CN1275980C

CN1275980C - 来源于微生物的转谷氨酰胺酶的修饰方法

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Publication number: CN1275980C
Application number: CNB018175139A
Authority: CN
Inventors: 柏木立己; 榛叶信久; 石川弘纪; 铃木荣一郎; 平山和雄; 横山敬一
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2000-08-17
Filing date: 2001-08-15
Publication date: 2006-09-20
Anticipated expiration: 2021-08-15
Also published as: KR100575394B1; EP1310560A1; CA2419453C; WO2002014518A1; AU2001278739A1; US20060275872A1; CA2419453A1; EP1310560A4; RU2260051C2; US20040002144A1; CN1469929A; US7553650B2; BR0113304A; KR20030027037A

Abstract

本发明涉及以来源于茂原链轮丝菌(Streptoverticilliummobaraense)的转谷氨酰胺酶(MTG)的立体结构为基础，设计、制作变异型MTG的方法，以及制作的变异型MTG。按照本发明，可以提供以立体结构为基础改变MTG的方法，以及据此改良了对基质的反应性的转谷氨酰胺酶。在本发明的方法中，以对MTG的晶体进行X射线晶体结构解析得到的立体结构为基础，推测MTG与基质的结合部位，通过位于转谷氨酰胺酶的基质结合部位的氨基酸残基的置换、插入、缺失来设计、制作变异型转谷氨酰胺酶。

Description

来源于微生物的转谷氨酰胺酶的修饰方法

发明背景

本发明涉及以采用X射线晶体结构解析技术确定的来源于茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)的转谷氨酰胺酶(以下简称为MTG)的立体结构为基础，设计、制作变异型MTG的方法，以及制作的变异型MTG。MTG通过使蛋白质之间形成交联键，生成凝胶状物质，因此广泛用于食品加工等领域。提高了转谷氨酰胺酶活性和热稳定性的变异型MTG有助于减少必要量，改变了基质特异性和最适pH的变异型MTG有可能将该酶适用于新的领域。

转谷氨酰胺酶是催化蛋白质的肽链内具有的γ-羧基酰胺基的酰基转移反应的酶。如果使该酶对蛋白质作用，则发生形成ε-(γ-Glu)-Lys交联的反应、Gln由于脱酰胺化转变成Glu的取代反应。

转谷氨酰胺酶迄今为止已知来源于动物的转谷氨酰胺酶和来源于微生物的转谷氨酰胺酶。前者是Ca²⁺依赖性的酶，分布在动物的脏器、皮肤、血液等中。例如，土拨鼠肝脏转谷氨酰胺酶〔K.Ikura等，生物化学(K.Ikura et al Biochemistry)，第27卷，第2898页(1988)〕、人表皮角蛋白细胞转谷氨酰胺酶〔M.A.Phillips等，Proc.Nat1.Acad.Sci.U.S.A，第87卷，第9333页(1990)〕、人血液凝固因子XIII〔A.Ichinose等，生物化学，第25卷，第6900页(1990)〕等。至于后者，由链轮丝菌属的细菌发现了Ca²⁺非依赖性的转谷氨酰胺酶。例如灰肉色链轮丝菌(Streptoverticillium griseocarneum)IFO12776、肉桂链轮丝菌肉桂亚种(Streptoverticillium cinnamoneumsub sp.cinnamoneum)IFO 12852、茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)IFO 13819等。其中，将由茂原链轮丝菌的变种(variant)的培养上清液发现的转谷氨酰胺酶称为MTG(Microbial Transglutaminase)。而且，由利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)NRRL B-3446也发现了Ca²⁺非依赖性的转谷氨酰胺酶(特表平10-504721号)。

MTG是由331个氨基酸构成的分子量约38000的单体蛋白质〔Journal of Biological Chemistry，第268卷，第11565页(1993)〕。也报道了由大肠杆菌(E.coli)、酵母等分泌表达的方法(特开平5-199883号)，或者在大肠杆菌中将MTG作为蛋白质包含体表达后，用蛋白质变性剂对该包含体进行增溶，经过脱变性剂处理使之再生，生产具有活性的MTG的方法(特开平6-30771号)。

与来源于动物的转谷氨酰胺酶不同，以MTG为首的来源于微生物的转谷氨酰胺酶是Ca²⁺非依赖性的，因此可以用于果冻等凝胶化食品、酸乳酪、干酪或凝胶状化妆品等的制造或者食用肉的肉质改善等(特开昭64-27471号)。另外，也用于制造对热稳定的微胶囊的材料、固定化酶的载体等，是工业实用性高的酶。

关于酶反应条件，例如在凝胶化食品的场合，如果酶反应时间短则不凝固，相反如果反应时间过长，则变得过硬，不能成为商品。因此，在果冻等凝胶化食品、酸乳酪、干酪或凝胶状化妆品等的制造中或者食用肉的肉质改善等中利用MTG时，通过调节基质以及酶的浓度、反应温度、反应时间，制作目的产物。但是，利用MTG的食品或试剂等覆盖很多方面，有时仅仅通过调节浓度、温度、时间等，不能制作所需的产品，从而产生了对MTG的酶活性进行改性的必要性。

为了对MTG的酶活性进行改性，有必要制作MTG的变异体，评价其活性、基质特异性等，探索出优良的变异体。制作变异体时，有必要操纵野生型的基因，因此能够制备基因重组型蛋白质成为了必要条件。MTG的场合，确立了使用大肠杆菌的大量表达体系(特开平6-30771号)。但是，用大肠杆菌大量表达的MTG作为不溶性的蛋白质包含体蓄积在菌体内。蛋白质包含体中变性的MTG必须在增溶后重折叠使之具有活性，因而制作一个变异型MTG必须要有2～3周的时间。因此，期望有一种方法，能够采用某种手段合理地修饰MTG，而不是对分子全体随机地引入变异。

发明公开

本发明的目的之一在于提供一种改良MTG的方法。

另外，本发明的另一目的在于提供改良了对基质的反应性的转谷氨酰胺酶。

本发明人为了解决上述课题进行了悉心研究，结果发现以立体结构为基础能够制作改良了对基质的反应性的转谷氨酰胺酶，从而完成了本发明。

概括来说，本发明可以例举如下。

(1)一种设计、制作变异型转谷氨酰胺酶的方法，以对MTG进行X射线晶体结构解析得到的立体结构为基础，推测MTG与基质的结合部位，通过位于转谷氨酰胺酶的基质结合部位的氨基酸残基的置换、插入、缺失来设计、制作变异型转谷氨酰胺酶。

(2)一种改变了基质特异性的变异型MTG，序列表中序列号2所示的MTG氨基酸序列的以下位置(活性残基Cys64至20以内，暴露于与酰基受体的推测结合部位表面的残基)：1-5、26、28、58-59、62、69、74-75、77、79、235-236、238-244、248-250、252-254、277-278、282-287、289、291、296-297、300-304中至少1个位置发生变化。

(3)一种改变了基质特异性的变异型转谷氨酰胺酶，该酶是具有转谷氨酰胺酶活性的酶，与MTG进行氨基酸序列对比时，与序列表中序列号2所示的MTG氨基酸序列的以下位置(活性残基Cys64至20以内，暴露于与酰基受体的推测结合部位表面的残基)：1-5、26、28、58-59、62、69、74-75、77、79、235-236、238-244、248-250、252-254、277-278、282-287、289、291、296-297、300-304相对应的至少1个位置发生变化。

(4)一种改变了基质特异性的变异型转谷氨酰胺酶，该酶是具有转谷氨酰胺酶活性的酶，采用Treading法与MTG的3维结构进行序列对比时，与序列表中序列号2所示的MTG氨基酸序列的以下位置(活性残基Cys64至20以内，暴露于与酰基受体的推测结合部位表面的残基)：1-5、26、28、58-59、62、69、74-75、77、79、235-236、238-244、248-250、252-254、277-278、282-287、289、291、296-297、300-304相对应的至少1个位置发生变化。

(5)一种改变了基质特异性的变异型MTG或变异型转谷氨酰胺酶，通过改变(2)～(4)中任意一项所述的氨基酸序列的位置上存在的酸性氨基酸残基或与该酸性氨基酸残基接近的氨基酸残基，缓和负电荷，从而改变基质特异性。

(6)一种基因，编码(2)项～(5)项中任意一项所述的变异型MTG或变异型转谷氨酰胺酶。

(7)一种重组DNA，包含(6)项所述的基因。

(8)一种微生物，具有(harboring)(7)项所述的重组DNA。

(9)一种制造变异型MTG或变异型转谷氨酰胺酶的方法，其特征在于培养(8)项所述的微生物，采集变异型MTG或变异型转谷氨酰胺酶。

(10)一种MTG的晶体，具有单斜晶系的空间群P21。

也就是说，本发明提供以MTG的立体结构为基础合理地设计、制作变异型MTG的方法，以及制作的变异型MTG。

附图说明

图1是用带状模型(ribbon model)表示MTG的晶体结构的图。

图2是按照与图1相同的方向表示MTG晶体结构的表面凸凹的图。

图3是表示MTG与来源于肉桂链轮丝菌的TG的氨基酸序列对比的图。

图4是表示MTG与来源于利迪链霉菌(Streptoverticilliumlydicus)的TG的氨基酸序列对比的图。

图5是表示S2Y·S2R·S2D变异体的部位特异性突变诱发法中使用的引物组的图。

图6是表示del 1-2、del 1-3变异体的部位特异性突变诱发法中使用的引物组的图。

图7是表示在¹⁵NH₄Cl存在下使野生型作用的卵白蛋白的1H-15NHSQC波谱的图。

图8是以在¹⁵NH₄C1存在下使野生型、Ser型、S2R、del 1-2、del 1-3作用的卵白蛋白的谷氨酰胺残基中图7记为a的信号的峰强度对反应时间作图而成的图。

图9是以在¹⁵NH₄Cl存在下使野生型和S2Y、S2R、S2D变异体作用的卵白蛋白的谷氨酰胺残基中图7记为a的信号的峰强度对反应时间作图而成的图。

图10是表示在¹⁵NH₄Cl存在下使野生型、Sg4、Sg7作用的卵白蛋白的¹H-¹⁵N HSQC波谱的图。

图11是表示MTG的原子坐标(1)的图。

图12是表示MTG的原子坐标(2)的图。

图13是表示MTG的原子坐标(3)的图。

图14是表示MTG的原子坐标(4)的图。

图15是表示MTG的原子坐标(5)的图。

图16是表示MTG的原子坐标(6)的图。

图17是表示MTG的原子坐标(7)的图。

图18是表示MTG的原子坐标(8)的图。

图19是表示MTG的原子坐标(9)的图。

图20是表示MTG的原子坐标(10)的图。

图21是表示MTG的原子坐标(11)的图。

图22是表示MTG的原子坐标(12)的图。

图23是表示MTG的原子坐标(13)的图。

图24是表示MTG的原子坐标(14)的图。

图25是表示MTG的原子坐标(15)的图。

图26是表示MTG的原子坐标(16)的图。

图27是表示MTG的原子坐标(17)的图。

图28是表示MTG的原子坐标(18)的图。

图29是表示MTG的原子坐标(19)的图。

图30是表示MTG的原子坐标(20)的图。

图31是表示MTG的原子坐标(21)的图。

图32是表示MTG的原子坐标(22)的图。

图33是表示MTG的原子坐标(23)的图。

图34是表示MTG的原子坐标(24)的图。

图35是表示MTG的原子坐标(25)的图。

图36是表示MTG的原子坐标(26)的图。

图37是表示MTG的原子坐标(27)的图。

图38是表示MTG的原子坐标(28)的图。

图39是表示MTG的原子坐标(29)的图。

图40是表示MTG的原子坐标(30)的图。

图41是表示MTG的原子坐标(31)的图。

图42是表示MTG的原子坐标(32)的图。

图43是表示MTG的原子坐标(33)的图。

图44是表示MTG的原子坐标(34)的图。

图45是表示MTG的原子坐标(35)的图。

图46是表示MTG的原子坐标(36)的图。

图47是表示MTG的原子坐标(37)的图。

图48是表示MTG的原子坐标(38)的图。

图49是表示MTG的原子坐标(39)的图。

图50是表示MTG的原子坐标(40)的图。

图51是表示MTG的原子坐标(41)的图。

图52是表示MTG的原子坐标(42)的图。

图53是表示MTG的原子坐标(43)的图。

图54是表示MTG的原子坐标(44)的图。

图55是表示MTG的原子坐标(45)的图。

图56是表示MTG的原子坐标(46)的图。

图57是表示MTG的原子坐标(47)的图。

图58是表示MTG的原子坐标(48)的图。

图59是表示MTG的原子坐标(49)的图。

图60是表示MTG的原子坐标(50)的图。

发明的最佳实施方式

以下，具体说明本发明。

转谷氨酰胺酶广泛用于明胶、干酪、酸乳酪、豆腐、鱼糕、火腿、香肠、面条等食品的制造或食用肉的肉质改善等(特开昭64-27471号)。另外，该酶也用于产业上的各种目的，例如用于制造对热稳定的微胶囊材料、固定化酶的载体等。转谷氨酰胺酶催化蛋白质分子的肽链内具有的谷氨酰胺残基的γ-羧基酰胺基的酰基转移反应。蛋白质分子中的赖氨酸残基的ε-氨基作为酰基受体发挥作用，在蛋白质分子中和分子间形成ε-(γ-Glu)-Lys键。

按照本发明人的发现，转谷氨酰胺酶并不是对所有谷氨酰胺残基反应，反应的难易程度，即反应性根据谷氨酰胺残基周围的残基的种类和位置而不同。因此，如果能够改变在特定环境下的对谷氨酰胺残基的反应性，则能够改变凝胶化速度，从而使转谷氨酰胺酶的用途更为广泛。

在本发明中，为了改变MTG的基质特异性，通过X射线晶体结构解析确定立体结构，预测与基质的结合方式，设计、引入符合目的的变异。这里所说的基质特异性是指与酰基受体中的各个谷氨酰胺残基的反应性。

通过X射线晶体结构解析确定蛋白质立体结构时，按照下述步骤进行。

(1)使蛋白质结晶。使蛋白质结晶是确定立体结构所不可缺少的，除此以外，作为蛋白质的高纯度纯化法、密度高且蛋白酶抗性强的稳定的保存法也具有产业上的实用性。

(2)对制作的晶体照射X射线收集衍射数据。另外，多数情况下蛋白质晶体通过照射X射线受到破坏，衍射能力劣化。这时迅速将晶体冷却至-173℃，在该状态下收集衍射数据的低温测定技术最近逐步普及。最后，为了收集用于确定结构的高分解能数据，利用亮度高的同步辐射光。

(3)进行晶体结构解析时，除衍射数据以外，相位信息也是必要的。MTG由于类似蛋白质的晶体结构是未知的，所以不可能采用分子置换法确定结构。因此，必须采用重原子同晶置换法解决相位问题。重原子同晶置换法是在晶体中引入汞或铂等原子序号大的金属原子，利用金属原子的较大的X射线散射能力对X射线衍射数据的影响，获得相位信息的方法。确定的相位能够通过使晶体中的溶剂区域的电子密度平滑得以改善。溶剂区域的水分子由于波动较大，几乎不能观测电子密度，因此通过使该区域的电子密度近似为0，可以趋近于真的电子密度，进而改善相位。另外，非对称单位含有多数分子时，通过使这些分子的电子密度平均，可以进一步大幅度改善相位。使蛋白质模型与利用这样改善的相位计算出的电子密度图相适合。该过程在计算机制图的基础上，使用MSI社(美国)的QUANTA等程序进行。之后，使用MSI社的X-PLOR等程序，进行结构精密化，完成结构解析。

本发明人等对于由茂原链轮丝菌纯化得到的天然型MTG以及在N末端添加了来源于起始密码子的Met的重组MTG(Met型)进行了结晶化，但是没能得到适于解析的晶体。但是，与Met型MTG相比，天然型MTG能够得到良好的晶体，因此认为除去N末端的Met与天然型同样由Asp1开始的重组MTG(Asp型MTG)有可能得到胜任解析的晶体，并进行了Asp型MTG的制备(实施例1)。结果，Asp型MTG能够得到良好的晶体(实施例2)，并成功地获得了立体结构(实施例3)。另外，MTG立体结构的原子坐标如图11～图60所示。

认为转谷氨酰胺酶的反应机理如下所述。首先，含有Gln的酰基供体与转谷氨酰胺酶反应，形成反应中间体，接着含有Lys的酰基受体对其进行攻击，在酰基供体和酰基受体之间形成ε-(γ-Glu)-Lys键。蛋白质成为酰基供体时，仅存在Gln是不够的，G1n周围的区域必须能够与MTG的基质结合部位很好得结合。相反，能够成为酰基受体时，如果含有伯胺，几乎所有的场合都足够了。因此，改变MTG的基质特异性也就是改变与酰基供体的结合部位的结构。如果能够改变MTG使MTG的基质特异性降低，即能够接受更多的酰基供体，则以更少的量就能够使蛋白质连接的情况增多，可以期待用量的减少。另外，如果现在不能交联的蛋白质能够连接，则MTG能够适用于新的领域。为了推测MTG与酰基供体的结合方式，MTG的立体结构是不可缺少的。

本发明解析出的MTG分子呈65×59×41的圆盘状(图1、图2)。也就是说，图1是用带状模型表示MTG的晶体结构的图。α-螺旋和β-片层分别用螺旋和箭头表示。另外，活性残基的Cys⁶⁴用圆点和条线模型(boll and stick model)表示(中央上部)。

另外，图2是按照与图1相同的方向表示MTG晶体结构的表面凸凹的图。具有电荷的区域表示得浓，不具有电荷的区域表示得淡。从上面看圆盘，具有楔状的凹口。活性残基Cys⁶⁴位于凹口的里面。由于Asp²⁵⁵与活性残基Cys⁶⁴相邻，提示被Asp²⁵⁵夺走了氢的Cys⁶⁴的SH基引起反应。另外，Cys⁶⁴的侧链朝向溶液侧，能够接近酰基供体和酰基受体。Ca²⁺依赖性的人凝血因子XIII中，活性残基Cys不露出到溶剂中，为了与酰基供体结合，人凝血因子XIII有必要发生大的结构变化，使活性残基与酰基供体结合。另一方面，认为MTG即使不发生结构变化也可能与酰基供体结合。因此，推测MTG与人凝血因子XIII相比，能够以更多的Gln残基作为基质。另外，对于MTG，由于没有必要考虑与酰基供体结合所伴有的结构变化，因而存在下述优点，即易于设计以进一步降低基质特异性为目标的变异体。而且，在分子量方面，人凝血因子XIII为166000，而MTG较小，为38000，易于确定与酰基供体的结合部位。如果观察MTG的结构，可以得知基质与连通溶剂与Cys⁶⁴的楔形凹处结合的可能性高。

在连通活性残基Cys⁶⁴的凹处配置有多数疏水性氨基酸残基或芳香族氨基酸残基，认为与酰基供体的疏水性残基或芳香族残基之间的相互作用是决定基质特异性的一个关键。另外，Asp等极性残基也散布在凹处的表面，认为在识别酰基供体时发挥重要的作用。通过位于假定是酰基供体结合部位的凹处的氨基酸残基的置换、插入或缺失，优选极性残基(Asp，Glu，Lys，Arg)或芳香族残基(Phe，Tyr，Trp)置换成其它氨基酸、置换成极性残基或芳香族残基、缺失极性残基或芳香族残基、插入极性残基或芳香族残基，能够得到改变了基质特异性的变异型转谷氨酰胺酶。但是，由于预测如果改变对于活性发挥重要作用的Cys⁶⁴和Asp²⁵⁵则会丧失活性，因此在制作变异体时有必要将其除外。

如下述实施例所述，在基质蛋白质的反应部位附近存在酸性氨基酸。另外，还认为MTG反应的谷氨酰胺残基大多位于基质蛋白质的表面，其周围易于存在容易露出到溶剂中的酸性氨基酸。这时，如果MTG的基质蛋白质相互作用部位存在酸性残基，则MTG与基质蛋白质的负电荷之间相互排斥，导致酶反应速度降低。因此，通过改变在假定酰基供体结合的MTG中含有Cys⁶⁴的凹处表面露出的酸性氨基酸残基，消除负电荷，或者使在序列上或空间上接近该酸性氨基酸的氨基酸残基成为碱性氨基酸，缓和负电荷，能够得到改变了基质特异性的转谷氨酰胺酶。作为酸性氨基酸，相当于序列号2所示的MTG的残基序号1、3、4、28、58、249、300、304的残基。

另外，接近酸性氨基酸的氨基酸是指距离酸性氨基酸即天冬氨酸或谷氨酸的羧基5以内存在的氨基酸残基，优选如下所述溶剂露出度为10％以上的残基。相当于序列号2所示的MTG的残基序号2、5、59、248-250、252、278、283-285、289、291、296-297、302-303的残基。

MTG的氨基酸序列如序列表中序列号2所示，编码MTG的基因的碱基序列如序列号1所示。

如实施例5所示，确认通过Asp¹或Asp³的缺失或者Ser2的置换，可以提高对蛋白质分子中特定谷氨酰胺残基的反应速度。从活性残基的Cys⁶⁴至N末端的Asp¹的距离为20，如果改变距离Cys⁶⁴20以内的氨基酸残基，则有可能改变基质特异性。另外，由于确认了至少环(loop)区域(233～253、276～288)规定基质特异性，因而认为如果改变该部位则能够改变基质特异性。特别是，如果改变在假定酰基供体结合的含有Cys⁶⁴的凹处表面露出的残基，则改变基质特异性的可能性提高。关于氨基酸残基是否露出到溶剂中，如果利用QUANTA等程序计算溶剂露出度(Solyent Accessibility)，则可以得知。另外，溶剂露出度是蛋白质中某一残基向溶剂中露出的面积除以其氨基酸在游离状态下向溶剂中露出的面积得到的值，用百分率表示。MTG的场合，如果改变距离活性残基Cys⁶⁴为20以内，且溶剂露出度为10％以上的残基，则改变基质特异性的可能性高。相当于序列号2所示的MTG的残基序号1-5、26、28、58-59、62、69、74-75、77、79、235-236、238-244、248-250、252-254、277-278、282-287、289、291、296-297、300-304的残基。

在设计、制作变异型转谷氨酰胺酶时，可以采用部位特异性变异法改变编码转谷氨酰胺酶的基因中与位于上述基质结合部位的氨基酸残基相对应的密码子，将得到的基因整合到适当的载体中，然后导入宿主中，培养性状转化体。所需的变异型转谷氨酰胺酶可以由性状转化体的培养菌体回收，进行评价。

作为使DNA的目的部位发生所需变异的部位特异性变异法，除实施例所示使用PCR的方法〔Higuchi，R.，61，in PCR technology；Erlich，H.A.编，Stockton press(1989)；Carter，P.，Meth.InEnzymol，第154卷，第382页(1987)〕以外，还有使用噬菌体的方法〔Kramer，W.和Frits，H.J.，Meth.In Enzymol，第54卷，第350页(1987)；Kunkel，T.A.等，Meth.In Enzymol，第154卷，第367页(1987)〕等。另外，作为整合编码变异型转谷氨酰胺酶的基因的载体，只要在宿主中能够复制，并没有特别的限制。使用大肠杆菌作为宿主时，可以例举该细菌能够自主复制的质粒。例如可以使用pUC19、pET、pGEMEX等。

另外，作为优选的宿主，可以例举大肠杆菌株，除此以外，只要是构筑的重组DNA的复制起点和变异型转谷氨酰胺酶基因发挥功能，重组DNA能够复制且变异型转谷氨酰胺酶基因能够表达的细菌，均可以用作宿主。作为优选宿主的代表，利用T7系启动子时，为大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，此外的场合为大肠杆菌JM109。

作为将包含编码变异型转谷氨酰胺酶的基因的DNA片断与载体连接而成的重组DNA导入宿主的方法，没有特别的限定，可以按照常规的方法进行。使用大肠杆菌作为宿主时，可以采用氯化钙法〔J.Mol.Biol.，第53卷，第159页(1970)〕、Hanahan法〔J.Mol.Biol.，第166卷，第557页(1983)〕、SEM法〔Gene，第96卷，第23页(1990)〕、Chung等的方法〔Proceedings of the National Academyof Sciences of the USA，第86卷，第2172页(1989)〕等方法。

如上所述得到的导入了包含编码变异型转谷氨酰胺酶的基因的重组DNA的性状转化体可以通过在含有碳源、氮源、无机离子以及必要时含有有机营养源的适当培养基中培养，以高水平在菌体内表达MTG。由培养菌体提取变异型转谷氨酰胺酶时，培养后收集菌体，将菌体悬浮于缓冲液中，进行溶菌酶处理、冷冻融解、超声波破碎等处理，破坏菌体后，通过离心分离分成上清液和沉淀。

变异型转谷氨酰胺酶由于作为蛋白质包含体生产并作为沉淀而被分离，因此可以用变性剂等对其增溶后，除去变性剂，进行分离、纯化。作为对生产的蛋白质包含体增溶的变性剂，可以例举尿素(例如8M)、盐酸胍(例如6M)等。如果通过稀释等将这些变性剂的浓度降低，则作为具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质再生，作为用于稀释的溶液，有磷酸缓冲液和Tris缓冲液等。

另外，活性再生后，为了分离纯化活性型蛋白质，可以将公知的分离纯化方法适当组合进行。例如盐析、透析、超滤、凝胶过滤、离子交换色谱、亲和色谱、反相高效液相色谱等。

在本发明中，基质特异性是指作为基质的蛋白质分子中的各谷氨酰胺残基对转谷氨酰胺酶的反应性。改变转谷氨酰胺酶的基质特异性是指改变至少一个谷氨酰胺残基的反应性。如果使改变了基质特异性的变异型转谷氨酰胺酶对蛋白质作用，与使原来的转谷氨酰胺酶作用时相比，蛋白质的交联度，即凝胶化程度也发生改变。

比较转谷氨酰胺酶的基质特异性时，可以采用测定酪蛋白的凝胶化时间的方法、通过电泳解析转谷氨酰胺酶反应产生的交联聚合物的方法、将反应物片断化后进行分析的方法等。另外，使用转谷氨酰胺酶，使¹⁵N标记铵离子对基质蛋白质反应，通过NMR也能够检测出标记的谷氨酰胺残基(特愿2000-141152)。

后者的基质特异性解析是通过转谷氨酰胺酶使作为基质的谷氨酰胺残基的羧基酰胺氮被¹⁵N标记，利用这一点，比较蛋白质中各谷氨酰胺残基的反应性的方法。作为转谷氨酰胺酶的基质的谷氨酰胺残基特异性地被¹⁵N标记，且根据转谷氨酰胺酶对谷氨酰胺残基的反应性标记速度不同，利用这一点可以比较各种转谷氨酰胺酶的基质特异性。

转谷氨酰胺酶的活性单位如下所述进行测定和定义。也就是说，以苯甲氧基羰基-L-谷氨酰胺基甘氨酸和羟胺作为基质进行反应，在三氯醋酸存在下将生成的异羟肟酸转变成铁络合物后，通过525nm处的吸光度测定其量。据此由异羟肟酸的量制作标准曲线，将1分钟生成1μ摩尔异羟肟酸盐的酶量定义为转谷氨酰胺酶的活性单位1单位。该测定方法的详细内容如现有的报道所述(例如参照特开昭64-27471号公报等)。

另外，除来源于茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶(MTG)以外，确认氨基酸序列与该酶具有同源性且具有转谷氨酰胺酶活性的酶、或者预测具有与该酶类似的立体结构且具有转谷氨酰胺酶活性的酶也能够以MTG的立体结构为基础进行修饰。在MTG中对于改变基质特异性等有效的氨基酸取代在肉桂链轮丝菌和利迪链霉菌(特表平10-504721号公报)等的类似酶中也有效。来源于肉桂链轮丝菌的转谷氨酰胺酶的氨基酸序列如序列表中序列号6所示，编码该氨基酸序列的基因的碱基序列如序列号5所示，来源于利迪链霉菌的转谷氨酰胺酶的氨基酸序列如序列表中序列号8所示，编码该氨基酸序列的基因的碱基序列如序列号7所示。另外，MTG与来源于肉桂链轮丝菌的转谷氨酰胺酶的氨基酸序列的同源性为78％(图3)、MTG与来源于利迪链霉菌的转谷氨酰胺酶的氨基酸序列的同源性为79％(图4)。也就是说，图3是表示MTG与来源于肉桂链轮丝菌的转谷氨酰胺酶的氨基酸序列对比的图。保留的氨基酸残基用*表示。另外，图4是表示MTG与来源于利迪链霉菌的转谷氨酰胺酶的氨基酸序列对比的图。保留的氨基酸残基用*表示。

关于两种不同蛋白质的氨基酸残基的对应排布(coordinateassignment)，如果两者的氨基酸序列的同源性为20％以上，可以通过氨基酸序列之间的对比(Sequence Alignment)判断出，如果同源性为20％以下，可以通过3维结构和氨基酸序列的对比(Threading)判断出。前者可以通过BLAST等程序进行，后者可以通过INSIGHT II等程序进行。BLAST可以通过使用ftp，由ncbi.nlm.nih.gov得到存在于/blast/executable的文件中适合所使用的计算机的文件。关于操作方法，详细记载于http：//genome.nhgri.nih.gov/blastall/blast_install中。INSIGHT II可以由MSI社购入。

改变了基质特异性的变异型转谷氨酰胺酶可以用于制造果冻等凝胶化食品、酸乳酪、干酪或凝胶状化妆品等，改善食用肉的肉质，制造对热稳定的微胶囊材料、固定化酶的载体等，除此以外还可以用于蛋白质的酶标记。如果对蛋白质进行¹⁵N标记，则能够用于利用NMR的结构解析等(特愿2000-141151)，如果用伯胺进行标记，则能够改善溶解性和稳定性(特愿2000-141152)。作为适于用作转谷氨酰胺酶的基质的蛋白质，可以广泛例举肌动蛋白、肌球蛋白等肌肉构成成分；白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子等人血浆成分；蛋白酶、转移酶等酶；生长激素、红细胞生成素等激素；细胞增殖、抑制等的细胞增殖因子；细胞分化、诱导、刺激等的免疫反应调节因子；单核因子、细胞因子、淋巴因子等细胞产生生物学活性蛋白质等。这些蛋白质不论其来源均可以使用，可以是来源于动物的蛋白质，也可以是来源于植物的蛋白质，还可以是来源于微生物的蛋白质。另外，也可以是将这些蛋白质的基因整合到大肠杆菌、酵母、动物细胞等中使之表达得到的蛋白质，或者利用无细胞蛋白质合成系统使之表达得到的蛋白质。

在转谷氨酰胺酶存在下使这些蛋白质反应的方法是在所需的转谷氨酰胺酶的作用条件下进行，例如在水性溶剂中，在约pH5.0～约pH9.0的范围，优选约pH6.0～约pH8.0的范围，温度约4℃～约55℃的范围，更优选约25℃～约40℃的范围，保持基质蛋白质和转谷氨酰胺酶。在该反应中，基质蛋白质的浓度优选1μM～1M的范围，另外转谷氨酰胺酶的用量优选约10nM～约100μM的范围，相当于每1mmol蛋白质为约0.01～约20单位。另外，并不限于上述反应条件。

除基质特异性以外，如果改变热稳定性和最适pH等，则能够扩展MTG的产业利用范围。如果提高热稳定性，则能够在更高的温度下进行蛋白质的凝胶化。在超市经常可以见到的填充豆腐的场合，在豆乳中加入MTG后，在密闭于包装中的状态下进行加热，因此温度容易上升，导致比较简单地达到MTG变性的温度。如果能够提高热稳定性，则能够减少由于变性而失活的蛋白质量，进而降低成本。热稳定性的提高可以通过引入脯氨酸残基、将采取逆时针螺旋结构的残基置换为甘氨酸残基〔Protein Engng.，第6卷，第85-91页(1993)〕、充填蛋白质内部的空隙〔Biochemistry，第32卷，第6171-6178页(1993)〕等实现。而且，如果能够使最适pH靠碱性侧，则能够提高反应条件为碱性的物质的凝胶化效率，例如使谷蛋白连接制造的面条。最适pH的改变可以通过改变活性残基的pKa〔ProteinEngineering.，第11卷，第383-388页(1998)〕实现。

实施例

以下结合实施例更具体地说明本发明，但是本发明并不受这些实施例的限定。

实施例1.重组天然型(Asp型)MTG的制备

为了使大肠杆菌生产具有与天然型相同的N末端氨基酸序列的重组MTG，构筑以下所述的MTG表达质粒pETMTGXa-01。pETMTGXa-01是能够表达在T7 gene 10蛋白质的氨基末端侧区域和MTG之间具有因子Xa的识别序列(IEGR)的融合蛋白的质粒。以下叙述pETMTGXa-01的构筑方法。首先，合成在MTG基因的上游具有编码BamHI切断部位、FactorXa识别部位的序列的引物pGEXMTGF01(序列表中序列号9)和具有SacI切断部位的引物pGEXMTGR01(序列表中序列号10)。使用这些引物，以MTG表达质粒pUCTRPMTG-02(+)(特开平11-75876号公报记载)的MTG基因作为模板进行PCR，将扩增的片断在pGEM-TEasy Vector(Promega公司)中克隆。PCR在96℃下30秒、50℃下15秒、60℃下1分钟的条件下进行25个循环。扩增片断的克隆按照使用说明书记载的方法进行，选择扩增片断与lacZ基因反向插入的无性系。解析保持该无性系的质粒的碱基序列，将具有目的正确的序列的质粒命名为pGEMMTGXa。接着，用EcoRI将pET5a(宝酒造株式会社)载体切断，使末端平滑后，用BamHI切断。用SalI将pGEMMTGXa切断，使末端平滑后，用BamHI切断，将得到的含有MTG基因的片断在进行了上述酶消化后的pET5a中亚克隆，构筑pETMTGXa-01。

将导入了pETMTGXa-01的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Promega公司)接种到含有200μg/ml氨苄青霉素的L培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取液5g/L、NaCl 15g/L、葡萄糖1g/L，pH7.2)50ml中，在37℃下预培养6小时。将预培养物8ml继续植入含有200μg/ml氨苄青霉素的M9水解酪蛋白氨基酸培养基(水解酪蛋白氨基酸8g/L、氯化铵5g/L、酵母提取液0.2g/L、维生素B1盐酸盐2mg/L、氯化钙2水合物14.5mg/L、磷酸氢二钠12水合物15.1g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁7水合物0.5g/L、葡萄糖5g/L，pH7.0，其中硫酸镁7水合物和葡萄糖单独杀菌)中，在37℃下培养4小时，OD₆₆₀达到约2.0时，添加1M IPTG 0.8ml，再在37℃下培养14小时。

通过离心分离由培养液收集菌体，悬浊于200ml的20mM Tris盐酸、30mM NaCl、5mM EDTA、pH7.5中。添加1mg/ml溶菌酶，在4℃下放置1小时后，进行超声波处理，将菌体破碎。离心分离收集含有变性后的MTG的蛋白质包含体。用少量水将蛋白质包含体充分悬浊后，添加试剂、水，达到8M尿素、20mM磷酸钠、1mM EDTA、20mM DTT/30ml，溶解蛋白质包含体。在37℃下温育2小时后，滴加1M盐酸，将pH降低至4，离心分离后，除去沉淀。对溶解的MTG的浓度进行定量，为约20mg/ml。缓慢滴加1000ml的20mM醋酸钠、2mM DTT、pH4.0中溶解的MTG溶液20ml，放置2小时。2小时后，滴加4M氢氧化钠，使pH上升至6，完成重折叠。对MTG的浓度进行定量，为约0.14mg/ml。另外，该重折叠操作均在4℃的低温室下进行。

通过超滤(Hydrosart，10kDa Molecular cut off；SartoconSlice Casette，Sartorius社制)将所得溶液的总量浓缩至200ml，使用Pharmacia公司的Sephadex G25(M)，将溶剂更换为20mM Tris盐酸、pH7.5。向得到的溶液250ml中添加牛因子Xa 5mg(血液学技术公司)后，在5℃下放置过夜。对MTG的浓度进行定量，为约0.36mg/ml。另外，通过蛋白质序列分析仪(岛津株式会社)解析用因子Xa切断后的MTG的N末端氨基酸序列，确认重折叠MTG通过因子Xa将N末端添加的序列完全切断，仅仅是具有成熟型N末端氨基酸序列的重组MTG。

用1M盐酸将通过因子Xa切断后的溶液调节为pH5.8后，用阳离子交换层析的平衡用缓冲液(20mM醋酸钠，pH5.8)稀释成5倍。接着，装入用相同缓冲液充分平衡后的阳离子柱(CM Sepharose FF，2.6φ×10cm，Amersham Pharmacia Biotech公司制)中。用相同缓冲液再平衡后，以波长280nm处的UV吸收为指标，回收通过0-0.4M NaCl的直线浓度梯度洗脱的蛋白质级分(46ml)。用阳离子交换层析的平衡用缓冲液(20mM醋酸钠，pH5.5)将该回收级分稀释成10倍。接着，将3分之1的量装入用相同缓冲液充分平衡后的阳离子柱(Resource S6ml，Amersham Pharmacia Biotech公司制)中。用相同缓冲液再平衡后，以波长280nm处的UV吸收为指标，对于通过0-0.5M NaCl的直线浓度梯度洗脱的蛋白质级分进行分级，回收通过反相HPLC未检测出杂质，且不含MTG的低pI体的峰顶点前方的级分(2ml)。进行2次同样的纯化，并对回收级分的副级分进行再次层析，最终回收8ml(40mg)的级分。再使用Sephadex G25(M)，将溶剂置换为20mM磷酸、pH6.0。通过等电点电泳对该回收的级分进行分析，确认是几乎不含pI不同的类似物的高纯度重组MTG。另外，层析均在室温下进行。

实施例2.结晶化

利用按照悬滴法的蒸气扩散进行结晶化。将重组Asp型MTG(浓度15mg/ml)溶液，以及含有25％聚乙二醇1000和25mM氯化钙的二甲基胂酸钠的83mM缓冲液(pH5.0)，以等量(各2μl)滴加到硅化后的盖玻片上混合，将其盖在装满上述缓冲液500μl的孔(well)上使混合液滴悬垂，在20℃下静置。1周后析出晶体，10天后成长为能够测定的大小(0.5×0.3×0.1mm程度)的板状晶体。MTG的晶体如果在常温下测定，则由于X射线损伤，晶体劣化，分解能力缓慢降低，因此在低温条件下进行测定。将晶体移至含有35％的聚乙二醇1000和35mM氯化钙的二甲基胂酸钠的117mM缓冲液(pH5.0)中后，通入-173℃的氮气，骤冷。

使用(株)Rigaku的X射线衍射装置R-AXIS IIc，收集2.7分辨力(resolution)的X射线衍射数据，确定晶体学参数。空间群为P21，晶格常数为a＝78.4、b＝117.1、c＝85.7、β＝112.9°。假定非对称单位含有4个分子(分子量38000)，则晶体的水分含量为50％。

实施例3.立体结构的确定

将晶体浸渍在重金属盐类的溶液中，进行重原子衍生物的筛选。重原子衍生物晶体的衍射数据使用Bruker社SMART6000和高能量研究所同步辐射光设施BL-6B进行测定。根据与天然数据的差帕特森图(Patterson map)，可以得知EMTS、K₂OSCl₆、K₂IrCl₆这3种能够得到良好的重原子同晶置换晶体。对于各种重原子同晶转换晶体，由差帕特森图求出主要重原子位点后，使用其确定其他多种次要重原子的位点。通过相位确定用程序MLPHARE将这些重原子位点的坐标精密化，计算相位。使用程序DM，进行溶剂平滑化和直方图匹配(histogrammatching)，改良相位后，描绘电子密度图，在非对称单位上观测4个MTG分子。用程序DM将相当于这4个分子的电子密度平均化，电子密度的质量得到大幅度改善。以2.7分辨力制作的电子密度图非常良好，可以使N末端至C末端所有的氨基酸残基适合电子密度。

最初的模型在制图计算机上使用程序QUANTA进行构筑，使用程序X-PLOR进行结构精密化。使用通过筑波·高能量研究所同步辐射光设施BL-6B测定的2.4分辨力的X射线数据，进行精密化，最终的模型(图1、图2)含有331个所有的氨基酸残基和400个水分子。使用10～2.4分辨力的反射得到的晶体学可靠性因子(R因子)为19.6％。使用程序PROCHECK制作Ramachandran图，表明甘氨酸以外的残基的82％位于最优选的区域，15％位于次优选的区域。

实施例4.部位特异性变异体的制作

由于N末端的Asp¹位于凹处的入口，推测与基质的识别有某种关系(图1、图2)。Asp¹的侧链与形成酶的其他残基不发生相互作用，因此认为即使改变该残基，也没有使蛋白质的立体结构变形的危险性。为了考察对Asp¹的基质特异性的影响，可以制作使该残基缺失得到的变异体(由于从Ser²开始，因此以后记做Ser型)，将其基质特异性与野生型进行比较。已经构筑了将含有编码Ser型的基因的质粒性状转化得到的大肠杆菌(特开平11-075876号)，利用其制作Ser型。

另外，与Asp¹同样，将位于通道入口的Ser²置换为其他氨基酸，也可能会改变基质特异性。制作了3种变异体，即，以增强疏水性相互作用为目的置换成Tyr得到的S2Y，和以增强静电相互作用为目的分别置换成Arg和Asp得到的S2R和S2D。这些变异导入在N末端添加了相当于起始密码子的Met的MTG(Met型)中。

而且，购入将半胱氨酸残基氧化后的胰岛素A链(Sigma公司)作为基质蛋白质，考察作为MTG基质的谷氨酰胺残基。胰岛素A链为21个氨基酸残基构成的蛋白质(序列号23)，从N末端数第5和第15个位置存在谷氨酰胺残基。以胰岛素A链作为捕捉基质蛋白质的结构特征的题材，是因为存在多个谷氨酰胺残基，而且分子量小，容易确定MTG反应的谷氨酰胺残基的位置。

在将半胱氨酸残基氧化后的胰岛素A链1mg中，添加1M的¹⁵NH₄Cl200μl、lmM的MTG 2μl，搅拌后，测定Mass。在将各氨基酸残基片断化的同时测定Mass，考察¹⁵N标记的残基，为N末端起第15个位置的谷氨酰胺残基。以上结果，表明胰岛素A链上存在的2种谷氨酰胺残基中，第15个位置的谷氨酰胺残基为MTG的基质。

胰岛素A链的第17个位置存在谷氨酸，存在于与第15个位置的谷氨酰胺相隔1个残基的位置。多肽链上的氨基酸侧链在相隔1个残基时，有朝向相同方向的趋势，因而认为第15个位置的谷氨酰胺残基与第17个位置的谷氨酸不仅在序列上，而且在空间上也非常接近。由于第15个位置的谷氨酰胺残基附近存在酸性氨基酸，因此不优选MTG的基质结合部位存在具有负电荷的氨基酸。另外，MTG反应的谷氨酰胺残基大多位于基质蛋白质的表面，认为其周围容易存在易于露出到溶剂中的酸性氨基酸，即使在基质蛋白质不是胰岛素的场合也可以这样说。

因此，推测如果通过改变酸性氨基酸或者使接近的氨基酸呈碱性，缓和负电荷，制成改变了基质特异性的变异型转谷氨酰胺酶，则可以改善基质特异性。Ser型MTG是缺失了序列号2的天冬氨酸得到的物质，S2R变异体是在酸性氨基酸附近设置碱性氨基酸缓和负电荷得到的物质，满足上述条件。而且，还制作缺失了残基序号1和2的del 1-2、缺失了残基序号1-3的del 1-3，分别消除Asp¹、Asp³的负电荷。

另外，夹持着活性残基Cys⁶⁴存在的2个环(233～253、276～288)宛如将基质夹在中间，因此存在规定基质特异性的可能性。但是，环在MTG的折叠中也发挥重要作用，不能随便缺失。因此，根据MTG的立体结构，探索如下所述的部位，即(1)几乎不与环以外的部位相互作用，不影响折叠，(2)缺失的部位(残基)的N末端和C末端的距离为7以下，能够被3个甘氨酸残基代替。采用3个甘氨酸残基是考虑能够形成转角结构，但是并不限于此。例如，残基序号241-252几乎不与其它部位相互作用，而且残基序号241的N末端与残基序号252的C末端的距离为约6，能够将残基序号241-252和3个甘氨酸残基交换。作为满足这种条件的缺失了环的变异体，制作将残基序号241-252置换成3个甘氨酸残基的Sg4、将残基序号278-287置换成3个甘氨酸残基的Sg7，明确了将活性残基Cys⁶⁴夹在中间的2个环的作用。

(1)Ser型MTG的制作

将导入了含有Ser型MTG基因的质粒pUCTRPMTG-02(+)(特开平11-075876号)的大肠杆菌JM109接种于含有200μl/ml氨苄青霉素的L培养基50ml中，在30℃下预培养7小时。将预培养液中16ml继续接种在800ml的M9培养基中，在37℃下培养24小时。由培养液离心分离收集菌体，悬浮于20mM Tris·30mM NaCl 12.5ml中。添加1mg/ml溶菌酶和0.5M EDTA，在4℃下放置1小时后，超声波处理20分钟将菌体破碎。离心分离收集含有改性的MTG的蛋白质包含体。用少量水将蛋白质包含体充分悬浊后，添加试剂、水，达到8M尿素、20mM磷酸钠、1mM EDTA、20mM DTT/5ml，溶解蛋白质包含体。

在37℃下温育2小时后，将pH降低至4，离心分离后，除去沉淀。缓慢滴加250ml的20mM醋酸钠(pH4.0)2mM DTT中溶解的MTG溶液，放置2小时。2小时后，使pH上升至5，离心分离除去不溶物后，再将pH上升至6，完成重折叠。另外，该重折叠操作均在4℃的低温室下进行。

使用Pharmacia公司的Sephadex G25(M)，将250ml的溶液置换为20mM醋酸钠(pH5.8)后，使用Pharmacia公司的离子交换树脂(CM Sepharose FF)，回收在20mM醋酸钠(pH5.8)中按照氯化钠的0-0.4M的直线浓度梯度洗脱的蛋白质级分(55ml)。再使用G25(M)，将溶剂交换为20mM磷酸钠(pH6.0)。

另外，Met的C末端为Ser时，通过大肠杆菌具有的蛋氨酸氨基肽酶除去N末端的Met，因此如果在起始密码子之后设置相当于Ser的密码子，则可以制备N末端为Ser的Ser型。

(2)置换Ser2的变异体的制作

为了使大肠杆菌生产3种变异型MTG(S2Y、S2R、S2D)，构筑如下所述的MTG表达质粒pGEMMTG3(编码序列号4所示的氨基酸序列，含有序列号3所示的碱基序列)，作为采用PCR的部位特异性突变诱发法的模板使用。pGEMMTG3是通过T7启动子诱导性地高度表达MTG的质粒，通过下述方法构筑，即，除去表达T7基因10蛋白质的氨基末端侧区域与MTG的融合蛋白的质粒pGEM15TG(Xa)〔Biosci.Biotech.Biochem，第61(5)卷，第830～835页(1997)〕的T7基因10蛋白质基因，与设计的合成基因进行交换，使之通过特开平11-75876号公报记载的大肠杆菌高度表达。

以下叙述pGEMMTG3的构筑方法。首先合成设计为缺失T7基因10蛋白质基因42个残基且5’末端具有PstI切断部位的引物pGEMTGF01(序列表中序列号11)，以及具有MTG基因中的EcoRI切断部位的引物pGEMTGR01(序列表中序列号12)。使用这些引物，pGEM15TG(Xa)作为模板进行PCR，将扩增的片断克隆到pUC19(宝酒造株式会社)中。PCR在96℃下30秒、50℃下15秒、60℃下1分钟的条件下进行25个循环。分析含有插入片断的质粒的碱基序列，将具有目的正确的序列的质粒命名为pUCTGN。pGEM15TG(Xa)具有2处NdeI切断部位，因此通过下述多个步骤将pUCTGN的NdeI/EcoRI片断与pGEM15TG(Xa)的NdeI/EcoRI片断进行置换。也就是说，将pGEM15TG(Xa)的用SmaI和EcoRI切断得到的小片断亚克隆到用SmaI和EcoRI切断的pBluescript(东洋纺绩株式会社)载体中，命名为pBS15TG(SE)。接着，使由pUCTGN用NdeI和EcoRI切断的含有TG基因的片断与由pBS15TG(SE)用NdeI和EcoRI切断的不含TG基因的片断结合，命名为pBSTG(SE)。而且，使由pGEM15TG(Xa)用SmaI和EcoRI切断得到的大片断与由pBSTG(SE)用NdeI和EcoRI切断的含有TG基因的片断结合，命名为pGEMTG。最后，将pGEMTG的MTG基因部分(PvuII和HindIII的切断片断)与pUCTRPMTG-02(+)(特开平11-75876号公报记载)的MTG基因(PvuII和HindIII的切断片断)进行置换，构筑pGEMMTG3。

变异是使用Stratagene公司的“quick exchange(注册商标)部位特异性突变诱发试剂盒”，按照制造商的方案，使用对应于各种变异型酶的引物(图5，序列号13～18)导入。也就是说，图5是表示S2Y·S2R·S2D变异体的部位特异性突变诱发法中使用的引物组的图。使用PCR反应的产物，对大肠杆菌JM109(宝酒造株式会社)进行性状转化。将性状转化细胞涂抹于含有100μl/ml氨苄青霉素的L琼脂培养基平皿上，37℃下温育16小时。采集生成的菌落，用含有100μl/ml的氨苄青霉素的L培养基振荡培养过夜。由培养液离心分离回收菌体后，使用KURABO社的Automatic DNA Isolation System PI-50，按照制造商的方案进行质粒的提取。编码各种变异型MTG的碱基序列通过DNA序列分析确认。质粒性状转化到大肠杆菌BL21(DE3)(Promega公司)中。

将导入了变异型MTG基因的大肠杆菌BL21(DE3)接种在含有200μg/ml氨苄青霉素的L培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取液5g/L、NaCl 5g/L、葡萄糖1g/L，pH7.2)50ml中，在37℃下预培养6小时。将预培养物8ml继续接种在含有200μg/ml氨苄青霉素的M9水解酪蛋白氨基酸培养基(水解酪蛋白氨基酸8g/L、氯化铵5g/L、酵母提取液0.2g/L、维生素B1盐酸盐2mg/L、氯化钙2水合物14.5mg/L、磷酸氢二钠12水合物15.1g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁7水合物0.5g/L、葡萄糖5g/L，pH7.0，其中硫酸镁7水合物和葡萄糖单独杀菌)中，在37℃下培养4小时，OD₆₆₀达到约0.6时，添加1M IPTG 0.8ml，再在37℃下培养14小时。培养后的菌体处理、蛋白质包含体溶解、蛋白质重折叠、蛋白质纯化按照(1)记载的方法进行。

(3)改变了酸性氨基酸残基的变异体的制作

使用MTG表达质粒pGEMMTG3作为部位特异性突变诱发法的模板，使用对应于各种变异型酶的合成DNA(图6，序列号19～22)作为引物。变异质粒的构筑、培养、菌体处理、蛋白质包含体溶解、蛋白质重折叠、蛋白质纯化按照实施例4(2)记载的方法进行。

(4)缺失了环的变异体Sg4和Sg7的制作

对于Sg4基因，切出对应于残基序号1-240和残基序号253-331的基因，对于Sg7基因，切出对应于残基序号1-277和残基序号288-331的基因，之后将两者连接进行制作。以下，叙述Sg4表达质粒和Sg7表达质粒的构筑方法。首先，使用5’末端具有SmaI切断部位的引物(序列号24)和3’末端具有编码3个甘氨酸残基的部位的引物(序列号25、26)，以pGEMMTG3作为模板进行PCR。同样，使用5’末端具有编码3个甘氨酸残基的部位的引物(序列号27、28)和3’末端具有HindIII切断部位的引物(序列号29)，以pGEMMTG3为模板进行PCR。接着，使用5’末端具有SmaI切断部位的引物(序列号24)和3’末端具有HindIII切断部位的引物(序列号29)，以扩增的2种DNA片断为模板进行PCR，得到扩增的Sg4基因和Sg7基因。对于Sg7基因，用SmaI和HindIII切断，克隆到pGEMMTG3的SmaI切断部位和HindIII切断部位。另一方面，对于Sg7，用EcoRI和HindIII切断，克隆到pGEMMTG3的EcoRI切断部位和HindIII切断部位。而且，确认所得质粒的插入片断的碱基序列，完成Sg4表达质粒和Sg7表达质粒的构筑。

培养、菌体处理、蛋白质包含体溶解、蛋白质重折叠、蛋白质纯化按照实施例4(2)记载的方法进行。

实施例5.基质特异性的比较

为了比较基质特异性，使用卵白蛋白(ovalbumin)作为基质蛋白质。卵白蛋白存在12个谷氨酰胺残基，通过NMR追踪分别对应的反应性。另外，为了用于食品和药品等领域，例如有必要提高蛋白质分子间的交联速度。因此，对于一部分变异体，也比较将酪蛋白凝胶化的时间。

(1)使用NMR解析基质特异性

(1-1)野生型与Ser型的比较

进行混合使之达到卵白蛋白100mg/ml、¹⁵NH₄Cl 200mM、转谷氨酰胺酶1μM，20分钟后进行第1次¹H-¹⁵N HSQC测定，接着每隔2小时15分钟进行¹H-¹⁵N HSQC测定，进行13次。使野生型反应3小时的¹H-¹⁵N HSQC的例子如图7所示。另外，对于野生型和Ser型分别将图7中记做a的信号的峰强度(纵轴)对反应时间(小时，横轴)作图(图8)。结果，对于给出图7中a所示信号的谷氨酰胺残基，判断出与野生型相比，使Ser型反应能够较快地被¹⁵N标记。

(1-2)野生型与S2Y·S2R·S2D变异体的比较

进行混合使之达到卵白蛋白100mg/ml、¹⁵NH₄Cl 200mM、转谷氨酰胺酶1μM，20分钟后进行第1次¹H-¹⁵N HSQC测定，接着每隔2小时15分钟进行¹H-¹⁵N HSQC测定，进行13次。对于给出图7中a所示信号的谷氨酰胺残基，将分别使野生型、S2Y、S2R、S2D反应得到的波谱的峰强度(纵轴)作图(图9)。结果，对于给出图7中a所示信号的谷氨酰胺残基，判断出¹⁵N标记的速度按照S2Y＜S2D＜野生型＜S2R的顺序增高。

(1-3)与改变了酸性氨基酸残基的变异体的比较

进行混合使之达到卵白蛋白100mg/ml、¹⁵NH₄Cl 200mM、转谷氨酰胺酶1μM，20分钟后进行第1次¹H-¹⁵N HSQC测定，接着每隔2小时15分钟进行¹H-¹⁵N HSQC测定，进行13次。与实施例5同样，对于给出图7中a所示信号的谷氨酰胺残基，将分别使野生型、Ser型、S2R、del 1-2、del 1-3反应得到的波谱的峰强度(纵轴)作图(图8)。结果，可以得知与野生型相比，del 1-2、del 1-3的反应性升高。而且，可知与Ser型和S2R相比，del 1-3的反应性显著高。

如上所述，如果通过改变酸性氨基酸，或者使接近的氨基酸为碱性，缓和负电荷，制作改变了基质特异性的变异型转谷氨酰胺酶，则与以前相比能够以少量对蛋白质进行交联，可以预计成本将大幅度降低。

(1-4)与缺失了环领域的变异体的比较

进行混合使之达到卵白蛋白100mg/ml、¹⁵NH₄Cl 200mM、转谷氨酰胺酶1μM，6小时后进行¹H-¹⁵N HSQC测定。结果，野生型观测到6组信号，而Sg4和Sg7分别仅观测到3组和2组信号(图10)。其中，对于图10观测到的信号中不带有序号的信号，通过不添加转谷氨酰胺酶的试验，可以得知并非来源于由于转谷氨酰胺酶反应被标记的谷氨酰胺残基。另外，对于被Sg7标记的卵白蛋白的波谱，由于Sg7的反应性低，标记率低，因此登载了选择更低水平的图。因此，不带有序号的信号稍微强调表示。

野生型①至⑥对应的谷氨酰胺残基反应，而Sg4仅①、③、④被标记。因此，判断出与野生型相比对于Sg4能够作为基质的谷氨酰胺残基数减少，即基质特异性高。另外，可以得知Sg7虽然反应性降低，但是仅①和③对应的谷氨酰胺残基能够作为基质。认为通过缺失环，减少与基质的结合面，能够反应的基质的种类减少。以上结果表明，通过以立体结构为基础制作变异体，可以改变MTG的基质特异性。通过使用改变了基质特异性的转谷氨酰胺酶，能够适用于与以往不同的题材，可以期待在新产业中的发展。

(2)酪蛋白凝胶化时间的比较

对于含有酪蛋白重量比8％的溶液2.5g，分别添加野生型、Ser型、S2Y、S2R、S2D变异体57.6μg，比较达到酪蛋白凝胶化的时间。反应温度为40℃。结果，达到凝胶化的时间野生型为90分钟，Ser型为85分钟，S2Y变异体为100分钟，S2R变异体为85分钟，S2D变异体为95分钟。判断出与野生型相比，Ser型和S2R变异体短时间凝胶化，而S2Y、S2D变异体则缓慢进行凝胶化。

按照本发明，容易以立体结构为基础改良MTG。特别是，能够提供改良了对基质的反应性的转谷氨酰胺酶。而且，通过使用改良了对基质的反应性的转谷氨酰胺酶，可以提供新型制品和新型技术。

序列表

<110>味之素株式会社

<120>来源于微生物的转谷氨酰胺酶的修饰方法

<130>Y1I0632

<140>

<141>

<150>JP 2000-247664

<151>2000-08-17

<150>JP 2000-396695

<151>2000-12-27

<160>29

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>993

<212>DNA

<213>茂原链轮丝菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(993)

<400>1

gac tcc gac gac agg gtc acc cct ccc gcc gag ccg ctc gac agg atg 48

Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met

1 5 10 15

ccc gac ccg tac cgt ccc tcg tac ggc agg gcc gag acg gtc gtc aac 96

Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn

20 25 30

aac tac ata cgc aag tgg cag cag gtc tac agc cac cgc gac ggc agg 144

Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg

35 40 45

aag cag cag atg acc gag gag cag cgg gag tgg etg tcc tac ggc tgc 192

Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys

50 55 60

gtc ggt gtc acc tgg gtc aat tcg ggt cag tac ccg acg aac aga ctg 240

Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu

65 70 75 80

gcc ttc gcg tcc ttc gac gag gac agg ttc aag aac gag ctg aag aac 288

Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn

85 90 95

ggc agg ccc cgg tcc ggc gag acg cgg gcg gag ttc gag ggc cgc gtc 336

Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val

100 105 110

gcg aag gag agc ttc gac gag gag aag ggc ttc cag cgg gcg cgt gag 384

Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu

115 120 125

gtg gcg tcc gtc atg aac agg gcc ctg gag aac gcc cac gac gag agc 432

Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser

130 135 140

gct tac ctc gac aac ctc aag aag gaa ctg gcg aac ggc aac gac gcc 480

Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala

145 150 155 160

ctg cgc aac gag gac gcc cgt tcc ccg ttc tac tcg gcg ctg cgg aac 528

Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn

165 170 175

acg ccg tcc ttc aag gag cgg aac gga ggc aat cac gac ccg tcc agg 576

Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg

180 185 190

atg aag gcc gtc atc tac tcg aag cac ttc tgg agc ggc cag gac cgg 624

Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg

195 200 205

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Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg

210 215 220

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Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile

225 230 235 240

ccg cgc agc ccc acc agc ccc ggt gag gga ttc gtc aat ttc gac tac 768

Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr

245 250 255

ggc tgg ttc ggc gcc cag acg gaa gcg gac gcc gac aag acc gtc tgg 816

Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp

260 265 270

acc cac gga aat cac tat cac gcg ccc aat ggc agc ctg ggt gcc atg 864

Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met

275 280 285

cat gtc tac gag agc aag ttc cgc aac tgg tcc gag ggt tac tcg gac 912

His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp

290 295 300

ttc gac cgc gga gcc tat gtg atc acc ttc atc ccc aag agc tgg aac 960

Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn

305 310 315 320

acc gcc ccc gac aag gta aag cag ggc tgg ccg 993

Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro

325 330

<210>2

<211>331

<212>PRT

<213>茂原链轮丝菌

<400>2

Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met

1 5 10 15

Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn

20 25 30

Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg

35 40 45

Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys

50 55 60

Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu

65 70 75 80

Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn

85 90 95

Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val

100 105 110

Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu

115 120 125

Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser

130 135 140

Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala

145 150 155 160

Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn

165 170 175

Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg

180 185 190

Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg

195 200 205

Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg

210 215 220

Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile

225 230 235 240

Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr

245 250 255

Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp

260 265 270

Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met

275 280 285

His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp

290 295 300

Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn

305 310 315 320

Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro

325 330

<210>3

<211>996

<212>DNA

<213>茂原链轮丝菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(996)

<220>

<221>mat-肽

<222>(4)..(996)

<400>3

atg gat tct gac gat cga gtc act cca cca gct gaa cea ctg gat cgt 48

Met Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg

-1 1 5 10 15

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Met Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val

20 25 30

aat aat tat att cgt aaa tgg caa caa gtt tat tct cat cgt gat ggt 144

Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly

35 40 45

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Arg Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly

50 55 60

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Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg

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ctg gca ttc gct tcc ttc gat gaa gat cgt ttc aag aac gaa ctg aag 288

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80 85 90 95

aac ggt cgt ccg cgt tct ggt gaa act cgt gct gaa ttc gaa ggt cgt 336

Asn Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg

100 105 110

gtt gct aag gaa tcc ttc gat gaa gag aaa ggc ttc cag cgt gct cgt 384

Val Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg

115 120 125

gaa gtt gct tct gtt atg aac cgt gct cta gag aac gct cat gat gaa 432

Glu Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu

130 135 140

tct gct tac ctg gat aac ctg aag aag gaa ctg gct aac ggt aac gat 480

Ser Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp

145 150 155

gct ctg cgt aac gaa gat gct cgt tct ccg ttc tac tct gct ctg cgt 528

Ala Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg

160 165 170 175

aac act ccg tcc ttc aaa gaa cgt aac ggt ggt aac cat gat ccg tct 576

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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Arg Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn

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Ile Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp

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tac ggt tgg ttc ggt gct cag act gaa gct gat gct gat aag act gta 816

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tgg acc cat ggt aac cat tac cat gct ccg aac ggt tct ctg ggt gct 864

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275 280 285

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Met His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser

290 295 300

gac ttc gat cgt ggt gct tac gtt atc acc ttc att ccg aaa tct tgg 960

Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp

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aac act gct ccg gac aaa gtt aaa cag ggt tgg ccg 996

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<210>4

<211>332

<212>PRT

<213>茂原链轮丝菌

<400>4

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-1 1 5 10 15

Met Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val

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Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly

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Arg Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly

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Leu Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys

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100 105 110

Val Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg

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275 280 285

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<210>5

<211>990

<212>DNA

<213>肉桂链轮丝菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(990)

<400>5

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Ser Arg Ala Pro Ser Asp Asp Arg Glu Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu

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gac agg atg cct gag gcg tac cgg gcc tac gga ggc agg gcc act acg 96

Asp Arg Met Pro Glu Ala Tyr Arg Ala Tyr Gly Gly Arg Ala Thr Thr

20 25 30

gtc gtc aac aac tac ata cgc aag tgg cag cag gtc tac agt cac cgc 144

Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg

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gac gga aag aaa cag caa atg acc gaa gag cag cga gaa aag ctg tcc 192

Asp Gly Lys Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Lys Leu Ser

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tac ggt tgc gtt ggc gtc acc tgg gtc aac tcg ggc ccc tac ccg acg 240

Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Pro Tyr Pro Thr

65 70 75 80

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Asn Arg Leu Ala Phe Gly Pro Phe Asp Glu Asn Lys Tyr Lys Asn Asp

85 90 95

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Gly Arg Ile Lys Gly Ser Phe Asp Glu Gly Lys Gly Phe Lys Arg Ala

115 120 125

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Arg Asp Val Ala Ser Val Met Asn Lys Ala Arg Glu Asn Ala His Asp

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gcg ctc cgc cgc gag gac agc cgc tcg aac ttc tac tcg gcg ctg agg 528

Ala Leu Arg Arg Glu Asp Ser Arg Ser Asn Phe Tyr Ser Ala Leu Arg

165 170 175

aac aca ccg tcc ttc aag gaa agg gac ggc ggc aac tac gac ccg tcc 576

Asn Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asp Gly Gly Asn Tyr Asp Pro Ser

180 185 190

aag atg aag gcg gtg atc tac tcg aag cac ttc tgg agc ggg cag gac 624

Lys Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp

195 200 205

cag cgg ggc tcc tcc gac aag agg aag tac ggc gac ccg gaa gcc ttc 672

Gln Arg Gly Ser Ser Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Glu Ala Phe

210 215 220

cgc ccc gta cca ggt acc ggc ctg gtc gac atg tcg aag gac aga agc 720

Arg Pro Val Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Lys Asp Arg Ser

225 230 235 240

att ccg cgc agt ccg gcc aag ccc ggc gaa ggt tgg gtc aat ttc gac 768

Ile Pro Arg Ser Pro Ala Lys Pro Gly Glu Gly Trp Val Asn Phe Asp

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Trp Thr His Gly Asp His Tyr His Ala Pro Asn Ser Asp Leu Gly Pro

275 280 285

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Met His Val His Glu Ser Lys Phe Arg Lys Trp Ser Ala Gly Tyr Ala

290 295 300

gac ttc ggc gcc tac gtg atc acg ttc ata ccc aag agc tgg aac acc 960

Asp Phe Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr

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<210>6

<211>330

<212>PRT

<213>肉桂链轮丝菌

<400>6

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Asn Arg Leu Ala Phe Gly Pro Phe Asp Glu Asn Lys Tyr Lys Asn Asp

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Gly Arg Ile Lys Gly Ser Phe Asp Glu Gly Lys Gly Phe Lys Arg Ala

115 120 125

Arg Asp Val Ala Ser Val Met Asn Lys Ala Arg Glu Asn Ala His Asp

130 135 140

Glu Gly Thr Tyr Ile Asn Asn Leu Lys Thr Glu Leu Thr Asn Asn Asn

145 150 155 160

Ala Leu Arg Arg Glu Asp Ser Arg Ser Asn Phe Tyr Ser Ala Leu Arg

165 170 175

Asn Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asp Gly Gly Asn Tyr Asp Pro Ser

180 185 190

Lys Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp

195 200 205

Gln Arg Gly Ser Ser Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Glu Ala Phe

210 215 220

Arg Pro Val Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Lys Asp Arg Ser

225 230 235 240

Ile Pro Arg Ser Pro Ala Lys Pro Gly Glu Gly Trp Val Asn Phe Asp

245 250 255

Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Arg Asp Lys Thr Thr

260 265 270

Trp Thr His Gly Asp His Tyr His Ala Pro Asn Ser Asp Leu Gly Pro

275 280 285

Met His Val His Glu Ser Lys Phe Arg Lys Trp Ser Ala Gly Tyr Ala

290 295 300

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305 310 315 320

Ala Pro Ala Lys Val Glu Gln Gly Trp Pro

325 330

<210>7

<211>993

<212>DNA

<213>利迪链霉菌

<220>

<22l>CDS

<222>(1)..(993)

<400>7

gca gcc gac gaa agg gtc acc cct ccc gcc gag ccg ctc aac cgg atg 48

Ala Ala Asp Glu Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asn Arg Met

1 5 10 15

cct gac gcg tac cgg gcc tac gga ggt agg gcc act acg gtc gtc aac 96

Pro Asp Ala Tyr Arg Ala Tyr Gly Gly Arg Ala Thr Thr Val Val Asn

20 25 30

aac tac ata cgc aag tgg cag cag gtc tac agt cac cgc gac ggc atc 144

Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Ile

35 40 45

caa cag caa atg acc gaa gag cag cga gaa aag ctg tcc tac ggc tgc 192

Gln Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Lys Leu Ser Tyr Gly Cys

50 55 60

gtc ggc atc acc tgg gtc aat tcg ggc ccc tac ccg acg aat aaa ttg 240

Val Gly Ile Thr Trp Val Asn Ser Gly Pro Tyr Pro Thr Asn Lys Leu

65 70 75 80

gcg ttc gcg ttc ttc gac gag aac aag tac aag agt gac ctg gaa aac 288

Ala Phe Ala Phe Phe Asp Glu Asn Lys Tyr Lys Ser Asp Leu Glu Asn

85 90 95

agc agg cca cgc ccc aat gag acg caa gcc gag ttt gag ggg cgc atc 336

Ser Arg Pro Arg Pro Asn Glu Thr Gln Ala Glu Phe Glu Gly Arg Ile

100 105 110

gtc aag gac agt ttc gac gag ggg aag ggt ttc aag cgg gcg cgt gat 384

Val Lys Asp Ser Phe Asp Glu Gly Lys Gly Phe Lys Arg Ala Arg Asp

115 120 125

gtg gcg tcc gtc atg aac aag gcc ctg gat agt gcg cac gac gag ggg 432

Val Ala Ser Val Met Asn Lys Ala Leu Asp Ser Ala His Asp Glu Gly

130 135 140

act tac atc gac aac ctc aag acg gag ctc gcg aac aaa aat gac gct 480

Thr Tyr Ile Asp Asn Leu Lys Thr Glu Leu Ala Asn Lys Asn Asp Ala

145 150 155 160

ctg cgc tac gag gac ggt cgc tcg aac ttt tac tcg gcg ctg agg aat 528

Leu Arg Tyr Glu Asp Gly Arg Ser Asn Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn

165 170 175

acg ccg tcc ttc aag gaa agg gat gga ggt aac tac gac cca tcc aag 576

Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asp Gly Gly Asn Tyr Asp Pro Ser Lys

180 185 190

atg aag gcg gtg gtc tac tcg aaa cac ttc tgg agc ggg cag gac cag 624

Met Lys Ala Val Val Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Gln

195 200 205

cgg ggc tcc tct gac aag agg aag tac ggc gac ccg gat gcc ttc cgc 672

Arg Gly Ser Ser Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg

210 215 220

ccc gac cag ggc aca ggc ctg gta gac atg tcg aag gac agg aat att 720

Pro Asp Gln Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Lys Asp Arg Asn Ile

225 230 235 240

ccg cgc agt ccc gcc caa cct ggc gaa agt tgg gtc aat ttc gac tac 768

Pro Arg Ser Pro Ala Gln Pro Gly Glu Ser Trp Val Asn Phe Asp Tyr

245 250 255

ggc tgg ttt ggg gct cag acg gaa tcg gac gcc gac aaa acc ata tgg 816

Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ser Asp Ala Asp Lys Thr Ile Trp

260 265 270

acc cac gcc aac cac tat cac gcg ccc aac ggc ggc ctg ggc ccc atg 864

Thr His Ala Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Gly Leu Gly Pro Met

275 280 285

aac gta tat gag agc aag ttc cgg aac tgg tct gcc ggg tac gcg gat 912

Asn Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Ala Gly Tyr Ala Asp

290 295 300

ttc gac cgc gga acc tac gtc atc acg ttc ata ccc aag agc tgg aac 960

Phe Asp Arg Gly Thr Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn

305 310 315 320

acc gcc ccc gcc gag gta aag cag ggc tgg tcg 993

Thr Ala Pro Ala Glu Val Lys Gln Gly Trp Ser

325 330

<210>8

<211>331

<212>PRT

<213>利迪链霉菌

<400>8

Ala Ala Asp Glu Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Ash Arg Met

1 5 10 15

Pro Asp Ala Tyr Arg Ala Tyr Gly Gly Arg Ala Thr Thr Val Val Asn

20 25 30

Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Ile

35 40 45

Gln Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Lys Leu Ser Tyr Gly Cys

50 55 60

Val Gly Ile Thr Trp Val Asn Ser Gly Pro Tyr Pro Thr Asn Lys Leu

65 70 75 80

Ala Phe Ala Phe Phe Asp Glu Asn Lys Tyr Lys Ser Asp Leu Glu Asn

85 90 95

Ser Arg Pro Arg Pro Asn Glu Thr Gln Ala Glu Phe Glu Gly Arg Ile

100 105 110

Val Lys Asp Ser Phe Asp Glu Gly Lys Gly Phe Lys Arg Ala Arg Asp

115 120 125

Val Ala Ser Val Met Asn Lys Ala Leu Asp Ser Ala His Asp Glu Gly

130 135 140

Thr Tyr Ile Asp Asn Leu Lys Thr Glu Leu Ala Asn Lys Asn Asp Ala

145 150 155 160

Leu Arg Tyr Glu Asp Gly Arg Ser Asn Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn

165 170 175

Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asp Gly Gly Asn Tyr Asp Pro Ser Lys

180 185 190

Met Lys Ala Val Val Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Gln

195 200 205

Arg Gly Ser Ser Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg

210 215 220

Pro Asp Gln Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Lys Asp Arg Asn Ile

225 230 235 240

Pro Arg Ser Pro Ala Gln Pro Gly Glu Ser Trp Val Asn Phe Asp Tyr

245 250 255

Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ser Asp Ala Asp Lys Thr Ile Trp

260 265 270

Thr His Ala Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Gly Leu Gly Pro Met

275 280 285

Asn Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Ala Gly Tyr Ala Asp

290 295 300

Phe Asp Arg Gly Thr Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn

305 310 315 320

Thr Ala Pro Ala Glu Val Lys Gln Gly Trp Ser

325 330

<210>9

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>9

cggatccatc gaaggtcgtg attctgacga tcgtgttact cc 42

<210>10

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>10

caatttgcga gctcattacg gccaaccctg 30

<210>11

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>11

cctgcagaag gagatataca tatggattct gacgatcgag tc 42

<210>12

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>12

catcgaaaga ttccttagc 19

<210>13

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>13

ggagatatac atatggatta cgacgatcgt gttactcc 38

<210>14

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>14

ggagatatac atatggatta cgacgatcgt gttactcc 38

<210>15

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>15

ggagatatac atatggatcg tgacgatcgt gttactcc 38

<210>16

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>16

ggagtaacac gatcgtcacg atccatatgt atatctcc 38

<210>17

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>17

ggagatatac atatggatga cgacgatcgt gttactcc 38

<210>18

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>18

ggagtaacac gatcgtcgtc atccatatgt atatctcc 38

<210>19

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>19

ggagatatac atatggacga tcgtgttact ccaccagc 38

<210>20

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>20

gctggtggag taacacgatc gtccatatgt atatctcc 38

<210>21

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>21

gaaggagata tacatatgga tcgtgttact ccaccagctg 40

<210>22

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>22

cagctggtgg agtaacacga tccatatgta tatctccttc 40

<210>23

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：氧化后的牛胰岛素A链

<220>

<221>MOD_RES

<222>(6)

<223>氧化

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)

<223>氧化

<220>

<221>MOD_RES

<222>(11)

<223>氧化

<220>

<221>MOD_RES

<222>(20)

<223>氧化

<400>23

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Ala Ser Val Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

1 5 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asn

20

<210>24

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>24

gattcattaa tgcagcccgg gagatc 26

<210>25

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>25

ccgatatcga agttaccgcc accgatgtta cgatcacgag acatgtctac 50

<210>26

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>26

gattcgtata catgcatacc gccaccatgg ttaccatggg tccatacagt c 51

<210>27

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>27

ggtggcggta acttcgatta cggttggttc ggtgc 35

<210>28

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>28

ggtggcggta tgcatgtata cgaatctaaa ttccg 35

<210>29

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>29

gaatactcaa gctttcatta cggcc 25

Claims

1.一种变异型MTG，其具有转谷氨酰胺酶活性，并具有带有变异的序列号2的氨基酸序列，其中向序列引入变异的方法是：

i)用Arg、Tyr或Asp替换Ser²；

ii)在N末端缺失两个或三个氨基酸残基；

iii)用三个Gly残基替换241-252号氨基酸残基；或者

iv)用三个Gly残基替换278-287号氨基酸残基。

2.一种基因，编码权利要求1所述的变异型MTG。

3.一种载体，包含权利要求2所述的基因。

4.一种微生物，具有权利要求3所述的载体。

5.一种制造变异型MTG的方法，其特征在于培养权利要求4所述的微生物，采集变异型MTG。