JP2009504171A - トランスグルタミナーゼ基質特異性の向上 - Google Patents
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Abstract
位置Tyr-75、Tyr-302、又はAsp-304に一又は複数の置換を有するS.モバレンス由来のトランスグルタミナーゼ。
Description
(技術分野)
本発明は、ストレプトマイセス・モバレンス(Streptomyces mobaraense)由来のトランスグルタミナーゼの新規の変異体に関する。この変異体は、向上された選択性を有するペプチドを修飾するために使われてもよい。
本発明は、ストレプトマイセス・モバレンス(Streptomyces mobaraense)由来のトランスグルタミナーゼの新規の変異体に関する。この変異体は、向上された選択性を有するペプチドを修飾するために使われてもよい。
(発明の背景)
適切に性質を変えるタンパク質に基をコンジュゲートすることによってペプチドの性質及び特徴を修飾することは、周知である。特に治療用のペプチドにとって、ペプチドの半減期を延長するペプチドへの基のコンジュゲートは、望ましいか又は、さらに必要である。一般的に、このようなコンジュゲート基はポリエチレングリコール(PEG)又は脂肪酸である−J.Biol.Chem. 271, 21969-21977 (1996)を参照。
既にトランスグルタミナーゼ(TGアーゼ)を用いてペプチドの性質が変更されている。食品産業、特にダイアリー産業において、例えばTGアーゼを用いた交差結合ペプチドには多くの技術が有用である。他の文書は、生理的に活性なペプチドの性質を変更するためのTGアーゼの使用を開示する。欧州特許第950665号、欧州特許第785276号及びSato, Adv. Drug Delivery Rev. 54, 487-504 (2002)は、TGアーゼの存在下で、少なくとも一のGlnとアミン-機能化PEGないしは類似のリガンドを含んでなるペプチド間の直接反応を開示し、、Biotech. Lett. 23, 1367-1372 (2001)においてWadaは、TGアーゼによる脂肪酸とのβ-ラクトグロブリンの直接的な結合を開示する。国際特許出願の国際公開第2005070468号は、TGアーゼを用いて官能基をグルタミン含有ペプチドに組み込んで機能化ペプチドを形成してもよいこと、そしてその後の工程においてこの機能化ペプチドを該機能化タンパク質と反応してPEG化ペプチドを形成しうるPEGなどと反応させてもよいことを開示している。
適切に性質を変えるタンパク質に基をコンジュゲートすることによってペプチドの性質及び特徴を修飾することは、周知である。特に治療用のペプチドにとって、ペプチドの半減期を延長するペプチドへの基のコンジュゲートは、望ましいか又は、さらに必要である。一般的に、このようなコンジュゲート基はポリエチレングリコール(PEG)又は脂肪酸である−J.Biol.Chem. 271, 21969-21977 (1996)を参照。
既にトランスグルタミナーゼ(TGアーゼ)を用いてペプチドの性質が変更されている。食品産業、特にダイアリー産業において、例えばTGアーゼを用いた交差結合ペプチドには多くの技術が有用である。他の文書は、生理的に活性なペプチドの性質を変更するためのTGアーゼの使用を開示する。欧州特許第950665号、欧州特許第785276号及びSato, Adv. Drug Delivery Rev. 54, 487-504 (2002)は、TGアーゼの存在下で、少なくとも一のGlnとアミン-機能化PEGないしは類似のリガンドを含んでなるペプチド間の直接反応を開示し、、Biotech. Lett. 23, 1367-1372 (2001)においてWadaは、TGアーゼによる脂肪酸とのβ-ラクトグロブリンの直接的な結合を開示する。国際特許出願の国際公開第2005070468号は、TGアーゼを用いて官能基をグルタミン含有ペプチドに組み込んで機能化ペプチドを形成してもよいこと、そしてその後の工程においてこの機能化ペプチドを該機能化タンパク質と反応してPEG化ペプチドを形成しうるPEGなどと反応させてもよいことを開示している。
また、トランスグルタミナーゼ(E.C.2.3.2.13)は、タンパク質-グルタミン-γ-グルタミルトランスフェラーゼとして知られていて、以下のような一般的な反応を触媒する。
このとき、Q-C(O)-NH2はグルタミン含有ペプチドを表し、次いでQ'-NH2は、上記の反応においてペプチドに取り込まれる官能基を提供するアミンドナーを表す。
このとき、Q-C(O)-NH2はグルタミン含有ペプチドを表し、次いでQ'-NH2は、上記の反応においてペプチドに取り込まれる官能基を提供するアミンドナーを表す。
インビボにおいて一般的なアミンドナーはペプチド結合リジンであり、次いで上記の反応によりペプチドの交差結合が生じる。凝固因子第XIII因子は、損傷の際の血液の凝固に作用するトランスグルタミナーゼである。例えばGlnのまわりのどのアミノ酸残基がタンパク質が基質であるために必要であるかは、異なるTGアーゼで互いに異なる。すなわち、異なるTGアーゼは、どのアミノ酸残基がGln残基に隣接しているかによって基質として異なるGln含有ペプチドを有するであろう。修飾されるペプチドが1より多いGln残基を含有する場合に、この態様が利用されうる。存在するGln残基のいくつかでペプチドを選択的にコンジュゲートすることが望ましい場合、関連するGln残基(一又は複数)を基質として受け入れるだけであるTGアーゼの選別によってこの選択性が可能となりうる。
ヒト成長ホルモン(hGH)は11のグルタミン残基を含んでなり、任意のTGアーゼが媒介するhGHのコンジュゲートは低選択性によって潜在的に妨害される。特定の反応条件下において、S.モバレンスTGアーゼ媒介反応においてhGHが機能化される上記の2工程のコンジュゲート反応は、2つの位置、すなわち40-Gln及び141-Glnで機能化されているhGHを生じうることを発見した。hGHのより特異的な機能化を媒介するTGアーゼの変異体を同定する必要がある。
ヒト成長ホルモン(hGH)は11のグルタミン残基を含んでなり、任意のTGアーゼが媒介するhGHのコンジュゲートは低選択性によって潜在的に妨害される。特定の反応条件下において、S.モバレンスTGアーゼ媒介反応においてhGHが機能化される上記の2工程のコンジュゲート反応は、2つの位置、すなわち40-Gln及び141-Glnで機能化されているhGHを生じうることを発見した。hGHのより特異的な機能化を媒介するTGアーゼの変異体を同定する必要がある。
(発明の概要)
本発明の発明者は、驚くべきことに、S.モバレンスのTGアーゼの特定のアミノ酸残基の置換によりhGHをより特異的に機能化するTGアーゼを産出することを発見した。
一実施態様では、本発明は、3以下の酸性又は塩基性のアミノ酸残基が他の塩基性又は酸性のアミノ酸残基に置換されているS.モバレンスのTGアーゼ(配列番号1)に関する。
一実施態様では、本発明は、置換Tyr-75→酸性アミノ酸残基;Tyr-302→塩基性アミノ酸残基;及び、Asp-304→塩基性アミノ酸残基のうちの一又は複数を含んでなる、配列番号1に示すペプチドに関する。
一実施態様では、本発明は、本発明に係るペプチドをコードする核酸コンストラクトに関する。
一実施態様では、本発明は、本発明に係るペプチドをコードする核酸を含んでなるベクターに関する。
一実施態様では、本発明は、本発明に係るペプチドをコードする核酸を含んでなるベクターを含む宿主に関する。
一実施態様では、本発明は、本発明に係るペプチドを含んでなる組成物に関する。
一実施態様では、本発明は、hGHのコンジュゲート方法であって、本発明に係るペプチドの存在下でアミンドナーとhGHを反応させることを含んでなる方法に関する。
本発明の発明者は、驚くべきことに、S.モバレンスのTGアーゼの特定のアミノ酸残基の置換によりhGHをより特異的に機能化するTGアーゼを産出することを発見した。
一実施態様では、本発明は、3以下の酸性又は塩基性のアミノ酸残基が他の塩基性又は酸性のアミノ酸残基に置換されているS.モバレンスのTGアーゼ(配列番号1)に関する。
一実施態様では、本発明は、置換Tyr-75→酸性アミノ酸残基;Tyr-302→塩基性アミノ酸残基;及び、Asp-304→塩基性アミノ酸残基のうちの一又は複数を含んでなる、配列番号1に示すペプチドに関する。
一実施態様では、本発明は、本発明に係るペプチドをコードする核酸コンストラクトに関する。
一実施態様では、本発明は、本発明に係るペプチドをコードする核酸を含んでなるベクターに関する。
一実施態様では、本発明は、本発明に係るペプチドをコードする核酸を含んでなるベクターを含む宿主に関する。
一実施態様では、本発明は、本発明に係るペプチドを含んでなる組成物に関する。
一実施態様では、本発明は、hGHのコンジュゲート方法であって、本発明に係るペプチドの存在下でアミンドナーとhGHを反応させることを含んでなる方法に関する。
(本発明の説明)
本明細書において、「酸性アミノ酸残基」なる用語は、7未満のpKaを有する天然のアミノ酸残基を示すことを意図する。具体的な例はAsp及びGluを含む。
本明細書において、「塩基性アミノ酸残基」なる用語は、7より上のpKaを有する天然のアミノ酸残基を示すことを意図する。具体的な例はTyr、Lys及びArgを含む。
本明細書において「アミノ基転移」又はその類似語は、グルタミンの側鎖の窒素が他の化合物の窒素、特に他の窒素含有求核試薬の窒素と交換される反応を示すことを意図する。
名詞の「コンジュゲート」なる用語は、修飾した(変更した)ペプチド、すなわち、該ペプチドの性質を修飾するために結合した成分を有するペプチドを表すことを意図する。動詞としては、この用語は、前記ペプチドの性質を修飾するためにペプチドに成分を結合する過程を示すことを意図する。
本明細書において、「酸性アミノ酸残基」なる用語は、7未満のpKaを有する天然のアミノ酸残基を示すことを意図する。具体的な例はAsp及びGluを含む。
本明細書において、「塩基性アミノ酸残基」なる用語は、7より上のpKaを有する天然のアミノ酸残基を示すことを意図する。具体的な例はTyr、Lys及びArgを含む。
本明細書において「アミノ基転移」又はその類似語は、グルタミンの側鎖の窒素が他の化合物の窒素、特に他の窒素含有求核試薬の窒素と交換される反応を示すことを意図する。
名詞の「コンジュゲート」なる用語は、修飾した(変更した)ペプチド、すなわち、該ペプチドの性質を修飾するために結合した成分を有するペプチドを表すことを意図する。動詞としては、この用語は、前記ペプチドの性質を修飾するためにペプチドに成分を結合する過程を示すことを意図する。
本明細書において、「特異性」及び「選択性」なる用語は交換可能に用いられ、hGHの他の特定のグルタミン残基と比較して、hGHの一又は複数の特定のグルタミン残基との反応に対するTGアーゼの優先度を表す。本明細書のために、hGHのGln141と比較したGln-40に関する本発明のペプチドの特異性は、実施例3に記載のように測定される。
また、微生物ストレプトマイセス・モバレンシスはストレプトベルチキリウム・モバレンスにも分類される。TGアーゼは生物体から単離されてもよく、このTGアーゼは相対的に低い分子量(〜38kDa)であることと、カルシウム非依存性であることに特徴を有する。S. モバレンスのTGアーゼは比較的十分に記載されている;例えば、結晶構造が解析されている(米国特許第156956号;Appl. Microbiol. Biotech. 64, 447-454 (2004))。
また、微生物ストレプトマイセス・モバレンシスはストレプトベルチキリウム・モバレンスにも分類される。TGアーゼは生物体から単離されてもよく、このTGアーゼは相対的に低い分子量(〜38kDa)であることと、カルシウム非依存性であることに特徴を有する。S. モバレンスのTGアーゼは比較的十分に記載されている;例えば、結晶構造が解析されている(米国特許第156956号;Appl. Microbiol. Biotech. 64, 447-454 (2004))。
コンジュゲートされたhGHを調製する一つの方法は、機能化したhGHを産出するための、官能基を含んでなるアミンドナーとhGHとの間の第一反応を含んでなり、この第一反応はTGアーゼに媒介される(すなわち触媒される)ものである。第二反応工程では、前記の機能化したhGHを、前記の組み込まれた官能基と反応してコンジュゲートされたhGHを提供することが可能なPEG又は脂肪酸などとさらに反応させる。第一反応を以下に略図する。
Xは、官能基又は潜在的な官能基、すなわち更なる反応、例えば酸化又は加水分解の際に官能基に変わる基を表す。
Xは、官能基又は潜在的な官能基、すなわち更なる反応、例えば酸化又は加水分解の際に官能基に変わる基を表す。
上記の反応がS.モバレンスのTGアーゼによって媒介される場合、hGHとH2N-X(アミンドナー)との間の反応は主にGln-40及びGln-141で起こる。上記の反応を用いてhGHをPEG化するなどして、延長された半減期を有する治療用の成長ホルモン生成物を獲得しうる。一般的に治療用組成物が単一の化合物組成物であることが望ましいので、上記の特異性の欠如には、Gln-40機能化hGHがGln-141機能化hGH及び/又は、Gln-40/Gln-141二重機能化hGHから分離される更なる精製工程が必要である。
本発明のペプチドは、hGHのGln-141と比較してGln-40に対して特異性を有し、この特異性は実施例3に記載のように測定するところの、Gln-141と比較してGln-40に対する、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性と異なるものである。したがって、本発明のペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を有するTGアーゼを用いた反応と比較して、記載の方法において産生されるGln-40機能化hGH又はGln-141機能化hGHの比率を変更するためのhGHのトランスグルタミン化方法に用いられてもよい。
本発明のペプチドは、hGHのGln-141と比較してGln-40に対して特異性を有し、この特異性は実施例3に記載のように測定するところの、Gln-141と比較してGln-40に対する、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性と異なるものである。したがって、本発明のペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を有するTGアーゼを用いた反応と比較して、記載の方法において産生されるGln-40機能化hGH又はGln-141機能化hGHの比率を変更するためのhGHのトランスグルタミン化方法に用いられてもよい。
以下は、本発明の実施態様の非制限的な一覧である。
実施態様1:Tyr-75、Tyr-302、Asp-304から選択されるアミノ酸残基の一又は複数が修飾されている、配列番号1に示す配列を含んでなる単離されたペプチド。
実施態様2:前記配列のTyr-75が修飾される、実施態様1に記載の単離されたペプチド。
実施態様3:Tyr-75が酸性アミノ酸残基に置換される、実施態様2に記載の単離されたペプチド。
実施態様4:Tyr-75がAsp又はGluに置換される、実施態様3に記載の単離されたペプチド。
実施態様5:Tyr-75がGluに置換される、実施態様4に記載の単離されたペプチド。
実施態様6:前記配列のTyr-302が修飾される、実施態様1から5のいずれか一に記載の単離されたペプチド。
実施態様7:Tyr-302がTyrと異なる塩基性アミノ酸残基に置換される、実施態様6に記載の単離されたペプチド。
実施態様8:Tyr-302がArg又はLysに置換される、実施態様7に記載の単離されたペプチド。
実施態様9:Tyr-302がArgに置換される、実施態様8に記載の単離されたペプチド。
実施態様10:前記配列のAsp-304が修飾される、実施態様1から9のいずれか一に記載の単離されたペプチド。
実施態様11:Asp-304が塩基性アミノ酸残基に置換される、実施態様10に記載の単離されたペプチド。
実施態様12:Asp-304がTyr、Lys又はArgに置換される、実施態様11に記載の単離されたペプチド。
実施態様13:Asp-304がLysに置換される、実施態様12に記載の単離されたペプチド。
実施態様14:配列番号2に示す配列を有する実施態様5に記載の単離されたペプチド。
実施態様15:配列番号3に示す配列を有する実施態様9に記載の単離されたペプチド。
実施態様16:配列番号4に示す配列を有する実施態様13に記載の単離されたペプチド。
実施態様17:配列番号5に示す配列を有する実施態様2〜13のいずれか一に記載の単離されたペプチド。
実施態様18:置換Tyr-75→酸性アミノ酸残基;Tyr-302→Tyrでない塩基性アミノ酸残基;及び、Asp-304→塩基性アミノ酸残基のうちの一又は複数を含んでなる、配列番号1に示す配列を含んでなるペプチド。
実施態様19:置換Tyr-75→Asp又はGlu;Tyr-302→Arg又はLys;及び、Asp-304→Tyr、Lys又はArgのうちの一又は複数を含んでなる配列番号1に示す配列を有する、実施態様18に記載のペプチド。
実施態様20:置換Tyr-75→Glu;Tyr-302→Arg;及び、Asp-304→Lysのうちの一又は複数を含んでなる配列番号1に示す配列を有する、実施態様18又は19に記載のペプチド。
実施態様21:配列が、Tyr-75のGluとの置換とTyr-302のArgとの置換を含んでなる配列番号1に示すものである、実施態様18から20のいずれか一に記載のペプチド。
実施態様22:配列が配列番号2に示すものである、実施態様18から20のいずれか一に記載のペプチド。
実施態様23:配列が配列番号3に示すものである、実施態様18から20のいずれか一に記載のペプチド。
実施態様24:配列が配列番号4に示すものである、実施態様18から20のいずれか一に記載のペプチド。
実施態様25:配列が配列番号5に示すものである、実施態様18に記載のペプチド。
実施態様26:ペプチドがトランスグルタミナーゼ活性を有する、実施態様1から25のいずれか一に記載のペプチド。
実施態様27:ペプチドがhGHのGln-141と比較してhGHのGln-40に特異性を有し、hGHのGln-141と比較してhGHのGln-40に対して、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチドと特異性が異なる、実施態様1から26のいずれか一に記載の単離されたペプチド。
実施態様28:ペプチドがhGHのGln-141と比較してhGHのGln-40に特異性を有し、hGHのGln-141と比較してhGHのGln-40に対して、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチドよりも特異性が高い、実施態様27に記載の単離されたペプチド。
実施態様29:hGHのGln-141と比較してhGHのGln-40に特異性を有するトランスグルタミナーゼであって、hGHのGln-141と比較してhGHのGln-40に対して、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチドと特異性が異なるトランスグルタミナーゼ。
実施態様30:hGHのGln-141と比較してhGHのGln-40に特異性を有し、hGHのGln-141と比較してhGHのGln-40に対して、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチドよりも特異性が高い、実施態様29に記載のトランスグルタミナーゼ。
実施態様31:実施態様1から30のいずれか一に記載のペプチドをコードする核酸コンストラクト。
実施態様32:実施態様31に記載の核酸コンストラクトを含んでなるベクター。
実施態様33:実施態様32に記載のベクターを含んでなる宿主。
実施態様34:実施態様1から30のいずれか一に記載のペプチドを含んでなる組成物。
実施態様35:hGHのコンジュゲート方法であって、実施態様1から30のいずれか一に記載のペプチドの存在下でアミンドナーと該hGHを反応させることを含んでなる方法。
実施態様36:位置Gln-141でコンジュゲートされたhGHの量と比較したときの位置Gln-40でコンジュゲートされたhGHの量が、前記方法においてペプチドが実施態様1から30のいずれか一に記載のペプチドでなく、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチドが用いられる場合の位置Gln-141でコンジュゲートされたhGHの量と比較したときの位置Gln-40でコンジュゲートされたhGHと比べて量が有意に増加する、実施態様35に記載のhGHのコンジュゲート方法。
実施態様37:コンジュゲートされたhGHの調製における実施態様1から30のいずれか一に記載のペプチドの使用。
実施態様38:hGHが位置Gln-40でコンジュゲートされる、実施態様37に記載の使用。
実施態様1:Tyr-75、Tyr-302、Asp-304から選択されるアミノ酸残基の一又は複数が修飾されている、配列番号1に示す配列を含んでなる単離されたペプチド。
実施態様2:前記配列のTyr-75が修飾される、実施態様1に記載の単離されたペプチド。
実施態様3:Tyr-75が酸性アミノ酸残基に置換される、実施態様2に記載の単離されたペプチド。
実施態様4:Tyr-75がAsp又はGluに置換される、実施態様3に記載の単離されたペプチド。
実施態様5:Tyr-75がGluに置換される、実施態様4に記載の単離されたペプチド。
実施態様6:前記配列のTyr-302が修飾される、実施態様1から5のいずれか一に記載の単離されたペプチド。
実施態様7:Tyr-302がTyrと異なる塩基性アミノ酸残基に置換される、実施態様6に記載の単離されたペプチド。
実施態様8:Tyr-302がArg又はLysに置換される、実施態様7に記載の単離されたペプチド。
実施態様9:Tyr-302がArgに置換される、実施態様8に記載の単離されたペプチド。
実施態様10:前記配列のAsp-304が修飾される、実施態様1から9のいずれか一に記載の単離されたペプチド。
実施態様11:Asp-304が塩基性アミノ酸残基に置換される、実施態様10に記載の単離されたペプチド。
実施態様12:Asp-304がTyr、Lys又はArgに置換される、実施態様11に記載の単離されたペプチド。
実施態様13:Asp-304がLysに置換される、実施態様12に記載の単離されたペプチド。
実施態様14:配列番号2に示す配列を有する実施態様5に記載の単離されたペプチド。
実施態様15:配列番号3に示す配列を有する実施態様9に記載の単離されたペプチド。
実施態様16:配列番号4に示す配列を有する実施態様13に記載の単離されたペプチド。
実施態様17:配列番号5に示す配列を有する実施態様2〜13のいずれか一に記載の単離されたペプチド。
実施態様18:置換Tyr-75→酸性アミノ酸残基;Tyr-302→Tyrでない塩基性アミノ酸残基;及び、Asp-304→塩基性アミノ酸残基のうちの一又は複数を含んでなる、配列番号1に示す配列を含んでなるペプチド。
実施態様19:置換Tyr-75→Asp又はGlu;Tyr-302→Arg又はLys;及び、Asp-304→Tyr、Lys又はArgのうちの一又は複数を含んでなる配列番号1に示す配列を有する、実施態様18に記載のペプチド。
実施態様20:置換Tyr-75→Glu;Tyr-302→Arg;及び、Asp-304→Lysのうちの一又は複数を含んでなる配列番号1に示す配列を有する、実施態様18又は19に記載のペプチド。
実施態様21:配列が、Tyr-75のGluとの置換とTyr-302のArgとの置換を含んでなる配列番号1に示すものである、実施態様18から20のいずれか一に記載のペプチド。
実施態様22:配列が配列番号2に示すものである、実施態様18から20のいずれか一に記載のペプチド。
実施態様23:配列が配列番号3に示すものである、実施態様18から20のいずれか一に記載のペプチド。
実施態様24:配列が配列番号4に示すものである、実施態様18から20のいずれか一に記載のペプチド。
実施態様25:配列が配列番号5に示すものである、実施態様18に記載のペプチド。
実施態様26:ペプチドがトランスグルタミナーゼ活性を有する、実施態様1から25のいずれか一に記載のペプチド。
実施態様27:ペプチドがhGHのGln-141と比較してhGHのGln-40に特異性を有し、hGHのGln-141と比較してhGHのGln-40に対して、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチドと特異性が異なる、実施態様1から26のいずれか一に記載の単離されたペプチド。
実施態様28:ペプチドがhGHのGln-141と比較してhGHのGln-40に特異性を有し、hGHのGln-141と比較してhGHのGln-40に対して、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチドよりも特異性が高い、実施態様27に記載の単離されたペプチド。
実施態様29:hGHのGln-141と比較してhGHのGln-40に特異性を有するトランスグルタミナーゼであって、hGHのGln-141と比較してhGHのGln-40に対して、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチドと特異性が異なるトランスグルタミナーゼ。
実施態様30:hGHのGln-141と比較してhGHのGln-40に特異性を有し、hGHのGln-141と比較してhGHのGln-40に対して、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチドよりも特異性が高い、実施態様29に記載のトランスグルタミナーゼ。
実施態様31:実施態様1から30のいずれか一に記載のペプチドをコードする核酸コンストラクト。
実施態様32:実施態様31に記載の核酸コンストラクトを含んでなるベクター。
実施態様33:実施態様32に記載のベクターを含んでなる宿主。
実施態様34:実施態様1から30のいずれか一に記載のペプチドを含んでなる組成物。
実施態様35:hGHのコンジュゲート方法であって、実施態様1から30のいずれか一に記載のペプチドの存在下でアミンドナーと該hGHを反応させることを含んでなる方法。
実施態様36:位置Gln-141でコンジュゲートされたhGHの量と比較したときの位置Gln-40でコンジュゲートされたhGHの量が、前記方法においてペプチドが実施態様1から30のいずれか一に記載のペプチドでなく、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチドが用いられる場合の位置Gln-141でコンジュゲートされたhGHの量と比較したときの位置Gln-40でコンジュゲートされたhGHと比べて量が有意に増加する、実施態様35に記載のhGHのコンジュゲート方法。
実施態様37:コンジュゲートされたhGHの調製における実施態様1から30のいずれか一に記載のペプチドの使用。
実施態様38:hGHが位置Gln-40でコンジュゲートされる、実施態様37に記載の使用。
一実施態様では、Gln-141と比較したときのGln-40に対する本発明のペプチドの特異性が、Gln-141と比較してGln-40に対して、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性よりも高く、その結果、本明細書中に記載のTGアーゼを用いたトランスグルタミナーゼ反応においてGln-141と比較したときのGln-40の産生が増加する。
一実施態様では、Gln-141と比較したときのGln-40に対する本発明のペプチドの特異性は、Gln-141と比較してGln-40に対して、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性より、少なくとも1.25、例として少なくとも1.50、例えば少なくとも1.75、例として少なくとも2.0、例えば少なくとも2.5、例として少なくとも3.0、例えば少なくとも3.5、例として少なくとも4.0、例えば少なくとも4.5、例として少なくとも5.0、例えば少なくとも5.5、例として少なくとも6.0、例えば少なくとも6.5、例として少なくとも7.0、例えば少なくとも7.5、例として少なくとも8.0、例えば少なくとも8.5、例として少なくとも9.0、例えば少なくとも9.5で、例として少なくとも10.0倍高い。
一実施態様では、Gln-141と比較したときのGln-40に対する本発明のペプチドの特異性は、Gln-141と比較してGln-40に対して、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性より、少なくとも1.25、例として少なくとも1.50、例えば少なくとも1.75、例として少なくとも2.0、例えば少なくとも2.5、例として少なくとも3.0、例えば少なくとも3.5、例として少なくとも4.0、例えば少なくとも4.5、例として少なくとも5.0、例えば少なくとも5.5、例として少なくとも6.0、例えば少なくとも6.5、例として少なくとも7.0、例えば少なくとも7.5、例として少なくとも8.0、例えば少なくとも8.5、例として少なくとも9.0、例えば少なくとも9.5で、例として少なくとも10.0倍高い。
配列番号2に記載のTGアーゼが用いられる場合、主にGln-141機能化hGHが得られ、ごくわずかな量のGln-40機能化hGH又は、Gln-40/Gln-141二重機能化hGHが得られる。
一実施態様では、本発明は、配列番号1に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチドであって、このとき配列Tyr-75がAsp又はGluに置換されている;及び/又は、Tyr-302がArg又はLysに置換されている;及び/又は、Asp-304がTyr、Lys又はArgに置換されているペプチドに関する。
一実施態様では、本発明は、配列番号1に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチドであって、このとき配列Tyr-75がGluに置換されている;及び/又は、Tyr-302がArgに置換されている;及び/又は、Asp-304がLysに置換されているペプチドに関する。
一実施態様では、本発明は、Tyr-75→Glu置換を有する配列番号1である、配列番号2に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチドに関する:
一実施態様では、本発明は、Tyr-302→Arg置換を有する配列番号1である、配列番号3に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチドに関する。
一実施態様では、Asp-304→Lys置換を有する配列番号1である、配列番号4に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチドに関する。
一実施態様では、本発明は、Tyr-75→Glu置換、Tyr-302→Arg置換及びAsp-304→Lys置換を有する配列番号1である、配列番号5に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチドに関する。
一実施態様では、本発明は、配列番号1に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチドであって、このとき配列Tyr-75がAsp又はGluに置換されている;及び/又は、Tyr-302がArg又はLysに置換されている;及び/又は、Asp-304がTyr、Lys又はArgに置換されているペプチドに関する。
一実施態様では、本発明は、配列番号1に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチドであって、このとき配列Tyr-75がGluに置換されている;及び/又は、Tyr-302がArgに置換されている;及び/又は、Asp-304がLysに置換されているペプチドに関する。
一実施態様では、本発明は、Tyr-75→Glu置換を有する配列番号1である、配列番号2に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチドに関する:
一実施態様では、本発明は、Tyr-302→Arg置換を有する配列番号1である、配列番号3に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチドに関する。
一実施態様では、Asp-304→Lys置換を有する配列番号1である、配列番号4に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチドに関する。
一実施態様では、本発明は、Tyr-75→Glu置換、Tyr-302→Arg置換及びAsp-304→Lys置換を有する配列番号1である、配列番号5に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチドに関する。
米国特許第5156956号に記載のアッセイにおいて決定されるように、本発明のペプチドはTGアーゼ活性を表す。簡単に説明すると、所定のペプチドの活性の測定は、Ca2+の非存在下でベンジルオキシカルボニル-L-グルタミニルグリシン及びヒドロキシルアミンを基質として用いた反応を行うこと、トリクロロ酢酸の存在下で結果として生じるヒドロキサム酸との鉄複合体を形成すること、525nmの吸光度を測定すること及び、ヒドロキサム酸の量を較正曲線によって測定して活性を算出することによって実施される。本明細書のために、前記アッセイにおいてトランスグルタミナーゼ活性を表すペプチドをトランスグルタミナーゼ活性を有するものとみなした。特に、本発明のTGアーゼ変異体は、S. モバレンスのTGアーゼの活性の30%より高い、例として50%より高い、例として70%より高い、例として90%より高い活性を表す。
一実施態様では、本発明は、配列番号:2、3、4又は5のいずれかを有するポリペプチドを含んでなる組成物に関する。
一実施態様では、本発明は、配列番号:2、3、4又は5のいずれかを有するポリペプチドを含んでなる組成物に関する。
本発明のペプチドは異なる方法で調製されてもよい。ペプチドは、当分野で公知のタンパク質合成方法によって調製されてもよい。ペプチドのサイズによって、本発明のペプチドを提供するためにその時組み合わされるいくつかのペプチドの断片を合成することによってより都合よく行われてもよい。しかしながら、特定の実施態様では、本発明のペプチドは、本発明のペプチドをコードする核酸コンストラクトを含んでなる好適な宿主の発酵によって調製される。
一実施態様では、本発明はまた、本発明のペプチドをコードする核酸コンストラクトにも関する。
本明細書中で用いられる「核酸コンストラクト」なる用語は、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA又はRNA起源の任意の核酸分子を示すことを意図する。「コンストラクト」なる用語は、一本鎖又は二本鎖であり、対象のタンパク質をコードする完全ないしは部分的な天然に生じるヌクレオチド配列に基づきうる核酸セグメントを示すことを意図する。場合によってコンストラクトは他の核酸セグメントを含有してもよい。
本発明のペプチドをコードする本発明の核酸コンストラクトは、適切にゲノム又はcDNAの起源のものでよく、例えばゲノム又はcDNAライブラリを調製して、標準的な技術に従った合成オリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションによってすべて又は一部のタンパク質をコードするDNA配列をスクリーニングすることによって得てもよい(J. Sambrook等, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照)。
本明細書中で用いられる「核酸コンストラクト」なる用語は、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA又はRNA起源の任意の核酸分子を示すことを意図する。「コンストラクト」なる用語は、一本鎖又は二本鎖であり、対象のタンパク質をコードする完全ないしは部分的な天然に生じるヌクレオチド配列に基づきうる核酸セグメントを示すことを意図する。場合によってコンストラクトは他の核酸セグメントを含有してもよい。
本発明のペプチドをコードする本発明の核酸コンストラクトは、適切にゲノム又はcDNAの起源のものでよく、例えばゲノム又はcDNAライブラリを調製して、標準的な技術に従った合成オリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションによってすべて又は一部のタンパク質をコードするDNA配列をスクリーニングすることによって得てもよい(J. Sambrook等, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照)。
また、タンパク質をコードする本発明の核酸コンストラクトは、確立された標準的な方法、例えばBeaucage及びCaruthers, Tetrahedron Letters 22, 1859-1869 (1981)に記載の亜リン酸アミダイト法又はMatthes等., EMBO Journal 3, 801-805 (1984)に記載の方法などによって合成して調製してもよい。リン酸アミダイト法によると、オリゴヌクレオチドは、例えば自動DNA合成機において合成され、精製され、アニールされ、ライゲートされ、適切なベクターにクローニングされる。
さらに、核酸コンストラクトは、標準的な技術によって、核酸コンストラクト全体の様々な部分に対応する断片である合成起源、ゲノム起源又はcDNA起源(必要に応じて)の断片をライゲートすることによって調製された、混合した合成とゲノムの起源、混合した合成とcDNAの起源、又は混合したゲノムとcDNAの起源のものであってもよい。
また、例えば米国特許第4683202号又はSaiki等, Science 239, 487-491 (1988)に記載のように、核酸コンストラクトは、特定のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって調製されてもよい。
核酸コンストラクトは以下、もっぱら用いられるDNAコンストラクトであることが好ましい。
さらに、核酸コンストラクトは、標準的な技術によって、核酸コンストラクト全体の様々な部分に対応する断片である合成起源、ゲノム起源又はcDNA起源(必要に応じて)の断片をライゲートすることによって調製された、混合した合成とゲノムの起源、混合した合成とcDNAの起源、又は混合したゲノムとcDNAの起源のものであってもよい。
また、例えば米国特許第4683202号又はSaiki等, Science 239, 487-491 (1988)に記載のように、核酸コンストラクトは、特定のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって調製されてもよい。
核酸コンストラクトは以下、もっぱら用いられるDNAコンストラクトであることが好ましい。
更なる態様では、本発明は、本発明のDNAコンストラクトを含んでなる組み換えベクターに関する。本発明のDNAコンストラクトが挿入される組み換えベクターは、組み換えDNA手順に都合よく供される任意のベクターであってもよく、ベクターの選択は導入しようとする宿主細胞に依存することが多いであろう。したがって、ベクターは自己複製するベクター、すなわち染色体外の実体として存在し、その複製が染色体複製から独立しているベクター、例えばプラスミドであってもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入される場合、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、組み込まれている染色体(一又は複数)と共に複製されるものであってもよい。
好ましくは、ベクターは、本発明のタンパク質をコードするDNA配列がDNAの転写に必要な付加的なセグメントに作用可能に連結されている発現ベクターである。通常、発現ベクターは、プラスミド又はウイルスDNA由来であるか、又は両方の成分を含有してもよい。「作用可能に連結される」なる用語は、セグメントが、意図する目的の通りに機能するように、例えば転写がプロモーターにおいて開始しタンパク質をコードするDNA配列まで進行するように整列されることを表す。
好ましくは、ベクターは、本発明のタンパク質をコードするDNA配列がDNAの転写に必要な付加的なセグメントに作用可能に連結されている発現ベクターである。通常、発現ベクターは、プラスミド又はウイルスDNA由来であるか、又は両方の成分を含有してもよい。「作用可能に連結される」なる用語は、セグメントが、意図する目的の通りに機能するように、例えば転写がプロモーターにおいて開始しタンパク質をコードするDNA配列まで進行するように整列されることを表す。
プロモーターは、選択した宿主細胞において転写活性を示す任意のDNA配列でよく、宿主細胞に相同な又は異種性のタンパク質をコードする遺伝子由来でもよい。
酵母宿主細胞における使用に好適なプロモーターの例には、酵母糖分解遺伝子(Hitzeman等, J. Biol. Chem. 255, 12073-12080 (1980);Alber及びKawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 419 - 434 (1982))又はアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(Young等, in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender等, eds.), Plenum Press, New York, 1982)由来のプロモーター、又はTPI1(米国特許第4599311号)ないしははADH2-4c(Russell等, Nature 304, 652 - 654 (1983))プロモーターが含まれる。
糸状菌宿主細胞における使用に好適なプロモーターの例は、例えば、ADH3プロモーター(McKnight等, The EMBO J. 4, 2093 - 2099 (1985))又はtpiAプロモーターである。他の有用なプロモーターの例は、A. オリゼーTAKAアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼ、A. ニガー中性α-アミラーゼ、A. ニガー酸安定性α-アミラーゼ、A. ニガーないしはA. アワモリのグルコアミラーゼ(gluA)、リゾムコール・ミーヘイリパーゼ、A. オリゼーアルカリプロテアーゼ、A. オリゼートリオースリン酸イソメラーゼ、又はA.ニデュランスアセトアミダーゼをコードする遺伝子由来のものである。TAKA-アミラーゼ及びgluAプロモーターが好ましい。
細菌性宿主細胞における使用に好適なプロモーターの例には、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)マルトジェニック(maltogenic)アミラーゼ遺伝子、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)α-アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)BANアミラーゼ遺伝子、バチルス・スブチリスアルカリプロテアーゼ遺伝子、又はバチルス・プミラス(Bacillus pumilus)キシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、又は、ファージλPRプロモーターないしはPLプロモーターないしは大腸菌lac、trp又はtacプロモーターが含まれる。
酵母宿主細胞における使用に好適なプロモーターの例には、酵母糖分解遺伝子(Hitzeman等, J. Biol. Chem. 255, 12073-12080 (1980);Alber及びKawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 419 - 434 (1982))又はアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(Young等, in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender等, eds.), Plenum Press, New York, 1982)由来のプロモーター、又はTPI1(米国特許第4599311号)ないしははADH2-4c(Russell等, Nature 304, 652 - 654 (1983))プロモーターが含まれる。
糸状菌宿主細胞における使用に好適なプロモーターの例は、例えば、ADH3プロモーター(McKnight等, The EMBO J. 4, 2093 - 2099 (1985))又はtpiAプロモーターである。他の有用なプロモーターの例は、A. オリゼーTAKAアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼ、A. ニガー中性α-アミラーゼ、A. ニガー酸安定性α-アミラーゼ、A. ニガーないしはA. アワモリのグルコアミラーゼ(gluA)、リゾムコール・ミーヘイリパーゼ、A. オリゼーアルカリプロテアーゼ、A. オリゼートリオースリン酸イソメラーゼ、又はA.ニデュランスアセトアミダーゼをコードする遺伝子由来のものである。TAKA-アミラーゼ及びgluAプロモーターが好ましい。
細菌性宿主細胞における使用に好適なプロモーターの例には、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)マルトジェニック(maltogenic)アミラーゼ遺伝子、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)α-アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)BANアミラーゼ遺伝子、バチルス・スブチリスアルカリプロテアーゼ遺伝子、又はバチルス・プミラス(Bacillus pumilus)キシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、又は、ファージλPRプロモーターないしはPLプロモーターないしは大腸菌lac、trp又はtacプロモーターが含まれる。
また、本発明のタンパク質をコードするDNA配列は、必要に応じて、ヒト成長ホルモンターミネーター(前掲のPalmiter等)又は(真菌宿主のための)TPI1(前掲のAlber及びKawasaki)ないしはADH3(前掲のMcKnight等)ターミネーターなどの、適切な転写ターミネーターに作用可能に連結されうる。さらに、ベクターは、ポリアデニル化シグナル(例えばSV40又はアデノウイルス5Elb領域由来)、転写エンハンサー配列(例えばSV40エンハンサー)及び翻訳エンハンサー配列(例えばアデノウイルスVA RNAをコードするもの)などの成分を含みうる。
さらに、本発明の組み換えベクターは、問題の宿主細胞中でのベクターの複製を可能にするDNA配列を含みうる。
宿主細胞が酵母菌である場合、ベクターの複製を可能にする好適な配列は、酵母プラスミド2μ複製遺伝子REP1-3及び複製開始点である。
宿主細胞が細菌細胞である場合、ベクターの複製を可能にする配列は、DNAポリメラーゼIII複合体コード遺伝子及び複製開始点である。
さらに、本発明の組み換えベクターは、問題の宿主細胞中でのベクターの複製を可能にするDNA配列を含みうる。
宿主細胞が酵母菌である場合、ベクターの複製を可能にする好適な配列は、酵母プラスミド2μ複製遺伝子REP1-3及び複製開始点である。
宿主細胞が細菌細胞である場合、ベクターの複製を可能にする配列は、DNAポリメラーゼIII複合体コード遺伝子及び複製開始点である。
また、ベクターは、選択マーカー、例えば宿主細胞中の欠損を補う生成物の遺伝子、例として、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をコードする遺伝子又はシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)TPI遺伝子(P.R. Russell, Gene 40, 125-130 (1985)に記載)、又はアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン又はメトトレキセートなどの薬剤に耐性を与えるものを含む。糸状菌では、選択マーカーには、amdS、pyrG、argB、niaD及びsCが含まれる。
宿主細胞の分泌経路に本発明のタンパク質を導くために、分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列ともしても知られる)を組み換えベクターに提供してもよい。分泌シグナル配列を、正確なリーディングフレーム内のタンパク質をコードするDNA配列に結合する。一般的に、分泌シグナル配列はタンパク質をコードするDNA配列の5'に位置する。分泌シグナル配列は、タンパク質と正常に結合されるか、又は他の分泌されたタンパク質をコードする遺伝子からのものであってもよい。
宿主細胞の分泌経路に本発明のタンパク質を導くために、分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列ともしても知られる)を組み換えベクターに提供してもよい。分泌シグナル配列を、正確なリーディングフレーム内のタンパク質をコードするDNA配列に結合する。一般的に、分泌シグナル配列はタンパク質をコードするDNA配列の5'に位置する。分泌シグナル配列は、タンパク質と正常に結合されるか、又は他の分泌されたタンパク質をコードする遺伝子からのものであってもよい。
酵母細胞からの分泌には、分泌シグナル配列は、細胞の分泌経路内への発現されたタンパク質の効率的な誘導を導く任意のシグナルペプチドをコードしうる。シグナルペプチドは、天然に生じるペプチドないしはその機能的な部分であってよく、合成ペプチドであってもよい。好適なシグナルペプチドは、α-因子シグナルペプチド(米国特許第4870008号を参照)、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド(O. Hagenbuchle等, Nature 289, 643-646 (1981)を参照)、変性カルボキシペプチダーゼシグナルペプチド(L.A. Valls等, Cell 48, 887-897 (1987)を参照)、酵母BAR1シグナルペプチド(国際公開第87/02670号を参照)、又は酵母アスパラギン酸プロテアーゼ3(YAP3)シグナルペプチド(M. Egel-Mitani等, Yeast 6, 127-137 (1990)を参照)であることが明らかとなった。
酵母での効率的な分泌のために、リーダーペプチドをコードする配列も、シグナル配列の下流とタンパク質をコードするDNA配列の上流に挿入されうる。リーダーペプチドの機能は、発現されたタンパク質を小胞体からゴルジ体へ、さらに培養培地への分泌のために分泌小胞へ誘導することである(すなわち、細胞壁を越えて、又は少なくとも細胞膜を通過して酵母菌の細胞膜周辺腔へのタンパク質の輸出)。リーダーペプチドは酵母α-因子リーダーであってよい(その使用は例えば米国特許第4546082号、欧州特許第16201号、欧州特許第123294号、欧州特許第123544号及び欧州特許第163529号に記載される)。あるいは、リーダーペプチドは合成リーダーペプチドであってもよく、それは天然には見られないリーダーペプチドであると言える。合成リーダーペプチドは、例えば、国際公開第89/02463号又は国際公開第92/11378号に記載のように構築されてもよい。
酵母での効率的な分泌のために、リーダーペプチドをコードする配列も、シグナル配列の下流とタンパク質をコードするDNA配列の上流に挿入されうる。リーダーペプチドの機能は、発現されたタンパク質を小胞体からゴルジ体へ、さらに培養培地への分泌のために分泌小胞へ誘導することである(すなわち、細胞壁を越えて、又は少なくとも細胞膜を通過して酵母菌の細胞膜周辺腔へのタンパク質の輸出)。リーダーペプチドは酵母α-因子リーダーであってよい(その使用は例えば米国特許第4546082号、欧州特許第16201号、欧州特許第123294号、欧州特許第123544号及び欧州特許第163529号に記載される)。あるいは、リーダーペプチドは合成リーダーペプチドであってもよく、それは天然には見られないリーダーペプチドであると言える。合成リーダーペプチドは、例えば、国際公開第89/02463号又は国際公開第92/11378号に記載のように構築されてもよい。
糸状菌での使用について、シグナルペプチドは、都合よく、アスペルギルスsp.アミラーゼないしはグルコアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコール・ミーヘイリパーゼないしはプロテアーゼをコードする遺伝子、又はフミコーラ・ラヌギノーサ(Humicola lanuginosa)リパーゼをコードする遺伝子由来でもよい。シグナルペプチドは、A. オリゼーTAKAアミラーゼ、A. ニガー中性α-アミラーゼ、A. ニガー酸安定性アミラーゼ、又はA. ニガーグルコアミラーゼをコードする遺伝子由来であることが好ましい。
本タンパク質をコードするDNA配列、プロモータ及び場合によってターミネーター及び/又は分泌シグナル配列のそれぞれをライゲートして、複製に必要な情報を含む好適なベクターにこれらを挿入するために用いられる手順は、当業者に周知である(例えば上掲のSambrook等を参照のこと)。
本タンパク質をコードするDNA配列、プロモータ及び場合によってターミネーター及び/又は分泌シグナル配列のそれぞれをライゲートして、複製に必要な情報を含む好適なベクターにこれらを挿入するために用いられる手順は、当業者に周知である(例えば上掲のSambrook等を参照のこと)。
本発明のDNAコンストラクト又は組み換えベクターが導入される宿主細胞は、本タンパク質を生産することが可能である任意の細胞であって、細菌、酵母、真菌類及び高等真核細胞が含まれる。
培養の際に、本発明のタンパク質を生産することが可能である細菌性宿主細胞の例は、グラム陽性細菌、例えばB. スブチリス(B. subtilis)、B. リチェニホルミス(B. licheniformis)、B. レンタス(B. lentus)、B. ブレビス(B. brevis)、B. ステアロサーモフィルス(B. stearothermophilus)、B. アルカロフィルス(B. alkalophilus)、B. アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)、B. コアグランス(B. coagulans)、B. サーキュランス(B. circulans)、B. ロータス(B. lautus)、B. メガテリム(B. megatherium)又はB. サリンジエンシス(B. thuringiensis)などのバシラス属の株、又はS. リビタンス(S. lividans)又はS. ミュリナス(S. murinus)などのストレプトマイセス、又はエシェリキア・コリ(大腸菌)などのグラム陰性細菌である。細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換によって又は当然知られている方法のコンピテント細胞を用いて行ってもよい(上掲のSambrook等を参照)。他の好適な宿主には、S. モバレンス(S. mobaraense)、S. リビダンス(S. lividans)及びC. グルタミカム(C. glutamicum)が含まれる(Appl. Microbiol. Biotechnol. 64, 447-454 (2004))。
培養の際に、本発明のタンパク質を生産することが可能である細菌性宿主細胞の例は、グラム陽性細菌、例えばB. スブチリス(B. subtilis)、B. リチェニホルミス(B. licheniformis)、B. レンタス(B. lentus)、B. ブレビス(B. brevis)、B. ステアロサーモフィルス(B. stearothermophilus)、B. アルカロフィルス(B. alkalophilus)、B. アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)、B. コアグランス(B. coagulans)、B. サーキュランス(B. circulans)、B. ロータス(B. lautus)、B. メガテリム(B. megatherium)又はB. サリンジエンシス(B. thuringiensis)などのバシラス属の株、又はS. リビタンス(S. lividans)又はS. ミュリナス(S. murinus)などのストレプトマイセス、又はエシェリキア・コリ(大腸菌)などのグラム陰性細菌である。細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換によって又は当然知られている方法のコンピテント細胞を用いて行ってもよい(上掲のSambrook等を参照)。他の好適な宿主には、S. モバレンス(S. mobaraense)、S. リビダンス(S. lividans)及びC. グルタミカム(C. glutamicum)が含まれる(Appl. Microbiol. Biotechnol. 64, 447-454 (2004))。
大腸菌といった細菌でタンパク質が発現されると、タンパク質は、一般的に不溶性顆粒(封入体ともいう)として細胞質で保持されうるか、又は細菌性分泌配列によって細胞膜周辺腔に誘導されうる。前者の場合、細胞は溶解され、顆粒が回収されて変性された後に、変性剤を希釈することによってタンパク質が再フォールディングされる。後者の場合、タンパク質は、例えば超音波処理又は浸透圧ショックにより細胞を崩壊させて細胞膜周辺腔の内容物を放出させて、タンパク質を回収することによって細胞膜周辺腔から回収されうる。
好適な酵母細胞の例には、サッカロマイセスssp.又はシゾサッカロマイセスssp.の細胞、特にサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)又はサッカロマイセス・クリヴェリ(Saccharomyces kluyveri)の菌株が含まれる。異種性のDNAにより酵母細胞を形質転換して、そこから異種性タンパク質を生産する方法は、例えば米国特許第4599311号、米国特許第4931373号、米国特許第4870008号、米国特許第5037743号及び米国特許第4845075号に記載される。これらはすべて出典明記によって本明細書中に援用される。形質転換細胞は、選択マーカー、一般的に薬剤耐性又は特定の栄養分(例えばロイシン)の非存在での生育能によって決定される表現型により選択可能である。酵母における使用に好適なベクターは、米国特許第4931373号に開示されるPOT1ベクターである。本発明のタンパク質をコードするDNA配列はシグナル配列及び場合によってリーダー配列(例えば上記のもの)の後にあってもよい。さらに、好適な酵母細胞の例は、K. ラクチス、ハンゼヌラ、例えばH. ポリモルファ(H. polymorpha)といったクリベロマイセス属、又はP.パストリスなどのピキア属の菌株である(参照Gleeson等, J. Gen. Microbiol. 132, 3459-3465 (1986);米国特許第4882279号)。
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルスspp.、パンカビspp.、フザリウムspp.又はトリコデルマssp.、特にA. オリゼー、A.ニデュランス又はA. ニガーの菌株の細胞である。タンパク質の発現のためのアスペルギルスspp.の使用は、例として欧州特許第272277号及び欧州特許第230023号に記述される。Malardier等 Gene 78, 147-156 (1989)に記載のように、例えばF. オキシスポラム(F. oxysporum)の形質転換が行われてもよい。
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルスspp.、パンカビspp.、フザリウムspp.又はトリコデルマssp.、特にA. オリゼー、A.ニデュランス又はA. ニガーの菌株の細胞である。タンパク質の発現のためのアスペルギルスspp.の使用は、例として欧州特許第272277号及び欧州特許第230023号に記述される。Malardier等 Gene 78, 147-156 (1989)に記載のように、例えばF. オキシスポラム(F. oxysporum)の形質転換が行われてもよい。
糸状菌を宿主細胞として用いる場合、宿主染色体にDNAコンストラクトを組み込んで、組み換え宿主細胞を得ることによって都合よく、本発明のDNAコンストラクトにて形質転換されうる。DNA配列は細胞中で安定して維持される傾向が強いので、一般的にこの組み込みは有用であると思われる。DNAコンストラクトの宿主染色体への組み込みは、従来法、例えば相同組み換え又は異種性の組み換えによって実施されうる。
次いで、上記の形質転換された又は形質移入された宿主細胞を、本発明のペプチドの発現を促す条件下で適切な栄養培地に培養し、その後結果として生じるタンパク質を培養物から回収する。
細胞を培養するために用いられる培地は、適切な添加物を含有する最少培地又は混合培地といった、宿主細胞を生育するために適した任意の従来の培地であってよい。好適な培地は、市販元から入手可能であるか又は公開された製法(例えばアメリカ培養細胞系統保存機関のカタログにおいて)に従って調製されてもよい。次いで、細胞によって生産されるタンパク質は、遠心ないしは濾過によって培地から宿主細胞を分離する、塩、例えば硫酸アンモニウムによる上清又は濾過液のタンパク質の構成成分を沈殿させる、様々なクロマトグラフィの手順によって精製、例えばイオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、等ことを含んでいる従来の手順によって培養液から取り戻されてもよい。そして、問題のタイプのタンパク質に依存している。
次いで、上記の形質転換された又は形質移入された宿主細胞を、本発明のペプチドの発現を促す条件下で適切な栄養培地に培養し、その後結果として生じるタンパク質を培養物から回収する。
細胞を培養するために用いられる培地は、適切な添加物を含有する最少培地又は混合培地といった、宿主細胞を生育するために適した任意の従来の培地であってよい。好適な培地は、市販元から入手可能であるか又は公開された製法(例えばアメリカ培養細胞系統保存機関のカタログにおいて)に従って調製されてもよい。次いで、細胞によって生産されるタンパク質は、遠心ないしは濾過によって培地から宿主細胞を分離する、塩、例えば硫酸アンモニウムによる上清又は濾過液のタンパク質の構成成分を沈殿させる、様々なクロマトグラフィの手順によって精製、例えばイオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、等ことを含んでいる従来の手順によって培養液から取り戻されてもよい。そして、問題のタイプのタンパク質に依存している。
本明細書中で引用される刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、本明細書の至る所に個別に特定の記載がなされようとも、あたかも各文献が個々にかつ特に出典明示により援用されることが示され、その全体が本明細書中に記載されている場合と同じ程度にその全体が出典明示により(法が許容する最大の範囲で)ここに援用される。
発明を特定する文脈における「a」及び「an」及び「the」なる用語並びに類似の表現の使用は、ここに特段の注記がなければ又は文脈上明らかに矛盾するということがなければ、単数と複数の双方をカバーするものとみなされる。例えば、「化合物」なる表現は、特に明記しない限り、本発明又は特定の記述された態様の様々な「化合物」を指すと理解されるものである。
発明を特定する文脈における「a」及び「an」及び「the」なる用語並びに類似の表現の使用は、ここに特段の注記がなければ又は文脈上明らかに矛盾するということがなければ、単数と複数の双方をカバーするものとみなされる。例えば、「化合物」なる表現は、特に明記しない限り、本発明又は特定の記述された態様の様々な「化合物」を指すと理解されるものである。
特に明記しない限り、本明細書において示されたすべての正確な値は、対応する近似値の代表である(例えば、特定の因子又は測定に関して示されたすべての正確な例示値は、必要に応じて「およそ」を修飾した対応するおよその測定値を示すともみなされうる)。
一又は複数の構成成分に関して「含む(comprising)」、「有する(having)」、「包含する(including)」、及び「含有する(containing)」といった用語を用いた本発明の態様ないしは任意の態様の本明細書中の記載は、特に明記しない限り又は内容と明らかに矛盾しない限り、特定の一又は複数の構成成分「からなる」、「から実質的になる」又は「を本質的に含む」本発明の態様ないしは類似の態様をサポートすることを意図する(例えば、特定の構成成分を含有するような本明細書中に記載の組成物は、特に明記しない限り又は内容と明らかに矛盾しない限り、その構成成分からなる組成物を表すとも理解されるべきである)。
一又は複数の構成成分に関して「含む(comprising)」、「有する(having)」、「包含する(including)」、及び「含有する(containing)」といった用語を用いた本発明の態様ないしは任意の態様の本明細書中の記載は、特に明記しない限り又は内容と明らかに矛盾しない限り、特定の一又は複数の構成成分「からなる」、「から実質的になる」又は「を本質的に含む」本発明の態様ないしは類似の態様をサポートすることを意図する(例えば、特定の構成成分を含有するような本明細書中に記載の組成物は、特に明記しない限り又は内容と明らかに矛盾しない限り、その構成成分からなる組成物を表すとも理解されるべきである)。
実施例1
hGHのPEG化
a) hGHをリン酸バッファ(50mM、pH8.0)に溶解する。この溶液を、アミンドナーの溶液、例えば1,3-ジアミノ-プロパン-2-オール溶解リン酸バッファ(50mM、1ml、pH8.0、アミンドナーの溶解後に希塩酸にてpHを8.0に調整)と混合する。
最後に、リン酸バッファ(50mM、pH8.0、1ml)に溶解したTGアーゼ(〜40U)の溶液を加え、容量をリン酸バッファ(50mM、pH8)を加えて10mlに調整する。混合した混合物を37℃でおよそ4時間インキュベートした。
温度を室温にまで下げ、N-エチル-マレイミド(TGアーゼ阻害薬)を1mMの終濃度で加える。さらに1時間後、混合物を、10容量のトリスバッファ(50mM、pH8.5)で希釈する。
b) 次いで、a)から得られるアミノ基転移hGHを場合によってさらに反応させ、アミンドナーに存在する場合には潜在的な官能基を活性化してもよい。
c) 次いで、a)又はb)から得られる機能化hGHをhGHに導入される官能基と反応することができる好適な機能化されたPEGと反応させる。例えば、オキシム結合は、アルコキシアミンによってカルボニル成分(アルデヒド又はケトン)を反応させることによって形成してもよい。
hGHのPEG化
a) hGHをリン酸バッファ(50mM、pH8.0)に溶解する。この溶液を、アミンドナーの溶液、例えば1,3-ジアミノ-プロパン-2-オール溶解リン酸バッファ(50mM、1ml、pH8.0、アミンドナーの溶解後に希塩酸にてpHを8.0に調整)と混合する。
最後に、リン酸バッファ(50mM、pH8.0、1ml)に溶解したTGアーゼ(〜40U)の溶液を加え、容量をリン酸バッファ(50mM、pH8)を加えて10mlに調整する。混合した混合物を37℃でおよそ4時間インキュベートした。
温度を室温にまで下げ、N-エチル-マレイミド(TGアーゼ阻害薬)を1mMの終濃度で加える。さらに1時間後、混合物を、10容量のトリスバッファ(50mM、pH8.5)で希釈する。
b) 次いで、a)から得られるアミノ基転移hGHを場合によってさらに反応させ、アミンドナーに存在する場合には潜在的な官能基を活性化してもよい。
c) 次いで、a)又はb)から得られる機能化hGHをhGHに導入される官能基と反応することができる好適な機能化されたPEGと反応させる。例えば、オキシム結合は、アルコキシアミンによってカルボニル成分(アルデヒド又はケトン)を反応させることによって形成してもよい。
実施例2
TGアーゼ特異的アッセイI
記載する方法を用いて、実施例1に記載の反応において修飾されているhGHのGln残基(一又は複数)を決定してもよい。すなわち、ここで記載する方法を用いて、本発明のTGアーゼの選択性を決定してもよいと言える。
TGアーゼ特異的アッセイI
記載する方法を用いて、実施例1に記載の反応において修飾されているhGHのGln残基(一又は複数)を決定してもよい。すなわち、ここで記載する方法を用いて、本発明のTGアーゼの選択性を決定してもよいと言える。
PEG化部位(一又は複数)の測定
実施例1において得られたモノPEG化hGHを、イオン交換クロマトグラフィ及びゲル濾過の組合せを用いて精製する。
PEG化の部位(一又は複数)を決定するために、精製された化合物を希釈して、ジチオトレイトール及びヨードアセトアミドを用いてアルキル化する。その後、化合物を非特異的なプロテアーゼであるプロテアーゼKを用いて消化し、結果として生じた消化物をアセトニトリル/TFAバッファシステムを用いた逆相C-18HPLCカラムにて分離する。PEG化ペプチドの保持時間は主にPEG成分によって決定されるので、これらの条件下にてPEG化したペプチドをPEG化していないペプチドよりも有意にゆっくりと溶出し、さらに、すべてのPEG化ペプチド(1より多い場合)を同じピークで溶出する。
ピーク含有PEG化ペプチド(一又は複数)を回収し、自動エドマン分析を用いたアミノ酸配列決定を行う。その結果、PEG化の正確な位置−PEG化アミノ酸は配列決定分析においてブランクサイクルを生じる−と同時に存在するペプチドの数と相対的な量についての情報が得られ、それにより、PEG化が1より多い部位で生じているかどうかが明らかとなる。
実施例1において得られたモノPEG化hGHを、イオン交換クロマトグラフィ及びゲル濾過の組合せを用いて精製する。
PEG化の部位(一又は複数)を決定するために、精製された化合物を希釈して、ジチオトレイトール及びヨードアセトアミドを用いてアルキル化する。その後、化合物を非特異的なプロテアーゼであるプロテアーゼKを用いて消化し、結果として生じた消化物をアセトニトリル/TFAバッファシステムを用いた逆相C-18HPLCカラムにて分離する。PEG化ペプチドの保持時間は主にPEG成分によって決定されるので、これらの条件下にてPEG化したペプチドをPEG化していないペプチドよりも有意にゆっくりと溶出し、さらに、すべてのPEG化ペプチド(1より多い場合)を同じピークで溶出する。
ピーク含有PEG化ペプチド(一又は複数)を回収し、自動エドマン分析を用いたアミノ酸配列決定を行う。その結果、PEG化の正確な位置−PEG化アミノ酸は配列決定分析においてブランクサイクルを生じる−と同時に存在するペプチドの数と相対的な量についての情報が得られ、それにより、PEG化が1より多い部位で生じているかどうかが明らかとなる。
実施例3
hGHのGln-40とGln-141に対する特異性についてのTGアーゼ変異体の試験
20μlの1,3-ジアミノ-2-プロパノール(10mMのリン酸バッファ中に180mg/ml、濃縮HClを加えてpHを8.3に調整)を、10mM リン酸バッファpH8.1の溶液(50μl)中のhGH(1mg)の溶液に加える。10mM リン酸バッファを、最終反応混合物容量が100μlとなる容量で加える。反応は、酵素(終濃度0.07〜7μM)を加えて開始する。反応混合物を37℃でインキュベートし、その反応の後にキャピラリー電気泳動法(CE)を行う。
一定量の反応混合物(10μl)に、100mM(1μl)のN‐エチルマレイミドを加える。混合物を室温で5分間インキュベートし、次いでH2Oで100倍に希釈してCE分析を行う。
CEは、Agilent Technologies 3D-CEシステム(Agilent Technologies)を用いて行う。データ収集及びシグナル処理は、Agilent Technologies 3DCE ChemStationを用いて行う。キャピラリーは、64.5cm(有効な長さ56.0cm)の50μm、すなわちAgilent製の"Extended Light Path Capillary"である。200nmでUV検出を行う(16nmBw、380nm及び50nmのBwを参照)。ランニング電解質は50mM リン酸バッファpH7.0である。キャピラリーは、0.1M NaOHにて3分間、次いでミリQ水にて2分間、そして、電解質にて3分間調整する。
hGHのGln-40とGln-141に対する特異性についてのTGアーゼ変異体の試験
20μlの1,3-ジアミノ-2-プロパノール(10mMのリン酸バッファ中に180mg/ml、濃縮HClを加えてpHを8.3に調整)を、10mM リン酸バッファpH8.1の溶液(50μl)中のhGH(1mg)の溶液に加える。10mM リン酸バッファを、最終反応混合物容量が100μlとなる容量で加える。反応は、酵素(終濃度0.07〜7μM)を加えて開始する。反応混合物を37℃でインキュベートし、その反応の後にキャピラリー電気泳動法(CE)を行う。
一定量の反応混合物(10μl)に、100mM(1μl)のN‐エチルマレイミドを加える。混合物を室温で5分間インキュベートし、次いでH2Oで100倍に希釈してCE分析を行う。
CEは、Agilent Technologies 3D-CEシステム(Agilent Technologies)を用いて行う。データ収集及びシグナル処理は、Agilent Technologies 3DCE ChemStationを用いて行う。キャピラリーは、64.5cm(有効な長さ56.0cm)の50μm、すなわちAgilent製の"Extended Light Path Capillary"である。200nmでUV検出を行う(16nmBw、380nm及び50nmのBwを参照)。ランニング電解質は50mM リン酸バッファpH7.0である。キャピラリーは、0.1M NaOHにて3分間、次いでミリQ水にて2分間、そして、電解質にて3分間調整する。
各動作の後、ミリQ水にて2分間、次いでリン酸にて2分間、そして、ミリQ水にて2分間によりキャピラリーを終える。4.0秒間、50mbarで水力学的注入を行う。電圧は+25kVである。キャピラリーの温度は30℃とし、動作時間は10.5分とする。
図1は、1,3-ジアミノ-2-プロパノールによるhGHのTGアーゼ-触媒トランスグルタミン化の代表的なCE分析の画像を示す。
単一-アミノ基転移生成物の量が5時間の反応時間内でその最大に達するように、酵素量を調整する。
反応速度の指標は、基質であるhGHの半分がアミノ基転移される時間によるものである。
表1は、選択されたTGアーゼの結果を示す。
図1は、1,3-ジアミノ-2-プロパノールによるhGHのTGアーゼ-触媒トランスグルタミン化の代表的なCE分析の画像を示す。
単一-アミノ基転移生成物の量が5時間の反応時間内でその最大に達するように、酵素量を調整する。
反応速度の指標は、基質であるhGHの半分がアミノ基転移される時間によるものである。
表1は、選択されたTGアーゼの結果を示す。
Claims (38)
- Tyr-75、Tyr-302、Asp-304から選択されるアミノ酸残基の一又は複数が修飾されている、配列番号1に示す配列を含んでなる単離されたペプチド。
- 前記配列のTyr-75が修飾される、請求項1に記載の単離されたペプチド。
- Tyr-75が酸性アミノ酸残基に置換される、請求項2に記載の単離されたペプチド。
- Tyr-75がAsp又はGluに置換される、請求項3に記載の単離されたペプチド。
- Tyr-75がGluに置換される、請求項4に記載の単離されたペプチド。
- 前記配列のTyr-302が修飾される、請求項1から5のいずれか一に記載の単離されたペプチド。
- Tyr-302がTyrと異なる塩基性アミノ酸残基に置換される、請求項6に記載の単離されたペプチド。
- Tyr-302がArg又はLysに置換される、請求項7に記載の単離されたペプチド。
- Tyr-302がArgに置換される、請求項8に記載の単離されたペプチド。
- 前記配列のAsp-304が修飾される、請求項1から9のいずれか一に記載の単離されたペプチド。
- Asp-304が塩基性アミノ酸残基に置換される、請求項10に記載の単離されたペプチド。
- Asp-304がTyr、Lys又はArgに置換される、請求項11に記載の単離されたペプチド。
- Asp-304がLysに置換される、請求項12に記載の単離されたペプチド。
- 配列番号2に示す配列を有する請求項5に記載の単離されたペプチド。
- 配列番号3に示す配列を有する請求項9に記載の単離されたペプチド。
- 配列番号4に示す配列を有する請求項13に記載の単離されたペプチド。
- 配列番号5に示す配列を有する請求項2〜13のいずれか一に記載の単離されたペプチド。
- 置換Tyr-75→酸性アミノ酸残基;Tyr-302→Tyrでない塩基性アミノ酸残基;及び、Asp-304→塩基性アミノ酸残基のうちの一又は複数を含んでなる、配列番号1に示す配列を含んでなるペプチド。
- 置換Tyr-75→Asp又はGlu;Tyr-302→Arg又はLys;及び、Asp-304→Tyr、Lys又はArgのうちの一又は複数を含んでなる配列番号1に示す配列を有する、請求項18に記載のペプチド。
- 置換Tyr-75→Glu;Tyr-302→Arg;及び、Asp-304→Lysのうちの一又は複数を含んでなる配列番号1に示す配列を有する、請求項18又は19に記載のペプチド。
- 配列が、Tyr-75のGluとの置換とTyr-302のArgとの置換を含んでなる配列番号1に示すものである、請求項18から20のいずれか一に記載のペプチド。
- 配列が配列番号2に示すものである、請求項18から20のいずれか一に記載のペプチド。
- 配列が配列番号3に示すものである、請求項18から20のいずれか一に記載のペプチド。
- 配列が配列番号4に示すものである、請求項18から20のいずれか一に記載のペプチド。
- 配列が配列番号5に示すものである、請求項18に記載のペプチド。
- ペプチドがトランスグルタミナーゼ活性を有する、請求項1から25のいずれか一に記載のペプチド。
- ペプチドがhGHのGln-141と比較してhGHのGln-40に特異性を有し、hGHのGln-141と比較してhGHのGln-40に対して、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチドと特異性が異なる、請求項1から26のいずれか一に記載の単離されたペプチド。
- ペプチドがhGHのGln-141と比較してhGHのGln-40に特異性を有し、hGHのGln-141と比較してhGHのGln-40に対して、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチドよりも特異性が高い、請求項27に記載の単離されたペプチド。
- hGHのGln-141と比較してhGHのGln-40に特異性を有するトランスグルタミナーゼであって、hGHのGln-141と比較してhGHのGln-40に対して、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチドと特異性が異なるトランスグルタミナーゼ。
- hGHのGln-141と比較してhGHのGln-40に特異性を有し、hGHのGln-141と比較してhGHのGln-40に対して、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチドよりも特異性が高い、請求項29に記載のトランスグルタミナーゼ。
- 請求項1から30のいずれか一に記載のペプチドをコードする核酸コンストラクト。
- 請求項31に記載の核酸コンストラクトを含んでなるベクター。
- 請求項32に記載のベクターを含んでなる宿主。
- 請求項1から30のいずれか一に記載のペプチドを含んでなる組成物。
- hGHのコンジュゲート方法であって、請求項1から30のいずれか一に記載のペプチドの存在下でアミンドナーと該hGHを反応させることを含んでなる方法。
- 位置Gln-141でコンジュゲートされたhGHの量と比較したときの位置Gln-40でコンジュゲートされたhGHの量が、前記方法においてペプチドが請求項1から30のいずれか一に記載のペプチドでなく、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチドが用いられる場合の位置Gln-141でコンジュゲートされたhGHの量と比較したときの位置Gln-40でコンジュゲートされたhGHの量と比べて有意に増加する、請求項35に記載のhGHのコンジュゲート方法。
- コンジュゲートされたhGHの調製における請求項1から30のいずれか一に記載のペプチドの使用。
- hGHが位置Gln-40でコンジュゲートされる、請求項37に記載の使用。
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