CN101287757A - 特异性改进的转谷氨酰胺酶变异体 - Google Patents
特异性改进的转谷氨酰胺酶变异体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101287757A CN101287757A CNA200680038433XA CN200680038433A CN101287757A CN 101287757 A CN101287757 A CN 101287757A CN A200680038433X A CNA200680038433X A CN A200680038433XA CN 200680038433 A CN200680038433 A CN 200680038433A CN 101287757 A CN101287757 A CN 101287757A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tyr
- asp
- isolated peptides
- peptide
- gln
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 title claims abstract description 80
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 title claims abstract description 80
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 367
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 170
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 77
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 64
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 44
- 101000581940 Homo sapiens Napsin-A Proteins 0.000 claims description 32
- 102100027343 Napsin-A Human genes 0.000 claims description 32
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 28
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 25
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 25
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 25
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 12
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 26
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 abstract description 109
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 abstract description 109
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 abstract description 109
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 46
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 41
- 241001495137 Streptomyces mobaraensis Species 0.000 description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 21
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 20
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 20
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 17
- 230000008859 change Effects 0.000 description 17
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 15
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 13
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 13
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- FHXGMDRKJHKLKW-QWRGUYRKSA-N Ser-Tyr-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FHXGMDRKJHKLKW-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 12
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 12
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 11
- UGTZYIPOBYXWRW-SRVKXCTJSA-N Ser-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O UGTZYIPOBYXWRW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 11
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 11
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 8
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 8
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 7
- FBHOPGDGELNWRH-DRZSPHRISA-N Ala-Glu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O FBHOPGDGELNWRH-DRZSPHRISA-N 0.000 description 6
- VBRDBGCROKWTPV-XHNCKOQMSA-N Ala-Glu-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N VBRDBGCROKWTPV-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 6
- YHKANGMVQWRMAP-DCAQKATOSA-N Ala-Leu-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YHKANGMVQWRMAP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 6
- 108010011667 Ala-Phe-Ala Proteins 0.000 description 6
- XRUJOVRWNMBAAA-NHCYSSNCSA-N Ala-Phe-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=CC=C1 XRUJOVRWNMBAAA-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 6
- ZJLORAAXDAJLDC-CQDKDKBSSA-N Ala-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZJLORAAXDAJLDC-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 6
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 6
- SGYSTDWPNPKJPP-GUBZILKMSA-N Arg-Ala-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SGYSTDWPNPKJPP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 6
- VKKYFICVTYKFIO-CIUDSAMLSA-N Arg-Ala-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N VKKYFICVTYKFIO-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 6
- NONSEUUPKITYQT-BQBZGAKWSA-N Arg-Asn-Gly Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)NCC(=O)O)N)CN=C(N)N NONSEUUPKITYQT-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 6
- KMSHNDWHPWXPEC-BQBZGAKWSA-N Arg-Asp-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O KMSHNDWHPWXPEC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 6
- XKDYWGLNSCNRGW-WDSOQIARSA-N Arg-Lys-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N)CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 XKDYWGLNSCNRGW-WDSOQIARSA-N 0.000 description 6
- QBQVKUNBCAFXSV-ULQDDVLXSA-N Arg-Lys-Tyr Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 QBQVKUNBCAFXSV-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 6
- DNLQVHBBMPZUGJ-BQBZGAKWSA-N Arg-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O DNLQVHBBMPZUGJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 6
- ICRHGPYYXMWHIE-LPEHRKFASA-N Arg-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O ICRHGPYYXMWHIE-LPEHRKFASA-N 0.000 description 6
- FTCGGKNCJZOPNB-WHFBIAKZSA-N Asn-Gly-Ser Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FTCGGKNCJZOPNB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 6
- WQLJRNRLHWJIRW-KKUMJFAQSA-N Asn-His-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O WQLJRNRLHWJIRW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 6
- LSJQOMAZIKQMTJ-SRVKXCTJSA-N Asn-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O LSJQOMAZIKQMTJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 6
- HPBNLFLSSQDFQW-WHFBIAKZSA-N Asn-Ser-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O HPBNLFLSSQDFQW-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 6
- BEHQTVDBCLSCBY-CFMVVWHZSA-N Asn-Tyr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O BEHQTVDBCLSCBY-CFMVVWHZSA-N 0.000 description 6
- WSWYMRLTJVKRCE-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ala-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WSWYMRLTJVKRCE-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 6
- QHAJMRDEWNAIBQ-FXQIFTODSA-N Asp-Arg-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O QHAJMRDEWNAIBQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 6
- UGKZHCBLMLSANF-CIUDSAMLSA-N Asp-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O UGKZHCBLMLSANF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 6
- MYLZFUMPZCPJCJ-NHCYSSNCSA-N Asp-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MYLZFUMPZCPJCJ-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 6
- FAUPLTGRUBTXNU-FXQIFTODSA-N Asp-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FAUPLTGRUBTXNU-FXQIFTODSA-N 0.000 description 6
- CUQDCPXNZPDYFQ-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O CUQDCPXNZPDYFQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 6
- UFNSPPFJOHNXRE-AUTRQRHGSA-N Gln-Gln-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O UFNSPPFJOHNXRE-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 6
- RDPOETHPAQEGDP-ACZMJKKPSA-N Glu-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RDPOETHPAQEGDP-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 6
- GFLQTABMFBXRIY-GUBZILKMSA-N Glu-Gln-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GFLQTABMFBXRIY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 6
- PXXGVUVQWQGGIG-YUMQZZPRSA-N Glu-Gly-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PXXGVUVQWQGGIG-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 6
- IVGJYOOGJLFKQE-AVGNSLFASA-N Glu-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N IVGJYOOGJLFKQE-AVGNSLFASA-N 0.000 description 6
- QOXDAWODGSIDDI-GUBZILKMSA-N Glu-Ser-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N QOXDAWODGSIDDI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 6
- TWYSSILQABLLME-HJGDQZAQSA-N Glu-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O TWYSSILQABLLME-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 6
- HGJREIGJLUQBTJ-SZMVWBNQSA-N Glu-Trp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HGJREIGJLUQBTJ-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 6
- GZUKEVBTYNNUQF-WDSKDSINSA-N Gly-Ala-Gln Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O GZUKEVBTYNNUQF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 6
- QIZJOTQTCAGKPU-KWQFWETISA-N Gly-Ala-Tyr Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 QIZJOTQTCAGKPU-KWQFWETISA-N 0.000 description 6
- VXKCPBPQEKKERH-IUCAKERBSA-N Gly-Arg-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VXKCPBPQEKKERH-IUCAKERBSA-N 0.000 description 6
- KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N Gly-Arg-Pro Natural products NCC(=O)NC(CCNC(=N)N)C(=O)N1CCCC1C(=O)O KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- AIJAPFVDBFYNKN-WHFBIAKZSA-N Gly-Asn-Asp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)CN)C(=O)N AIJAPFVDBFYNKN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 6
- DUYYPIRFTLOAJQ-YUMQZZPRSA-N Gly-Asn-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)CN DUYYPIRFTLOAJQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 6
- LXXLEUBUOMCAMR-NKWVEPMBSA-N Gly-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)CN)C(=O)O LXXLEUBUOMCAMR-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 6
- JMQFHZWESBGPFC-WDSKDSINSA-N Gly-Gln-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O JMQFHZWESBGPFC-WDSKDSINSA-N 0.000 description 6
- YYXJFBMCOUSYSF-RYUDHWBXSA-N Gly-Phe-Gln Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O YYXJFBMCOUSYSF-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 6
- JQFILXICXLDTRR-FBCQKBJTSA-N Gly-Thr-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCC(O)=O JQFILXICXLDTRR-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 6
- UMRIXLHPZZIOML-OALUTQOASA-N Gly-Trp-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)NC(=O)CN UMRIXLHPZZIOML-OALUTQOASA-N 0.000 description 6
- HTZKFIYQMHJWSQ-INTQDDNPSA-N His-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N HTZKFIYQMHJWSQ-INTQDDNPSA-N 0.000 description 6
- DMAPKBANYNZHNR-ULQDDVLXSA-N His-Val-Tyr Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N DMAPKBANYNZHNR-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 6
- LZDNBBYBDGBADK-UHFFFAOYSA-N L-valyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 LZDNBBYBDGBADK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 6
- CZCSUZMIRKFFFA-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CZCSUZMIRKFFFA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 6
- HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 6
- YKNBJXOJTURHCU-DCAQKATOSA-N Leu-Asp-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YKNBJXOJTURHCU-DCAQKATOSA-N 0.000 description 6
- OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 6
- CGHXMODRYJISSK-NHCYSSNCSA-N Leu-Val-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O CGHXMODRYJISSK-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 6
- MRWXLRGAFDOILG-DCAQKATOSA-N Lys-Gln-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O MRWXLRGAFDOILG-DCAQKATOSA-N 0.000 description 6
- VSRXPEHZMHSFKU-IUCAKERBSA-N Lys-Gln-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O VSRXPEHZMHSFKU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 6
- UQRZFMQQXXJTTF-AVGNSLFASA-N Lys-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UQRZFMQQXXJTTF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 6
- UIJVKVHLCQSPOJ-XIRDDKMYSA-N Lys-Ser-Trp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(O)=O UIJVKVHLCQSPOJ-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 6
- VHTOGMKQXXJOHG-RHYQMDGZSA-N Lys-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VHTOGMKQXXJOHG-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 6
- UNPGTBHYKJOCCZ-DCAQKATOSA-N Met-Lys-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O UNPGTBHYKJOCCZ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 6
- XPVCDCMPKCERFT-GUBZILKMSA-N Met-Ser-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O XPVCDCMPKCERFT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 6
- FXBKQTOGURNXSL-HJGDQZAQSA-N Met-Thr-Glu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O FXBKQTOGURNXSL-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 6
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 6
- 108010066427 N-valyltryptophan Proteins 0.000 description 6
- AYPMIIKUMNADSU-IHRRRGAJSA-N Phe-Arg-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AYPMIIKUMNADSU-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 6
- XMPUYNHKEPFERE-IHRRRGAJSA-N Phe-Asp-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 XMPUYNHKEPFERE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 6
- WDOCBGZHAQQIBL-IHPCNDPISA-N Phe-Trp-Ser Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 WDOCBGZHAQQIBL-IHPCNDPISA-N 0.000 description 6
- APMXLWHMIVWLLR-BZSNNMDCSA-N Phe-Tyr-Ser Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 APMXLWHMIVWLLR-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 6
- CYQQWUPHIZVCNY-GUBZILKMSA-N Pro-Arg-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CYQQWUPHIZVCNY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 6
- YFNOUBWUIIJQHF-LPEHRKFASA-N Pro-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O YFNOUBWUIIJQHF-LPEHRKFASA-N 0.000 description 6
- VYWNORHENYEQDW-YUMQZZPRSA-N Pro-Gly-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 VYWNORHENYEQDW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 6
- RMJZWERKFFNNNS-XGEHTFHBSA-N Pro-Thr-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RMJZWERKFFNNNS-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 6
- SRKMDKACHDVPMD-SRVKXCTJSA-N Ser-Lys-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)N SRKMDKACHDVPMD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 6
- LVHHEVGYAZGXDE-KDXUFGMBSA-N Thr-Ala-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O LVHHEVGYAZGXDE-KDXUFGMBSA-N 0.000 description 6
- IRKWVRSEQFTGGV-VEVYYDQMSA-N Thr-Asn-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O IRKWVRSEQFTGGV-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 6
- VGYBYGQXZJDZJU-XQXXSGGOSA-N Thr-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VGYBYGQXZJDZJU-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 6
- FDALPRWYVKJCLL-PMVVWTBXSA-N Thr-His-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(O)=O FDALPRWYVKJCLL-PMVVWTBXSA-N 0.000 description 6
- MROIJTGJGIDEEJ-RCWTZXSCSA-N Thr-Pro-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 MROIJTGJGIDEEJ-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 6
- KERCOYANYUPLHJ-XGEHTFHBSA-N Thr-Pro-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O KERCOYANYUPLHJ-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 6
- JNKAYADBODLPMQ-HSHDSVGOSA-N Thr-Trp-Val Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)=CNC2=C1 JNKAYADBODLPMQ-HSHDSVGOSA-N 0.000 description 6
- CRWOSTCODDFEKZ-HRCADAONSA-N Tyr-Arg-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)C(=O)O CRWOSTCODDFEKZ-HRCADAONSA-N 0.000 description 6
- BCOBSVIZMQXKFY-KKUMJFAQSA-N Tyr-Ser-His Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N)O BCOBSVIZMQXKFY-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 6
- AZSHAZJLOZQYAY-FXQIFTODSA-N Val-Ala-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O AZSHAZJLOZQYAY-FXQIFTODSA-N 0.000 description 6
- XXROXFHCMVXETG-UWVGGRQHSA-N Val-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O XXROXFHCMVXETG-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 6
- BZWUSZGQOILYEU-STECZYCISA-N Val-Ile-Tyr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 BZWUSZGQOILYEU-STECZYCISA-N 0.000 description 6
- SVFRYKBZHUGKLP-QXEWZRGKSA-N Val-Met-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N SVFRYKBZHUGKLP-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 6
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 6
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 6
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 108010080575 glutamyl-aspartyl-alanine Proteins 0.000 description 6
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 6
- 108010010147 glycylglutamine Proteins 0.000 description 6
- 108010092114 histidylphenylalanine Proteins 0.000 description 6
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 6
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 6
- 108010038320 lysylphenylalanine Proteins 0.000 description 6
- 108010018625 phenylalanylarginine Proteins 0.000 description 6
- 108010093296 prolyl-prolyl-alanine Proteins 0.000 description 6
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 108700004896 tripeptide FEG Proteins 0.000 description 6
- 108010084932 tryptophyl-proline Proteins 0.000 description 6
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 6
- LSLIRHLIUDVNBN-CIUDSAMLSA-N Ala-Asp-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN LSLIRHLIUDVNBN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 5
- CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N Ala-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 5
- MFMDKJIPHSWSBM-GUBZILKMSA-N Ala-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O MFMDKJIPHSWSBM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 5
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 5
- NXVGBGZQQFDUTM-XVYDVKMFSA-N Asn-Ala-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N NXVGBGZQQFDUTM-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 5
- NECWUSYTYSIFNC-DLOVCJGASA-N Asp-Ala-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 NECWUSYTYSIFNC-DLOVCJGASA-N 0.000 description 5
- XYBJLTKSGFBLCS-QXEWZRGKSA-N Asp-Arg-Val Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O XYBJLTKSGFBLCS-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 5
- DGKCOYGQLNWNCJ-ACZMJKKPSA-N Asp-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DGKCOYGQLNWNCJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 5
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 5
- QPRZKNOOOBWXSU-CIUDSAMLSA-N Glu-Asp-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N QPRZKNOOOBWXSU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 5
- LGYZYFFDELZWRS-DCAQKATOSA-N Glu-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LGYZYFFDELZWRS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 5
- VDCRBJACQKOSMS-JSGCOSHPSA-N Gly-Phe-Val Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VDCRBJACQKOSMS-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 5
- ONORAGIFHNAADN-LLLHUVSDSA-N Phe-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N ONORAGIFHNAADN-LLLHUVSDSA-N 0.000 description 5
- RMKGXGPQIPLTFC-KKUMJFAQSA-N Phe-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RMKGXGPQIPLTFC-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 5
- WLYPRKLMRIYGPP-JYJNAYRXSA-N Phe-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 WLYPRKLMRIYGPP-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 5
- CGBYDGAJHSOGFQ-LPEHRKFASA-N Pro-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 CGBYDGAJHSOGFQ-LPEHRKFASA-N 0.000 description 5
- XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 5
- VYVBSMCZNHOZGD-RCWTZXSCSA-N Thr-Val-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VYVBSMCZNHOZGD-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 5
- UIRPULWLRODAEQ-QEJZJMRPSA-N Trp-Ser-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 UIRPULWLRODAEQ-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 5
- APQIVBCUIUDSMB-OSUNSFLBSA-N Val-Ile-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N APQIVBCUIUDSMB-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 5
- 108010069020 alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 5
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 4
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 4
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 4
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- JTWZNMUVQWWGOX-SOUVJXGZSA-N Gln-Tyr-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)C(=O)O JTWZNMUVQWWGOX-SOUVJXGZSA-N 0.000 description 4
- DNAZKGFYFRGZIH-QWRGUYRKSA-N Gly-Tyr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 DNAZKGFYFRGZIH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 4
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 4
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 3
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 description 3
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 3
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 3
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 3
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 3
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 3
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 3
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- NEAQRZUHTPSBBM-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3,3-dimethyl-7-nitro-4h-isoquinolin-1-one Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C=C2C(=O)N(O)C(C)(C)CC2=C1 NEAQRZUHTPSBBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100034042 Alcohol dehydrogenase 1C Human genes 0.000 description 2
- 241001513093 Aspergillus awamori Species 0.000 description 2
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 2
- 241000193752 Bacillus circulans Species 0.000 description 2
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 description 2
- 241000193422 Bacillus lentus Species 0.000 description 2
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 2
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 2
- 101000796894 Coturnix japonica Alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 2
- VOLVNCMGXWDDQY-LPEHRKFASA-N Gln-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)C(=O)O VOLVNCMGXWDDQY-LPEHRKFASA-N 0.000 description 2
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 2
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 2
- GWCRIHNSVMOBEQ-BQBZGAKWSA-N Gly-Arg-Ser Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GWCRIHNSVMOBEQ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 101000780463 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1C Proteins 0.000 description 2
- 101000958041 Homo sapiens Musculin Proteins 0.000 description 2
- 101000801742 Homo sapiens Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 2
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 2
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N N-ethyl-succinimide Natural products CCN1C(=O)CCC1=O GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N N-ethylmaleimide Chemical compound CCN1C(=O)C=CC1=O HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- 241000223258 Thermomyces lanuginosus Species 0.000 description 2
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100033598 Triosephosphate isomerase Human genes 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 101150021650 gluA gene Proteins 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 102000046949 human MSC Human genes 0.000 description 2
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005891 transamination reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 229960004418 trolamine Drugs 0.000 description 2
- NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- UYBWIEGTWASWSR-UHFFFAOYSA-N 1,3-diaminopropan-2-ol Chemical compound NCC(O)CN UYBWIEGTWASWSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000981 3-amino-3-oxopropyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 1
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SDZRIBWEVVRDQI-CIUDSAMLSA-N Ala-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O SDZRIBWEVVRDQI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 101000757144 Aspergillus niger Glucoamylase Proteins 0.000 description 1
- 101900318521 Aspergillus oryzae Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 1
- 101150071434 BAR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 1
- 241000149420 Bothrometopus brevis Species 0.000 description 1
- 101100280051 Brucella abortus biovar 1 (strain 9-941) eryH gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000898643 Candida albicans Vacuolar aspartic protease Proteins 0.000 description 1
- 101000898783 Candida tropicalis Candidapepsin Proteins 0.000 description 1
- 101710113783 Candidapepsin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 208000036086 Chromosome Duplication Diseases 0.000 description 1
- 102100030563 Coagulation factor XI Human genes 0.000 description 1
- 101000898784 Cryphonectria parasitica Endothiapepsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010074864 Factor XI Proteins 0.000 description 1
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 1
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 1
- JJKKWYQVHRUSDG-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Lys Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O JJKKWYQVHRUSDG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ATRHMOJQJWPVBQ-DRZSPHRISA-N Glu-Ala-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O ATRHMOJQJWPVBQ-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- DYFJZDDQPNIPAB-NHCYSSNCSA-N Glu-Arg-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O DYFJZDDQPNIPAB-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- AKJRHDMTEJXTPV-ACZMJKKPSA-N Glu-Asn-Ala Chemical compound C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C(O)=O AKJRHDMTEJXTPV-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- HJIFPJUEOGZWRI-GUBZILKMSA-N Glu-Asp-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N HJIFPJUEOGZWRI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000125500 Hedypnois rhagadioloides Species 0.000 description 1
- RXVOMIADLXPJGW-GUBZILKMSA-N His-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O RXVOMIADLXPJGW-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 101000741885 Homo sapiens Protection of telomeres protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 241000235087 Lachancea kluyveri Species 0.000 description 1
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 description 1
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXUCYYZNZFGLL-SRVKXCTJSA-N Lys-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KCXUCYYZNZFGLL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 241000235395 Mucor Species 0.000 description 1
- 101100235161 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) lerI gene Proteins 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N N-acetyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(C)=O XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 241000269887 Notothenia angustata Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 101100378536 Ovis aries ADRB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000194109 Paenibacillus lautus Species 0.000 description 1
- OQTDZEJJWWAGJT-KKUMJFAQSA-N Phe-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O OQTDZEJJWWAGJT-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- KAJLHCWRWDSROH-BZSNNMDCSA-N Phe-Phe-Asp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 KAJLHCWRWDSROH-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- VIIRRNQMMIHYHQ-XHSDSOJGSA-N Phe-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N VIIRRNQMMIHYHQ-XHSDSOJGSA-N 0.000 description 1
- JARJPEMLQAWNBR-GUBZILKMSA-N Pro-Asp-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JARJPEMLQAWNBR-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100038745 Protection of telomeres protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108030001310 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000235403 Rhizomucor miehei Species 0.000 description 1
- 101000933133 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000910082 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000910079 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000910086 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000910088 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-5 Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 101000898773 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Saccharopepsin Proteins 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N Senegenin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@](C)(C(O)=O)[C@@H]2CC[C@@]3(C)C(CC[C@]4(CCC(C[C@H]44)(C)C)C(O)=O)=C4[C@@H](CCl)C[C@@H]3[C@]21C CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N 0.000 description 1
- BYIROAKULFFTEK-CIUDSAMLSA-N Ser-Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO BYIROAKULFFTEK-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- QMCDMHWAKMUGJE-IHRRRGAJSA-N Ser-Phe-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QMCDMHWAKMUGJE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 description 1
- 101000837751 Streptomyces mobaraensis Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241001468239 Streptomyces murinus Species 0.000 description 1
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 description 1
- 101150033985 TPI gene Proteins 0.000 description 1
- 108700007696 Tetrahydrofolate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- XYFISNXATOERFZ-OSUNSFLBSA-N Thr-Ile-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N XYFISNXATOERFZ-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- 229940098113 Transglutaminase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- RNDWCRUOGGQDKN-UBHSHLNASA-N Trp-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RNDWCRUOGGQDKN-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- GITNQBVCEQBDQC-KKUMJFAQSA-N Tyr-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GITNQBVCEQBDQC-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 108091034131 VA RNA Proteins 0.000 description 1
- JVGDAEKKZKKZFO-RCWTZXSCSA-N Val-Val-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O JVGDAEKKZKKZFO-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 108010048241 acetamidase Proteins 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical group C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960003311 ampicillin trihydrate Drugs 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 229940054340 bacillus coagulans Drugs 0.000 description 1
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000002478 diastatic effect Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-FWAVGLHBSA-N hygromycin A Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](C(=O)C)O[C@@H]1Oc1ccc(\C=C(/C)C(=O)N[C@@H]2[C@@H]([C@H]3OCO[C@H]3[C@@H](O)[C@@H]2O)O)cc1O YQYJSBFKSSDGFO-FWAVGLHBSA-N 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 108010090785 inulinase Proteins 0.000 description 1
- 150000004698 iron complex Chemical class 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002923 oximes Chemical class 0.000 description 1
- 229940049547 paraxin Drugs 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229940081969 saccharomyces cerevisiae Drugs 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000009871 tenuigenin Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 101150080369 tpiA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
- C12N9/1044—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII
Abstract
本发明提供得自茂原链霉菌(S.mobaraense)的转谷氨酰胺酶的变异体，该变异体对于人生长激素的Gln－40或Gln－141的选择性得到改进。
Description
本明领域
本发明涉及来自茂原链霉菌(Streptomyces mobaraense)的转谷氨酰胺酶新的变异体。这种变异体可用于修饰肽以改进选择性。
发明背景
通过将基团与肽缀合，适当改变性质，从而改变所述蛋白质的性质和特征是众所周知的。特别是对于治疗肽，可能需要或者甚至是必需将基团与所述肽缀合，延长肽的半寿期。这种缀合基团通常是聚乙二醇(PEG)或脂肪酸-参见J.Biol.Chem.271，21969-21977(1996)。
以前曾经用转谷氨酰胺酶(TGase)改变肽的性质。在食品工业中，特别是在乳品工业中有应用许多技术，例如使用转谷氨酰胺酶使肽交联。其它文献公开了转谷氨酰胺酶改变生理活性肽性质的用途。EP950665、EP 785276和Sato，Adv.Drug Delivery Rev.54，487-504(2002)公开了在转谷氨酰胺酶存在下，包含至少一个Gln的肽与胺官能化PEG或类似配体之间的直接反应，Wada(Biotech.Lett.23，1367-1372(2001))公开了β-乳球蛋白与脂肪酸通过转谷氨酰胺酶的直接缀合。国际专利申请WO2005070468公开了转谷氨酰胺酶可用来将官能团掺入到含有谷氨酰胺的肽中形成官能化肽，这种官能化肽在随后的步骤中，可与例如能够与所述官能化蛋白反应的聚乙二醇进行反应，形成聚乙二醇化肽(PEGylated peptide)。
转谷氨酰胺酶(E.C.2.3.2.13)亦称蛋白质-谷氨酰胺-γ-谷氨酰转移酶，催化以下通用反应：
其中Q-C(O)-NH2可表示含有谷氨酰胺的肽，Q’-NH2则表示在上述反应中提供掺入肽的官能团的胺供体。
体内常见的胺供体是与肽结合的赖氨酸，上述反应则提供交联的肽。凝血因子-因子XIII是在受伤时实现血液凝结的转谷氨酰胺酶。不同的转谷氨酰胺酶间彼此也存在差别，例如在Gln周围的氨基酸残基需要蛋白质作为底物，也就是说不同的转谷氨酰胺酶将有不同的含有Gln的肽作为底物，这取决于与Gln残基相邻的氨基酸残基。如果将被修饰的肽含有一个以上的Gln残基，则可以利用这一方面。如果需要选择性地将肽仅在某些Gln残基上缀合，则表示可以选择出仅接受相关Gln残基作为底物的转谷氨酰胺酶来获得这种选择性。
人生长激素(hGH)含有11个谷氨酰胺残基，因此，任何转谷氨酰胺酶介导的hGH缀合都可能因选择性低而受到妨碍。已经发现在某些反应条件下，上述两步缀合反应，在茂原链霉菌转谷氨酰胺酶介导的反应中使hGH官能化，可以在两个位置，即40-Gln和141-Gln上产生官能化hGH。因此，需要鉴定能介导特异性较高的hGH官能化的转谷氨酰胺酶变异体。
发明概述
本发明的发明人预料不到地发现，在得自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶上，某些氨基酸残基的取代提供介导特异性较高的官能化hGH的转谷氨酰胺酶。
在一个实施方案中，本发明涉及得自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶(SEQ ID No.1)，其中多至3个酸性或碱性氨基酸残基被其它碱性或酸性氨基酸残基取代。
在一个实施方案中，本发明涉及分离肽，该分离肽包含与得自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶氨基酸序列有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Asp-4、Val-30、Tyr-62、Tyr-75、Arg-89、Glu-115、Ser-210、Asp-221、Ala-226、Pro-227、Gly-250、Val-252、Asn-253、Phe-254、His-277、Tyr-278、Leu-285、Tyr-302、Asp-304和Lys-327。
在一个实施方案中，本发明涉及得自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶(SEQ ID No.1)，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Asp-4、Val-30、Tyr-75、Arg-89、Glu-115、Ser-210、Asp-221、Ala-226、Pro-227、Gly-250、Tyr-302、Asp-304和Lys-327。
在一个实施方案中，本发明涉及SEQ ID No.1中所限定的肽，该肽包含一种或多种以下的取代：Tyr-75→酸性氨基酸残基；Tyr-302→碱性氨基酸残基；和Asp-304→碱性氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明涉及编码本发明肽的核酸构建体。
在一个实施方案中，本发明涉及包含编码本发明肽的核酸的载体。
在一个实施方案中，本发明涉及包含载体的宿主，该载体包含编码本发明肽的核酸。
在一个实施方案中，本发明涉及包含本发明肽的组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及缀合hGH的方法，该方法包括在本发明的肽存在下，使hGH与胺供体反应。
附图简述
图1表示上述得自茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)的转谷氨酰胺酶序列与上述得自拉达卡链轮丝菌(Streptoverticilliumladakanum)的转谷氨酰胺酶序列的序列比对。
图2是典型的毛细管电泳分析图，表示转谷氨酰胺酶催化的hGH与1，3-二氨基-2-丙醇的转谷氨酰胺作用。
图3是由拉达卡链轮丝菌转谷氨酰胺酶催化的hGH突变型反应混合物的HPLC分析。上图：hGH-Q40N。第一峰(26.5分钟，面积1238)是产物-Q141，第二峰(29.7分钟，面积375)是剩余的hGH-Q40N。下图：hGH-Q141N。第一峰(19.2分钟，面积127)是产物-Q40，第二峰(30.3分钟，面积1158)是剩余的hGH-Q141N。
图4是茂原链霉菌转谷氨酰胺酶催化的hGH突变型反应混合物的HPLC分析。上图：hGH-Q40N。第一峰(26.9分钟，面积1283)是产物-Q141，第二峰(30.1分钟，面积519)是剩余的hGH-Q40N。下图：hGH-Q141N。第一峰(19.5分钟，面积296)是产物-Q40，第二峰(30.6分钟，面积1291)是剩余的hGH-Q141N。
发明详述
本文中，术语“酸性氨基酸残基”是指pKa＜7的天然氨基酸残基。具体的实例包括Asp和Glu。
本文中，术语“碱性氨基酸残基”是指pKa＞7的天然氨基酸残基。具体的实例包括Tyr、Lys和Arg。
本文中，“转氨基作用”或类似术语是指其中谷氨酰胺侧链上的氮与另一种化合物的氮，特别是与另一种含氮亲核试剂的氮进行交换的反应。
术语“缀合(conjugate)”作为名词时是指修饰肽，即肽具有与其键合的部分，可改变所述肽的性质。作为动词时，该术语是指将某一部分与肽键合以改变所述肽的性质的方法。
本文中，术语“特异性”和“选择性”可互换使用，以描述与hGH上的其它特异性谷氨酰胺残基相比时，转谷氨酰胺酶优先与hGH上的一个或多个谷氨酰胺残基反应。对本说明书来说，根据按实施例3所述方法测定肽的结果，来确定与hGH上的Gln141相比时，本发明的肽对Gln-40的特异性。
微生物茂原链霉菌(Streptomyces mobaraense)在分类学上亦称茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)。可从该生物分离出转谷氨酰胺酶，该转谷氨酰胺酶以相对低的分子量(～38kDa)和不依赖钙为特征。已经对得自茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶进行了相对全面的描述；例如已经对其晶体结构进行了解析(US 156956；Appl.Microbiol.Biotech.64，447-454(2004))。
从拉达卡链轮丝菌分离的转谷氨酰胺酶序列的氨基酸序列与得自茂原链轮丝菌的序列，除了两个序列之间总共有22个氨基酸的差异之外，其余的均相同(Yi-Sin Lin等，Process Biochemistry 39(5)，591-598(2004))。得自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶的序列见SEQ ID No.1，得自拉达卡链轮丝菌的转谷氨酰胺酶序列见SEQ ID No.6，图1表示上述得自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶序列与上述得自拉达卡链轮丝菌的转谷氨酰胺酶的序列比对。
一种制备缀合hGH的方法包括hGH与包含胺供体的官能团之间的第一反应以提供官能化hGH，所述第一反应是由转谷氨酰胺酶介导(即催化)的。第二反应步骤中，使所述官能化hGH与例如能够与所述所掺入的官能团反应的PEG或脂肪酸进一步反应，以提供缀合的hGH。第一反应图示如下。
X表示官能团或潜在官能团，即在进一步反应时(例如氧化或水解)转变成官能团的基团。
如果上述反应是由得自茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶介导的，则hGH与H2N-X(胺供体)之间的反应主要发生在Gln-40和Gln-141上。例如，可以利用上述反应使hGH聚乙二醇化以得到具有半寿期延长的治疗性生长激素产物。因为一般认为需要的是治疗组合物为单一化合物的组合物，所以上述产物缺乏特异性，需要进一步的纯化步骤，将Gln-40官能化hGH与Gln-141官能化hGH和/或Gln-40/Gln-141双官能化hGH分离开来。
WO2005/070468和WO2006EP063246中全面介绍了转谷氨酰胺酶在人生长激素缀合中的这种应用。
本发明的肽对于hGH的Gln-40与Gln-141相比具有特异性，这种特异性不同于按实施例3所述方法测定的具有SEQ ID No.1中所示氨基酸序列的肽对于Gln-40与Gln-141相比的特异性。因此，本发明的肽可用于使hGH转谷氨酰胺化的方法，以在与用具有SEQ ID No.1氨基酸序列的转谷氨酰胺酶的反应相比时，增加Gln-40官能化hGH或Gln-141官能化hGH的产生。
在一个实施方案中，本发明提供分离肽，该分离肽包含与SEQ IDNo.1的氨基酸序列有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Asp-4、Val-30、Tyr-62、Tyr-75、Arg-89、Glu-115、Ser-210、Asp-221、Ala-226、Pro-227、Gly-250、Val-252、Asn-253、Phe-254、His-277、Tyr-278、Leu-285、Tyr-302、Asp-304和Lys-327。
本领域所知术语“同一性”是指两个或更多个肽序列间的关系，通过比较序列来确定。本领域中，“同一性”还指肽之间序列相关性的程度，通过两个或更多个氨基酸残基的序列段之间的匹配数目确定。“同一性”测量较小的两个或更多个序列相同匹配的百分比，该序列带有由具体的数学模型或计算机程序(即“算法”)得出的空位比对(如果有的话)。可以通过已知方法容易地计算出相关肽的同一性。这些方法包括但不限于以下文献记载的方法：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.主编，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.主编，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，第1部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.主编，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.主编，M.Stockton Press，New York，1991；和Carillo等，SIAM J.Applied Math.48，1073(1988)。
测定同一性优选的方法是得出所测序列间的最大匹配。测定同一性的方法见可公开获取的计算机程序。测定两个序列间同一性的优选的计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Devereux等，Nucl.Acid.Res.12，387(1984)；Genetics Computer Group，University ofWisconsin，Madison，Wis.)，BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等，J.Mol.Biol.215，403-410(1990))。BLASTX程序可公开获自美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)和其它来源(BLAST Manual，Altschul等，NCB/NLM/NIHBethesda，Md.20894；Altschul等，同上)。众所周知的Smith Waterman算法也可用于测定同一性。
例如，运用计算机算法GAP(Genetics Computer Group，Universityof Wisconsin，Madison，Wis.)，对待测定序列同一性百分比的两个肽进行其相应氨基酸最佳匹配的比对(“匹配跨距(matched span)”，由算法确定)。空位引入罚分(gap opening penalty)(经计算为平均对角线(averagediagonal)的三倍；“平均对角线”是所用比较矩阵对角线的平均；“对角线”是通过具体比较矩阵赋予每个完全匹配氨基酸的分值或数目)和空位延伸罚分(通常是空位引入罚分的{分值(1/10)}倍数)以及比较矩阵(例如PAM 250或BLOSUM 62)与算法结合使用。算法还利用了标准比较矩阵(对于PAM 250比较矩阵参见Dayhoff等，Atlas of ProteinSequence and Structure，第5卷，增刊3(1978)；对于BLOSUM 62比较矩阵参见Henikoff等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 89，10915-10919(1992))。
肽序列比较的优选参数包括下列参数：
算法：Needleman等，J.Mol.Biol.48，443-453(1970)；比较矩阵：Henikoff等，PNAS USA 89，10915-10919(1992)的BLOSUM 62；空位罚分：12，空位长度罚分(Gap Length Penalty)：4，相似性阈值(Thresholdof Similarity)：0。
具有上述参数的GAP程序是有用的。运用GAP算法，上述参数对于肽比较是默认参数(与末端空位无罚分一起)。
在一个实施方案中，本发明的肽包含SEQ IDNo.1中所限定的氨基酸序列，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Asp-4、Val-30、Tyr-62、Tyr-75、Arg-89、Glu-115、Ser-210、Asp-221、Ala-226、Pro-227、Gly-250、Val-252、Asn-253、Phe-254、His-277、Tyr-278、Leu-285、Tyr-302、Asp-304和Lys-327。
在一个实施方案中，本发明的肽包含SEQ ID No.1中所限定的氨基酸序列，其中所述序列在位于距离Cys-64 20
以下(例如距离Cys-6415
以下)的一个或多个氨基酸残基上被修饰。
用得自茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶晶体结构，测量与Cys64的距离，参见Tatsuki Kashiwagi等，Journal of Biological Chemistry277(46)，44252-44260(2002)。原子坐标还以代码1IU4存入蛋白质数据库中。
位于距离Cys6415
以下的得自茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶氨基酸的实例包括下列氨基酸：
Arg5、Val6、Thr7、Glu28、Thr29、Val30、Val31、Tyr34、Gln56、Arg57、Glu58、Trp59、Leu60、Ser61、Tyr62、Gly63、Val65、Gly66、Val67、Thr68、Trp69、Val70、Asn71、Ser72、Gln74、Tyr75、Pro76、Thr77、Asn78、Tyrl98、Serl99、Lys200、His201、Phe202、Trp203、Asn239、Ile240、Pro241、Phe251、Val252、Asn253、Phe254、Asp255、Tyr256、Gly257、Trp258、Phe259、Trp272、Thr273、His274、Gly275、Asn276、His277、Tyr278、His279、Ala280、Leu285、Gly286、Ala287、Met288、His289、Val290、Tyr291、Glu292、Ser293、Asn297、Trp298、Ser299、Gly301、Tyr302、Asp304、Phe305、Gly308和Ala309。
在一个实施方案中，本发明的肽包含SEQ ID No.1中所限定的氨基酸序列，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Asp-4、Arg-89、Glu-115、Ser-210、Asp-221和Lys-327。
在一个实施方案中，本发明的肽包含SEQ ID No.1中所限定的氨基酸序列，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Ala-226和Pro-227。
在一个实施方案中，本发明的肽包含SEQ ID No.1中所限定的氨基酸序列，其中所述序列在Tyr-75上被修饰。
在一个实施方案中，本发明的肽包含SEQ ID No.1中所限定的氨基酸序列，其中所述序列在Tyr-302上被修饰。
在一个实施方案中，本发明的肽包含SEQ ID No.1中所限定的氨基酸序列，其中所述序列在Asp-304上被修饰。
在一个实施方案中，本发明的肽包含SEQ ID No.1中所限定的氨基酸序列，其中所述序列如SEQ ID No.6中限定。
在一个实施方案中，本发明的肽对于hGH的Gln-40与hGH的Gln-141相比时具有特异性，该特异性不同于具有SEQ ID No.1中所示氨基酸序列的肽对于hGH的Gln-40与hGH的Gln-141相比时的特异性。
在一个实施方案中，本发明的肽对于Gln-40与Gln-141相比时的特异性，比具有SEQ ID No.1中所示氨基酸序列的肽对于Gln-40与Gln-141相比时的特异性高，这导致在用本文所述转谷氨酰胺酶的转谷氨酰胺酶反应中，Gln-40的产生与Gln-141相比时增加。
在一个实施方案中，本发明的肽对于Gln-40与Gln-141相比时的特异性，比具有SEQ ID No.1中所示氨基酸序列的肽对于Gln-40与Gln-141相比时的特异性高至少1.25倍，例如至少1.50倍、例如至少1.75倍、例如至少2.0倍、例如至少2.5倍、例如至少3.0倍、例如至少3.5倍、例如至少4.0倍、例如至少4.5倍、例如至少5.0倍、例如至少5.5倍、例如至少6.0倍、例如至少6.5倍、例如至少7.0倍、例如至少7.5倍、例如至少8.0倍、例如至少8.5倍、例如至少9.0倍、例如至少9.5倍、例如至少10.0倍。
在一个实施方案中，本发明的肽对于Gln-141与Gln-40相比时的特异性，比具有SEQ ID No.1中所示氨基酸序列的肽对于Gln-141与Gln-40相比时的特异性高，这导致在用本文所述转谷氨酰胺酶的转谷氨酰胺酶反应中，Gln-141的产生与Gln-40相比时增加。
在一个实施方案中，本发明的肽对于Gln-141与Gln-40相比时的特异性，比具有SEQ ID No.1中所示氨基酸序列的肽对于Gln-141与Gln-40相比时的特异性高至少1.25倍，例如至少1.50倍、例如至少1.75倍、例如至少2.0倍、例如至少2.5倍、例如至少3.0倍、例如至少3.5倍、例如至少4.0倍、例如至少4.5倍、例如至少5.0倍、例如至少5.5倍、例如至少6.0倍、例如至少6.5倍、例如至少7.0倍、例如至少7.5倍、例如至少8.0倍、例如至少8.5倍、例如至少9.0倍、例如至少9.5倍、例如至少10.0倍。
在一个实施方案中，本发明提供对于hGH的Gln-40与hGH的Gln-141相比时具有特异性的转谷氨酰胺酶肽，该特异性不同于具有SEQ ID No.1中所示氨基酸序列的肽对于hGH的Gln-40与hGH的Gln-141相比时的特异性。
在一个实施方案中，本发明提供对于hGH的Gln-40与hGH的Gln-141相比时具有特异性的转谷氨酰胺酶肽，该特异性比具有SEQID No.1中所示氨基酸序列的肽对于hGH的Gln-40与hGH的Gln-141相比时的特异性高。
在一个实施方案中，本发明提供对于hGH的Gln-141与hGH的Gln-40相比时具有特异性的转谷氨酰胺酶肽，该特异性比具有SEQ IDNo.1中所示氨基酸序列的肽对于hGH的Gln-141与hGH的Gln-40相比时的特异性高。
在一个实施方案中，本发明提供编码本发明肽的核酸构建体。
在一个实施方案中，本发明提供包含本发明核酸构建体的载体。
在一个实施方案中，本发明提供包含本发明载体的宿主。
在一个实施方案中，本发明提供包含本发明肽的组合物。
在一个实施方案中，本发明提供用于缀合hGH的方法，其中所述方法包括在本发明肽的存在下，使所述hGH与胺供体反应。
在一个实施方案中，本发明提供本发明的肽在制备缀合hGH中的用途。
下面是本发明实施方案的非限制性一览：
实施方案1：一种分离肽，该肽包含与SEQ ID No.1的氨基酸序列有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Asp-4、Val-30、Tyr-62、Tyr-75、Arg-89、Glu-115、Ser-210、Asp-221、Ala-226、Pro-227、Gly-250、Val-252、Asn-253、Phe-254、His-277、Tyr-278、Leu-285、Tyr-302、Asp-304和Lys-327。
实施方案2：实施方案1的分离肽，该肽包含与SEQ ID No.1的氨基酸序列有至少85％同一性的氨基酸序列，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Asp-4、Val-30、Tyr-62、Tyr-75、Arg-89、Glu-115、Ser-210、Asp-221、Ala-226、Pro-227、Gly-250、Val-252、Asn-253、Phe-254、His-277、Tyr-278、Leu-285、Tyr-302、Asp-304和Lys-327。
实施方案3：实施方案2的分离肽，该肽包含与SEQ ID No.1的氨基酸序列有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Asp-4、Val-30、Tyr-62、Tyr-75、Arg-89、Glu-115、Ser-210、Asp-221、Ala-226、Pro-227、Gly-250、Val-252、Asn-253、Phe-254、His-277、Tyr-278、Leu-285、Tyr-302、Asp-304和Lys-327。
实施方案4：实施方案3的分离肽，该肽包含与SEQ ID No.1的氨基酸序列有至少95％同一性的氨基酸序列，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Asp-4、Val-30、Tyr-62、Tyr-75、Arg-89、Glu-115、Ser-210、Asp-221、Ala-226、Pro-227、Gly-250、Val-252、Asn-253、Phe-254、His-277、Tyr-278、Leu-285、Tyr-302、Asp-304和Lys-327。
实施方案5：实施方案4的分离肽，该肽包含SEQ ID No.1中所限定的氨基酸序列，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Asp-4、Val-30、Tyr-62、Tyr-75、Arg-89、Glu-115、Ser-210、Asp-221、Ala-226、Pro-227、Gly-250、Val-252、Asn-253、Phe-254、His-277、Tyr-278、Leu-285、Tyr-302、Asp-304和Lys-327。
实施方案6：实施方案1-5中任一项的分离肽，其中所述序列在Gly-250上被修饰。
实施方案7：实施方案6的分离肽，其中Gly-250被Thr取代。
实施方案8：实施方案6的分离肽，其中Gly-250被Ser取代。
实施方案9：实施方案1-8中任一项的分离肽，其中所述序列在位于距离Cys-6420以下的一个或多个氨基酸残基上被修饰。
实施方案10：实施方案1-9中任一项的分离肽，其中所述序列在位于距离Cys-6415
以下的一个或多个氨基酸残基上被修饰。
实施方案11：实施方案10的分离肽，其中序列在Cys64位上不被修饰。
实施方案12：实施方案10或实施方案11的分离肽，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Val-30、Tyr-62、Val-252、Asn-253、Phe-254、His-277、Tyr-278和Leu-285。
实施方案13：实施方案12的分离肽，其中所述序列在Tyr-62上被修饰。
实施方案14：实施方案12或实施方案13的分离肽，其中所述序列在His-277和/或Tyr-278上被修饰。
实施方案15：实施方案12-14中任一项的分离肽，其中所述序列在Leu-285上被修饰。
实施方案16：实施方案12-15中任一项的分离肽，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Val-252、Asn-253和Phe-254。
实施方案17：实施方案10-16中任一项的分离肽，其中所述序列在Val-30上被修饰。
实施方案18：实施方案17的分离肽，其中Val-30被Ile取代。
实施方案19：实施方案1-18中任一项的分离肽，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Asp-4、Arg-89、Glu-115、Ser-210、Asp-221和Lys-327。
实施方案20：实施方案19的分离肽，其中Asp-4被Glu取代。
实施方案21：实施方案19或实施方案20的分离肽，其中Asp-4被Glu取代，1、2和3位上的氨基酸缺失。
实施方案22：实施方案19-21中任一项的分离肽，其中Arg-89被Lys取代。
实施方案23：实施方案19-22中任一项的分离肽，其中Glu-115被Asp取代。
实施方案24：实施方案19-23中任一项的分离肽，其中Ser-210被Gly取代。
实施方案25：实施方案19-24中任一项的分离肽，其中Asp-221被Ser取代。
实施方案26：实施方案19-25中任一项的分离肽，其中Lys-327被Thr取代。
实施方案27：实施方案1-26中任一项的分离肽，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Ala-226和Pro-227。
实施方案28：实施方案27的分离肽，其中Ala-226被Asp取代。
实施方案29：实施方案27的分离肽，其中Pro-227被Arg取代。
实施方案30：实施方案1-29中任一项的分离肽，其中所述序列在Tyr-75上被修饰。
实施方案31：实施方案30的分离肽，其中Tyr-75被不同于Glu的氨基酸取代。
实施方案32：实施方案31的分离肽，其中Tyr-75被不同于Asp或Glu的氨基酸取代。
实施方案33：实施方案32的分离肽，其中Tyr-75被不同于酸性氨基酸残基的氨基酸取代。
实施方案34：实施方案30的分离肽，其中Tyr-75被酸性氨基酸残基取代。
实施方案35：实施方案34的分离肽，其中Tyr-75被Asp或Glu取代。
实施方案36：实施方案35的分离肽，其中Tyr-75被Glu取代。
实施方案37：实施方案1-36中任一项的分离肽，其中所述序列在Tyr-302上被修饰。
实施方案38：实施方案37的分离肽，其中Tyr-302被不同于Tyr的碱性氨基酸残基取代。
实施方案39：实施方案38的分离肽，其中Tyr-302被Arg或Lys取代。
实施方案40：实施方案39的分离肽，其中Tyr-302被Arg取代。
实施方案41：实施方案1-40中任一项的分离肽，其中所述序列在Asp-304上被修饰。
实施方案42：实施方案41的分离肽，其中Asp-304被碱性氨基酸残基取代。
实施方案43：实施方案42的分离肽，其中Asp-304被Tyr、Lys或Arg取代。
实施方案44：实施方案43的分离肽，其中Asp-304被Lys取代。
实施方案45：实施方案36的分离肽，该肽具有SEQ ID No.2中所限定的序列。
实施方案46：实施方案40的分离肽，该肽具有SEQ ID No.3中所限定的序列。
实施方案47：实施方案44的分离肽，该肽具有SEQ ID No.4中所限定的序列。
实施方案48：实施方案30-44中任一项的分离肽，该肽具有SEQ
ID No.5中所限定的序列。
实施方案49：一种分离肽，该肽包含与SEQ ID No.6的氨基酸序列有至少80％同一性的氨基酸序列。
实施方案50：实施方案49的分离肽，该肽包含与SEQ ID No.6的氨基酸序列有至少85％同一性的氨基酸序列。
实施方案51：实施方案50的分离肽，该肽包含与SEQ ID No.6的氨基酸序列有至少90％同一性的氨基酸序列。
实施方案52：实施方案51的分离肽，该肽包含与SEQ ID No.6的氨基酸序列有至少95％同一性的氨基酸序列。
实施方案53：实施方案52的分离肽，该肽包含SEQ ID No.6中所限定的氨基酸序列。
实施方案54：一种肽，该肽具有SEQ ID No.1中所限定的序列，该序列包含一种或多种以下的取代：Tyr-75→酸性氨基酸残基；Tyr-302→不是Tyr的碱性氨基酸残基；和Asp-304→碱性氨基酸残基。
实施方案55：实施方案54的肽，该肽具有SEQ ID No.1中所限定的序列，该序列包含一种或多种以下的取代：Tyr-75→Asp或Glu；Tyr-302→Arg或Lys；和Asp-304→Tyr、Lys或Arg。
实施方案56：实施方案54或实施方案55的肽，该肽具有SEQ IDNo.1中所限定的序列，该序列包含一种或多种以下的取代：Tyr-75→Glu；Tyr-302→Arg；和Asp-304→Lys。
实施方案57：实施方案54-56中任一项的肽，其中序列如SEQ IDNo.2中限定。
实施方案58：实施方案54-56中任一项的肽，其中序列如SEQ IDNo.3中限定。
实施方案59：实施方案54-56中任一项的肽，其中序列如SEQ IDNo.4中限定。
实施方案60：实施方案54的肽，其中序列如SEQ ID No.5中限定。
实施方案61：实施方案54-60中任一项的肽，其中所述肽是分离肽。
实施方案62：实施方案1-61中任一项的分离肽，该肽具有转谷氨酰胺酶活性。
实施方案63：实施方案1-62中任一项的分离肽，该肽对于hGH的Gln-40与hGH的Gln-141相比时具有特异性，该特异性不同于具有SEQ ID No.1中所示氨基酸序列的肽对于hGH的Gln-40与hGH的Gln-141相比时的特异性。
实施方案64：实施方案63的分离肽，该肽对于hGH的Gln-40与hGH的Gln-141相比时具有特异性，该特异性比具有SEQ ID No.1中所示氨基酸序列的肽对于hGH的Gln-40与hGH的Gln-141相比时的特异性高。
实施方案65：实施方案63的分离肽，该肽对于hGH的Gln-141与hGH的Gln-40相比时具有特异性，该特异性比具有SEQ ID No.1中所示氨基酸序列的肽对于hGH的Gln-141与hGH的Gln-40相比时的特异性高。
实施方案66：实施方案65的分离肽，前提条件是所述修饰不只是由Tyr-75上的取代和/或Tyr-302上的取代和/或Asp-304上的取代组成。
实施方案67：实施方案65的分离肽，前提条件是所述修饰不只是由Tyr-75被酸性氨基酸残基取代、和/或Tyr-302上的取代和/或Asp-304上的取代组成。
实施方案68：实施方案65的分离肽，前提条件是所述修饰不只是由Tyr-75被Asp或Glu取代、和/或Tyr-302上的取代和/或Asp-304上的取代组成。
实施方案69：实施方案65的分离肽，前提条件是所述修饰不只是由Tyr-75被Glu取代、和/或Tyr-302上的取代和/或Asp-304上的取代组成。
实施方案70：实施方案65的分离肽，前提条件是所述修饰不只是由Tyr-302被不同于Tyr的碱性氨基酸残基取代、和/或Tyr-75上的取代和/或Asp-304上的取代组成。
实施方案71：实施方案65的分离肽，前提条件是所述修饰不只是由Tyr-302被Arg或Lys取代、和/或Tyr-75上的取代和/或Asp-304上的取代组成。
实施方案72：实施方案65的分离肽，前提条件是所述修饰不只是由Tyr-302被Arg取代、和/或Tyr-75上的取代和/或Asp-304上的取代组成。
实施方案73：实施方案65的分离肽，前提条件是所述修饰不只是由Asp-304被不同于Tyr的碱性氨基酸残基取代、和/或Tyr-75上的取代和/或Tyr-302上的取代组成。
实施方案74：实施方案65的分离肽，前提条件是所述修饰不只是由Asp-304被Tyr、Arg或Lys取代、和/或Tyr-75上的取代和/或Tyr-302上的取代组成。
实施方案75：实施方案65的分离肽，前提条件是所述修饰不只是由Asp-304被Lys取代、和/或Tyr-75上的取代和/或Tyr-302上的取代组成。
实施方案76：实施方案65的分离肽，前提条件是所述修饰序列不是SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5。
实施方案77：实施方案65的分离肽，前提条件是所述修饰不只是由Tyr-75被酸性氨基酸残基取代、和/或Tyr-302被不是Tyr的碱性氨基酸残基取代、和/或Asp-304被碱性氨基酸残基取代组成。
实施方案78：实施方案65的分离肽，前提条件是所述修饰不只是由Tyr-75被Asp或Glu取代、和/或Tyr-302被Arg或Lys取代、和/或Asp-304被Tyr、Lys或Arg取代组成。
实施方案79：实施方案65的分离肽，前提条件是所述修饰不只是由Tyr-75被Glu取代、和/或Tyr-302被Arg取代、和/或Asp-304被Lys取代组成。
实施方案80：实施方案65的分离肽，前提条件是所述修饰不只是由Tyr-75被Glu取代和Tyr-302被Arg取代组成。
实施方案81：实施方案65的分离肽，前提条件是所述序列不包括与SEQ ID No.1相比正好一个单突变，该单突变是Tyr-75上的突变。
实施方案82：实施方案65的分离肽，前提条件是所述序列不包括与SEQ ID No.1相比正好一个单突变，该单突变是Tyr-75被酸性氨基酸残基取代。
实施方案83：实施方案65的分离肽，前提条件是所述序列不包括与SEQ ID No.1相比正好一个单突变，该单突变是Tyr-75被Asp或Glu取代。
实施方案84：实施方案65的分离肽，前提条件是所述序列不包括与SEQ ID No.1相比正好一个单突变，该单突变是Tyr-75被Glu取代。
实施方案85：实施方案65的分离肽，前提条件是所述序列不包括与SEQ ID No.1相比正好一个单突变，该单突变是Tyr-302上的突变。
实施方案86：实施方案65的分离肽，前提条件是所述序列不包括与SEQ ID No.1相比正好一个单突变，该单突变是Tyr-302被不同于Tyr的碱性氨基酸残基取代。
实施方案87：实施方案65的分离肽，前提条件是所述序列不包括与SEQ ID No.1相比正好一个单突变，该单突变是Tyr-302被Arg或Lys取代。
实施方案88：实施方案65的分离肽，前提条件是所述序列不包括与SEQ ID No.1相比正好一个单突变，该单突变是Tyr-302被Arg取代。
实施方案89：实施方案65的分离肽，前提条件是所述序列不包括与SEQ ID No.1相比正好一个单突变，该单突变是Asp-304上的突变。
实施方案90：实施方案65的分离肽，前提条件是所述序列不包括与SEQ ID No.1相比正好一个单突变，该单突变是Asp-304被碱性氨基酸残基取代。
实施方案91：实施方案65的分离肽，前提条件是所述序列不包括与SEQ ID No.1相比正好一个单突变，该单突变是Asp-304被Tyr、Arg或Lys取代。
实施方案92：实施方案65的分离肽，前提条件是所述序列不包括与SEQ ID No.1相比正好一个单突变，该单突变是Asp-304被Lys取代。
实施方案93：实施方案65的分离肽，前提条件是所述修饰不只是由Asp-4上的取代和/或Val-30上的取代和/或Gly-250的取代组成。
实施方案94：实施方案65的分离肽，前提条件是所述修饰不只是由Asp-4被Glu取代和/或Val-30上的取代和/或Gly-250的取代组成。
实施方案95：实施方案65的分离肽，前提条件是所述修饰不只是由Val-30被Ile取代和/或Asp-4上的取代和/或Gly-250上的取代组成。
实施方案96：实施方案65的分离肽，前提条件是所述修饰不只是由Gly-250被Thr取代和/或Asp-4上的取代和/或Val-30上的取代组成。
实施方案97：实施方案65的分离肽，前提条件是所述修饰不只是由Gly-250被Ser取代和/或Asp-4上的取代和/或Val-30上的取代组成。
实施方案98：实施方案65的分离肽，前提条件是所述序列不包括与SEQ ID No.1相比正好一个单突变，该单突变是Asp-4上的突变。
实施方案99：实施方案65的分离肽，前提条件是所述序列不包括与SEQ ID No.1相比正好一个单突变，该单突变是Asp-4被Glu取代。
实施方案100：实施方案65的分离肽，前提条件是所述序列不包括与SEQ ID No.1相比正好一个单突变，该单突变是Val-30上的突变。
实施方案101：实施方案65的分离肽，前提条件是所述序列不包括与SEQ ID No.1相比正好一个单突变，该单突变是Val-30被Ile取代。
实施方案102：实施方案65的分离肽，前提条件是所述序列不包括与SEQ ID No.1相比正好一个单突变，该单突变是Gly-250上的突变。
实施方案103：实施方案65的分离肽，前提条件是所述序列不包括与SEQ ID No.1相比正好一个单突变，该单突变是Gly-250被Thr取代。
实施方案104：实施方案65的分离肽，前提条件是所述序列不包括与SEQ ID No.1相比正好一个单突变，该单突变是Gly-250被Ser取代。
实施方案105：实施方案65的分离肽，前提条件是所述序列不包括与SEQ ID No.1相比正好一个单突变，该单突变是Asp-4上的突变。
实施方案106：实施方案65的分离肽，前提条件是所述序列不包括与SEQ ID No.1相比正好一个单突变，该单突变是Asp-4被Glu取代。
实施方案107：实施方案65的分离肽，前提条件是所述序列不包括与SEQ ID No.1相比正好一个单突变，该单突变是Val-30上的突变。
实施方案108：实施方案65的分离肽，前提条件是所述序列不包括与SEQ ID No.1相比正好一个单突变，该单突变是Val-30被Ile取代。
实施方案109：一种转谷氨酰胺酶肽，所述肽对于hGH的Gln-40与hGH的Gln-141相比时具有特异性，该特异性不同于具有SEQ IDNo.1中所示氨基酸序列的肽对于hGH的Gln-40与hGH的Gln-141相比时的特异性。
实施方案110：实施方案109的转谷氨酰胺酶肽，所述肽对于hGH的Gln-40与hGH的Gln-141相比时具有特异性，该特异性比具有SEQID No.1所示氨基酸序列的肽对于hGH的Gln-40与hGH的Gln-141相比时的特异性高。
实施方案111：实施方案的109的转谷氨酰胺酶肽，所述肽对于hGH的Gln-141与hGH的Gln-40相比时具有特异性，该特异性比具有SEQ ID No.1中所示氨基酸序列的肽对于hGH的Gln-141与hGH的Gln-40相比时的特异性高。
实施方案112：编码实施方案1-111中任一项的肽的核酸构建体。
实施方案113：包含实施方案112的核酸构建体的载体。
实施方案114：包含实施方案113的载体的宿主。
实施方案115：包含实施方案1-111中任一项的肽的组合物。
实施方案116：用于缀合hGH的方法，其中所述方法包括在实施方案1-111中任一项的肽存在下，使所述hGH与胺供体反应。
实施方案117：实施方案116的用于缀合hGH的方法，其中与在Gln-141位上缀合的hGH量相比的在Gln-40位上缀合的hGH量，和在所述方法中使用具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列的肽而不是实施方案1-111中任一项的肽时与在Gln-141位上缀合的hGH量相比的在Gln-40位上缀合的hGH量相比显著增加。
实施方案118：实施方案116的用于缀合hGH的方法，其中与在Gln-40位上缀合的hGH量相比的在Gln-141位上缀合的hGH量，和在所述方法中使用具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列的肽而不是实施方案1-111中任一项的肽时与在Gln-40位上缀合的hGH量相比的在Gln-141位上缀合的hGH量相比显著增加。
实施方案119：实施方案1-111中任一项的肽在制备缀合的hGH中的用途。
实施方案120：实施方案119的用途，其中hGH是在Gln-40位上缀合的。
实施方案121：实施方案119的用途，其中hGH是在Gln-141位上缀合的。
如果使用SEQ ID No.2中所限定的转谷氨酰胺酶，则主要获得Gln-141官能化hGH，而仅获得少量的Gln-40官能化hGH或Gln-40/Gln-141双官能化hGH。
在一个实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID No.1中所限定的氨基酸序列的肽，该序列上Tyr-75被Asp或Glu取代；和/或Tyr-302被Arg或Lys取代；和/或Asp-304被Tyr、Lys或Arg取代和/或Gly-250被Ser或Thr取代；和/或Asp-4被Glu取代；和/或Val-30被Ile取代；和/或氨基酸1-4缺失和被Gly置换(Δ(DSDD)1-4G)。
在一个实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID No.1中所限定的氨基酸序列的肽，其中Tyr-75被Glu取代；和/或Tyr-302被Arg取代；和/或Asp-304被Lys取代；和/或Gly-250被Ser取代；和/或Asp-4被Glu取代；和/或Val-30被Ile取代；和/或氨基酸1-4缺失。
在一个实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID No.2中所限定的氨基酸序列的肽，其是Tyr-75→Glu取代的SEQ ID No.1。
在一个实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID No.3中所限定的氨基酸序列的肽，其是Tyr-302→Arg取代的SEQ ID No.1。
在一个实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID No.4中所限定的氨基酸序列的肽，其是Asp-304→Lys取代的SEQ ID No.1。
在一个实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID No.5中所限定的氨基酸序列的肽，其是Tyr-75→Glu取代、Tyr-302→Arg取代和Asp-304→Lys取代的SEQ ID No.1。
在一个实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID No.6中所限定的氨基酸序列的肽，其是拉达卡链轮丝菌的转谷氨酰胺酶。
本发明的肽具有转谷氨酰胺酶活性，如US 5,156,956所述测定法所测定的一样。简单地讲，对给定肽的活性进行测定是在Ca2+不存在时，用苄氧羰基-L-谷氨酰胺酰甘氨酸和羟胺为底物进行反应，在三氯乙酸存在下，与所得的异羟肟酸形成铁络合物，测定525nm的吸收，用标准曲线确定异羟肟酸的量以计算活性。对于本说明书，在所述测定中具有转谷氨酰胺酶活性的肽，被认为具有转谷氨酰胺酶活性。具体地讲，本发明转谷氨酰胺酶变异体的活性比得自茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶的大30％，例如大50％、例如大70％、例如大90％。
在一个实施方案中，本发明涉及包含具有SEQ ID No：2、3、4或5中任一个的多肽的组合物。
本发明的肽可用不同方法制备。所述肽可以用本领域已知的蛋白质合成方法制备。鉴于肽的大小，肽可以较方便地通过合成几个肽的片段，然后使片段结合以提供本发明的肽。然而，在一个具体的实施方案中，本发明的肽通过使包含编码本发明肽的核酸构建体的合适宿主进行发酵来制备。
在一个实施方案中，本发明还涉及编码本发明肽的核酸构建体。
本文所用术语“核酸构建体”是指cDNA、基因组DNA、合成DNA或RNA来源的任何核酸分子。术语“构建体”是指可以是单链或双链的核酸区段，它可以是基于编码目标蛋白质的完全或部分天然存在的核苷酸序列。构建体可任选含有其它核酸区段。
编码本发明肽的本发明核酸构建体适宜为基因组或cDNA来源，例如按照标准技术，制备基因组或cDNA文库，用合成寡核苷酸探针，通过杂交筛选编码所有或部分蛋白质的DNA序列，从而获得的核酸构建体(参见J.Sambrook等，1989，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第二版，Cold Spring Harbor，New York)，以及通过按本领域已知方法引入突变获得的构建体。
可以通过已建立的标准方法，例如Beaucage和Caruthers介绍的亚磷酰胺法(Beaucage和Caruthers，Tetrahedron Letters 22，1859-1869(1981))或Matthes等介绍的方法(Matthes等，EMBO Journal 3，801-805(1984))，合成制备编码蛋白质的本发明核酸构建体。例如按照亚磷酰胺法，在自动DNA合成仪中，寡核苷酸经合成，纯化，退火，连接并克隆到合适的载体上。
此外，核酸构建体可以是合成和基因组核酸混合的、合成核酸和cDNA混合的或基因组和cDNA来源混合的，可按照标准技术通过连接合成、基因组或cDNA来源(适当时)的片段、对应于完整核酸构建体各个部分的片段制备。
还可用特异性引物通过聚合酶链式反应制备核酸构建体，例如参见US 4,683,202或Saiki等，Science 239，487-491(1988)。
核酸构建体优选为DNA构建体，该术语专用于下文。
在又一方面，本发明涉及包含本发明DNA构建体的重组载体。本发明DNA构建体所插入的重组载体可以是便于进行重组DNA法的任何载体，载体的选择通常取决于其所导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，也就是说以染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒。或者，载体可以是被导入宿主细胞后再整合到宿主细胞基因组中的载体，与其所整合的染色体一起复制。
载体优选为表达载体，其中编码本发明蛋白质的DNA序列与DNA转录所需要的另外的区段操作性连接。一般而言，表达载体衍生自质粒DNA或病毒DNA，或者可以含有这两种组分。术语“操作性连接”是指区段的排列方式使得其按既定目标共同发挥作用，例如转录以启动子开始，并沿编码蛋白质的DNA序列进行下去。
启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，可以衍生自与宿主细胞同源或异源的蛋白质编码基因。
用于酵母宿主细胞的合适启动子的实例包括得自酵母糖酵解基因的启动子(Hitzeman等，J.Biol.Chem.255，12073-12080(1980)；Alber和Kawasaki，J.Mol.Appl.Gen.1，419-434(1982))或醇脱氢酶基因启动子(Young等，Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals(Hollaender等主编)，Plenum Press，New York，1982)，或TPI1启动子(US 4,599,311)或ADH2-4c启动子(Russell等，Nature 304，652-654(1983))。
用于丝状真菌宿主细胞的合适启动子的实例是例如ADH3启动子(McKnight等，The EMBO J.4，2093-2099(1985))或tpiA启动子。其它有用的启动子的实例是衍生自以下酶的编码基因启动子：米曲霉(A.oryzae)TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(A.niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(gluA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲酶(A.nidulans)乙酰胺酶。优选为TAKA-淀粉酶启动子和gluA启动子。
用于细菌宿主细胞的合适启动子的实例包括嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)麦芽淀粉酶基因启动子、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因启动子、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BAN淀粉酶基因启动子、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)碱性蛋白酶基因启动子或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)木糖苷酶基因启动子或噬菌体λPR或PL启动子或大肠杆菌(E.coli)lac、trp或tac启动子。
必要时，编码本发明蛋白质的DNA序列还可与合适的终止子操作性连接，例如人生长激素终止子(Palmiter等，同上)或(对于真菌宿主)TPI1终止子(Alber和Kawasaki，同上)或ADH3终止子(McKnight等，同上)。载体另还包含例如聚腺苷酸化信号(例如得自SV40或腺病毒5 Elb区)、转录增强子序列(例如SV40增强子)和翻译增强子序列(例如编码腺病毒VA RNA翻译增强子序列)等元件。
本发明的重组载体另还包含使载体能够在有关宿主细胞中复制的DNA序列。
如果宿主细胞是酵母细胞，则使载体能够复制的合适序列是酵母质粒2μ复制基因REP 1-3和复制起点。
如果宿主细胞是细菌细胞，则使载体能够复制的序列是DNA聚合酶III复合体编码基因和复制起点。
载体还可包含选择标记，例如其产物代偿宿主细胞缺陷的基因，例如二氢叶酸还原酶(DHFR)编码基因或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)TPI基因(参见P.R.Russell，Gene 40，125-130(1985))，或者赋予药物抗性的基因，药物例如氨苄西林、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素或甲氨蝶呤。对于丝状真菌，选择标记包括amdS、pyrG、argB、niaD和sC。
为了指导本发明的蛋白质进入宿主细胞的分泌途径，可以在重组载体中提供分泌信号序列(亦称前导序列、前原序列或前序列)。将分泌信号序列在正确阅读框中加入到编码蛋白质的DNA序列上。分泌信号序列通常位于编码蛋白质的DNA序列的5′端。分泌信号序列正常可与蛋白质缔合，或者可得自编码其它分泌蛋白的基因。
对于酵母细胞的分泌，分泌信号序列可编码任何信号肽，确保有效地指导所表达的蛋白质进入细胞的分泌途径。信号肽可以是天然存在的信号肽或其功能部分，或者可以是合成肽。已经发现合适的信号肽为α因子信号肽(参见US 4,870,008)、小鼠唾液淀粉酶的信号肽(参见O.Hagenbuchle等，Nature 289，643-646(1981))、修饰的羧肽酶信号肽(参见L.A.Valls等，Cell 48，887-897(1987))、酵母BAR1信号肽(参见WO 87/02670)或酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信号肽(参见M.Egel-Mitani等，Yeast 6，127-137(1990))。
对于酵母中的有效分泌，编码前导肽的序列也可插入信号序列的下游和编码蛋白质DNA序列的上游。前导肽的功能是指导所表达的蛋白质从内质网至高尔基体，继而至分泌小泡以便分泌到培养基中(即蛋白质穿过细胞壁或者至少穿过细胞膜输出到酵母细胞的周质间隙内)。前导肽可以是酵母α因子前导肽(其使用参见例如US 4,546,082、EP 16201、EP 123294、EP 123544和EP 163529)。或者，前导肽可以是合成前导肽，也就是说是天然不存在的前导肽。合成前导肽可以按例如WO 89/02463或WO 92/11378所述方法构建。
对于用于丝状真菌，信号肽可方便地得自曲霉(Aspergillus sp.)淀粉酶或葡糖淀粉酶的编码基因、曼赫根毛霉脂肪酶或蛋白酶的编码基因、或细毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶的编码基因。信号肽优选得自以下淀粉酶的编码基因：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性淀粉酶或黑曲霉葡糖淀粉酶。
分别连接编码本发明蛋白质的DNA序列、启动子和任选终止子和/或分泌信号序列，将其插入含有复制所需信息的合适载体内所使用的方法，为本领域技术人员所熟知(参见例如Sambrook等，同上)。
向其中引入本发明DNA构建体或重组载体的宿主细胞可以是能够产生本发明蛋白质的任何细胞，包括细菌、酵母、真菌和高等真核细胞。
细菌宿主细胞的实例是在培养中能够产生本发明蛋白质的革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌例如芽孢杆菌属(Bacillus)的菌株，例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短小芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂类芽孢杆菌(B.lautus)、巨大芽孢杆菌(B.megatherium)或苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)的菌株，或者链霉菌属(Streptomyces)的菌株，例如变铅青链霉菌(S.lividans)或鼠链霉菌(S.murinus)，革兰氏阴性菌例如大肠杆菌。可以本身公知的方式，通过原生质体转化，或者通过用感受态细胞，实现细菌的转化(参见Sambrook等，同上)。其它合适的宿主包括茂原链轮丝菌、变铅青链霉菌和谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)(Appl.Microbiol.Biotechnol.64，447-454(2004))。
如果在细菌(例如大肠杆菌)中表达蛋白质，则蛋白质可以保留在细胞质内，通常为不溶性颗粒(称为包含体)，或者由细菌分泌序列指导进入周质间隙。在前一种情况下，将细胞裂解，回收颗粒，变性后，通过稀释变性剂使蛋白质重折叠。在后一种情况下，可以通过使细胞破裂(例如通过超声处理或渗压震扰)以释放周质间隙的内容物，来回收蛋白质。
合适酵母细胞的实例括酵母(Saccharomyces spp.)细胞或裂殖酵母(Schizosaccharomyces spp.)细胞，具体地讲为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)菌株。用异源DNA转化酵母细胞从而产生异源蛋白质的方法参见例如US 4,599,311、US4,931,373、US 4,870,008、5,037,743和US 4,845,075，所有这些专利都通过引用结合到本文中。通过经选择标记确定的表型选择转化细胞，选择标记通常具有药物抗性或者在缺乏特殊养分(例如亮氨酸)时生长的能力。用于酵母优选的载体是POT1载体，参见US 4,931,373。本发明编码蛋白质的DNA序列可位于信号序列和任选例如上述前导序列之前。合适酵母细胞的其它实例是克鲁维酵母属(Kluyveromyces)菌株，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)；汉逊酵母属(Hansenula)菌株，例如多形汉逊酵母(H.polymorpha)；或毕赤酵母属(Pichia)，例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)(参见Gleeson等，J.Gen.Microbiol.132，3459-3465(1986)；US 4,882,279)。
其它真菌细胞的实例为丝状真菌细胞，例如曲霉(Aspergillusspp.)、链孢霉(Neurospora spp.)、镰孢菌(Fusarium spp.)或木霉(Trichoderma spp.)，具体地讲是米曲霉、构巢曲霉或黑曲霉菌株。曲霉在蛋白质表达中的应用参见例如EP 272277和EP 230023。例如可按Malardier等(Malardier等，Gene 78，147-156(1989))所述方法进行尖镰孢菌(F.oxysporum)的转化。
如果丝状真菌用作宿主细胞，可被本发明的DNA构建体转化，通过方便地将DNA构建体整合至宿主染色体中以获得重组宿主细胞。这种整合一般被认为是有优势的，因为DNA序列很可能被稳定保留在细胞内。可以按照常规方法(例如同源重组或异源重组)，进行DNA构建体整合至宿主染色体中。
然后，将上述转化或转染的宿主细胞在允许表达本发明肽的条件下，培养在合适的营养培养基中，培养后从培养物中回收所得蛋白质。
所用培养细胞的培养基可以是适于宿主细胞生长的任何常用培养基，例如基本培养基或含有适当补充剂的复合培养基。合适的培养基可向供货商获取，或者可以按照已发表的配方来配制(例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)目录)。然后，用常规方法从培养基中回收由细胞产生的蛋白质，常规方法包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，通过盐(例如硫酸铵)沉淀上清液或者滤液中的蛋白质组分，通过各种层析法纯化，例如离子交换层析法、凝胶过滤层析法、亲和层析法等，这取决于所述蛋白质的类型。
本文所引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，都通过引用全部结合到本文中，其程度与每个文献单独而具体指明通过引用结合到本文中并在本文中公开其全部(到法律所允许的最大程度)一样，不论在本文其它地方任何单独提出具体文献的引用结合。
描述本发明内容的术语前未加数词修饰时和类似表述应理解为涵盖了单数和复数，除非本文中另有说明或者明显与本文内容相抵触。例如表述“化合物”应理解为是指本发明或具体描述方面的各种“化合物”，除非另有说明。
除非另有说明，否则本文所提供的所有精确值是相应近似值的代表(例如有关具体因子或测量值所提供的所有精确的示例性数值也可被认为是提供相应的近似测量值，如有需要由“约”修饰)。
本发明方面或本发明任何方面就一种或多种成分使用术语例如“包含”、“具有”、“包括”或“含有”的描述时，是给“由具体的一种或多种成分组成”、“基本由具体的一种或多种成分组成”或“基本包含具体的一种或多种成分”的本发明方面或类似方面提供支持，除非另有说明或明显与内容相抵触(例如本文所述包含具体成分的组合物就应理解为也可描述成由该成分组成的组合物，除非另有说明或明显与内容相抵触)。
实施例
实施例1
hGH的聚乙二醇化
a)将hGH溶于磷酸缓冲液(50mM，pH 8.0)。将胺供体(例如1，3-二氨基-丙-2-醇)溶于磷酸缓冲液(50mM，1ml，pH 8.0，在胺供体溶解后，用稀盐酸调节pH至8.0)。将hGH溶液与胺供体溶液相混合。
最后，加入溶于磷酸缓冲液(50mM，pH 8.0，1ml)的转谷氨酰胺酶溶液(～40U)，加入磷酸缓冲液(50mM，pH 8)调节体积至10ml。将混匀的混合物在37℃下温育约4小时。使温度降至室温，加入N-乙基-马来酰亚胺(转谷氨酰胺酶抑制剂)至终浓度为1mM。混合物再经1小时后，用10倍体积的tris缓冲液(50mM，pH 8.5)稀释。
b)然后，如果存在胺供体时，得自a)的转氨基化hGH可任选进一步反应以激活潜在的官能团。
c)然后，得自a)或b)的官能化hGH与能够将官能团引入hGH的合适官能化PEG反应。例如通过羰基部分(醛或酮)与烷氧基胺反应形成肟键。
实施例2
转谷氨酰胺酶特异性测定I
可以用所述方法测定在按实施例1所述反应中经修饰的hGH上的Gln残基。也就是说本文所述方法可用来测定本发明转谷氨酰胺酶的选择性。
确定聚乙二醇化位点
应用离子交换层析法和凝胶过滤的结合，对从实施例1中所得到的单聚乙二醇化hGH进行纯化。
为了确定聚乙二醇化的位点，用二硫苏糖醇和碘乙酰胺，使纯化的化合物还原和烷基化。随后化合物用非特异性蛋白酶(蛋白酶K)消化，所得消化物用反相C-18HPLC柱分离(用乙腈/TFA缓冲液系统)。在这些条件下，聚乙二醇化肽比非聚乙二醇化肽的洗脱迟得多，此外，所有聚乙二醇化肽(如果是一种以上)将在同一峰中被洗脱出来，因为聚乙二醇化肽的保留时间主要由PEG部分决定。
收集含有聚乙二醇化肽的峰，用自动Edman分析对氨基酸进行测序。结果既提供聚乙二醇化确切位点的信息-在测序分析中聚乙二醇化氨基酸将产生空白循环-同时又提供在本发明肽上的数目和相对含量，因此揭示了是否在多个位点上发生聚乙二醇化。
实施例3
测定转谷氨酰胺酶突变型对于hGH上Gln-141与Gln-40的特异性(测
定I)
将20μl1，3-二氨基-2-丙醇(180mg/ml的10mM磷酸缓冲液，通过加入浓HCl调节pH至8.3)加到hGH(1mg)溶液的10mM磷酸缓冲液(pH 8.1)(50μl)溶液中。加入一定量的10mM磷酸缓冲液使最终的反应混合物体积为100μl。加入酶(终浓度0.07-7μM)开始反应。使反应混合物在37℃下温育，反应后进行毛细管电泳(CE)。
向等分量的反应混合物(10μl)中加入N-乙基马来酰亚胺100mM(1μl)。使混合物在环境温度下温育5分钟，然后在毛细管电泳分析前用水稀释100倍。
用Agilent Technologies 3D-CE系统(Agilent Technologies)进行毛细管电泳。用Agilent Technologies 3DCE ChemStation获取数据并进行信号处理。得自安捷伦(Agilent)的“延长光程毛细管(Extended LightPath Capillary)”，毛细管为64.5cm(有效长度56.0cm)，内径50μm。在200nm (16nm Bw，参照380nm和50nm Bw)下进行UV检测。电泳电解质为磷酸缓冲液50mM(pH 7.0)。毛细管用0.1M NaOH处理3分钟，然后用Milli-Q水处理2分钟，用电解质处理3分钟。
每次电泳后，毛细管都用milli-Q水冲洗2分钟，然后用磷酸冲洗2分钟，用milli-Q水冲洗2分钟。动力进样以50毫巴进行4.0秒。电压为+25kV。毛细管温度为30℃，运行时间为10.5分钟。
图2是典型的毛细管电泳分析图，显示转谷氨酰胺酶催化的hGH与1，3-二氨基-2-丙醇的转谷氨酰胺作用。
调整酶用量使单转氨基作用产物的量在5小时反应时间内达到最高。
半数底物hGH完成转氨基化的时间反映反应速度的指标。
表1表示所选转谷氨酰胺酶的结果。
表1
| 酶突变型 | 浓度 | 转氨基化Gln 40与Gln 141 | 达到约50％hGH的时间＝ |
| WT | 0.07μM | 15:85 | 1小时15分钟 |
| Y75E | 3.90μM | 45:55 | ＜30分钟 |
| Y302R | 0.39μM | 30:70 | 30分钟 |
| Y75E，Y302R | 7.2μM | 65:35 | 1小时30分钟 |
WT 具有SEQ ID No.1氨基酸序列的转谷氨酰胺酶
Y75E 具有SEQ ID No.2氨基酸序列的转谷氨酰胺酶
Y302R 具有SEQ ID No.3氨基酸序列的转谷氨酰胺酶
Y75E，Y302R SEQ ID No.1中所限定的转谷氨酰胺酶，其中Tyr-75被
Glu取代，Tyr-302被Arg取代
实施例4
测定转谷氨酰胺酶突变型对hGH上的Gln-141与Gln-40的选择性(测
定II)
本测定使用两种hGH突变型，每个在Gln-40和Gln-141一个位上由天冬酰胺残基替换谷氨酰胺，只留下一个谷氨酰胺进行反应。所述突变型的制备法见Kunkel TA等，Methods in Enzymology 154，367-382(1987)和Chung Nan Chang等，Cell 55，189-196(1987)。hGH突变型Q40N是hGH中Gln-141的模型底物，Q141N是Gln-40的模型底物。
向400μl 225mM 1，3-二氨基-2-丙醇和35mM Tris(通过加入浓HCl调节pH至8.0)的缓冲液溶液中，加入600μl突变型hGH(1.5mg/ml)和5μl转谷氨酰胺酶(1.6mg/ml)，使反应混合物在25℃下温育30分钟。
用Mono Q 5/5GL 1ml(GE Health)柱通过FPLC进行随后分析，在280nm下进行UV检测。缓冲液A：20mM三乙醇胺(pH 8.5)；缓冲液B：20mM三乙醇胺0.2M NaCl(pH 8.5)；流速：0.8ml/分钟。洗脱递度规定如下：
| 步骤 | 时间/分钟 | ％A | ％B |
| 1 | 2.00 | 100.0 | 0.0 |
| 2 | 4.00 | 70.0 | 30.0 |
| 3 | 5.00 | 70.0 | 30.0 |
| 4 | 35.00 | 50.0 | 50.0 |
由在属于两个产物Q141和Q40的曲线(见图3和图4)下两个面积(任意单位)之比，计算选择性之比。如果用得自茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶(SEQ ID No.1)和得自拉达卡链轮丝菌的转谷氨酰胺酶(SEQ ID No.6)，所得结果见表2。Q40N+其产物-Q141＝Q141N+其产物-Q40，使之归一化至100。
表2
| 酶 | Q40N | 产物-Q141 | Q141N | 产物-Q40 | 转氨基化Gln40与Gln 141 | Gln 40与Gln141(归一化) |
| 茂原链轮丝菌 | 29 | 71 | 81 | 19 | 19:71 | 21:79 |
| 拉达卡链轮丝菌 | 23 | 77 | 90 | 10 | 10:77 | 11:89 |
序列表
<110>诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司(Novo Nordisk A/S)
<120>特异性改进的转谷氨酰胺酶变异体
<130>7483.504 WO
<160>6
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>331
<212>PRT
<213>茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)
<400>1
Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met
1 5 10 15
Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Ash
20 25 30
Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg
35 40 45
Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys
50 55 60
Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu
65 70 75 80
Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn
85 90 95
Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val
100 105 110
Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu
115 120 125
Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser
130 135 140
Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala
145 150 155 160
Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn
165 170 175
Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg
180 185 190
Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg
195 200 205
Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg
210 215 220
Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile
225 230 235 240
Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr
245 250 255
Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp
260 265 270
Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met
275 280 285
His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp
290 295 300
Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn
305 310 315 320
Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro
325 330
<210>2
<211>331
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)变异体
<400>2
Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met
1 5 10 15
Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn
20 25 30
Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg
35 40 45
Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys
50 55 60
Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Glu Pro Thr Asn Arg Leu
65 70 75 80
Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn
85 90 95
Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val
100 105 110
Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu
115 120 125
Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser
130 135 140
Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala
145 150 155 160
Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn
165 170 175
Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg
180 185 190
Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg
195 200 205
Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg
210 215 220
Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile
225 230 235 240
Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr
245 250 255
Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp
260 265 270
Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met
275 280 285
His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp
290 295 300
Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn
305 310 315 320
Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro
325 330
<210>3
<211>331
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>茂原链轮丝菌(Streptoverticill ium mobaraense)变异体
<400>3
Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met
1 5 10 15
Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn
20 25 30
Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg
35 40 45
Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys
50 55 60
Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu
65 70 75 80
Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn
85 90 95
Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val
100 105 110
Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu
115 120 125
Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser
130 135 140
Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala
145 150 155 160
Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn
165 170 175
Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg
180 185 190
Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg
195 200 205
Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg
210 215 220
Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile
225 230 235 240
Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr
245 250 255
Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp
260 265 270
Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met
275 280 285
His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Arg Ser Asp
290 295 300
Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn
305 310 315 320
Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro
325 330
<210>4
<211>331
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)变异体
<400>4
Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met
1 5 10 15
Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn
20 25 30
Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg
35 40 45
Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys
50 55 60
Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu
65 70 75 80
Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn
85 90 95
Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val
100 105 110
Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu
115 120 125
Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser
130 135 140
Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala
145 150 155 160
Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn
165 170 175
Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg
180 185 190
Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg
195 200 205
Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg
210 215 220
Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile
225 230 235 240
Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr
245 250 255
Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp
260 265 270
Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met
275 280 285
His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Lys
290 295 300
Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn
305 310 315 320
Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro
325 330
<210>5
<211>331
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)变异体
<400>5
Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met
1 5 10 15
Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn
20 25 30
Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg
35 40 45
Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys
50 55 60
Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Glu Pro Thr Asn Arg Leu
65 70 75 80
Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn
85 90 95
Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val
100 105 110
Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu
115 120 125
Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser
130 135 140
Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala
145 150 155 160
Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn
165 170 175
Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg
180 185 190
Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg
195 200 205
Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg
210 215 220
Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile
225 230 235 240
Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr
245 250 255
Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp
260 265 270
Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met
275 280 285
His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Arg Ser Lys
290 295 300
Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn
305 310 315 320
Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro
325 330
<210>6
<211>331
<212>PRT
<213>拉达卡链轮丝菌(Streptoverticillium ladakanum)
<400>6
Asp Ser Asp Glu Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met
1 5 10 15
Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Ile Val Asn
20 25 30
Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg
35 40 45
Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys
50 55 60
Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu
65 70 75 80
Ala Phe Ala Phe Phe Asp Glu Asp Lys Tyr Lys Asn Glu Leu Lys Asn
85 90 95
Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val
100 105 110
Ala Lys Asp Ser Phe Asp Glu Ala Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Asp
115 120 125
Val Ala Ser Val Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Gly
130 135 140
Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala
145 150 155 160
Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn
165 170 175
Thr Pro Ser Phe Lys Asp Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Lys
180 185 190
Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg
195 200 205
Ser Gly Ser Ser Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Glu Ala Phe Arg
210 215 220
Pro Asp Arg Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile
225 230 235 240
Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Ser Phe Val Asn Phe Asp Tyr
245 250 255
Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp
260 265 270
Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met
275 280 285
His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Asp Gly Tyr Ser Asp
290 295 300
Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Val Thr Phe Val Pro Lys Ser Trp Asn
305 310 315 320
Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro
325 330
Claims (78)
1.一种分离肽，所述肽包含与SEQ ID No.1的氨基酸序列有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Asp-4、Val-30、Tyr-62、Tyr-75、Arg-89、Glu-115、Ser-210、Asp-221、Ala-226、Pro-227、Gly-250、Val-252、Asn-253、Phe-254、His-277、Tyr-278、Leu-285、Tyr-302、Asp-304和Lys-327。
2.权利要求1的分离肽，所述肽包含与SEQ ID No.1的氨基酸序列有至少85％同一性的氨基酸序列，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Asp-4、Val-30、Tyr-62、Tyr-75、Arg-89、Glu-115、Ser-210、Asp-221、Ala-226、Pro-227、Gly-250、Val-252、Asn-253、Phe-254、His-277、Tyr-278、Leu-285、Tyr-302、Asp-304和Lys-327。
3.权利要求2的分离肽，所述肽包含与SEQ ID No.1的氨基酸序列有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Asp-4、Val-30、Tyr-62、Tyr-75、Arg-89、Glu-115、Ser-210、Asp-221、Ala-226、Pro-227、Gly-250、Val-252、Asn-253、Phe-254、His-277、Tyr-278、Leu-285、Tyr-302、Asp-304和Lys-327。
4.权利要求3的分离肽，所述肽包含与SEQ ID No.1的氨基酸序列有至少95％同一性的氨基酸序列，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Asp-4、Val-30、Tyr-62、Tyr-75、Arg-89、Glu-115、Ser-210、Asp-221、Ala-226、Pro-227、Gly-250、Val-252、Asn-253、Phe-254、His-277、Tyr-278、Leu-285、Tyr-302、Asp-304和Lys-327。
5.权利要求4的分离肽，所述肽包含SEQ ID No.1中所限定的氨基酸序列，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Asp-4、Val-30、Tyr-62、Tyr-75、Arg-89、Glu-115、Ser-210、Asp-221、Ala-226、Pro-227、Gly-250、Val-252、Asn-253、Phe-254、His-277、Tyr-278、Leu-285、Tyr-302、Asp-304和Lys-327。
6.权利要求1-5中任一项的分离肽，其中所述序列在Gly-250上被修饰。
7.权利要求6的分离肽，其中Gly-250被Thr取代。
8.权利要求6的分离肽，其中Gly-250被Ser取代。
9.权利要求1-8中任一项的分离肽，其中所述序列在位于距离
以下的一个或多个氨基酸残基上被修饰。
10.权利要求1-9中任一项的分离肽，其中所述序列在位于距离
以下的一个或多个氨基酸残基上被修饰。
11.权利要求10的分离肽，其中序列在Cys64位上不被修饰。
12.权利要求10或11的分离肽，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Val-30、Tyr-62、Val-252、Asn-253、Phe-254、His-277、Tyr-278和Leu-285。
13.权利要求12的分离肽，其中所述序列在Tyr-62上被修饰。
14.权利要求12或13的分离肽，其中所述序列在His-277和/或Tyr-278上被修饰。
15.权利要求12-14中任一项的分离肽，其中所述序列在Leu-285上被修饰。
16.权利要求12-15中任一项的分离肽，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Val-252、Asn-253和Phe-254。
17.权利要求10-16中任一项的分离肽，其中所述序列在Val-30上被修饰。
18.权利要求17的分离肽，其中Val-30被Ile取代。
19.权利要求1-18中任一项的分离肽，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Asp-4、Arg-89、Glu-115、Ser-210、Asp-221和Lys-327。
20.权利要求19的分离肽，其中Asp-4被Glu取代。
21.权利要求19或20的分离肽，其中Asp-4被Glu取代，1、2和3位上的氨基酸缺失。
22.权利要求19-21中任一项的分离肽，其中Arg-89被Lys取代。
23.权利要求19-22中任一项的分离肽，其中Glu-115被Asp取代。
24.权利要求19-23中任一项的分离肽，其中Ser-210被Gly取代。
25.权利要求19-24中任一项的分离肽，其中Asp-221被Ser取代。
26.权利要求19-25中任一项的分离肽，其中Lys-327被Thr取代。
27.权利要求1-26中任一项的分离肽，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Ala-226和Pro-227。
28.权利要求27的分离肽，其中Ala-226被Asp取代。
29.权利要求27的分离肽，其中Pro-227被Arg取代。
30.权利要求1-29中任一项的分离肽，其中所述序列在Tyr-75上被修饰。
31.权利要求30的分离肽，其中Tyr-75被不同于Glu的氨基酸取代。
32.权利要求31的分离肽，其中Tyr-75被不同于Asp或Glu的氨基酸取代。
33.权利要求32的分离肽，其中Tyr-75被不同于酸性氨基酸残基的氨基酸取代。
34.权利要求30的分离肽，其中Tyr-75被酸性氨基酸残基取代。
35.权利要求34的分离肽，其中Tyr-75被Asp或Glu取代。
36.权利要求35的分离肽，其中Tyr-75被Glu取代。
37.权利要求1-36中任一项的分离肽，其中所述序列在Tyr-302上被修饰。
38.权利要求37的分离肽，其中Tyr-302被不同于Tyr的碱性氨基酸残基取代。
39.权利要求38的分离肽，其中Tyr-302被Arg或Lys取代。
40.权利要求39的分离肽，其中Tyr-302被Arg取代。
41.权利要求1-40中任一项的分离肽，其中所述序列在Asp-304上被修饰。
42.权利要求41的分离肽，其中Asp-304被碱性氨基酸残基取代。
43.权利要求42的分离肽，其中Asp-304被Tyr、Lys或Arg取代。
44.权利要求43的分离肽，其中Asp-304被Lys取代。
45.权利要求36的分离肽，所述肽具有SEQ ID No.2中所限定的序列。
46.权利要求40的分离肽，所述肽具有SEQ ID No.3中所限定的序列。
47.权利要求44的分离肽，所述肽具有SEQ ID No.4中所限定的序列。
48.权利要求30-44中任一项的分离肽，所述肽具有SEQ ID No.5中所限定的序列。
49.一种分离肽，所述肽包含与SEQ ID No.6的氨基酸序列有至少80％同一性的氨基酸序列。
50.权利要求49的分离肽，所述肽包含与SEQ ID No.6的氨基酸序列有至少85％同一性的氨基酸序列。
51.权利要求50的分离肽，所述肽包含与SEQ ID No.6的氨基酸序列有至少90％同一性的氨基酸序列。
52.权利要求51的分离肽，所述肽包含与SEQ ID No.6的氨基酸序列有至少95％同一性的氨基酸序列。
53.权利要求52的分离肽，所述肽包含SEQ ID No.6中所限定的氨基酸序列。
54.一种肽，所述肽具有SEQ ID No.1中所限定的序列，所述序列包含一种或多种以下的取代：Tyr-75→酸性氨基酸残基；Tyr-302→不是Tyr的碱性氨基酸残基；和Asp-304→碱性氨基酸残基。
55.权利要求54的肽，所述肽具有SEQ ID No.1中所限定的序列，所述序列包含一种或多种以下的取代：Tyr-75→Asp或Glu；Tyr-302→Arg或Lys；和Asp-304→Tyr、Lys或Arg。
56.权利要求54或55的肽，所述肽具有SEQ ID No.1中所限定的序列，所述序列包含一种或多种以下的取代：Tyr-75→Glu；Tyr-302→Arg；和Asp-304→Lys。
57.权利要求54-56中任一项的肽，其中所述序列如SEQ ID No.2中限定。
58.权利要求54-56中任一项的肽，其中所述序列如SEQ ID No.3中限定。
59. 权利要求54-56中任一项的肽，其中所述序列如SEQ ID No.4中限定。
60.权利要求54的肽，其中所述序列如SEQ ID No.5中限定。
61.权利要求54-60中任一项的肽，其中所述肽是分离肽。
62.权利要求1-61中任一项的分离肽，所述肽具有转谷氨酰胺酶活性。
63.权利要求1-62中任一项的分离肽，所述肽对于hGH的Gln-40与hGH的Gln-141相比时具有特异性，该特异性不同于具有SEQ IDNo.1中所示氨基酸序列的肽对于hGH的Gln-40与hGH的Gln-141相比时的特异性。
64.权利要求63的分离肽，所述肽对于hGH的Gln-40与hGH的Gln-141相比时具有特异性，该特异性比具有SEQ ID No.1中所示氨基酸序列的肽对于hGH的Gln-40与hGH的Gln-141相比时的特异性高。
65.权利要求63的分离肽，所述肽对于hGH的Gln-141与hGH的Gln-40相比时具有特异性，该特异性比具有SEQ ID No.1中所示氨基酸序列的肽对于hGH的Gln-141与hGH的Gln-40相比时的特异性高。
66.一种转谷氨酰胺酶肽，所述肽对于hGH的Gln-40与hGH的Gln-141相比时具有特异性，该特异性不同于具有SEQ ID No.1中所示氨基酸序列的肽对于hGH的Gln-40与hGH的Gln-141相比时的特异性。
67.权利要求66的转谷氨酰胺酶肽，所述肽对于hGH的Gln-40与hGH的Gln-141相比时具有特异性，该特异性比具有SEQ ID No.1中所示氨基酸序列的肽对于hGH的Gln-40与hGH的Gln-141相比时的特异性高。
68.权利要求66的转谷氨酰胺酶肽，所述肽对于hGH的Gln-141与hGH的Gln-40相比时具有特异性，该特异性比具有SEQ ID No.1中所示氨基酸序列的肽对于hGH的Gln-141与hGH的Gln-40相比时的特异性高。
69.一种核酸构建体，所述核酸构建体编码权利要求1-68中任一项的肽。
70.一种载体，所述载体包含权利要求69的核酸构建体。
71.一种宿主，所述宿主包含权利要求70的载体。
72.一种组合物，所述组合物包含权利要求1-68中任一项的肽。
73.一种用于缀合hGH的方法，其中所述方法包括在权利要求1-68中任一项的肽存在下，使所述hGH与胺供体反应。
74.权利要求73的用于缀合hGH的方法，其中与在Gln-141位上缀合的hGH量相比的在Gln-40位上缀合的hGH量，和在所述方法中使用具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列的肽而不是权利要求1-68中任一项的肽时与在Gln-141位上缀合的hGH量相比的在Gln-40位上缀合的hGH量相比显著增加。
75.权利要求73的用于缀合hGH的方法，其中与在Gln-40位上缀合的hGH量相比的在Gln-141位上缀合的hGH量，和在所述方法中使用具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列的肽而不是权利要求1-68中任一项的肽时与在Gln-40位上缀合的hGH量相比的在Gln-141位上缀合的hGH量相比显著增加。
76.权利要求1-68中任一项的肽在制备缀合hGH中的用途。
77.权利要求76的用途，其中hGH是在Gln-40位上缀合的。
78.权利要求76的用途，其中hGH是在Gln-141位上缀合的。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP05107599.2 | 2005-08-18 | ||
| EP05107599 | 2005-08-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101287757A true CN101287757A (zh) | 2008-10-15 |
Family
ID=37199008
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2006800300847A Withdrawn CN101263225A (zh) | 2005-08-18 | 2006-08-18 | 改进转谷氨酰胺酶的底物特异性 |
| CNA200680038433XA Withdrawn CN101287757A (zh) | 2005-08-18 | 2006-08-18 | 特异性改进的转谷氨酰胺酶变异体 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2006800300847A Withdrawn CN101263225A (zh) | 2005-08-18 | 2006-08-18 | 改进转谷氨酰胺酶的底物特异性 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20090117640A1 (zh) |
| EP (2) | EP1919946A1 (zh) |
| JP (2) | JP2009504170A (zh) |
| CN (2) | CN101263225A (zh) |
| WO (2) | WO2007020291A1 (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106755000A (zh) * | 2017-03-10 | 2017-05-31 | 安徽医学高等专科学校 | 一种优化的谷氨酰胺转氨酶基因和前导序列及其分泌表达 |
| CN107406483A (zh) * | 2014-12-19 | 2017-11-28 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 微生物转谷氨酰胺酶，其底物和其使用方法 |
| CN107586764A (zh) * | 2017-09-26 | 2018-01-16 | 天津科技大学 | 一种谷氨酰胺转氨酶突变体及其基因、工程菌和制备方法 |
| CN111386346A (zh) * | 2017-11-30 | 2020-07-07 | 天野酶制品株式会社 | 修饰型转谷氨酰胺酶 |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BRPI0808014A2 (pt) * | 2007-02-22 | 2014-06-17 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Variantes de transglutaminase com especificidade melhorada |
| DE102007042727A1 (de) * | 2007-09-07 | 2009-09-24 | Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg | Thermostabile Transglutaminasen |
| KR20110039348A (ko) | 2008-08-06 | 2011-04-15 | 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 | 연장된 생체내 효능을 가지는 콘쥬게이트된 단백질 |
| KR20110122100A (ko) | 2009-01-22 | 2011-11-09 | 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 | 안정한 성장 호르몬 화합물 |
| EP2404999B1 (en) * | 2009-03-06 | 2015-04-29 | Ajinomoto Co., Inc. | Thermotolerant transglutaminase originating in actinomyces |
| EP2461831B1 (en) | 2009-08-06 | 2018-11-21 | Novo Nordisk Health Care AG | Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy |
| JP5980689B2 (ja) | 2010-01-22 | 2016-08-31 | ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー | 安定な成長ホルモン化合物 |
| CN102834109B (zh) | 2010-01-22 | 2016-01-20 | 诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司 | 稳定的生长激素化合物 |
| WO2013092998A1 (en) | 2011-12-23 | 2013-06-27 | Innate Pharma | Enzymatic conjugation of antibodies |
| HUE043698T2 (hu) | 2012-04-17 | 2019-09-30 | Aeneas Gmbh & Co Kg | Eljárás cöliákia és gluténérzékenység tünetek elõtti diagnosztizálására |
| US10132799B2 (en) | 2012-07-13 | 2018-11-20 | Innate Pharma | Screening of conjugated antibodies |
| WO2014072482A1 (en) | 2012-11-09 | 2014-05-15 | Innate Pharma | Recognition tags for tgase-mediated conjugation |
| WO2014140300A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Innate Pharma | Solid phase tgase-mediated conjugation of antibodies |
| JP6464145B2 (ja) | 2013-04-05 | 2019-02-06 | ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー | 成長ホルモン化合物製剤 |
| EP3010547B1 (en) | 2013-06-20 | 2021-04-21 | Innate Pharma | Enzymatic conjugation of polypeptides |
| WO2014202775A1 (en) | 2013-06-21 | 2014-12-24 | Innate Pharma | Enzymatic conjugation of polypeptides |
| CN103816562B (zh) * | 2013-12-02 | 2016-01-13 | 华东师范大学 | 一种战争创伤快速止血产品及其制备方法 |
| US11054425B2 (en) | 2014-12-19 | 2021-07-06 | Roche Sequencing Solutions, Inc. | System and method for identification and characterization of transglutaminase species |
| WO2018004014A1 (ja) * | 2016-07-01 | 2018-01-04 | 国立大学法人九州大学 | トランスグルタミナーゼ活性を有する組換えタンパク質 |
| CN108103040B (zh) * | 2018-02-02 | 2021-05-04 | 泰兴市东圣生物科技有限公司 | 一种耐酸性微生物转谷酰胺酶及其编码基因 |
| KR20220153047A (ko) * | 2020-03-13 | 2022-11-17 | 큐리 컴퍼니 인코포레이티드 | 트랜스글루타미나제 변이체 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19814860A1 (de) * | 1998-04-02 | 1999-10-07 | Fuchsbauer Hans Lothar | Bakterielle Transglutaminasen |
| ATE532870T1 (de) * | 1999-09-30 | 2011-11-15 | Ajinomoto Kk | Verfahren zur herstellung von transglutaminase |
| BR0113304A (pt) * | 2000-08-17 | 2004-01-06 | Ajinomoto Kk | Método para planejar e preparar uma transglutaminase mutante, mtg mutante transglutaminase mutante, gene, dna recombinante, microorganismos, método para produzir uma mtg mutante ou uma transglutaminase mutante, e, cristais de mtg monoclìnicos |
| US6660510B2 (en) * | 2001-12-17 | 2003-12-09 | Food Industry Research And Development | Transglutaminase gene of Streptoverticillium ladakanum and the transglutaminase encoded therefrom |
| CN100351379C (zh) * | 2001-12-18 | 2007-11-28 | 食品工业发展研究所 | 拉达卡链轮丝菌的转谷氨酰胺酶基因及其编码的转谷氨酰胺酶 |
| CN1243022C (zh) * | 2003-10-17 | 2006-02-22 | 华东师范大学 | 生物修饰重组人生长激素复合物及其制备方法 |
| ES2642214T3 (es) * | 2004-01-21 | 2017-11-15 | Novo Nordisk Health Care Ag | Conjugación de péptidos mediante transglutaminasa |
-
2006
- 2006-08-18 JP JP2008526506A patent/JP2009504170A/ja not_active Withdrawn
- 2006-08-18 WO PCT/EP2006/065440 patent/WO2007020291A1/en active Application Filing
- 2006-08-18 JP JP2008526507A patent/JP2009504171A/ja not_active Withdrawn
- 2006-08-18 CN CNA2006800300847A patent/CN101263225A/zh not_active Withdrawn
- 2006-08-18 CN CNA200680038433XA patent/CN101287757A/zh not_active Withdrawn
- 2006-08-18 EP EP06778282A patent/EP1919946A1/en not_active Withdrawn
- 2006-08-18 WO PCT/EP2006/065439 patent/WO2007020290A1/en active Application Filing
- 2006-08-18 EP EP06792886A patent/EP1920050A1/en not_active Withdrawn
- 2006-08-18 US US12/063,693 patent/US20090117640A1/en not_active Abandoned
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107406483A (zh) * | 2014-12-19 | 2017-11-28 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 微生物转谷氨酰胺酶，其底物和其使用方法 |
| CN107406483B (zh) * | 2014-12-19 | 2022-02-22 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 微生物转谷氨酰胺酶，其底物和其使用方法 |
| CN106755000A (zh) * | 2017-03-10 | 2017-05-31 | 安徽医学高等专科学校 | 一种优化的谷氨酰胺转氨酶基因和前导序列及其分泌表达 |
| CN107586764A (zh) * | 2017-09-26 | 2018-01-16 | 天津科技大学 | 一种谷氨酰胺转氨酶突变体及其基因、工程菌和制备方法 |
| CN107586764B (zh) * | 2017-09-26 | 2020-06-09 | 天津科技大学 | 一种谷氨酰胺转氨酶突变体及其基因、工程菌和制备方法 |
| CN111386346A (zh) * | 2017-11-30 | 2020-07-07 | 天野酶制品株式会社 | 修饰型转谷氨酰胺酶 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101263225A (zh) | 2008-09-10 |
| WO2007020290A1 (en) | 2007-02-22 |
| US20090117640A1 (en) | 2009-05-07 |
| EP1920050A1 (en) | 2008-05-14 |
| JP2009504170A (ja) | 2009-02-05 |
| EP1919946A1 (en) | 2008-05-14 |
| WO2007020291A1 (en) | 2007-02-22 |
| JP2009504171A (ja) | 2009-02-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101287757A (zh) | 特异性改进的转谷氨酰胺酶变异体 | |
| CN101506233A (zh) | 具有提高的特异性的转谷氨酰胺酶变异体 | |
| JP2021020958A (ja) | 加水分解に対する合成の比が改善したスブチリシン変異体を使用するペプチド断片縮合及び環化 | |
| KR20030087042A (ko) | 단백질의 분비 생산 방법 | |
| US7807443B2 (en) | Microorganisms providing novel gene products forming or decomposing polyamino acids | |
| AU632002B2 (en) | A novel protease | |
| CN102666570B (zh) | 新的肽基α-羟基甘氨酸α-酰胺化裂合酶 | |
| KR100484602B1 (ko) | 박테리아 발현 시스템에서 포밀-메티오닌 펩타이드의 탈포밀화 | |
| Kim et al. | Primary structure, sequence analysis, and expression of the thermostable D-hydantoinase from Bacillus stearothermophilus SD1 | |
| NZ285576A (en) | Dna encoding a bacterial keratinase | |
| KR20140019436A (ko) | 발현 방법 | |
| JP7246323B2 (ja) | Ｓ２又はｓ２’ポケット中の突然変異を有するサブチリシンバリアント | |
| WO1997033984A1 (en) | Novel achromobacter lyticus protease variants | |
| JP3284103B2 (ja) | 変異型ズブチリシンｙａｂ及びその適用 | |
| Norrander et al. | Manipulation and expression of the maize zein storage proteins in Escherichia coli | |
| Nakase et al. | Substrate recognition mechanism of carboxypeptidase Y | |
| CAMPANER et al. | Limited proteolysis and site-directed mutagenesis reveal the origin of microheterogeneity in Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase | |
| US5770424A (en) | DNA constructs and methods of producing xylanolytic enzymes | |
| EP4122944A1 (en) | Enzymatic synthesis of cyclic peptides | |
| KR940011339B1 (ko) | 세린프로테아제억제제의 제조를 위한 dna 재조합 방법 | |
| Kimura | 4.2 Chemical and Genetic Mutation of Enzymes for Creating Novel Catalysts | |
| JP2002253246A (ja) | Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C04 | Withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Open date: 20081015 |