CN116840197A - 一种2’-o-甲基转移酶活性检测方法、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种2’‑O‑甲基转移酶活性检测方法、试剂盒及应用。本发明的2’‑O‑甲基转移酶活性检测方法，利用S‑腺苷‑L‑同型半胱氨酸水解酶、腺苷脱氨酶将生成的S‑腺苷‑L‑同型半胱氨酸不可逆地转化为同型半胱氨酸；硫醇特异性荧光分子探针结合同型半胱氨酸后形成的化合物采用特异性结合硫醇基而发射荧光的分子探针来直接测定反应中产生的同型半胱氨酸含量，然后计算出相应的S‑腺苷‑L‑同型半胱氨酸含量，以此测定2’‑O‑甲基转移酶活性；本发明的检测方法具有操作简便，检测快速，准确度高，可实现高通量、自动化检测，无放射性污染等突出优势。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种2’-O-甲基转移酶活性检测方法、试剂盒及应用。
背景技术
哺乳动物细胞内的mRNA前体需要经过多种酶参与的转录后修饰在5’端形成帽子结构，以提高mRNA的稳定性并促进其转运和翻译过程。其中作为关键酶之一的2’-O-甲基转移酶负责将具有0型帽子结构(Cap0，m7GpppN)的RNA的第一个核苷酸(N，通常是A或G)的2’-OH进一步甲基化形成1型帽子结构(Cap1，m7GpppmN)，如图1所示。RNA的2’-O甲基化修饰是细胞先天免疫系统区分内源性和外源性mRNA的分子特征，具有非常重要的生理功能。使用酶促反应为体外转录的RNA加帽是一种简单高效的方法，能够显著提高外源性RNA在细胞内的稳定性和翻译能力。因此，检测2’-O-甲基转移酶的活性具有重要的意义。
标准的2’-O-甲基转移酶活性检测采用放射性底物掺入法，即使用3H标记的S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)为底物(标记在供体甲基上)，经2’-O-甲基转移酶将具有放射性标记的甲基掺入到体外转录的RNA上，再通过色谱纯化回收目的RNA，利用液体闪烁计数仪检测目的RNA中的放射性，进而计算出2’-O-甲基转移酶的活性。这种方法具有放射性污染，且检测成本高、操作步骤复杂、耗时长，不利于推广使用，也难以实现高通量和自动化，不适用于突变体的筛选。
基于目前的2’-O-甲基转移酶活性检测方法存在的缺陷，有必要对此进行改进。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种2’-O-甲基转移酶活性检测方法、试剂盒及应用，以解决或部分解决现有技术中存在的问题。
第一方面，本发明提供了一种2’-O-甲基转移酶活性检测方法，包括以下步骤：
在RNA加帽缓冲液中加入具有Cap0帽子结构的RNA、S-腺苷-L-甲硫氨酸、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶、腺苷脱氨酶以及含有2’-O-甲基转移酶的待测样品得到待测反应液，并发生酶催化反应；
配制含有硫醇特异性荧光分子探针的荧光反应液，将荧光反应液加入至酶催化反应后的待测反应液中，利用荧光法测定酶催化反应中生成的S-腺苷-L-同型半胱氨酸浓度，进而测定2’-O-甲基转移酶的活性。
优选的是，2’-O-甲基转移酶活性检测方法，包括以下步骤：
配制已知不同浓度的S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准溶液母液；
在RNA加帽缓冲液中加入具有Cap0帽子结构的RNA、S-腺苷-L-甲硫氨酸、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶、腺苷脱氨酶以及已知不同浓度的S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准溶液母液得到标准反应液，于36～38℃下酶催化反应5～30min；
将荧光反应液加入至酶催化反应后的标准反应液中，使用382～386nm激发光激发并读取511～515nm的发射光荧光值，以S-腺苷-L-同型半胱氨酸浓度以及对应的荧光值作曲线得到S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准曲线；
在RNA加帽缓冲液中加入具有Cap0帽子结构的RNA、S-腺苷-L-甲硫氨酸、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶、腺苷脱氨酶以及含有已知浓度2’-O-甲基转移酶的待测样品得到待测反应液，于36～38℃下酶催化反应5～30min；
将荧光反应液加入至酶催化反应后的待测反应液中，使用382～386nm激发光激发并读取511～515nm的发射光荧光值，以读取的发射光荧光值以及S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准曲线计算得到反应中生成的S-腺苷-L-同型半胱氨酸浓度；
根据已知浓度2’-O-甲基转移酶的待测样品在反应中生成的S-腺苷-L-同型半胱氨酸浓度，计算2’-O-甲基转移酶活性。
优选的是，2’-O-甲基转移酶活性检测方法，所述RNA加帽缓冲液是含有浓度为4～6mM KCl、0.5～1.5mM MgCl2和0.5～1.5mM DTT，pH为7.0～8.0的Tris缓冲液。
优选的是，2’-O-甲基转移酶活性检测方法，所述荧光反应液的配制方法为将硫醇特异性荧光分子探针加入至荧光缓冲液中；其中，硫醇特异性荧光分子探针的浓度为2～20μM。
优选的是，2’-O-甲基转移酶活性检测方法，所述荧光缓冲液是盐离子浓度为20-200mM、pH为7.0-8.0的Tris或PB缓冲液。
优选的是，2’-O-甲基转移酶活性检测方法，所述荧光缓冲液为含有4～6mM KCl、0.5～1.5mM MgCl2、pH为7.0～8.0的Tris缓冲液。
优选的是，2’-O-甲基转移酶活性检测方法，待测反应液中Cap0帽子结构的RNA的浓度为20-50μM、S-腺苷-L-甲硫氨酸的浓度为50-100μM、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶的活力浓度为1-10U/L、腺苷脱氨酶的活力浓度为0.02-0.2U/μL。
优选的是，2’-O-甲基转移酶活性检测方法，配制已知不同浓度的S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准溶液母液，其中S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准溶液母液的浓度分别为0～10μM、12～25μM、35～45μM、55～65μM、75～85μM、95～105μM、115～125μM。
第二方面，本发明还提供了一种2’-O-甲基转移酶活性检测方法所用试剂盒，，包括：RNA加帽缓冲液、具有Cap0帽子结构的RNA、S-腺苷-L-甲硫氨酸、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶、腺苷脱氨酶、2’-O-甲基转移酶、S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准溶液、含有硫醇特异性荧光分子探针的荧光反应液。
第三方面，本发明还提供了一种所述的试剂盒在检测2’-O-甲基转移酶活性以及2’-O-甲基转移酶突变体筛选中的应用。
本发明的一种2’-O-甲基转移酶活性检测方法和方法，相对于现有技术具有以下有益效果：
1、本发明的2’-O-甲基转移酶活性检测方法，利用S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶、腺苷脱氨酶将生成的S-腺苷-L-同型半胱氨酸不可逆地转化为同型半胱氨酸；硫醇特异性荧光分子探针结合同型半胱氨酸后形成的化合物采用特异性结合硫醇基而发射荧光的分子探针来直接测定反应中产生的同型半胱氨酸含量，然后计算出相应的S-腺苷-L-同型半胱氨酸含量，以此测定2’-O-甲基转移酶活性；本发明的检测方法具有操作简便，检测快速，准确度高，可实现高通量、自动化检测，无放射性污染等突出优势；
2、本发明的2’-O-甲基转移酶活性检测方法所用的试剂盒，通过定量检测单位时间内甲基转移反应产物S-腺苷-L-同型半胱氨酸的生成量来测定2’-O-甲基转移酶的活性；本发明的试剂盒，通过定量比较2’-O-甲基转移酶野生型及突变体在单位时间内甲基转移反应产物S-腺苷-L-同型半胱氨酸的生成量来筛选出性能更优的突变体酶。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为2’-O-甲基转移酶参与RNA加帽反应示意图；
图2为本发明的2’-O-甲基转移酶检测方法示意图；
图3为本发明实施例1中测定得到的S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准曲线图；
图4为本发明实施例2中测定得到的2’-O-甲基转移酶标准曲线图；
图5为本发明实施例3中不同2’-O-甲基转移酶(2’-O-MTase)的突变体活性测试结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
本申请实施例提供了一种2’-O-甲基转移酶活性检测方法，包括以下步骤：
S1、在RNA加帽缓冲液中加入具有Cap0帽子结构的RNA、S-腺苷-L-甲硫氨酸、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶、腺苷脱氨酶以及含有2’-O-甲基转移酶的待测样品得到待测反应液，并发生酶催化反应；
S2、配制含有硫醇特异性荧光分子探针的荧光反应液，将荧光反应液加入至酶催化反应后的待测反应液中，利用荧光法测定酶催化反应中生成的S-腺苷-L-同型半胱氨酸浓度，进而测定2’-O-甲基转移酶的活性。
本申请的2’-O-甲基转移酶活性检测方法，包括在两个反应体系中进行的两步酶催化反应和一步荧光反应：(1)在保证以S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)为甲基供体且2’-O-甲基转移酶(2'-O-MTase)有生物学活性的RNA加帽缓冲液中，加入Cap0帽子结构的RNA(Cap0-RNA)、S-腺苷-L-甲硫氨酸、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶(SAH水解酶)、待测的含有2’-O-甲基转移酶的样品，通过两步酶催化反应产生含有硫醇基的产物同型半胱氨酸(Hcy-SH)；(2)在荧光反应体系中，硫醇特异性荧光分子探针(ThioGlo1)在溶液中基本不发射荧光，结合同型半胱氨酸(Hcy-SH)后形成的化合物在382～386nm激发光下发射强绿色荧光，以此检测甲基转移反应中产生的S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)浓度，进而确定RNA加帽反应中2’-O-甲基转移酶(2'-O-MTase)的活性。本发明的检测方法，可直接用于荧光检测同型半胱氨酸含量，避免了复杂的RNA纯化回收工作，极大地缩短了检测时间，通常在30min内即可完成整个检测过程，非常便捷。
进一步的，参考图2所示，S-腺苷-L-甲硫氨酸作为甲基供体、Cap0帽子结构的RNA(Cap0-RNA)为甲基受体；S-腺苷-L-甲硫氨酸、Cap0帽子结构的RNA在2’-O-甲基转移酶的作用下发生加帽反应，具体为：在2’-O-甲基转移酶的作用下降Cap0帽子结构的RNA的第一个核苷酸的2’-OH进一步甲基化形成Cap1帽子结构的RNA(Cap1-RNA)同时生成S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)；生成S-腺苷-L-同型半胱氨酸发生两步酶促化反应，具体的，S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶(SAH水解酶)、腺苷脱氨酶将生成的S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)不可逆地转化为同型半胱氨酸(单独S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶水解S-腺苷-L-同型半胱氨酸生成同型半胱氨酸和腺苷为可逆反应，腺苷脱氨酶将产物之一的腺苷进一步分解为肌苷(Inosine)和氨，确保了S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解反应的正向进行)；硫醇特异性荧光分子探针(ThioGlo1)结合同型半胱氨酸(Hcy-SH)后形成的化合物(Hcy-S-ThioGlo1)采用特异性结合硫醇基而发射荧光的分子探针来直接测定反应中产生的同型半胱氨酸含量，然后计算出相应的S-腺苷-L-同型半胱氨酸含量，以此测定2’-O-甲基转移酶活性。
具体的，Cap0帽子结构的RNA为m7GpppN、Cap1帽子结构的RNA为m7GpppmN。
在一些实施例中，2’-O-甲基转移酶活性检测方法，包括以下步骤：
S1、配制已知不同浓度的S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准溶液母液；
S2、在RNA加帽缓冲液中加入具有Cap0帽子结构的RNA、S-腺苷-L-甲硫氨酸、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶、腺苷脱氨酶以及不同浓度的S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准溶液母液得到标准反应液，于36～38℃下酶催化反应5～30min；
S3、将荧光反应液加入至酶催化反应后的标准反应液中，使用382～386nm激发光激发并读取511～515nm的发射光荧光值，以S-腺苷-L-同型半胱氨酸的检测浓度以及对应的荧光值作曲线得到S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准曲线；
S4、在RNA加帽缓冲液中加入具有Cap0帽子结构的RNA、S-腺苷-L-甲硫氨酸、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶、腺苷脱氨酶以及含有已知浓度2’-O-甲基转移酶的待测样品得到待测反应液，于36～38℃下酶催化反应5～30min；
S5、将荧光反应液加入至酶催化反应后的待测反应液中，使用382～386nm激发光激发并读取511～515nm的发射光荧光值，以读取的发射光荧光值以及S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准曲线计算得到反应中生成的S-腺苷-L-同型半胱氨酸浓度；
S6、根据已知浓度2’-O-甲基转移酶的待测样品在反应中生成的S-腺苷-L-同型半胱氨酸浓度，计算2’-O-甲基转移酶活性。
步骤S1具体为：将S-腺苷-L-同型半胱氨酸加入至荧光缓冲液中，即可配制得到已知不同浓度的S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准溶液母液。这里的荧光缓冲液与荧光反应液所用的荧光缓冲液相同。
步骤S2中向RNA加帽缓冲液中加入不同浓度的S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准溶液母液得到标准反应液，具体的，标准溶液母液中S-腺苷-L-同型半胱氨酸浓度为标准反应液中S-腺苷-L-同型半胱氨酸浓度的10倍。
具体的，步骤S3具体为：将含有硫醇特异性荧光分子探针的荧光反应液加入至96孔酶标板中，且每孔均加入等量的荧光反应液，例如体积为90～110μL，优选为100μL；然后向荧光反应液中分别加入相同体积的含有不同浓度的S-腺苷-L-同型半胱氨酸的酶催化反应后的标准反应液，例如标准反应液加入的体积为8～12μL，优选为10μL，混合均匀后，立即到酶标仪(检测的温度为24-30℃)上使用382～386nm激发光激发并读取511～515nm的发射光荧光值，每30s读取一次，连续读取5min，取平均值，得到平均荧光值(即荧光强度)；同时，测定空白对照组(即加入的标准反应液中S-腺苷-L-同型半胱氨酸浓度为0μM)的背景荧光值；将测试得到的含有不同浓度的S-腺苷-L-同型半胱氨酸的标准反应液的荧光值减去空白对照组的背景荧光值，作为反应荧光值；以已知浓度的S-腺苷-L-同型半胱氨酸的标准品反应液的反应荧光值作为纵坐标、以对应的S-腺苷-L-同型半胱氨酸浓度作为横坐标作曲线即得到S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准曲线。
步骤S5具体为：按照上述相同的方法，将含有硫醇特异性荧光分子探针的荧光反应液加入至96孔酶标板中，且每孔均加入等量的荧光反应液；然后向荧光反应液中分别加入相同体积的含有不同浓度的2’-O-甲基转移酶的酶催化反应后的待测反应液，混合均匀后，立即到酶标仪上使用382～386nm激发光激发并读取511～515nm的发射光荧光值，每30s读取一次，连续读取5min，取平均值，得到平均荧光值(即荧光强度)；同时，测定阴性对照组的背景荧光值；将测试得到的含有不同浓度的2’-O-甲基转移酶的待测反应液的荧光值减去阴性对照组的背景荧光值，作为反应荧光值；同时根据S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准曲线，依据反应荧光值计算得到待测反应液经过加帽反应生成的S-腺苷-L-同型半胱氨酸浓度。其中，阴性对照组具体为：向荧光反应液中分别加入待测反应液，且待测液中不加入2’-O-甲基转移酶而使用相同体积的荧光缓冲液代替。这里的荧光缓冲液与荧光反应液所用的荧光缓冲液相同。
在一些实施例中，RNA加帽缓冲液是含有浓度为4～6mM KCl、0.5～1.5mM MgCl2和0.5～1.5mM DTT(二硫苏糖醇)，pH为7.0～8.0的Tris缓冲液。
在一些实施例中，荧光反应液的配制方法为将硫醇特异性荧光分子探针加入至荧光缓冲液中；其中，硫醇特异性荧光分子探针的浓度为2～20μM，优选为5μM。
在一些实施例中，荧光缓冲液是盐离子浓度为20-200mM、pH为7.0-8.0的Tris或PB缓冲液。具体的，所用的盐包括KCl、MgCl2等。
在一些实施例中，荧光缓冲液为含有4～6mM KCl、0.5～1.5mM MgCl2、pH为7.0～8.0的Tris缓冲液。优选的，荧光缓冲液为含有5mM KCl、1mM MgCl2、pH为8.0的Tris缓冲液。
在一些实施例中，待测反应液中Cap0帽子结构的RNA的浓度为20-50μM，优选为20μM、S-腺苷-L-甲硫氨酸的浓度为50-100μM，优选为100μM、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶的活力浓度为1-10U/L，优选为5.7U/L、腺苷脱氨酶的活力浓度为0.02-0.2U/μL，优选为0.05U/μL。
在一些实施例中，在1～3μLRNA加帽缓冲液中加入11～15μL无核酸酶水稀释的具有Cap0帽子结构的RNA、1～3μLS-腺苷-L-甲硫氨酸、1～3μLS-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶、1～3μL腺苷脱氨酶以及1～3μL含有2’-O-甲基转移酶的待测样品，而标准反应液中使用相同体积不同浓度的S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准溶液代替待测样品，其他均相同。具体的，在1μLRNA加帽缓冲液中加入13μL无核酸酶水稀释的具有Cap0帽子结构的RNA、2μLS-腺苷-L-甲硫氨酸、1μLS-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶、1μL腺苷脱氨酶以及2μL含有2’-O-甲基转移酶的待测样品，总体积20μL；而标准反应液中使用2μL不同浓度的S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准溶液母液代替待测样品。
在一些实施例中，配制已知不同浓度的S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准溶液母液，其中S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准溶液母液的浓度分别为0～10μM、12～25μM、35～45μM、55～65μM、75～85μM、95～105μM、115～125μM。
具体的，S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准溶液母液的浓度可以根据使用情况确定，例如S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准溶液母液的浓度分别为0、20、40、60、80、100、120μM。
在一些实施例中，含有2’-O-甲基转移酶的样品来源于基因工程表达的产物。
基于同一发明构思，本申请实施例还提供了一种2’-O-甲基转移酶活性检测试剂盒，包括：RNA加帽缓冲液、具有Cap0帽子结构的RNA、S-腺苷-L-甲硫氨酸、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶、腺苷脱氨酶、2’-O-甲基转移酶、S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准溶液母液、含有硫醇特异性荧光分子探针的荧光反应液。
本申请的试剂盒中各原料均通过常规方法制备得到或者直接在市场上够买得到，本申请并未对各原料本身做改进。例如，Cap0帽子结构的RNA通过制备RNA并使用牛痘加帽酶进行加帽，再经纯化获得；S-腺苷-L-甲硫氨酸购买自武汉糖智药业有限公司，货号为SA-1001；S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶购买自北京阿匹斯生物技术有限公司，货号为AA0092A；腺苷脱氨酶购买自北京阿匹斯生物技术有限公司，货号为AA0001C；S-腺苷-L-同型半胱氨酸购买自阿拉丁试剂(上海)有限公司，货号为S139501；硫醇特异性荧光分子探针购买自上海麦克林生化科技有限公司，货号为M849030。
具体的，上述试剂盒的使用方法为：按照上述2’-O-甲基转移酶活性检测方法，首先利用上述原料配制待测反应液、利用上述原料配制标准反应液；利用酶催化反应后的标准反应液与含有硫醇特异性荧光分子探针的荧光反应液发生荧光反应，作出S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准曲线；利用酶催化反应后的待测反应液与含有硫醇特异性荧光分子探针的荧光反应液发生荧光反应，以及S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准曲线计算得到反应中生成的S-腺苷-L-同型半胱氨酸浓度，进而计算2’-O-甲基转移酶活性。
该试剂盒可用于2’-O-甲基转移酶活性的快速测定以及2’-O-甲基转移酶突变体的筛选。该试剂盒通过定量检测单位时间内甲基转移反应产物S-腺苷-L-同型半胱氨酸的生成量来测定2’-O-甲基转移酶的活性；按照试剂盒的使用方法，通过定量比较2’-O-甲基转移酶野生型及突变体在单位时间内甲基转移反应产物S-腺苷-L-同型半胱氨酸的生成量来筛选出性能更优的突变体酶。
以下进一步以具体实施例说明本申请的2’-O-甲基转移酶活性检测方法，以下实施例所采用的的设备及其型号为：Bio Tek Synergy H1多功能酶标仪；实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂和方法为本领域常规试剂和方法。
实施例1
本实施例提供了S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准曲线测定方法，包括以下步骤：
S1、将S-腺苷-L-同型半胱氨酸加入至荧光缓冲液中分别配制浓度为0、20、40、60、80、100、120μM的S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准溶液母液；
S2、在1μLRNA加帽缓冲液中加入13μL无核酸酶水稀释的具有Cap0帽子结构的RNA、2μLS-腺苷-L-甲硫氨酸、1μLS-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶、1μL腺苷脱氨酶以及步骤S1中2μL不同浓度的S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准溶液母液得到标准反应液，并于37℃下酶催化反应10min；
S3、按照每100μL荧光反应液中加入10μL酶催化反应后的标准反应液，混合均匀后，使用384nm激发光激发并读取513nm的发射光荧光值，每个标准反应液做两组平行实验，并取平均荧光值；
其中，RNA加帽缓冲液为含5mM KCl、1mM MgCl2和1mM DTT，pH为8.0的Tris缓冲液；标准反应液中Cap0帽子结构的RNA浓度为20μM、S-腺苷-L-甲硫氨酸浓度为100μM、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶的活力浓度为5.7U/L、腺苷脱氨酶的活力浓度为0.05U/μL；
荧光反应液的配制方法为将硫醇特异性荧光分子探针加入至荧光缓冲液中；其中，硫醇特异性荧光分子探针的浓度为5μM；
荧光缓冲液为含有5mM KCl、1mM MgCl2、pH为8.0的Tris缓冲液；
利用上述测试得到的含有不同浓度的S-腺苷-L-同型半胱氨酸的标准反应液的荧光值减去空白对照组(即标准反应液中S-腺苷-L-同型半胱氨酸浓度为0μM)的背景荧光值，作为反应荧光值；以已知浓度的S-腺苷-L-同型半胱氨酸的标准品反应液的反应荧光值作为纵坐标、以对应的S-腺苷-L-同型半胱氨酸浓度作为横坐标作曲线，结果如图3所示。
其中，图3中SAH浓度指的是，标准反应液中S-腺苷-L-同型半胱氨酸的浓度，可以理解的是，将2μL不同浓度的S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准溶液母液加入至加冒体系后总体积变成20μL，相当于稀释了10倍，因此，标准反应液中S-腺苷-L-同型半胱氨酸的检测浓度为分别为0、2、4、6、8、10、12μM；图2中荧光强度即为反应荧光值。
图3中S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准曲线R2>0.999，表明在S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准浓度在2-12μM范围内，荧光强度与S-腺苷-L-同型半胱氨酸浓度具有极好的线性相关性。
实施例2
本实施例提供了2’-O-甲基转移酶标准曲线测定方法，包括以下步骤：
S1、将2’-O-甲基转移酶加入至荧光缓冲液中分别配制浓度为50、100、200、300、400、500ng/μL的2’-O-甲基转移酶标准溶液母液；
S2、在1μLRNA加帽缓冲液中加入13μL无核酸酶水稀释的具有Cap0帽子结构的RNA、2μLS-腺苷-L-甲硫氨酸、1μLS-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶、1μL腺苷脱氨酶以及2μL不同浓度的2’-O-甲基转移酶标准溶液母液得到待测反应液，并于37℃下酶催化反应10min；其中待测反应液中2’-O-甲基转移酶的浓度分别是5、10、20、30、40、50ng/μL；
S3、按照每100μL荧光反应液中加入10μL酶催化反应后的待测反应液，混合均匀后，使用384nm激发光激发并读取513nm的发射光荧光值，每个标准反应液做两组平行实验，并取平均荧光值；
其中，RNA加帽缓冲液为含5mM KCl、1mM MgCl2和1mM DTT，pH为8.0的Tris缓冲液；待测反应液中Cap0帽子结构的RNA浓度为20μM、S-腺苷-L-甲硫氨酸浓度为100μM、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶的活力浓度为5.7U/L、腺苷脱氨酶的活力浓度为0.05U/μL；
荧光反应液的配制方法为将硫醇特异性荧光分子探针加入至荧光缓冲液中；其中，硫醇特异性荧光分子探针的浓度为5μM；
荧光缓冲液为含有5mM KCl、1mM MgCl2、pH为8.0的Tris缓冲液；
利用上述测试得到的含有不同浓度的2’-O-甲基转移酶的待测反应液的荧光值减去阴性对照组(阴性对照组具体为：步骤S2中不加入2μL不同浓度的2’-O-甲基转移酶标准溶液母液，而加入2μL的荧光缓冲液替代，其余均与步骤S2～S3相同)的背景荧光值，作为反应荧光值；同时根据S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准曲线，依据反应荧光值计算得到待测反应液经过加帽反应生成的S-腺苷-L-同型半胱氨酸浓度；以计算得到的S-腺苷-L-同型半胱氨酸浓度为纵坐标、以待测反应液中2’-O-甲基转移酶的浓度为横坐标作曲线，即为2’-O-甲基转移酶标准曲线，结果如图4所示。
图4中2’-O-甲基转移酶标准曲线R2>0.999，表明待测反应液中2’-O-甲基转移酶的浓度在5-50ng/μL范围内，可准确测定中2’-O-甲基转移酶在反应10min时的甲基转移反应产物S-腺苷-L-同型半胱氨酸的浓度。
实施例3
2’-O-甲基转移酶(2’-O-MTase)的突变体活性测定
根据文献(Züst et al.,PLoS Pathogens,2013；Zeng et al.,Journal ofVirology,2016；Hou et al.,Journal of Virology,2019)报道及基因数据库(NCBI；Advanced Consensus Maker)分析，构建并纯化表达了10种2’-O-MTase突变体(Mut1-Mut10)，与2’-O-MTase野生型(WT)一同比较活性。按照试剂盒的使用方法，配制含有不同2’-O-MTase突变体的待测反应液，且待测反应液中各组2’-O-MTase的终浓度均为20ng/μL。按照实施例1中的方法，测定S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准曲线。按照实施例2中的方法，测试得到的含有不同2’-O-MTase突变体的待测反应液的荧光值减去阴性对照组的背景荧光值，作为反应荧光值；同时根据S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准曲线，依据反应荧光值计算得到待测反应液经过加帽反应生成的S-腺苷-L-同型半胱氨酸浓度；结果如图5所示。
从图5中可以看出，与2’-O-MTase野生型(WT)相比，Mut3、Mut6和Mut7的活性都有提高，尤其是Mut3和Mut7，活性提高60％以上，具有广阔的开发和应用前景。
上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种2’-O-甲基转移酶活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
在RNA加帽缓冲液中加入具有Cap0帽子结构的RNA、S-腺苷-L-甲硫氨酸、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶、腺苷脱氨酶以及含有2’-O-甲基转移酶的待测样品，得到待测反应液，并发生酶催化反应；
配制含有硫醇特异性荧光分子探针的荧光反应液，将荧光反应液加入至酶催化反应后的待测反应液中，利用荧光法测定酶催化反应中生成的S-腺苷-L-同型半胱氨酸浓度，进而测定2’-O-甲基转移酶的活性。
2.如权利要求1所述的2’-O-甲基转移酶活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
配制已知不同浓度的S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准溶液母液；
在RNA加帽缓冲液中加入具有Cap0帽子结构的RNA、S-腺苷-L-甲硫氨酸、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶、腺苷脱氨酶以及已知不同浓度的S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准溶液母液得到标准反应液，于36～38℃下酶催化反应5～30min；
将荧光反应液加入至酶催化反应后的标准反应液中，使用382～386nm激发光激发并读取511～515nm的发射光荧光值，以S-腺苷-L-同型半胱氨酸浓度以及对应的荧光值作曲线得到S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准曲线；
在RNA加帽缓冲液中加入具有Cap0帽子结构的RNA、S-腺苷-L-甲硫氨酸、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶、腺苷脱氨酶以及含有已知浓度2’-O-甲基转移酶的待测样品得到待测反应液，于36～38℃下酶催化反应5～30min；
将荧光反应液加入至酶催化反应后的待测反应液中，使用382～386nm激发光激发并读取511～515nm的发射光荧光值，以读取的发射光荧光值以及S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准曲线计算得到反应中生成的S-腺苷-L-同型半胱氨酸浓度；
根据已知浓度2’-O-甲基转移酶的待测样品在反应中生成的S-腺苷-L-同型半胱氨酸浓度，计算2’-O-甲基转移酶活性。
3.如权利要求1所述的2’-O-甲基转移酶活性检测方法，其特征在于，所述RNA加帽缓冲液是含有浓度为4～6mM KCl、0.5～1.5mM MgCl2和0.5～1.5mM DTT，pH为7.0～8.0的Tris缓冲液。
4.如权利要求1所述的2’-O-甲基转移酶活性检测方法，其特征在于，所述荧光反应液的配制方法为将硫醇特异性荧光分子探针加入至荧光缓冲液中；其中，硫醇特异性荧光分子探针的浓度为2～20μM。
5.如权利要求4所述的2’-O-甲基转移酶活性检测方法，其特征在于，所述荧光缓冲液是盐离子浓度为20-200mM、pH为7.0-8.0的Tris或PB缓冲液。
6.如权利要求5所述的2’-O-甲基转移酶活性检测方法，其特征在于，所述荧光缓冲液为含有4～6mM KCl、0.5～1.5mM MgCl2、pH为7.0～8.0的Tris缓冲液。
7.如权利要求1所述的2’-O-甲基转移酶活性检测方法，其特征在于，待测反应液中Cap0帽子结构的RNA的浓度为20-50μM、S-腺苷-L-甲硫氨酸的浓度为50-100μM、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶的活力浓度为1-10U/L、腺苷脱氨酶的活力浓度为0.02-0.2U/μL。
8.如权利要求2所述的2’-O-甲基转移酶活性检测方法，其特征在于，配制已知不同浓度的S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准溶液母液，其中S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准溶液母液的浓度分别为0～10μM、12～25μM、35～45μM、55～65μM、75～85μM、95～105μM、115～125μM。
9.一种如权利要求1～8任一所述的2’-O-甲基转移酶活性检测方法所用的试剂盒，其特征在于，包括：RNA加帽缓冲液、具有Cap0帽子结构的RNA、S-腺苷-L-甲硫氨酸、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶、腺苷脱氨酶、2’-O-甲基转移酶、S-腺苷-L-同型半胱氨酸标准溶液母液、含有硫醇特异性荧光分子探针的荧光反应液。
10.如权利要求9所述的试剂盒在检测2’-O-甲基转移酶活性以及2’-O-甲基转移酶突变体筛选中的应用。
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