KR940010862B1 - 유용한 메탈로프로테이나제 억제제 씨퀀스 재조합 벡터계의 제조를 위한 dna 재조합 방법 - Google Patents

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Description

유용한 메탈로프로테이나제 억제제 씨퀀스 재조합 벡터계의 제조를 위한 DNA 재조합 방법

본 발명은 메탈로프로테이나제 억제제(Metalloproteinase inhibitors)와 그를 제조하기 위한 DNA 재조합 방법 및 그를 세포내에서 생성할 수 있도록 하는 뉴클레오티드 씨퀀스에 관한 것으로서, 특히 콜라게나제억제제(collagenase inhibitor)와 그를 제조하기 위한 DNA 재조합 방법 및 이러한 재조합 방법에 사용되는 뉴클레오티드 씨퀀스에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 뉴클레오티드 씨퀀스를 함유하는 일련의 백터도 포함한다.

내인성 단백질 분해효소(Endogenous Proteolytic Enzymes)는 생체내에 침입하는 미생물이나 항원-항원복합체, 그리고 생체에 더이상 필요치 않은 어떤 조직의 단백질을 분해시키는 작용을 하는데, 정상적인 기능을 가진 생체에 있어서는 단백질 분해효소가 제한된 양으로 생성되어 특정 억제제에 의하여 부분적으로 조절되게 된다.

메탈로프로테이나제는 생체내에 존재하는 효소로서 주로 결합조직을 분해하는 역할을 하는 바, 약간의 결합조직의 분해는 유기체의 정상적인 기능에 있어서 필수적인 것이긴 하지만 결합조직이 과다하게 분해되는 현상은 몇몇 질병에 걸린 상태에서 일어나게 되는 것으로서 이는 적어도 부분적으로 메탈프로테이나제가 과다하게 분비되기 때문인 것으로 여겨지고 있으며, 치근막 질환이나 각막이나 피부암, 류머티스성 관절염 및 암성 고형종양의 확산에 메탈로프로테이나제가 관련이 있는 것으로 생각되어지고 있다.

이와 같은 질병들은 일반적으로 결합조직의 특이한 형태인 콜라겐이 많이 분포되어 있는 신체부위에서 발생된다. 결합조직에 상기 질병들을 가진 환자들을 관찰해보면 결합조직의 여러가지 성분, 즉 엘라스틴, 콜라겐 및 프로테오글리칸 등이 지나치게 분해되어 있음을 알 수 있다. 따라서, 독특한 메탈로프로테이나제, 예컨대 콜라게나제와 프로테오글리코나제, 젤라티나제 및 몇가지의 엘라스타제 등의 농도가 과다하게 되면상기 질병과 관련된 결합조직의 분해를 일으키거나 악화시키는 것으로 추정된다.

정상적인 상태에서 생체는 메탈로프로테이나제와 결합하여 그들의 결합조직 기질에 대한 이 효소들의 작용을 효과적으로 방지하는 메탈로프로테이나제 억제제를 갖고 있는 바, 특히, 건강한 생체에는 상기와 같은 질병에서 나타나는 결합조직의 손상이 일어나지 않도록 과다한 메탈로프로테이나제에 결합하고 있는 반면에 충분한 양의 메탈로프로테이나제가 활성을 갖는 상태로 남아 있도록 메탈로프로테이나제와 상호작용하기에 충분한 양으로 메탈로프로테이나제 억제제가 존재하게 된다.

따라서, 상기 질병에서 일어나는 결합조직의 파괴는 메탈로프로테이나제의 농도와 메탈로프로테이나제 억제제의 농도사이의 상대적인 불균형에 그 직접적인 원인이 있는 것으로 추측된다. 이와 같은 현상은 활성 메탈로프로테이나제의 양이 과다하거나, 또는 활성 메탈로프로테이나제 억제제의 양이 부족한데 그 원인이있고, 과도한 메탈로프로테이나제가 결합조직의 분해를 일으켜 상기 질병을 일으키거나 악화시키는 원인이되는 것으로 여겨진다. 결합조직에 질환이 있는 환자들을 메탈로프로테이나제 억제제로 치료하게 되면 과다한 메탈로프로테이나제의 분해 작용이 감소되거나 중지되는 것으로 여겨진다. 본 발명에 있어서 특별히 주목되는 메탈로프로테이나제 억제제는 콜라겐 억제제인바, 이는 상기 콜라게나제 억제제가 결합조직의 질환을 치료하거나 예방하는데 약물학적으로 유용한 것으로 여겨지기 때문이다.

종래에도 메탈로프로테이나제와 메탈로프로테이나제 억제제의 존재에 대해서 논의되어 왔는데, 예를들면 Sellers 등은 Biochemical and Biophysical Research Communications 87 : 581-589(1979)에서 토끼의 골수에서 단리한 콜라겐 억제제에 대하여 기술하고 있고, Stricklin과 Welgus은 J.B.C.258 : 12252-12258(1983)과 J.B.C.258 : 12259-12264(1983)에서 사람피부의 섬유아세포(fibroblast)로부터 단리한 콜라게나제 억제제에 대하여 소개하고 있다.

또한 Murphy 등은 Biochem.J.195 : 167-170(1981)에서, Cawston 등은 Arthritis and Rheumatism, 27 : 285(1984)에서 자연적으로 발생하는 체액중의 콜라게나제 억제제에 대해서 기술하고 있고, Reynolds등은 Cellular Interactions, Dingle and Gordon, eds., (1981)에서 메탈로프로테이나제 억제제에 대해서 기술하고 있다.

상기와 같은 종래의 기술들은 특정한, 단리된 메탈로프로테이나제 억제제를 특성화하고, 결합조직의 질병에 대한 그들의 잠재적인 치료효과와 직접적인 치료효과에 대해서 기술하고 있으며, 결합조직의 파괴를 방지하는 메탈로프로테이나제 억제제의 효과에 대해서도 기술하고 있으나 메탈로프로테이나제 억제제를 세포내에서 생성시킬 수 있는 뉴클레오티드 씨퀀스를 단리시키거나 이들 억제제를 제조하기 위한 DNA 재조합 방법에 대해서는 기술하고 있지 않다.

따라서, 본 발명에서는 메탈로프로테이나제 억제제를 DNA 재조합 방법으로 합성시킬 수 있는 뉴클레오티드 씨퀀스를 발견하게 되었는바, 본 발명에 따른 메탈로프로테이나제 억제제는 사람의 피부 섬유아세포의 배양물로부터 단리된 것과 생물학적으로 동등한 것이다.

본 발명에 따른 DNA 재조합 방법에 의해서 제조된 본 발명의 메탈로프로테이나제 억제제는 메탈로프로테이나제에 의한 각종 결합조직에 대한 질병의 예방 및 치료에 보다 활발한 연구가 진행되도록 할 것이다.

또한, 본 발명에 따른 메탈로프로테이나제 억제제는 질병상태와 관련된 과다한 메탈로프로테이나제를 포함한 메탈로프로테이나제를 중화시키는데 유용한 바, 본 발명의 메탈로프로테이나제 억제제를 활성성분으로하는 것을 개발하므로서 상기 질병에 대한 치료가 가능하리라고 여겨진다. 더우기, 새로이 발견된 억제제를 사용하여 분해된 결합조직의 질환에 대한 진단실험을 개발할 수 있도록 본 발명에 따른 메탈로프로테이나제 억제제는 그의 메탈로프로테이나제 목표물과 상호작용을 할 수 있다.

한편, 여기에서 논의하고자 하는 재조합 메탈로프로테이나제 억제제는 그의 메탈로프로테이나제 목표물과 화학양론적(예컨대 l : 1의 비율)으로 상호작용하고 내열성과 산안정성이 있으며 글리코실화되며 높은 등전점(isoelectric point)을 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 목적은 메탈로프로테이나제 억제제를 제공하는데 있는데, 메탈로프로테이나제 억제제는 그 활성을 가지고 있으면서 경제성도 있는 약물학적 조성물을 제공하기에 충분한 양과 순도로 제조될 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 메탈로프로테이나제 억제제를 제조하기 위한 DNA 재조합 방법을 제공하는데 있어서 이러한 방법으로 제조된 재조합 메탈로프로테이나제 억제제는 사람 피부의 섬유아세포 배양물로부터 단리해낼 수 있는 메탈로프로테이나제 억제제와 생물학적으로 동등한 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 메탈로프로테이나제 억제제의 DNA 재조합 합성을 용이하게 하기 위하여, 메탈로프로테이나제 억제제를 세포내에서 생성시킬 수 있는 뉴클레오티드 씨퀀스와 이를 함유하고 있는 벡터를 클로닝시키는 것을 제공하는 것으로, 상기 벡터는 약물학적으로 유용한 양만큼의 메탈로프로테이나제 억제제를 제조하기 위해 재조합계에서 이용될 수 있다.

상기 이외의 다른 목적과 장점은 다음에서 부분적으로 설명될 것이나, 설명되지 않은 부분들도 실시예를 통하여 밝혀질 것이고, 특히 첨부된 특허청구의 범위에 의해서 명백해질 것이다.

상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위해서 메탈로프로테이나제 억제제는 메탈로프로테이나제와 화학양론적 반응을 하는 것으로 설명되며 또한 내열성이 매우 강하고, 산안정성을 보이며 글리코실화되며 등전점이 높은 한편, 특히 사람 피부의 섬유아세포 배양물로부터 단리된 억제제와 생물학적으로 동등한 것이다.

또한, 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 이미 상술한 바와 같이 메탈로프로테이나제 억제제를 코드하는 뉴클레오티드 씨퀀스가 제공되는데 상기 씨퀀스는 메탈로프로테이나제 억제제의 세포내 생산을 가능하게 하는 뉴클레오티드 씨퀀스를 포함한다.

한편, 상기 뉴클레오티드 씨퀀스는 합성된 씨퀀스이거나 또는 제한분획물("restriction fragments : 천연" DNA 씨퀀스)일 수 있는데, 바람직하기로는 사람의 섬유아세포 cDNA 라이브러러(library)로부터 단리시켜 인체 피부의 섬유아세포 배양물로부터 단리시킨 그 억제제와 생물학적으로 동등한 콜라게나제 억제제를 세포내에서 생성시키는 것이다.

본 발명에 있어서 가장 바람직한 DNA 씨퀀스의 정보스트랜드(Coding-Strand)는 다음과 같은 뉴클레오티드 씨퀀스를 갖는 것으로 알려져 있다.

상기와 같은 약자로 표시된 뉴클레오티드에 대해서는 다음의 상세한 설명 및 실시예에서 설명하겠다.

두번째로 바람직한 DNA 씨퀀스는 시발씨퀀스의 5'에 뉴클레오티드 씨퀀스가 추가된 것으로서, 상기의 바람직한 첫번째 씨퀀의 1 내지 351번 뉴클레오티드가 다음의 두번째 DNA 씨퀀의 83 내지 432번 뉴클레오티드로서 포함되어 있으며, 다음과 같은 뉴클레오티드 씨퀀스를 갖는다.

세번째로 바람직한 DNA 씨퀀스는 상기 첫번째 씨퀀스의 3' 씨퀀스와 두번께 씨퀀스의 5' 영역(region)을 병합시킨 것으로서, 다음과 같은 뉴클레오티드 씨퀀스를 갖는다.

네번째로 바람직한 DNA 씨퀀스를 이용하는 방법을 본 발명자들은 동물세포에서 인스탄트(instant) 메탈로프로테이나제 억제제를 발현하는 가장 좋은 방법으로 이용하는데, 이 씨퀀스의 정보 스트랜드는 다음과 같다.

천연 DNA 씨퀀스를 본 발명에 이용하기 위하여 확인하여 단리시키는 것을 용이하게 하기 위해서 본 발명자들은 사람 피부의 섬유아세포 cDNA 라이브러리를 개발하였는바, 상기 라이브러리는 세포가 본 발명에 따른 메탈로프로테이나제 억제제를 합성할 수 있도록 하는 유정정보를 포함한다. 앞에서 설명한 DNA 재조합 방법에 사용될 수 있는 다른 천연의 DNA 씨퀀스는 인간의 유전 라이브러리(genomic library)로부터 단리될 수 있다.

또한, 본 발명에 유용한 뉴클레오티드 씨퀀스는 합성될 수 있는데 이러한 합성 DNA 씨퀀스는 이 분야의 통상의 지식을 가진 자가 알고 있는 씨퀀싱 기술과 폴리뉴클레오티드 합성에 의해서 제조될 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명의 목적에 따라 이를 달성하기 위해서, DNA 재조합 방법은 결국 앞에서 언급된 뉴클레오티드 씨퀀스를 사용하여 미생물학적으로 인스탄트 메탈로프로테이나제 억제제를 제조하는 것으로 알려져 왔는데, 이와 같은 DNA 재조합 방법은 다음과 같다 :

(1) 숙주미생물이 메탈로프로테이나제 억제제 활성, 바람직하기로는 콜라게나제 억제제 활성을 갖는 단백질을 생산할 수 있도록 뉴클레오티드 씨퀀스를 제조하고, (2) 뉴클레오티드 씨퀀스에 대한 작용효소(operational element)를 포함하면서 숙주미생물에 전이되어 복제될 수 있는 벡터에다 상기 뉴클레오티드 씨퀀스를 클로닝(Cloning)한 다음, (3) 메탈로프로테이나제 억제제 단백질을 발현(expression)할 수 있는 숙주미생물에 상기 뉴클레오티드 씨퀀스와 작용요소가 포함된 벡터를 전이시켜서 (4) 벡터의 증식과 억제제의 발현에 적당한 조건하에서 상기 숙주미생물을 배양하여 (5) 억제제를 얻거나, 이 억제제를 얻은 다음 활성의 3차 구조를 갖도록 하여 메탈로프로테이나제 억제제 활성을 갖도록 한다.

본 발명의 목적에 따라 이를 달성하기 위해 적어도 앞에서 언급된 뉴클레오티드 씨퀀스중의 하나로 이루어진 일련의 클로닝 벡터가 제공되는데 그 중에 특히 플라스미드(plasmid) pUC9-F5/237 p10이 알려져 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같은 바, 본 발명이 반드시 여기에 국한되는 것은 아니다.

또한, 이하의 실시예와 함께 본 발명에 다른 바람직한 구현예를 자세히 설명하게 될 참고문헌은 본 발명의 원리를 설명하는데 많은 도움이 될 것이다.

이미 앞에서 강조한 바와 같이 본 발명은 여러가지 숙주미생물내에서 메탈로프로테이나제 억제제를 세포내에서 생성시킬 수 있는 뉴클레오티드 씨퀀스에 관한 것으로서, 여기서 "뉴클레오티드 씨퀀스"라 함은 합성 생성된 뉴클레오티드 씨퀀스나 천연 DNA 씨퀀스의 제한분획물을 말한다.

또한, "메탈로프로테이나제 억제제"라 함은 아미노산 씨퀀스를 세포내에서 생성시키는 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid)에 존재하는 코돈(codon)에 의해서 정해지는 단백질의 1차 구조를 의미하는데, 해독후 변형(post-translational modif-ication)을 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있으며 해독후 변형의 예로는 글리코실화(glycosylation)가 있는 것으로 여겨진다. 또한, "메탈로프로테이나제 억제제"라는 용어는 미생물이 배설하는 단백질의 형태 또는 배설되지 않고 미생물내에 존재하는 메티오닐(methionyl)-메탈로프로테이나제 억제제를 의미할 수도 있다.

바람직한 구현예에 있어서, 뉴클레오티드 씨퀀스는 콜레게나제 억제제를 세포내에서 생성시킬 수 있는 것으로서, 특히 사람 피부의 섬유아세포로부터 미리 단리시킨 콜라게나제 억제제와 생물학적으로 동등한 억제제의 세포내 생성을 가능하게 할 수 있다. 여기서 "생물학적으로 동등하다"는 의미는 본 발명에 따른 뉴클레오티드 씨퀀스를 사용하여 제조된 억제제가 천연의 인간 콜라게나제 억제제, 특히 사람 피부의 섬유아세포 배양물에서 단리시킨 천연의 사람 콜라게나제 억제제와 반드시 같은 정도는 아니라 할지라도 같은 유형의 콜라게나제에 의한 조직손상을 막을 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 첫번째 바람직한 DNA 씨퀀스는 다음과 같은 뉴클레오티드 씨퀀스를 갖는다.

여기서 약자는 다음과 같은 뉴클레오티드를 의미한다.

뉴클레오티드 약자

데옥시아데닐산 A

데옥시구아닐산 G

데옥시시티딜산 C

티미딜산 T

본 발명에 따른 두번째 바람직한 DNA 씨퀀스의 뉴클레오티드 씨퀀스는 다음과 같다.

상기한 두번째 씨퀀스에 있어시, 개방된 해석구조(reading frame)는 1부터 432번 뉴클레오티드로 나타나는데 상기 구조에서 첫번째 메티오닌은 49번부터 51번 뉴클레오티드에 의해서 코드되고 여기서부터 해독(translation)이 시작된다.

여기서 뉴클레오티드 49번부터 114번으로 나타나는 아미노산 씨퀀스는 완성된 메탈로프로테이나제에서는 찾아불 수 없다는 것에 유의해야 하며, 상기 씨퀀스가 사람 단백질의 리더(leader) 단백질인 것으로 여겨진다.

세번째로 바람직한 DNA 씨퀀스는 다음과 같은 뉴클레오티드 씨퀀스를 가진다.

상기 세번째 씨퀀스는 상기 두번째 바람직한 씨퀀스의 5' 비해독영역(non-translated region)과 상기 첫번째 바람직한 씨퀀스의 3' 영역을 포함하고 있어서 미생물이나 포유동물 발현계(expression system)에 있는 성숙한 인간의 콜라게나제 억제제와 유사한 메탈로프로테이나제의 세포내 생성을 가능하게 하는 것으로생각된다.

동물세포내에서 인스탄트 메탈로프로테이나제 억제제를 발현하기 위해 본 발명자들은 네번째로 바람직한 DNA 씨퀀스를 이용하는 방법이 가장 바람직하다고 생각하며 이러한 씨퀀스의 정보 스트랜드는 다음과 같다.

본 발명의 실시에 있어서, 단백질 씨퀀스중 약간의 아미노산을 변경시키는 것이 단백질의 기본 성질에는 영향을 미치지 않을 수도 있다는데 유의해야 하며 메탈로프로테이나제 억제제 활성을 갖는 다른 뉴클레오티드 씨퀀스, 즉 동일한 아미노산 씨퀀스를 세포내에서 생성시킬 수 있는 것과 유사한 아미노산 씨퀀스를 세포내에서 생성시킬 수 있는 것들이 모두 발명의 범위내에 포함된다.

이를 유사한 아미노산 씨퀀스의 일부는 천연의 사람 메탈로프로테이나제 억제제와 본질적으로 유사한데 비하여 메탈로프로테이나제 억제제로 작용할 수 있는 다른 아미노산 씨퀀스는 천연의 억제제와 본질적인 유사성을 나타내지 않는다. 여기서 "본질적인 유사성"이란 천연 메탈로프로테이나제 억제제와 50% 이상, 바람직하기로는 60% 이상, 더욱 바람직하기로는 80% 이상 유사한 정도를 의미한다. 이와 같은 유사성의 퍼센트는 아미노산 100개의 길이에 있는 4개의 캡(gap)이 일직선내로 유도될 수 있을 때 비교되는 씨퀀스에서 동일한 아미노산 잔기와 일직선상에 있는 두 씨퀀스중에서 더 작은 것에서 발견되는 아미노산 잔기의 백분율로 계산되었으며, 여기에 대해서는 Dayhoff, M.O., Atlas of Protein Sequence and Structure,Vol.5, p124(1972), National Biochemical Reserch Foundation에 기술되어 있다.

이와 같이, 본 발명의 뉴클레오티드 씨퀀스는 합성적으로 제조될 수도 있는데, 폴리뉴클레오티드 씨퀀스의 합성은 통상적인 기술중의 하나로 알려져 있다. 본 발명에 대해 참고문헌인 Matteucci, M.D. 및 Caruthers, M.H., J.Am.Chem.Soc.103 : 3185(1981) 등에 소개되어 있다.

또한 상기 뉴클레오티드 씨퀀스는 천연 씨퀀스의 분획물, 즉 자연에 존재하는 폴리뉴클레오티드의 분획물이 될수도 있는데 본 발명자들에 의해서 처음으로 단리되고 정제되었다. 하나의 구현예로서 상기 뉴클레오티드 씨퀀스는 cDNA 라이브러리에서 단리된 제한분획물이 되며 cDNA 라이브러리는 사람의 피부섬유 아세포로부터 제조될 수 있다.

다른 구현예에 있어서, 뉴클레오티드 씨퀀스는 사람의 유전 라이브러리에서 단리되는데 상기 구현예에서 유익한 라이브러리의 예를들어보면 Lawn 등의 Cell 15 : 1157-1174(1978)에 기술되어 있다.

이미 강조한 바와 같이, 본 발명은 상술한 뉴클레오티드 씨퀀스중에서 적어도 하나를 포함하는 일련의 벡터에 관한 것으로서, 얻고자 하는 메탈로프로테이나제 억제제를 대량 생산할 수 있는 숙주미생물의 능력을 증가시키기 위해서 단일 벡터내에 뉴클레오티드 씨퀸스의 복사도 부가적으로 포함시킬 수 있는 것으로 생각된다.

본 발명의 범위에 속하는 클로닝 벡터는 상기 뉴클레오티드 씨퀀스의 전후에 보충되는 뉴클레오티드 씨퀀스를 포함할 수 있는데 이들 보충되는 씨퀀스는 상기 뉴클레오티드 씨퀀스의 전사(transcription)를 방해하지 않아야 하며, 전사나 해독 또는 최종의 메탈로프로테이나제 억제제의 1차 아미노산 구조가 활성을 갖는 3차 구조로 될 수 있는 능력을 증가시킬 수 있을 것이다.

본 발명에 따른 바람직한 벡터인 pUC9-F5/237 p10은 앞에서 설명한 바람직한 뉴클레오티드 씨퀀스를 포함하며, 상기 벡터는 American Type Culture Collecti-on in Rockville, Maryland에 기탁번호 제 53003호로 기탁된 C600/pUC9-F5/237 p10세포에 존재한다.

메탈로프로테이나제 억제제를 코드화하는 바람직한 뉴클레오티드 씨퀀스는 영역 A로 확인되고 플라스미드 pUC9-F5/237 p10은 영역 A의 바람직한 DNA 씨퀀스의 전후에 보충 뉴클레오티드 씨퀀스를 포함하게 되고 이러한 전후에 존재하는 보충 씨퀀스를 각각 영역 B 및 영역 C로서 확인된다.

또다른 바람직한 구현예에 있어서, 보충 씨퀀스를 제거하는데 적당한 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease)로 벡터에서 제거될 수도 있다. 또한 영역 C로 확인된 상기 뉴클레오티드 씨퀀스의 뒷부분 보충 씨퀀스는 적당한 제한 엔도뉴클레아제, 바람직하기로는 HgiAI로 처리하고 합성 올리고뉴클레오티드를 이용한 영역 A의 3' 말단을 다시 만들어 T-4 DNA 리가제(ligase)로 벡터 결찰시켜서 제거시킬 수 있다. 지역 B로 확인된 상기 뉴클레오티드 씨퀀스의 앞부분 보충 씨퀀스도 다음의 실시예 2에서 설명한 방법에 의해 독특하게 제거시킬 수 있다.

바람직한 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 뉴클레오티드 씨퀀스를 발현할 수 있고 또한 이를 포함하고있는 클로닝 벡터는 다양한 작용요소를 가지고 있다. 이들 "작용요소"에는 적어도 하나의 촉진자(promoter)와 적어도 하나의 Shine-Dalgarno 씨퀀스와 그리고 적어도 하나의 종결인자 코돈(terminator codon)이 포함되어 있다. 더욱 바람직하기로는 이들 "작용요소"에는 적어도 하나의 작용인자(operator)와 적어도 하나의 리더(leader) 씨퀀스, 그리고 세포내로부터 방출되는 단백질을 위하여 적어도 하나의 조절인자(regulator)를 포함하여 벡터 DNA의 적당한 전사와 그다음의 해독을 위하여 바람직하거나 필수적인 다른 DNA 씨퀀스를 역시 포함하는 것이 좋다.

본 발명의 다른 구현예에서는 앞에서 설명한 하나이상의 뉴클레오티드 씨퀀스를 포함하는 공지 또는 아직 발견되지 않은 벡터를 사용하는데, 이들 벡터들은 다음과 같은 특성을 전부 또는 일부 갖는 것이 좋다.

(1) 최소한의 숙주-유기체 씨퀀스를 갖는다.

(2) 원하는 숙주내에서 안정하다.

(3) 원하는 숙주내에서 높은 복사수(Copy number)를 나타낼 수 있다.

(4) 조절 촉진자(regulatable promoter)를 갖는다.

(5) 뉴클레오티드 씨퀀스가 삽입될 곳에서부터 떨어진 플라스미드 부분에 존재하는 선택가능한 특성을 코팅하는 적어도 하나이상의 DNA 씨퀀스를 갖는다.

(6) 벡터내로 융화되어야 한다.

다음의 클로닝 벡터 목록은 앞에서 설명한 특성들을 갖춘 벡터들을 나타낸 것으로서 본 발명에서 사용하기에 좋은바, 이것들은 앞에서 설명한 방법과 문헌을 참고로 통상의 기술을 가진자에 의해 비교적 수월하게 실시될 수 있다.

[표 1]

앞에서 설명한 바와 같은 특성을 가지는 본 발명에 사용하기에 적합한 추가의 클로닝 벡터가 현재 존재하고 있거나 앞으로 발견될 것으로 보인다. 이들 벡터들은 필수적인 작용요소와 함께 뉴클레오티드 씨퀀스가 도입될 수 있는, 알려진 일련의 클로닝 벡터계열의 범위내에 속하며, 변성된 벡터도 본 발명의 범위내에 포함되는 바, 앞으로 자세히 설명하게 될 DNA 재조합 방법에서 사용될 수 있을 것이다.

상기 표 1에 나타낸 것 이외에, 실시예 2의 E.coli 벡터도 클로닝 벡터로서 바람직한 한 구현예가 된다.

또한, 광범위한 그램음성균 영역에서 자율적으로 복제되는 몇가지 벡터 플라스미스는 Pseudomonas의 숙주내에 클로닝 매개물로서 바람직하게 사용되는데, 여기에 대해서는 Tait, R.C., Close, T.J., Lundquist, R.C., Hagiya, M., Rodriguez, R.L. 및 Kado, C.I.가 Biotechnology, May, 1983, pp. 269-275에, Panopulos, N.J.가 Genetic Engineering in the Plant Sciences, Praeger Publishers, New York, pp163-185(1981)에 Sakaguchi, K.가 Current topic in Microbiology and Immunology 96 : 31-45(1982)등에 기술하고 있고, 각각을 참고문헌으로 사용하였다.

특히, 바람직한 제조방법에서는 Bagdasarian M., Bagdasarian, M.M., Coleman, S. 및 Timmis, K.N.이 Plasmids of Medical Environmental and Commercial Importance에, Timmis, K. N. 과 Puhler, A.가 eds., Elsevier/North Holland Biomedical Press(1979)에 설명한 바와 같이 플라스미드 RSF1010과 그들의 유도체를 사용할 수 있다. RSF1010의 장점은 E.coli와 Pseudomonas종 내로 빠르게 변형(transformation)하여 안정하게 유지되는 비교적 작고 복사수사 높은 플라스미드라는 점이다. 이러한 계에 있어서 Escherichia에 대하여 묘사된 것과 같이 Tac 발현계를 사용하는 것이 좋은데 왜냐하면 E.colitrp 촉진자는 Sakaguchi, K.의 Current Topics in Microbiology and Immunology 96 : 31-45(1982) 및 Gray, G.L., McKeown, K. A., Jones, A.J.S., Seeburg, P. H. 및 Heyneker, H. L.의 Biotechnology Feb. 1984., pp.161-165에서 설명한 바와 같이 Pseudomonas RNA 폴리머라제에 의해서 쉽게 인식되는 것으로 나타나기 때문이다. 전사 활성도는 촉진자를, 예컨대 E.coli 또는 P.aeruginosa trp 촉진자와 교환하는 것을 필요로 함으로써 좀더 극대화시킬 수 있다.

바람직한 구현예에 있어서, P.aeruginosa는 그의 제조를 일으키고 세포로부터 방출될 리더씨퀀스와 연결된 생성물이나 세포내 생성물로서 메탈로프로테이나제 억제제를 합성시키는 벡터로 변형되며, 상기 리더씨퀀스는 베타락타마제, OpmA 단백질, 자연적으로 발생하는 사람 시그널 펩테드, 그리고 Pseudomonas의 카르복시펩티다제 G2가 이루는 그중에서 선택되는 것이 바람직하다. 해독은 메탈로프로테이나제 억제제를 세포내에서 발현되도록 하기 위해 숙주의 잘 표현된 어떠한 단백질의 시발위치는 물론 실시예 2에 기술된 바와 같이 어떠한 E.coli 단백질의 해독시발 위치에도 연결될 수 있다.

숙주 Pseudomonas종의 제한 음성종이 이용될 수 없는 경우에, E.coli로부터 단리된 플라스미드 구조물의 변형효율이 낮아서 원하는 숙주의 변형이전에 다른 종의 r^-, m⁺균주를 따라 Pseudomonas 클로닝 벡터를 통과시키는 것이 필요한 바, Bagdasarian, M.등, Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, pp. 411-422, Timmis and Puhler eds., Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979)에서 설명하고 있다.

또한, Bacillus 숙주에 있어서 바람직한 발현계는 클로닝 매개물로서 플라스미드 pUBl10을 사용한다. 다른 숙주 벡터계에 있어서 Bacillus에서 본 발명의 메탈로프로테이나제 억제제를 세포내 또는 분비 단백질로서 발현하는 것이 가능한데 본 발명에 구현예에서는 상기 두가지를 모두 포함한다. Bacillus와 E.coli 모두에서 복제하는 셔틀 벡터는 여러가지 유전자를 시험하고 구성하는데 유용한데, 여기에 대해서는 Dubnau,K., Gryczan, T., Contente, S. 및 Shivakumar, A.G.의 Genetic Engineering, Vol. 2와 Setlow 및 Hollander eds.의 Plenum Press, New York, pp115-131(1980)에 기술되어 있고 특별히 참고도서로 인용하였다. B.subtilis로부터의 메탈로프로테이나제 억제제의 발현과 분비를 위하여, 알파-아밀라제의 시그널(signal) 씨퀀스가 메탈로프로테이나제 억제제에 대한 코딩영역에 연결시키는 것이 바람직하다. 메탈로프로테이나제 억제제의 세포내 합성을 위하여 뉴클레오티드 씨퀀스는 알파-아밀라제 리더 씨퀀스의 리보솜 결합위치에 해독할 수 있도록 연결될 것이다.

이들 구조물의 전사는 알파-아밀라제 촉진자나 그의 유도체에 의해서 지시되는 것이 바람직한바, 이러한 유도체는 천연 알파-아밀라제 촉진자의 RNA 폴리머라제 인식 씨퀀스를 함유하나 lac 작용인자 영역도 혼합된다. 페니실리나제 유전자 촉진자와 lac 작용인자로부터 형성된 유사한 혼성촉진자(hybrid promoter)는 조절될 수 있는 유형으로 Bacillus 숙주내에서 기능을 나타내는데 여기에 대해서는 YanSura, D.G. 및 Henner의 Genetics and Biotechnology of Bacilli, Ganesan, A.T. 및 Hoch, J.A., eds.의 Academic Press, pp. 249-263(1984)에 설명하였고, 이를 참고문헌으로 인용하였다. laclq의 lacI 유전자는 역시 조절을 위해 포함될 수 있다.

Clostridium에서의 발현을 위한 바람직한 구조는 참고문헌인 Squires, C.H.등이 J.Bacteriol. 159 : 460-471(1984)에서 기술한 플라스미드 pJU12에 있는데, Heefner D. L. 등이 J. Bacteriol.159 : 460-464(1984)에서 설명하고 있는 방법에 의해 C.perfringens으로 변형된다. 전사는 테트라싸이클린 내성 유전자의 촉진자에 의해서 지시되고 해독은 다른 숙주에 사용하는 적당한 벡터에 대하여 앞에서 설명한 과정과 유사한 방법으로 동일한 tet^r유전자의 Shine-Dalgarno 씨퀀스에 연결된다.

효모내로 들어가는 외래 DNA의 유지는 몇가지 방법으로 이루어질 수 있는데(Botstein, D. 및 Davis, R.W., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harber Laboratory, Strathern, Jones and Broach, eds., pp.607-636(1982), Saccharomyces를 숙주유기체로 사용하는 바람직한 하나의 발현계는 2미크론(micron) 플라스미드에 안티콜라게나제 유전자를 포함한다. 2미크톤 환의 장점은 Cir^o균주내로 도입될 때 비교적 높은 복제수와 안정성을 갖는다는 것이다. 이들 벡터들은 E.coli에서 복제되고 선택되도록 pBR322로부터 적어도 하나이상의 항생물질 내성 마커(antibiotic resistance marker)와 복제근원(origin)을 혼합한 것이 좋다. 또한, 이 플라스미드는 효모의 LEU2 돌연변이체에서 동일한 목적을 제공하기 위해 효모 LEU2 유전자와 2미크론 씨퀀스를 갖는 것이 좋다.

효모 GALI 유전자의 조절촉진자는 뉴클레오티드 씨퀀스 유전자를 전사시키는데 바람직하게 적용될 것이고 효모의 상기 뉴클레오티드 씨퀀스의 해독은 효모 알파-효소의 분비를 일으키는 리더씨퀀스에 연결되는데 이것은 효모내에서 진행되어 결과적으로 메탈로프로테이나제 억제제를 분비시키는 융합단백질(fusionprotein)을 형성시키게 한다. 한편, 메티오닐 메탈로프로테이나제 억제제는 세포내의 함유물에 대하여 해독될 것이다.

효모내의 메탈로프로테이나제 억제제를 코딩하는 mRNA의 해독은 실시예 2에서 알 수 있는 바와 같이 pUC8-Fic에 존재하는 씨퀀스보다 효모의 바람직한 코돈용도가 더 효과적일 것으로 기대되는데 전핵 바이어스에 테일로드(teilroad)되어 있다. 이러한 이유 때문에 TthlllI 부위에서 시작하는 뉴클레오티드 씨퀀스의 5' 말단 부분이 재합성되는 것이 바람직하다. 이 코돈의 새로운 씨퀀스 요소가 효모에서 가장 자주 사용된다.

이러한 새로운 씨퀀스는 다음과 같은 뉴클레오티드 씨퀀스를 갖는 것이 바람직하다.

HgiAI

5' GAT CCG TGC ACT TGT GTT CCA CCA CAC

GC ACG TGA ACA CAA GGT GGT GTG

CCA CAA ACT GCT TTC TGT AAC TCT GAC C

GGT GTT TGA CGA AAG ACA TTG AGA CTG GA 3'

각각의 클로닝 벡터와 상기 목록에 포함된 계에 대한 시험에서 나타나는 바와 같이 여러가지 작용요소는 본 발명의 바람직한 벡터에 각각 존재할 수도 있다.

실제로 벡터들이 쉽게 단리되고 조립되며, 내부 교환될 수 있도록 함으로써 각 벡터들을 제조할 수도 있다. 이것은 메탈로프로테이나제 억제제의 코딩영역과 이러한 요소들을 조합함으로써 다수의 관능성 유전자의 결합을 용이하게 할 수 있다. 또한 이들 다수의 요소들은 하나이상의 숙주에 집어 넣을 수 있다.

적어도 하나의 선택할 수 있는 마커와 뉴클레오티드 씨퀀스의 전사가 일어나게 할 수 있는 적어도 하나의 촉진자 씨퀀스와 함께 예상되는 숙주미생물에 의해서 인식되는 복제에 대한 적어도 하나 이상의 근원이 이들 벡터내에 포함되어 있는 것으로 예측된다.

또한, 보다 바람직한 구현예에 있어서는 벡더가 조절인자("작용인자 : operators")로서 작용할 수 있는 DNA 씨퀀스와 조절인자 단백질에 대한 정보를 가질 수 있는 다른 DNA 씨퀀스를 포함하게 될 것으로 추측된다.

이러한 계열의 바람직한 벡터에 있어서는 벡터가 리보솜 결합부위와 전사 종결인자 그리고 리더씨퀀스를 추가적으로 포함하게 된다.

한가지 구현예로서 조절인자들은 어떤 주위조건에서는 뉴클레오티드 씨퀀스에 의하여 코드되는 단백질을 전사하고 이어서 발현하도록 하기도 한다. 특히 예컨대 이소프로필티오-β-d-갈락토시드가 없는 조건하에서는 뉴클레오티드 씨퀀스의 발현이 일어나지 않을 정도로 조절인자가 벡터에 삽입되는 것이 바람직한데, 이러한 상황에서는 뉴클레오티드 씨퀀스를 포함하는 변형된 미생물이 메탈로프로테이나제 억제제에 대한 표현이 시작되기도 전에 원하는 밀도만큼 성장할 수 있으며, 이와 같은 구현예에 있어서, 원하는 프로테아제 억제제의 표현이 원하는 밀도가 된후에 DNA 씨퀀스를 표현시킬 수 있는 미생물 환경에 물질을 첨가시킴으로써 유도되어지게 된다.

또한, 벡터나 뉴클레오티드 씨퀀스의 5' 말단에 적당한 분비선 리더씨퀀스가 존재하는 것이 좋고 리더씨퀸스가 전사나 해독 종결신호를 방해하지 않고 프로테아제 억제제를 표현할 수 있도록 하는 뉴클레오티드 씨퀀스의 시발영역에 바로 연이어 존재하도록 하는 위치에 있게 된다.

상기와 같은 리더씨퀀스는 다음과 같은 이유에 의해서 필요하다.

(1) 리더씨퀀스가 존재하면 초기생성물이 성숙한 재조합 메탈로프로테이나제 억제제로 숙주내에서 성장하는 것을 용이하게 할 수 있다.

(2) 리더씨퀀스가 존재하면 메탈로프로테이나제 억제제를 세포질 밖으로 나오게 함으로써 재조합 메탈로프로테이나제 억제제의 정제를 용이하게 할 수 있다.

(3) 리더씨퀀스가 존재하면 메탈로프로테이나제 억제제를 세포질 밖으로 나오게 함으로써 메탈로프로테이나제 억제제가 그의 활성구조로 폴드(fold)될 수 있는 능력에 영향을 줄 수 있다.

특히, 리더씨퀀스는 리더씨퀀스를 제거하고 메탈로프로테이나제 억제제 활성을 잠재적으로 갖는 아미노산 씨퀀스의 폴리펩티드를 남겨두기 위해 리더펩티다제로 초기 해독생성물을 절단시킬 수 있으며, 몇가지 종류의 숙주미생물에서는 적당한 리더씨퀀스가 존재함으로써 E,coli의 경우에서와 같이 완성된 단백질을 외질공간(periplasmic space)으로 이동하게 한다.

Bacillus 및 Pseudomonas 균주와 어떤 효모의 경우에는 적당한 리더씨퀀스가 세포막을 통하여 세포의 배지로 단백질을 이동시키기도 하는데, 이러한 상황에서는 단백질은 세포의 단백질로부터 정제될 수 있다.

한편, 본 발명에 따라 제조된 메달로프로테이나제 억제제의 몇가지 경우에 있어서는, 리더씨퀀스가 존재하면 완성된 단백질이 그의 활성구조로 폴드될 수 있는 환경내에 존재하게 하는 것이 필요하며 이러한 구조는 적당한 메탈로프로테이나제 활성을 갖게 된다.

그외의 작용요소에는 다른 단백질의 미생물 표현을 위하여 필요한 다른 DNA 씨퀀스와 리보솜 결합부위가 포함되어 있으나 여기에 제한되어 있지는 않다. 상기 작용요소는 통상의 기술을 가진자가 종래의 문헌이나 본 발명에 포함된 기술에 따라 쉽게 선택할 수 있다. 이러한 작용요소에 대한 일반적인 실험은 B.Lewin의 Genes, Wiley ＆ Sons.New York(1983)에 기술되어 있는바, 본 발명이 대한 참고문헌으로 사용하였다.

적당한 작용요소에 대한 여러가지 예는 앞에서 논의된 벡터에 그 근거를 둘수도 있고, 앞에서 언급된 벡터의 기본적인 특성에 대하여 논의한 간행물을 통해서 밝혀질 수도 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 추가적인 DNA 씨퀀스는 메탈로프로테이나제 억제제에 대한 정보를 가진 뉴클레오티드 씨퀀스의 바로 앞부분에 위치하며 상기 추가적인 DNA 씨퀀스는 해독 연결인자(coupler)로 작용할 수도 있는데 인접해 있는 메탈로프로테이나제 억제제 RNA의 리보솜 결합부위의 바로옆에 리보솜이 위치하도록 하는 RNA에 대한 정보가 들어있는 DNA 씨퀀스이다.

앞에서 논의된 클로닝 벡터의 필수적인 구성성분을 단리하거나 합성함에 있어서, 벡터는 이 분야에서 통상의 기술을 가진자가 알고 있는 일반적인 방법에 의해서 제조될 수 있는바, 이러한 벡터의 제조는 이들의 업무이며 의무라고 생각하며, 꾸준한 실험을 하여야 한다. 예를들면 Schoner 등의 Proceedings of the National Academy of Science U.S.A., 81 : 5403-5407(1984)에 설명된 바와 같이 유사한 DNA 씨퀀스가 적당한 클로닝 벡터내로 결찰되었다,

본 발명에 따른 클로닝 벡터의 구조에 있어서, 뉴클레오티드 씨퀀스의 배수복사(multiple copies)와 이에 수반된 작용요소를 각 벡터에 삽입시킬 수 있다는데 유의해야 한다. 이와 같은 구현예에 있어서, 숙주미생물은 요구되는 벡터량 매우 많은 양의 메탈로프로테이나제 억제제를 생산하게 된다. 벡터에 삽입될 수 있는DNA 씨퀀스의 배수복사수는 적당한 숙주미생물에 전이되어 복제되고 전사되어서 생긴 벡터의 능력에 의해서만 제한되며, 이는 그 크기에 의존한다. 추가적으로 클로닝 벡터는 약물내성 마커 또는 선택할 수 있는 특성을 숙주미생물에 포현하는 다른 마커와 같은 선택할 수 있는 마커를 포함하는 것이 좋다. 실제적으로 본 발명의 구현예에 있어서, 엠피실린의 내성에 대한 유전자가 벡터 pUC9-F5/237 p10에 포함되어 있다.

이와 같은 약물내성이나 그외의 선택할 수 있는 마커는 형질변환체(transformants)의 선택을 부분적으로 용이하게 한다. 또한, 클로닝 벡터에 상기의 선택할 수 있는 마커가 존재하면 배지내에서 오염미생물이 증가하는 것을 막을 수 있다. 이러한 구현예에 있어서, 변형된 숙주미생물의 순수한 배양물은 생존을 위한 표현형(phenotype)을 필요로 하는 조건하에서 미생물을 배양함으로써 얻을 수 있다.

비람직한 구현예에 있어서, 3' 비해독 씨퀀스로 조립할 수 있는 코딩영역의 3' 말단을 재구성하는 것이 바람직하다. 이와 같은 비해독 씨퀀스내에 속하는 것은 mRNA를 안정하게 하는 것이나 그들의 전사를 보강하는 것, 그리고 벡터를 안정하게 할 수 있는 강한 전사 종결시그널을 제공하는 것이며, 여기에 대해서는 Gentz, R., Langner, A., Chang, A.C.Y., Cohen, S.H. 및 Bujard, H.의 Proc.Natl.Acad.Sci. USA78 : 4936-4940(1981)에 기재되어 있다.

또한, 본 발명은 메탈로프로테이나제 억제제를 제조하기 위한 DNA 재조합 방법에 관한 것으로서, 일반적으로 다음과 같은 방법으로 이루어진다.

(1) 숙주미생물이 메탈로프로테이나제 억제제의 활성을 가진 단백질을 생성하도록 지시할 수 있는 뉴클레오티드 씨퀀스를 제조하고, (2) 뉴클레오티드 씨퀀스에 대한 작용요소를 포함하면서 숙주미생물내에 전이되어 복제할 수 있는 벡터에다 뉴클레오티드 씨퀀스를 클로닝한 다음, (3) 메탈로프로테이나제 억제제를 표현할 수 있는 숙주미생물에다 뉴클레오티드 씨퀀스와 작용요소가 포함된 벡터를 전이시켜서, (4) 벡터의 증식과 억제제의 표현에 적당한 조건하에서 숙주미생물을 배양하고, (5) 억제제를 얻어내거나, 그 다음에 억제제가 메탈로프로테이나제 억제제의 활성을 갖는 활성 3차구조로 되게 한다.

이와 같은 방법에 있어서, 뉴클레오티드 씨퀀스는 앞에서 설명한 바와 같이 천연 폴리뉴클레오티드이거나 합성 폴리뉴클레오티드이다.

본 발명에 따른 제조방법의 바람직한 구현예에 있어서, 뉴클레오티드 씨퀀스는 다음과 같은 씨퀀스을 가진다.

본 발명에 따른 제조방법에 적당한 것으로 생각되는 벡터는 앞에서 설명한 것들과 동일하며, 바람직한 구현예에서는 클로닝 벡터 pUC9-F5/237 p10를 사용할 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 벡터들은 곧 숙주미생물에 전이되는데, 이때 숙주미생물은 외인성 DNA를 수용할수 있는 능력이 있고 이들 유전자와 수반되는 작용요소를 표현할 수 있는 것이면 어느 것이나 숙주미생물로 사용할 수 있다. 숙주미생물은 혐기성균, 조건혐기성균 또는 호기성균이어도 좋다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주로는 특히 효모와 박테리아가 있는데, 특이한 효모에는 Saccharomyces, 특히 Saccharomyces cerevisiae가 있다.

한편, 특정한 박테리아에는 Bacillus, Escherichia 및 Pseudomonas가 포함되 며, 이외의 여러가지 숙주에 대해서는 상기 표 1에 설명되어 있다. 본 발명의 다른 구현예에서는 Bacillus subtilis, Escherichia coli 또는 Pseudomonas aeruginosa를 숙주미생물로 사용하였다.

숙주미생물이 선택되고 나면, 통상의 기술을 가진자가 일반적으로 알려진 방법에 따라 벡터를 숙주미생물에 전이시킨다. 이와 같은 방법에 대해서는 R.W.Davis 등이 Advanced Bacterial Genetics al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York(l980)에서 설명하고 있다. 한 구현예에 있어서, 낮은 온도에서 변형이 일어나는 것이 좋은데, 온도는 앞에서 설명한 작용요소를 사용하여 유전자의 발현을 조절하므로서 조절할 수 있다. 다른 구현예에 있어서, 만일 삼투성 조절인자가 벡터에 삽입되어 있다면 변형이 일어나는 동안 염농도의 조절은 합성유전자가 적당히 조절되게 해야 한다.

만일 재조합 메탈로프로테이나제 억제제가 효모에 나타나기 시작하면 먼저 클로닝 벡터를 E.coli로 전이시켜서 벡터를 복제하고 그곳에서 벡터를 얻어내어 증식시킨 다음 정제시키고, 이어서 메탈로프로테이나제 억제제를 발현할 수 있도록 벡터를 효모에 전이시킨다.

숙주미생물은 메탈로프로테이나제 억제제를 표현하기 좋은 조건하에서 배양시키는데 이러한 조건은 일반적으로 각 숙주미생물에 따라 독특한 것으로서 이들 미생물의 성장에 관한 문헌, 예컨대 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th Ed., Williams ＆ Wilkins company, Baltimore, Maryland에 기술된 내용에 따라 이미 통상적인 기술중의 하나로 쉽게 결정되게 된다.

DNA 씨퀀스의 발현을 조절하는데 필요한 조건은 벡터에 존재하거나 삽입되는 어떤 작용요소에 따라 달라지는데 변형단계와 배양단계에 영향을 주게 된다. 하나의 구현예에 있어서, 세포는 DNA 씨퀀스의 발현을 억제하는 적당한 조절조건하에서 고밀도로 성장하며, 최적의 세포농도에 이르렀을 때 뉴클레오티드 씨퀀스를 발현하기에 적당한 주위조건으로 변화된다. 그러므로 메탈로프로테이나제 억제제의 생성은 거의 최적농도까지 숙주세포가 성장한 후의 짧은 시간내에 일어나는 것으로 생각되며 생성된 메탈로프로테이나제 억제제는 그 발현에 필수적인 조절조건이 유도된 다음 얼마후에 수거될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 재조합 메탈로프로테이나제 억제제는 얻어낸 다음 활성구조로 되기 이전에 정제되는데, 이러한 구현예에서는 단백질을 먼저 정제하게 되면 리폴드(refold) 단백질을 높은 수율로 회수하는 것이 용이하다고 생각되어진다.

한편, 다른 실시예에 있어서는 메탈로프로테이나제 억제제를 정제하기 이전에 그들의 활성구조로 리폴드할 수도 있다. 또다른 실시예에서는 메탈로프로테이나제 억제제가 배양배지에서 회수했을 때 리폴드된 활성상태로 되어 있을 수도 있다.

어떤 환경에서 숙주미생물에서 발현되고 세포벽이나 세포막을 통해서 또는 외질공간으로 단백질을 수송할때 메탈로프로테이나제 억제제는 적당한 활성구조를 갖게 될 수도 있는데, 일반적으로 이러한 현상은 적당한 리더씨퀀스를 코드하는 DNA가 재조한 단백질을 코드하는 DNA에 연결된다면 일어나게 될 것이다. 본 발명의 바람직한 메탈로프로테이나제 억제제는 세포내막 밖으로 자리를 옮기면서 그들의 완성된 활성형으로된다. 다수의 시그널 펩티드의 구조에 대해서는 예컨대 Marion, E.E.Watson이 Nuc. Acid Res.12 : 515-5164(1984)에 기술하고 있다. 뉴클레오티드 씨퀀스와 함께 이러한 리더씨퀀스는 세포막을 따라 이동되며 세포로부터 방출될 때 분열되는 리더씨퀀스 영역을 가지게 되는 용해 단백질을 세포내 생성하도록 할 것으로 여겨진다.

바람직한 구현예에 있어서, E.coli OmpA 단백질의 시그널 단백질이 리더씨퀀스로 사용되며 메탈로프로테이나제 억제제의 구조에 대한 정보를 가지는 이 DNA 씨퀀스와 인접한 부분에 위치하게 된다.

또한, 바람직한 리더씨퀀스에는 베타-락타마제와 카르복시펩티다제, 그리고 사람의 시그널 단백질의 리더씨퀀스가 포함되는바, 상기 및 이외의 리더씨퀀스에 대해서 설명하고자 한다.

만일, 메탈로프로테이나제 억제제가 그의 적당한 활성구조를 갖지 않는다면, 형성된 모든 디설파이드 결합 및/또는 발생되어 있는 비공유 상호작용(noncovalent int-eraction)은 메탈로프로테이나제 억제제가 조절된 조건하에서 변성제 및 환원제, 예컨대 구아니디늄 클로라이드와 β-메르캅토에탄올에 의해서 산화되고, 희석되어 그의 활성구조를 나타내기 전에 상기 변성제 및 환원제에 의해 먼저 깨지게 될 것이다.

여기서 전사 종결인자는 벡터를 안정하게 하는 역할을 하는데, 특히 Gentz등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 4936-4940(1981)에 기술하고 있는 씨퀀스가 본 발명에서 유용할 것으로 추측된다.

본 발명은 통상의 기술의 가진자가 여기에 포함된 기술을 이용하여 다른 특수한 문제나 환경에도 적용시킬 수 있을 것으로 생각된다. 본 발명에 따른 생성물과 그들의 단리 및 제조방법에 대해서는 다음의 실시예를 통하여 자세히 설명하고자 한다.

(1) HEF-SA 섬유아세포에서 폴리(A⁺) RNA의 제조

크기가 75cm²인 플라스크내에서 HEF-SA 세포를 거의 배양하였다. 둘베코 인산염(Dulbecco's phosphate) 완충식염수로 상기 세포를 2번 세척시키고 1% w/v SDS(BDH Chemicals, Ltd., Poole, England), 5mM EDTA 및 20㎍/㎖ 프로테아제 K(Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana)가 함유된 10mM Tris(pH 7.5) 2㎖를 첨가시켜 얻어냈다. 상기와 동일한 용액으로 각 플라스크를 세척하였다.

수확된 세포로부터 부분표본 70㎍/㎖ 프로테아제 K를 만들고, 이 부분표본 40℃의 온도에서 45분동안 배양시켰다. 단백질 가수분해된 용액에 5M스토크(stock)를 가하여서 단백질 가수분해된 용액에 NaCl의 농도가 150mM이 되게 하고 이와 동일한 용량의 페놀 : 클로로포름(1 : 1)으로 추출한 다음 이와 같이 하여 형성된 액상물질을 상기와 동일한 용량의 클로로포름으로 재추출하였다.

이어서, 상기 용량의 2배량인 에탄올을 가하고 -20℃의 온도에서 하룻밤 동안 배양하여 Beckman J2-21 원심분리기(Beckman사 제품)에서 17,500xg로 10분동안 원심분리하여 핵산을 침전시킨 다음 이를 다시 0.1% w/v SDS 25㎖에 용해시켰다.

이 용액을 상기와 동일한 용량의 클로로포름으로 추출하고, 다시 상기 용량의 2배량인 냉각 에탄올을 가한 다음 -20℃의 온도에서 2시간 동안 방치시켰다. 이어서 10,000xg로 15분동안 원심분리시키면 침전이 생기게 되는데 이 침전물을 0.5mM EDTA와 약 0.1% SDS를 포함하는 pH가 7.5인 1mM Tris 10㎖에 재용해하였다. 이 용액에 pH 5.0인 10㎖의 4M LiCl, 20mM NaOAc를 가하여 RNA를 침전시키고 이를 다시 -20℃의 온도에서 18시간동안 배양시킨 다음 원심분리하여 침전물을 회수하고, 생성된 침전물을 2㎖iCl로 두번 세척하다가 pH가 7.5인 1mM Tris, 0.5mM EDTA, 0.1% SDS에 재용해시켜 -70℃의 온도에서 보관하였다.

(2) 올리고 dT 셀룰로오스에서의 크로마토그래피

상기와 같이 하여 제조된 세포의 RNA를 에탄올 침전시켜서 0.5M NaCl에 재용해시켰다. 0.45mg/㎖의 RNA 5㎖를 세척된 Ⅶ형 올리고 dT 셀룰로오스(PL Bioch-emicals, Milwaukee, Wisconsin)의 1㎖ 컬럼에 넣었다.

이어서,0.5M NaCl 10㎖로 상기 컬럼을 세척하고 멸균된 물 2.0㎖로 용출시킨 다음, 용출된 RNA의 폴리(A⁺) 분획물을 에탄올 침전시키고 다시 용해시켜서 pH가 8인 1mM Tris, 0.1mM EDTA의 1mg/㎖용액으로 만든 다음 상기 용액을 -70℃에서 보관하였다.

(3) cDNA 합성

폴리(A⁺) RNA는 AMV 리버스 트랜스크립타제(reverse transcriptase, Life Sciences사 제품)에 의한 cDNA 합성용 템플레이트(template)로 제공되기 위해 올리고 dT(PL Biochemicals, Milwaukee,Wisconsin)로 시발(prime) 된다.

합성반응에 이어서, 0.1배 부피의 3N NaOH를 가하여 RNA를 수화시키고 67℃의 온도에서 10분 동안 배양한 다음, 용액을 중화시키고, pH가 7.5인 10mM Tris, 5mM EDTA, 그리고 1% SDS에서 크기가 0.7×25cm인 컬럼으로 비오겔(biogel) A 1.5(BioRad Laboratories, Richmond. California)를 사용하여 겔여과 크로마토그래피를 실시함으로써 cDNA를 정제하였다.

cDNA가 포함된 분획물을 모아서 에탄올 침전으로 농축하고 cDNA에 dG꼬리를 붙인 다음 앞에서 설명한 과정으로 겔여과에 의해 정제하였다.

두번째 스트랜드(strand)의 합성은 올리고 dC로 시발하여 DNA 폴리머라제(Boehringer Mannheim 제품)의 큰 분획으로 초기반응에서 중합시킨 후, E.coli DNA 폴리머라제 I(Boehringer Mannheim 제품)을 첨가하고 둔단되도록 계속 배양하였다. 더블스트랜드 cDNA를 크로마토그래피로 다시 정제하고 EcoRI 메틸라제(New Engl-ands Biolabs 제품)의 작용으로 cDNA내에 있는 EcoRI 제한위치를 변형시킨 다음, cDNA를 다시 정제하여 합성 EcoRI 연결인자(linker)에 결찰하였다. 이어서 마지막으로 말단부를 엔도뉴클레아제로 자르고 cDNA를 겔여과법으로 정제시켰다. 이 DNA를 시험관 내의 람다 gt10 DNA내의 독특한 EcoRI 위치에 결찰시켜 Huynh, T. V., Young, R. A. 및 Davis, R. W.가 DNA Cloning Techniques, A Practical Approach (ed. Glover, D. M.) (IRL Press Oxford), in press에서 설명 하고 있는 방법에 따라서 E.coli 균주 hflA를 감염시키는데 사용하였는바, 이러한 방법에 의해서 약 25,000개의 재조합물이 증식되었다.

(4) 스크리닝(Screening)

얻고자 하는 재조합 파지(phage)를 함유하는 씨퀀스는 원하는 메탈로프로테이나제 억제제의 일차구조 부분을 코딩하는 합성 올리고뉴클레오티드에 대한 이들의 선택적 혼성에 의해 선택되는데, 이하 상기 합성 올리고뉴클레오티드를 FIBAC라 한다. 단백질 씨퀀스의 이러한 부분들은 Stricklin, G.P.and Welgus, H.G.가 J.Biol. Chem. 258 : 12252-12258(1983)에서 설명하고 있는 것들과 부분적으로 일치하였다. 재조합 파지는 E.coli 균주 hflA를 감염시키는데 사용하는 바, 우선 밀도가 약 2×10³pfu /150mm가 되도록 니트로셀룰로오스 필터(BA 85, Schleicher ＆ Schuell Inc. Keene, New Hampshire)위에 파지를 몇방울 옮기고 Benton and Davis, Science 196 : 180-182(1979)에 기술한 바와 같이 DNA를 변성시키고 반드시 고정시켰다.

이러한 과정을 수행함에 있어서, 필터는 0.5M NaCl 용액과 0.1M Tris, 그리고 pH가 8.0의 1.5MNaCl에서 각각 10 내지 15분동안 연속적으로 처리하고, 마지막으로 2×SSPE에 담궈두었다(여기서 2×SSPE는 pH가 7.4인 0.36M NaCl, 20㎖ NaH₂PO₄, 2mM EDTA 혼합용액이다). 이어서 필터를 건조시켜서 75℃ 내지 80℃의 온도에서 3 내지 46시간동안 가열한 다음 이중 필터(duplicate filter)를 형성시켰다.0.1×SET, 0.15% NaPPi 및 1×덴하트용액을 함유하는 5×SSPE에서 상기 필터를 37℃의 온도로 1내지 3시간동안 예비혼성시키고 5' 말단 표지된 51-mer 올리고뉴클레오티드(특히 활성도가 약 10⁶cpm/pmole) 5×10⁵cpm/㎖를 함유하는 상기와 동일한 용액내에서 37℃의 온도로 72시간동안 혼성시켰다. 이어서 37℃의 온도에서 0.1×SET와 0.05% 소디움 피로포스페이트가 함유된 5×SSPE 용액으로 6번 세척하고 다시 21℃의 온도에서 2×SSPE 용액으로 3번 세척한 다음 이들을 건조시켜서 Kodak lightening-plus intensifying Screen으로 -70℃의 온도에서 Kodak XAR-5 필름에 자동방사선 사진을 찍었다. 이중 필터에 분명하게 나타나는 시그널은 반점(plague)의 정제를 위하여 파지를 집어내는데 사용되는데 반점의 정제단계를 위한 필터의 제조과정 및 혼성과정은 상기와 동일하다.

세척과정은 37℃의 온도에서 2×SSPE로 6번 세척하는 것으로 단순화되었다. 도포(plating)를 반복하므로써 정제된 6개의 단리물은 연속적인 탐침(Probe)에 의한 시험을 하기 위하여 E.coli 균주 c600의 단일층(single lawn)에 가지런히 두었다.

각 단리물에 대한 17-mer의 바람직한 혼성화는(조절반점에 대하여) 반점 정제에 사용된 것과 동일한 조건하에서 .관찰되었다. 탐침 C는 혼성을 실시하는 동안 SSPE의 농도가 4x로 감소하는 것을 제외하고는 동일하게 시험하였는데 각 단리물은 비교반점에 했던 것보다 탐침에 더 강한 혼성화를 나타내었다.

(5) 파지 정제와 cDNA 특성화

단리된 6가지 파지에 대한 각각은 플레이트 스토크(plate stock) 기술에 의해 얻어지고, 일련의 CsCl 블록 그래디언트 원심분리에 의해서 정제되었다. 이어서 Davis, R.W., Botstein, D. 및 Roth, J.R., A Manual for Genetic Engineering : Advanced Bacterial Genetics, (1980), Cold Spring Harbor Laboratory에서 기술한 바와 같이 50% 포름아미드에 대하여 투석하므로서 각 단리물로부터 DNA를 추출하고 이를 EcoRl로 분해시킨 다음 생성물을 아가로즈 겔 전기영동(agarose gel elec-trophoresis)으로 분석하였다. 큰 클론중의 하나로부터 뽑아낸 삽입물, 람다 FIBAC 5는 SalI, HindIII, BamHI 그리고 EcoRI에 대하여 내부위치가 모자라는 것으로 밝혀졌다. 람다 FIBAC 5 DNA로부터 cDNA 삽입물을 방출시키고 4개의 효소로 람다부(lambdaarm)를 분해한 다음 분획물은 에탄올 침전시키고 더이상 정제하지 않은 상태에서 플라스미드 pUC9의 EcoRI 자리에 결찰하여, 이들 플라스미드를 E.coli 균주 JM83을 변형시키는데 사용하고 변형체(tramsformant)는 플레이트를 포함하는 앰피실린에서 선택되었다. 몇가지 변형체로부터의 플라스미드를 정제하고 EcoRI 분해산물을 기초로 하여 특성화하였다. 아가로즈 겔 전기영동에서 람다 FIBAC 5로부터 삽입물과 함께 이동하는 삽입물을 가진 것 하나를 선택하여 이 플라스미드를 pUC9-F5/237 p10이라고 이름하였다.

(6) 맵핑(mapping)과 서브클로닝(Subcloning)

pUC9-F5/237 p10내의 삽입물을 내부 PstI위치에 맵핑시켰다. EcoRI와 Pst에 의한 중복분해(Double digest)는 3개의 내부 PstI 인식자리를 나타내고 완전한 삽입물과 성분조각물(component piece)을 M13 박테리오파지 mp19와 mp18에 각각 서브클로닝하였다. 조각물은 디데옥시뉴클레오티드 방법에 따라 연결하였는데, 상기 방법은 본 발명에서 참고문헌으로 사용한 Sanger, F., Nicklen, S. 및 Coulson, A. R., Rpoc. Natl. Acad. Sci. USA 74 : 5463-5467(1977)에 기술되어 있다.

pUC9-F5/237 p10으로부터 제조된 DNA 삽입물의 씨퀀스는 사람 피부 섬유아세포에서 단리할 수 있는 콜라게나제 억제제와 생물학적으로 동등한 성숙된 섬유아세포 콜라게나제 억제제의 1차구조를 코딩하는 개방된 해석구조를 나타내었다. 상기 씨퀀스의 두드러진 특성은 다음과 같다.

(1) 삽입물은 클로닝 계통적 분류법과 일치되는 G/G 및 A/T 호모-폴리머릭 트랙트(Homo-polymeric tract) EcoRI 제한자리에 의해서 측면으로 접해있다.

(2) 정보스트랜드는 적용되는 기술과 일치되는 상태에서 3' 말단에 폴리 A와 5'말단에 폴리 C를 가지는 5' 내지 3' 컨벤션(convention)에 주어진다.

(3) 만일 폴리트랙트의 3' 말단에 바로 인접해 있는 GTTGTTG 씨퀀스에서 첫번째 G를 뉴클레오티드 1로 생각한다면, 개방된 해석구조에 나타난 뉴클레오티드 34에서부터 뉴클레오티드 585까지는 사람 섬유아세포의 성숙한 콜라게나제 억제제의 1차구조가 된다.

(4) 뉴클레오티드 586에서 588에 나타난 TGA 종결코돈은 성숙한 단백질의 해독 생성물과 동일한 해독 생성물의 카르복시 종결부위가 된다.

(5) 뉴클레오티드 1부터 33까지는 진행된 단백질의 1차구조에서는 찾아볼 수 없으나 분비된 단백질의 특성을 나타내는 리더 펩티드의 일부일 것으로 추측되는 아미노산 씨퀀스이다.

(6) 세개의 내부 PstI 자리에는 그들의 첫번째 염기 뉴클레오티드 298, 327 및 448을 갖는다.

(7) 뉴클레오티드 78에서 시작되는 제한효소 TthlllI에 대한 단일 인식 씨퀀스가 있다.

(8) 뉴클레오티드 227에서 시작되는 제한 엔도뉴클레오티드 NcoI에 대한 단일 인식 씨퀀스가 있다. 뉴클레오티드 1부터 703까지의 씨퀀스의 제한위치를 분석하면 다음과 같다.

다음은 나타나지 않았다.

[실시예 2]

[E.coli에서 콜라게나제 억제제의 발현]

본 실시예에서는 클론 cDNA의 5' 말단부에 뉴클레오티드 씨퀀스를 커플링하는 바람직한 방법을 설명하고자 한다.

본 실시예에는 코딩 씨퀀스 내의 특정지점에서 핵산의 분열을 일으키는 것과 절단 및 재결합에 의해서(즉, 유용한 제한위치를 혼합하므로서) 합성 올리고뉴클레오티드로 코딩씨퀀스의 원하는 부분을 재조합하는 것이 포함된다.

코딩영역의 5' 말단부는 5' 방향의 TthlllI 위치에서 연장되는 DNA의 양스트랜드를 합성하고 BamHI돌출부에서 종결하여 절단될 수 있는데, 이러한 합성 올리고뉴클레오티드, 즉 FIBAC는 다음과 같은 특성을 갖는다 :

(1) 코돈선택은 고도로 발현된 세균단백질의 유전자내에서 가장 흔히 발견되는 쪽에서 기울어지게 된다.

(2) 해독이 시작되는 메티오닌 코돈은 FIBAC를 가지는 사람의 코딩영역이 시작되는 시스테인에서부터 바로 역류(upstream)한다.

(3) BamHI 위치 내지 메티오닌 코돈의 간격은 pUC8내로 클론될 때 FIBAC의 코딩영역은 베타갈락토시다제 유전자의 5' 말단부와 함께 구조내(in-frame)에 있게 되는 정도이다.

(4) 구조내 정지코돈과 Shine Dalgarno 씨퀀스가 역시 존재한다. 베타갈락토시다제의 아미노 종결영역에 대한 이 조립체의 해독은 TAA코돈에서 종결되며, FIBAC의 해독은 다음 ATG에서 시작된다.

(5) 코돈은 FIBAC 시발코돈에서 G로 시작하는 HgiAI위치를 만들도록 선택되었다.

(6) BamHI 씨퀀스의 3' 말단부에서 하나의 염기에 의해서 분리된 Pvul 위치가 있다.

FIBAC A의 구조는 다음과 같다.

FIBAC A는 4가지 성분의 일련의 올리고뉴클레오티드로서 ABI DNA 신시사이저(Foster City, California)를 사용하여 합성되었다.

성분 올리고뉴클레오티드 FAI은 GATCC GCGAT CGGAG TGTAA GAAAT GTGCA CTTGC, 성분 올리고뉴클레오티드 FA2는 GGAACG CAAGT GCACA TTTCT TACAC TCCGA TCGCG, 성분 올리고뉴클레오티드 FA3는 GTTC CGCCG CATCC GCAGA CTGCT TTCTG CAACT CTGAC C, 성분 올리고뉴클레오티드 FA4는 AGGTC AGAGT TGCAG AAAGC AGTCT GCGGA TGCGG C이다.

FIBAC 유전자의 코딩영역의 나머지는 pUC9-F5/237 p10을 TthlllI과 EcoRI 효소로의 이중 분해에 의해 생성된 3' TthlllI 내지 EcoRI 분획으로 단리된다.

합성 연결인자는 TthlllI의 3' 말단부를 EcoRI 분획물에 SalI 위치에 연결되도록 한다. 이들 올리고뉴클레오티드는 EcoRI위치를 파괴하고 SalI 위치를 다시 만들도록 설계될 것이며 연결인자는 올리고뉴클레오티드 연결인자 A1과 연결인자 A2로 이루어진다.

연결인자 A1은 AATTGGCAG이고, 연결인자 A2는 TCGACTGCC이다.

이들 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드 FA1-FA4는 각각 활성화(kinased)되고, cDNA의 EcoRI 3' 말단부에 TthlllI와 동일한 분자비율로 어닐(anneal)되어 있으며 BamHI/SalI는 mp19RF DNA를 자른다. 결착된 DNA는 JM105를 형질전환시키는데 사용된다.

IPTG와 X-gal 존재하에서 나타나는 그들의 색깔과 올리고뉴클레오티드 FA2로의 혼성화에 의해 플라그(Plaque)를 선택하여 수개의 양성 플라그를 씨퀀스하였다. 도안된 씨퀀스를 포함하는 것은 BamHI/SalI 분해된 pUC8에 서브클론되었다.

이 구조물에서 FABAC 유전자의 해독은 베타-갈락토시다제에 대하여 시작된 해독에 연결되며 이러한 발현벡터를 pUC8-Fic라 한다. 고도로 발현된 다른 단백질에 대하여 시작되는 해독에 FABAC 해독이 연결되는 것은 유사하게 배열된다. 예를들어 Shine-Dalgarno와 시발인자 메티오닌 씨퀀스를 포함하는 OmpA 유전자의 부분이 합성되었다. 이 씨퀀스는 OmpA 단백질의 완전한 시그널 펩티드를 코드하고 EcoRV, Pvul, StuI, EcoRI 등에 대한 편리한 제한위치를 가진다.

센스 스트랜드(Sanse Strand)의 씨퀀스는 다음과 같다.

이상 상기 씨퀀스를 OmpA리더라 칭한다. OmpA에 대한 FIBAC의 해독은 Pvul와 SalI로 pUC8-Fic를 절단하고 코딩영역을 단리시키므로서 커플링되는데 이것은 OmpA리더에서 단리된 EcoRI 내지 Pvu1 분획물과 함께 EcoRI/SalI으로 절단된 pUC8에 클론된다. 이전의 실시예에서와 같이 전사는 lac촉진자에 의해서 촉진되고 lac 작용인자에서 lac 유전자 생성물에 의해서 조절된다. 이 FIBAC 발현벡터를 pUC8-F/OmpAic라 칭한다.

내부 세포막을 지나는 FIBAC의 전좌(translocation)를 효과적으로 하기 위하여 적당한 리더씨퀀스가 FIBAC 아미노종결부위에 첨가되는데 이렇게 하여 생성된 단백질은 전좌하여 성숙한 형태로 된다.

또한, 이러한 전좌를 효과적으로 하기 위하여 FIBAC의 구조영역으로 이어지는 E.coli OmpA 단백질의 시그널 펩티드를 코딩하는 FIBAC 유전자가 생성된다.

이와 같은 특이한 FIBAC 유전자는 변화된 FIBAC 코딩영역의 5' 말단부에 구조 정지코돈을 가져야 한다. 이를 달성하기 위하여 HgiAI 위치로부터 NcoI 위치까지 퍼져있는 pUC8-Fic로부터 5' 코딩영역 부위를 단리시킨다. 상류시퀀스(upstream Sequence)는 내부 StuI 위치를 포함하여, BamHI와 HgiAI로부터 응집성을 말단부를 갖는 내부 StuI 부위를 함유하는 연결인자로 재합성되는데 이는 두개의 올리고뉴클레오티드,즉 연결인자 B1과 연결인자 B2로써 합성된다.

연결인자 B1은 GATCCCAGGCCTGCA이고, 연결인자는 B2는 GGCCTGG이다.

상기 연결인자 B1 및 B2는 각각 활성화되고, 상기 NcoI 분획의 HgiAI과 BamHI/NcoI 절단 pUC8-Fic를 동일한 분자비율로 하여 어닐시킨다.

얻어진 구조물은 베타-갈락토시다제의 아미노종결부의 해독으로 구조내에 FIBAC의 코팅씨퀀스를 갖는다. 이 씨퀀스의 해독은 FIBAC로 용해 단백질을 형성하는데 이러한 플라스미드를 pUC8-Ff라 한다.

EcoRI/StuI 절단 pUC8-Ff를 OmpA리더의 StuI분획의 정제된 과량의 EcoRI과 결찰하므로서 FIBAC의 코딩영역에 OmpA 리더씨퀀스를 부착시킬 수 있다.

변형후에 몇개의 콜로니(colonies)로부터의 플라스미드는 혼성에 의해서 특성화될 것이며, OmpA 리더분획물에 합병된 이들은 구조를 더 확인하기 위해서 특성화된다. 이 플라스미드 pUC8-F OmpA1은 E.coli OmpA 단백질의 시그널 펩티드에서 시작하고, FIBAC에서 종결되는 용해 단백질의 합성을 지시하게 된다.

단백질의 OmpA 영역에 있는 시그널은 세포질로부터 단백질을 내보내고 FIBAC의 1차구조에서 적당하게 절단시키는데 영향을 준다.

만일, 리더펩티드의 씨퀀스 또는 단백질이나 핵산에 있어서 FIBAC과 리더펩티드와의 조합으로 인해 발현효율이 떨어진다면, 유전자는 알려진 몇가지의 FIBAC 리더씨퀀스의 정보를 갖도록 변경될 수도 있다.

앞에서 논의된 모든 유전자의 전사는 lac 촉진자에 의해서 효과적으로 일어난다. 해독에 대한 시발위치의 경우에 있어서 유전자의 작용인자 및 촉진자는 내부교환될 수 있다.

한편, 본 발명의 참고문헌인 Amann, E., Brosius, J. 및 Ptashne, M.의 Gene 25 : 167-178(1983)에 기술된 바와 같이 FIBAC는 람다 P_L촉친자와 작용인자(O_L), 그리고 혼성촉진자 작용인자, Tac 등을 합병하는 벡터로부터 발현될 수도 있다. 리보솜 결합위치 구조영역과 3' 비해독씨퀀스를 포함한 유전자영역의 절단과 P_L또는 Tac촉진자를 포함하는 다른 벡터에의 삽입은 pUC8-F/OmpAic와 pUC8-F/OmpA1내에서 이들 구조에 인접한 독특한 제한위치를 유용하게 한다.

StuI분획이나 또는 비슷하게 분해된 플라스미드 pDP8에 EcoRI를 삽입하는 것은 람다 P_L촉진자에 의해서 지시된 이들 유전자의 전사를 효과적으로 한다. 전자조절은 이와 동일한 플라스미드에 잠재된 cI857 돌연변이에 의해서 온도에 민감하게 된다.

Tac 촉진자의 전사단위에 유사한 유전자분획을 집어넣은 것은 먼저 SalI 분획의 EcoRV 위치에 단리시키므로서 이루어질 수 있다. 이것은 BamHI 및 PvuII 위치에 의해서 인접되어 있고 lac 작용인자를 포함하는 합성 Tac 촉진자 씨퀀스와 함께 pBR322의 BamHI 내지 SalI 위치 또는 바람직한 유도체내로 삽입될 수 있다. 이때 유도체는 lacI 유전자나 또는 Iq유전자를 포함하는 구조물이다.

Escherichia 이외의 다른 숙주미생물내에서 FIBAC를 발현하는 방법에 대해서 고려되었고 Bacillus, Pseudomonas, 그리고 Clostridium 등의 세균과 효모는 각각 독특한 장점을 가지고 있는데, 앞에서 기술된 과정들은 다른 것들에도 적용할 수 있다.

일반적으로 어떤 미생물에 대한 발현 벡터는 앞에서 언급된 E.coli의 벡터가 합병된 것과 유사한 모양으로 구현될 수 있다. 몇가지 경우에 있어서, 앞에서 논의된 특이한 유전자 구조를 새로운 숙주에 사용할 수 있는 벡터내로 직접 옮길 수 있으나, 상기 이외에는 유전자의 작용적 또는 구조적 요소를 번경시키는 것이 필요하거나 또는 필수적이다.

[실시예 3]

사람의 콜라게나제 억제제는 여러가지 미생물내에서 발현된 후에 쉽게 정제할 수 있는데, 이러한 경우에 오염된 단백질의 스펙트럼은 달라지게 된다. 비슷한 다른 과정이나 다른 단백질로부터 사람 콜라게나제 억제제를 잘 선별해낼 수 있게 하기 위하여 이미 알려진 여러가지 단계중에서 적당한 정제 단계가 선택된다.

만일, 미생물로부터 억제제가 분비되지 않는다면 재조합 미생물 내부에 함유체(inclusion body)가 형성될 수도 있다. 상기 함유체는 프렌치 프레스(French press)로 세포를 파괴시킨 후 분별 원심분리기로 다른 단백질을 분리시킨 다음 불용성 상기 함유체를 6M 구아니딘 하이드로클로라이드나 8M 요소에 용해시키되, 억제제 단백질의 시스테인을 소디움설파이트와 함께 반응시킴으로서 억제제 단백질이 좀 더 완전하게 용해된다. 이와 같은 단계에 이어서 시스테인에 디티오트레이톨을 가해주면 시스테인은 원래의 형태로 되돌아갈 수 있게 된다.

함유체로부터 억제제 단백질을 용해시킨 다음 리폴드되기 전에 폴드되지 않은 억제제에 대하여 상승된 항체를 사용하는 면역친화성 크로마토그래피로 억제제로 단백질을 정제시킨다.

상기 억제제는 다음 실시예 6이하에서 설명되는 내용에 따라 리폴드될 수 있는데 억제제가 리폴드된 후 또는 억제제가 미생물로부터 분비된다면 다른 단백질에서 여러가지 방법으로 정제시킬 수 있는 바, 그 첫단계는 50K달톤 차단막이나 암모늄설페이트 분할법으로 한외여과시키는 것이다. 또한 다른 유용한 방법으로서 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과, 헤파린-세파로즈 크로마토그래피, 역상크로마토그래피, 아연-킬레이트 크로마토그래피 등이 있으나 이들에 국한하는 것은 아니다.

상기의 모든 과정들은 정제 방법에 따라서 성공적으로 수행할 수 있다. 추가적인 고분해단계는 소수성 상호작용(hydrophobic interaction) 크로마토그래피나 면역친화성 크로마토그래피가 있다. 정제가 끝나면 순도가 적어도 90 내지 95%인 메탈로프로테이나제 억제제가 얻어진다.

[실시예 4]

사람의 양수로부터 얻어낸 사람의 콜라게나제 억제제의 정제 폐기된 양막천자(Amniocentesis) 샘플에서 얻어낸 사람외 양수 6ℓ를 Millipore pellicon cassetts system내의 Millipore사의 100KD MW 차단필터를통하여 한외여과시키고, 역시 Millipore사의 10KD 차단필터와 이어서 Amicon PM-10막을 사용하여 농축시킨다. 이와 같이 하여 얻어진 농축 양수의 부분표본(10㎖)을 LKB사의 Ultrogel AcA54의 2.5×100cm컬럼으로 용출시키고 pH가 7.6인 0.05M hepes, 1M 염화나트륨 0.01M 염화칼슘 용액, 그리고 0.02% 소디움아지드(Sigma Chemical Compony)로 평형시킨다.

억제제가 포함된 분획물을 모아서 0.01M 염화칼륨과 0.02% 소디움아지드가 포함된 pH 7.5인 0.025M Hepes 완충액에 대하여 투석시킨 다음 상기와 동일한 용액으로 평형시킨 1.5×28cm 크기의 헤파린-세파로즈 CL-6B(Pharmacia, Inc.) 컬럼에 부하시킨다.

이어서, 이 컬럼을 1ℓ의 상기 완충용액으로 세척하고 선형그래디언트를 갖는 0 내지 0.3M의 염수로 용출시켜서 0.1 내지 0.15M 염수의 용출에서 나타나는 억제제의 활성이 가장 큰 분획물을 모은 다음 1㎖로 농축하고 0.05% 트리플루오로 아세트산(Aldrich Chemical Company)으로 평형시킨 Synchropak rp-8 역상 HPLC 컬럼에 부하시키되 선형그래디언트를 갖는 0 내지 40%의 아세토니트릴을 분당 1/2%로 용출시켰다.

얻어진 모든 분획물을 바로 Savant speed-Vac 농축기에서 건조시켜서 아세토니트릴을 제거하고, 분석하기 이전에 pH가 7.5인 0.1M Hepes에 재용해시킨다. 이때 억제제는 농도가 32% 내지 38%인 아세토니트릴에서 용출되는바, 억제제가 포함된 분획물을 모아서 100㎖의 부분표본을 Bio-red Biosil-TSK 250HPLC 겔여과 컬럼으로 다시 용출시킨다. 이와 같이 하여 얻어진 0.1mg의 억제제는 SDS 폴리-아크릴아미드 겔 전기영동에 의해서 측정된 순도가 95%이상이었다.

[실시예 5]

[태아의 피부 섬유아세포의 혈청이 없는 배지(Serum-Free Medium)에서 얻어진 사람의 섬유아세포 콜라게나제 억제제의 정제]

태아의 피부 섬유아세포를 혈청이 없는 조직배지에서 배양시키고, 10ℓ를 모아서 0.25% 소디움아지드와 0.01M 염화칼슘 용액이 함유된 pH가 7.5인 0.02M Hepes 완충용액에 대하여 투석한 다음 상기와 동일한 완충용액으로 평형시킨 2.8×48mm 크기의 헤파린-세파로즈 CL-6B(Pharmacia, Inc.) 컬럼에 부하시킨다. 이어서 상기와 동일한 완충용액 2ℓ로 컬럼을 세척하고 상기 완충용액이 포함된 0 내지 0.3M의 염화나트륨으로 선형그래디언트를 갖도록 용출시킨다.

사람 섬유아세포의 콜라게나제를 억제하는 억제제의 활성도에 의하여 얻어진 분획물에 대한 억제제의 존재를 측정하게 되면 염화나트륨의 농도가 약 0.15M일 때 활성도의 피크에 해당되는 분획물이 얻어진다. 이렇게 하여 얻어진 분획물을 Amicon YM10필터로 한외여과시켜 약 5mm로 농축한 다음, 1%의 트리플루오로아세트산으로 평형시킨 4.1×250mm 크기의 Synchrolpakrp-3 역상 HPLC 컬럼에서 4번으로 분리시켜 용출시키되 0.1% 트리플루오로아세트산에서 0 내지 60%의 직선기울기를 갖는 아세토니트릴로 용출시킨다. 기울기를 분당 1/2% 아세토니트릴로 하면 아세토니트릴의 농도 26 내지 29% 사이의 2개 피크에서 억제제가 용출된다. 얻어진 모든 분획물을 Savant speed-Vac 농축기에서 바로 건조시키고 pH가 7.5인 0.1M Hepes에 재용해 시킨다음, 분석하면 적어도 1.2mg의 콜라게나제 억제제가 얻어지며 순도는 90 내지 95%이다.

이 물질은 17.5%의 환원 SDS겔에서 단일밴드를 나타낸다. 시스테인을 카르복시 메틸화(Carboxy methylation)시킨후 동일한 조건하에서 RP-8 컬럼으로 용출시키면 억제제는 단백질 씨퀀싱을 위하여 알맞게 균질화된다.

[실시예 6]

사람 콜라게나제 억제제가 미생물 내에서 그들의 유전자를 발현하고 미생물에 의해서 생성된 다른 대부분의 단백질로부터 콜라게나제 억제제를 분리시킨 다음에는 그의 변성상태에서 쉽게 천연구조로 리폴드될 수 있는 것으로 추측된다. 참고도서로 인용한 Freedman, R. B. and Hillson, D.A., "Formation of DisulfideBonds" (The Enzymology of Post-Translational Modification.of Proteins, Vol. I,R.B. Freedman and H.C.Hawkins eds., pp.258-207(1980)에 기술되어 있는 바와 같이 다른 디설파이드 함유 단백질이 리폴드하는데 필수적인 조건에서 유추해보면, 사람의 콜라게나제 억제제는 pH가 8.0이상인 용액내에서 리폴드되어야 하는 것으로 알려져 있다.

상기 pH에서는 단백질의 시스테인이 부분적으로 이온화되며, 이러한 조건은 본래의 디설파이드 결합쌍을 얻는데 필수적이다. 억제제가 리폴드되는 과정을 방해하는 분자간 디설파이드 연결집합체의 형성을 최소로하기 위해서는 억제제의 농도가 0.1mg /㎖이하로 비교적 작아야 한다.

폴드되지 않은(환원된) 구조에 대한 리폴드된 천연의 디설파이드 결합구조의 안정성은 용액의 산화-환원 포텐샬(Potential)과 다른 산화환원 활성분자의 농도에 의존하기 때문에 산화 환원 포텐셜은 10의 환원 : 산화된 글루타치온 비율과 대등한 포텐샬이 되는 산화 환원 완충용액으로 완충시켜야 한다. 환원된 글루타치온의 바람직한 농도범위는 0.1 내지 1.0mM인 바, 이보다 높은 농도에서는 혼합된 디설파이드가 단백질을 형성하여 리폴드된 천연 구조에 대한 산출량이 줄어들게 된다. 폴드되지 않은 단백질과 천연의 구조에 대한 상대적인 안정성과 특히 리폴드하는 비율 및 산출량은 예컨대 pH, 온도, 수소이온 완충용액의 형태, 이온강도, 음이온 및 양이온의 존재유무 등의 다른 용액 변수에 의존하는데 여기에 대해서는 Privalov, P.L.의 "Stability of Proteins, Small Globular Protein," Advances in Protein Chemistry. Vol.33, pp.167-236(1979)에 기술되어 있다. 상기 조건은 모든 단백질에 대하여 달라지며, 실험에 의해 결정된다. 나중에 천연 리폴드된 단백질로부터 쉽게 분리시킬 수 있고, 또한 천연의 구조(폴드되지 않은 구조에 반대되는 것으로서)를 강하게 결합시키는 어떤 분자를 첨가시키므로서 산출량뿐만 아니라 리폴드 비율도 증가시킬 수 있다. 이와 같은 분자는 천연의 구조에 대하여 생긴 모노클로날 항체와 천연의 콜라게나제 억제제와 강하게 결합되는 다른 단백질 예컨대, 포유동물 효소 콜라게나제 또는 겔라게나제 또는 겔라티나제 등을 포함하고 있다.

[실시예 7]

바람직한 두번째 씨퀀스는 다음과 같다.

다음은 나타내지 않았다.

상기 cDNA는 다음과 같은 특성을 갖는다.

1. 코딩스트랜드는 5' 말단부에 폴리 C트랙트(tract)로 5' 에서 3' 방향으로 존재하게 된다.

2. 단일 씨퀀스 GGC CAT CGC CGC에 있는 첫번째 G를 뉴클레오티드 1이라고 한다면, 개방해석구조는 뉴클레오티드 1로부터 뉴클레오티드 432까지에 나타나며, 이것은 부분적인 cDNA의 3' 말단이다.

3. 상기 해석구조에 있어서 첫번째 메티오닌은 뉴클레오티드 49 내지 51에 의해 코드화되며, 이는 해독시발위치를 나타낸다.

4. 뉴클레오티드 49부터 114로 나타낸 아미노산 씨퀀스는 성숙한 단백질의 1차구조에서는 찾아볼 수 없으며, 사람 단백질의 리더 펩티드의 씨퀀스이다.

5. 뉴클레오티드 82 내지 432의 씨퀀스는 실시예 1의 바람직한 첫번째 씨퀀스로부터의 삽입물에서 뉴클레오티드 1 내지 351의 뉴클레오티드 씨퀀스와 동일하다.

6. 완성된 단백질의 아미노산 씨퀀스는 당에 부착시키기 위한 두개의 일치 씨퀀스를 나타낸다. 뉴클레오티드 202 내지 210에 의해 나타내어지는 -N-G-T와 뉴클레오티드 346 내지 345에 의한 -N-R-S-씨퀀스는 성숙한 단백질에서 각각 아미노산 30 내지 32부위와 78 내지 80부위이며, 양쪽부위는 사람의 억제제 단백질내에서 글리코실화된다.

[실시예 8]

E.coli 내에서 FIBAC 유전자의 전사와 해독을 지시하는 일련의 발현벡터가 얻어지게 된다.

(가) 발현벡터 pFib51

전사가 lac 촉진자와 작용인자에 의해서 지시되고 조절되도록 하는 방법으로 사람의 섬유아세포 콜라게나제 억제제의 코딩영역("FIBAC")이 포함된 플라스미드 pUC8의 유도체를 먼저 제조한다. 이와 같이 하여 얻어진 것, 즉 pFib51은 pUC8-Fic을 조립하기 위하여 실시예 2에서 개술한 과정을 약간 수정하므로서 제조된다. 코딩영역의 5' 말단부를 제거하는 것을 뉴클레오티드 93에 있는 HaeIII 위치부터 뉴클레오티드 698에서 시작되는 3' LcoRI위치 사이에 걸친 DNA조각을 단리시키므로서 효과적으로 이루어진다. 5' 말단부는 올리고뉴클레오티드 FA3 및 FA4가 각각 HaeIII 인식위치까지 재조립을 연장하기 위한 12개 염기에 의해서 이어지는 것을 제외하고는 기재된 바와 같이 재조립될 수 있는데, 이 FIBAC C'의 구조는 다음과 같다.

GA TCC GCG AGC GGA CTG TAA GAA

G CGC TAG CCT CAC ATT CTT

ATG TGC ACT TGC GTT CCG CCG CAT

TAC ACG TGA ACG CAA GGC GGC GTA

CCG CAG ACT GCT TTC TGC AAC TCT

GGC GTC TGA CGA AAG ACG TTG AGC

GAC CTG GTG ATC AGG G

CTG GAC CAC TAG TCC C

FIBAC의 현저한 특징은 실시예 2에서 설명한 바와 같다. 합성 연결인자는 SalI 위치에 HaeIII 내지 EcoRI 분획물의 3' 말단부를 연결하여서 제조한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 SalI 위치를 재생성시키고 그의 EcoRI 위치를 없애는 것으로 여겨진다. 또한 연결인자의 내부 KpnI 위치를 포함하기 위하여 원래 설명한 것으로부터 변형되는데, 이러한 새로운 연결인자는 올리고뉴클레오티드 "변형 연결인자 A1"과 "변형 연결인자 A2"로 이루어진다. 이때, 변형 연결인자 A1은 AATTGGACCAG 이고, 변형 연결인자 A2는 TCGACTGGTACC 이다.

M13 mp19에 대한 결찰이나, 클로닝, 그리고 선택 등은 전술한 실시예에서 이미 본질적으로 기술하였다. FIBAC의 코딩영역은 BamHI과 HindIII로 분해된 씨퀀스를 가진 클론으로부터 제거되고 pUC8내의 제한위치로 서브클론되는데 이와 같이 하여 생긴 플라스미드가 pFib51이다. 이러한 플라스미드에 있어서, FIBAC유전자의 전사는 lac 촉진자에 의해서 일어나며, 메티오닐 FIBAC의 해독은 베타갈락토시다제에 대하여 시작된 해독과 연결되게 된다.

(나) 발현벡터 pFib55

성숙한 FIBAC 코딩 씨퀀스의 5' 말단부에 HgiAI 제한위치의 형성으로 코딩 씨퀀스내의 552위치에서 다른 HgiAI 위치를 제외하고 플라스미드 pFib51내에서 완전한 FIBAC 코딩 씨퀀스가 HgiAI/SalI, KpnI, 또는 HindIII 중복분해를 거쳐서 이동할 수 있게 할 것이다. 상기 제한위치는 시험관내에서 올리고뉴클레오티드 지시성, 위치특이성 돌연변이를 사용하여 제거할 수 있고, 이들에 대해서는 Zoller와 Smith의 Methods in Enzymology 100 : 468에 기술되어 있다.

해독적으로 상기 lacZ에 연결된 met-FIBAC 유전자를 포함하는 박테리오파지 mp18의 유도체로부터 단리된 단일 스트랜드 DNA는 합성 올리고뉴클레오티드 GGGC TTTGCACCTGGCAG에 어닐된다. 이 올리고뉴클레오티드는 단일 미스매취(mismatch)와 함께 HgiAI 위치를 지나서 FIBAC 코딩영역에 어닐한다. 이러한 결과로 생성된 DNA는 E.coli DNA 폴리머라제의 Klenow 분획물, T4 리가제와 4가지 데옥시-뉴클레오티드트리포스페이트의 혼합물과 함께 배양시킨다.

이와 같이 하여 얻어진 공유적으로 인접한 이중 스트랜드 파지 DNA는 E.coli 균주 JM107을 전이시키는데 사용된다. 플라그는 6×SSS내에서 58℃ 이상의 온도에서 나타나는 돌연변이 유발 올리고뉴클레오티드에 그들을 혼성시키므로서 돌연변이 씨퀀스의 존재에 대하여 분석했다.

선택된 클론은 아미노산 위치 173에 CTG를 대신하는 1eu 코돈 CTT를 가진다. 이 클론의 코딩영역은 BamHI 내지 HindIII 분획물로 절단되고, 유사하게 분해된 pUC8에 결찰된다. 생성된 플라스미드 pFib55는 FIBAC 코딩영역이 더 쉽게 이동됨은 물론 pFib55의 모든 장점을 갖는다.

(다) 발현벡터 pFib56

베타갈락토시다제 또는 어떤 E.coli에 대한 임의의 해독적 연결(tanslational coupling) 방법이 유사하게 이루어질 수 있다. 하나의 구현예로서, 플라스미드 pFib5l에 대한 측면에서 발현을 조절하는 것이 유사하나(즉 pUC8 내에서 lacZ에 해독적으로 연결된 FIBAC) 다른 해독연결인자를 사용한 클론이 고안되었다. pFib56을 제조하기 위하여 다음의 DNA 분획이 합성되었다.

EcoRI 말단부 HgiAI 말단부

5' AATTCCAAGGAGAAATAAATGTGCA 3'

HgiAI 말단부 EcoRI 말단부

5' CATTTATTTCTCCTTGG 3'

상기 이중 스트랜드 EcoRI/HgiAI 분획물을 HgiAI/HindIII FIBAC 코딩 씨퀀스와 EcoRI와 HindIII로분해된 플라스미드 pUC8에 결합시키고 결찰하면 이때의 플라스미드는 pFib56이다. 이 플라스미드가 E.coli 균주 JM107로 변형되었을 때 균주 JM107/pFib56은 JM107/pFib51이나 JM107/pFi55 보다 더 많은 메티오닐 FIBAC를 표현할 수 있게 된다.

이로부터, pFib56내의 해독연결인자가 pFib51내의 것보다 더욱 효과적이라는 결론을 내릴 수 있다.

(라) 발현벡터 pFib10과 pFibll

발현된 FIBAC를 대장균의 원형질 주변의 공간으로 옮기도록 하기 위해 리더 펩티드를 FIBAC의 아미노말단에 첨가한다. 리더 펩티드는 내부 세포막의 밖으로 용해단백질을 효과적으로 운반시킨다. 세포의 진행은 시그널 펩티드를 제거하고 성숙한 형태의 FIBAC를 생성하게 한다.

이와 같은 목적을 위하여 두개의 시그널 씨퀀스 즉, E.coli ompA와 phoS 유전자 생성물의 리더 펩티드를 FIBAC에 각각 용해시켰다.

ompA_L-FIBAC와 phoS_L-FIBAC 용해 단백질은 ompA나 phoS 리더분획물 : 그리고 천연 FIBAC로 용해물이 단백질 분해과정을 일으키게 하고, E.coli의 주변 원형질에 위치하는 그들은 지시하는 시그널을 포함한다.

플라스미드 pFib10은 opmA_L-FIBAC 용해 단백질에 대한 코딩 씨퀀스가 삽입된 pUC3의 유도체이다. 또한 ompA로부터 제조된 5' 비해독 씨퀀스도 포함하며, 이 플라스미드의 전사는 pUC8의 lac촉진자/작용인자에 의해서 지시된다. 해독은 ompA 리더씨퀀스를 시작하는 메티오닌 코돈에서 시작되고 ompA 유전자에서 발견된 Shine-Dalgarno 씨퀀스를 사용한다. 플라스미드는 pFib55의 HgiAI/HindIII 분획물에 포함된 FIBAC 코딩 씨퀀스를 ompA 리더 펩티드의 정보를 가진 합성 올리고뉴클레오티드와 EcoRI/HindIII 분해 pUC8에 함께 연결시켜서 제조한다. 합성 올리고뉴클레오티드의 코딩 스트랜드는 다음과 같다.

ompA_L

EcoRI 말단부

5' AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGAC

GTATTTTGGATGATAACGAGGCGCAAAAAAT

Pvul

GAAAAAGACAGCTATCGCGATCGCAGTGGCA

CTGGCTGGRRRCGCTACCGTAGCGCAGGCCTGCA 3'

HgiAI 말단부

이 합성은 각 스트랜드에 대해서 2개씩, 모두 4개의 올리고뉴클레오티드로 이루어진다. 2중 스트랜드DNA는 다음과 같은 모양으로 되어 있다.

(1) 코딩 스트랜드의 5' 말단부에 EcoRI 응집성 말단부와 3' 말단부에 HgiAI 응집성 말단부를 갖는다.

(2) ompA 유전자의 리더 펩티드를 코딩하는 개방해석구조를 나타내며, HgiAI 위치에 연결했을 때 FIBAC 유전자를 가진 구조이다.

(3) 해독 부분에 비코딩 씨퀀스 5'를 가지며 이는 ompA 유전자내에서 정상적으로 발견되는 리보솜 결합위치를 포함한다.

(4) 내부에 독특한 PvuI 위치를 갖는다.

플라스미드 pFibII은 플라스미드 pKK223-3의 유도체로서 플라스미드 pKK 223-3의 4550bp EcoRI/HindIII 분획물에 의해서 교체된 pUC8 부분을 제외하고는 pFib10과 동일하다. 이러한 구조에 있어서, 전사는 혼성 tac 촉진자/작용인자에 의해서 조절되고 지시된다. 추가적으로 이러한 플라스미드는 고도의 표현계내에서 플라스미드를 안정하게 할 수 있는 전사 종결인자를 포함한다.

(마) 발현벡터 pFib13

플라스미드 pFib13에 있어서, ompA_L씨퀀스의 5' 비해독영역이 제거되었으며,opmA_L-FIBAC 용해 유전자는 플라스미드 pUC8에 나타난 것과 같이 lacZ 유전자의 N-말단부분에 해독적으로 직접 연결되는 바, 이는 플라스미드 pFib10의 EcoRI/PvuI (3200bp) 분획물을 다음 합성 올리고뉴클레오티드에 결찰시킴으로로서 제조된다.

EcoRI 말단부

5' AATTCCAAGGAGAAATAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGAT3'

Pvu'l 말단부

Pvul 말단부

5' CGCGATAGCTGTCTTTTTCATTTATTTCTCCTTGG3'

EcoRI 말단부

(바) 발현벡터 pFib31

E.coli의 phoS 유전자는 인산염 결합 단백질을 코드하고 Surin, B.D. 등의 J.Bacteriol. 157 : 772-778(1984)에 의하여 씨퀀싱되었고, 여기에 기술되어 있다. 이 단백질은 주변 세포질에 있으며, 그 구획으로 향하는 25-아미노산 리더씨퀀스와 함께 있다. 상기 리더씨퀀스는 주변세포질에 오직 성숙한 phoS 단백질만 남기는 해독과정 동안에 단백질 분해적으로 제거된다. 다음에 나타낸 바와 같이 EcoRI 및 HgiAI 말단부를 가진 2개의 이중 스트랜드 DNA 분획물로서 phoS 리더씨퀀스가 제조되었다.

EcoRI/ClaI

EcoRI 말단부

5' AATTCATGAAAGTTATGCGTACCACCGTCGCAACTGT

TGTCGCCGCGACCTTAT3'

Clal 말단부

Clal 말단부

5' CGATAAGGTCGCGGCGACAACAGTTGCGACGGTGGTA

CGCATAACTTTCATG3'

EcoRI 말단부

ClaI/HgiAI HgiAI 말단부

5' CGATGA TGCTTTCTGTGTTTGCGTGCA3'

HgiAI 말단부 HgiAI 말단부

5' CGCAAACACAGAAAGCACTCAT3'

상기 분획물들을 ClaI 위치내부에서 phoS 리더에 결찰시키고, 앞에서 설명한 HgiAL/HindIII FIBAC 정보 분획물과 EcoRI과 HindIII에 의해 분해된 플라스미드 pKK223-3을 동시에 결합시킨다. 이와 같이 하여 생성된 플라스미드를 pFib31이라고 한다.

[실시예 9]

[E.coli내에서 FIBAC 유전자의 발현]

앞에서 설명한 플라스미드가 잠재된 E.coli 세포에 의해서 생성된 kFIBAC의 형태와 양을 정성적으로 결정하는 방법에는 다음과 같은 3가지 방법이 사용된다.

(1) FlBAC 항체를 생성된 E.coli 단백질과 독특하게 반응시키고 폴리아크릴아미드-SDS-전기영동에 의해 용해되고 결국 니트로셀룰로우즈 페이퍼(western blo-tting)에 결합되는 FIBAC 유전자를 유도한다.

(2)³⁵S-시스테인,³⁵S-메티오닌, 또는³⁵S₄ ^2-로 FIBAC 단백질을 라벨하고 FIBAC 유전자를 유도한다.

(3) 항체 커플링(coupIing)이나 광학 활성 라벨링없이 FIBAC와 E.coli 단백질을 함유하는 폴리아크릴아미드 SDS겔로 조사한다.

이러한 방법들은 각 균주에 의해서 생성된 FlBAC 양의 비교뿐만 아니라, 기능적인 메탈로프로테이나제를 억제할 필요없이 발현에 있어서 FIBAC이 정제되도록 한다.

상기 실시예 8에서 논의된 모든 플라스미드는 E.coli 균주 JM107을 배경으로 하여 발현되었다. E.coli내에서 FIBAC의 발현은 세포내막의 바깥쪽으로 단백질을 수송하도록 되어진 이러한 시스템에서 훨씬 더 크다. 이것은 세포질내에서 발현된 단백질이 변성되기 때문인 것으로 보인다.

성숙한 형태의 FIBAC를 생성하는 ompA_L-FIBAC 용해 단백질의 진행은 세포의 성장단계(Phase)에 부분적으로 의존하고 있는 것으로 생각되는데 성장단계의 초기 log단계에서 IPTG로 유도된 세포는 진행된 FIBAC와 진행되지 않은 FIBAC의 혼합물을 축적하는 반면, 후기 log단계에서 유도된 세포배양물은 진행된 FIBAC만 축적한다. 그러나 phoS_L-FIBAC 용해물을 발현하는 균주는 성장단계와는 전혀 무관하게 단백질을 진행시키는 것처럼 보인다.

상기 실시예 8에서 언급된 모든 발현벡터는 선택가능한 마커와 같이 앰피실린 내성을 가지는데 제조목적상 테트라싸이클린 내성 마커를 갖는 것이 좋을 수도 있다. 일반적인 발현벡터로 유용한 하나의 플라스미드는 테트라싸이클린 내성 마커로 제조되었다.

이 플라스미드는 pKK223-2의 유도체로서, 절단된(truncated) 테트라싸이클린 내성 유전자는 pBR322로부터 응용한 완전히 기능적인 tet^r유전자로 대체되었다.

[실시예 10]

[E.coli에서 발현된 FIBAC의 정제]

재조합된 사람의 콜라게나제 억제제(FIBAC)는 플라스미드 pFibll로 변형된 E.coli 균주 JM107로부터 정제된다. 상기 균주 JM107/pFibll에 있어서, FIBAC는 불용성 집합체로서 축적되게 할 수 있다. 본 실시예에서는 세포의 성장조건, FIBAC 유전자 발현의 유도, 세포수확, 그리고 전체 세포분해질(lysate)의 불용성 분획물로부터 FIBAC의 정제 등에 대해서 설명하고자 한다. 이와 동일한 문헌이 전체 세포분해질의 가용성 분획물로부터 FIBAC를 본질적으로 풍부하게 하는 데에도 사용될 수 있다.

(가) 불용성 분획물

초기 OD₆₀₀이 0.15 내지 0.20이 되도록 JM107/pFibll을 하룻밤 동안 배양하므로서 농도가 100㎍/㎖인 앰피실린을 포함하는 루리아 육즙(Luria broth)을 접종하였다. OD₆₀₀이 1.5로, 37℃의 온도에서 진탕 플라스크 세포 배양시키고, 최종농도가 0.5mM이 되도록 배지에 IPTG를 보충하여 37℃의 온도에서 2.5 내지 3시간동안 배양하였다. 세포배양물을 냉각조에서 4℃의 온도로 갑자기 냉각시키고, 원심분리하여 세포를 수확하였다. 전술한 바와 같이 성장한 1ℓ 배양물이 평균 3g의 세포(습식중량)로 얻어졌다.

얻어진 세포를 차가운 라이시스 완충액(Lysis buffer : 50mM MES, pH 6.0, 4mM EDTA)으로 한번 세척하고, 최종농도가 0.26세포(중량)/㎖가 되도록 재현탁시킨 다음 세포부유물을 다음 공정때까지 -70℃ 의 온도로 동결보관하였다.

French pressure cell(SLM-Aminco model #FA-079 fitted with piston #FA-073 and operated at 20,000psti, SLM Instruments,Inc. Urbana,Illinois) 에 2번 통과시켜서 전체 세포분해질을 만들고, 이 세포분해질을 얼음 위에서 2 내지 3시간 동안 10㎍의 DNase I/gr 세포(중량)로 배양하였다. 이어서 세포분해질을 작은 부분표본으로 나누어서 다음 공정때까지 -70℃의 온도로 동결보관한다. 5㎖의 세포분해질을 4℃의 온도에서 Eppendorff 마이크로 원심분리기로 30분동안 원심분리하여 세포분해질의 부유물과 세포분해질의 펠릿분획물을 얻고, 상기 펠릿분획물을 3㎖의 50mM Tris-HCI, pH 8.0, 4mM EDTA, 50mNDTT로 두번 세척하였다. 세척과정에서 생긴 부유물은 모아서 좀더 분석하기 위하여 보관하였다. 세척된 펠릿분획물을 3㎖의 50mM MES, pH 6.0, 4mM EDTA, 50mM DTT, 10M 우레아에 재현탁하여 용해시키고 실온에서 15분동안 배양하였다. 만일, 단백질 카바밀레이션(carbamylation)이 우레아 용해에 의해 일어날 수 있다면 전체 단백질 아미노기 위에 적당하고 친핵성 물질을 100배 초과하여 첨가함으로서 부반응을 억제할 수 있다. 이렇게 하여 형성된 용액을 Eppendorf 마이크로 원심분리기에서 4℃의 온도로 15분동안 원심분리하여 정제하고, 용해과정에서 생긴 모든 단백질이 그대로 포함된 부유물을 좀더 분석할 수 있도록 보관하였다. 잔류된 작은 펠릿분획물은 대부분이 파괴된 세포벽이고 일부는 단백질(FIBAC는 없음)인바, 이들은 버린다.

제조된 여러가지 분획물중에서 FIBAC를 구별해내기 위하여 SDS-PAGE와 항-FIBAC 항체를 가진 웨스턴 블로트(western blot)의 탐침을 사용하였다. IPTG-유도 JM107/pFibll로부터 얻어진 전체 세포분해질 단백질의 SDS-겔 분석은 약 20,000달톤(dalton)의 분자덩어리로 된 뚜렷한 단백질 띠가 나나났는데, 이는 JM107/pFibll가 포함되어 있지 않은 세포분해질의 겔 현상에서는 나타나지 않는 것이다. 20,000Da단백질과 더 빠른 이동밴드, 추측컨대 FIBAC의 분해 생성물은 웨스턴 블로트 분석에서 항-FIBAC 항체와 반응한다.

상기 단백질의 IPTG 유도 의존성, 분자량, 그리고 항-FIBAC 항체와의 반응성은 단백질의 발현된 재조합 FIBAC를 나타내는 것을 제시한다.

IPTG-유도 JM107/pFibll에서 얻어진 세포분해질 부유분획과 세포분해질 펠릿을 분석하면 FIBAC가 없는 것으로 나타났다. FIBAC의 덩어리가 세포분해질 펠릿분획물이 용해된 요소-DTT에서 발견되었다. 이것은 IPTG 유도에 있어서 FIBAC가 불용성 분획물로 축적하고 세척된 세포분해질 펠릿으로부터 본질적으로 정제된 형태로 단리될 수 있다는 것을 의미한다.

세포분해질 펠릿이 용해된 우레아-DTT을 CM-크로마토그래피의 시발물질로 사용하였다. 용해된 세포분해질 폘릿(16mg 단백질)의 부분표본 1.2㎖를 차거운 CM-완충액(50mm MES, pH 6.0, 6M urea, 14mM Z-ME)을 사용하여 25㎖로 희석하고, 4℃의 온도에서 완충액으로 미리 평형시킨 카르복시메틸 셀룰로오즈 컬럼(25×130mm)에 상기 샘플을 가한 다음, A₂₈₀이 베이스라인(base line)으로 되돌아올 때까지 CM-완충액으로 컬럼을 세척하였다. 흡수된 단백질을 CM-완충액내에서 NaCl 농도의 기울기가 선형(0-200mM)이 되도록 용출하였다. 전체 기울기 용적은 400㎖이고, 유속은 26㎖/hr이며, 5㎖의 분획물이 수거되었다. "흘러내린(flow-through)" 분획물(CM-FT)과 피크 분획물 58 내지 81을 모아서 SDS-PAGE로 분석하였다.

이들 분획물에 대한 전기영동 및 면역학적 분석에 의하면 약간의 변성된 FIBAC를 포함하는 재조합 FIBAC가 검출될 수 있는 다른 어떤 단백질은 포함하지 않고 약 120mM NaCl에서 용출된다는 것이 밝혀졌다. 사용된 크로마토그래피의 조건하에서는 대부분의 비 FIBAC 단백질이 CM-컬럼에 흡수되지 않았고 "흘러내린" 분획물에서 발견되었다.

상기 과정에서 얻어진 CM-정제 FIBAC의 양은 전체 세포단백질의 1.3%인 것으로 추정되었다. Bradford 단백질 분석은 단리 및 정제 과정에 있어서의 정량(quantitation)으로 사용하였다. 50mM MES, 6M 우레아, 14mM Z-메르켑토에탄올내에서 2㎖(100㎍)의 정제된 FIBAC를 Centirion 원심분리기에 의해서 200ℓ로 농축시키고 최종 Tris 농도가 0.5M이 되도록 pH 8.5인 2M Tris-HCI을 가함으로서 pH를8.5로 조정하였다. 이어서 FIBAC의 시스테인 잔기를³H-요오드 아세트산으로 카르복시메틸레이트화하고 알킬화반응 혼합물을 역상 HPLC로 탈열하였다.

변형된 FIBAC를 30%의 아세토니트릴 용액에서 용출하고 다음 분석을 하기 위하여 수거하고, HPLC에서 단리된 변형 FIBAC의 부분표본을 SDS-PAGE 분석하였다. 카르복시메틸화에 사용된(시발물질) CM-정제 FIBAC와 탈염 HPLC 및 알킬화후의 FIBAC를 비교해 본 결과, 변형된 FIBAC가 변형되지 않은 FIBAC보다 SDS겔에서 더 천천히 이동하는 것으로 밝혀졌다.

이와 같은 결과는 특히 FIBAC내에 존재하는 변형된 시스테인의 실질적인 수라는 관점에서 통상적인 실험결과와 다른 것이다.

다음으로, 자동적인 에드만 분해를 위한 Applied Biosystems(model 470A) 기체상 단백질 씨퀀서(Foster City, CA)로 카르복시메틸화된 FIBAC를 처리하여 처음 24잔기에 대한 아미노산 씨퀀스를 확인하였다. 에드만 분해의 처음 6싸이클에 대한 씨퀀싱 데이터를 다음 표에 나타내었다. 이 데이터는 정제된 FIBAC(C-T-V-P-P-…)의 N-말단 아미노산 씨퀀스가 천연 FIBAC에 대하여 미리 결정된 것과 동일하다는 것을 증명한다.

따라서, 성숙한 형태의 FIBAC 단백질을 생성하기 위하여 ompA-FIBAC 용해 단백질의 ala-cys 연결이 분열되므로서 pFibll이 재조합 FIBAC로 진행한다는 결론이 된다.

정제된 재조합 FIBAC의 N-말단 아미노산 씨퀀스 분석

(단백질을 씨퀀싱하기 전에 시스테인 잔기를³H-요오드아세트산으로 방사능 표지하였다.)

(나) 용해 분획물

시발물질에 대한 추가적인 오염때문에, 여기서 논의된 과정이 균일하게 분비된 초기 FIBAC의 결과에 따르지는 않지만 FIBAC가 원래의 형태로 리폴드될 수 있도록 충분히 정제하되, 연속적인 정제과정이 단리과정을 완성시키는데 사용될 수도 있다.

이러한 실시예에 있어서, 세포성장, 유도, 수확 및 전체 세포분해질의 제조는 전술한 실시예에서 설명하였다. 세포분해질의 어떤 분해물에서 FIBAC를 정제해내는 본 과정의 가능성을 증명하기 위하여, 균질물의 원심분리 분류법은 생략하고 그 대신에 전체 세포분해질을 10M 우레아, 4mM EDTA, 50mM DDT, 50mM MES, pH 6으로 만든 다음, 22℃의 온도에서 15분동안 배양하였다. 이어서 상기용액을 4℃의 온도에서 Eppendorf 마이크로 원심분리기로 15분동안 원심분리하였다. 펠릿을 제거하고 부유물은 CM-완충액(50mM MES, pH 6.0, 6M 우레아, 14mM Z-메르캡토에탄올)으로 희석시킨 다음, 전술한 실시예에서 설명한 바와 같이 크로마토그래피를 사용하여 카르복시메틸 셀룰로오스로 분류하였다. 약 120mM 염에서 약간의 변성된 FlBAC와 면역학적으로 무관한 몇가지 오염물질과 함께 FIBAC가 용출되었다.

SDS-PAGE 분석에 의한 FIBAC의 순도는 이러한 분획물내에서 전체 단백질의 50퍼센트보다 클 것으로 추정되는데 이와 같은 순도값에서는 다음 리폴딩 과정에 따라 FIBAC가 그들 본래의 구성대로 리폴드할 수있다.

상기 리폴드 FIBAC는 메탈로프로테이나제 억제제로서 충분한 기능을 가지며 음이온 교환 크로마토그래피에 의해서 좀더 정제될 수 있다.

음이온 교환 크로마토그래피는 600mM 우레아, 50mM Tris, pH 6으로 평형시킨 Whatman DE-52의10×100mm컬럼(Whatman Inc.Clifton, New Jersey)에서 효과적이었다. 5N NaOH를 점적하여 비정제 리폴드 FIBAC가 포함된 용액을 pH 9.6이 되도록 적정하고 DEAE 셀룰로오즈로 처리하였다. 흘러내린 분획물을 분석한 결과 FIBAC가 포함되어 있지 않은 것으로 나타났다. 면역학적으로 무관한 오염물은 메트릭스에 결합되어서 용액으로부터 제거되었다. 흘러내린 분획물은 다음과 같은 방법으로 CM-셀룰로오즈 컬럼에서 농축할 수 있다.

음이온 교환 컬럼에서 흘러내린 분획물을 5N HCI을 가하여 pH 7.5로 적정하고 이 용액을 600mM 우레아와 50mM Tris, pH 7.5로 미리 평형시킨 CM-셀룰로오스 컬럼(25×130mm)에 처리하였다. 용출된 단백질이 스펙트럼으로 나타나지 않을때까지 상기와 동일한 완충액으로 컬럼을 세척하고 이어서 NaCl 250㎖로 만들어진 상기 완충액으로 FIBAC를 용출한 다음, 피크단백질을 모아서 50mM Tris, pH 7.5에 대하여 평형이 되도록 투석하였다.

생성된 FlBAC의 전기영동적, 면역학적 및 기능적 분석은 순도가 90%이상인 활성 리폴드 콜라게나제 억제제를 나타낸다. 검출할 수 있는 유일한 오염물은 정제에 의하여 세포분해질에서 생성된 FIBAC 변성산물이다.

상기 오염물의 동일한 아미노말단 씨퀀스와 외형적인 분자덩어리 때문에 단백질 클립(clip)이 카르복시말단부에 인접하게 되는 것으로 결론지을 수 있으며, 이러한 물질은 좀더 정제함으로서 제거될 수 있다(예컨대, 리폴드된 FlBAC의 친화성 크로마토그래피나 고도의 분해(resolution)이온 교환 크로마토그래피).

[실시예 11]

[효모 FIBAC 발현 클론의 제조]

유전자 발현 및 단백질 방출벡터가 제조되는 다른 미생물에는 효모(Saccharomyces cerevisiae)가 있다. 효모 알파인자는 세포내에서 생성되어서 성장배지로 방출되는 짝호르몬(mating hormone)인데, 단일 펩티드 씨퀀스가 이 수송을 지시한다. FIBAC 정보 씨퀀스가 효모 알파요소 리더씨퀀스의 용해물을 FIBAC로 제조하기 위하여 효모 발현벡터에 클론된다. 먼저 플라스미드 pGS385의 유도체를 제조하였는데 플라스미드 pGS385는 다음과 같은 모양으로 되어 있다.

(1) 촉진자, 리더 펩티드, 폴리아데닐화 시그널 및 전사종결 시그널이 포함된 효모 알파요소 유전자 부분을 포함한다.

(2) 가장 멀리 떨어진 두 HindIII 위치 사이에 있는 알파요소 유전자 부분은 독특한 HindIII 위치를 만들면서 제거되어 있다.

(3) HindIII 위치에 독특한 SalI 위치 3' 를 포함한다.

(4) 복제의 pBR322 근원과 E.coli내에서 선택과 복제를 일으키는 앰피실린 내성 유전자를 갖는다.

플라스미드 pG385를 HindIII과 SalI로 분해하였다. HindIII 위치는 알파요소 리더씨퀀스의 카르복시 말단부를 정의한다. 합성 옥타뉴클레오티드 5'-AGCTTGCA-3'는 알파요소 C-말단을 FIBAC의 N-말단에 걸치게 하는데 사용하였는데 알파요소 전사-해독씨퀀스는 상기 벡터내에서 유전자 표현을 추진한다. 이어서 EcoRI로 분해하므로서 제거하고 플라스미드 pBR322의 유도체인 플라스미드 YiP5로 삽입된 완전한 알파요소-FIBAC 용해물은 효모 ura3 유전자를 포함한다.

상기 플라스미드는 염색체 ura3 장소에 완전한 플라스미드의 통합(integration)을 지시하기 위하여 S.cerevisiae로 바뀌고 ura3내에서 유일한 StuI 위치가 분해된 후에 발현벡터로서 사용하기에 적당하다. 이러한 YiP5의 알파-FIBAC 용해 유도체의 통합물이 얻어지고, 여기서 생성되며, 그리고 콜로니 스크리닝(colony screening) 기술에 의해서 결정된 것과 같이 면역 반응성물질을 분비한다.

[실시예 12]

[동물세포내에서 재조합 FIBAC의 발현]

본 실시예에서는 동물세포내에서 FIBAC를 생산하기 위한 두개의 발현계가 제시되었다. 첫번째는 COS-1 세포내에서 전사를 지시하는 SV 40만기(late) 촉진자를 합병(incorporate)한다. 이 표현계는 COS-1 세포내에서 FIBAC의 수송과 후-해독병경, 그리고 단백질 합성 및 발현을 연구하는데 매우 유용한 바, 상기계는 빠르고 편리하기는 하지만 COS-1 원숭이 세포선(line)에 국한된다. SV 40 발현 플라스미드는 pJC119의 유도체이며 이에 대한 제조방법은 Sprague, J., Condra, J.H., Arnheiter, H. 및 Lazzarini,R.A., J.Virol. 45 : 773-781(1983)에 자세히 기술되어 있다.

자연에 존재하는 시그널씨퀀스를 포함하는 완전한 FIBAC 정보지역은 부분적인 cDNA 클론으로부터 조립하였다. 전구물 펩티드에 대한 시발인자 메티오닌과 일치하는 NcoI 위치는 짧은 합성 올리고뉴클레오티드를 통하여 pJC119내의 유일한 XhoI에 연결될 수 있다. 완전한 FIBAC 정보지역과 3' 비해독 씨퀀스는 SV40 만기 촉진자에 의해 전사가 지시되는 상기 위치에 삽입된다. 이 플라스미드는 복제의 SV40 기원, 복제의 pBR322 기원, 그리고 앰피실린 내성 선택 제조인자를 포함한다.

두번째 계는 인체세포선의 FIBAC를 안정하고 연속적으로 표현하기 때문에 동물세포내에서 FIBAC를 생산하는데 바람직하다. 이 벡터는 pBPV52-1의 유도체이며 이에 대해서는 참고문헌인 Florkiewica, R.Z.,Smith, A., Bergmann, J.E. 및 Rose, J.K., Cell Biol.97 : 1381-1388(1983)에 기술되어 있다. 이 플라스미드는 복제의 소와 유두종(bovine papilloma) 바이러스 근원, 복제의 pBR322 근원, 베다락타마제 유전자, 그리고 BPV DNA의 69%의 전형 분획의 형태로 되어 있다. 복제의 SV40 기원과 SV40 초기촉진자는상기 플라스미드에 클론된다.

인체세포내에서 벡터의 복제를 방해하는 pPR322의 씨퀀스는 제외된다. 상기 플라스미드로서, FIBAC cDNA의 완전한 정보부분이 SV40 초기촉진자에 의해서 그의 전사를 지시할 수 있도록 삽입된다.

이들 세포로부터의 분비 및 발현에 이어서 전술된 실시예 4 및 5에 따라 FIBAC를 배지에서 정제해 낼수 있다.

[실시예 13]

[리폴딩 FIBAC ]

FIBAC의 리흘딩을 관찰하기 위하여 2가지의 시험이 사용되었는데, 이들은 모두 원래의 구조를 갖는 FIBAC가 나타내는 기능적 영향을 측정한다. 첫번째 시험은¹⁴C-라벨된 콜라겐을 변성시키는 인체 섬유아세포 콜라게나제의 활성도에 있어서, 샘플의 억제효과를 측정하는 억제시험이고, 두번째 시험은 인체 콜라게나제에 대한 리폴드 FIBAC의 결합을 측정하는 번경된 ELISA이다.

콜라게나제 결합 ELISA는 FIBAC 활성도의 활성도가 검출된 1차분석이다. 여기서 콜라게나제를 96-웰 ImmulonII 플레이트(1.0㎍/㎖ in 50mM Tris, pH 8.2, 5mM CaCl₂: 웰당 100㎍)에 4℃의 온도로 하룻밤 동안 도포시켰다. 차단(blocking) 완충액내에서 희석된 FIBAC 표준 또는 미지의 샘플의 희석도를 변화시키면서 세척완충액(50mM Tris, pH 7.5, 5mM CaCl₂, 0.02% Tween-20)내에서 150㎕/웰의 3% BSA로 45분동안 웰을 차단시킨 후 웰(100㎕/웰)내로 피펫을 사용하여 옮겼다. 45분동안 배양(37℃)한 다음 웰을 세척 완충액으로 세번 세척하고 친화성-정제 토끼(Affinity-purified rabbit)와 항-FIBAC를 웰(diluted 1/100,100㎕/웰)에 가한 다음 37℃의 온도에서 45분동안 배양하였다. 웰을 다시 세척하고 알카리 포스파다제 접합된 염소 항-토끼 IgG(Sigma, 세척완충액으로 1/1000희석)을 웰(100㎕/웰)에 가한다. 이어서 37℃의 온도에서 한시간동안 배양시키고 웰을 마지막으로 세척한 다음 알카리 포스파타제 대체물(Sigma # 104-105, Img/㎖ in 10% 디에탄올아민, 100mM MgCl₂, pH 9.8)을 웰에 가한다. TitertekMultiskan MC ELlSA 전구물(Flow Labo-ratories)를 사용하여 495mm에서 현색(color development)을 관찰하였다. 천연의 FIBAC는 정량된 미지 샘플에 대한 표준 곡선을 제공한다.

콜라게나제 억제시험에 있어서,¹⁴C-라벨된 기니아피그의 피부 콜라겐 펠릿(25㎕/펠릿=2100cpm)을 50㎕의 트립신-활성화된 콜라게나제(약 75㎍/㎖ in 50mM Tris, pH 7.5, 10mM CaCl₂)로 분해하고¹⁴C를용액내로 방출시킨다.

상기 펠릿을 분해율에 준해서 1 내지 3시간동안 배양한 다음 100㎕의 Tris 완충액을 가하여 반응을 정지시키고 10,000rpm으로 10분동안 원심분리한다.

형성된 부유물을 3㎖의 휘광액(Scintillation fluid)이 포함된 휘광 바이알에 피폣으로 옮기고 계산하였다. 콜라겐 펠릿에 용액을 가하기 전에 표준 또는 정제된 FIBAC의 다양한 희석물 50㎕로 콜라게나제를 예비 배양하는 것은 콜라겐의 분해와¹⁴C를 용액내로 연속 방출하는 것을 방해할 것이다.

미지 샘플의 억제 활성도의 정량분석은 시험에 사용된 활성 콜라게나제의 양에 의존하는바, 미지 샘플의 활성도는 억제제와 효소사이의 1 : 1분자비율을 가정하므로서 계산될 수 있다.

이러한 시험을 사용하며, 단백질 농도, 산화된 글루타티온 농도, pH 및 온도 등에 관해서 리폴딩 과정의 친화도를 측정하였다. 이러한 파라메타의 모든 조합이 완전하게 측정되지 않은 반면에 과정은 효과적으로 원형으로 재현되도록 개발되었다.

FIBAC의 리폴딩은 리폴딩되는 FIBAC의 농도에 거의 의존하며, 산화조건하에서는 희석용액은 내부사슬(interchain) 디설파이드의 형성을 방해하며, 결국 집합체의 침전이 생긴다.

정제된 재조합 FIBAC는 리폴드될 수 있고, 다음과 같은 방법에 의해시 100%의 단백질 회수율을 가진다.

(1) 6M 우레아, 50MES, pH 6.0, 14mM 2-메르캡토에탄올 내에서 희석하고 정제된 FIBAC(300㎍/㎖이하)를 70mM의 산화된 글루타티온 존재하에서 배양한다.

(2) 실온에서 10분동안 배양시킨 다음, 샘플을 50mM Tris, pH 9.0으로 10배 희석한다.

(3) 샘플을 4℃의 온도에서 하룻밤동안 배양한다.

상기 재활성화된 물질의 SDS-PAGE 분석은 완전한 FIBAC와 분해된 FIBAC의 존재를 모두 나타내었다. 분해된 FIBAC는 정제과정을 통해서 나왔으며 재활성 과정에서는 더이상의 분해는 나타나지 않았다.

상기 용해된 FIBAC는 콜라게나제 결합 활성(ELISA)과 콜라게나제 억제활성을 모두 가지는 것으로 나타났다. 단백질의 양에 관련된 활성도는 콜라게나제 억제제 시험에 의해 결정된 90%보다 큰 것으로 나타났는데, 이 수치는 시험에 있어서 콜라게나제의 추정량에 근거한 계산으로부터 유도되었으나, 추정된 값이기는 하지만 50% 이상 떨어진 것으로 생각되지는 않는다.

FIBAC 표준에 대하여 측정된 것과 같이 결합활성도는 다른 샘플의 비교반응을 관찰할 수 있게 하였다. 50%의 순수한 FIBAC 제조물에 리폴딩 과정이 나타났다. 허용할 수 있는 오염 단백질의 양과 특성은 여전히 불확실하지만 약간의 활성 FIBAC가 정제과정 없이 전체 세포분해질에서 검출되어 적어도 약간의 생성물이 5% 순도이하에서 얻을 수 있음을 증명하였다.

본 발명에 따른 방법 및 제조물은 숙련된 기술자에 의해서 다양하게 수정 또는 변화될 수 있는 바, 본 발명은 첨부된 특허청구의 범위와 이에 상응하는 범위내에서의수정 및 변화를 포함한다.

Claims (18)

1. (1) 메탈로프로테이나제 억제제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 씨퀀스를 포함하는 벡터를 함유하는 숙주미생물을 제조하고, (2) 상기 억제제의 발현에 적절한 조건하에서 상기 숙주미생물을 배양하고, (3) 얻어진 억제제를 수확하는 것으로 이루어진 DNA 재조합 방법에 의해 미생물을 이용하여 메탈로프로테이나제 억제제를 제조하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 메탈로프로테이나제 억제제는 콜라게나제 억제제임을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 씨퀀스는 다음과 같은 씨퀀스 부분을 포함하는 것임을 특징으로하는 방법.

   

   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 씨퀀스를 포함하는 상기 벡터는 pUC9-F5/237 p10임을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 숙주미생물은 박테리아임을 특징으로 하는 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 박테리아는 Bacillus 중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 박테리아는 Bacillus subtilis임을 특징으로 하는 방법.
8. 제 5 항에 있어서, 상기 박테리아는 Escherichia coli임을 특징으로 하는 방법.
9. 제 5 항에 있어서, 상기 박테리아는 Pseudomonas 중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 박테리아는 Pseudomonas aeruginosa임을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1 항에 있어서, 상기 숙주미생물은 효모임을 특징으로 하는 방법.
12. 제 11 항에 있어서, 효모는 Saccharomyces cerevisiae임을 특징으로 하는 방법.
13. 제 1 항에 있어서, 상기 억제제는 활성의 3차 구조로 되기 전에 얻어짐을 특징으로 하는 방법.
14. 제 1 항에 있어서, 상기 억제제는 얻어지기 전에 활성의 3차 구조로 되도록 함을 특징으로 하는 방법.
15. 제 1 항에 있어서, 메탈로프로테이나제 억제제는 사람의 피부 섬유아세포로부터 단리될 수 있는 콜라게나제 억제제와 생물학적으로 균등한 것임을 특징으로 하는 억제제.
16. (1) 메탈로프로테이나제 억제제를 코딩하는 뉴클레오티드 씨퀀스를 포함하는 벡터를 함유하는 숙주동물 세포를 제조하고,(2) 상기 억제제의 발현에 적절한 조건하에서 상기 숙주동물 세포를 배양하고, (3) 얻어진 억제제를 수확하는 것으로 이루어진 DNA 재조합 방법에 의해 동물세포로부터 메탈로프로테이나제 억제제를 제조하는 방법.
17. 제 16 항에 있어서, 상기 벡터는 동물세포 숙주로 전이되기 이전에 미생물 숙주내에서 증식되어짐을 특징으로 하는 방법.
18. 제 17 항에 있어서, 상기 벡터는 다음과 같은 DNA 씨퀀스 부분을 포함하고 있음을 특징으로 하는 방법.