PT614982E - Vector recombinante e o seu uso para a preparacao exocelular de anticorpos sob a forma de molecula unica a partir de bacillus subtilis - Google Patents

Vector recombinante e o seu uso para a preparacao exocelular de anticorpos sob a forma de molecula unica a partir de bacillus subtilis Download PDF

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PT614982E
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Description

Descrição k*Vector recombinante e o seu uso para a preparação exocelular de anticorpos sob a forma de molécula única a partir de bacillus subtilis” A presente invenção diz respeito, de uma maneira geral à produção exocelular de anticorpos sob a forma de molécula única (scFv) a partir de Bacillus subtilis ÍB subtilis).
Em particular, a presente invenção refere-se a um vector recombinante que compreende o promotor do gene para protease neutra, uma nova sequência de secreção e uma sequência de ADN que codifica um anticorpo scFv de interesse, uma estirpe de B. subtilis transformada com o referido vector recombinante e um processo para a produção exocelular de anticorpos scFv mediante cultura referida estirpe de B. subtilis. A possibilidade de obter fragmentos de anticorpo (mini-anticorpos) pela sua expressão em células bacterianas tem tomado acessíveis novas e interessantes expectativas de aplicação.
De facto, as suas dimensões reduzidas permitem uma melhoria nas características farmacocméticas para usos de diagnóstico e terapêutico. Além disso, a produção de mini-anticorpos em microrganismos é economicamente mais favorável do que a produção de anticorpos monoclonais (mAbs) em células de mamíferos visto serem garantidas uma maior reprodutibilidade das preparações e uma ausência completa de contaminantes eventuais de ADN oncogémco virai. Os anticorpos são proteínas tetraméricas formadas a partir de duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (K. ou lmabda). Na cadeia H pode observar-se uma região \ variável (VH) e três regiões constantes, enquanto que na cadeia leve apenas se
encontra presente uma região constante além da região variável (VK). As partes variáveis, que se encontram na extremidade amino-terminal de cada cadeia, são responsáveis pela ligação ao antigénio enquanto que as porções constantes interactuam com os outros componentes do sistema imune (função fectora).
As regiões responsáveis pela ligação ao antigénio e as que têm uma função efectora podem ser separadas mediante digestão enzimática sem alteração da sua funcionalidade. Na verdade, sabe-se que a porção Fv do anticorpo, isto é VH - VK, isolada através da digestão enzimática de IgG, mantém totalmente a sua capacidade para a ligação ao antigénio. A utilização da referida porção do anticorpo, que forma o sítio completo de ligação do antigénio, pode apresentar alguns problemas de estabilidade para o Fv na medida em que as duas cadeias, não se encontrando ligadas covalentemente, tendem a dissociar-se.
Recentemente foram propostas algumas estratégias para reduzir o inconveniente da dissociação das duas cadeias.
De particular interesse parece ser a que se encontra descrita por Bird et al., 1988 (Science, 242: 423-426) que consiste na expressão em E.coli de uma molécula formada pela união das regiões variáveis das duas cadeias por meio de um péptido apropriado (ligador). As duas regiões VH e VK são assim sintetizadas numa molécula única (scFv), com a extremidade carboxilo da região VK ligada à extremidade amino-terminal do VH, ou vice-versa, por meio do ligador.
Ao usarem esta estratégia, contudo, Bird et al. obtiveram uma expressão de scFv no interior da célula sob a forma de agregados insolúveis não fúncionais. A funcionalidade dessas moléculas só pode ser recuperada através de processos
J complexos, os quais, muito embora eficientes (Bird et al. referem rendimentos de renaturação compreendidos entre 5% e 30%), não apresentam qualquer vantagem quando comparados com sistemas em que os anticorpos são produzidos numa forma solúvel e funcional. A técnica conhecida descreve sistemas para a secreção de scFv funcional no periplasma de E coli. um ambiente a partir do qual podem recuperar-se moléculas de anicorpo após lise controlada das bactérias.
Está-se a prestar correntemente atenção ao desenvolvimento de sistemas para a síntese e a secreção de moléculas recombinantes em B. subtilis. B. subtilis é, de facto, um microrganismo interessante do ponto de vista biotecnologico: E completamente não patogénico, tem a capacidade de segregar o produto da expressão do gene no meio de cultura e é fácil de cultivar numa grande escala.
Uma limitação parcial ao uso desse microrganismo reside na falta de vectores que permitam uma produção exocelular eficiente dos anticorpos scFv. Bird et al. (US 4 946 778) obtiveram 1 mg/litro de scFv utilizando sistemas de expressão e secreção em B. subtilis que compreende as regiões promotoras e a sequência de secreção isolada a partir dos genes que codificam para as enzimas proteolíticas.
Recentemente, foi proposto um novo sistema para melhorar a secreção de scFv em B. subtilis (Wu et al.. 1993, Biotechnology, 1_U 71-76). Os valores obtidos (5 mg/litro), contudo, ainda parecem ter pouco o interesse para uso industrial.
Descobriu-se que as desvantagens da técnica anterior mencionada acima podem ser agora ultrapassadas pela adopção de um vector recombinante particular que compreende o promotor do gene para a protease neutra e uma sequência de 4 ADN que codifica para um novo péptido de secreção.
Em particular, o referido vector recombinante permite a expressão em B. subtilis de anticorpos de scFv de uma forma completamente solúvel e a sua secreção com rendimentos elevados.
Um objecto da presente invenção é um vector recombinante para a expressão e a secreção de anticorpos sob a forma de molécula individual a partir de B. subtilis que compreende o promotor do gene para a protease neutra, uma sequência nova de secreção e uma sequência de ADN que codifica para um anticorpo sob a forma de uma molécula única.
Um outro objecto da presente invenção é uma estirpe de B. subtilis transformada com o referido vector recombinante.
Um outro objecto da presente invenção é um processo para a preparação exocelular dos referidos anticorpos que compreende a cultura de uma estirpe de B subtilis transformada com o referido vector recombinante e a remoção do meio de cultura dos anticorpos sob a forma de molécula simples.
Um outro objecto da presente invenção e a utilização dos referidos anticorpos em diagnóstico e terapia.
Um outro objecto da presente invenção é a sequência de ADN que codifica para um péptido de secreção sinal.
Um outro objecto da presente invenção é o anticorpo scFv5E8 específico para a sub-unidade alfa de gonadotropina coriónica humana.
Outros objectos da presente invenção serão óbvios a partir da descrição dos exemplos que se seguem.
Descrição das fiauras 5 A Figura 1: ilustra o nucleótido e a sequência de amino-ácidos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal 5E8 específico para a sub--unidade alfa de gonadotropina humana. A Figura 2: ilustra o nucleótido e a sequência de amino-ácidos da região variável da cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal 5E8 específico para sub--umdade alfa de gonadotropina humana. A Figura 3, ilustra o mapa de restrição do vector recombtnante pSM507. Descrição pormenorizada da invenção
Em particular, o vector recombtnante de acordo com a presente invenção compreende:
1) o promotor do gene para a protease neutra de B. subtil is BGSC 1A341; 2) a sequência de secreção (1) 5’ ATG AG A AGC AAA AAA ACG CGT ATC AGC TTG TTG TTT GCG TTA ACG TTA ATC TTT ACG ATG GCA TTC AGC GGC CGC TCT GCC ATG GCC 3’e j 3) uma sequência de ADN que codifica para um anticorpo sob a forma de molécula individual com a sequência VH/VK-L-VK/VH-(TAG)n na qual: VH e VK são as regiões variáveis das cadeias pesada e leve de um anticorpo de interesse; L (ligador) é um ligador peptidico entre as duas regiões variáveis Val-Ser-Ser-íGly^-Ser)^; TAG é um péptido reconhecido pelos anticorpos policlonais dirigido para o mesmo péptido, n representa o número 1 ou 0. A sequência de secreção (T). ou a sequência líder (LS), codifica para um novo
péptido de secreção com a sequência de amino-ácidos seguinte:
Met Arg Ser Lys Lys Thr Arg Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Gly Arg Ser Ala Met Ala. O vector recombinante da presente invenção pode ser obtido mediante. a) síntese de um oligonucleotido que compreende a sequência de secreção (T), a sequência que codifica para o ligador peptídico e, eventualmente, a sequência que codifica para o péptido TAG e em que o referido oligonucleotido contém sítios de restrição únicos que permitem a inserção da sequência que codifica para a região variável da- cadeia pesada ou leve do anticorpo a jusante da sequência de secreção (I) e a montante do ligador peptídico e a inserção da sequência que codifica para a região variável da cadeia leve ou pesada do anticorpo a jusante do ligado peptídico e a montante péptido do TAG: b) clonagem do referido oligonucleotido num vector plasmidico que compreende o promotor do gene para protease neutra de B. subtilis BGSC 1A341; c) clonagem das sequências de ADN que codificam para a região variável das cadeias pesada e leve do anticorpo de interesse nos sítios de restrição do oligonucleotido; e finalmente d) isolamento do vector recombinante.
De acordo com uma forma de realização da presente invenção, o oligonucleotido na fase a) tem a sequência (L1)
Eco RI 5’ GAA TTC TTA TGA GA A GCA AAA AAA CGC GTA 30 TC A GCT TGT TGT TTG GGT TAA CGT TA A TCT TTA 63 CG A TGG CAT TCA GCG GCC GCT CTG CCA TGG CCG 96
PstI BstEII CAC AGG TCC AAC TGC AGC CTA TGG TCA CCG TCT 129 CCT CAG GTG GCG GTG GCT CTG GCG GTG GTG GGT 162
Kpnl
CGG GTG GCG GCG GAT CTG AC A TTC AAG GTA CCC 195 BgLH CCT GAG ATC TCA TGG AAG AAC TTA TGA TCG AGG 228
Sall HindIII GTA GGT AAG TCG AC A AGC TT 3; 248
Interrupção em que: imediatamente a jusante da sequência de secreção (I) (a partir dos nucleotidos 9 a 95 inclusive) há 4 sítios de restrição (PstI, BstEII. Kpnl e BglIIf) posicionados de tal modo que são capazes de clonar no mesmo quadro de leitura as sequências de ADN que codificam para a região variável da cadeia pesada (VH) e a cadeia leve (K), respectivamente. Entre o sitio BstEII (região de C-terminal do VH) e o sítio Kpnl (região de N-terminal do VK), a sequência codifica para um ligador peptidico entre as duas regiões, tendo a sequência Val-Ser-Ser-(Gly4-Ser)3, além disso, a sequência que se segue ao sitio Bgl II codifica para um nonapeptido com a sequência Met-Glu-Glu-Leu-Met-Ile-Clu-Gly-Arg útil como um alvo específico de reconhecimento pelos anticorpos antipeptídicos para controlar a expressão da proteína, utilizando o método das manchas de Western, e para a sua purificação. Esta sequência é seguida por um códão de interrupção para os sítios de tradução e de restrição Sall e HindIII. 8
Na forma de realização preferida, o vector plasmídico na fase b) é pSM308 ATCC 68047 que compreende a origem de replicação em B. subtilis, o gene CAT que codifica para a resistência ao cloranfenicol, o promotor para a protease neutra (npr) da estirpe B. subtilis BGCS 1A341, um sítio de restrição EcoRÍ localizado imediatamente a jusante do promotor e o sítio de reconhecimento do ribosoma (RBS) e um sitio HindlII a montante do sitio EcoRI. A clonagem do oligonucleotido pode ser conduzida de acordo com as técnicas normais, utilizando um vector plasmídico previamente digerido com enzimas de restrição apropriadas. Subsequentemente, a partir de clones positivos obtidos pelas técnicas de transformação e de selecção, podem isolar-se os plasmídeos de clonagem úteis para a construção do vector recombinante.
Operando nas condições preferidas, obtém-se um vector plasmídico com cerca de 4 Kb, denominado pSMA, em que LI se encontra inserido correctamente a jusante do promotor npr. A introdução das sequências que codificam para as regiões variáveis das cadeias pesada e leve de um anticorpo nos sítios de restrição do oligonucleotido LI resulta na construção do vector recombinante que, de acordo com a presente invenção, a partir de um promotor único, permite a expressão simultânea na mesma célula de um precursor completamente solúvel tendo a sequência seguinte: LS-VH-L-VK-TAG na qual: LS é a sequência de ADN (I) que codifica para o novo péptido de secreção sinal: VH é a região variável da cadeia pesada; VK é a região variável da cadeia leve;
L é o ligador peptidico Val-Ser-Ser-(Gly4-Ser)j e TAG é o nonapeptido Met-Glu-Glu-Leu-Met-Ile-Glu-Gly-Arg. O referido precursor é então processado correctamente a nível membranar e o anticorpo VH-L-VK-TAG é segregado no meio de cultura com um rendimento elevado.
As sequências que codificam para as regiões variáveis VH e VK podem ser escolhidas de entre os anticorpos monoclonais específicos para um antigénio de interesse. A título de exemplo não limitativo da invenção, clonaram-se sequências de codificação (genes) para as regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo monoclonal 5E8 específicas para a sub-umdade alfa da gonadotropina corionica humana (A. Albertini et al.. 1987 ("Human Tumor Markers. Ed. Walter de Gruvter & Co., Berlim) 387-401). A partir de uma cultura de hibridoma que produz anticorpos monoclonais 5E8. extraiu-se todo o ARNm a partir do qual se amplificou subsequente o ADN que codifica para as regiões variáveis das cadeias leve (VK5E8) e pesada (VH5E8) do anticorpo em questão. Conduziram-se as operações seguindo os métodos habituais que utilizam dois pares de oligonicleotidos como iniciadores que hibridizam nas extremidades 5' e 3’. respectivamente, dos genes que codificam para as referidas regiões.
Por meio da técnica de amplificação obtiveram-se fragmentos de ADN que compreendiam o gene VH5E8 delimitado ha extremidade 5' por um sitio PstI e na extremidade 3' por um sítio BstEII e o gene VK5ES delimitado na extremidade 5’ por um sitio Κ,ρηΐ e na extremidade 3' por um sítio BgIII. 7>f
Os fragmentos de ADN digeridos com o par de enzimas de restrição PstI e BstEII, e Kpnl e BglII foram clonados no vector pSMA obtendo-se o vector recombinante psM507.
De acordo com a presente invenção, construiram-se vectores recombinantes caracterizados por combinações de promotores/sequências de secreção diferentes a partir de npr/(LSI).
Para esta finalidade utilizou-se o plasmideo pSM268, que compreende um promotor constitutivo (Pc). a origem da replicação em B. subtil is, o gene que codifica para a resistência ao cloranfenicol e os sítios de restrição EcoRI, situados imediatamente a jusante da sequência de consenso de ligação para os ribosomas (RBS) para B. subtilis. e HindriT localizadas a jusante do sitio EcoRI. Obteve-se o referido plasmideo a partir de pSM214 ATCC 67320 mediante eliminação da região Avall-Xbal (que compreende a origem da replicação em E.coli e a sequência Km1) e circularização subsequente com T4 AND ligase.
Sintetizou-se então um oligonucleotido (L2) que compreende a sequência com 22 tripletos que codifica para o péptido lider do pelB de Erwinia carotovora (Lei. S.P. et al., 1987, J. Bacteriol. 169, 4379) e tem a sequência seguinte:
Eco RI 5’ GAA TTC ATA TGA AAT ACC TAT TGC CTA CGG 30 CCG CCG CTG GAT TGT TAT TAC TCG CTG CCC AAC 63
PstI
CAG CCA TGG CCG CAC AGG TCC AAC TGC AGC CTA 96 BstEII TGG TC A CCG TCT CCT CAG GTG GCG GTG GCT CTG 129
GCG GTG GTG GGT CGG GTG GCG GCG GAT CTG ACA 162 Kpnl BgLll TTC AAC GTA CCC CCT GAG ATC TC A TGG A AG AAC 195
Sall Hmdlll TTA TGA TCG AGG GTA GGT AAG TCG ACA AGC TT 3; 227
Interrupção
Ftnalmente. empreendeu-se a construção dos seguintes plasmideos de clonagem: - pSMB que compreende o promotor npr e o oligonucleotido L2 (sequência de secreção sinal de pelB); - pSiVlC que compreende o promotor constitutivo Pc e o oligonucleotido LI (sequência de secreção sinal I) e - pSMD que compreende o promotor constitutivo Pc e o oligonucleotido L2 (sequência de secreção sinal de pelB). A clonagem nos referidos plasmideos de fragmentos de ADN que compreendem o gene VH5E8 e o gene VK5E8 conduziu ao isolamento dos vectores recombinantes pSM438 (nprpel B); pSM443 (Pc/sequência (l)) e pSV1442 (Pc/pelB).
Subsequentemente, cultivaram-se células de B.subtilis transformadas com os referidos vectores em um meio de cultura apropriado. A partir da análise das proteínas intracelulares e exocelulares da referida cultura mostrou-se que: - o plasmídio pSM507 dá origem à acumulação de pelo menos 30 mg/litro de anticorpo solúvel no sobrenadante; - o plasmídeo pSM442 é responsável pela expressão de niveis elevados de
anticorpo (10% de proteínas totais) quase exclusivamente de forma intracelular e insolúvel; - o plasmídeo psM438 tem como resultado a secreção de scFv em uma quantidade três vezes inferior ao plasmidio pSM507 e dá origem à acumulação de precursor numa forma insolúvel, e finalmente - o plasmídeo psM443 não dá origem à acumulação de precursor mas para um nível de secreção inferior ao que se encontra com o plasmidio psM507.
Estes resultados indicam que a combinação de promotor do gene para protease neutra-sequência de secreção sinal (I) é fundamental para a expressão e a secreção óptimas do anticorpo. Por consequência, o vector recombinante de acordo com a presente invenção é útil para a produção exocelular de anticorpos scFv por meio de um processo de fermentação que utiliza uma estirpe de B.subtilis transformada com o referido vector.
Tipicamente, pode realizar-se o processo mediante cultura de uma estirpe de B.subtilis transformada com o vector recombinante da presente invenção em um meio de cultura que contém uma fonte de carbono, uma fonte de azoto e microelementos. isolando-se então o anticorpo scFv aí segregado.
Os referidos anticorpos podem ser purificados por uma das técnicas normalmente utilizadas neste campo de trabalho específico.
Realizaram-se ensaios de ligação e de afinidade sobre o extracto celular bruto obtido a partir do meio de cultura de células de B.subtilis (pSM507) que indicam que as características de interacçâo num sítio de ligação no scFv5E8 em comparação com o anticorpo monoclonal de origem se mantêm.
Por consequência, o anticorpo sob a forma de molécula individual, um outro 13 objecto da presente invenção, pode ser utilizado em técnicas de diagnóstico para a determinação dé tumores endócrinos e, de uma maneira geral, tumores de origem trofoblástica.
0 plasmídio pSM507 foi depositado como B.subtilis SM.S300(pSM507) na American Type Culture Collection onde recebeu o número de depósito ATCC 69173.
Os exemplos seguintes têm a finalidade de ilustrar a presente invenção sem limitar o seu âmbito.
Exemplo 1
Construção do vector de clonauem pSMA.
Digeriu-se o plasmideo pSM308 ATCC 68047 (10 pg) com as enzimas EcoRi e HindIIl (Boehringer) à temperatura de 37CC durante 1 hora. Bloqueou-se imediatamente a reacção com EDTA 20 mM (concentração final).
Ligou-se uma aliquota da mistura de digestão com o oligonucleoúdo Ll, sintentizado por meio do sintetizador automático System Plus (Beckman), em uma mistura de ligase (ATP 1 mM, Tris-HCl 20 mM pH 7,6, MgCl2 10 mM e DTT 10 mM) contendo 2 U de T4 ADN ligase. Conduziu-se a reacção à temperatura de 14°C durante uma noite. Finalmente, utilizou-se a mistura de ligase para transformar as células de B subtil is SMS330 (rec", npr', apr) tornadas competentes de acordo com o método descrito por Contente e Dubnau (Mol. Gen. Genet. 167, 251 - 258, 1979).
Seleccionaram-se os clones recombinantes sobre placas de TBAB (D1FCO) que contêm 5 μ/ml de cloranfenicol (Cm). A partir de um clone positivo (CmR) isolou-se o vector plasmidico designado pSMA. 14
Exemplo 2
Construção dos vectores de clonauem pSMB, pSMC e pSMD.
Digeriram-se os plasmídeos pSM308 ATCC 68047 e pSM268 (10 iig) com as enzimas de restrição EcoRi e HindII e ligaram-se então separadamente com o oligonucleotido LI ou o oligonucleotido L2 Utilizaram-se então as misturas de ligase para transformar células apropriadas de B subtil is SMS330. Finalmente, a partir dos clones positivos seleccionados do meio que contém Cm, isolaram-se os seguintes vectores de clonagem: - pSMB que compreende o promotor npr e o oligonucleotido L2 (sequência de segregação sinal de pel B ) - pSMC que compreende o promotor constitutivo Pc e o oligonucleotido LI (sequência de secreção sinal (I)) e - PSMD que compreende o promotor constitutivo Pc e o oligonucleotido L2 (sequência de segregação sinal de pel B).
Exemplo 3
Clonagem das regiões variáveis das cadeias pesada e leve de Mab5E8 especificas para a sub-unidade alfa de gonadotropina humana.
Utilizaram-se os seguintes iniciadores para a clonagem: 1) VH,FOR com a sequência:
BstEII 5’ TGAGGAGACG GTGACCCTGG TCCCTTGGCC CCAG 3' utilizada para o recozimento da extremidade 37 do cordão da sequência que codifica para a região variável da cadeia pesada; 2) VK|FOR com a sequência.
Be! II 5’ GTTAGATCTC CAGCTTGGTC CC 3’ utilizada para o recozimento da extremidade 3’ do cordão da sequência que codifica para a região variável da cadeia leve, 3) VH1BACK com a sequência:
PstI 5' AGGTIIAIÇT_GÇAG(G/C)ACTCI GG 3’ utilizada para o recozimento da extremidade 3' do cordão anti-sentido da sequência que codifica para a região variável da cadeia pesada; 4) VK.BACK com a sequência:
Kpnl
5’ GACATTCAGG GTACCCAGTC TCCA 3T utilizada para o recozimento da extremidade 3; do cordão anti-sentido da sequência que codifica para a região variável da cadeia leve. A) Preparação de ADNc
Cultivou-se o hibridoma que produz os anticorpos monoclonais 5E8 específicos para a sub-unidade alfa da gonadotropina humana no meio RPMT 1640 complementado com soro fetal de bovino a 10%, L-glutamma 200 mM, penicilina e estreptomicina e usaram-se cerca de 4x10 células para isolar todo o ARN. Separou-se o ARNm poli A- a partir do ARN total mediante uma técnica de extracçào que utiliza guanidina-isotiocianato (estojo de extracçào de ARN fornecido por Stratagene) seguida por cromatografia de afinidade sobre oligodT celulose (Boehringer).
Com o objecto de clonar a sequência que codifica para a região variável de 16 cadeia pesada, preparam-se 25 μΐ da solução da reacção que contém 5 ug de ARNm, 20 pmoles do iniciador VH|FOR, 250 μΜ de cada um de dATP, dTTP, dCTP e dGTP, 10 mM de ditiotreitol (DTT), 100 m\l de Tris-Hcl, 10 mM de MgCU e 140 miVl de KC1, pH 8,3. Aqueceu-se a solução reaccional à temperatura de 65CC durante 10 minutos e arrefeceu-se depois até à temperatura ambiente para permitir o recozimento do iniciador na extremidade 3' da sequência que codifica para a região variável no ARNm.
Após a adição de 2 μΐ do virus da transcriptase inversa de murganho Molonev (21 U/ul, Boehringer) à solução reaccional, mantém-se a solução resultada à temperatura de 42CC durante 1 hora para permitir assim a síntese do ADNc. Utilizou-se a mesma estratégia para clonar a sequência que codifica para a região variável da cadeia leve utilizando VKiFOR como iniciador. B) Amplificação dos ADNs que codificam para as regiões variáveis
Para a amplificação da sequência que codifica para a região variável da cadeia pesada, adicionaram-se 10 μΐ da mistura obtida em A) a 50 pmoles de cada um dos iniciadores (1 e 3), 250 μΜ de cada um de dATP, dTTP, dCTP e dGTP, 67 mM de Tris-HCl, 10 mM de MgCl?, 17 mM de sulfato de amónio, 200 μg/m] de gelatina e 4 unidades de Taq polimerase (Boehringer) e perfez-se então ate 100 μΐ com água. Cobriu-se a solução reaccional com uma camada de parafina viscosa (liquida) e submeteu-se primeiro a 3 ciclos de amplificação com recozimento à temperatura de 45SC e depois a 30 ciclos em que cada ciclo compreendeu 1 minuto de desnaturação dos ácidos nucleicos à temperatura de 95°C, 1 minuto de recozimento dos iniciadores à temperatura de 50°C e 2 minutos de alongamento à 17 temperatura de 72°C.
Após amplificação extraiu-se a solução reaccional duas vezes com fenol--clorofórmico. Precipitou-se então o ADNc com etanol e após separação mediante centrifugação, retomou-se com 100 μΐ de água e guardou-se à temperatura de 4°C.
Utilizou-se o mesmo processo para amplificar a sequência que codifica para a região variável da cadeia leve utilizando como iniciadores VK^FOR e VK^BACK.
Sequenciaram-se os ADNc que codificam para as referidas regiões variáveis pelo método de (versão do estojo de Sequenase 2,0 USB) e indicaram-se o nucleotido e as sequências de amino-ácido nas figuras 1 e 2.
Exemplo 3
Construção de vectores recombinantes
Digeriram-se os ADNs (10 μΐ) derivados da região de amplificação com os pares de enzima de restrição PstI e BstEIl, e Kpnl e Bgl II e fraccionaram-se subsequentemente os produtos da digestão sobre geles de poliacrilamida (8%) por meio de electroforese. Diluíram-se então duas bandas que contêm respectivamente um fragmento de ADN com cerca de 309 bp que compreende o gene VH5E8 delimitado na extremidade 5' por um sitio Pstl e na extremidade 3: por um sitio BstEIl e um fragmento de ADN com 312 bases que compreende o gene VK5E8 delimitado na extremidade 5' por um sitio Kpnl e na extremidade 3? por um sítio Bgl III. Diluíram-se os fragmentos de ADN a partir do gel e clonaram-se nos sítios Pstl e BstEIl e Kpnl e Bgl II do vector pSMa-pSMD obtido nos exemplos 1 e 2.
Mediante técnicas de transformação e selecçâo dos clones positivos, isolaram-se os plasmídeos recombinantes, designadamente pSM507. pSM438, pSM443 e pSM442 com as características referidas no quadro 1. 18
D
Exemplo 4
Expressão e secreção de scFv em B.subtilis
Tomaram-se competente células de B.subtilis SMS300 como segue: diluiu-se a cultura obtida durante a noite em meio ΥΎ (25 g/1 de caldo de infusão de vitela, extracto de levedura a 5 g/1) 1:10 com meio mínimo ao qual se adicionou 5 mM de MgS04, 0,5% de glicose, 0,02% de ácidos casaminicos e 50 pg/ml amino--ácidos essenciais (MMGl) e deixou-se desenvolver durante 4,5 horas à temperatura de 37°C e diluiu-se então ainda a 1:5 com meio mínimo ao qual se adicionou 5 mM de MgS04, 0,5% de glicose, 5 μ/ml de amino-ácidos essenciais e 0,01% de ácidos casaminicos (MMG2).
Transformaram-se aliquotas (1 ml) da referida diluição com 1 pg de cada vector recombinante e incubaram-se à temperatura de 37°C durante 90 minutos com agitação vigorosa.
Após selecção dos transformantes em placas de meio VY que contem cloranfemcol, inocularam-se as colónias individuais em frascos de 100 ml que contêm 10 ml de VY (DIFCO) com 5 μ/ml de cloranfenicol e deixou-se crescer durante a noite à temperatura de 37=C.
Centrifugaram-se então seis ml da cultura a 15 000 rpm durante 2 minutos à temperatura de 4CC e fim de separar o grânulo celular a partir do meio de cultura a partir do qual se isolaram as proteínas exocelulares.
Na prática, adicionaram-se 40 μΐ do meio de cultura a 10 ul de tampão de carga com a composição seguinte: 125 mM de Tris-HCl pH 6,8, 3% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 20% de glicerol, 3% de beta-mercaptoetanol e 0,025% de
azul de bromofenol, desnaturou-se em seguida por acçào do calor (100CC) e carregou-se sobre gel de poliacrilamida - SDS a 15%.
Em paralelo, extraíram-se as proteínas intracelulares após se voltado a suspender o grânulo celular em 460 μΐ de tampão 50 mM que contém 25% de sacarose em TE pH 8,00. Incubou-se a mistura na presença de 12 μΐ de uma solução de lisozima a 40 mg/ml e 96 μΐ de EDTA 0,5 VI pH 8, primeiro à temperatura de 37°C durante 30 minutos e seguidamente à temperatura de 4CC durante 10 minutos. Após adição de 500 μΐ de 1% de TritonR, 50 mV! de Tris-HCl pH 6,8 e 63 mM de EDTA completou-se a li se da célula mediante sonicação durante 2 minutos em gelo. A centrifugação a 6500 rpm durante 10 minutos à temperatura de 4CC separou o sobrenadante (fracção solúvel) a partir do grânulo (íracção insolúvel). Retomaram-se as fracções proteicas até ao volume de 1,2 ml com tampão de carga e ferveram-se durante 5 minutos para se obter proteínas desnaturadas e reduzidas. Subsequentemente, analisaram-se 10 μΐ de cada preparação de proteína sobre gel de poliacrilamina (15%) sob condições de desnaturação e de redução.
Após electroforese a 40 m.A durante cerca de 3 horas, observaram-se as bandas de proteína sobre os dois geles mediante marcação com azul de Coomassie, transferiram-se em paralelo para um filtro de nitrocelulose (Schleicher e Schull 0.45 pm) e trataram-se com soro de coelho que produz anticorpos anti-TAG e anticorpos de cabra anti-coelho IgG conjugados com peroxidase (Amersham). Após marcação com azul de Coomassie. obtiveram-se os resultados seguintes: QUADRO 1
Produção de scFv5E8 em B.subtilis 20 plasmídeo líder promotor rendimento total secreção solúvel pSM507 LS (I) npr 30 mg/l 100% pSM438 pelB npr 39 mg/l 25% pSM443 LS (I) Pc 10 mg/l 100% pSM442 pelB Pc 200 mg/l 0
Exemplo 5
Caracterização do anticorpo
Isolou-se o anticorpo scFv5E8 a partir do meio de cultura de células de B.subtilis SMS300 (pSM507) por meio de filtração sobre gel em coluna TSK125 + TSK250 com um caudal de I ml/minuto, utilizando PBS como eluente num volume de injecção de 2 ml. Isolaram-se fracções de 2 em 2 minutos para 2,0 ml/fracção e injectou-se cada fracção em BIAcoreR para verificar a imuno-reactividade com o antigene alfa hCG fixado ao sensor.
Os resultados encontram-se reunidos no quadro seguinte. QUADRO 2 scFv5E8 Mab 5E8 Kass 3.952 x 10- 1,415 n. 10" Kdiss 6,386 x IO'4 2,300 x IO'6 KD 1,616 x IO'9 1,696 x 10'n KA 6,173 x 10s 5,882 x 10'° em que: Kass e kdiss são as constantes de associação e de dissociação cinétia; KD é a constante de dissociação no equilíbrio; KA e a constante de afinidade. 21
Os resultados mostram que a constante de associação para scFv5E8 é semelhante à de Mab 5E8 enquanto que Kdiss é cerca de 300 vezes maior do que a do anticorpo monocolonal de origem. Esses valores são comparáveis com os obtidos por Borrebaeck et al.. (Biotech. J_0: 697-698, 1992) que comparam um anticorpo monoclonal e o seu derivado monofuncional (Fab) preparado mediante proteólise e indicam a manutenção das características de interacção no nível do sítio de ligação de scFv produzido em B.subtilis em comparação com o anticorpo monoclonal de origem.
Lisboa, 24 de Outubro de 2000 £5 Agente Oficia! da Propriedade Industriai
JOSÉ BE SAMPAIO A.O.P.L JRun do SísSsím, 295, r/c-Drt. 1250 L5SEOA

Claims (14)

  1. Reivindicações 1. Vector recombinante de expressão e secreção de B.subtilis que compreende: 1) o promotor do gene para protease neutra em B. subtilis BGSC 1A341; 2) a sequência de secreção (I) 5’ ATG AGA AGC AAA AAA ACG CGT ATC AGC TTG TTG TTT GCG TTA ACG TTA ATC TTT ACG ATG GCA TTC AGC GGC CGC TCT GCC ATG GCC 3' e 3) uma sequência de ADN que codifica para um anticorpo sob a forma de molécula individual com a sequência VH/VK-L-VK/VH-(TAG)n na qual: VH e VK são as regiões variáveis das cadeias pesada e leve de um anticorpo de interesse; L é o ligador peptidico Val-Ser-Ser-tGlyj-Sefh; TAG é um péptido reconhecido por anticorpos anti-péptido. n representa o número I ou 0.
  2. 2. Vector recombinante de acordo com a reivindicação 1. caracterizado pelo facto de o péptido TAG ter a sequência de amino-ácido Met-Glu-Glu-Leu-Met--Ile-Glu-Glv-Arg.
  3. 3. Vector recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de VH e VK serem as regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo monoclonal Mab5E8 especifico para a sub-unidade alfa de gonadotropina coriónica humana.
  4. 4. Vector recombinante de acordo com a reivindicação 1, contido no microorganismo B.subtilis SV1S300 (pSM507) e depositado na ATCC sob a designação 691 73.
  5. 5. Vector recombinante de acordo com a reivindicação l, caracterizado pelo facto de: a) se sintetizar um oligonucleotido que compreende a sequência de secreção (I), a sequência que codifica para o ligador peptidico e. eventualmente, a sequência que codifica para o péptido TAG e em que o referido oligonucleotido contém sitios de restrição únicos que permitem a inserção da sequência que codifica para a região variável da cadeia pesada ou leve do anticorpo a jusante da sequência de secreção (I) e a montante do ligador peptidico e a inserção da sequência que codifica para a região variável da cadeia leve ou pesada do anticorpo a jusante do ligador peptidico e a montante do péptido TAG: b) se clonar o referido oligonucleotido num vector plasmidico que compreende o promotor do gene para a protease neutra de B. subtilis BGSC 1A341; c) se clonar as sequências de ADN que codificam para a região variável das cadeias pesada e leve do anticorpo de interesse nos sítios de restrição do oligonucleotido, e finalmente d) se isolar o vector recombinante.
  6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o oligonucleotido da fase a) ter a sequência: 5’ GAA TTC TTA TGA GAA GCA AAA AAA CGC GTA TC A GCT TGT TGT TTG CGT TAA CGT TAA TCT TTA CG A TGG CAT TCA GCG GCC GCT CTG CCA TGG CCG CAC AGG TCC AAC TGC AGC CTA TGG TCA CCG TCT CCT CAG GTG GCG GTG GCT CTG GCG GTG GTG GGT CGG J GTG GCG GCG GAT CTG ACA TTC AAG GTA CCC CCT GAG ATC TCA TGG AAG A AC TTA TGA TCG AGG GTA GGT AAG TCG ACA AGC TT 3\
  7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o vector plasmídico da fase b) ser o pSY1308 ATCC 68047.
  8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de as sequências de AND da fase c) codificarem para as regiões variáveis da cadeia pesada e leve do anticorpo monoclonal MAb 5E8 específico para a sub-unidade alfa de gonadotropina coriónica humana.
  9. 9. Microrganismo hospedeiro transformado com um vector recombmante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se escolher o referido microrganismo de entre o grupo B.subtilis.
  10. 10 Microrganismo de acordo com a reivindicação 6. caracterizado pelo facto de ser o B.subtilis SMS300 (pSM507) ATCC 69173.
  11. 11. Processo para a preparação exocelular de anticorpos sob a forma de uma molécula individual a partir de B.subtilis. que compreende: a) a cultura em um meio de cultura apropriado da estirpe de B.subtilis transformada com um vector recombinante tal como definido na reivindicação 1; e b) a separação e a purificação do anticorpo assim obtido a partir do meio de cultura.
  12. 12. Processo de acordo com a reivindicação 11. caracterizado pelo facto de B.subtilis ser B.subtilis SMS300 (pSM507) ATCC 69173 e o anticorpo segregado ser o anticorpo sob a forma de uma molécula simples específica para a sub-unidade alfa de gonatropina coriónica humana. 4
  13. 13. Sequência de secreção (1) de acordo com a reivindicação 1, designadamente: 5’ ATG AG A AGC AAA AAA ACG CGT ATC AGC TTG TTG TTT GCG TTA ACG TTA ATC TTT ACG ATG GCA TTC AGC GGC CGC TCT GCC ATG GCC 3'
  14. 14. Sequência de ADN de acordo com a reivindicação 13, que codifica para o péptido de secreção: Met Arg Ser Lys Lys Thr Arg Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Glv Arg Ser Ala Met Ala. Lisboa, 24 de Outubro de 2000 0 Agente Oficia! da Propriedade industriai
    JOSÉ 3312 SAMPAIO Λ.Ο.ΤΜ. Run do Saíhre, 19S, r/c-Drt. 1250 LISBOA 1 Resumo “Vector recombinante e o seu uso para a preparação exocelular de anticorpos sob a forma de molécula única a partir de bacillus subtilis” Um vector recombinante para a expressão e secreção de anticorpos sob a forma de uma molécula simples (scFv) em B.subtilis. em que o referido vector compreende o promotor do gene para protease neutra, uma nova sequência de secreção (I) e uma sequência de ADN que codifica para um anticorpo scFv o interesse, uma estirpe de B.subtilis transformada com o referido vector recombinante e um processo para a produção exocelular de anticorpos scFv por meio de uma cultura da referida estirpe B.subtilis. O vector recombinante permite a expressão de scFv em uma forma completamente solúvel e a sua secreção com rendimentos elevados. Lisboa, 24 de Outubro de 2000 OÂgení© Ofício! do Propriedade Industrial
    JOSÉ m. SAMPAIO A.Q.P.I. Riu do Salitre, 195, r/c-Drt. 125« LISBOA
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69426527T2 (de) * 1993-06-09 2001-08-30 Unilever Nv Verfahren zur herstellung von fusionsproteinen, die scfv fragmente enthalten, in transformierten schimmelpilzen
US5665570A (en) * 1994-02-10 1997-09-09 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibody-encoding recombinant DNA and its use
US5891680A (en) * 1995-02-08 1999-04-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12
US5801064A (en) * 1995-12-04 1998-09-01 Foresman; Mark D. Assay methods and reagents for detecting autoantibodies
CA2213512A1 (en) * 1995-12-22 1997-07-03 Toray Industries, Inc. Method for producing bioactive fusion protein
EP0909277B2 (en) 1996-06-07 2008-12-24 Poniard Pharmaceuticals, Inc. Humanized antibodies that bind to the same antigen as bound by antibody nr-lu-13, and their use in pretargeting methods
JP2002502977A (ja) 1998-02-04 2002-01-29 インビトロジェン コーポレイション マイクロアレイとその使用
US6576478B1 (en) * 1998-07-14 2003-06-10 Zyomyx, Inc. Microdevices for high-throughput screening of biomolecules
WO2001083827A1 (en) 2000-05-04 2001-11-08 Yale University High density protein arrays for screening of protein activity
JP2004520011A (ja) * 2000-08-21 2004-07-08 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション Ｒａｎｋリガンド介在障害の治療において有用な抗−ｒａｎｋリガンドモノクローナル抗体
AU2003210996A1 (en) * 2002-02-11 2003-09-04 Zymogenetics, Inc. Materials and methods for preparing dimeric growth factors
US20070148166A1 (en) * 2002-05-13 2007-06-28 Wu Madeline C S Scfvs in photosynthetic microbes

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1206302B (it) * 1987-06-26 1989-04-14 Serono Cesare Ist Ricerca Ormone follicolo-stimolante urinario
IT1228925B (it) * 1987-08-07 1991-07-10 Eniricerche Spa Procedimento per la preparazione dell'ormone della crescita umano
IT1223577B (it) * 1987-12-22 1990-09-19 Eniricerche Spa Procedimento migliorato per la preparazione dell'ormone della crescita umano naturale in forma pura
IT1231156B (it) * 1989-07-19 1991-11-19 Eniricerche Spa Espressione e secrezione di interleuchina 1 beta umana matura in bacillus subtilis e mezzi e metodi per il suo ottenimento.

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