件下，在血浆中的同型半胱氨酸的浓度导致统计显著的疾病危险(参见O.Nygard等，上文)，临床分析提供检测生物液体的总的同型半胱氨酸含量的能力是非常有用的。这说明游离同型半胱氨酸(或其中发现同型半胱氨酸的任何其它形式)可重复的检测，但不存在来自其它物质，如甲硫氨酸和半胱氨酸的干扰也为临床医生提供有价值的信息。
因此，本发明针对克服在对病人样品的大规模筛选的条件下的上面的复杂性的同型半胱氨酸分析方法开发以及为此的试剂的选择。
可用于本发明实践中的同型半胱氨酸酶
根据本发明的实践，用下文称为“同型半胱氨酸酶”的酶酶促测定生物样品中的同型半胱氨酸浓度，其被定义为能催化从同型半胱氨酸产生硫化氢的反应的酶。在通常的情况下，还产生氨和α-丁酮酸。如本文所描述的，优选检测称为硫化氢，虽然产品氨和/或α-丁酮酸或其它产品也可被检测。如本文所定义的同型半胱氨酸酶可催化涉及其它巯基化合物的反应，并在文献中获得多个名称；然而，如果它们拥有从同型半胱氨酸催化产生硫化氢的特性，则它们通常可用于本发明的实践中。
本发明实践优选的第一个同型半胱氨酸酶是来自细菌来源，恶臭假单胞菌的L-甲硫氨酸-α-脱氨-γ-巯基甲烷裂解酶(甲硫氨酸裂解酶)。该酶已由S.Ito等纯化，生物化学杂志，79，pp.1263-1272(1976)，并被测定具有约170kDa的分子量。在S.Ito研究的内容中，酶对甲硫氨酸进行α-γ消除为α丁酮酸、甲硫醇和氨。如果同型半胱氨酸为底物，那么α丁酮酸、硫化氢和氨将是产生的产物。类似的酶已从卵状假单胞菌分离，H.Tanaka等，生物化学杂志，16，pp.100-106(1977)。还开发了重组产生该假单胞菌属酶的方法(参见Y.Tan等，蛋白质的表达和纯化，9，pp.233-245，1997)，并且，在诊断试剂盒的成本和分析的可重复性方面，期望重组酶在本发明临床实践中的应用提供优势。Tan等的参考文献描述了包含单拷贝的酶编码序列的称为pAC1-1的克隆的构建。称为pAC1-11的串联包含两个拷贝的编码序列另一个克隆已被构建。使用PAC1-1结构，pT7-7质粒被用来构建pAC1-11。在BamHI位点两个编码序列被连接在一起，第一个基因将NdeI位点与BamHI位点连接，第二个基因将BamHI位点与另一个BamHI位点连接。
还测定了恶臭假单胞菌酶的底物特异性。例如，N.Esaki等，酶学方法，143，pp.459-465(1987)报道在相对活性大小上，针对甲硫氨酸的活性被指定为100，半胱氨酸为10和同型半胱氨酸为180。酶对于所有三种含硫氨基酸为活性的强调需要定义可恰当测定硫化氢来源的临床分析。应注意到酶对于同型半胱氨酸比对于半胱氨酸的表观10倍的优选不能解释为生物样品中的半胱氨酸的浓度可能高-实际上大大高于同型半胱氨酸的浓度。使用现有技术已知的常规的筛选方法和分析法，适宜纯化活性的同型半胱氨酸酶可来自其它假单胞菌属的种或来自其它细菌。
另一组为可用于本发明实践中的同型半胱氨酸酶的来源的微生物为毛滴虫属的种的寄生虫和相关的原生动物。毛滴虫属是重要的尿道寄生虫并为耐氧(但绝非厌氧)的具鞭毛原生动物。根据本发明的实践优选使用来自阴道毛滴虫同型半胱氨酸酶。
为了抵销宿主组织中氧的毒性，认为毛滴虫属的种使用其硫醇代谢的能力，参见K-W Thong等，实验寄生虫学.63，pp.143-151(1987)和本文引用的文献。虽然在毛滴虫属的种之间发现了在同型半胱氨酸酶活性的相当大的变化(本文称为同型半胱氨酸脱硫酶活性)，通常筛选可获得种类的可接受水平的酶活性。通常来讲，在用于下述分析法中，优选同型半胱氨酸酶应具有至少约1单位/mg纯化蛋白的比活，虽然本领域技术人员熟知设计使用更多或更少量的具有不同酶活性的酶或酶制剂的这些分析法的改变的相关技术。注意到高度纯化和活性恶臭假单胞菌酶具有约20单位/mg的比活(一个单位的酶活性可被描述为在标准条件下每分钟转化的1mmol底物)(参见Y.Tan等，上文)。
上面的K-W.Thong等(1987)报道的“同型半胱氨酸脱硫酶活性”看来来自负责毛滴虫属中的甲硫氨酸纯化分解活性的相同的酶，B.C.Lockwood和G.H.Coombs(生物化学杂志，279，pp.675-682，1991)后来提到甲硫氨酸-γ-裂解酶，其中还描述了该酶的纯化。如上所述，来自阴道毛滴虫的甲硫氨酸-γ-裂解酶(同型半胱氨酸)的使用优选用于本发明的实践中。
还优选阴道毛滴虫酶的重组形式的使用。一个可能的克隆方法遵循A.Marcos等的观察结果，FEMS微生物通讯，135，pp.259-264(1996)，即阴道毛滴虫基因可能具有很少的内含子。因此，构建基因组文库(参见D.E.Riley等分子和生物化学寄生虫学，51，pp.161-164，1992)，并用被预期反映一些部分保守序列的对应于恶臭假单胞菌酶的DNA片段筛选。
Lockwood等还列举了包括假单胞杆菌属、梭状芽孢杆菌属和气单胞菌属的种的其它具有甲硫氨酸-γ-裂解酶活性的细菌。
期望这些种类是可用于本发明实践中的同型半胱氨酸酶活性的来源。期望提供有用的同型半胱氨酸酶的另外的生物为一些海藻(参见例如D.A.Gage等，自然，387，pp.981-897，(1997)，描述了具有广泛甲硫氨酸相关代谢的种类)；硫细菌；和土壤或其它生活在极端环境条件下的微生物(参见例如R.A.Kerr，科学，276，pp.703-704，1997和E.Pennist，科学，276，pp.705-706，1997)。可为同型半胱氨酸酶类型的酶的有利来源的其它微生物的实例包括涉及牙周疾病的细菌，如能从半胱氨酸形成挥发性硫的那些。在这方面，参见S.Persson等，口腔微生物和免疫学，5(4)，pp.195-201，1990。
最后，对于可用于本发明实践中的“同型半胱氨酸酶”的定义，在本文不应局限的理解为硫化氢必须是该酶的产物。广义上讲，本发明提供高生产率的诊断方法，其允许对非常大量的包含同型半胱氨酸的样品的进行成本有效的分析，同时避免检测干扰物。
因此，如果在可避免来自类似于同型半胱氨酸的物质的干扰的条件下，该方法检测这些代谢物，则期望分解同型半胱氨酸的其它酶可用于本发明的实践中。下面的实施例描述了准确测定同型半胱氨酸，同时避免检测干扰物的方法的大的图谱。因此，理解下面公开的方法可被本领域技术人员修改用于使用许多其它对同型半胱氨酸作用的酶的检测方法中。
嵌合同型半胱氨酸酶
如上所述，在本发明的一个优选方面，提供编码嵌合同型半胱氨酸酶的来自多于一个基因(或其它多核苷酸，如cDNA或其它内含子较少的序列)的嵌合核苷酸序列(DNA或RNA)。
这些同型半胱氨酸酶具有对于本发明极为有用的特性，其一个优选的实例包括包含对应于阴道毛滴虫和恶臭假单胞菌同型半胱氨酸酶的氨基酸序列的嵌合酶。
认为在各种条件下，恶臭假单胞菌同型半胱氨酸酶比阴道毛滴虫酶更稳定。作为其一个适宜的共有序列，参见B.Lockwood等，生物化学杂志，279，pp.675-682(1991)，纯化中阴道毛滴虫酶的回收非常低(参见p.679表2，称为“甲硫氨酸γ裂解酶”)。因此，在本发明的实践中，为了发挥其增强的稳定性，在嵌合酶中优选包括恶臭假单胞菌序列。
如上所讨论的，不同的同型半胱氨酸酶对其各种含硫底物，例如半胱氨酸、甲硫氨酸和同型半胱氨酸具有各自不同的活性。虽然在特定的环境中具体反映条件的选择可能影响表观活性，但证据表明针对作为底物的同型半胱氨酸阴道毛滴虫酶比恶臭假单胞菌酶具有更高的活性，而恶臭假单胞菌对作为底物的半胱氨酸或甲硫氨酸显示更大的活性。在这方面，Lockwod等，1991，在其表4中报道的结果值得注意，因为阴道毛滴虫酶的相对活性数据证实了非常显著的“优先权”将同型半胱氨酸作为底物(还参见其p.678报道的Km数据)。这与N.Esaki等报道的上面对于恶臭假单胞菌酶的数据相反。
因此，用于本发明临床诊断应用中的同型半胱氨酸酶的特性可通过提供由于来自其两个组成部分的种类的嵌合蛋白而产生的功能性特性的为嵌合分子的酶而得以改进。尤其是，优选选择在本发明的嵌合同型半胱氨酸酶中包含本质上导致其稳定性的恶臭假单胞菌酶的区，同时还包含优选增强对作为底物的同型半胱氨酸的活性的阴道毛滴虫酶的区。
在该酶的设计方面，最近报道的阴道毛滴虫同型半胱氨酸酶确实代表来自两个基因的两种蛋白质种类是引人注意的(参见J.C.Mottram，序列直接送递至Gene Bank，1997，7，17提交，阴道毛滴虫mgl1基因，登记号AJ000486，NIDg2330884，和阴道毛滴虫mgl2基因，登记号AJ000487，NIDg2330886)，如直接提出的，其全部序列被全部被本文引作参考。还参见1998，2，26公开的国际专利申请WO98/07872和A.McKie等，生物分析杂志，278，pp.5549-5556，1998。
由此，本发明提供包含编码恶臭假单胞菌同型半胱氨酸酶的氨基酸序列和阴道毛滴虫同型半胱氨酸酶的氨基酸序列(来自mgl1或mgl2或两者)的从中可表达具有同型半胱氨酸酶活性的功能性蛋白的嵌合核苷酸序列的纯化和分离DNA分子。在一个优选的方面，核苷酸构建物(或对应于氨基酸构建物)主要对应于恶臭假单胞菌的核苷酸序列，因此提供包含恶臭假单胞菌同型半胱氨酸酶的编码核苷酸序列的DNA分子，其中它的编码所述酶的一个或多个氨基酸的一个或多个亚序列对应地被一个或多个编码阴道毛滴虫同型半胱氨酸酶的对应的氨基酸的亚序列取代。在本发明的一个实例中，mgl1基因编码的阴道毛滴虫酶在下文被称为T1蛋白，mgl2基因编码的阴道毛滴虫酶在下文被称为T2蛋白。
在嵌合多肽和编码多核苷酸的选择方面，下面的考虑值得注意。T1和T2蛋白由明显类似的DNA序列所编码。因此，通常希望是这样的情况，将mgl1编码亚序列置换入恶臭假单胞菌骨架中本质上具有相同的效果，并产生本质上类似于从等同的mgl2亚序列置换产生的那些的改进。
然而，注意到存在有限数目的亚区，其中T1和T2序列基本不同，而同时T1序列(T2序列不甚如此)显示与公开的恶臭假单胞菌序列本质的同源性。的确，公开的恶臭假单胞菌序列显示与T1序列显著的同源性。
因此，本发明的另一个优选的方面，存在确定的阴道毛滴虫酶的编码序列区，其中T2序列和对应的T1序列相互极为不同，然而T1序列本质上与恶臭假单胞菌序列类似。不被理论所限制，认为T2的这些编码亚区提供唯一的插入至恶臭假单胞菌编码提供针对同型半胱氨酸的嵌合种类的增强的活性的氨基酸序列区的多核苷酸中的机会，从而便于本发明的诊断方法。
由此，本发明提供包含恶臭假单胞菌同型半胱氨酸编码序列的DNA分子，其中其各自编码所述酶的一个或多个氨基酸的一个或多个亚序列对应地被一个或多个各自编码阴道毛滴虫同型半胱氨酸酶的一个或多个对应的氨基酸的核苷酸亚序列取代，并且其中所述产生的氨基酸取代选自：
(a)来自阴道毛滴虫(T2)的Cys-Ser-Arg-Ala-Asp-Ile-Ile-Ala-Lys-Val-Lys-Ser(SEQ ID NO：1)或其任何子集取代来自恶臭假单胞菌的Val-Gly-Ser-Gln-Ala-Leu-Val-Asp-Arg-Ile-Arg-Leu(SEQ ID NO：2)或其任何子集；
(b)来自阴道毛滴虫(T2)的Asp-Val-Asp(SEQ ID NO：3)或其任何子集取代来自恶臭假单胞菌的Glu-Leu-Lys(SEQ IS NO：4)或其任何子集；
(c)来自阴道毛滴虫(T2)的Cys-His-Val-Val(SEQ ID NO：5)或其任何子集取代来自恶臭假单胞菌的Ala-Leu-Gln-Leu(SEQ IS NO：6)或其任何子集：
(d)来自阴道毛滴虫(T2)的Cys-Glu-Asn-Val-Gln-Asp-Ile-Ile-Asp-Asp(SEQ ID NO：7)或其任何子集取代来自恶臭假单胞菌的Gly--Leu-Glu-Asp-Ile-Asp-Asp-Leu-Leu-Ala(SEQ IS NO：8)或其任何子集；和
(e)包含一种、两种、三种或四种由上面(a)、(b)、(c)和(d)组提供的取代的所有组合。
对于上面列出的阴道毛滴虫mgl2(“T2”)的氨基酸序列，应注意到它们大致对应于下面的氨基酸序列的位置：
Cys-Ser-Arg-Ala-Asp-Ile-Ile-Ala-Lys-Val-Lys-Ser(SEQ ID NO：1)，大约226-237；
Asp-Val-Asp(SEQ ID NO：3)，大约318-320；
Cys-His-Val-VAl(SEQ ID NO：5)，大约331-335；和
Cys-Glu-Asn-Val-Gln-Asp-Ile-Ile-Asp-Asp(SEQ ID NO：7)，大约381-390。
对于本发明这方面的实例，上面列出的阴道毛滴虫亚序列可被另外修饰以接受保守的氨基酸置换。此外，阴道毛滴虫亚序列不需对应地取代上面列出的恶臭假单胞菌序列，这样例如阴道毛滴虫亚序列可在附近被插入(即从中高达约10个氨基酸位置的距离)，同时靶定的恶臭假单胞菌序列部分或全部原位保留。此外，阴道毛滴虫插入物可包含在其上述序列的N末端或C末端侧发现的其它氨基酸的转移，只要针对同型半胱氨酸的增加的活性的好处不因为降低的酶稳定性而受损害。
适宜的嵌合编码多核苷酸的构建对于本领域技术人员是显然易见的，并可包括定点突变或环出诱病较少或使用PCR技术。用于这些编码多核苷酸表达的适宜的宿主细胞描述在例如Y.Tan等，蛋白质的表达和纯化，9，pp.233-245，1997。
用于缺乏对半胱氨酸的活性的一步分析法的同型半胱氨酸酶
根据本发明的实例，还提供新的基本上对半胱氨酸为非活性的同型半胱氨酸酶，即任何该活性足够低致使组织液、尿液、血液、血清或血浆样品或其它来自人类个体的生物液体或样品中存在的同型半胱氨酸的量可在一个酶分析法中测定--不需要校正还存在于样品中的半胱氨酸和/或甲硫氨酸的量。当认识到这些生物样品中的半胱氨酸是/或甲硫氨酸的浓度通常比其中的同型半胱氨酸浓度高很多，并且在一些疾病状态尤其如此时，由于对简易和快速同型半胱氨酸分析的广泛的公共健康需要，这些发现的重要性对临床医生马上为显然易见的。虽然这些酶可能与甲硫氨酸反应，但由于不同的可检测反应产物(硫化氢)产生，这通常是不相关的。
在这方面，由SEQIDNO：10代表的新的阴道毛滴虫同型半胱氨酸酶的活性尤其引人注意(参见实施例8，和图2至4，下文将进一步讨论)。与对半胱氨酸比较，该酶对同型半胱氨酸的相对活性容易允许同型半胱氨酸的测定，而不需要校正存在于生物检测样品中的任何半胱氨酸。
在本发明的一个优选的实施例中，该新的酶被模仿在各种微生物中发现的同型半胱氨酸酶，包括假单胞杆菌属、梭状芽孢杆菌属气单胞菌属或毛滴虫属，尤其优选的同型半胱氨酸酶来自阴道毛滴虫，包括从其mgl1基因(SEQ ID NO：11)或mgl2基因表达的那些。
在图1中(面A和B)描述了两种阴道毛滴虫同型半胱氨酸酶的氨基酸序列，第一个来自本发明的新的克隆(pAC2-1)，第二个酶来自已知的mgl1基因(还参见SEQIDNO：10和12用于氨基酸的比较；SEQ ID NO：9和11用于编码DNA的比较)。与mgl1比较，将看到pAC2-1特征在于三个不同(突变)的存在：
在氨基酸位置47，Phe变为Leu，
在氨基酸位置172Asp变为Glu，和
在氨基酸位置308，Ser变为Tyr。
通过掺入包括一种或多种这些不同(突变)的氨基酸置换产生的修饰的同型半胱氨酸酶的氨基酸序列尤其可用于本发明实例中。因此，本发明优选的实例包括提供同型半胱氨酸酶以包含一种或多种选自下面的SEQIDNO：10的(亚)序列：
(a)Gly-Gly-Asn-Arg-Leu-Ala-Gly-Gln-Glu(参见SEQIDNO：10的残基43-51)
(b)包含Leu的(a)的子集；
(c)Arg-Val-Cys-Lys-Glu-Ala-His-Ser-Gln(参见SEQIDNO：10的残基168-176)
(d)包含Glu的(c)的子集；
(e)Gln-Met-Arg-Met-Tyr-Gly-Ser-Met-Ile(参见SEQIDNO：10的残基304-312)；和
(f)包含Tyr的(e)的子集。
还应注意到SEQIDNO：10，即本发明优选的同型半胱氨酸酶由从阴道毛滴虫基因组DNA分离的基因的DNA序列(pAC2-1，参见SEQIDNO：9)表达而来。相反，报道的mgl1和mgl2的分离看来涉及cDNA步骤。pAC2-1可能因此代表新的同型半胱氨酸酶毛滴虫属基因。
在一个代表性实例中，同型半胱氨酸酶模仿来自假单胞杆菌属、梭状芽孢杆菌属气单胞菌属或毛滴虫属的酶，其中其起始多肽序列的一个或多个肽亚序列对应地被一个或多个选自下面的SEQIDNO：10的同源肽序列取代：
(a)Gly-Gly-Asn-Arg-Leu-Ala-Gly-Gln-Glu(参见SEQIDNO：10的残基43-51)
(b)包含Leu的(a)的子集；
(c)Arg-Val-Cys-Lys-Glu-Ala-His-Ser-Gln(参见SEQIDNO：10的残基168-176)
(d)包含Glu的(c)的子集；
(e)Gln-Met-Arg-Met-Tyr-Gly-Ser-Met-Ile(参见SEQIDNO：10的残基304-312)；和
(f)包含Tyr的(e)的子集。
在这方面，术语“同源”的使用不表明该同源性是准确的，但使用公知的模型的对这些序列的比较表明即使目前显著不同，但这些序列可能来自共同的祖先基因或其子集。类似地，如本文使用的术语“突变”应广泛地被理解包括由天然或实验性等任何方式产生的修饰。
因此，通常优选的实例包括模仿第一种毛滴虫同型半胱氨酸酶的嵌合同型半胱氨酸酶，其中其一个或多个对应于第二个毛滴虫同型半胱氨酸的Leu47、Glu172和Tyr308残基(来自pAC2-1，如SEQIDNO：10所描述)的氨基酸对应地被一个或多个所述Leu47、Glu172和Tyr308取代。
本发明另一个实例通过为SEQIDNO：10的置换变异体、插入变异体、缺失变异体或其它衍生物的同型半胱氨酸酶确定，其中所述变异体或衍生物具有一种或多种下面的特性：
(a)在适宜分析法中，SEQIDNO：10对同型半胱氨酸活性的至少约10％，优选约至少25％，较优选约至少50％(如实施例8所描述)；和/或
(b)在适宜分析法中，SEQIDNO：10对半胱氨酸或甲硫氨酸活性的不超过约1000％，优选小于500％，较优选小于200％(如实施例8所描述)。
该特性的范围通常被认为与半胱氨酸或甲硫氨酸比较，保持酶对同型半胱氨酸的的足够的增强的活性以致一步法仍然可行，虽然理解在各个临床应用中对这一相对敏感性的准确的要求可容易地被确定。例如，至少对于非患病的病人半胱氨酸通常被期望在尿样中为低浓度。对于提供如例如通过适宜重组方法产生的来自其它生物的突变同型半胱氨酸酶，上面相关的提示被期望是有用的。由于该同型半胱氨酸酶对同型半胱氨酸的比活性比对半胱氨酸和甲硫氨酸高至少约100倍，因此由SEQ ID NO：10代表的酶是尤其有用的实例。
在一个其中同型半胱氨酸酶被修饰以提高其用于一步分析法中的有用性的代表性实例中，如下改变(当然通常通过修饰适宜的编码DNA)野生型阴道毛滴虫的氨基酸序列(来自mgl1，参见SEQ ID NO：11和12)：
缺失Phe47、Asp172和Ser308其中的一个或多个，或被根据下式取代：
(1)对于Phe47，用Leu、Ile、Val、Ala、Gly、Met和Trp取代；
(2)对于Asp172，用Glu、Gln或Asn取代；
(2)对于Ser308，用Tyr、Phe、Met、Trp、Gln、Thr或Asn取代，
其中如现有技术所认识的，提示了相对保守的氨基酸置换，以及其在这方面的功效可通过常规实验确定。
如下进一步描述的(参见实施例7)，镍-NTA亲和纯化方法(可从Qiagen公司购得，德国)可被用来易化同型半胱氨酸酶从大肠杆菌或其它被适宜同型半胱氨酸酶编码DAN序列转染的宿主细胞中的纯化。这些方法利用了蛋白咪唑基选择性地与固定在NTA树脂介质中的镍阳离子的结合。在本发明这方面的一个优选的实例中，通过修饰适宜的编码DNA(参见SEQ ID NO：9和10)，包含例如6个组成型组氨酸残基的氨基末端的标记被导入同型半胱氨酸酶中，从而便于其从宿主细胞物质中的纯化。
同型半胱氨酸酶SEQ ID NO：10(还参见图1AB)是包含一个或多个位于所述蛋白的天然Met1的N末端侧的组氨酸的修饰的同型半胱氨酸酶的代表，其中所述修饰的酶对半胱氨酸或甲硫氨酸无活性，足以使存在于个体组织液、尿液、血液、血清或血浆中的同型半胱氨酸的浓度可通过在一步分析法中使用该酶来测定。在该分析法中，测定从所述修饰的同型半胱氨酸酶对同型半胱氨酸反应产生的一种或多种产物的量，并且这些测定基本上不受样品中半胱氨酸或甲硫氨酸浓度的影响。根据这方面的公开，可用于本发明实例中的同型半胱氨酸酶包含一个或多个，优选2-15个，最优选5-8个组成型地位于天然同型半胱氨酸酶Met1的N末端侧的组氨酸残基。
实施例
实施例：通过双酶减法检测包含半胱氨酸样品中的同型半胱氨酸
如下测定血浆样品中的同型半胱氨酸的浓度。使用EDTA作为抗凝剂用标准真空器收集血样(0.1-5.0ml)，接着离心制备血浆。
虽然希望血样中的游离同型半胱氨酸的测定为临床医生提供提供有用的预测信息，但认识到大部分同型半胱氨酸以与其它分子经二硫键结合存在(例如游离半胱氨酸、其它同型半胱氨酸分子和可获得的蛋白质巯基基团)。根据本发明的实例，通常优选在方法中使用二硫化物还原剂(如二硫苏糖醇，“DTT”)以使得能检测更宽范围的同型半胱氨酸分子。
还制备150单位/ml阴道毛滴虫酶的同型半胱氨酸酶贮液。虽然取决于各种因素，包括样品中的同型半胱氨酸的浓度，确切的活性要经实验者选择，但酶贮液范围通常为1-1000单位/ml，优选100-200单位/ml。
如上所述，还优选以类似的活性水平使用恶臭假单胞菌酶。
在缓冲液中为适宜稀释度的血浆样品被分成等体积的两份，份1和份2。向份1中加入适宜量的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(“SAHH”)
和一定量的腺苷(SAHH可来自真核和原核来源，提供了在阴道毛滴虫中克隆它的方法，Bagnara等，分子和生物化学寄生虫学，81，pp.1-11，1996)。在存在足够的腺苷时，血浆中的同型半胱氨酸被转化为S-腺苷同型半胱氨酸。份2体积不与SAHH反应。
接着将阴道毛滴虫同型半胱氨酸酶加入至份1和份2样品中并反应约10-30分钟。优选同型半胱氨酸酶的最终浓度为0.5-1单位/ml的范围，虽然如所需可调节准确的量。注意到保留在份1样品中的腺苷防止水解反应向反方向进行，因此选择其起始浓度应考虑这一点。需要量考虑取决于选择的SAHH，但有用的起始点为不少于存在的同型半胱氨酸的浓度。接着测定份1和份2的硫化氢，通过从份2中减去份1的硫化氢测定值，并将结果乘以2来计算存在于起始样品中的同型半胱氨酸的量。通过将范围为约0.1-1.0mol的乙酸铅加入到样品中，从而沉淀硫化物来进行硫化氢的测定。在360nm或其它可测定不溶性沉淀的适宜波长下(如在可见光范围)用标准分光光度计测定沉淀物。
可用于双酶减法的实例中的另一种酶为胱硫醚β合成酶，它催化从同型半胱氨酸和丝氨酸产生胱硫醚骨架。对于血清或血浆样品，可通过利用血液中相对高浓度的丝氨酸在胱硫醚方向驱动反应。该酶适宜的来源包括从毛滴虫属、假单胞杆菌属或来自哺乳动物组织，包括例如肝脏分离的物质。该酶可以提供与上面对S-腺苷同型半胱氨酸水解酶描述的范围相等的单位/ml的量使用。如上面与使用SAHH结合所述的，优选采取步骤以防止该酶促反应朝可能导致不准确数据的反方向进行。可通过将外源丝氨酸加入至反应样品中，或通过一旦完成对胱硫醚的转化不可逆地抑制酶在胱硫醚方向驱动，接着保持反应。适宜的抑制剂包括对活性位点具有高亲和性的丝氨酸类似物。
可获得其它基于双酶减法的方法。最近公开的研究可能表明酶甲硫氨酸tRNA合成酶(甲硫氨酸tRNA合成酶)能接受同型半胱氨酸作为反应物(参见H.Jakubowsky等，FEBS通讯，317，pp.237-246，1993)。因此，使用该酶可重复上面的结果。
实施例2：另一种S-腺苷同型半胱氨酸水解酶法
将根据实施例1产生的S-腺苷同型半胱氨酸进行下面的操作：在其产生后，将其分离，并在S-腺苷同型半胱氨酸被转化回至同型半胱氨酸的条件下，与另外量的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶接触；此后，将用所述酶制剂产生的同型半胱氨酸与同型半胱氨酸酶接触以从中产生硫化氢。
实施例3：通过直接酶促减法对包含半胱氨酸的样品中的同型半胱氨酸的检测
在实施例1的起始步骤后，制备包含同型半胱氨酸和半胱氨酸的血浆样品。不将样品分成份；相反，在存在的半胱氨酸与tRNA混合的条件下加入酶半胱氨酸tRNA合成酶样品。酶可选自真核或原核生物，并且现有技术熟知其反应条件。
接着，如上所述将缺乏半胱氨酸的样品与同型半胱氨酸反应，直接从硫化氢的测定值确定同型半胱氨酸的浓度。
在下面实施例10中提供另一种直接酶减法的实例，其基于可为真核或原核来源的酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶。描述了引入使用该酶的分析体系。
可用于缺失半胱氨酸的其它酶包括半胱氨酸氧化酶和胱硫醚β-合成酶。
实施例4：检测与其它生物分子结合的同型半胱氨酸的方法
如上所述，同型半胱氨酸与其它生物分子结合存在于生物液体中，以这种形式“储存”的同型半胱氨酸被认为导致病理学过程。因此，可望确定总的同型半胱氨酸的量，这包括(1)同型半胱氨酸二聚体，(2)同型半胱氨酸/半胱氨酸异源二聚体，(3)同型半胱氨酸与蛋白质的结合物，其中同型半胱氨酸通过二硫键与蛋白质的半胱氨酸结合，以及(4)同型半胱氨酸与蛋白质的结合物，其中同型半胱氨酸(包括其N-酰化的形式)与蛋白质的氨基酸的R基团结合，最显著的是与蛋白质赖氨酸的ε氨基结合。
对于形式(1)至(3)，还原溶液被用来释放共价结合的同型半胱氨酸。在一个实施例中，制备约0.1M或更小的硼氢化钠贮液或氰基氢硼化钠溶液。通过室温下，在pH6-8下将硼氢化物加入到血浆样品中(在实施例起始步骤之后)达5分钟来进行反应。消除过量的氢硼化物，接着将样品进行实施例1或3的酶促步骤。另外，样品被根据下面的步骤进一步处理，可用HCl中和硼氢化物。
然而，在某些环境下，发现硼氢化钠可使同型半胱氨酸酶变性，因此优选使用DTT。
实施例5：酸条件下的处理
对于上面形式(4)，可以约50/50蛋白质样品的稀释度使用6NHCl。氮气氛下，在沸腾温度下回流1-2小时后，真空下，将水从样品中除去至完全干燥。如果与其它氨基酸结合，这释放同型半胱氨酸，并且还完成同型半胱氨酸内酯化过程。在干燥点，加入乙酸钠(1M)和乙酸酐(10M)。沸腾温度下再回流1小时以产生乙酰化的同型半胱氨酸硫羟丙酮。
通过蒸发除去酐至干燥。用乙醚选择性地提取N-乙酰化的同型半胱氨酸硫羟丙酮。35℃下，真空蒸发乙醚。接着加入打开硫羟丙酮环的生理缓冲液(磷酸盐缓冲液，pH7.5)。此时，进行其中一个反应。可接着加入同型半胱氨酸，反应10-30分钟，接着如上检测硫化氢，或优选加入猪肾脱乙酰酶以使同型半胱氨酸脱乙酰化，随后加入同型半胱氨酸酶。
实施例6：通过直接酶促减法检测还包含半胱氨酸的样品中的同型半胱氨酸的其它方法
通常来讲，这一另外的方法利用了这一事实，即通过同型半胱氨酸酶作用从半胱氨酸产生的丁酮酸可独立于通过同型半胱氨酸酶对生物样品，如血浆中存在的同型半胱氨酸和半胱氨酸作用产生的硫化氢而被检测。因此，同型半胱氨酸的确定可通过一次减法来进行。根据该方法，丁酮酸可通过任何数量的从中产生可检测产物的酶来测定。类似的，可使用亮氨酸脱氢酶根据硫化氢确定α-丁酮酸(从同型半胱氨酸而非半胱氨酸产生)。
该方法的两个基本过程，丁酮酸的检测和硫化氢的检测可在有适宜对照的情况下，在一个样品中同时进行，或它们可在平行样品中独立地进行。
在一个优选的实例中，被用来检测丁酮酸的酶为哺乳动物乳酸脱氢酶，并且使用标准的分光光度计在一个杯中进行丁酮酸和总的硫化氢测定。在实施例1的起始步骤后，优选包含同型半胱氨酸和半胱氨酸的血浆样品。不将样品分成份，代之以在从同型半胱氨酸产生硫化氢、氨和α丁酮酸，和另外，硫化氢、氨和丁酮酸从半胱氨酸产生的条件下，加入同型半胱氨酸酶(来自阴道毛滴虫或恶臭假单胞菌)。还在致使它将与从半胱氨酸产生的丁酮酸反应的条件下，加入酶乳酸脱氢酶的样品(以可与用于前面实施例的单位/ml的量)，接着在340nm或其附近以熟知的方法检测反应(对于NADH)。
如前(参见实施例1)，可通过测定从同型半胱氨酸酶产生的全部的硫化氢，并且在可检测沉淀的有色铅盐的任何适宜波长下，如在可见光的范围或在或靠近例如360nm下用比色法测定样品中同型半胱氨酸和半胱氨酸的总浓度。如现有技术所知，还可根据其它发色金属盐的形成来检测硫化氢。通过将(从半胱氨酸和同型半胱氨酸)产生的全部硫化氢与(仅从半胱氨酸)产生的全部丁酮酸比较来确定原始样品中的同型半胱氨酸的浓度。该方法也可很容易自动进行，并可同时监测两个检测波长。
虽然使用乳酸脱氢酶检测血液或来自血液的溶液中的丁酮酸可遵循一些现有技术公知的方法，但应重复某些预防措施。丁酮酸在血液和从其产生的物质中极不稳定，并且它甚至可聚合。因此，如现有技术所知，可望在回收样品的无蛋白质过滤物和仅当用偏磷酸处理的样品中进行丁酮酸的测定。
实施例7：大肠杆菌BL21(DE3)pAC2-1克隆的产生
如下所述地完成阴道毛滴虫的pAC2-1同型半胱氨酸酶基因的克隆。通常来讲，被认为可用于其它微生物中的重组方法对于毛滴虫DNA的操作也是可用，尤其是因为如上所述许多毛滴虫基因缺乏内含子。有用的参考文献因此可参考Y.Tan等蛋白质的表达和纯化，pp.233-245，(1997)和1996，12，19公开的Y.Tan等的国际专利公开号WO96/40284。
通过标准方法(Wizard Minipreps，Promega，Madison，WI)从阴道毛滴虫分离基因组DNA，并将其用作根据PCR试剂盒(Roche，Branchburg，NJ)提供的方法进行的PCR反应的模板。根据mgl1基因的核苷酸序列产生寡核苷酸引物(J.C.Mottram等，基因库，登记号AJ000486，NID g2330884，1997，7，17提出)。
所使用的具体的引物：
(有义)5’-GGATTACATATGCATCATCATCATCATCACATGAGTGGCCACGCTATCGAC-3’(SEQ ID NO：13)，其包括CATATG NdeI位点；和(反义)5’-GGATTAGGATCCTTAGAGGACTAAGTCGAGAGCC-3’(SEQ ID NO：14)，其包括GGATCC BamHI位点。使用的其它试剂包括限制性内切酶、T4DNA连接酶和和BL21(DE3)感受态细胞，所有均购自Stratagene(San Diego，CA)。GeneAmp PCR试剂盒购自Roche(Branchburg，NJ)，DNA纯化试剂盒购自Promega(Madison，WI)。PCR扩增的寡核苷酸探针由IDT公司(Coralville，IA)合成。所有其它试剂购自Sigma(St.Louis，MO)。野生型阴道毛滴虫购自美国典型培养物中心(Rockville，MD)。
如下进行PCR反应：94℃，1分钟变性；50℃退火，2分钟；和72℃延伸2分钟，35次。这之后是72℃最后一次延伸，10分钟。收集PCR扩增产物(通过Kb梯形标记确定其表现为一个1.2kb的带)，用NdeI和BamHI限制酶消化，使用标准方法(由Dr.Stan Tabor，Harvard Medieal School，Boston，MA，参见Tabor，S.“使用T7RNA聚合酶/启动子体系的表达”，在现代分子生物学方法，F.A.Ausubel等编，1990，pp.16.2.1-16.2.11，Greene Publishingand Wiley-Interscience，New York)，在其NdeI和BamHI克隆位点与pT7-7载体相连。接着通过电转化法将产生的质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。
37℃保温过夜后，从含有氨苄青霉素的平板中选择氨苄青霉素抗性克隆。37℃下，将来自选择菌落的细胞在5ml LB培养基(Fisher)中培养过夜。根据α丁酮酸分析(使用K.Soda等方法的改进，酶学方法，143，459-465，1981-基于甲基-2-苯并噻唑啉酮腙的反应)，和/或其中产生和测定了H2S的脱硫甲基化作用分析(参见A.E.Braunstein等，生物化学与生物物理进展，242，pp.247-260，1971)中的粗培养物提取物的酶活性选择适宜的克隆，这两种分析方法在下面将被直接引用。
还构建了大肠杆菌BL21(DE3)pAC2-1克隆的变异体，其中该变异体不同仅在于包含的质粒(表达载体pAC2-11，也基于pT7-7)包含串联存在的两个拷贝的编码体系半胱氨酸酶的序列。称为大肠杆菌BL21(DE3)pAC2-11的该特定的克隆，提供用于本发明诊断过程中的高水平的重组体系半胱氨酸酶的表达。简单地说，2拷贝的编码序列被放在pT7-7的NdeI和Bsp106I位点之间。第一个拷贝将NdeI与BamHI相连，第二个将BamHI与Bsp106I相连。可通过相同的方法从pAC2-1或pAC2-11克隆纯化重组体系半胱氨酸酶。
α丁酮酸/丙酮酸分析法
在本分析法的第一步，37℃下，将还含有10um吡哆醛磷酸和不同浓度(25uM-25mM)的DL-同型半胱氨酸或L-甲硫氨酸或L-半胱氨酸的1ml体积的100mM磷酸缓冲液，pH8.0分别与足够的粗的细胞提取物(细胞被超声破碎，离心后回收上清)样品(通常50ul)保温10分钟以提供约1-100单位的同型半胱氨酸酶(“HCYase”)。通过加入0.1ml 50％TCA终止反应。接着使用Eppendorf离心机，以13krpm将上清离心2分钟。然后将0.5ml上清样品加入至0.5ml 0.05％3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(“MBTH”)的0.8ml 1M乙酸钠溶液，pH5.2中并在50℃下保温30分钟。在OD320通过分光光度法测定各样品的反应产物的量。用牛血清白蛋白作为标准，使用Bio-Rad 500-0006盒(Bio-Rad，Richmond，CA)测定蛋白的量。以单位/mg蛋白计算酶比活，1单位酶被定义为每分钟从同型半胱氨酸催化形成1umol β-丁酮酸的量。当然还可使用提供例如1-100单位酶/分析实践的纯化的同型半胱氨酸酶样品。
脱硫甲基化作用筛选分析法
如上所述，采用的分析法为上面A.E.Braunstein等的方法的改进。标准的反应混合物由磷酸钾缓冲液(pH7.5，100mM)，乙酸铅和提供1-100单位的同型半胱氨酸酶的足够的粗细胞提取物组成，向混合物中加入不同浓度(5uM-100uM)的底物DL-同型半胱氨酸或L-半胱氨酸或L-甲硫氨酸，这样总的反应体积为1.5ml。37℃下保温10分钟后，在OD360通过分光光度法获得对硫化铅的测定。还可使用提供例如1-100单位酶/分析实践的纯化的同型半胱氨酸酶样品进行该分析法。
产物同型半胱氨酸酶的纯化
在使用上面起始分析筛选后，使用包括DEAE Sepharose快速层析法(对于来自pAC2-1克隆的产生的酶活性分布图，参见图3)，或包括镍-NTA亲和层析(对于来自pAC2-1克隆的产生的酶活性分布图，参见图4)的方法，从有希望的克隆中纯化同型半胱氨酸酶(“HCYases”)。
细胞生长条件
将10ul对应于特定克隆的冷冻的大肠杆菌贮液接种至5ml还含有10ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中(Fisher)，30℃，适当振荡下(300rpm)培养过夜。接着在500ml烧瓶中将培养物分成2份新鲜的100ml体积的LB培养基，30℃下，也以300rpm进一步培养6小时。  随后将全部培养物分至18个包含800mlLB培养基的烧瓶中(每个为6升)。37℃下，以300rpm继续培养过夜，获得大约为10的OD600。接着将细菌以4000g沉淀以使用新鲜LB培养基替代生长培养基，再在37℃下，以300rpm继续保温6小时。当OD600达到20时，通过4℃下以4000g离心10分钟收集细菌。应认识到对上面方法的各种改变也是有效的。
层析前的预处理
首先将细菌沉淀悬浮在提取溶液中(20mM磷酸钾，10uM磷酸吡哆醛和0.01％β-巯基乙醇，pH9.0)，随后用空洞式匀浆器(型号HC8000，Microfluidics公司，Newton，MA)破碎细胞。4℃下，用冷冻离心机(Sorvall，superspeed RC2-B)以8000g将悬液离心30分钟。收集上清，50℃下加热1分钟，接着使用制备级装置(型号TFF PLHK 100K，Millipore，Bedford，MA)，使用包含10mM磷酸钾缓冲液，pH8.3的2.5ft2压力的柱体进行超滤。在超滤期间将pH调至7.2。
层析条件-第一柱
将来自上面的浓缩液(为pH7.2)上样至包含2400ml填充体积的DEAESepharoseFF(Pharmacia，Uppsala，瑞典)的40mM KCl-PPM缓冲液溶液(40mM氯化钾；和10mM磷酸钾，10uM磷酸吡哆醛，0.01％β-巯基乙醇，pH7.2)的第一柱(100m直径×30cm)。上样蛋白样品后，将柱用约10体积的40mM KCl-PPM缓冲液预洗涤直至OD600降至0.1以下。将蛋白用线性梯度为40-300mM KCl的PPM缓冲液洗脱，收集500ml级分。通过其黄色和活性分析确定包含同型半胱氨酸酶的级分。
层析条件-第二柱
在对80mM KCl，10mM磷酸钾，pH8.3溶液透析24小时后，将回收的洗脱液(约2-5mg/ml代表5-10g总蛋白的回收)上样至第二柱中。上样后，将第二柱(DEAE SepharoseFF填充的Pharmacia XK 50/30-500ml体积，50mm直径×25cm)用4体积的80mM KCl，10mM磷酸钾，pH8.3(以约6-8ml/分钟的流速)预洗涤直至OD280降至0.1以下。接着用线性梯度为80-300mM氯化钾的10mM磷酸钾缓冲液(pH8.3)洗脱透析半胱氨酸酶。收集300ml级分的洗脱液，通过黄色和同型半胱氨酸酶活性可确定活性级分。以这种方式纯化的同型半胱氨酸酶的酶活结果(针对同型半胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸)在下面实施例8中讨论(还参见图3)。
另一方面，可使用另一种两阶段方法。在第一阶段，分配物质为DEAESepharoseFF，上样和预洗涤用20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2进行。使用20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2(溶液A)至20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2，500mMNaCl(溶液B)的线性梯度(8ml/分钟)完成蛋白的洗脱。在第二阶段，分配物质为phenyl SepharoseFF，上样和预洗涤用0.6M NH4SO4的20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2进行。使用0.6M NH4SO4，20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2(溶液A)至20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2(溶液B)的线性梯度(8ml/分钟)完成蛋白的洗脱。从这另一种方法获得下面的纯化结果。上述细胞裂解物包含8400单位比活为5.2(单位/mg)的同型半胱氨酸酶。在预备柱方法完成后，回收6300单位的比活为64的同型半胱氨酸酶(约75％的产率)。在完成DEAESepharoseFF步骤(第一柱)后，回收5040单位的比活为172的同型半胱氨酸酶(约60％的产率)，在phenyl SepharoseFF步骤(第二柱)后，保留4200单位的比活为300的同型半胱氨酸酶(约50％的产率)。
产生的同型半胱氨酸酶的分析
为了HPLC分析，使用具有Supelco ProgelTMTSK柱(G3000SWXL，30cm×7.8mm，Supelco，Bellefonte，PA)的L-6200A Intelligent泵(Hitachi有限公司，东京，日本)。通常上样20ul大小的包含约0.1-0.5mg/ml蛋白的样品，并用0.12M NaCl，10mM磷酸钠缓冲液，pH7.2以约1ml/分钟的流速洗脱。用分光光度计(Hitachi U2000)在280nm波长下测定包含级分的蛋白。牛血清白蛋白(MW66000)和来自甘薯的β-淀粉酶(MW200000)(Sigma，St.Louis，MO)被用作MW标准。产生的保留值为：对于BSA，8.88分钟；对于β-淀粉酶，7.82分钟；和对于产物同型半胱氨酸酶，为8.28分钟。
在(非还原的)7.5或10％聚丙烯酰胺-预制平板上，在含有或不含有0.1％SDS的0.2M Tris-甘氨酸缓冲液，pH8.3中对产生的蛋白进行电泳。使用的分子量标准为Kaleidoscope Prestained标准(Bio-Rad，Richmond，CA)。在存在0.1％SDS时，产物同型半胱氨酸酶被分离为约43kD的一条带，在不存在0.1％SDS时，为约172kD的一条带。
接着使用ACGT公司(Northbrook，IL)的T7 DNA聚合酶和双脱氧核苷酸终止反应进行适宜克隆的DNA测序。使用引物游走方法，在DNA分析仅上分析序列。
使用Ni-NTA方法纯化为6X组氨酸标记的的蛋白形式的同型半胱氨酸酶
另一种从大肠杆菌纯化重组同型半胱氨酸酶的方法包括使用镍-NTA亲和层析。该方法利用蛋白的组氨酸咪唑与固定在NTA树脂基质中的镍阳离子的亲和性。为了充分利用该方法(Qiagen公司，德国)，在同型半胱氨酸酶的天然Met1的N末端侧，将6个另外组氨酸残基的序列加入至(优选通过接着被表达的编码DNA的修饰)蛋白中(参见上面实施例7，和SEQ ID NO：9和10)。
根据该纯化方法(对于其它信息，还可参见“The QIAexpressionist，6×组氨酸标记的蛋白的高水平表达和纯化手册”，1997，3，第3版，可从Qiagen获得)，通过离心收集100ml大肠杆菌BL21(DE3)，克隆pAC2-1的浓缩生长培养物，将生的测沉淀重新悬浮在4ml裂解缓冲液中(300mMNaCl，10mM咪唑，50mM NaH2PO4，pH8.0)。接着将产生的细胞悬液在冰上超声破碎1分钟。
使用台式离心机，以最大速度进行20分钟来除去细胞碎片。接着将清亮上清与1ml Ni-NTA淤浆(Oiagen)混合，在冰上轻轻振荡60分钟以进行吸附。随后将混合物转移至可处理的聚丙烯柱中，弃去流过的级分。接着将Ni-NTA树脂珠用8ml洗涤缓冲液(300mM NaCl，20mM咪唑，50mM NaH2PO4，pH8.0)洗涤，此后，通过使用2ml洗脱缓冲液(300mM NaCl，20mM咪唑，50mM NaH2PO4，pH8.0)洗脱最终收集重组蛋白。如上鉴定纯化的蛋白。以这种方式纯化的同型半胱氨酸酶的酶活性结果(针对同型半胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸)描述在下面实施例8中(还参见图4)。
实施例8：本发明同型半胱氨酸酶的代表性的催化特性
图2-4表明本发明同型半胱氨酸酶对于一步分析法的显著提高的有用性。图2描述的结果反映出包含pAC2-1克隆的宿主大肠杆菌细胞的粗裂解物的用途，并显示了当各以25mM存在于各分析法中时3种底物(同型半胱氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸)的比活(u/mg)。图3和4描述的结果(仍对于比活pAC2-1克隆的大肠杆菌)反映出纯化的酶制剂对于同型半胱氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸的相对活性。对于如图3所示的分析，使用如实施例7描述的DEAE Separose快速方法纯化酶；对于图4，使用包括镍-NTA琼脂糖亲和试剂的实施例7的纯化方法(参见上面方法标题为“α-丁酮酸分析/丙酮酸分析”)。
清楚地认识到可获得许多方法以从宿主大肠杆菌中纯化
重组同型半胱氨酸酶。如举例说明的，本发明新的同型半胱氨酸酶对同型半胱氨酸显示通常比其针对半胱氨酸或甲硫氨酸显示的活性高100倍，甚至高达约1000倍的活性(使用本发明的分析法，参见例如实施例)。
实施例9：一步法/单酶临床分析法
将立即认识到为了利用新种类的同型半胱氨酸酶的底物特异性，生物液体中的同型半胱氨酸的多步/多酶分析方法很容易被修改用于简单化的一步/单酶分析法中(在本文术语“一步分析法”和“单酶分析法”被互换使用以表明为了在半胱氨酸和/或甲硫氨酸存在下，准确测定同型半胱氨酸，仅需将样品与一种酶接触)。适宜于这些方法的同型半胱氨酸酶的浓度一般与上面实施例1或说明书其它地方描述的那些相等或很容易地被测定。
根据本发明的单酶诊断方法，生物样品，例如全血、血浆、血清尿液或组织液中的同型半胱氨酸的浓度可被足够准确的确定以为医生提供有价值的诊断信息，而不存在来自污染浓度的半胱氨酸和/或甲硫氨酸的干扰。这些诊断分析迅速、准确，包括最少量的试剂，因此可用于临床实验室的大规模筛选操作和作为公共健康测定。
在一个代表性的实例中，正常血浆中的半胱氨酸的浓度可为约30-120uM(mMol)，同型半胱氨酸的浓度仅为约5-15uM。如现有技术的认识到的，随着血浆中的同型半胱氨酸的浓度升至15um水平之上，个体患心血管疾病的危险可能显著增加。高危心血管病人已被确定具有高达数百微摩尔的同型半胱氨酸水平。类似的，被半胱氨酸代谢疾病影响的病人可能具有高达500或甚至1000uM的半胱氨酸水平。本发明的诊断试剂盒可用于测定生物液体中1-500uM范围的同型半胱氨酸浓度，例如其中所述液体还包含0uM(通常从10uM)至约1000uM或更高的半胱氨酸。
根据本发明的优选实例，提供了同型半胱氨酸酶，其中所述酶对同型半胱氨酸与对半胱氨酸的相对活性通过检测产物硫化氢为在病人样品中测定的同型半胱氨酸的表观浓度(它还反映来自半胱氨酸的贡献)小于其实际值的约150％优选小于约110％，最优选小于约102％。在本发明的另一个优选实例中，例如使用新的从pAC2-1表达的毛滴虫同型半胱氨酸酶，在单酶分析法中测定的同型半胱氨酸的表观浓度反映出不超过来自半胱氨酸的约1％的不真实影响。
根据本发明的实例，该单酶分析法(使用例如SEQ ID NO：10作为同型半胱氨酸酶)可用于宽范围的天然浓度(和浓度比例)的同型半胱氨酸和半胱氨酸(适宜时还有甲硫氨酸)，因此能准确地反映健康个体和处于最为尤其是心血管疾病疾病状态的危险中的那些个体的液体化学。
因此，在其最优选的一个方面，本发明提供一种用于个体生物液体中的同型半胱氨酸浓度的单酶分析法中的诊断试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)同型半胱氨酸酶；和
(b)至少一种能被用来测定由同型半胱氨酸酶对同型半胱氨酸反应形成的产物硫化氢的量的试剂；其中
所述同型半胱氨酸酶对半胱氨酸是足够非活性以致任何由所述同型半胱氨酸酶对半胱氨酸反应产生的硫化氢基本上不干扰使用所述试剂盒以评价心血管疾病的危险。
由于本发明的诊断试剂盒可在宽范围的同型半胱氨酸和半胱氨酸浓度和相对浓度下使用，因此，期望存在各种本发明成功的实践的实例。代表性的实例如下：
(1)最通常的，起因于替代同型半胱氨酸的半胱氨酸的所测定的硫化氢的部分应足够小以防止由合格的医务工作者对结果的有效的解释。通常，当可规因于同型半胱氨酸的所产生的硫化氢的量大约为全部的一半时，可获得有用的诊断信息。在与同型半胱氨酸比较，病人样品中的通常较高浓度的半胱氨酸的情况下，这些酶的特异性仍然是可性的。然而，优选在分析中检测的可归因于同型半胱氨酸的全部硫化氢的部分至少为90％，优选95％。较优选98％和最优选99％或更高。根据本发明的实例，例如使用由SEQ ID NO：10代表的同型半胱氨酸酶很容易获得99％的水平。
(2)在显示了心血管疾病危险，并且其中同型半胱氨酸的浓度为约20uM或更高的病人样品的分析中，300uM或更高的半胱氨酸浓度导致少于检测总量的1％的硫化氢。显然这些酶对于具有甚至较高的半胱氨酸浓度的生物样品仍极为有效。
(3)在显示心血管疾病危险，并且半胱氨酸与同型半胱氨酸浓度的比例例如为约15∶1的病人样品的分析中，半胱氨酸导致少于检测总量的约1％的硫化氢。
下面进一步显示已知同型半胱氨酸酶与本发明新的酶之间的不同。
从阴道毛滴虫分离的同型半胱氨酸(它可能反映从多于一个基因的表达)被报道(参见上面Lockwod等，1991)对于同型半胱氨酸具有约0.5mM的Km，而对于从pAc2-1克隆表达的新的酶所测定的Km值为(均在37℃，pH8.0)：对于同型半胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸分别为4.8mM，3.45mM和3.1mM。
从37℃下，pH8.0，在1ml体积的包含10uM磷酸吡哆醛，分别为不同浓度的(10uM-1.6mM)的DL-同型半胱氨酸、L-甲硫氨酸或L-半胱氨酸的100mM磷酸缓冲液中，pH8.0，使用50ul酶(300单位/ml)进行的分析中测定Km值。提供加入0.1ml 50％TCA终止反应。接着用Eppendorf离心机以13rpm将产生的悬液离心2分钟。随后将0.5ml样品加入至0.5ml体积的0.05％3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙的0.8ml 1M乙酸钠溶液中，pH5.2，并在50℃保温30分钟。接着在通过分光光度计在OD320测定反应产物的量。使用标准动力学表达和作图从Vmax值的计算中确定报道在图5中的Kcat(转换的数字)值。
显然从pAC2-1克隆表达的酶的动力学与野生型酶的那些极为不同。本发明的另一个方面包括认识到虽然为了提供增强的动力学特性，在阴道毛滴虫酶的氨基酸序列中描述了一些改变，但本领域技术人员将找到其它可能的机理来完成它。其一个实例为在或不在活性位点该酶的共价修饰。如果它们导致具有如本文首先公开的动力学特性的酶的产生，则这些修饰同型半胱氨酸酶的其它方法在本发明的实践中。
实施例10：基于γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的分析方法
γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(EC6.3.2.2，还称为谷氨酸-半胱氨酸连接酶)是另一种可被用来增强生物样品中的同型半胱氨酸分析准确性的酶。该酶催化(和限速)在活细胞中具有许多重要功能的三肽谷胱甘肽(γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸)合成中的第一步。由于谷胱甘肽在代谢途径中起重要的作用，因此认为γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶极不可能接受同型半胱氨酸作为对底物半胱氨酸的替代。因此，该酶的使用通过除去所有干扰的半胱氨酸而导致生物样品中的同型半胱氨酸的高度特异性的测定(借助于同型半胱氨酸酶)。在一个一个优选的实例中，使用直接酶减法进行分析(参见上面实施例3)。
A部分-大肠杆菌γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶编码DNA的表达
本发明一个重要的成绩是提供对生物样品中的同型半胱氨酸的浓度进行准确测定的高敏感性的酶基分析法。如上所述，在许多种生物样品中，天然发生浓度的半胱氨酸干扰同型半胱氨酸的测定。如下所述，一种特别优选的用于同型半胱氨酸的酶基分析法包括使用两种酶，(1)对同型半胱氨酸具有高特异性对半胱氨酸具有极低特异性的同型半胱氨酸酶(如从pAC2-1表达的阴道毛滴虫酶，SEQ ID NO：10)和(2)如来自克隆GSH-I His(参见下文)的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，使用它将进一步消除来自半胱氨酸的干扰。
立即理解一旦认识该多酶方法的价值，使用的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶可从各种来源提供，如猪的肝脏、小麦的胚芽、牛的晶状体、大鼠的肝脏或包括奇异变形菌或大肠杆菌B的细菌。可通过已知的方法从这些来源纯化γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，或例如从宿主原核细胞，如大肠杆菌或在这方面通常被认为有效的真核细胞重组表达。适宜的大肠杆菌菌株包括大肠杆菌BL21(DE3)，HB101和JM109。
在广泛使用该方法的条件下，还马上认识到基于本文的教导临床医生可获得各种具体的分析条件，酶浓度，检测发色团等。例如大肠杆菌γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(gshI)基因的核苷酸序列已由K.Watanabe等报道(参见核酸研究，14(11)，pp.4393-4400，1986，和本文引用的参考文献)。推测了518个氨基酸的开放读框，不寻常的密码子TTG被确定为翻译起始(Met1)。在分子水平上表征了该酶和其功能，描述了它的表达和纯化方法(Y.Inoue等，应用分子生物学和生物技术，38，pp.473-477，1993)。
在本发明的实践中，为了克隆大肠杆菌γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因，分离了大肠杆菌HB101的基因组DNA，并将其用作PCR模板。选择引物以使得编码序列扩增至两个重叠片段中。对于较小的产生的基因片段，选择的引物为GSH-1和GSH-4，对于较大的片段，类似地选择GSH-3和GSH-4。不寻常的起始密码子TTG(参见GSH-1，下面SEQ ID NO：15)也被ATG所置换。
引物GSH-1至GSH-4的核苷酸序列如下(核苷酸的数目被指定对应于基于其中报道的包含开放读框的分离的2098bp HincII-PstI限制性片段的K.Watanabe等在p.4396使用的那些)：
GSH-1(有义链)，5’-ATCGCTAG[CATATG1]ATCCCGGACGTATCACAG-3’，它包括编码核苷酸No.338-358(K.Watanabe等)，其中[CATATG1]编码Met1和提供NdeI位点(SEQID NO：15)；
GSH-2(反义链)，5’-ATCACCATCCACTGGTGTAATG-3’，对应于核苷酸No.541-562(SEQ ID NO：16)；
GSH-3(有义链)，5’-CTACCGATTTTGCGGAAG-3’，对应于核苷酸No.510-527(SEQ ID NO：17)；和
GSH-4(反义链)，5’-CATGACGGATCCTCAGGCGTGTTTTTCCAG-3’，对应于核苷酸No.1877-1894(1894为终止密码子)，连接有12个另外的核苷酸(SEQ ID NO：18)。
为了在产生的蛋白的N末端加上一个寡(6聚体)组氨酸标记(还与上面实施例7比较)，如下一系列连续的组氨酸的密码子(CAT/CAC)包含在引物GSH-1H的编码序列的5’末端(接着GSH-1H被用在用GSH-2置换GSH-1中，如前，不寻常起始密码子被置换)：
GSH-1H 5’-ATCGCTAGCATATGCATCATCATCATCATCACATG(原有的Met1)ATCCCGGACGTATC-3’(SEQ ID NO：19)。
为了组装适宜的表达质粒，将小片段用NdeI和EcoRI消化，大片段用EcoRI和BamHI消化。两种片段被用于以3-方式与包含NdeI和BamHI位点的NdeI/BamHI预消化的pT7-7质粒相连以产生质粒pGSH-I和pGSH-I-HIS(其不同仅在于N’末端组氨酸标记的编码序列)。通过RE分析证实正确的克隆。接着将质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，制备蛋白的小量制备物以证实重组蛋白的表达。
使用实施例7对于纯化pAC2-1阴道毛滴虫同型半胱氨酸酶所描述的方法，通过镍-NTA亲和层析从大肠杆菌BL21(DE3)中纯化足够的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶。
B部分-使用γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和Zn(OH)2捕获的分析法
根据本发明的实践，在使用γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶以从生物样品中除去半胱氨酸后，可通过任一方法完成其中同型半胱氨酸浓度的测定，优选包括使用同型半胱氨酸酶检测一种或多种产生的反应产物的那些。
下面提供有效分析法的另一个实例，包括比色测定在有效消耗同型半胱氨酸酶反应中产生的硫化氢的反应中原位产生的亚甲蓝。该方法利用在可见光范围，如在740nm处有效检测染料分子亚甲蓝(甲基硫堇氯)。具体地说，通过在硫化氢存在下，用氯化铁氧化N，N-二甲基-对-苯二胺(“NDPD”)制备亚甲蓝。在一个该反应方法的变化中，N，N-二乙基-对-苯二胺替代N，N-二甲基-对-苯二胺，结果将比色检测提高至约5倍。如本领域将认识的，其它来源的铁是适宜的。
根据本发明的公开，本领域技术人员可认识到可获得许多方法来检测样品同型半胱氨酸，该“亚甲蓝法”被发现尤其可用于需要快速、准确和经济地筛选许多数量的样品的临床检验中。
如下进行证实该方法的标准。用磷酸缓冲液将人血清样品稀释(1∶1)，接着通过使用Amicon 30k Centriprep的超滤去蛋白，4℃下，以4000rpm离心60分钟。收集去蛋白和稀释的血清，在Eppendorf中分成1ml的等分试样以用于分析中。在下述步骤中，测定游离的同型半胱氨酸。还可通过在方法的适宜点包括一个还原步骤(例如加入5mMβ-巯基乙醇)测定以二硫化物二聚体形式(同型半胱氨酸或半胱氨酸/同型半胱氨酸异源二聚体)存在或被发现与蛋白经二硫键结合的全部血清同型半胱氮酸的部分。然而，根据这些试剂灭活蛋白的能力(包括γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和同型半胱氨酸酶)，优选选择为还原剂(见下文)的能还原同型半胱氨酸二硫键的特殊化合物，例如不含灭活的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和同型半胱氨酸酶。
在这些方法中，首先证实分析的重复性。因此，在第一个实践中，将不同量的同型半胱氨酸掺加至各个血清试管中(1∶1稀释和去蛋白)(以获得1uM，5uM，10uM，15uM和20uM的最终浓度)。接着将50ul同型半胱氨酸酶的等分试样(从pAC2-1表达的阴道毛滴虫酶，SEQ ID NO：10，或野生型恶臭假单胞菌酶)加入至各试管中，37℃下，将各试管盖紧盖保温20分钟(以保留H2S)。通过加入100ul 1M NaOH终止反应，混合，紧接着另外加入0.3ml捕获溶液(溶液A)，迅速混合，以13000rpm离心1分钟(通过将4g NaOH，2.94g柠檬酸三钠，和10g乙酸锌溶解在1l水中制得溶液A)。弃去各试管中的上清，将沉淀溶解在0.15ml溶液B中(2.7％w/v FeCl3的6NHCl溶液)，接着加入0.75ml溶液C(0.2％w/vNDPD的1NHCl溶液)。充分混合内容物，接着在将盖密封在室温下保温30分钟。在740nm用分光光度计读取反映在同型半胱氨酸酶反应中产生的H2S的产物亚甲蓝的浓度。对于重组恶臭假单胞菌和阴道毛滴虫酶的结果的线性很好。
进行一类似组的分析，其中血清被掺入同型半胱氨酸酶以获得1至20微摩尔的半胱氨酸浓度。在比较重组产生的阴道毛滴虫酶(SEQ ID NO：10，来自克隆pAC2-1)和重组产生的野生型恶臭假单胞菌酶的结果时，实验证实尽管两种酶对同型半胱氨酸显示高活性，但pAC2-1变体对半胱氨酸具有更小的活性，因此是优选的。
下面的方法显示来自克隆pAC2-1的阴道毛滴虫酶与来自大肠杆菌B的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的优选结合的使用
在一个分析实例中，在可密封的Eppendorf试管中制备用Tris-HCl，100mM，pH8.0缓冲的包含10mM L-谷氨酸，2mMATP，25mM MgCl2的保温混合物，并且其包含5ug来自克隆GSH-I His的重组γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶以及足够量的待送进例如约50umol的同型半胱氨酸的生物样品。还注意到优选以下面的顺序将试剂从下面的贮液加入至试管中：
(1)700ul水；
(2)100ul 1M Tris ph8.0
(3)包含同型半胱氨酸/半胱氨酸的样品(约50ul)，或其它适宜量；
(4)100ul 100mM L-谷氨酸；
(5)20ul 100mM ATP；
(6)10ul 2.5M MgCl2；和
(7)10ul 0.5mg/ml来自克隆GSH-I His的重组γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶。
25℃下，将内含物保温30分钟，此后，加入10ul同型半胱氨酸酶(4.5mg/ml阴道毛滴虫酶，SEQ ID NO：10，来自克隆pAC2-1)，将小瓶密封，接着在37℃下进一步保温20分钟。通过加入100ul 1M NaOH终止H2S的产生，混合，接着加入300ul溶液A，混合，此后，如上以13000rpm将试管离心45秒。小心除去所有上清后，将沉淀重新悬浮在150ul溶液B中，接着加入750ul溶液C，室温下进一步保温20分钟。在可见光范围内，最优选从约650至750nm的范围内监测亚甲蓝的产生。
注意到虽然文献报道表明γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶可在在45℃左右最佳地起作用，但在本发明的实践中发现在25℃进行得非常好。
如前所述(参见实施例4)，存在于生物样品中的同型半胱氨酸的大部分可与其它生物分子结合，并且这些“储存”形式的同型半胱氨酸被认为导致病理学过程。因此，在测定同型半胱氨酸浓度时，可望包括这些其它的形式。总的同型半胱氨酸浓度的主要贡献者包括(1)同型半胱氨酸二聚体，(2)同型半胱氨酸/半胱氨酸异源二聚体，和(3)同型半胱氨酸与蛋白的结合物，其中同型半胱氨酸通过二硫键的方式与蛋白的半胱氨酸相连。根据本发明的实践，可通过适宜地使用二硫键还原剂准确的测定这些其它同型半胱氨酸的总的浓度。并非所有二硫化物还原剂都特别适宜于此功能，因为它们还提供还原同型半胱氨酸酶或γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶中的二硫键的能力，参与硫醇交换反应，或直接与酶的硫醇基团反应，从而改变酶的活性。一种不甚优选的试剂为β-巯基乙醇。
可能可用于本发明实践中的二硫化物还原剂为可从分子探针公司，Eugene，获得的三-(2-羧基乙基)-膦(“TCEP”)，或可新鲜地制备为100mM贮液(以10ul/1ml试管样品使用)并可优选刚好就在加入含有同型半胱氨酸的生物样品本身之前分散至小瓶中。本领域技术人员已知其它适宜的还原剂。实际上，DTT被发现是最优选的还原剂并导致对分析酶的最小的作用。
本发明的这一方面由测定存在于包含同型半胱氨酸和半胱氨酸的生物样品中的同型半胱氨酸的量的方法代表，该方法包括测定在由同型半胱氨酸酶催化的反应中从同型半胱氨酸产生的产物的浓度，该产物还可由所述同型半胱氨酸酶对所述样品中的半胱氨酸反应产生，并且其中所述样品包含其它干扰浓度的半胱氨酸，所述方法包括步骤：
(a)在底物存在下，将所述样品与允许将半胱氨酸转化为γ-谷氨酰半胱氨酸的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶一起保温；
(b)将从步骤(a)产生的混合物与同型半胱氨酸酶一起保温；和
(c)测定能在由同型半胱氨酸酶催化的反应中从同型半胱氨酸和半胱氨酸产生的产物的浓度，其中所述使得二硫化物结合的同型半胱氨酸分子可用于与同型半胱氨酸酶的反应的步骤通过在其步骤(a)前将所述样品用三-(2-羧基乙基)膦处理来进行。
另一种涉及产物氨的检测的方法
如上所述，同型半胱氨酸酶的氨产物还可被用来定量生物样品中的同型半胱氨酸。然而，除开由半胱氨酸浓度导致的干扰(根据上面描述的方法它被适当阐述)，如果检测氨，则甲硫氨酸的干扰是可能的。在这种情况下，通常通过认识到甲硫氨酸还可通过在同型半胱氨酸酶本身反应期间甲硫氨酸的释放来检测来完成校正。因此，可测定其浓度，并接着将其减去。可通过使用作为反应物的N，N-二甲基[或二乙基]-对-苯二胺，在约510nm测定OD，通过产生的亚甲蓝(包括其变异体)测定产生的甲硫醇。参见Tanaka等，应用生物化学杂志，2，pp.439-444，1980。如现有技术所认识的，氨也可在涉及谷氨酸脱氢酶的分析中测定，这些方法可适宜于本发明的实践。
实施例11：加强的对硫化氢的检测方法
已开发与上面实施例10提供的方法相关的加强的用于硫化氢检测的方法。如下制备根据本发明这方面的诊断试剂盒。
制备下面的试剂/贮液：
(a)缓冲液-50mM硼酸盐缓冲液贮液，pH7.5，从309mg H3BO3，f.w.61.83制备，加入至90ml重蒸馏水中，用NaOH将pH调节至7.5，此后，用重蒸馏水将体积调至100ml的总体积。
(b)还原剂-将15.4mg DL-二硫苏糖醇(“DTT”)，Sigma，St.Louis，MO溶解在1ml三价铁硼酸盐缓冲液，产生100mM溶液。
(c)发色试剂I-将33.25mg氰铁酸钾K3Fe(CN)6，Sigma，溶解在10ml 1NHCl，1％(w/v)Triton X-100，Sigma的溶液中，产生10mM三价铁贮液。该溶液应在使用前很好的混合。
(d)发色试剂II-将52.5mg N，N-二丙基-苯二胺(“DPPDA”)，Wako PureChemical Industries，Ltd.，日本，溶解在重蒸馏水中至100mM的最终浓度。
(e)重组同型半胱氨酸酶-由SEQ ID NO：10代表的酶(来自大肠杆菌克隆pAC2-1，ATCC98549)可以产物HYaseTM从AntiCancer，Inc，San Diego，CA购得，并具有172000的分子量和40单位/mg的比活。使用前应用硼酸盐缓冲液将酶稀释至4单位/mg，分析中储存于0-4℃，新鲜配制用于每次使用。
(f)DL-同型半胱氨酸-将2.7mg DL-同型半胱氨酸，Sigma加入至2ml硼酸盐缓冲液中(4mM的最终浓度)，每天新鲜制备校准标准，使用期间储存于0-4℃(注意：通常同型半胱氨酸酶仅使用天然同型半胱氨酸的L-光学异构体，但D/L混合物提供经济的L-异构体的来源，当然需要50％的校正因子以提供有效的L型的浓度)。
代表性的分析方法如下。将0.1ml血浆加入至0.9ml硼酸盐缓冲液中。接着加入10ul 100mM DTT溶液，均匀混合，接着37℃下保温30分钟。接着混合加入30ul HYaseTM重组同型半胱氨酸酶(在硼酸盐缓冲液中预稀释至4单位/ml)，随后在37℃下在保温1分钟。同时加入并混合200ul发色试剂I和10ul发色试剂II，37℃下将样品保温20分钟。用分光光度计在677nm测定OD来检测产物亚甲蓝类型的发色团。接着从构建的校准曲线确定L-同型半胱氨酸的血浆浓度，该曲线可使用同型半胱氨酸和/或其二硫键结合的二聚体，同型半胱氨酸作为标准。在提供该代表性的实例中，当然很显然在选择分析试剂或试剂的浓度中的许多改变是可能，这些修改立即被本领域技术人员所认识。
实施例12：其它方法
下面提供其它方法的实例和其实验者可发现可用于本发明实践中变化的形式。
重组细菌的生长
用一小瓶包含来自主细胞库(MCB)的重组同型半胱氨酸酶(pAC2-1，参见SEQ ID NO：9和10)的重组大肠杆菌开始各发酵过程。将10ul来自MCB的细菌接种至5ml LB培养基中，37℃，400rpm振荡培养过夜。将培养物转移至6L烧瓶中的800ml LB培养基中，37℃，400rpm振荡培养过夜，此时OD600为约10。通过4000rpm离心20分钟收集细菌。接着将细菌转移至6L烧瓶中的800ml LB培养基的培养物中，37℃，400rpm培养16小时。4℃下，通过4000rpm离心20分钟收集细菌。
预柱处理
混合来自重组大肠杆菌的90×800ml培养物的细菌沉淀，用空洞型匀浆器(Microfluidics公司，Newton，MA；型号HC 8000)破碎。将匀浆悬浮在2体积的20mM包含10uM磷酸吡哆醛，0.01％β-巯基乙醇和20％乙醇的磷酸钾，pH7.2中。50℃下，将匀浆热处理1分钟。1％(w/v)聚乙烯亚胺(PEI)加入至悬液中并混合20分钟。4℃下，以12000rpm将悬液用自动冷冻离心机(sorvall，Superspeed RC2-B)离心40分钟以除去核酸。接着收集上清，并与聚乙二醇8000(PEG 8000)混合至10-12％(w/v)的最终浓度，4℃下搅拌60分钟。通过以12000rpm离心40分钟除去沉淀(包含污染蛋白)。接着将3.0M氯化钠加入至上清中以产生沉淀重组同型半胱氨酸酶的0.12M的最终浓度。通过以12000rpm离心40分钟收集沉淀，并溶解在20mM包含10uM磷酸吡哆醛和0.01％β-巯基乙醇的磷酸钾缓冲液中，pH7.2。
DEAE-Sepharose FF层析
将来自预柱处理的酶样品上样至预先用20mM磷酸钾pH7.2平衡的DEAE-Sepharose FF(30×5cm)柱中。上样后，将其用大约体积的50mM氯化钠，20mM磷酸钾pH7.2预洗涤直至OD280降至0.1以下。接着将重组同型半胱氨酸酶用相同缓冲液的0.05-0.5M的线性氯化钠浓度梯度洗脱90分钟。
Phenyl-Sepharose 6 FF层析
固体硫酸铵(79.3mg/ml)加入至DEAE-Sepharose FF层析的活性级分中以产生0.6M的直至浓度。在将上清上样至Phenyl-Sepharose 6 FF柱(20×2.6cm)中之前，将柱用由0.6M硫酸铵的20mM硫酸钾pH7.6组成的缓冲液B平衡。通过线性降低的硫酸铵梯度，用缓冲液B(它包含20mM磷酸钾pH7.6，10um磷酸吡哆醛，0.02％β-巯基乙醇和5.0％乙二醇)洗脱结合蛋白。通过除去硫酸铵和聚乙二醇的DEAE Separose FF(20×1.6cm)浓缩活性级分。纯化的酶贮存于-80℃。
重组同型半胱氨酸酶的活性分析
37℃下，使用变化量的酶，在1.5ml Eppindorf试管中，使用1ml 50mM磷酸缓冲液pH8.0(还包含10uM磷酸吡哆醛和20mM同型半胱氨酸)将酮产物的α、γ或α，β-消除(对于同型半胱氨酸为α丁酮酸)的活性分析进行10分钟。通过加入0.5ml 4.5％TCA终止反应。接着将0.05ml产生的溶液与0.45ml0.05％3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)混合，并加至1.0ml 1.0M乙酸钠的样品中，pH5.2，接着50℃下保温30分钟。
通过分光光度法以OD335确定反应产物的量。腙产物具有7.6×103l/mol×cm的消光系数。用牛血清白蛋白作为标准，使用Lowry试剂盒(Sigma)测定蛋白量。比活计算为单位/mg蛋白，其中1单位酶被定义为催化形成1umolα丁酮酸/分钟的量。
37℃下，分别将同型半胱氨酸和半胱氨酸的γ和β-消除反应的活性分析进行30分钟。使用亚甲蓝形成在OD671测定产生的H2S。
SDS-PAGE和PAGE
根据NOVEX Kit(NOVEX Experimental Technology，San Diego)描述的方法进行电泳。12％的Tris-Gel被用于SDS-PAGE。在用考马氏亮兰染色后，用分子量标准(NOVEX mark 12 Wide Range蛋白质标准)估算蛋白带的强度，包括肌球蛋白，200kD；β-半乳糖苷酶，116.3kD；磷酸化酶b，97.4kD；牛血清白蛋白，66.3kD；碳酸酐酶，31.0kD；胰蛋白酶抑制剂，21.5kD；溶菌酶，14.4kD；抑酶肽，6.0kD。通过浸没在包含3.3mM-DL-同型半胱氨酸，0.33mM乙酸铅，28.4mM β-巯基乙醇和100mM Tris-HCl缓冲液，pH7.5的反应混合物中染色非变性凝胶的重组同型半胱氨酸酶活性。包含同型半胱氨酸酶活性的带将同型半胱氨酸转化为α-丁酮酸，氨和硫化氢。硫化氢与乙酸铅反应以形成深棕色的沉淀(Pb2S)。接着用考马氏兰染色凝胶的蛋白。
为了进一步支持本文的公开，根据布达佩斯条约，于1997年9月26日在美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD，USA进行了证实的可存活的生物材料的保藏。该材料被确定为大肠杆菌BL21(DE3)，克隆pAC2-1，并给予了ATCC号98549。当本专利允许时，对该材料对于公众的可获得性的全部限制将是不可改变地取消。
本发明的其他陈述
根据本发明的上述的详细描述的公开内容，本领域的实施者会认识到以下陈述为本发明的进一步的实施例。
1.测定存在于包含例如同型半胱氨酸和半胱氨酸的生物样品中的同型半胱氨酸的量的方法，包括将实施样品与能从同型半胱氨酸和半胱氨酸产生硫化氢的酶制剂接触，通过测定从同型半胱氨酸产生的硫化氢的量来确定所述样品中同型半胱氨酸的量。
2.根据陈述1的方法，其中的生物样品包括与其它分子共价结合的同型半胱氨酸分子，并且该方法包括在测定硫化氢前从中解离该同型半胱氨酸的步骤。
3.根据陈述2的方法，其中的生物样品包括与蛋白质氨基酸R基共价结合的同型半胱氨酸分子。
4.根据陈述2的方法，其中的生物样品包括与蛋白质半胱氨酸残基，游离半胱氨酸分子或其他同型半胱氨酸分子二硫键共价结合的同型半胱氨酸分子。
5.根据陈述1的方法，其中的硫化氢产生于半胱氨酸和同型半胱氨酸，而从同型半胱氨酸所的硫化氢不同于从半胱氨酸产生的硫化氢，所述方法包括如下的另外的起始步骤：
(a)将所述生物样品与保护同型半胱氨酸免于所述酶制剂作用的试剂接触；
(b)让所述酶制剂从存在于所述样品中的半胱氨酸产生硫化氢；
(c)除去所述硫化氢；和
(d)脱保护所述同型半胱氨酸，并加入另外量的酶制剂以从中产生硫化氢。
6.根据陈述5的方法，其中的同型半胱氨酸通过酸处理转化成内酯形式而被保护，随后通过溴化物或弱碱脱保护。
7.根据陈述1的方法，包括另外的起始步骤：
(a)将存在于所述生物样品中的同型半胱氨酸与年将其转化为可被分离的化合物的其它酶制剂接触；
(b)分离所述化合物；
(c)在所述化合物被转回为同型半胱氨酸的条件下，将所述化合物与酶制剂或其它试剂接触；和
(d)将如此产生的同型半胱氨酸与年从中产生硫化氢的所述酶制剂接触。
8.根据陈述7的方法，包括步骤：
(a)将存在于所述生物样品中的同型半胱氨酸在能将其转化为S-腺甘同型半胱氨酸的的条件下与包括S-腺甘同型半胱氨酸水解酶的其它酶制剂接触；
(b)分离所述化合物；
(c)在S-腺甘同型半胱氨酸被转回为同型半胱氨酸的条件下，将S-腺甘同型半胱氨酸与另外量S-腺甘同型半胱氨酸水解酶接触；和
(d)将如此产生的同型半胱氨酸与能从中产生硫化氢的所述酶制剂接触。
9.根据陈述1的方法，其中所述生物样品被用使得半胱氨酸对所述酶制剂为非活性的试剂预处理。
10.根据陈述9的方法，其中所述的试剂是半胱氨酸合成酶。
11.根据陈述1的方法，其中所述的酶制剂为包括原核生物源的同型半胱氨酸酶。
12.根据陈述11的方法，其中所述的同型半胱氨酸酶来自恶臭假单胞菌。
13.根据陈述1的方法，其中所述的酶制剂为包括真核生物源的同型半胱氨酸酶。
14.根据陈述11的方法，其中所述的同型半胱氨酸酶来自阴道毛滴虫。
15.根据陈述1的方法，其中所述的生物样品选自尿、组织液、血液、血清或血浆。
16.测定存在于包含同型半胱氨酸和半胱氨酸的生物样品中的同型半胱氨酸的量的方法，包括步骤：
(a)将所述样品分成2份，份1或1份2；
(b)将份1与能将同型半胱氨酸转化为不为同型半胱氨酸底物的底物的第一种酶制剂接触，其中所述第一种酶制剂不将半胱氨酸认作底物；
(c)独立地将份1和份2与包含能从同型半胱氨酸和半胱氨酸产生硫化氢的同型半胱氨酸酶的第二种酶制剂接触；
(d)测定份1和份2产生的硫化氢的量；和
(e)通过从份1的硫化氢的测定量减去份2的硫化氢的测定量，并将结果乘以2计算所述生物样品中的同型半胱氨酸的量。
17.根据陈述16的方法，其中该第一种酶制剂包括S-腺甘同型半胱氨酸水解酶，而同型半胱氨酸被转化为S-腺甘同型半胱氨酸。
18.测定存在于个体生物液体中的同型半胱氨酸的量的方法，其中所述方法包括将所述样品与能催化从同型半胱氨酸产生可检测量的硫化氢的酶接触的步骤，并且其中所述样品进一步包含从中可产生干扰所述测定的可检测量的硫化氢的量的半胱氨酸，其改进包括含有可以单独检测源于同型半胱氨酸源于的硫化氢的一个或多个附加步骤。
19.测定生物样品中的同型半胱氨酸的量的诊断试剂盒，包含：
(a)来自阴道毛滴虫或卵状假单胞菌属(例如卵状假单胞菌或恶臭假单胞菌)的同型半胱氨酸酶，和
(b)至少一种能被用来测定在同型半胱氨酸酶反应中形成的硫化氢的量的试剂。
20.根据陈述19的诊断试剂盒，包括另外的用于从其可共价结合其他分子解离同型半胱氨酸的试剂。
21.根据陈述19的诊断试剂盒，包括另外的用于转变同型半胱氨酸以形成对该同型半胱氨酸酶无活性的试剂。
22.根据陈述19的诊断试剂盒，包括另外的用于在该同型半胱氨酸与同型半胱氨酸酶反应前从该生物样品分离同型半胱氨酸的试剂。
23.根据陈述19的诊断试剂盒，包括另外的用于转变同型半胱氨酸以形成对该半胱氨酸酶无活性的试剂。
24.测定存在于包含同型半胱氨酸和半胱氨酸的生物样品中的同型半胱氨酸的量的方法，包括步骤：
(a)将该样品与能从同型半胱氨酸中产生硫化氢和α-丁酮酸，并从半胱氨酸中产生硫化氢和丙酮酸的酶制剂接触，和
(b)将该样品或其备份或部分与通过其作用可测定该样品或其备份或部分中丙酮酸的量的酶制剂接触，并然后
(c)通过比较如此测定的丙酮酸的量与从中产生的硫化氢的量计算该样品中同型半胱氨酸的量。
25.根据陈述24的方法，其中该可测定样品中丙酮酸的酶制剂包括乳酸脱氢酶。
26.根据陈述25的方法，其中的生物样品包括与蛋白质氨基酸R基结合的同型半胱氨酸分子，并且该方法进一步包括先使该结合的同型半胱氨酸分子可得到以在其中检测的步骤。
27.根据陈述25的方法，其中的生物样品包括与蛋白质半胱氨酸残基，游离半胱氨酸分子或其他同型半胱氨酸分子二硫键共价结合的同型半胱氨酸分子，并且该方法进一步包括先使该结合的同型半胱氨酸分子可得到以在其中检测的步骤。
28.测定存在于包含同型半胱氨酸和半胱氨酸的生物样品中的同型半胱氨酸的量的方法，包括步骤：
(a)将所述样品分成2份，份1或1份2；
(b)将份1与能将同型半胱氨酸转化为不为同型半胱氨酸底物的底物的第一种酶制剂接触，其中所述第一种酶制剂不将半胱氨酸认作底物，该制剂进一步包括选自S-腺甘同型半胱氨酸水解酶或胱硫醚合成酶的酶；
(c)独立地将份1和份2与包含能从同型半胱氨酸和半胱氨酸产生硫化氢的同型半胱氨酸酶的第二种酶制剂接触；
(d)测定份1和份2产生的硫化氢的量；和
(e)通过从份2的硫化氢的测定量减去份1的硫化氢的测定量计算所述生物样品中的同型半胱氨酸的量，并将结果乘以2。
29.根据陈述24的方法，其中该同型半胱氨酸酶来自
(a)  恶臭假单胞菌
(b)  阴道毛滴虫，或
(c)  通过表达包括来自恶臭假单胞菌和阴道毛滴虫的核苷酸序列的嵌合编码多核苷酸而产生的嵌合酶。
30.根据陈述28的方法，其中该同型半胱氨酸酶来自
(a)恶臭假单胞菌
(b)阴道毛滴虫，或
(c)通过表达包括来自恶臭假单胞菌和阴道毛滴虫的核苷酸序列的嵌合编码多核苷酸而产生的嵌合酶。
31.根据陈述24的方法，其中所述的生物样品选自尿、组织液、血液、血清或血浆。
32.根据陈述28的方法，其中所述的生物样品选自尿、组织液、血液、血清或血浆。
33.测定生物样品中的同型半胱氨酸的量的诊断试剂盒，包含：
(a)阴道毛滴虫或恶臭假单胞菌同型半胱氨酸酶，或通过表达包括来自恶臭假单胞菌和阴道毛滴虫的核苷酸序列的嵌合编码多核苷酸而产生的嵌合酶：
(b)至少一种能被用来测定在同型半胱氨酸酶反应中形成的硫化氢的量的试剂；和
(c)至少一种能被用来测定在同型半胱氨酸酶反应中从该样品中存在的半胱氨酸形成的丙酮酸的量的试剂。
34.测定生物样品中的同型半胱氨酸的量的诊断试剂盒，包含：
(a)阴道毛滴虫或恶臭假单胞菌同型半胱氨酸酶，或通过表达包括来自恶臭假单胞菌和阴道毛滴虫的核苷酸序列的嵌合编码多核苷酸而产生的嵌合酶；
(b)至少一种能被用来测定在同型半胱氨酸酶反应中形成的硫化氢的量的试剂；和
(c)胱硫醚合成酶。
35.包含编码恶臭假单胞菌同型半胱氨酸酶的氨基酸序列和阴道毛滴虫同型半胱氨酸酶的氨基酸序列的从中可表达具有同型半胱氨酸酶活性的功能性蛋白的嵌合核苷酸序列的纯化和分离DNA分子。
36.根据陈述35的DNA分子，包含编码恶臭假单胞菌同型半胱氨酸酶的核苷酸序列，其中它的编码所述酶的一个或多个氨基酸的一个或多个亚序列对应地被一个或多个编码阴道毛滴虫同型半胱氨酸酶的对应的氨基酸的亚序列取代。
37.根据陈述35的DNA分子，其中的阴道毛滴虫同型半胱氨酸酶由mgl1或mgl2基因编码。
38.根据陈述35的DNA分子，其中的阴道毛滴虫同型半胱氨酸酶由mgl2基因编码。
39.根据陈述38的DNA分子，包含恶臭假单胞菌同型半胱氨酸编码序列的DNA分子，其中其各自编码所述酶的一个或多个氨基酸的一个或多个亚序列对应地被一个或多个各自编码阴道毛滴虫同型半胱氨酸酶的一个或多个对应的氨基酸的核苷酸亚序列取代，并且其中所述产生的氨基酸取代选自：
(a)来自阴道毛滴虫(T2)的Cys-Ser-Arg-Ala-Asp-Ile-Ile-Ala-Lys-Val-Lys-Ser(SEQ ID NO：1)或其任何子集取代来自恶臭假单胞菌的Val-Gly-Ser-Gln-Ala-Leu-Val-Asp-Arg-Ile-Arg-Leu(SEQ IS NO：2)或其任何子集；
(b)来自阴道毛滴虫(T2)的Asp-Val-Asp(SEQ ID NO：3)或其任何子集取代来自恶臭假单胞菌的Glu-Leu-Lys(SEQ IS NO：4)或其任何子集；
(c)来自阴道毛滴虫(T2)的Cys-His-Val-VAl(SEQ ID NO：5)或其任何子集取代来自恶臭假单胞菌的Ala-Leu-Gln-Leu(SEQ IS NO：6)或其任何子集；
(d)来自阴道毛滴虫(T2)的Cys-Glu-Asn-Val-Gln-Asp-Ile-Ile-Asp-Asp(SEQ ID NO：7)或其任何子集取代来自恶臭假单胞菌的Gly-Leu-Glu-Asp-Ite-Asp-Asp-Leu-Leu-Ala(SEQ IS NO：8)或其任何子集；和
(e)包含一种、两种、三种或四种由上面(a)、(b)、(c)和(d)组提供的取代的所有组合；和
(f)与(a)，(b)，(c)，(d)或(e)的核苷酸互补的核苷酸序列。
40.测定生物样品中的同型半胱氨酸的量的诊断试剂盒，包含：
(a)根据陈述35的同型半胱氨酸酶，和
(b)至少一种能被用来测定在同型半胱氨酸酶反应中形成的硫化氢的量的试剂。
41.测定生物样品中的同型半胱氨酸的量的诊断试剂盒，包含：
(a)根据陈述39的同型半胱氨酸酶，和
(b)至少一种能被用来测定在同型半胱氨酸酶反应中形成的硫化氢的量的试剂。
42.根据陈述39的重组DNA分子，其中编码该嵌合同型半胱氨酸酶的DNA序列可操作地连接到表达控制序列。
43.修饰以含有根据陈述42的重组DNA分子的宿主细胞。
44.测定患者的生物体液中的同型半胱氨酸酶的浓度的方法，包括在可测定其中的同型半胱氨酸酶的浓度的的该样品中的硫化氢和丙酮酸的测定都可在一个小池中进行。
45.足够对半胱氨酸和甲硫氨酸为非活性的同型半胱氨酸酶，致使个体的组织液、尿液、血液、血清或血浆样品中存在的同型半胱氨酸的量可在一个酶分析法中测定，其中测定样品中同型半胱氨酸酶和同型半胱氨酸反应得到的一个或多个产物，其中测定基本上不受其中的半胱氨酸和甲硫氨酸的浓度的影响。
46.根据陈述45的同型半胱氨酸酶，基本上模仿阴道毛滴虫的同型半胱氨酸酶的氨基酸序列。
47.根据陈述46的同型半胱氨酸酶，模仿mgl1基因编码的阴道毛滴虫酶。
48.根据陈述46的同型半胱氨酸酶，模仿mgl2基因编码的阴道毛滴虫酶。
49.根据陈述46的同型半胱氨酸酶，具有对应于SEQ ID NO：10，或其残基Met1到Leu396的氨基酸序列。
50.同型半胱氨酸酶，包含一种或多种选自下面的SEQIDNO：10的肽序列：
(a)Gly-Gly-Asn-Arg-Leu-Ala-Gly-Gln-Glu(参见SEQIDNO：10的残基43-51)
(b)包含Leu的(a)的子集；
(c)Arg-Val-Cys-Lys-Glu-Ala-His-Ser-Gln(参见SEQIDNO：10的残基168-176)
(d)包含Glu的(c)的子集；
(e)Gln-Met-Arg-Met-Tyr-Gly-Ser-Met-Ile(参见SEQIDNO：10的残基304-312)；和
(f)包含Tyr的(e)的子集。
51.根据陈述45的同型半胱氨酸酶，模仿假单胞杆菌属、梭状芽孢杆菌属气单胞菌属或毛滴虫属同型半胱氨酸酶。
52.根据陈述45的同型半胱氨酸酶，来自假单胞杆菌属、梭状芽孢杆菌属气单胞菌属或毛滴虫属，其中其一个或多个肽序列对应地被一个或多个选自下面的SEQIDNO：10的肽序列取代：
(a)Gly-Gly-Asn-Arg-Leu-Ala-Gly-Gln-Glu(参见SEQIDNO：10的残基43-51)
(b)包含Leu的(a)的子集；
(c)Arg-Val-Cys-Lys-Glu-Ala-His-Ser-Gln(参见SEQIDNO：10的残基168-176)
(d)包含Glu的(c)的子集；
(e)Gln-Met-Arg-Met-Tyr-Gly-Ser-Met-Ile(参见SEQIDNO：10的残基304-312)；和
(f)包含Tyr的(e)的子集。
53.模仿毛滴虫属同型半胱氨酸酶的嵌合同型半胱氨酸酶，其中其一个或多个对应于SEQIDNO：10的Leu47、Glu172和Tyr308的氨基酸由此对应地被取代。
54.为SEQIDNO：10的置换变异体、插入变异体、缺失变异体或衍生物，或其残基Met1到Leu396的同型半胱氨酸酶，其中所述变异体或衍生物具有一种或多种下面的特性：
(a)SEQIDNO：10对同型半胱氨酸活性的至少约25％(如实施例8所描述)；和/或
(b)SEQIDNO：10对半胱氨酸活性的不超过约500％(如实施例8所描述)。
55.根据陈述45的同型半胱氨酸酶，即：
(a)足够对半胱氨酸和甲硫氨酸为非活性的同型半胱氨酸酶，致使个体的组织液、尿液、血液、血清或血浆样品中存在的同型半胱氨酸的量可在一个酶分析法中测定，其中测定样品中同型半胱氨酸酶和同型半胱氨酸反应得到的一个或多个产物，其中测定基本上不受其中的半胱氨酸和甲硫氨酸的浓度的影响。
(b)模仿SEQ ID NO：12，但缺失Leu47、Glu172和Tyr308其中的一个或多个，或被根据下式取代：
(1)对于Leu47，用Leu、Ile、Val、Ala、Gly、Met和Trp取代；
(2)对于Asp172，用Glu、Gln或Asn取代；
(2)对于Ser308，用Tyr、Phe、Met、Trp、Gln、Thr或Asn取代。
56.根据陈述45的同型半胱氨酸酶，对同型半胱氨酸的的比活性比对半胱氨酸和甲硫氨酸高至少约100倍。
57.纯化和分离DNA分子，包括编码根据陈述45的同型半胱氨酸酶的核苷酸序列，其中编码序列可操作地连接到能在宿主中指导其中表达的控制序列。
58.含有根据陈述57的DNA分子的宿主细胞。
59.根据陈述57的纯化和分离DNA分子，含有编码SEQIDNO：10或其残基Met1到Leu396的同型半胱氨酸酶的核苷酸序列。
60.根据陈述59的DNA分子，包括SEQIDNO：9或其核苷酸39-1226的片段或其互补序列的核苷酸序列。
61.RNA分子，对应于SEQIDNO：9或其编码同型半胱氨酸酶的片段。
62.测定存在于包含同型半胱氨酸和半胱氨酸的生物样品中的同型半胱氨酸的量的方法，包括测定从在由同型半胱氨酸酶催化的反应中的同型半胱氨酸产生的产物的浓度，其中该产物也可通过所述同型半胱氨酸酶对所述样品中的半胱氨酸反应而产生，并且其中所述样品包含其它干扰浓度的半胱氨酸，所述方法包括提供对半胱氨酸为非活性的足以使该样品中存在的同型半胱氨酸的浓度可在一个分析步骤中测定的形式的该酶的步骤。
63.根据陈述62的方法，其中所述的生物样品是人类个体的尿、组织液、血液、血清或血浆。
64.根据陈述63的方法，其中的生物样品包括与蛋白质氨基酸R基结合的同型半胱氨酸分子，并且该方法进一步包括先使该结合的同型半胱氨酸分子可得到以在其中检测的步骤。
65.根据陈述63的方法，其中的生物样品包括与蛋白质半胱氨酸残基，游离半胱氨酸分子或其他同型半胱氨酸分子二硫键共价结合的同型半胱氨酸分子，并且该方法进一步包括先使该结合的同型半胱氨酸分子可得到以在其中检测的步骤。
66.测定存在于包含同型半胱氨酸和半胱氨酸的生物样品中的同型半胱氨酸的量的方法，包括测定从在由同型半胱氨酸酶催化的反应中的同型半胱氨酸产生的产物的浓度，其中该产物也可通过所述同型半胱氨酸酶对所述样品中的甲硫氨酸反应而产生，并且其中所述样品包含其它干扰浓度的甲硫氨酸，所述方法包括提供对甲硫氨酸为非活性的足以使该样品中存在的同型半胱氨酸的浓度可在一个分析步骤中测定的形式的该酶的步骤。
67.根据陈述65的方法，其中所述的生物样品是人类个体的尿、组织液、血液、血清或血浆。
68.用于个体生物样品中的同型半胱氨酸的一步酶分析中的诊断试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)根据陈述45的同型半胱氨酸酶；和
(b)至少一种能被用来测定由同型半胱氨酸酶对同型半胱氨酸反应形成的产物的量的试剂。
69.根据陈述65的诊断试剂盒，其中所述(b)部分的试剂用于测定由同型半胱氨酸酶对同型半胱氨酸反应形成的产物硫化氢的量。
70.修饰的同型半胱氨酸酶，包括位于该蛋白的正常Met1的N端的一个或多个组氨酸残基，该同型半胱氨酸酶对半胱氨酸或甲硫氨酸为非活性的足以使例如在个体组织液、尿、血液、血清或血浆中存在的同型半胱氨酸的浓度可在一个分析步骤中测定，其中测定了两种实施同型半胱氨酸酶对所述样品中的同型半胱氨酸的反应的一种或多种产物的量，并且其中所述测定基本上不受其中的半胱氨酸或甲硫氨酸的浓度的影响。
71.根据陈述70的修饰的同型半胱氨酸酶，包括位于该蛋白的正常Met1的N端的约6个组氨酸残基。
72.DNA分子，编码据陈述70的修饰的同型半胱氨酸酶。
73.测定存在于包含同型半胱氨酸和半胱氨酸的生物样品中的同型半胱氨酸的量的方法，该方法包括测定从在由同型半胱氨酸酶催化的反应中的同型半胱氨酸产生的产物的浓度，其中该产物也可通过所述同型半胱氨酸酶对所述样品中的半胱氨酸反应而产生，并且其中所述样品包含其它干扰浓度的半胱氨酸，所述方法包括步骤：
(a)在存在允许半胱氨酸转化为γ-谷氨酰半胱氨酸时，将所述样品与γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶一起保温；
(b)将从步骤(a)产生的混合物与同型半胱氨酸酶一起保温，和
(c)测定能从由同型半胱氨酸酶催化的反应中的同型半胱氨酸和半胱氨酸产生的产物的浓度。
74.根据陈述73的方法，其中所测定的产物为硫化氢或氨。
75.根据陈述73的方法，其中同型半胱氨酸酶来自阴道毛滴虫。
76.根据陈述75的方法，其中同型半胱氨酸酶是mgl1基因编码的阴道毛滴虫酶。
77.根据陈述75的方法，其中同型半胱氨酸酶是mgl2基因编码的阴道毛滴虫酶。
78.根据陈述75的方法，具有对应于SEQ ID NO：10，或其残基Met1到Leu396的氨基酸序列。
79.根据陈述73的方法，其中同型半胱氨酸酶来自恶臭假单胞菌。
80.根据陈述73的方法，其中所述的生物样品选自尿、组织液、血液、血清或血浆。
81.根据陈述73的方法，其中同型半胱氨酸酶来自假单胞杆菌属、梭状芽孢杆菌属气单胞菌属或毛滴虫属。
82.根据陈述73的方法，其中的生物样品包括与蛋白质半胱氨酸残基，游离半胱氨酸分子或其他同型半胱氨酸分子二硫键共价结合的同型半胱氨酸分子，并且该方法进一步包括使该结合的同型半胱氨酸分子可得到以与同型半胱氨酸酶反应的步骤。
83.根据陈述82的方法，其中的使该结合的同型半胱氨酸分子可得到以与同型半胱氨酸酶反应的步骤是通过在步骤(a)前用三-(2-羧乙基)膦处理该样品而进行的。
84.根据陈述73的方法，其中的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶来自大肠杆菌。
85.根据陈述74的方法，其中的硫化氢检测是通过比色检测N，N-二烷基-对苯二胺与三价铁和该硫化氢的氧化反应所产生的亚甲蓝型发色团而进行的。
86.根据陈述85的方法，其中的N，N-二烷基-对苯二胺是N，N-二甲基，N，N-二乙基，N，N-二-正-丙基，或N，N-二-正-丁基。
87.用于个体生物样品中的同型半胱氨酸的一步酶分析中的诊断试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶
(b)同型半胱氨酸酶；和
(c)至少一种能被用来测定由同型半胱氨酸酶对同型半胱氨酸反应形成的硫化氢，或氨的量的试剂。
88.根据陈述87的诊断试剂盒，其中所述(c)部分的试剂用于测定由同型半胱氨酸酶对同型半胱氨酸反应形成的产物硫化氢的量。
89.测定存在于包含同型半胱氨酸和半胱氨酸的生物样品中的同型半胱氨酸的量的方法，该方法包括测定从在由同型半胱氨酸酶催化的反应中的同型半胱氨酸产生的产物化合物的浓度，其中该产物化合物也可通过所述同型半胱氨酸酶对所述样品中的半胱氨酸反应而产生，并且其中所述样品包含其它干扰浓度的半胱氨酸，所述方法包括步骤：
(a)在合适的环境中，将所述样品与能将半胱氨酸转变为非同型半胱氨酸酶的底物的酶一起保温；
(b)将从步骤(a)产生的混合物与同型半胱氨酸酶一起保温以产生一个或多个产物化合物，和
(c)通过测定该产物化合物的浓度测定样品中同型半胱氨酸的量。
90.根据陈述89的方法，其中所测定的产物为硫化氢或氨。
91.根据陈述89的方法，其中步骤(a)所用的酶是γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，半胱氨酸氧化酶，胱硫醚β合成酶，或半胱氨酸tRNA合成酶。
92.根据陈述73的方法，其中的生物样品含有甲硫氨酸。
                    序列表
(1)一般信息：(i)申请人：Tan，Yuying
       Lenz，Martin
       Perry，Andrew W.
         Hoffman，Robert M.
(ii)发明题目：用于生物样品的高特异性同型半胱氨酸分析法
(iii)序列数目：19
(iv)通讯地址：
  (A)地址：MORRISON & FOERSTER
  (B)街道：2000 Pennsylvania Avenue，NW
  (C)城市：Washington
  (D)州：DC
  (E)国家：USA
  (F)ZIP：20006-1888
(v)计算机可读形式：
  (A)介质类型：软盘
  (B)计算机：兼容
  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：Patentin Release #1.0，Verson #1.30
(vi)本申请数据：
  (A)申请号：Express Mail EH 493650174 US
  (B)申请日：同此
  (C)分类：
(vii)优先申请数据：
  (A)申请号：US 08/7899,776
  (B)申请日：1997，7，24
(vii)优先申请数据：
  (A)申请号：US 08/918,214
  (B)申请日：1997，8，25
(vii)优先申请数据：
(A)申请号：US 08/941,921
(B)申请日：1997，10，01(vii)优先申请数据：
(A)申请号：US 08/974,609
(B)申请日：1997，11，19(vii)优先申请数据：
(A)申请号：US 09/061,337
(B)申请日：1998，4，17(viii)代理人/机构信息：
(A)名称：Donahue，E.Victor
(B)登记号：35，492
(C)参考/记录号：312762001340(ix)电信信息：
(A)电话：(202)887-1546
(B)传真：(202)887-0763
(C)电报：90-4030(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO：1：信息：(i)序列特征：
(A)长度：12个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Cys Ser Arg Ala Asp Ile Ile Ala Lys Val Lys Ser1               5                   10(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO：2：信息：(i)序列特征：
(A)长度：12个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
   Val Gly Ser Gln Ala Leu Val Asp Arg Ile Arg Leu
   1               5                   10
(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO：3：信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：3个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
   Asp Val Asp
   1
(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO：4：信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：3个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
   Glu Leu Lys
   1
(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO：5：信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：4个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
   Cys His Val Val
   1
(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO：6：信息：  (i)序列特征：
(A)长度：4个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Ala Leu Gln Leu1(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO：7：信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：10个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：
Cys Glu Asn Val Gln Asp Ile Ile Asp Asp
1               5                   10(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO：8：信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：10个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：
Gly Leu Glu Asp Ile Asp Asp Leu Leu Ala
1               5                   10(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO：9：信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：1240个碱基对
  (B)类型：核酸  (C)链型：单链(D)拓扑学：线性(ix)特性：(A)：名称/关键词：CDS(B)：位置：18..1226(ix)特征：(A)：名称/关键词：mat-肽(B)：位置：39(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：AAGAAGGAGA TATACAT ATG CAT CAT CAT CAT CAT CAC ATG TCT CAC GAG         50
               Met His His His His His His Met Ser His Glu
                -7      -5                   1AGA ATG ACC CCA GCA ACA GCA TGC ATC CAT GCT AAT CCA CAG AAG GAT        98Arg Met Thr Pro Ala Thr Ala Cys Ile His Ala Asn Pro Gln Lys Asp5                  10                  15                  20CAG TTT GGA GCA GCC ATC CCA CCA ATC TAC CAA ACA TCA ACA TTC GTT       146Gln Phe Gly Ala Ala Ile Pro Pro Ile Tyr Gln Thr Ser Thr Phe Val
             25                  30                  35TTC GAT AAC TGC CAA CAG GGT GGA AAC AGA CTC GCT GGT CAG GAA TCC       194Phe Asp Asn Cys Gln Gln Gly Gly Asn Arg Leu Ala Gly Gln Glu Ser
         40                  45                  50GGC TAC ATC TAC ACA CGT CTC GGC AAC CCA ACA GTT TCA AAC CTC GAA       242Gly Tyr Ile Tyr Thr Arg Leu Gly Asn Pro Thr Val Ser Asn Leu Glu
     55                  60                  65GGC AAG ATC GCC TTC CTC GAG AAA ACA GAA GCA TGC GTT GCC ACA TCT       290Gly Lys Ile Ala Phe Leu Glu Lys Thr Glu Ala Cys Val Ala Thr Ser
 70                  75                  80TCT GGC ATG GGT GCC ATT GCT GCT ACA GTT TTG ACA ATC CTC AAG GCC       338Ser Gly Met Gly Ala Ile Ala Ala Thr Val Leu Thr Ile Leu Lys Ala85                  90                  95                 100GGA GAT CAC TTA ATC TCC GAT GAG TGC CTT TAT GGC TGC ACA CAT GCT       386Gly Asp His Leu Ile Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Gly Cys Thr His Ala
            105                 110                 115CTC TTT GAG CAC GCA TTG ACA AAG TTC GGC ATC CAG GTC GAC TTC ATC       434Leu Phe Glu His Ala Leu Thr Lys Phe Gly Ile Gln Val Asp Phe Ile
        120                 125                 130AAC ACA GCC ATC CCA GGC GAG GTC AAG AAG CAC ATG AAG CCA AAC ACA       482Asn Thr Ala Ile Pro Gly Glu Val Lys Lys His Met Lys Pro Asn Thr
    135                 140                 145AAG ATT GTC TAT TTC GAG ACA CCA GCC AAC CCA ACA CTC AAG ATC ATC       530Lys Ile Val Tyr Phe Glu Thr Pro Ala Asn Pro Thr Leu Lys Ile Ile
150                 155                 160GAC ATG GAG CGC GTC TGC AAG GAA GCC CAC AGC CAG GAG GGC GTC TTA       578Asp Met Glu Arg Val Cys Lys Glu Ala His Ser Gln Glu Gly Val Leu165                 170                 175                 180GTT ATC GCC GAT AAC ACA TTC TGC TCA CCA ATG ATC ACA AAC CCA GTC       626Val Ile Ala Asp Asn Thr Phe Cys Ser Pro Met Ile Thr Asn Pro Val
            185                 190                 195GAC TTT GGC GTC GAT GTT GTT GTC CAC TCT GCA ACA AAG TAC ATC AAC       674Asp Phe Gly Val Asp Val Val Val His Ser Ala Thr Lys Tyr Ile Asn
        200                 205                 210GGC CAC ACA GAT GTC GTC GCT GGC CTT ATC TGT GGC AAG GCT GAC CTC       722Gly His Thr Asp Val Val Ala Gly Leu Ile Cys Gly Lys Ala Asp Leu
    215                 220                 225CTT CAA CAG ATT CGT ATG GTT GGT ATC AAG GAT ATC ACA GGA TCT GTT       770Leu Gln Gln Ile Arg Met Val Gly Ile Lys Asp Ile Thr Gly Ser Val
230                 235                 240ATC AGC CCA CAC GAC GCT TGG CTC ATC ACA CGT GGC CTC TCA ACA CTC       818Ile Ser Pro His Asp Ala Trp Leu Ile Thr Arg Gly Leu Ser Thr Leu245                 250                 255                 260AAC ATC AGA ATG AAG GCT GAG AGC GAG AAC GCC ATG AAG GTC GCT GAG       866Asn Ile Arg Met Lys Ala Glu Ser Glu Asn Ala Met Lys Val Ala Glu
            265                 270                 275TAC CTC AAA TCT CAC CCA GCC GTT GAG AAG GTT TAC TAC CCA GGC TTC       914Tyr Leu Lys Ser His Pro Ala Val Glu Lys Val Tyr Tyr Pro Gly Phe
        280                 285                 290GAG GAC CAC GAG GGC CAC GAT ATC GCT AAG AAG CAG ATG AGA ATG TAC       962Glu Asp His Glu Gly His Asp Ile Ala Lys Lys Gln Met Arg Met Tyr
    295                 300                 305GGT TCA ATG ATC ACA TTC ATC CTC AAG TCC GGC TTC GAA GGC GCT AAG      1010Gly Ser Met Ile Thr Phe Ile Leu Lys Ser Gly Phe Glu Gly Ala Lys
310                 315                 320AAG CTC CTC GAC AAC CTC AAG CTT ATC ACA CTT GCA GTT TCC CTT GGT      1058Lys Leu Leu Asp Asn Leu Lys Leu Ile Thr Leu Ala Val Sar Leu Gly325                 330                 335                 340GGC TGC GAG TCC CTC ATC CAG CAC CCA GCT TCA ATG ACT CAC GCT GTC      1106Gly Cys Glu Ser Leu Ile Gln His Pro Ala Ser Met Thr His Ala Val
            345                 350                 355GTT CCA AAG GAG GAG CGT GAG GCC GCT GGT ATT ACA GAT GGC ATG ATC      1154Val Pro Lys Glu Glu Arg Glu Ala Ala Gly Ile Thr Asp Gly Met Ile
        360                 365                 370CGC CTT TCT GTC GGT ATT GAA GAT GCC GAC GAA CTC ATC GCT GAT TTC      1202Arg Leu Ser Val Gly Ile Glu Asp Ala Asp Glu Leu Ile Ala Asp Phe
    375                 380                 385AAA CAG GGC CTT GAC GCT CTT TTA TAAGGATCCT CTAG                      1240Lys Gln Gly Leu Asp Ala Leu Leu
390                 395(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO：10：信息：(i)序列特征：
(A)长度：403个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：Met His His His His His His Met Ser His Glu Arg Met Thr Pro Ala-7      -5                   1               5Thr Ala Cys Ile His Ala Asn Pro Gln Lys Asp Gln Phe Gly Ala Ala10                  15                  20                  25Ile Pro Pro Ile Tyr Gln Thr Ser Thr Phe Val Phe Asp Asn Cys Gln
             30                  35                  40Gln Gly Gly Asn Arg Leu Ala Gly Gln Glu Ser Gly Tyr Ile Tyr Thr
         45                  50                  55Arg Leu Gly Asn Pro Thr Val Ser Asn Leu Glu Gly Lys Ile Ala Phe
     60                  65                  70Leu Glu Lys Thr Glu Ala Cys Val Ala Thr Ser Ser Gly Met Gly Ala
 75                  80                  85Ile Ala Ala Thr Val Leu Thr Ile Leu Lys Ala Gly Asp His Leu Ile90                  95                 100                 105Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Gly Cys Thr His Ala Leu Phe Glu His Ala
            110                 115                 120Leu Thr Lys Phe Gly Ile Gln Val Asp Phe Ile Asn Thr Ala Ile Pro
        125                 130                 135Gly Glu Val Lys Lys His Met Lys Pro Asn Thr Lys Ile Val Tyr Phe
    140                 145                 150Glu Thr Pro Ala Asn Pro Thr Leu Lys Ile Ile Asp Met Glu Arg Val
155                 160                 165Cys Lys Glu Ala His Ser Gln Glu Gly Val Leu Val Ile Ala Asp Asn170                 175                 180                 185Thr Pne Cys Ser Pro Met Ile Thr Asn Pro Val Asp Phe Gly Val Asp
            190                 195                 200Val Val Val His Ser Ala Thr Lys Tyr Ile Asn Gly His Thr Asp Val
        205                 210                 215Val Ala Gly Leu Ile Cys Gly Lys Ala Asp Leu Leu Gln Gln Ile Arg
    220                 225                 230Met Val Gly Ile Lys Asp Ile Thr Gly Ser Val Ile Ser Pro His Asp
235                 240                 245Ala Trp Leu Ile Thr Arg Gly Leu Ser Thr Leu Asn Ile Arg Met Lys250                 255                 260                 265Ala Glu Ser Glu Asn Ala Met Lys Val Ala Glu Tyr Leu Lys Ser His
            270                 275                 280Pro Ala Val Glu Lys Val Tyr Tyr Pro Gly Phe Glu Asp His Glu Gly
        285                 290                 295His Asp Ile Ala Lys Lys Gln Met Arg Met Tyr Gly Ser Met Ile Thr
    300                 305                 310Phe Ile Leu Lys Ser Gly Phe Glu Gly Ala Lys Lys Leu Leu Asp Asn
315                 320                 325Leu Lys Leu Ile Thr Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Cys Glu Ser Leu330                 335                 340                 345Ile Gln His Pro Ala Ser Met Thr His Ala Val Val Pro Lys Glu Glu
            350                 355                 360Arg Glu Ala Ala Gly Ile Thr Asp Gly Met Ile Arg Leu Ser Val Gly
        365                 370                 375Ile Glu Asp Ala Asp Glu Leu Ile Ala Asp Phe Lys Gln Gly Leu Asp
    380                 385                 390Ala Leu Leu
395(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO：11：信息：(i)序列特征：
(A)长度：1191个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ix)特性：
(A)：名称/关键词：CDS
(B)：位置：1..1188
其它信息：/密码子-启始＝1(ix)特征：
(A)：名称/关键词：mat-肽
(B)：位置：1(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：ATG TCT CAC GAG AGA ATG ACC CCA GCA ACA GCA TGC ATC CAT GCT AAT        48Met Ser His Glu Arg Met Thr Pro Ala Thr Ala Cys Ile His Ala Asn1               5                  10                  15CCA CAG AAG GAT CAG TTT GGA GCA GCC ATC CCA CCA ATC TAC CAA ACA        96Pro Gln Lys Asp Gln Phe Gly Ala Ala Ile Pro Pro Ile Tyr Gln Thr
         20                  25                  30TCA ACA TTC GTT TTC GAT AAC TGC CAA CAG GGT GGA AAC AGA TTC GCT       144Ser Thr Phe Val Phe Asp Asn Cys Gln Gln Gly Gly Asn Arg Phe Ala
     35                  40                  45GGT CAG GAA TCC GGC TAC ATC TAC ACA CGT CTC GGC AAC CCA ACA GTT       192Gly Gln Glu Ser Gly Tyr Ile Tyr Thr Arg Leu Gly Asn Pro Thr Val
 50                  55                  60TCA AAC CTC GAA GGC AAG ATC GCC TTC CTC GAG AAA ACA GAA GCA TGC       240Ser Asn Leu Glu Gly Lys Ile Ala Phe Leu Glu Lys Thr Glu Ala Cys65                  70                  75                  80GTT GCC ACA TCT TCT GGC ATG GGT GCC ATT GCT GCT ACA GTT TTG ACA       288Val Ala Thr Ser Ser Gly Met Gly Ala Ile Ala Ala Thr Val Leu Thr
             85                  90                  95ATC CTC AAG GCC GGA GAT CAC TTA ATC TCC GAT GAG TGC CTT TAT GGC       336Ile Leu Lys Ala Gly Asp His Leu Ile Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Gly
        100                 105                 110TGC ACA CAT GCT CTC TTT GAG CAC GCA TTG ACA AAG TTC GGC ATC CAG       384Cys Thr His Ala Leu Phe Glu His Ala Leu Thr Lys Phe Gly Ile Gln
    115                 120                 125GTC GAC TTC ATC AAC ACA GCC ATC CCA GGC GAG GTC AAG AAG CAC ATG       432Val Asp Phe Ile Asn Thr Ala Ile Pro Gly Glu Val Lys Lys His Met
130                 135                 140AAG CCA AAC ACA AAG ATT GTC TAT TTC GAG ACA CCA GCC AAC CCA ACA       480Lys Pro Asn Thr Lys Ile Val Tyr Phe Glu Thr Pro Ala Asn Pro Thr145                 150                 155                 160CTC AAG ATC ATC GAC ATG GAG CGC GTC TGC AAG GAC GCC CAC AGC CAG       528Leu Lys Ile Ile Asp Met Glu Arg Val Cys Lys Asp Ala His Ser Gln
            165                 170                 175GAG GGC GTC TTA GTT ATC GCC GAT AAC ACA TTC TGC TCA CCA ATG ATC       576Glu Gly Val Leu Val Ile Ala Asp Asn Thr Phe Cys Ser Pro Met Ile
        180                 185                 190ACA AAC CCA GTC GAC TTT GGC GTC GAT GTT GTT GTC CAC TCT GCA ACA       624Thr Asn Pro Val Asp Phe Gly Val Asp Val Val Val His Ser Ala Thr
    195                 200                 205AAG TAC ATC AAC GGC CAC ACA GAT GTC GTC GCT GGC CTT ATC TGT GGC       672Lys Tyr Ile Asn Gly His Thr Asp Val Val Ala Gly Leu Ile Cys Gly
210                 215                 220AAG GCT GAC CTC CTT CAA CAG ATT CGT ATG GTT GGT ATC AAG GAT ATC       720Lys Ala Asp Leu Leu Gln Gln Ile Arg Met Val Gly Ile Lys Asp Ile225                 230                 235                 240ACA GGA TCT GTT ATC AGC CCA CAC GAC GCT TGG CTC ATC ACA CGT GGC       768Thr Gly Ser Val Ile Ser Pro His Asp Ala Trp Leu Ile Thr Arg Gly
            245                 250                 255CTC TCA ACA CTC AAC ATC AGA ATG AAG GCT GAG AGC GAG AAC GCC ATG       816Leu Ser Thr Leu Asn Ile Arg Met Lys Ala Glu Ser Glu Asn Ala Met
        260                 265                 270AAG GTC GCT GAG TAC CTC AAA TCT CAC CCA GCC GTT GAG AAG GTT TAC       864Lys Val Ala Glu Tyr Leu Lys Ser His Pro Ala Val Glu Lys Val Tyr
    275                 280                 285TAC CCA GGC TTC GAG GAC CAC GAG GGC CAC GAT ATC GCT AAG AAG CAG       912Tyr Pro Gly Phe Glu Asp His Glu Gly His Asp Ile Ala Lys Lys Gln
290                 295                 300ATG AGA ATG TCG GGT TCA ATG ATC ACA TTC ATC CTC AAG TCC GGC TTC       960Met Arg Met Ser Gly Ser Met Ile Thr Phe Ile Leu Lys Ser Gly Phe305                 310                 315                 320GAA GGC GCT AAG AAG CTC CTC GAC AAC CTC AAG CTT ATC ACA CTT GCA      1008Glu Gly Ala Lys Lys Leu Leu Asp Asn Leu Lys Leu Ile Thr Leu Ala
            325                 330                 335GTT TCC CTT GGT GGC TGC GAG TCC CTC ATC CAG CAC CCA GCT TCA ATG      1056Val Ser Leu Gly Gly Cys Glu Ser Leu Ile Gln His Pro Ala Ser Met
        340                 345                 350ACT CAC GCT GTC GTT CCA AAG GAG GAG CGT GAG GCC GCT GGT ATT ACA      1104Thr His Ala Val Val Pro Lys Glu Glu Arg Glu Ala Ala Gly Ile Thr
    355                 360                 365GAT GGC ATG ATC CGC CTT TCT GTC GGT ATT GAA GAT GCC GAC GAA CTC      1152Asp Gly Met Ile Arg Leu Ser Val Gly Ile Glu Asp Ala Asp Glu Leu
370                 375                 380ATC GCT GAT TTC AAA CAG GGC CTT GAC GCT CTT TTA TAA                  1191Ile Ala Asp Phe Lys Gln Gly Leu Asp Ala Leu Leu385                 390                 395(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO：12：信息：(i)序列特征：
(A)长度：396个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：Met Ser His Glu Arg Met Thr Pro Ala Thr Ala Cys Ile His Ala Asn1               5                  10                  15Pro Gln Lys Asp Gln Phe Gly Ala Ala Ile Pro Pro Ile Tyr Gln Thr
         20                  25                  30Ser Thr Phe Val Phe Asp Asn Cys Gln Gln Gly Gly Asn Arg Phe Ala
     35                  40                  45Gly Gln Glu Ser Gly Tyr Ile Tyr Thr Arg Leu Gly Asn Pro Thr Val
 50                  55                  60Ser Asn Leu Glu Gly Lys Ile Ala Phe Leu Glu Lys Thr Glu Ala Cys65                  70                  75                  80Val Ala Thr Ser Ser Gly Mer Gly Ala Ile Ala Ala Thr Val Leu Thr
             85                  90                  95Ile Leu Lys Ala Gly Asp His Leu Ile Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Gly
        100                 105                 110Cys Thr His Ala Leu Phe Glu His Ala Leu Thr Lys Phe Gly Ile Gln
    115                 120                 125Val Asp Phe Ile Asn Thr Ala Ile Pro Gly Glu Val Lys Lys His Met
130                 135                 140Lys Pro Asn Thr Lys Ile Val Tyr Phe Glu Thr Pro Ala Asn Pro Thr145                 150                 155                 160Leu Lys Ile Ile Asp Met Glu Arg Val Cys Lys Asp Ala His Ser Gln
            165                 170                 175Glu Gly Val Leu Val Ile Ala Asp Asn Thr Phe Cys Ser Pro Met Ile
        180                 185                 190Thr Asn Pro Val Asp Phe Gly Val Asp Val Val Val His Ser Ala Thr
    195                 200                 205Lys Tyr Ile Asn Gly His Thr Asp Val Val Ala Gly Leu Ile Cys Gly
210                 215                 220Lys Ala Asp Leu Leu Gln Gln Ile Arg Met Val Gly Ile Lys Asp Ile225                 230                 235                 240Thr Gly Ser Val Ile Ser Pro His Asp Ala Trp Leu Ile Thr Arg Gly
            245                 250                 255Leu Ser Thr Leu Asn Ile Arg Met Lys Ala Glu Ser Glu Asn Ala Met
        260                 265                 270Lys Val Ala Glu Tyr Leu Lys Ser His Pro Ala Val Glu Lys Val Tyr
    275                 280                 285Tyr Pro Gly Phe Glu Asp His Glu Gly His Asp Ile Ala Lys Lys Gln
290                 295                 300Met Arg Met Ser Gly Ser Met Ile Thr Phe Ile Leu Lys Ser Gly Phe305                 310                 315                 320Glu Gly Ala Lys Lys Leu Leu Asp Asn Leu Lys Leu Ile Thr Leu Ala
            325                 330                 335Val Ser Leu Gly Gly Cys Glu Ser Leu Ile Gln His Pro Ala Ser Met
        340                 345                 350Thr His Ala Val Val Pro Lys Glu Glu Arg Glu Ala Ala Gly Ile Thr
    355                 360                 365Asp Gly Met Ile Arg Leu Ser Val Gly Ile Glu Asp Ala Asp Glu Leu
370                 375                 380Ile Ala Asp Phe Lys Gln Gly Leu Asp Ala Leu Leu385                 390                 395  (2)INFORMATION FOR SEQ ID NO：13：信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：51个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：GGATTACATA TGCATCATCA TCATCATCAC ATGAGTGGCC ACGCTATCGA C               51(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO：14：信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：34个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：GGATTAGGAT CCTTAGAGGA CTAAGTCGAG AGCC                                 34(2)INFORAMATION FOR SEQ ID NO：15：信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：32个碱基对
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(A)长度：22个碱基对
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(A)长度：18个碱基对
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(A)长度：30个碱基对
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(A)长度：49个碱基对
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Claims (40)

1.测定存在于包含同型半胱氨酸和半胱氨酸的生物样品中的同型半胱氨酸的量的方法，该方法包括测定从在由同型半胱氨酸酶催化的反应中的同型半胱氨酸产生的产物化合物的浓度，其中该产物化合物也可通过所述同型半胱氨酸酶对所述样品中的半胱氨酸反应而产生，并且其中所述样品包含其它干扰浓度的半胱氨酸，所述方法包括步骤：
(a)在合适的环境中，将所述样品与能将半胱氨酸转变为非同型半胱氨酸酶的底物的化合物的第一酶一起保温；
(b)将从步骤(a)产生的混合物与同型半胱氨酸酶一起保温以产生产物化合物，和
(c)通过测定该产物化合物的浓度测定样品中同型半胱氨酸的量。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)所用的酶选自γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，半胱氨酸氧化酶，胱硫醚β合成酶，或半胱氨酸tRNA合成酶。
3.根据权利要求1的方法，其中的生物样品含有甲硫氨酸。
4.根据权利要求1的方法，其中所述的生物样品选自尿、组织液、血液、血清或血浆。
5.根据权利要求1的方法，其中所述的同型半胱氨酸酶来自原核或真核微生物。
6.根据权利要求5的方法，其中同型半胱氨酸酶来自梭状芽孢杆菌属菌株，气单胞菌属菌株，恶臭假单胞菌或阴道毛滴虫。
7.根据权利要求1的方法，其中步骤(b)所用的同型半胱氨酸酶选自：
(a)mgl1基因编码的阴道毛滴虫酶(SEQ ID NO：11)；
(b)mgl2基因编码的阴道毛滴虫酶；
(c)SEQ ID NO：10，或其残基Met1到Leu396；
(d)模仿SEQ ID NO：12，但缺失Leu47、Glu172和Tyr308其中的一个或多个，或被根据下式取代：
(1)对于Leu47，用Leu、Ile、Val、Ala、Gly、Met和Trp取代；
(2)对于Asp172，用Glu、Gln或Asn取代；
(3)对于Ser308，用Tyr、Phe、Met、Trp、Gln、Thr或Asn取代；
(e)模仿假单胞杆菌属、梭状芽孢杆菌属，气单胞菌属或毛滴虫属，其中其一个或多个原始多肽的亚序列对应地被一个或多个选自下面的SEQIDNO：10的同源肽序列取代：
(1)Gly-Gly-Asn-Arg-Leu-Ala-Gly-Gln-Glu(参见SEQIDNO：10的残基43-51)
(2)包含Leu的(1)的子集；
(3)Arg-Val-Cys-Lys-Glu-Ala-His-Ser-Gln(参见SEQIDNO：10的残基168-176)
(4)包含Glu的(3)的子集；
(5)Gln-Met-Arg-Met-Tyr-Gly-Ser-Met-Ile(参见SEQIDNO：10的残基304-312)；和
(6)包含Tyr的(5)的子集；
(f)恶臭假单胞菌同型半胱氨酸编码序列的DNA分子，其中一个或多个肽序列对应地被一个或多个阴道毛滴虫同型半胱氨酸酶的肽序列取代，并且其中所述产生的氨基酸取代选自：
(1)来自阴道毛滴虫(T2)的Cys-Ser-Arg-Ala-Asp-Ile-Ile-Ala-Lys-Val-Lys-Ser(SEQ ID NO：1)或其任何子集取代来自恶臭假单胞菌的Val-Gly-Ser-Gln-Ala-Leu-Val-Asp-Arg-Ile-Arg-Leu(SEQ ID NO：2)或其任何子集；
(2)来自阴道毛滴虫(T2)的Asp-Val-Asp(SEQ ID NO：3)或其任何子集取代来自恶臭假单胞菌的Glu-Leu-Lys(SEQ IS NO：4)或其任何子集；
(3)来自阴道毛滴虫(T2)的Cys-His-Val-VAl(SEQ ID NO：5)或其任何子集取代来自恶臭假单胞菌的Ala-Leu-Gln-Leu(SEQ IS NO：6)或其任何子集；
(4)来自阴道毛滴虫(T2)的Cys-Glu-Asn-Val-Gln-Asp-Ile-Ile-Asp-Asp(SEQ ID NO：7)或其任何子集取代来自恶臭假单胞菌的Gly--Leu-Glu-Asp-Ile-Asp-Asp-Leu-Leu-Ala(SEQ IS NO：8)或其任何子集；和
(5)包含一种、两种、三种或四种由上面(1)、(2)、(3)和(4)组提供的取代的所有组合；
(g)SEQ ID NO：10的置换变异体、插入变异体、缺失变异体或衍生物，或其残基Met1到Leu396，其中所述变异体或衍生物具有一种或多种下面的特性：
(1)在合适的检测中的SEQIDNO：10对同型半胱氨酸活性的至少约25％；和/或
(2)不超过在合适的检测中的SEQIDNO：10对半胱氨酸活性的约500％；
(h)嵌合同型半胱氨酸酶，由包括来自除(e)和(f)中所说的之外的恶臭假单胞菌和阴道毛滴虫的同型半胱氨酸酶编码核苷酸序列的嵌合核苷酸表达而产生。
8.测定存在于包含同型半胱氨酸和半胱氨酸的生物样品中的同型半胱氨酸的量的方法，该方法包括测定从在由同型半胱氨酸酶催化的反应中的同型半胱氨酸产生的产物化合物的浓度，其中该产物化合物也可通过所述同型半胱氨酸酶对所述样品中的半胱氨酸反应而产生，并且其中所述样品包含其它干扰浓度的半胱氨酸，所述方法包括步骤：
(a)在合适的环境中，将所述样品与能将半胱氨酸转变为非同型半胱氨酸酶的底物化合物的第一酶一起保温；
(b)将从步骤(a)产生的混合物与同型半胱氨酸酶一起保温以产生产物化合物，和
(c)通过测定该产物化合物的浓度测定样品中同型半胱氨酸的量；
其中的生物样品还包括与蛋白质半胱氨酸残基，游离半胱氨酸分子或其他同型半胱氨酸分子二硫键共价结合的同型半胱氨酸分子，并且该方法进一步包括使该结合的同型半胱氨酸分子可得到以与步骤(b)的同型半胱氨酸酶反应的步骤。
9.根据权利要求8的方法，其中的使该结合的同型半胱氨酸分子可得到以与同型半胱氨酸酶反应的步骤是通过在步骤(a)前用三-(2-羧乙基)膦，DL-二硫苏糖醇，β-巯基乙醇或其他二硫键还原剂处理该样品而进行的。
10.纯化和分离DNA分子，包括具有同型半胱氨酸酶活性的蛋白质的编码序列，其中该编码序列选自：
(a)编码SEQ ID NO：10，或其残基Met1到Leu396的核苷酸序列；
(b)核苷酸序列，编码模仿SEQ ID NO：12的多肽，但该多肽中的Leu47、Glu172和Tyr308其中的一个或多个缺失，或被根据下式取代：
(1)对于Leu47，用Leu、Ile、Val、Ala、Gly、Met和Trp取代；
(2)对于Asp172，用Glu、Gln或Asn取代；
(2)对于Ser308，用Tyr、Phe、Met、Trp、Gln、Thr或Asn取代；
(c)核苷酸序列，编码模仿假单胞杆菌属、梭状芽孢杆菌属气单胞菌属或毛滴虫属的同型半胱氨酸酶，其中其一个或多个原始氨基酸序列的肽亚序列对应地被一个或多个选自下面的SEQIDNO：10的同源肽序列取代：
(1)Gly-Gly-Asn-Arg-Leu-Ala-Gly-Gln-Glu(参见SEQIDNO：10的残基43-51)
(2)包含Leu的(1)的子集；
(3)Arg-Val-Cys-Lys-Glu-Ala-His-Ser-Gln(参见SEQIDNO：10的残基168-176)
(4)包含Glu的(3)的子集；
(5)Gln-Met-Arg-Met-Tyr-Gly-Ser-Met-Ile(参见SEQIDNO：10的残基304-312)；和
(6)包含Tyr的(5)的子集；
(d)核苷酸序列，编码恶臭假单胞菌同型半胱氨酸酶，其中一个或多该同型半胱氨酸酶的肽序列对应地被一个或多个阴道毛滴虫同型半胱氨酸酶的肽序列取代，并且其中所述产生的氨基酸取代选自：
(1)来自阴道毛滴虫(T2)的Cys-Ser-Arg-Ala-Asp-Ile-Ile-Ala-Lys-Val-Lys-Ser(SEQ ID NO：1)或其任何子集取代来自恶臭假单胞菌的Val-Gly-Ser-Gln-Ala-Leu-Val-Asp-Arg-Ile-Arg-Leu(SEQ IS NO：2)或其任何子集；
(2)来自阴道毛滴虫(T2)的Asp-Val-Asp(SEQ ID NO：3)或其任何子集取代来自恶臭假单胞菌的Glu-Leu-Lys(SEQ IS NO：4)或其任何子集；
(3)来自阴道毛滴虫(T2)的Cys-His-Val-VAl(SEQ ID NO：5)或其任何子集取代来自恶臭假单胞菌的Ala-Leu-Gln-Leu(SEQ IS NO：6)或其任何子集；
(4)来自阴道毛滴虫(T2)的Cys-Glu-Asn-Val-Gln-Asp-Ile-Ile-Asp-Asp(SEQ ID NO：7)或其任何子集取代来自恶臭假单胞菌的Gly--Leu-Glu-Asp-Ile-Asp-Asp-Leu-Leu-Ala(SEQ IS NO：8)或其任何子集；和
(5)包含一种、两种、三种或四种由上面(1)、(2)、(3)和(4)组提供的取代的所有组合；
(e)核苷酸序列，编码SEQIDNO：10的置换变异体、插入变异体、缺失变异体或衍生物，或其残基Met1到Leu396，其中所述变异体或衍生物具有一种或多种下面的特性：
(1)在合适的检测中的SEQIDNO：10对同型半胱氨酸活性的至少约25％；和/或
(2)不超过在合适的检测中的SEQIDNO：10对半胱氨酸活性的约500％；
(f)核苷酸序列，编码嵌合同型半胱氨酸酶，由包括来自除(e)和(f)中所说之外的恶臭假单胞菌和阴道毛滴虫的同型半胱氨酸酶编码核苷酸序列的嵌合核苷酸表达而产生。
11.根据权利要求10的纯化和分离DNA分子，其中编码序列可操作地连接到能在宿主中指导其中表达的控制序列。
12.含有根据权利要求11的DNA分子的宿主细胞。
13.同型半胱氨酸酶，即
(a)SEQ ID NO：10，或其残基Met1到Leu396；
(b)模仿SEQ ID NO：12，但其中缺失Leu47、Glu172和Tyr308其中的一个或多个，或被根据下式取代：
(1)对于Leu47，用Leu、Ile、Val、Ala、Gly、Met和Trp取代；
(2)对于Asp172，用Glu、Gln或Asn取代；
(2)对于Ser308，用Tyr、Phe、Met、Trp、Gln、Thr或Asn取代；
(c)模仿假单胞杆菌属、梭状芽孢杆菌属，气单胞菌属或毛滴虫属，其中其一个或多个原始多肽序列的肽亚序列对应地被一个或多个选自下面的SEQIDNO：10的同源肽序列取代：
(1)Gly-Gly-Asn-Arg-Leu-Ala-Gly-Gln-Glu(参见SEQIDNO：10的残基43-51)
(2)包含Leu的(1)的子集；
(3)Arg-Val-Cys-Lys-Glu-Ala-His-Ser-Gln(参见SEQIDNO：10的残基168-176)
(4)包含Glu的(3)的子集；
(5)Gln-Met-Arg-Met-Tyr-Gly-Ser-Met-Ile(参见SEQIDNO：10的残基304-312)；和
(6)包含Tyr的(5)的子集；
(d)恶臭假单胞菌同型半胱氨酸编码序列的DNA分子，其中一个或多个肽序列对应地被一个或多个阴道毛滴虫同型半胱氨酸酶的肽序列取代，并且其中所述产生的氨基酸取代选自：
(1)来自阴道毛滴虫(T2)的Cys-Ser-Arg-Ala-Asp-Ile-Ile-Ala-Lys-Val-Lys-Ser(SEQ ID NO：1)或其任何子集取代来自恶臭假单胞菌的Val-Gly-Ser-Gln-Ala-Leu-Val-Asp-Arg-Ile-Arg-Leu(SEQ IS NO：2)或其任何子集；
(2)来自阴道毛滴虫(T2)的Asp-Val-Asp(SEQ ID NO：3)或其任何子集取代来自恶臭假单胞菌的Glu-Leu-Lys(SEQ IS NO：4)或其任何子集；
(3)来自阴道毛滴虫(T2)的Cys-His-Val-VAl(SEQ ID NO：5)或其任何子集取代来自恶臭假单胞菌的Ala-Leu-Gln-Leu(SEQ IS NO：6)或其任何子集；
(4)来自阴道毛滴虫(T2)的Cys-Glu-Asn-Val-Gln-Asp-Ile-Ile-Asp-Asp(SEQ ID NO：7)或其任何子集取代来自恶臭假单胞菌的Gly--Leu-Glu-Asp-Ile-Asp-Asp-Leu-Leu-Ala(SEQ IS NO：8)或其任何子集；和
(5)包含一种、两种、三种或四种由上面(1)、(2)、(3)和(4)组提供的取代的所有组合；
(e)SEQIDNO：10的置换变异体、插入变异体、缺失变异体或衍生物，或其残基Met1到Leu396，其中所述变异体或衍生物具有一种或多种下面的特性：
(1)在合适的检测中的SEQIDNO：10对同型半胱氨酸活性的至少约25％；和/或
(2)不超过在合适的检测中的SEQIDNO：10对半胱氨酸活性的约500％；
(f)嵌合同型半胱氨酸酶，由包括来自除(e)和(f)中所说的之外的恶臭假单胞菌和阴道毛滴虫的同型半胱氨酸酶编码核苷酸序列的嵌合核苷酸表达而产生。
14.同型半胱氨酸酶，其对半胱氨酸和甲硫氨酸为足够非活性，致使个体的组织液、尿液、血液、血清或血浆样品中存在的同型半胱氨酸的量可在一个酶分析法中测定，其中测定样品中同型半胱氨酸酶和同型半胱氨酸反应得到的一个或多个产物，其中测定基本上不受其中的半胱氨酸和甲硫氨酸的浓度的影响。
15.用于个体生物样品中的同型半胱氨酸的量的诊断试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)选自γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，半胱氨酸氧化酶，胱硫醚β合成酶，或半胱氨酸tRNA合成酶的酶；
(b)同型半胱氨酸酶；和
(c)至少一种能被用来测定由同型半胱氨酸酶对该样品反应形成的硫化氢，或氨的量的试剂。
16.根据权利要求15的试剂盒，其中该酶(a)是来自大肠杆菌的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶。
17.测定存在于包含同型半胱氨酸和半胱氨酸的生物样品中的同型半胱氨酸的量的方法，包括步骤：
(a)将该样品与能从同型半胱氨酸中产生硫化氢和α-丁酮酸，并从半胱氨酸中产生硫化氢和丙酮酸的酶制剂接触，和
(b1)将该样品或其备份或部分与通过其作用可测定该样品或其备份或部分中丙酮酸的量的酶制剂接触，或
(b2)将该样品或其备份或部分与通过其作用可测定该样品或其备份或部分中α-丁酮酸的量的酶制剂接触，并然后
(c)通过比较如此测定的丙酮酸或α-丁酮酸的量与从中产生的硫化氢的量计算该样品中同型半胱氨酸的量。
18.根据权利要求17的方法，其中该酶制剂包括可测定样品中丙酮酸的乳酸脱氢酶或可测定样品中α-丁酮酸的亮氨酸脱氢酶。
19.测定存在于包含例如同型半胱氨酸和半胱氨酸的生物样品中的同型半胱氨酸的量的方法，包括将实施样品与能从同型半胱氨酸和半胱氨酸产生硫化氢的酶制剂接触，通过测定从同型半胱氨酸产生的硫化氢的量来确定所述样品中同型半胱氨酸的量，其中任选地，该生物样品包括与其它分子共价结合的同型半胱氨酸分子，并且该方法包括在测定硫化氢前从中解离该同型半胱氨酸的进一步的步骤。
20.根据权利要求19的方法，其中的硫化氢产生于半胱氨酸和同型半胱氨酸，而从同型半胱氨酸所的硫化氢通过包括如下的另外的起始步骤不同于从半胱氨酸产生的硫化氢：
(a)将所述生物样品与保护同型半胱氨酸免于所述酶制剂作用的试剂接触；
(b)让所述酶制剂从存在于所述样品中的半胱氨酸产生硫化氢；
(c)除去所述硫化氢；和
(d)脱保护所述同型半胱氨酸，并加入另外量的酶制剂以从中产生硫化氢。
21.根据权利要求19的测定存在于包含同型半胱氨酸和半胱氨酸的生物样品中的同型半胱氨酸的量的方法，包括步骤：
(a)将所述样品分成2份，份1或1份2；
(b)将份1与能将同型半胱氨酸转化为不为同型半胱氨酸底物的底物的第一种酶制剂接触，其中所述第一种酶制剂不将半胱氨酸认作底物；
(c)独立地将份1和份2与包含能从同型半胱氨酸和半胱氨酸产生硫化氢的同型半胱氨酸酶的第二种酶制剂接触；
(d)测定份1和份2产生的硫化氢的量；和
(e)通过从份2的硫化氢的测定量减去份1的硫化氢的测定量，并将结果乘以2计算所述生物样品中的同型半胱氨酸的量。
22.根据权利要求21的方法，其中步骤(b)所用的酶制剂包括选自S-腺甘同型半胱氨酸水解酶或胱硫醚合成酶的酶。
23.测定生物样品中的同型半胱氨酸的量的诊断试剂盒，包含：
(a)阴道毛滴虫或恶臭假单胞菌同型半胱氨酸酶，或通过表达包括来自恶臭假单胞菌和阴道毛滴虫的核苷酸序列的嵌合编码多核苷酸而产生的嵌合酶；
(b)至少一种能被用来测定在同型半胱氨酸酶反应中形成的硫化氢的量的试剂；和
(c)至少一种能被用来测定在同型半胱氨酸酶反应中从该样品中存在的半胱氨酸形成的丙酮酸的量的试剂。
24.一种用于个体生物液体中的同型半胱氨酸浓度的单酶分析法中的诊断试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)同型半胱氨酸酶；和
(b)至少一种能被用来测定由同型半胱氨酸酶对同型半胱氨酸反应形成的产物硫化氢的量的试剂；其中
所述同型半胱氨酸酶对半胱氨酸是足够无活性的以致任何由所述同型半胱氨酸酶对半胱氨酸反应产生的硫化氢基本上不干扰使用所述试剂盒评价心血管疾病的危险。
25.权利要求24的诊断试剂盒，其中包含的同型半胱氨酸酶具有这一特性，即当所述液体中的同型半胱氨酸和半胱氨酸的浓度分别为约20umol和约300umol时，在对同型半胱氨酸的分析中，在与生物样品接触时，通过所述同型半胱氨酸酶的作用而产生的硫化氢的至少约90％是由所述同型半胱氨酸产生。
26.权利要求25的诊断试剂盒，其中包含的所述同型半胱氨酸酶具有这一特性，即在对同型半胱氨酸的分析中在与生物样品接触时通过所述同型半胱氨酸酶的作用而产生的硫化氢的至少约99％是由所述同型半胱氨酸产生。
27.权利要求24的诊断试剂盒，其能被用来测定在所述生物液体中的范围为1-500umol的同型半胱氨酸浓度，其中所述液体还包含约10-约1000umol的半胱氨酸。
28.权利要求24的诊断试剂盒，其能被用来测定组织液、血液、血浆、血清或尿液中的同型半胱氨酸。
29.权利要求24的诊断试剂盒，进一步包含一种或多种选自下面的试剂：
(a)一种能还原二硫键的试剂；
(b)三价铁的铁的来源；
(c)N，N-二烷基-对-苯二胺；和
(d)作为校准标准的同型半胱氨酸。
30.权利要求24的诊断试剂盒，包含：
(a)SEQ ID NO：10，或其残基Met1至Leu396作为同型半胱氨酸酶；
(b)试剂50mM硼酸盐缓冲液，pH7.5；100mM DL-二硫苏糖醇；10mM氰铁酸钾，1％w/v TritonX-100；100mM N，N-二烷基-苯二胺的溶液，其中二烷基选自二甲基、二乙基、二丙基或二丁基；和
(c)同型半胱氨酸和/或同型胱氨酸作为校准标准。
31.包含一个或多个拷贝的SEQ ID NO：10，或其残基Met1至Leu396的编码序列的宿主细菌细胞。
32.权利要求31的宿主细胞，其为大肠杆菌pAC2-1或pAC2-11。
33.权利要求31的宿主细胞，其为ATCC98549。
34.一种测定存在于个体生物液体中的同型半胱氨酸的量的方法，其中所述方法包括将所述样品与能催化从同型半胱氨酸产生可检测量的硫化氢的酶接触的步骤，并且其中所述样品进一步包含从中可产生干扰所述测定的可检测量的硫化氢的量的半胱氨酸，其改进包括选择其中所用同型半胱氨酸酶，该酶具有这一特性，即当所述液体中的同型半胱氨酸和半胱氨酸的浓度分别为约20umol和约300umol时，在对同型半胱氨酸的分析中，在与生物样品接触时通过所述同型半胱氨酸酶的作用而产生的硫化氢的至少约90％是由所述同型半胱氨酸产生。
35.一种用于测定个体生物液体中的同型半胱氨酸浓度的单酶法，包括使用根据权利要求24的诊断试剂盒。
36.一种评价个体心血管疾病危险的诊断方法，其中测定所述个体的生物液体中的同型半胱氨酸浓度，不存在来自在所述液体中半胱氨酸和甲硫氨酸浓度的干扰，所述方法包括步骤：
(a)为了以游离同型半胱氨酸的形式释放以二硫键合形式存在于其中的全部同型半胱氨酸部分，将生物液体与能还原二硫键的试剂接触；
(b)在其中所述硫化氢不溢出的条件下，将所述样品与和同型半胱氨酸比较，对半胱氨酸基本上为无活性的同型半胱氨酸酶接触，致使由所述接触产生的至少约90％的硫化氢由同型半胱氨酸产生；
(c)为了在原位产生亚甲兰类型的发色团，将三价铁的铁和N，N-二烷基-苯二胺加入至所述包含硫化氢的样品中；
(d)根据产生的发色团的浓度确定存在于所述样品中的同型半胱氨酸的浓度；和
(e)将所述结果与被已知与增加的心血管疾病危险有关的个体生物液体中的同型半胱氨酸水平比较。
37.权利要求36的方法，其中所述同型半胱氨酸酶为SEQ ID NO：10，或其残基Met1至Leu396。
38.根据权利要求1，8，17和19任一的方法，其中的生物样品含有甲硫氨酸。
39.权利要求36的方法，其中所述生物液体样品选自组织液、尿液、血液、血清和血浆。
40.权利要求24的诊断试剂盒，包含
(a)与对同型半胱氨酸比较，对半胱氨酸基本为无活性的同型半胱氨酸酶；
(b)一种缓冲液；一种还原剂，一种可用来检测硫化氢的试剂；和任选，
(c)同型半胱氨酸和/或同型胱氨酸作为校准标准。
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