JP2002520009A - 修飾タンパク質 - Google Patents

修飾タンパク質

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JP2002520009A
JP2002520009A JP2000559143A JP2000559143A JP2002520009A JP 2002520009 A JP2002520009 A JP 2002520009A JP 2000559143 A JP2000559143 A JP 2000559143A JP 2000559143 A JP2000559143 A JP 2000559143A JP 2002520009 A JP2002520009 A JP 2002520009A
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マシュー・モレル
フランク・ビクス
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Abstract

(57)【要約】 修飾グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質を生産する方法であって、該修飾タンパク質に、グルテン内に取り込まれる能力、またはリガンド若しくは他の高分子を結合する能力を与えるドメインを、該タンパク質に付加することを含む方法、修飾グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質、並びにその使用。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、修飾タンパク質の生産、特に修飾グルテニン(glutenin)若しくは種
子貯蔵タンパク質の生産に一般的に向けられる。
【０００２】
【従来の技術】
コムギ貯蔵タンパク質は、その可溶性に基づいて２種類のクラスに分類される
。グリアジンは水性アルコールに容易に可溶性であり、分子内ジスルフィド結合
のみを有するモノマー状タンパク質である。グルテニンは、分子内ジスルフィド
結合によって安定化された大きな分子量のポリマーで存在し、還元剤なしでは水
性アルコール中に不溶性である(Kasarda 1989)。これらのタンパク質は内乳にか
なりの量で存在し、種子の発芽のための窒素、炭素及び硫黄の貯蔵庫として機能
していると考慮される。
【０００３】 グルテニンは、グルテンと称される連続的なタンパク質性ネットワークを形成
している。グルテンの独特の物理化学的特性は、焼き製品（パン、ビスケット、
ケーキ）、パスタのヌードル及び他の食料製品に加工するためのコムギの生地の
性質を決定する。ジスルフィド結合を通じた互いとの架橋を形成するグルテニン
は、小麦粉生地の粘弾性を生ずる重要な分子であると解されている(MacRitchie
1992)。パンの作製におけるコムギの独特な位置は、膨張に際して気体を維持す
る生地の能力に基づく。グルテンは、生地の約１０％を占め、デンプン及び脂質
と共に主にタンパク質より成る（７０−８０％）。デンプンは粒子状デンプン、
及び壊れたデンプンである。コムギの脂質貯蔵物は非極性脂質、構造的脂質、及
び発芽脂質である(Gan等, 1995)。構造的脂質はまた極性脂質とも称される。発
芽脂質は、非デンプン脂質、及びデンプンリソホスホリピドに分類される。グル
テンの構造及び特性は分子内相互作用によって決定され、もしグルテンの機能的
特性が操作できるのであれば、これらは理解できるということは重要である。
【０００４】 生地は、水によって促進される小麦粉構成成分の間の非常に多様な相互作用か
ら生ずる。デンプンは約４６％の水を取り込み、壊れたデンプンは水分吸収に顕
著に寄与する。水和の間でタンパク質は顕視的な鎖若しくは微小繊維を発するこ
とが示されている。小麦粉の特徴的なタンパク質は、水の添加に際して小麦粉脂
質（極性）に結合する(Morrison 1989)。
【０００５】 生地の形成は、粘弾性及び気体維持性を有する膜のネットワークを形成するよ
うに、グルテニンポリマーの再配向として顕視化される。共有結合（ジスルフィ
ド結合）及び非共有結合（水素結合、疎水性結合及びイオン結合）が、十分に発
達した生地の形成に関与する。発酵の間、焼く間、及び焼いた後でさえ、相互作
用はさらに修飾される。小麦粉タンパク質のジスルフィド結合は、生地中の相互
作用において鍵となる役割を果たす。該結合は、ポリペプチド鎖内及びその間の
比較的強力な架橋を形成し、他のより低エネルギーの結合を安定化する。ジスル
フィド結合は、パンの構造が、焼いている間のデンプンのゼラチン化とタンパク
質の熱的な変性によって整えられるまで、タンパク質マトリックスに対する必要
な安定性を提供する。水素結合は、共有結合よりかなり弱いものであるが、生地
の構造に顕著に寄与する。独特の特性は、他の水素結合と相互転換する能力であ
り、それはタンパク質鎖の再配向を容易にし、ストレスに対して余裕を生ずる。
疎水性結合は、小麦粉の構成成分の非極性基から生ずる。これらの結合は可逆的
であるため、それらは粘性の流動を容易に提供でき、それによって機械的な生地
の形成を容易にする。イオン結合は、生地の構造の形成において比較的小さな役
割しか果たさないが、いくつかの特異的な構成成分が、イオン化可能な部分を有
する。それ故イオン結合の相互作用は、流動学的特性について重要であり得る（
レビューとして、Bushuk 1998参照）。
【０００６】 生地の機能性に対する各種のタンパク質の群、及びこれらの分子の特異的な構
造の特性の寄与を評価することについての主要な制限は、特異的なタンパク質を
生地の中に取り込ませ、試験する適切な系が存在しないことにある。しかしなが
ら二つの進歩のため、この状況は最近変化している。第一は、生地中にポリマー
状グルテニンを含む外因性タンパク質を取り込ませるための適切な方法を有する
、小規模の試験装置(Mixograph, Entensograph)の開発である(Bekes等, 1994)。
この系の利点は、試験に必要なタンパク質が少量であること、並びに例えばタン
パク質エンジニアリングによって生産された複数のサンプルを迅速に試験できる
能力にある。第二の最近の進歩は、コムギについての信頼できるトランスフォー
メーション系の開発であり(Weeks等, 1993; Witrzens等, 1998)、それは例えば
所望の特徴を有する新規なタンパク質の発現によって、貯蔵タンパク質組成の改
変を可能にする。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
グルテンマトリックス中の、タンパク質−タンパク質、タンパク質−脂質、並
びにタンパク質−デンプンの相互作用を改変するために、本発明者は、グルテン
マトリックス中に、新規な表面活性分子若しくは分子の一部の取り込みを可能と
する系を開発した。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
第一の態様として、本発明は、修飾グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質を
生産する方法を提供し、該方法は、修飾タンパク質にグルテン中に取り込ませる
能力、またはリガンド若しくは他の高分子を結合する能力を与えるドメインを、
タンパク質に付加することを含む。
【０００９】 一つの好ましい実施態様として、修飾グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質
は、そのアミノ酸配列中に付加された一つ以上のアミノ酸残基を含む。より好ま
しくは、一つ以上のアミノ酸残基は、一つ以上のシステイン残基である。好まし
くは、一つ以上のシステイン残基は、タンパク質のアミノ酸配列の一方若しくは
両方の末端で取り込まれる。一つ以上のシステインの付加は、修飾タンパク質を
、使用の際にグルテンにより容易に取り込ませることができる。本発明に従って
生産されたグルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質に対する修飾は、食料若しく
は産業上の使用のために、グルテンネットワーク中に当該タンパク質を取り込ま
せることができる。
【００１０】 本発明者は、グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質中への、グルテニン以外
のタンパク質から得た外因性アミノ酸配列（ドメイン）の取り込みが、該タンパ
ク質を広範囲の食料の応用で使用する場合、グルテンの一般的特性を修飾するこ
とを見出した。
【００１１】 図１５は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるトランスフォーム化コムギ
植物中のトランスジーンを同定するためのスキームの模式図を提供する。遺伝子
とそのプロモーター（例えば高分子量グルテニンＢ×１７についての遺伝子から
得たもの）の間の界面にまたがるプライマーペアは、Ｃホルデインとグリアジン
遺伝子の間の高いホモロジーから生ずる偽のポジティブが検出されないことを確
実にする。
【００１２】 さらに好ましい実施態様において、該ドメインは、修飾タンパク質にリガンド
若しくは他の高分子を結合する能力を与える結合ドメインである。
【００１３】 該結合ドメインは、食料調製物若しくは食料組成物において有用であるリガン
ドを結合するいずれかのドメインであり得る。好ましい形態として、該結合ドメ
インは、脂質若しくはデンプンを結合可能なリガンドである。本発明者は、オオ
ムギオレオシン遺伝子の脂質結合ドメイン、コムギＣＭ１６タンパク質の脂質結
合ドメイン、及びAspergillus nigerから得られたグルコアミラーゼのデンプン
結合ドメインが、特に本発明に適していることを見出した。しかしながら、他の
天然若しくは修飾ドメインもまた、本発明に適しているものと予測されるであろ
う。
【００１４】 本発明によって修飾される一つのグルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質は、
オオムギから得られたＣホルデイン遺伝子である。しかしながら、他のグルテニ
ン若しくは種子貯蔵タンパク質もまた、本発明に従って修飾されてもよいことが
予測されるであろう。コムギにおいて、上記グルテニン若しくは種子タンパク質
は、低分子量グルテニン、高分子量グルテニン、グリアジン、プロインドリン、
若しくは穀物柔軟タンパク質（フリアビリンとしても周知である）、またはクロ
ロホルム／メタノール溶解タンパク質を含む。これらのタンパク質のホモローグ
は、二倍体、三倍体及び六倍体コムギ、ライムギ、トリチカール(triticale)、
オオムギ、オートムギ、コメ、モロコシ、及びトウモロコシのような他の穀物中
に存在し、これらのタンパク質をコードする遺伝子もまた、本発明に従って修飾
されてもよい。
【００１５】 第二の態様として、本発明は、グルテン若しくは種子貯蔵タンパク質に、グル
テン中に取り込まれる能力、またはリガンド若しくは他の高分子を結合する能力
を与えるドメインが挿入された修飾タンパク質を提供する。
【００１６】 一つの好ましい実施態様として、修飾グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質
は、本発明の第一の態様に従った方法によって生産される。
【００１７】 別の実施態様として、修飾グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質は、ANG/SB
D/Cys7Cys236、ANG/OHBD/Cys7Cys236またはANG/CM16/Cys7Cys236である。
【００１８】 第三の態様として、本発明は、本発明の第二の態様に従った修飾グルテニン若
しくは種子貯蔵タンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。
【００１９】 第四の態様として、本発明は、細胞内に取り込まれた本発明の第三の態様に従
った単離された核酸分子を提供し、該核酸の発現に際し、該細胞は修飾グルテニ
ン若しくは種子貯蔵タンパク質を生産する。
【００２０】 該細胞は、例えば修飾グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質を生産可能な組
換え細菌細胞であってもよい。好ましくは該細菌細胞は、大腸菌である。別法と
して該細胞は、Pichia種若しくはSaccharomyces cerevisiaeのような酵母、バキ
ュロウイルス発現系のような発現系を使用する昆虫細胞、または哺乳動物細胞で
あってもよい。別法として該細胞は、植物の種中に、修飾グルテニン若しくは種
子貯蔵タンパク質を生産可能な組換え植物の植物細胞であってもよい。好ましく
は該植物細胞は、組換えコムギ細胞である。
【００２１】 第五の態様として、本発明は、食料製品の調製における、本発明の第二の態様
に従った修飾グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質の使用を提供する。
【００２２】 食料製品の例として、発酵若しくは未発酵のパン、パスタ、ヌードル、朝食用
シリアル、スナック食品、ケーキ、練り粉製食品、または小麦粉ベースのソース
若しくは成分を含む他の食料が含まれる。
【００２３】 本発明に従った修飾グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質は、使用において
、生じた生産物に価値と有用性を付加する態様で、グルテンを含む生地及び他の
物質の構造を修飾できる。修飾グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質は、食料
特性の修飾剤として、食料産業での使用に適している。
【００２４】 本発明者は、本発明に従った修飾タンパク質が、細菌発酵において生産できる
こと、並びに商業的な使用のための該タンパク質の大規模な生産が可能であるこ
とを示す。
【００２５】 第六の態様として、本発明は、非食料製品の調製における、本発明の第二の態
様に従った修飾グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質のの使用を提供する。
【００２６】 非食料製品の例として、フィルム、コーティング、接着剤、結合材料、若しく
はパッケージ材料が、制限されることなく含まれる。本発明に従った修飾タンパ
ク質は、普通のグルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質に対するものと同じ非食
料での使用が可能であると予測されるであろう。
【００２７】 第七の態様として、本発明は、食料製品の調製における、本発明の第二の態様
に従った修飾グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質を含む、穀物若しくは穀物
の成分の使用を提供する。
【００２８】 本発明に従った修飾グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質は、本発明の第四
の態様によって生産されたトランスジェニック植物中に含まれ、若しくはそれに
よって生産されてもよい。かくして、これらの植物によって生産された穀物若し
くは他の植物製品が、小麦粉、セモリーナ、糠、チップ、細菌分画等の粗形態と
して使用されてもよい。上記植物は、これもまた使用可能である、通常の及び修
飾グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質の混合物を生産してもよい。
【００２９】
【発明の実施の形態】
本明細書を通じて、文脈が他の断り書きを必要としなければ、用語「含む」、
若しくはその変異型である「含んでいる」「含まれる」は、主張される要素、数
字若しくは工程、または要素の群、数字群若しくは工程群を取り込むように解さ
れるが、いずれかの他の要素、数字若しくは工程、または要素の群、数字群若し
くは工程群を排除するものとは解されない。
【００３０】 本発明をより明白に理解するために、好ましい形態が、以下の実施例及び図面
を参考にして記載されるであろう。
【００３１】
【実施例】
材料と方法 細菌株とプラスミド 大腸菌株ＤＨ５αをクローニング宿主株として使用し、大腸菌株ＡＤ４９４（
ＤＥ３）(Novagen)をこの実験における発現宿主として使用した。
【００３２】 ｐＧＥＭ−Ｔ(Promega)をＰＣＲ産物のクローニングベクターとして使用した
。ｐＪＫＫｍ（−）(Kirschman andCramer, 1988)を融合タンパク質遺伝子のた
めのクローニングビヒクルとして使用した。発現のための新たに集められた遺伝
子を、プラスミドｐＥＴ−１１ｄ(Novagen)中でサブクローン化した。
【００３３】 ANGΔCys7Cys236のクローニング 制限エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡ修飾酵素を、New England Biolabs及びPro
mega Corpから得た。他の化学薬品及び試薬は、分析試薬グレードであった。オ
リゴヌクレオチドプライマーを、標準的なホスホルアミダイト化学を使用して、
Applied Biosystem 394 DNA/RNAシンセサイザーで合成し、水酸化アンモニウム
溶液中で加熱して脱保護した。プライマーを脂溶性にし、ＴＥ緩衝液中に溶解し
た。
【００３４】 ポリメラーゼ連鎖反応によるオオムギのゲノムクローン(Lambdahor1-17)から
得たＣホルデイン(Accession X60037)の４７７ｂｐの長い断片（全体の遺伝子の
約２／３）を増幅するために、二つの特異的にデザインされたプライマーを使用
した。
【００３５】 オリゴヌクレオチド１（配列番号１）： Met Arg Cys 5' GTC ATG AGG CAA CTA AAC CCT TGC AGC CAA GAG TTG CAA TC 3' BspH I オリゴヌクレオチド２（配列番号２）： ★★★ Val Cys Gln Gln Pro 5' GGA TCC CTA GAC CAT ACT CCA TAT GCA TGA AGC TTG TTG GGG GAC TGG TTG 3
' BamH I Nde I Hind III
【００３６】 反応を、７２℃で１分３０秒、５５℃で２０秒、７２℃で１分の１サイクル；
９４℃で３０秒、７２℃で１分３０秒の３６サイクルを使用して、FTS-4000 The
rmal Sequencer (Corbett Research, AUstralia)で実施した。反応を、５μｌ中
に４５μｌのSupermix (BRL Life Technology)及び１ｎｇのテンプレートＤＮＡ
及び５０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドを含む５０μｌで実施した。該ＤＮＡ
をQIAquickプロトコール(QIAGEN)に引き続き精製し、製造者に推奨されているよ
うにpGEM-T Vector System I (Promega)を使用してクローン化した。アンピシリ
ン（１００ｍｇ／ｌ）で補ったＬＢ培地での生育について選択された白色トラン
スフォーマントコロニーを、Jetstarミニプレップカラム(Genomed)を使用して陽
性コロニーから精製し、挿入物を、Prism色素ターミネーターサイクルシクーエ
ンシングプロトコール(Perkin-Elmer)を使用して両方向でシークエンスした。AN
G遺伝子を含む一つのプラスミド単離物を、pGEM-ANGと名付けた。
【００３７】 このプラスミドは二つのＮｄｅＩ制限部位を含み、一方は遺伝子中に存在し、
もう一方はpGEM-T複数クローニング部位(MCS)中に存在した。それを一つにする
ため、ANG遺伝子をpJKKm中にサブクローン化した。pJKKmはMCS中にHindIII部位
を有するので、それをサブクローン化の前に欠失しなければならなかった。
【００３８】 １μｇのプラスミドを、２０μｌ中で５ユニットのHindIII酵素で切断した。M
ung Bean Nucleaseを、％７の突出を除去するために使用した。２μｌの１０×
ＺｎＳＯ4溶液及び０．０２ユニットの酵素を、反応混合物に加え、３０℃でイ
ンキュベーションした。反応混合物を、インキュベーションの１時間後にフェノ
ール／クロロホルムで一度抽出した。ＤＮＡをエタノール沈降物で回収し、５０
μｌ中に再懸濁した。ＤＮＡ溶液の１０μlの等量物を、ライゲーションのため
に使用した。ライゲーションを、T4 DNAリガーゼを使用して4℃で一晩１０μlの
溶液で実施した。ライゲーション混合物を、エレクトロポレーションによる大腸
菌ＤＨ５αのコンピート細胞をトランスフォームするために使用した。クローン
を、カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）で補ったＬＢ培地で生育させた。プラスミド
を上述のように三種のコロニーから精製した。ＤＮＡサンプルを、HindIII酵素
切断を実施することによって試験した。HindIII部位を含まない一つのクローン
を選択し、pJKK-Hと名付けた。
【００３９】 pJKK-HをSphI及びBamHIで切断し、プラスミド内にpGEM-ANG SphI-BamHI断片を
サブクローン化した。両者の切断ＤＮＡを、上述のようにQIAquickカラムで精製
し、５０：１のモル比でＴ４ＤＮＡリガーゼを使用して１４℃で一晩１０μlの
溶液中でライゲーションした。トランスフォーム化大腸菌コンピーテント細胞を
、カナマイシンを補ったＬＢ培地に広げた。コロニーをＰＣＲによって挿入物含
有プラスミドＤＮＡについて試験し、３の陽性クローンを上述のようにシークエ
ンスした。一つのクローンをpJANGΔCys7Cys236として名付け、さらなるクロー
ニング作業を使用して、融合タンパク質について遺伝子を集めた。このクローニ
ングビヒクルのヌクレオチド及びアミノ酸配列が図１に示されている。
【００４０】 オレオシン疎水性結合ドメインのデザインとクローニング オレオシン疎水性結合ドメイン（ＯＨＢＤ）の配列を、３種（トウモロコシ、
コメ及びオオムギ）のオレオシンタンパク質のコンセンサス配列を含むようにデ
ザインした。該配列は、オオムギオレオシンアイソマー−２(Aalen 1995, Acces
ion Number X82678)とほぼ同一である。該タンパク質をコードする４種のプライ
マーをデザインした（図２）。該遺伝子を、オーバーラップ伸長の方法の修飾に
よって構築し、そこでは二つの部分的にオーバーラップしたオリゴヌクレオチド
をさらに伸長し、制限酵素切断部位をコードする短い外部プライマーによって増
幅し、pJANGΔCys7Cys236内にクローン化した。ＰＣＲ増幅を同じサイクルプロ
グラムとSupermix溶液を使用して上述のように実施した。長いオリゴヌクレオチ
ドの濃縮物は０．１ｍＭであり、ＰＣＲ反応混合物中に短いプライマーを２μＭ
とした。ＰＣＲ産物をQIAquickカラムで精製し、上述のようにPromegaキットを
使用してpGEM-Tプラスミド内にクローン化した。これらの陽性クローンをプラス
ミド調製のために使用し、配列決定してヌクレオチド配列を確認した。一つのク
ローンをさらなる実験に使用し、pGEM-OHBDと名付けた。
【００４１】 デンプン結合ドメインのクローニング Aspergillus nigerのグルコアミラーゼ１(1,4-α-D-グルカングルコヒドラー
ゼ)(Accession number: X00548)のデンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）に対応する
ＤＮＡを、精製ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。我々が、pJANGΔCys
7Cys236ベクター内へのクローニングのためのＤＮＡ断片の両末端にテールを付
加できるようにプライマーをデザインした。ＰＣＲプライマーの配列は以下のも
のである： オリゴヌクレオチド７（配列番号３）： Gln Ala Cys Thr 5' CAA GCT TGT ACC ACT CCC ACC GCC 3' Hind III オリゴヌクレオチド８（配列番号４）： Ile Cys Arg 5' CCA TAT GCA CCG CCA GGT GTC AGT CAC 3' Nde I
【００４２】 増幅、pGEM-Tへのクローニング及び配列決定を上述のように実施した。該遺伝
子断片を有する一つのクローンを、pGEM-SBDと名付けた。
【００４３】 融合のためのCM16及びCM17遺伝子のクローニング 両者の遺伝子を、ＰＣＲによって精製コムギ(Triticum aestivum)ゲノムＤＮ
Ａから増幅した。 ヌクレオチド９（配列番号５）： 5' GTC GGC AAT GAA GAT TGC ACC 3' ヌクレオチド１０（配列番号６）： 5' TCC AAC TGC GTT CTC CTC TTG GCC 3' ヌクレオチド１１（配列番号７）： 5' GGA TCC CTA GCT CCA CTG AGA CTC 3'
【００４４】 CM16遺伝子（登録番号X55455）についてオリゴヌクレオチド１０及び１１を、
CM17遺伝子（登録番号X59791)についてオリゴヌクレオチド９及び１１を使用し
た。クローンをそれぞれpGEM-CM16及びpGEM-CM17と称した。pJANGΔCys7Cys236
ベクター内へのサブクローニングのために、遺伝子を、鋳型としてpGEMクローン
を使用して再びＰＣＲ増幅し、QIAquickカラムで精製し、適切な酵素で切断した
。この増幅で使用されるプライマーは以下のものであった： ヌクレオチド１２（配列番号８）： Gln Ala Leu Gly 5' TGC GCT CAA GCT TTA GGC AAT GAA GAT TGC ACC 3' Hind III ヌクレオチド１３（配列番号９）： Ile Cys Ser 5' CAT ACT CCA TAT GCA GCT CCA CTG AGA CTC 3' Nde I
【００４５】 融合のためのプロインドリン遺伝子のクローニング Sadequer Rahmanの好意によって提供された、プロインドリンＡ(PIN-A)につい
てのラムダゲノムクローンを、ＰＣＲによる該遺伝子（登録番号X69913)を増幅
するための鋳型として使用した。プライマーを以下のようにデザインした： オリゴヌクレオチド１４（配列番号１０）： Gln Ala Tyr 5' CAA GCT TAC GAT GTT GCT GGC GGG 3' Hind III オリゴヌクレオチド１５（配列番号１１）： 5' CCA TAT GCA CCA GTA ATA GCC AAT AGT GC 3' Nde I
【００４６】 ＰＣＲ産物を精製し、pGEM-T内にライゲーションし、上述のように配列決定し
た。一つのクローンを使用して、pGEM-PIN-Aと名付けた。
【００４７】 ＡＮＧ分子との遺伝子若しくは遺伝子断片の融合 pJANGΔCys7Cys236ベクターを、全ての他のpGEMクローンと同様にＮｄｅＩ及
びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で切断し、QIAquickカラムで精製した。約２０：１の
モル比で挿入物：ベクターとＴ４ＤＮＡリガーゼを含む１０μlの溶液中でライ
ゲーションを１４℃で一晩実施した。１μｌのリガーゼ混合物を、大腸菌コンピ
ーテント細胞のトランスフォーメーションのため使用し、カナマイシンを含むLB
プレートに広げた。３種の融合遺伝子を含むコロニーを、プラスミド調製及び配
列決定のために各トランソフォーマントからピックアップした。例えばオレオシ
ン結合ドメイン含有ANG分子の場合、該クローンをpJANG/OHBD/Cys7Cys236と名付
けた。
【００４８】 融合遺伝子を、ＮｃｏＩとＢａｍＨＩ部位の間でｐＥＴ−１１ｄ発現ベクター
中にサブクローン化した。これらのクローンは、例えばpET-ANG/OHBD/Cys7Cys23
6と称された。
【００４９】 組換えコムギ中のANG/ドメイン/Cys7Cys236についての遺伝子の検出のためのＰ
ＣＲプライマーの配列 組換えコムギ中のANG/ドメイン/Cys7Cys236についての遺伝子の検出のために
使用されるプライマーは、以下のものである： プライマー 長さ 配列 名称 B×17 3' 23 CAACCATGTCCTGAACCTTCACC 配列番号１２ PGS2024 18 TGGCTGTTGAGGTTGCAC 配列番号１３
【００５０】 融合タンパク質の発現 タンパク質発現のために、pETクローンの一つを発現実験を開始する一日前に
大腸菌株AD494(DE3)にトランスフォームした。
【００５１】 小規模の発現を、一つのトランスフォーマントコロニーを使用して、アンピシ
リン(100mg/l)を補った２ＹＴ培地の５mlで実施した。イノキュレーションから
約５時間後(OD600=0.4)、タンパク質の発現を、０．４ｍＭイソプロピル-β-D-
チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導した。誘導培養物と非
誘導培養物の両者を、さらに３７℃で４時間インキュベーションした。発現を、
Laemmli (1970)に従ったＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニターした。
【００５２】 大規模な発現を、攪拌フラスコ中で実施した。１リットルの２ＹＴ培地で、１
ｍｌの一晩の培養物をイノキュレートし、〜０．６Ａｂの細胞密度で０．４ｍＭ
ＩＰＴＧの添加によってタンパク質の発現を誘導した。培養物を一晩攪拌しなが
らインキュベーションし、細胞を遠心分離によって回収した。
【００５３】 タンパク質の検出 ＰＡＧＥゲルを、１０％ＴＣＡ中で０．０２５％のクマシーブルーＲ−２５０
で一晩染色した。過剰な染色を、水−エタノール−酢酸（８：１：１）溶液によ
って洗い流した。
【００５４】 PIN-A含有融合タンパク質の免疫学的検出を、Ciaffi等(1999)の方法を使用し
て実施した。抗体を、Sadequr Rahmanの好意によって提供されたプロインドリン
粗抽出物に対して生じさせた。
【００５５】 他のキメラタンパク質を、John Skerrittの好意によって提供されたホルデイ
ンに対して生じた抗体を使用してイムノブロットにおいて検出した。
【００５６】 融合タンパク質の精製 発現したANG/CM16/Cys7Cys236、ANG/CM17/Cys7Cys236及びANG/SBD/Cys7Cys236
タンパク質を、沈降工程を除いていずれかに印刷された方法(Tamas等, 1998)に
従って精製した。この操作において２容量の1.5M NaClを、４等量のアセトンよ
りむしろ70%エタノール抽出物と混合した。
【００５７】 トランスジェニックコムギ植物における修飾貯蔵タンパク質をコードする遺伝子
の検出 トランスジェニックコムギ植物における修飾タンパク質についての遺伝子の存
在を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって決定した。反応を、９μｌのPC
R Supermix (GibcoBRL)、５０ｎｇの鋳型ＤＮＡ（標準的プロトコールを使用し
てコムギ葉組織から抽出された）、１７２ｎｍｏｌのB×17 3'及びRGS2024の各
プライマー、並びに０．６μｌの２５ｍＭＭｇＣｌ２を含む１１．６μｌで実施
した。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分の１サイクル；９４℃で３０秒、６０℃で３
０秒、７２℃で１分の３５サイクル；７２℃で４分、２５℃で１分の１サイクル
であった。ANG/OHBD/Cys7Cys236についての遺伝子を含む一つの植物の結果が、
図１７に示されている。約６００ベースペアのＰＣＲ産物が、遺伝子の存在下で
示されている。６００ｂｐのＰＣＲ産物は、陰性コントロール植物から得たＰＣ
Ｒ反応では得られなかった。
【００５８】 結果 pJANGΔCys7Cys236の切断、構築及びクローニング 該遺伝子を、Ｃホルデインをコードする融合タンパク質についてこのベクター
を構築するために選択した。この分子は、オオムギ内乳から得た貯蔵タンパク質
であり、システイン残基の不存在によって特徴付けられる。オオムギゲノムクロ
ーンは、２０残基のシグナルペプチドを含む２６１残基の分子をコードする。成
熟タンパク質（分子量２８ｋＤａ）についての遺伝子は、７２３ヌクレオチドを
有し、６６９ｂｐの長さの断片の中央繰り返しドメインを含む。ＰＣＲのための
オリゴヌクレオチドを、中央部分のサイズを減少し、両者の独特の末端ドメイン
において、システインによる一つの残基を置換してデザインした。オリゴヌクレ
オチド１は、該遺伝子の５’末端に結合し、５’末端に付加配列を有し、メチオ
ニンについての開始ＡＴＧコドンとＢｓｐＨＩについての制限部位を取り込んで
いる。オリゴヌクレオチド１は、２２位でＡの代わりにＴを有し、７位でセリン
のコドンがシステインに変化している。オリゴヌクレオチド２の３’末端は、４
３０と４４８ヌクレオチドの間の繰り返しドメイン中の配列と相補的である。こ
れは、強力な繰り返し領域内のかなり独特な配列であり、繰り返しモチーフの末
端をコードしてもいる。増幅遺伝子は、中央繰り返しドメインについて４１１ｂ
ｐ（１３７アミノ酸）の長さの断片のみを含む。このオリゴヌクレオチドはまた
、ＣホルデインのＣ末端独特領域（６アミノ酸）の全配列と、ＢａｍＨＩについ
ての制限部位を、停止コドンの直後に含む。全長サイズの分子の２３６位でのト
レオニン残基を変化するため（Ｃ末端から６残基）、該オリゴヌクレオチドは、
２６位でＣを、２７位でＡを、それぞれＧ及びＴを置換するために有する。イソ
ロイシンコドンの「揺らぎ」塩基である、２２位でＣをＡで置換するというこの
プライマー中の別のベースペア変化が存在する。この置換は、ＮｄｅＩ酵素に対
する制限部位の作製を許容する。オリゴヌクレオチド２は、アラニン及びセリン
をコードする、Ｃホルデイン遺伝子の一部ではない６のヌクレオチドを有する。
これらの外部ヌクレオチドは、ANG遺伝子内にＮｄｅＩの近くで一つの独特の制
限部位を作製するために加えられた。二つの制限部位は、４ｂｐ離れており、両
酵素での切断が容易となっている。ＨｉｎｄＩＩＩとＢｄｅＩの間の別の分子若
しくは分子の断片についての遺伝子の挿入は、本発明者に新奇なデザインされた
特徴を有する融合タンパク質の作成を可能とした。
【００５９】 ANGΔCys7Cys236分子についての遺伝子は、４７９ｂｐの長さであり、１８．
５ｋＤａの分子量を有するタンパク質をコードする（図３）。
【００６０】 ＰＣＲ増幅したＤＮＡを、プラスミド内に二つの工程でクローン化し、修飾Ｍ
ＣＳを有するpJKKmと称した。オリジナルプラスミドから得た欠失ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ制限部位を有するため、クローニングビヒクルpJANGΔCys7Cys236は、遺伝子
挿入物としてANG遺伝子内に独特のＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｄｅＩ切断部位を有す
る。ベクターのサイズは３８７３ｂｐであり、宿主大腸菌細胞にカナマイシン耐
性を提供する。遺伝子は、SP6 RNAポリメラーゼ転写開始部位に近接して、５’
末端を有するベクター中に存在している。
【００６１】 pET-11d内へのエンジニアリング遺伝子のサブクローニングは、プラスミド内
の耐性遺伝子の差異のため、該断片のアガロースゲル精製を必要としない。
【００６２】 ANGΔCys7Cys236タンパク質の発現 ホルデインCys7Cys236に対するこの短い分子の特徴をチェック及び比較するた
めに、少量と大量の両者でそれを発現させた。ＩＰＴＧでの誘導の前及び３時間
後の全細胞タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンの比較は、誘導サンプル中の
新規なバンドを示した。ANG分子は、７０％（ｖ／ｖ）エタノールで溶解細胞か
ら容易に抽出され、２容量の１．５Ｍ ＮａＣｌ溶液の添加によって沈降した。
還元剤（０．１Ｍ ＤＴＴ）の存在下での生じた沈降物は、大腸菌溶解物中の外
部バンドと同じ移動度を有した。該タンパク質の見かけの分子量は約２１ｋＤａ
であり、ゲル中でわずかに小さい移動度を有した。この特徴は、貯蔵タンパク質
に異常なものではない。ＤＴＴの不存在下で、エタノール抽出されたサンプルは
、ラダーなバンドを与え、それは該タンパク質が、ジスルフィド結合を通じた長
い鎖を形成できることを示す。
【００６３】 生地のグルテンマトリックス中に取り込まれるANG分子の能力を、小規模なテ
スターで実施された一連の混合実験によって確認した。
【００６４】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び混合実験の結果は、ANGΔCys7Cys236タンパク質が、2の
システイン残基を含むＣホルデインタンパク質と同じ若しくは同様な特性を有す
ることを明白に示した。
【００６５】 オレオシン疎水性結合ドメイン（ＯＨＢＤ）についての合成遺伝子のデザイン、
構築及びクローニング 「ｐｉｌｅｕｐ」と称されるGenetic Computer Group (GCG)プログラムを使用
して、４種の分子（１種のトウモロコシ、２種のオオムギ及び１種のコメ）の比
較に従ってアミノ酸配列をデザインした。この実験についてＰＨＢＤ遺伝子断片
は、オオムギ遺伝子（登録番号：X82677)と全く同一である、オレオシンの脂溶
性ストレッチの完全な領域を含む（図２）。コドン使用頻度を、ミスアニリング
及びシークエンシングの問題を導くものである、Ｇｓ及びＣｓの長いストレッチ
を避けるようにデザインした。遺伝子断片の５’隣接領域は、トリペプチド配列
、両親媒性Ｎ末端より成り、一方で３’末端は、オレオシンのＣ末端の別のトリ
ペプチドより成った。中央アンチパラレルベータストランドドメインは７１残基
を有した。アンチパラレルのターンは１３残基より成り、最も保存的な領域であ
る。二つのアンチパラレルストランドは、反対のストランド上で同じ疎水性度の
残基のペアで非常に対照的である。これらの特徴は、トウモロコシオレオシンタ
ンパク質について報告されたものと非常に同様である(Huang 1996)。
【００６６】 サブクローニングのための二つの適切な制限部位と隣接した合成遺伝子断片を
、pGEM-Tベクター内にクローン化した。２４３ｂｐのヌクレオチドの断片の正確
な配列を含む一方のクローンをpGEM-OHBDと名付けた。ＯＨＢＤ断片のサイズは
７７アミノ酸であり、７ｋＤａの分子量を有した。
【００６７】 デンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）のクローニング Aspergillus nigerから得たグルコアミラーゼ１は二つのドメインを含み、一
方は触媒ドメインであり（１−４７０残基）、他方（５０９−６１６残基）は粒
子状デンプンの結合に関与する(Le Gal-Coeffet等, 1995)。
【００６８】 ＳＢＤに対応するＤＮＡを、Aspergillus niger精製ゲノムＤＮＡからＰＣＲ
法によって増幅し、pGEM-Tベクター中にクローン化し、配列決定し、pGEM-SBDと
名付けた。このクローンは、pJANGΔCys7Cys236ベクター内への挿入のための二
つの制限部位と、ＳＢＤの最初のシステインの前の外部アラニンとを有する３３
７ｂｐの長さの断片（図４）を有した。この残基は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位か
ら由来した。結合ドメインは、１０８アミノ酸を有し、二つのシステインを含み
、１１．９ｋＤａの分子量を有する。
【００６９】 融合のためのCM16とCM17遺伝子のクローニング α-アミラーゼ／トリプシンインヒビターファミリーのメンバーとして報告さ
れ、特異的脂質がその画分にタイトに結合することが報告されている、CM16及び
CM17(CMはクロロホルム／メタノール可溶性と称される)タンパク質の両者を、コ
ムギから精製した(Kobrehel及びSauvaire, 1990)。これらの二つの分子はアミノ
酸レベルで非常に相同であるが、荷電残基の配置中にいくつかの差異が存在する
（図５）。
【００７０】 これらの二つの遺伝子をクローン化するために、３種のプライマーを、二つの
別個のＰＣＲ反応においてコムギゲノムＤＮＡから該遺伝子を増幅するために使
用した。一方のプライマー（オリゴヌクレオチド１１）は該遺伝子の３’末端に
ハイブリダイズし、その一方で二つの遺伝子の間を区別し、二つの特異的プライ
マーは５’末端用にデザインされた。pGEM-CM17クローンは、成熟タンパク質の
みに対する遺伝子を有した。しかしながら、pGEM-CM16クローンは、シグナルペ
プチド領域から得たいくつかの外部塩基対を有した。両者のクローンは、１０の
システイン残基を有し、１３．４ｋＤａの分子量を有する成熟クロロホルム／メ
タノール可溶性タンパク質をコードするＤＮＡ断片を有した。
【００７１】 これらの遺伝子をANGΔCys7Cys236含有ベクター内にサブクローン化するため
に、二つの制限部位を、鋳型として両者のpGEMクローンに対する同じプライマー
ペアを使用して、ＰＣＲによって各末端の一方に付加した。成熟タンパク質のＮ
末端に対応するプライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素に対するヌクレオチドを
含んだ。それはまた、ＨｉｎｄＩＩＩ酵素に対して必要な配列のために、外部ア
ラニン残基、第一のコドンにおけるミューテーション（ロイシンに対するＴＴＡ
）及びCM17においてバリン、CM16分子においてイソロイシン（ＡＴＧ）の置換を
有した。ＡＮＧクローニングビヒクル内にクローン化された断片は、３６０ヌク
レオチドを有した。
【００７２】 融合のためのプロインドリン(PIN-A)遺伝子のクローニング コムギホスホリピドとグリコリピドの両者にタイトに結合可能なPIN-Aタンパ
ク質(Dubreil等, 1997)に対するクローンは、ゲノムライブラリーから由来するS
. Rahmanの好意によって提供された。
【００７３】 ＰＣＲ増幅ＤＮＡは、成熟タンパク質よりもＮ末端において５残基短い、プロ
インドリンＡの１２１アミノ酸長の断片をコードした。この短いタンパク質は、
１０のシステイン残基を有し、１４．３ｋＤａの分子量を有した（図６）。ＡＮ
Ｇ分子内への挿入のため、pGEM-PIN-Aクローンはまた、ＨｉｎｄＩＩＩ部位の必
要性のため、二つの制限部位（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｄｅＩ）並びに外部アラニ
ンを有した。
【００７４】 ANG/OHBD/Cys7Cys236タンパク質の発現 pJANGΔCys7Cys236クローニングビヒクル中にOHBD遺伝子断片を挿入するため
に、完全な遺伝子を発現ベクターpET-11d中にサブクローン化した。タンパク質
をAD494(DE3)株を使用して大腸菌において発現した。この遺伝学的に操作された
新規な遺伝子（７１７ｂｐの長さ）は、２５．５ｋＤａの分子量を有するタンパ
ク質をコードした。
【００７５】 細胞を一晩の発現（５ｍｌ培養物）の後遠心分離によって回収し、0.1M DTTを
含む１００μｌのゲルに乗せる緩衝液(0.125M TRIS/HCl pH6.8, 4% SDS, 10%(v/
v)グリセリン）に再懸濁した。タンパク質をSDS-PAGEによって分析し、クマシー
ブルーで染色した（図７）。レーンＡはスタンダード分子量マーカーを含み、レ
ーンＢはPET-11dベクターを含む宿主大腸菌細胞のコントロールを示し、レーン
ＣはANG/OHBD/Cys7Cys236遺伝子を含むpET-11dから得た組換えANG/OHBD/Cys7Cys
236タンパク質（３０ｋＤａマーカーよりわずかにさらに移動する）の発現を示
す。新たに合成されたタンパク質の見かけの分子量（〜２９ｋＤａ）は、ＤＮＡ
のヌクレオチド配列に基づいて計算されたものより大きかった。同様な特徴は、
穀物の異なるプロラミンについて以前に観察されている。この融合タンパク質は
、プロラミンの一部とオレオシン分子の一部より成った。Ｃホルデインは、ロッ
ド型の分子として考慮され、オレオシン疎水性結合ドメインはアンチパラレル鎖
を有し、それは油体に浸透し、かくしてアンカータンパク質を安定化するであろ
う。そのことは、二つの断片の何れもが、分子量マーカー分子と比較して大きな
構造を有しないことを意味する。SDS-PAGEでの見かけの分子量の矛盾は、おそら
くこれら二つの構造的現象のためであり、それはより小さい移動度で明らかであ
った。図８は、Ｃホルデインタンパク質に対する抗体を使用したSDS-PAGEゲル（
ジチオスレイトールのような還元剤の不存在下で使用した）のウエスタンブロッ
トを示す。レーンＡはスタンダード分子量マーカーを示し、レーンＢはＮ末端領
域に単一のシステインを含む修飾Ｃホルデイン遺伝子を発現する大腸菌細胞の抽
出物を含み、レーンＣはpET-11d発現プラスミドにANG/OHBD/Cys7Cys236遺伝子を
含む大腸菌からの抽出物を含む。２９ｋＤａでのホルデイン抗体に対する強力な
抗体交差反応は、２９ｋＤａタンパク質がANG/OHBD/Cys7Cys236遺伝子の産物で
あることを確認する。
【００７６】 ANG/PIN-A/Cys7Cys236タンパク質の発現と分析 ANGΔCys7Cys236、及びカナマイシン耐性プラスミドから得た８４０ヌクレオ
チドの長さを有するプロインドリン−Ａ遺伝子より成るＤＮＡ断片（上記参照）
を、pET-11d発現ベクター中にサブクローン化した。一つのトランスフォーマン
トコロニーを拾い、５ｍｌの２ＹＴ培地にトランスフェクトした。タンパク質発
現をＩＰＴＧによって誘導し、２及び６時間後に細胞を遠心分離によって回収し
、２００μｌのゲルに乗せる緩衝液中に再懸濁した。誘導の前後の細菌のタンパ
ク質含有物のSDS-PAGE分析が図１０に示されている。レーンＡはスタンダードタ
ンパク質分子量マーカーを含み、レーンＢはpET-11dプラスミドを有する細胞の
抽出物を含み、レーンＣ及びＤはANG/PIN-A/Cys7Cys236遺伝子を含むpET-11dベ
クターを有する細胞の抽出物を含む。レーンＣはＩＰＴＧ誘導の２時間後の抽出
物を含み、レーンＤはＩＰＴＧ誘導の６時間後に調製された抽出物を含む。外来
タンパク質バンドは、誘導の後３５ｋＤａの見かけの分子量を有するものとして
ゲルに出現した（レーンＤ）。この出現したタンパク質は、プロインドリンＡ抗
体と陽性に反応した（図１１）。レーンＡ及びＢは、それぞれ誘導の２時間及び
６時間後のANG/PIN-A/Cys7Cys236遺伝子を含むpET-11dを有する細胞の抽出物を
含む。レーンＣはプロインドリンＡ遺伝子単独（ANGΔCys7Cys236遺伝子内に挿
入されていない）を含むプラスミドを有する細胞のウエスタンブロットを含み、
レーンＤはコントロールpET-11dベクターを有する細胞の抽出物を含む。全ての
レーンを、抗プロインドリンＡ抗体と反応させた。図１２は、抗ホルデイン抗体
で反応させたSDS-PAGEゲルのウエスタンブロットを示す。レーンＡは分子量マー
カーを含み、レーンＢはコントロールpET-11dベクターを有する細胞の抽出物を
含み、レーンＣはプロインドリンＡ遺伝子単独を含むプラスミドを有する細胞の
抽出物を含み、レーンＤはANG/PIN-A/Cys7Cys236遺伝子を含むpET-11dベクター
を有する細胞の抽出物を含む。発現されたタンパク質はレーンＤにおいて明白に
示されている。
【００７７】 類似体グルテニン−プロインドリンＡ融合タンパク質は、そのアミノ酸配列に
基づいて計算された値（３２．８ｋＤａ）よりもわずかに低い移動度をSDS-PAGE
で有した。この小さい差異は、おそらく該分子のANG部分のロッド形態のためで
あろう。しかしながら発現されたプロインドリンＡタンパク質は、計算されたも
のと同じ移動度を有した。
【００７８】 コムギトランスフォーメーションに引き続く修飾タンパク質の発現 微小銃照射は、コムギ内に遺伝子を移動するために使用される最も広く適用さ
れている方法である。コムギへの遺伝子の移動及びその発現を、選択マーカー遺
伝子及び興味ある遺伝子をそれぞれ含む特異的ＤＮＡ構築物を使用して実施する
。使用された選択マーカー遺伝子は、プラスミドpEmuKON (Chamberlain等, 1994
)に含まれた。興味ある遺伝子構築物のために構築は、図１３に示される。コム
ギトランスフォーメーションを、Witrzens等 (1998)に記載された方法に従って
パロモマイシン選択を使用して実施した。
【００７９】 ANG/SBD/Cys7Cys236タンパク質の発現、精製及び分析 pET-11d及びANG/SBD/Cys7Cys236タンパク質に対する遺伝子を含む該プラスミ
ドの誘導体(pET-SBD)を、AD494(DE3)株中に別個にトランスフォームした。それ
ぞれの一つのトランスフォーメーションコロニーを、２００ｍｇ／ｌのアンピシ
リンを含むＬＢ培地の５ｍｌ培養液にイノキュレートするために使用した。３７
℃で４時間の攪拌後、これらの培養物を、２ｌフラスコ中の同じ培地の６００ｍ
ｌをイノキュレートするために使用し、これらを３７℃で一晩（１６時間）攪拌
しながらインキュベートした。ＩＰＴＧをイノキュレーションの６時間後にこれ
らの培養物に加え、プラスミドからのタンパク質の発現を誘導した。各培養物か
ら得た細胞を、５℃で１５分１０，０００ｇでの遠心分離によって回収した。
【００８０】 各培養物から得た細胞の半分を、8M尿素、5mM EDTA及び1mM DTTを含む50mM Tr
is-Cl緩衝液pH7.5の３５ｍｌ中に室温で３０分インキュベーションすることによ
って溶解した。不溶性物質を、１５℃で１時間２００，０００ｇで遠心分離して
除去した。次いで上清を、５℃で尿素を引いた抽出緩衝液(50m mTris-Cl pH7.5,
5mM EDTA, 1mM DTT)に対して過度に透析した。曇った沈降物を５℃で１時間２
００，０００ｇでの遠心分離によって除去し、上清（３５ｍｌ）を−２０℃で貯
蔵した。
【００８１】 β-シクロデキストリン結合タンパク質を、二つの透析物のそれぞれの２０ｍ
ｌから精製し、50m mTris-Cl pH7.5, 100mM NaCl, 40mM ジチオスレイトール, 1
mM EDTA（カラム緩衝液）で平衡化した５ｍｌβ-シクロデキストリン−セファロ
ースカラムを通過させて細菌抽出物を分類した。搭載した後、カラムを２０ｍｌ
のカラム緩衝液で洗浄し、結合したタンパク質を15mMβシクロデキストリンを含
む２５ｍｌのカラム緩衝液で溶出した。５ｍｌの分画を搭載の間回収し、洗浄し
、カラム分画の溶出物を水に対して過度に透析し、凍結乾燥し、もともとの細菌
細胞培養物のｍｌ等量に対して約１μｌで0.1M Tris-Cl pH6.8に再懸濁した。
【００８２】 最終搭載分画及び洗浄及び溶出分画の天然PAGE及びSDS-PAGEが図１４に示され
ている。各レーンは、細菌培養物の７ｍｌの等量物から得たタンパク質を含む。
二つの主要なβ-シクロデキストリン結合タンパク質が、プラスミドpET-SBDを有
する株から得た溶出分画（レーン６及び７参照）で見られた。これらは、SDS-PA
GEゲルから３０ｋＤａ及び＞６０ｋＤａと評価される。３０ｋＤａタンパク質は
、プラスミドpET-11dを有するコントロール株から得た抽出物のカラムからも溶
出されるが（パネルＣ、レーン６）、それは前者の株と同じレベルでは生産され
ていない。
【００８３】 ANG/CM16/Cys7Cys236タンパク質の発現、精製及び分析 この誘導タンパク質（８３４ｂｐ長）の遺伝子を、上述のようにアンピシリン
耐性pET-11d発現ベクター中に、カナマイシン耐性pJKKmオリジナルプラスミドか
らサブクローン化した。OD600が０．６ユニットになるまで細菌を３７℃で培養
し、次いでＩＰＴＧを加えることによって発現を誘導した。細胞を誘導の２，４
若しくは６時間後に回収し、サンプルをSBDキメラタンパク質の場合と同様に調
製した。
【００８４】 SDS-PAGE分析の結果が図９に示される（ゲルはクマシータンパク質染色で染色
されている）。レーンＡはスタンダードタンパク質分子量マーカーを含む。レー
ンＢからＥは粗大腸菌溶解物のエタノール可溶性抽出物を示す。レーンＢはコン
トロールプラスミドpET-11dを含む細胞から得ら抽出物を含む。レーンＣ、Ｄ及
びＥは、それぞれＩＰＴＧを使用したタンパク質合成の誘導の２，４，及び６時
間後の細胞から調製された、ANG/CM16/Cys7Cys236遺伝子を含むpET-11dベクター
を有する細胞のエタノール可溶性抽出物を含む。エタノール可溶性分画は、クマ
シー染色ゲルで単一のバンドのみを与え、それは３５ｋＤａの見かけの分子量を
有するタンパク質を表す。これはまた、計算値（３１．９ｋＤａ）よりも大きく
、この矛盾もまた該タンパク質の普通でない形態によって説明される。
【００８５】 攪拌フラスコ中の大規模なタンパク質発現の収率は、１ｌの培地当たり３０ｍ
ｇのタンパク質であった。
【００８６】 デンプン結合活性の証明 アフィニティー精製カラムの分画６及び７における主要なタンパク質のデンプ
ン結合活性を、以下のように証明した。分画を、図１８に示されるように、グリ
セリン(10% w/v)、CHAPS (0.05% w/v)及びβ-シクロデキストリン(5mM)及びデン
プン（コーンアミロペクチン, 0.1% w/v)の各種の組み合わせを含む４種の天然P
AGEゲルに乗せた。各ゲル中のタンパク質バンドの移動度を比較した。各分画中
の主要タンパク質バンドの電気泳動移動度は、デンプンの存在下で顕著に遅れる
ことが見出された（図１８，パネルＢ）。これらのタンパク質バンドのデンプン
結合活性の特異性が、β-シクロデキストリンによる競合的阻害によって示され
た（パネルＣ、Ｄ）。
【００８７】 トリプシンペプチド容量フィンガープリンティング及びＮ末端タンパク質シーク
エンシングによる精製デンプン結合タンパク質の同定 AD494(DE3)/pET-SBD株から得たβ-シクロデキストリンアフィニティーカラム
分画の天然ゲル由来の二つの主要タンパク質バンドを、ゲル中のトリプシン切断
にかけ、引き続きマトリックスアシストレーザー吸収タイムオブフライト(MALDI
-TOF)マススペクトロスコピーにかけた。同定されたトリプシン断片の容量を、A
NG/SBD/Cys7Cys236から予測されるトリプシンペプチドの理論的容量と比較し、
並びにマッチングトリプシンペプチドを与える他の候補のタンパク質についての
タンパク質配列データベースを検索するために使用した。
【００８８】 分画６の３０ｋＤａタンパク質（図１４，パネルＡ、Ｂ、レーン６）は、該タ
ンパク質配列の５７％をカバーする１７のペプチドマッチに基づいて、大腸菌の
ペリプラスムマルトース結合タンパク質(malE遺伝子の産物）と同定された。
【００８９】 分画７の主要タンパク質バンド（図１４，パネルＡ、Ｂ、レーン７）は、該配
列の２３．１１％をカバーする４のマッチングペプチドに基づいて、ANG/SBD/Cy
s7Cys236と同定された（表１）。このタンパク質の同定のさらなる証拠は、Ｎ末
端タンパク質シークエンシングから得られた。１０サイクルのシークエンシング
は、ANG/SBD/Cys7Cys236について予測される、以下の配列を生じた： ＭＲＱＬＮＰＣＳＱＥ これは精製タンパク質の同定の確信的な証拠を提供し、機能的データは、示され
たような修飾種子貯蔵タンパク質の特性であることを確認する。
【００９０】 表１ ANG/SBD/Cys7Cys236のマススペクトル特性 ペプチド 予測容量 開始 終了 配列 容量 1776.74 1777.28 224 238 IESDDSVEWESDPNR 2193.00 2193.85 221 238 FIRIESDDSVEWESDPNR 2652.26 2653.54 198 220 YTSSDPLWYVTVTLPAGESFEYK 2257.03 2258.00 239 258 EYTVPQAC★GTSTATVTDTWR Ｃ★＝システインのアクリルアミド内転
【００９１】 ジスルフィド結合ポリマーを形成するANG/SBD/Cys7Cys236の能力の証明 類似体グルテンタンパク質(ANG)のデザインは、Ｎ及びＣ末端の両者のシステ
イン残基を含み、それがグルテンマクロポリマー中への修飾種子貯蔵タンパク質
のジスルフィド介在取り込みを可能にする。本発明者は、ジスルフィド結合ポリ
マー性種内へ取り込まれるANG/ドメインCys7Cys236タンパク質の能力が、外部ド
メインの存在によって損なわれないことを、in vitro重合実験によって示した。
【００９２】 ポリマーを形成する能力は、50mM Tris-Cl緩衝液pH6.8におけるANG/SBD/Cys7C
ys236タンパク質の銅介在性の酸化によって示された。タンパク質サンプルの３
種のペアを使用し、その一種のペアはANGのジスルフィド結合に対するリガンド
のいずれかの効果を分析するために、付加されたβ-シクロデキストリン(0.5mM)
を含んだ。二つのペアは、EDTA (10mM)の添加による金属のキレート形成の前に
、0.1mM CuSO4の存在下で室温で５分酸化された。次いでこれらのペアの一方を
、20mM DTTの存在下で還元した。サンプルのもう一方のペアは、銅が添加されな
かったが、EDTAの存在下でDTTで還元された。サンプルをSDS-PAGEによって分析
した（図１９）。リガンドβ-シクロデキストリンの存在のため、酸化に対する
効果は存在しなかった。酸化タンパク質サンプルの大部分は、分離ゲルに丁度入
る大きい分子量のバンドを形成する（レーン１，２）。この移動度の変化はジス
ルフィド結合ポリマー状形態の形成のためであることは、ジスルフィド特異的還
元剤DTTの能力によって示され、それは還元サンプルで見られる高移動度形態に
ポリマーを戻すように破壊する（レーン５，６）。
【００９３】 トランスジェニックコムギ植物における修飾種子貯蔵タンパク質をコードする遺
伝子の検出 トランスジェニックコムギ植物における修飾タンパク質に対する遺伝子の存在
を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって決定した。反応を、９μlのPCR Superm
ix (GibcoBRL), 50ng鋳型ＤＮＡ（標準的なプロトコールを使用してコムギ葉組
織から抽出された）, 172nmolのB×17 3'及びRGS2024のそれぞれのプライマー、
０．６μlの25mM MgCl2を含む１１．６μｌ容量で実施した。PCR条件は、９４℃
で２分の１サイクル；９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分の３５サ
イクル；７２℃で４分、２５℃で１分の１サイクルであった。ANG/OHBD/Cys7Cys
236のPCR産物が図１７に示されている。約６００塩基対のPCR産物が、遺伝子の
存在を示す。６００ｂｐのPCR産物は、陰性コントロール植物から得たPCR反応で
は得られない。
【００９４】 ジスルフィド結合ポリマーを形成するANG/SBD/Cys7Cys236の能力の証明 類似体グルテニンタンパク質(ANG)のデザインは、Ｎ及びＣ末端にシステイン
残基を含み、それはグルテンマクロポリマー中への修飾種子貯蔵タンパク質のジ
スルフィド介在取り込みを可能にする。本発明者は、ジスルフィド結合ポリマー
性種へ取り込まれるANG/ドメイン/Cys7Cys236タンパク質の能力は、外部ドメイ
ンの存在によって損なわれないことを、in vitro重合実験によって示した。
【００９５】 ポリマーを形成する能力は、50mM Tris-Cl緩衝液pH6.8における該タンパク質
の銅介在性の酸化によって示された。タンパク質サンプルの３種のペアを使用し
、その一種のペアはANG部分のジスルフィド結合に対するリガンド結合のいずれ
かの効果を分析するために、付加されたβ-シクロデキストリン(0.5mM)を含んだ
。二つのペアは、EDTA (10mM)の添加による金属のキレート形成の前に、0.1mM C
uSO4の存在下で室温で５分酸化された。次いでこれらのペアの一方を、20mM DTT
の存在下で還元した。サンプルのもう一方のペアは、銅が添加されなかったが、
EDTAの存在下でDTTで還元された。サンプルをSDS-PAGEによって分析した（図１
９）。リガンドβ-シクロデキストリンの存在のため、酸化に対する効果は存在
しなかった。酸化タンパク質サンプルの大部分は、分離ゲルに丁度入る大きい分
子量のバンドを形成する（レーン１，２）。この移動度の変化はジスルフィド結
合ポリマー状形態の形成のためであることは、ジスルフィド特異的還元剤DTTの
能力によって示され、それは還元サンプルで見られる高移動度形態にポリマーを
戻すように破壊する（レーン５，６）。
【００９６】 要約 本発明に従った修飾グルテニンの結合活性の説明は、ANG/SBD/Cys7Cys236タン
パク質と称されるものについて、上述の実施例において提供された。該データは
、発現プラスミド(pET-SBD)を有する大腸菌株からの新規なタンパク質（６０ｋ
Ｄａの見かけの分子量）の発現と精製の説明を、コントロールプラスミド(pET-1
1d)を有する同じ株におけるこのタンパク質の欠如と比較して、示唆することを
提供する（図１４）。該精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程の使用
を含み、そこではタンパク質が、β-シクロデキストリン含有カラムマトリック
スに結合する能力に基づいて精製された。それ故これは、本発明者が機能的リガ
ンド結合ドメインを含む種子貯蔵タンパク質の生産を通じて実施する還元を説明
する方法の第一の実施例を表す。
【００９７】 天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用するコーンデンプンに対する主要
精製タンパク質の結合、並びにβ-シクロデキストリンによるこの結合の阻害の
説明(PAGE)（図１８）は、本発明の実施のための還元の非常に説得力のある説明
である。
【００９８】 ペプチドマスフィンガープリンティング及びＮ末端タンパク質シークエンシン
グによるANG/SBD/Cys7Cys236のようなこのタンパク質の同定は、高分子結合ドメ
インを含む修飾種子貯蔵タンパク質の機能性をさらに説明する。SDS-PAGEによる
このタンパク質の見かけの分子量は、該タンパク質の計算された分子量がわずか
に３０ｋＤａである一方で、予測されない電気泳動移動度を有して移動する修飾
Ｃホルデインタンパク質の一般的な現象のさらなる例示を示すであろう。別法と
して、該タンパク質は、おそらく単一結合β-シクロデキストリンの周囲にダイ
マーを形成し、それはSDSと還元剤の存在下での熱処理によって解離されない。
【００９９】 ANG部分がジスルフィド結合ポリマー状種を形成することは、銅酸化アフィニ
ティー精製タンパク質の天然PAGEによって示された。融合タンパク質は、新規な
デンプン結合活性を含むことが示されている。重要なことは、修飾タンパク質が
、Ｎ及びＣ末端でシステイン残基を通じて重合する能力を失っていると解される
ことであり、それ故新規なタンパク質は、コムギ小麦粉中でグルテンマクロポリ
マー中に取り込まれ得ることである。
【０１００】 高分子結合ドメインを有する修飾種子貯蔵タンパク質（この場合ANG/SBD/Cys7
Cys236)の能力の説明は、ジスルフィド結合ポリマー状種を形成できることにあ
る（図１９）。これは、ジスルフィド結合を通じてグルテンマクロポリマー中に
取り込まれる該タンパク質の能力を示す。
【０１０１】 表１は、ANG/SBD/Cys7Cys236株から精製された主要β-シクロデキストリン結
合タンパク質（デンプン結合タンパク質）の実験的に測定されたトリプシン断片
の分子量と、ANG/SBD/Cys7Cys236タンパク質のトリプシン断片の理論的分子量の
間の同一性を示す。内因性細菌マルトース結合タンパク質との３０ｋＤａタンパ
ク質の同一性もまた提供される。
【０１０２】 当業者は、広く記載された本発明の精神若しくは範囲を離れることなく、特異
的な実施態様で示された本発明に対して、数多くの変形及び／または修飾がなさ
れ得ることは、予測されるであろう。それ故本実施態様は、全ての面で説明的な
ものとして考慮され、制限的なものとして考慮されるべきではない。
【０１０３】
【参考文献】
【０１０４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、pJANGΔCys7Cys236ベクターの配列を現す（配列番号
１４及び配列番号１５）。pJKKm及びpGEM-TプラスミドのMCSの制限部位及び酵素
が太字で記載されている。ANG中への遺伝子挿入のためのクローニング部位は下
線が引かれ、太字で記載されている。pET 11d発現ベクター内への遺伝子のサブ
クローニングのための切断部位は下線が引かれている。
【図２】 図２は、オレオシン疎水性結合ドメイン(OHBD)のヌクレオチド
配列（配列番号１６）及びアミノ酸配列（配列番号１７）を示す。矢印は、プラ
イマー伸長の方向を示している。小さい文字は、クローニングのための外部ヌク
レオチド及びANG分子から得たアミノ酸を示している。中央のアンチパラレルな
ドメインのアミノ酸配列は、二つの矢印で表されている。
【図３】 図３は、ANGΔCys7Cys236（分子量１８．５ｋＤａ）のヌクレ
オチド配列（配列番号１８）及びアミノ酸配列（配列番号１９）を示す。システ
イン残基は、太字の文字で表されている。外部の二つのアミノ酸及び６個のヌク
レオチドが、小さな文字で記載されている。
【図４】 図４は、Aspergillus nigerから得た1,4-α-D-グルカングルコ
ヒドロラーゼ（分子量１１．９ｋＤａ）のデンプン結合ドメインのヌクレオチド
配列（配列番号２０）及びアミノ酸配列（配列番号２１）を示す。小さな文字は
、クローニングのための外部ヌクレオチド、及びANG分子から得たアミノ酸を示
している。制限部位は太字であり、下線が引かれている。
【図５】 図５は、CM16（配列番号２３）及びCM17（配列番号２４）のヌ
クレオチド配列（配列番号２２）とアミノ酸配列を示す（分子量は１３．４ｋＤ
ａである）。小さな文字は、クローニングのための外部ヌクレオチド、及びANG
分子から得たアミノ酸を示している。制限部位は太字で記載され、下線が引かれ
ている。ヌクレオチド配列の下の第一のアミノ酸配列はCM16を表し、CM17タンパ
ク質との差異のみが示されている。
【図６】 図６は、プロインドリンＡ（分子量は１４．３ｋＤａである）
のヌクレオチド配列（配列番号２５）とアミノ酸配列（配列番号２６）を示す。
小さな文字は、クローニングのための外部ヌクレオチド、及びANG分子から得た
アミノ酸を示している。制限部位は太字で記載され、下線が引かれている。
【図７】 図７は、ANG/OHBD/Cys7Cys236遺伝子の発現を表す。ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ分析引き続き、クマシーブルー染色を実施した。レーンＡは、スタンダ
ード分子量マーカーを含む。レーンＢは、宿主大腸菌細胞がpET-11dベクターを
含むコントロールを示す。レーンＣは、ANG/OHBD/Cys7Cys236遺伝子を含むpET-1
1dからの組換えANG/OHBD/Cys7Cys236タンパク質（３０ｋＤａのマーカーからさ
らにわずかに移動している）の発現を示す。
【図８】 図８は、ANG/OHBD/Cys7Cys236遺伝子の発現を表す。ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ分析引き続き、Ｃホルデインに対する抗体を使用したウエスタンブロッ
トを実施した。レーンＡは、スタンダード分子量マーカーを含む。レーンＢは、
Ｎ末端領域中の単一のシステインを含む修飾Ｃホルデイン遺伝子を発現する大腸
菌細胞の抽出物を含む。レーンＣは、pET-11d発現プラスミド中のANG/OHBD/Cys7
Cys236遺伝子を含む大腸菌からの抽出物を含む。
【図９】 図９は、クマシーブルー染色による、精製ANG/CM16/Cys7Cys23
6遺伝子産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーンＡは、スタンダードタンパ
ク質分子量マーカーを含む。レーンＢからＥは、粗大腸菌溶解物のエタノール溶
解性抽出物を示す。レーンＢは、コントロールプラスミドpET-11dを含む細胞か
ら得た抽出物を含む。レーンＣ、Ｄ及びＥは、ＩＰＴＧを使用するタンパク質合
成の誘導の後、それぞれ２，４及び６時間後の細胞から調製された、ANG/CM16/C
ys7Cys236遺伝子を含むpET-11dベクターを有する細胞のエタノール溶解性抽出物
を含む。
【図１０】 図１０は、ANG/PIN-A/Cys7Cys236遺伝子の発現を表す。ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥゲルをクマシーブルーで染色した。レーンＡは、スタンダードタン
パク質分子量マーカーを含む。レーンＢは、コントロールpET-11dプラスミドを
有する細胞の抽出物を含み、レーンＣ及びＤは、ANG/PIN-A/Cys7Cys236遺伝子を
含むpET-11dベクターを有する細胞の抽出物を含む。レーンＣは、ＩＰＴＧ誘導
の２時間後の抽出物を含む。レーンＤは、ＩＰＴＧ誘導の６時間後に調製された
抽出物を含む。
【図１１】 図１１は、ANG/PIN-A/Cys7Cys236遺伝子の発現を表す。ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ分析に引き続き、抗プロインドリンＡ抗体でウエスタンブロッティ
ングを実施した。レーンＡ及びＢは、それぞれ誘導の２時間及び６時間後のANG/
PIN-A/Cys7Cys236遺伝子を含むpET-11dベクターを有する細胞の抽出物を含む。
レーンＣは、プロインドリンＡ遺伝子単独（ANGΔCys7Cys236遺伝子内に挿入さ
れていない）を含むプラスミドを有する細胞のウエスタンブロットを含む。レー
ンＤは、コントロールpET-11dベクターを有する細胞の抽出物を含む。
【図１２】 図１２は、ANG/PIN-A/Cys7Cys236遺伝子の発現を表す。ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ分析に引き続き、抗ホルデイン抗体でウエスタンブロッティングを
実施した。レーンＡは、分子量マーカーを含む。レーンＢは、コントロールpET-
11dベクターを有する細胞の抽出物を含む。レーンＣは、プロインドリンＡ遺伝
子単独を含むプラスミドを有する細胞の抽出物を含む。レーンＤは、ANG/PIN-A/
Cys7Cys236遺伝子を含むpET-11dベクターを有する細胞の抽出物を含む。
【図１３】 図１３は、新規なタンパク質遺伝子を含む構築物での、コム
ギのトランスフォーメーションのためのプラスミドを示す。該ベクターは、Ｋｐ
ｎＩ及びＢａｍＨＩ部位領域内への遺伝子の挿入によって修飾されているpTLZHM
Wcasプラスミドに基づく。該ベクターは、pTLZ-ANGCys7Cys13、pTLZ-ANGCys236
及びpTLZ ANG/OHBD/Cys7Cys236である。
【図１４】 図１４は、ANG/SBD/Cys7Cys236の発現及びβ-シクロデキス
トリンアフィニティー精製を示す。pET-11dコントロールプラスミド、若しくはA
NG/SBD/Cys7Cys236の発現のためのpET-SBDプラスミドのそれぞれを有する、AD49
4(DE3)株のＩＰＴＧ誘導培養物から得た抽出物を乗せた、５ｍｌのβ-シクロデ
キストリン−セファロースアフィニティーカラムから得たカラム分画の天然PAGE
及びSDS-PAGEゲルを示す。 パネルＡ＝AD494(DE3)/pET-SBDから得た分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。 パネルＢ＝AD494(DE3)/pET-SBDから得た分画の天然ＰＡＧＥ。 パネルＣ＝AD494(DE3)/pET-11dから得た分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。 パネルＤ＝AD494(DE3)/pET-11dから得た分画の天然ＰＡＧＥ。 レーンＭ＝ｋＤａで示される分子量を有する分子量マーカー。 レーン１＝カラム搭載物からの非結合フロースルー。 レーン２−５＝カラム緩衝液(50mM Tris-Cl pH7.5, 100mM NaCl, 40mMジチオス
レイトール, 1mM EDTA)での４回の５ｍｌの洗浄物。 レーン６−１０＝１５ｍＭβ−シクロデキストリンを含むカラム緩衝液での４回
の５ｍｌ溶出物。
【図１５】 図１５は、高分子に対する結合ドメインを含む修飾種子貯蔵
タンパク質を生産する方法の模式図を表す。この例において、Ｂホルデイン遺伝
子は、Ｎ及び／またはＣ末端ドメイン中にシステイン残基を含む類似体グルテン
（ＡＮＧ）タンパク質を生産するように改変される。次いでこのタンパク質を、
別のタンパク質から得た結合ドメインで、その繰り返しドメインの一部を置換す
ることによってさらに修飾する。システイン残基の付加は、例えばコムギ小麦粉
中のグルテンマクロポリマー中への、該タンパク質の取り込みを可能にする。特
異的結合ドメインの付加は、他の高分子（例えばデンプン、脂質）に対するグル
テンネットワークの非共有結合を提供する。上記タンパク質は、成分若しくは添
加物としての使用のため、組換え細菌、酵母、若しくは他の異種宿主において発
現されてもよく、または例えばコムギといったトランスジェニック植物の種子中
に生産されてもよい。
【図１６】 図１６は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるトランス
フォーム化コムギ植物中のトランスジーンの同定のためのスキームの模式図であ
る。遺伝子とそのプロモーター（高分子量グルテニンＢ×１７についての遺伝子
から得られた）の間の界面にまたがるプライマーペアは、Ｃホルデインとグリア
ジン遺伝子の間の高いホモロジーから生ずる偽のポジティブを検出しないことを
確実にする。
【図１７】 図１７は、取り込まれたリガンド結合ドメインを有する修飾
種子貯蔵タンパク質についての遺伝子を含む、トランスジェニックコムギ植物の
ＰＣＲベースの同定を示すアガロースゲルを示す。この例において、ANG/OHBD/C
ys7Cys236についての遺伝子が、コムギ植物をトランスフォームするために使用
されたプラスミド（レーン１）、及び推定のトランスフォーマントコムギ植物（
レーン２）で検出されたが、非トランスフォーム化コントロールコムギ植物（レ
ーン３）では検出されない。
【図１８】 図１８は、天然ＰＡＧＥによってアッセイされたANG/SBD/Cy
s7Cys236タンパク質のデンプン結合活性を示す。AD494(DE3)/pET-SBD株の尿素抽
出物のβ−シクロデキストリンアフィニティーカラムから得られた分画６および
７のそれぞれから得られたタンパク質を、デンプン（パネルＢ及びＤ）及び／ま
たはベータ−シクロデキストリン（パネルＣ及びＤ）を含む天然ゲル、またはデ
ンプンとβ−シクロデキストリンの両者を含まない（パネルＡ）天然ゲルに乗せ
た。デンプン単独の存在下での電気泳動移動度の減少（パネルＢ）は、核タンパ
ク質の特異的デンプン結合活性を示す。
【図１９】 図１９は、高分子結合ドメインを含む修飾種子貯蔵タンパク
質の酸化的重合を示す。この例において、ANG/SBD/Cys7Cys236は、添加したβ−
シクロデキストリンの存在下若しくは不存在下で、ジスルフィド結合的な重合性
の種を形成するように酸化された（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのスキャンイメージ中
に矢印で示されている；レーン１，２）。重合性の種は、ジスルフィド特異的還
元ジチオスレイトールによって後に還元することができ（ＤＴＴ；レーン３，４
）、重合が、該分子のANG部分のＮ及びＣ末端の導入されたシステイン残基の存
在のために生ずることを示す。 Ｍ＝（ｋＤａ）で示される分子量を有する分子量マーカー； レーン１＝β−シクロデキストリンの存在下で酸化されたANG/SBD/Cys7Cys236； レーン２＝β−シクロデキストリンの不存在下で酸化されたANG/SBD/Cys7Cys236
； レーン３＝β−シクロデキストリンの存在下で酸化され、次いでＤＴＴで還元さ
れたANG/SBD/Cys7Cys236； レーン４＝β−シクロデキストリンの不存在下で酸化され、次いでＤＴＴで還元
されたANG/SBD/Cys7Cys236； レーン５＝β−シクロデキストリンの存在下で酸化された還元ANG/SBD/Cys7Cys2
36； レーン６＝β−シクロデキストリンの不存在下で酸化された還元ANG/SBD/Cys7Cy
s236。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年６月１日（２０００．６．１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００８】
【課題を解決するための手段】 第一の態様として、本発明は、修飾グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質を
生産する方法を提供し、該方法は、修飾タンパク質にリガンド若しくは他の高分
子を結合する能力を与える外因性アミノ酸ドメインを、該タンパク質に付加する
ことを含み、該修飾タンパク質は、グルテン内に取り込まれる能力を有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００９】 一つの好ましい実施態様として、修飾グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質
は、そのアミノ酸配列中に付加された一つ以上の外因性アミノ酸残基をさらに含
む。より好ましくは、一つ以上のアミノ酸残基は、一つ以上のシステイン残基で
ある。好ましくは、一つ以上のシステイン残基は、タンパク質のアミノ酸配列の
一方若しくは両方の末端で取り込まれる。一つ以上のシステインの付加は、修飾
タンパク質を、使用の際にグルテンにより容易に取り込ませることができる。本
発明に従って生産されたグルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質に対するさらな
る修飾は、食料若しくは産業上の使用のために、グルテンネットワーク中に当該
タンパク質を取り込ませることを可能にする、若しくは補助できる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】 本発明者は、グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質中への、グルテニン若し
くは種子貯蔵タンパク質以外のタンパク質から得た外因性アミノ酸配列（ドメイ
ン）の取り込みが、特に該修飾タンパク質を広範囲の食料の応用で使用する場合
、グルテンの一般的特性を修飾することを見出した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１１】 図１６は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるトランスフォーム化コムギ
植物中のトランスジーンを同定するためのスキームの模式図を提供する。遺伝子
とそのプロモーター（例えば高分子量グルテニンＢ×１７についての遺伝子から
得たもの）の間の界面にまたがるプライマーペアは、Ｃホルデインとグリアジン
遺伝子の間の高いホモロジーから生ずる偽のポジティブが検出されないことを確
実にする。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】削除
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０３】
【参考文献】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/19 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:865） //(Ｃ１２Ｎ 1/19 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） 5/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (71)出願人 グッドマン フィルダー リミテッド オーストラリア国 ニューサウスウェール ズ 2000， シドニー， グロスベナー プレイス， レベル 42 (71)出願人 グループ リマグレイン パシフィック ピーティーワイ． リミテッド オーストラリア国 ニューサウスウェール ズ 2000， シドニー， オコーネル ス トリート １， レベル 31 (72)発明者 ルディ・アペルス オーストラリア・オーストラリアン・キャ ピタル・テリトリー・2614・アランダ・ジ ンガナ・ストリート・40 (72)発明者 マシュー・モレル オーストラリア・オーストラリアン・キャ ピタル・テリトリー・2614・アランダ・ワ ンガラ・ストリート・33 (72)発明者 フランク・ビクス オーストラリア・ニュー・サウス・ウェー ルズ・2119・ビークロフト・ハル・ロー ド・34 (72)発明者 ラスズロ・タマス ハンガリー・Ｈ−1033・ブダペスト・ヴァ リオグ・ウトゥカ・９ Ｆターム(参考） 4B023 LC05 LE26 LG06 LG10 LK10 4B024 AA05 AA20 BA80 CA03 CA06 CA07 DA01 DA02 DA06 DA12 EA04 GA11 HA01 4B032 DB01 DB05 DB32 DB40 DG02 DK21 DK22 DL06 DL20 4B065 AA26X AA62X AA77X AA80X AA88X AA88Y AA90X AB01 AC14 BA02 CA24 CA41 CA60 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA40 BA41 CA32 EA01 FA72 FA73 FA74

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 修飾グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質を生産する方法
    であって、該修飾タンパク質に、グルテン内に取り込まれる能力、またはリガン
    ド若しくは他の高分子を結合する能力を与えるドメインを、該タンパク質に付加
    することを含む方法。
  2. 【請求項２】 該ドメインが、一つ以上のアミノ酸残基を含む、請求項１記
    載の方法。
  3. 【請求項３】 該一つ以上のアミノ酸残基が、一つ以上のシステイン残基を
    含む、請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 該一つ以上のシステイン残基が、該タンパク質のアミノ酸配
    列の一方若しくは両方の末端で取り込まれる、請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 該ドメインが、該修飾タンパク質に、リガンド若しくは他の
    高分子を結合する能力を与える結合ドメインである、請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 該修飾タンパク質が、該タンパク質に、グルテン内に取り込
    まれる能力を与える一つ以上のアミノ酸残基をさらに含む、請求項５記載の方法
    。
  7. 【請求項７】 該結合ドメインが、脂質若しくはデンプンを結合できる、請
    求項５または６記載の方法。
  8. 【請求項８】 該脂質結合ドメインが、オオムギオレオシン遺伝子、若しく
    はコムギＣＭ１６タンパク質の脂質結合領域から由来する、請求項７記載の方法
    。
  9. 【請求項９】 該デンプン結合ドメインが、Aspergillus nigerから得たグ
    ルコアミラーゼから由来する、請求項７記載の方法。
  10. 【請求項１０】 該グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質が、低分子量グ
    ルテニン、高分子量グルテニン、グリアジン、プロインドリン、穀物柔軟タンパ
    ク質、フリアビリン、及びクロロホルム／メタノール可溶性タンパク質より成る
    群から選択される、請求項１から９のいずれか一項記載の方法。
  11. 【請求項１１】 該グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質が、オオムギか
    ら得られたＣホルデインである、請求項１０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 該タンパク質に、グルテンに取り込まれる能力、またはリ
    ガンド若しくは他の高分子を結合する能力を与えるドメインが挿入されている、
    修飾グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質。
  13. 【請求項１３】 請求項１から１１のいずれか一項記載の方法によって生産
    された、修飾グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質。
  14. 【請求項１４】 ANG/SBD/Cys7Cys236、ANG/OHBD/Cys7Cys236、及びANG/CM1
    6/Cys7Cys236より成る群から選択される、修飾グルテニン若しくは種子貯蔵タン
    パク質。
  15. 【請求項１５】 請求項１１から１４のいずれか一項記載の修飾グルテニン
    若しくは種子貯蔵タンパク質をコードする、単離された核酸分子。
  16. 【請求項１６】 請求項１５記載の単離された核酸分子を含む細胞であって
    、該核酸分子の発現に際して、修飾グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質を生
    産する細胞。
  17. 【請求項１７】 細菌、酵母、植物、昆虫、若しくは哺乳動物より成る群か
    ら選択される、請求項１６記載の細胞。
  18. 【請求項１８】 大腸菌である、請求項１７記載の細菌細胞。
  19. 【請求項１９】 Pichia種若しくはSaccharomyces cerevisiaeである、請求
    項１７記載の酵母細胞。
  20. 【請求項２０】 組換えコムギ細胞である、請求項１７記載の植物細胞。
  21. 【請求項２１】 食料製品の調製における、請求項１１から１４のいずれか
    一項記載の修飾グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質の使用。
  22. 【請求項２２】 食料製品が、発酵若しくは未発酵のパン、パスタ、ヌード
    ル、朝食用シリアル、スナック食品、ケーキ、練り粉製食品、及び小麦粉ベース
    のソースを含む食料より成る群から選択される、請求項２１記載の使用。
  23. 【請求項２３】 非食料製品の調製における、請求項１１から１４のいずれ
    か一項記載の修飾グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質の使用。
  24. 【請求項２４】 非食料製品が、フィルム、コーティング、接着剤、結合材
    料、若しくはパッケージ材料より成る群から選択される、請求項２３記載の使用
    。
  25. 【請求項２５】 食料製品の調製における、請求項１１から１４のいずれか
    一項記載の修飾グルテニン若しくは種子貯蔵タンパク質を含む穀物若しくは穀物
    の成分の使用。
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