JPS62502101A - メタロプロテイナ−ゼ阻害剤の配列をもつ組換ベクタ−系及びメタロプロテイナ−ゼ阻害剤製造のための組換ｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 メタロブロティナーゼ阻害剤の配列をもっ組換ベクター系及びメタロブ０テイナ ーゼ阻害剤ロ造のための組換ＤＮＡ 背景技術 この発明は、１９８５年２月５日登録の米国特許出願第６９９１８１号の部分継 続出願である１９８５年１０月４日登録の米国特許出願第７８４３１９号の部分 継続出願である。内在性蛋白分解酵素は、侵入してきた生物体、抗原−抗体複合 体、及び、生物体にはもはや不要のあるいは役立たないある種の組織蛋白を分解 する役割をもつ。正常に機能する生物では、蛋白分解酵素は、限定された量で生 産され、特異的な阻害剤により一部調節される。

メタロブＯティナーゼは、結合組織の分解にしばしば関与する体内に存在する酵 素である。いくらかの結合組織の分解は生物の正常な機能には必要である一方、 過剰の結合組織分解がいくつかの疾病状態で起きており、少なくとも一部分は、 過」［のメタロプロティナーゼのためであると信じられている。メタロブ０テイ ナーゼは少なくとも歯根膜の疾病、角膜及び皮膚の潰瘍、リューマチ様関節炎及 び癌様の固形！！瘍の展開に関連すると信じられている。

これらの疾病は通常結合組織の特定の形態であるコラーゲンを高い割合で含む体 内の領域で起きる。結合組織のこれらの疾病をもつ患者の試験から、コラーゲン プロテオグリカン及びエラスチンを含む結合組織の各種成分の過剰な破壊が明ら かとなった。それ故、例えば、コラゲナーゼ、プロテオグリコナーゼ、ゲラチナ ーゼ及びある種のエラスターゼのような特定のメタロプロテイナーゼの過剰濃度 が、前記の疾病を伴う結合組織破壊を引き起こし、あるいは悪化させることが推 測された。

正常状態で体は、結合組織基質にメタロプロテイナーゼが作用するのを効果的に 妨げるようにこれらのひ素に結合するメタロプロテイナーゼ阻害剤を有している 。特に、Ｉａ際な生物では、メタロプロテイナーゼ阻害剤は、過剰のメタロプロ テイナーゼを結合しつつ充分量のメタロプロテイナーゼを活性のあるままにさせ る範囲までメタロプロテイナーゼと相互作用するのに充分な濃度で存在し、その 結果各種疾病で見られる結合組織の損傷は起こらない。

前述の疾病状態に存在する結合組織破壊の１つの直接の原因は、メタロプロテイ ナーゼ／メタロプロテイナーゼ阻害剤の相対的な濃度の不均衡であると仮定され ている。これらの場合において、過剰量の活性メタロプロテイナーゼ、あるいは 活性メタＯプロテイナーゼ阻害剤の口の欠乏のために、過剰のメタロプロテイナ ーゼが、疾病を引き起こしあるいは悪化させるような結合組織の分解を起こすと 信じられている。結合組織の疾病をもつ人をメタロブロティナーゼ阻害剤で処置 することにより、過剰のメタロブロティナーゼの分解作用は縮小されあるいは停 止されることが仮定される。それ故、本発明者にとって特定の興味ある特定のメ タロブＯティナーゼ阻害剤は、これらの阻害剤が医薬的に結合組織の疾病の処置 あるいは妨害に役立つと信じられているので、コラゲナーゼ阻害剤である。

メタロプロテイナーゼ及びメタロプロテイナーゼ阻害剤の存在は、科学文献で議 論されている。例えばセラーズ等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル ・リサーチ・コミュニケーション、第８７巻、５８１−５８７ページ（１９７９ 年）は、ウサギの骨のコラゲナーゼ阻害剤の分離を議論している。ヒト皮膚繊維 芽細胞から分離されるコラゲナーゼ阻害剤は、ストリックリンとつ（１９８３年 ）及びウェルガスとストリックリン、ｚヱーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ ストリー、第２５８巻、１２２５’９−１２２６４ページ＜１９８３年）に８１ 年）及びコーストン等、２二二二Ｌリヨ乙（２−二）−ン」ミニーリューマテイ ズム、第２７巻、２８５ページ（１９８４年）にＶｉｍされている。さらに、メ タＯプロテイナーゼ阻害剤は、セルラー・インターラクションズ（細胞相互作用 ）、ディンゲルとゴートン’＆　（１９８１年）の中でレイノルズ等により議論 されている。これらの論文は、特定の分離されたメタロプロテイナーゼ阻害剤を 特徴づけし、ある程度まで結合組織の疾病の処置におけるメタロプロテイナーゼ の役割あるいは潜在的な役割を議論し、この破壊を妨げるメタロブＯテイナーゼ 阻害剤の能力を推測しているのだが、以前には、これらの研究者の誰も、メタロ ブＯテイナーゼ阻害剤の細胞内生産を指揮することのできる簡易ＤＮＡ配列を分 離し、あるいは、これらの阻害剤の生産のための組換えＤＮＡ法を創造すること はできなかった。

驚くべきことに、本発明者は、メタＯプロテイナーゼ阻害剤の粗換えＤＮＡ合成 を指揮できる簡易ＤＮＡ配列を発見した。これらのメタロプロテイナーゼ阻害剤 は、生物学的にヒト皮膚繊維芽細胞の培養から分離されたものと等価である。こ こで述べられている組換えＤＮＡ法によりＬ’Ｊ’ＳＩされた本発明のメタロプ ロテイナーゼ阻害剤は、メタロプロテイナーゼにより誘導される結合組織の疾病 の予防及び処置についての拡大研究を可能にする。

さらに、本発明のメタロプロテイナーゼ阻害剤は、疾病状態に伴う過剰のメタロ プロテイナーゼを含むメタロプロテイナーゼを中和するのに役立つ。それ故、活 性成分として本発明のメタロプロテイナーゼ阻害剤を具象化するこれらの疾病の 治療法が開発されると信じられている。

さらに、この新しく発見された本発明のメクロブＯテイナーゼ阻害剤は、その阻 害剤を用いて、結合組織の分解疾病に対する診断試験の開発方法で、メタロプロ テイナーゼの標的と相互作用することができる。

ここで３Ｍ　Ｂされている組換えメタロプロテイナーゼ阻害剤は、そのメタロプ ロテイナーゼ標的と化学ｍ論的に（即ち、１：１の割合で）相互作用する。さら に、これらのメタロブＯテイナーゼ阻害剤は熱耐性、酸安定、グリコシレージョ ンされており、高等電点を示す。

発明の開示 本発明は、メタロブＯテイナーゼ阻害剤及びそれを生産する組換えＤＮＡ法及び メタＯプロテイナーゼ阻害剤の細胞内生産を指揮することができる簡易ＤＮＡ配 列に関する。特に、本発明は、コラゲナーゼ阻害剤、それを生産するための組換 えＤＮＡ法及び組換え法に利用するための簡易ＤＮＡ配列に関する。本発明は又 、これらの簡易ＤＮＡ配列を含む一連のベクターに関する。

本発明の１つの目的は、メタロプロテイナーゼ阻害剤活性をもつ経済的な医薬成 分を供給するため、充分なＭと純度で生産されるメタロプロテイナーゼ阻害剤を 供給することである。

本発明の別の目的は、これらのメタロプロテイナーゼ阻害剤の生産のための粗換 えＤＮＡ法を供給することである。この方法により生産された組換えメタロブ０ テイナーゼ阻害剤は、生物学的に、ヒト皮Ｆ４ｍ維芽：ａｌ胞の培養から分離さ れるメタロプロテイナーゼ阻害剤と等価である。

これらのメタロプロテイナーゼ阻害剤の組換えＤＮＡ合成を促進するために、本 発明のもう一つ目的は、メタロプロテイナーゼ阻害剤の＋ｉ１１胞内生産を指揮 することがでそる簡易ＤＮＡ配列を供給することがある。又、本発明の目的は、 これらの簡易配列を含むクローニング・ベクターを供給することである。これら のベクターは、医るために組換え系に使用することができる。

発明の更に別の目的及び利点は以下記述の部に述べられ、一部は記述から自明と なりこの発明の実践から習得しうるちのとなろう。これらの目的と利点は、特許 請求の範囲に特に指摘されている手段と組合わせにより実現達成される。

これらの目的を達するため、本発明の目的に従い、メタロプロテイナーゼと化学 量論的に反応することができるメタロプロテイナーゼ阻害剤が述べられている。

これらのメタロブ０テイナーゼ阻害剤は著しく熱耐性で酸に安定、グリコシレー ジョンされており、高い等電点を示した。さらに、これらのメタロプロテイナー ゼ阻害剤はヒト皮膚繊維芽細胞の培養から分離される阻害剤と生物学的に同等で ある。

さらにこれらの目的を達成するため、かつ本発明の目的に従い、実像化され、こ の中で広く述べられているようにメタロブ０テイナーゼ阻害剤をコードする簡易 ＤＮＡ配列が準備される。これらの配列は、メタロブ０テイナーゼ阻害剤の細胞 内生産を指揮できるヌクレオチド配列から成る。簡易配列は合成配列又は制限断 片（“天然”ＤＮＡ配列）のいずれでも良い。最良の形態では、簡易ＤＮＡ配列 は、ヒト繊維芽細胞Ｃ［）ＮＡライブラリーから分離され、ヒト皮ｓｉ維芽細胞 培養から分離される阻害剤と生物学的に等価であ−るコラゲナーゼ阻害剤の細胞 内生産を指揮できる。

発見された最初の好ましいＤＮＡ配列の解読鎖は次のヌクレオチド配列をもつ。

λＡＣＣλＧ：％Ｃ：λ　Ｃ二ττ入丁入ＣＣλ　ＧＣＧフτλフＧλＧｋτＣ λＡＧλτＧ入　ＣＣλλＧλτＧτ入　τλλλＧＧＧフ■b コ１０　コ２０　３コロ　３４０　３５０　コロ。

ＣＡＧＳ入ＴＧＧλＣτＣフフクＣλＣλフ　Ｃ入Ｃフ入Ｃ；τＧＣ入ＧフτＴ ＣＧτＧＧＣフＣ（ＣτＣａλ入　ＣλＧＣＣ）Ｇ入ＧＣ５５０５ｏ　０　５７ ０　５　ｏｏ　５９０　ｏ　００Ｇ／％Ｇこ：λＧＧ’ＪＣ？ＧフＧこλＣ：τ り　ＧＣ入ＧτＣ：：τＧ　ＣＧｅ；τＣ：；λＧ入　τλ（、ＣＣτＣλλτ 　Ｃ；τＧ：梶F、４コＣ入 Ｇ？ＧＯλｋＧｃ？Ｇ　λλＧζ：）ＧＣＣＡＣλＧＴＯＴＣＣλｃｃ　ｃ＝Ｃ τフＣＣＣλＣτＣＣＣｋＴＣ，−−Ｃ？−、ＣＣＧＧＡＣ` ６７０　６ａＯ６９０フへ０ ＡτＣλλ八τλλλ　Ｇ；％Ｇττ入Ｃ＝入ＣＣＣλＧＣλλλλ入　λλλ λλＡＧＯλ八　でτＣ上記略記号によりあられされたヌクレオチドは、発明を 実施するための最良の形態の項に述べられている。

開始配列の５′に付加的なヌクレオチド配列をもつ第２の好ましいＤＮＡ配列が 発見された。８２番目から４３２番目のヌクレオチドとして、上述の第１の配列 の１番目から３５１番目のヌクレオチドを含むこの配列は次のヌクレオチド配列 をもつ。

ＧＧＣＣλ”（ＧＣ：　ＧＣＡＧＡ：Ｃ５ｔｈ−Ｇ　Ｃ５ＣＣＣ）＋ＧλＧＡ　 （ｉＡ（λα’ＪｓＧＡＧ　υ心αスＣＣλτｃ、、＝ｅｃF＝ ７ｏ　父　９０　１００　１１０　１２０ＧＡＣ”：、Ｃ：τＧＧＣ”：”：Ｃ ７０こλ：Ｃ；　τＧフτＧフフＧＣフ　Ｇ７ＧりＣτＣλτ入　ＧＣＣ；口λ ＧｃλＧ　ＧＧζ；フfＣλｃｃ １３０　１４０　１５０　１ｇｏ　１７０　Ｌミ０ＴＧＴＯＴＣ：ＣＡＣＣＣ； ＡＣ’ニーＣＡＣＡ　ＧＭＣ’−ＧＣＣＣＣフッ　ＴＧＣλλτ）ＣＣＧ　ｋＣ ＣＣＣフッＣλτ　Ｃ，１（ｚ唐fｃｃλＡＧ １９０　２００　２１０　２２０　２’０　２４０ＴＴＣＧＴＧＧＧＧλ　０１ ＣＣ入ＧＡＡＧ？　ＣＡＡＣＣＡＧＡ（ＣＡｃｅ〕τλτλＣＣλＧＣ０Ｔ−， Ａ？ＧＡ　ＧＡτＣλ入Ｇ入τf Ｃ；τＣ：＝τＧＧＡλζ 第２の配列の５′領域と第１の配列の３′領域を合わせた第３の好ましい配列は 次のヌクレオチド配列をもつゆフＱ　８０　９０　Ｗｏｏ　１１０　１２０ＧＡ ＣＣＣ口τＧＧζ　Ｔ？Ｃ？ＧｅλτＣＣτＧフτＧフτＧＣフ　ＧフＧＧＣτ ＧＡＴ入　ＧＣＣにλＧＣλＧ　ＧＧＣＣ’：ＧＣ：Ｃb ｌ３０　１４０　１５０　ＬｌｉＯ１７０ＬａＯτＧ７Ｇ？ＣＣ：λＣＣ：口＾ ＣＣＣλＣλ　Ｇ入ＣＧＧＣ：ττＣτａＣλ入ττＣＣａ　λＣＣフｃｃ’ｒ ｃ＾ＴＣ入ＧＧＧＣＣλ入Ｇ１９０　２００　２ｉ０　２２０　２コ０　２４゜ ττＣＣ７ＧＧＧＧλ　ＣＡＣ；λＧ入ＡＧフ　Ｃλλｃｅ入ＧλＣ：　λＣＣ フフλτλＣＣλＧＣＧフフ入τＧ入　ＧλτＣ入λＧλフf ２５０　２６０　２７０　２８０　２９０　！００ＡＣＣλλＧλフＧフ　λτ λλ入ＧＧＧフτ　（Ｃ入λＧＣＣτ）入　ＧＧＧＧ入フｃ＝ｃｃ　ｃフＧλＣ λτＣに　ＧτフＣＳτＣフλb コニロ　３２ｏ　３コ０　３４ｏ　コ５０　３６０ＡＣ：：：：りＣ二λτＧＧ λＧλＧτＧτＣフクＣ工λ：λＣτフＣ二λＣλＧＧτＣＣ０眠ンλＣＣＳ　 Ｃ入ＧζＧλＧＯλＧ３７０　３＋！０　３９０　４００　４１０　４２０τフ τＣ″＋ＣλτフＧＣτＧＧλλλ入Ｃフ　ＣＣλＧＧ入フＣＧλ　ＣＣＣフッ ＧごλＣ入　τＣλＣτλＣＣフＧ　ＣλＧフフフＣＳtＧ ４３０　４４０　４５０　４６０　４７０　４ε口ＧＣＴＣ８：ＣＴＣａ’：入 　ＡＣＡＧＣＣ”ＧＡＧ　Ｃ７ＴλＧＣ：ＣＡＣ（５ＣＣＧＧＧＧＣＴ　ＴＣＡ ＣＣＡＡＧＡＣＣ’：λＣｋＣh：ＧＴ”： ４９０　５００　５１０　５２０　５コ０　５４０ＧＧＣ−；τＧλＧＧ　六入 ）ＧＣλＣλＧτ　ＧフッでＣＣ口τＧτ　τフλτＣｅλフＣ（：　ＣＣ）Ｑ ＣλλλＣフ　ＧＣ入ＧλＧフp５（ ５５０　’　５６０　５フ０　５ａＯ５９０６００現在のところ、動物細胞で迅 速なメタロプロテイナーゼ阻害剤の発現のためには、本発明者らｔま第４の好ま しいＤＮＡ配列を利用する方法が最も好ましいと考えてしする。この配列の解読 類は以下のように読む。

７０　８０　９０　１口０　１１０　１２０１９０　２００　２’０　２２０　 ２コロ　２４０３１０　コ２０　３コ０　コ４０　３５０　コロ０τλｔニア％ ｃ：：：＝　ｃ：λＴＧＧＡＧλＧ　ＴＧＴＣフＧＣＧＧＡ　？ＡＣ−−ＣＣＡ ＣλＧＧＴＣにλＣＡ；ｓ　Ｃ：ＳＣλＧＣＧFＧ ３ａＯ３９０４００４１０４２０ ＧＡＣＴフフ；フＣλ　ττＧＣフＧＧλλλ　λＣＣ６０λＧＧ入τ　ＧＧ入 Ｃ：ＣフフＧＣλＣ入τＣ入ＣτλＣＣフクζλＧτフτＣ４３０４ＡＱ　４！ ０　４６０　４７０　４ａＯＧτＣＳごＣ：：フ　（−Ｇλ入Ｃ入ＧＣＣ）　Ｇ λＧＣττλＧＣτ　ＣλＣ−＝りＣ：製ＧＧＣ−τＣλＣ＝弘　Ｃλ二：τλ Ｃλ；τ４９０　５００　５１０　５２０　５２０　５　ｑ　ＣＧτフＧＯこτ Ｇ″：Ｃλｃ＝λ入τＣＣλＣλＧτＣフフτＣ：ＣτＣτττλフＣ；λ　τ Ｃ−：τＧこ入λ　λＣ？Ｇ、ｌ：λＧＡＣ■ ５５０　５６０　５７０　５ａＯ５９０６００ＧＯζλこτ：ンτフ　ＧＣττ ＳτりＣλＣＧり入Ｃ：λＧこτＣＣフＣＣλ入ＧＳＣτ　ＣτＣλλλλＧＧ Ｇ　ＣττＣＣ入Ｇフに６Ｌり　６２つ　６コ０　６４０　６ミ０　６６０Ｃ＝ ＣλＣ：？？Ｓ　Ｃ：：ＳＣＣフＧＣＣ７（コＧＧＡＧＣＣ：Ａ　ＧＧＧＣ”： Ｇ）ＧＣλ　Ｃ：ツクＧこＡＧＴＣＣＣＴＣ＋Ｃ：Ｇ−A：Ｃ ６フ０　６８０　６９０　７００　７１０　７２０ＣλＧλフλＧζ；フ　Ｇλ λ：Ｃ：フに：　ＣＧＧλＧ＝＝ｓλλ　ＧＣフＧλ入ＧＣ：フ　ＧζλＣλＧ τＧτＣＣ入ＣＣｅフＧττ；フ３０　フ４０　７５０　７６０　７フ０　７８ ０にλＣτ口２こ入フ　ＣτでτＣτフＣＣＳ　ＧλＣ入Ａτり入λλ　τλλ λＧ入Ｇττ入ＣＣλＣＣＣλＧこλ　λ−−υり一−スλ本発明に使用するた めの天然のＤＮＡ配列の同定及び分離を進めるために、ヒト反日繊維芽細胞ｃＤ ＮＡライブラリーを開発した。このライブラリーは、本発明のメタロブＯテイナ ーゼ阻害剤を合成するための細胞を指運できる遺伝情報を含む。ここに述べられ ている粗換えＤＮＡ法に用いられている他の天然のＤＮＡ配列はヒトのゲノムラ イブラリーから分離される。

更に、本発明の方法に役立つ簡易ＤＮＡ配列は、合成野における通常の知識を有 する者により既知のポリヌクレオチド合成及びシーケンシング技術によりｉｎさ れる。

さらに、これらの目的を達するために、本発明の意図するところに従い、上記簡 易ＤＮＡ配列を用いたメタロブＯテイナーゼ阻害剤の微生物による製造に帰着す る租換えＤＮＡ法が明らかにされる。この組換えＤＮＡ法は、（６）　メタＯプ ロテイナーゼ阻害剤活性をもつ蛋白、好ましくはコラゲナーゼ阻害剤活性をもつ 蛋白を生産するために宿主微生物を指揮できる簡易ＤＮＡ配列の調製０　簡易Ｄ ＮＡ配列に対して操作しうる成分を含み、宿主微生物へ移行され、その中で複製 されるベクターへの簡易ＤＮＡ配列のクローニング （へ）　簡易ＤＮＡ配列及び操作成分を含むベクターのメタＯプロテイナーゼ阻 害剤蛋白を発現できる宿主微生物への移行 ゆ　ベクターの増幅及び阻害剤の発現に適当な条件下での宿主微生物の培養 （へ）（ｉ）　阻害剤の回収及び （ｉｉｌ　阻害剤に活性のある３次構造をとらせ、それによりメタロプロテイナ ーゼ阻害剤活性をもたせることから成る。尚、（ｅｖｉｌ又は（ｉｉ）の順序は いずれが先でも差支えない。

さらにこれらの目的を達成するために、さらに本発明の目的に従い、上述の簡易 ＤＮＡ配列の少なくとも１個を含む一連のクローニング・ベクターが準備される 。特に、プラスミドｐＬＪｃ９−Ｆ５／２３７Ｐ１０が明らかにされる。前述の 一般的記述及び以下の詳細な記述は本発明を例示的に説明するものであって、こ れによってこの発明が限定されるものではない。

この明刻書の一部として組込まれ、かつその一部を構成している各種の図表は、 発明の１つの実施態様を示し、記述の部分と共に、本発明の詳細な説明するもの である。

を−筋するための最　のに匹 図及び以下の実施例と共にこの発明の最良の形態についてふれながら、本発明の 詳細な説明する。

上述の様に、本発明は一つには、各種の宿主微生物において、メタロブＯテイナ ーゼ阻害剤の細胞内生産を指運できる簡易ＤＮＡ配列に関するものである。これ に関連して本発明においては“簡易ＤＮＡ配列″は、合成により生産されたヌク レオチド配列あるいは天然に存在するＤＮＡ配列の制限断片と意味するものであ る。また、この明細書では、゛メタロプロテイナーゼ阻害剤”は、アミノ酸配列 の細胞内生産を指揮し、翻訳後修飾を含むあるいは含まないデオキシリボ核酸配 列に存在するコドンにより定義されるような蛋白の１次構造を意味する。

そのような翻訳後修飾に例えばグリコシレージョンを含むことが期待される。さ らに、゛メタロプロテイナーゼ阻害剤”という語は、微生物から排泄されるよう な蛋白ようなメチオニルーメタロプロテイナーゼ阻害剤と解釈するように意図さ れている。

好ましい形態としては、簡易ＤＮＡ配列は、コラゲナーゼ阻害剤の細胞内生産を 指揮できるものである。特に好ましい形態としては、簡易ＤＮＡ配列は、ヒト皮 Ｆ３＄維芽細胞培養から以前に分離されたものと生物学的に等価のコラゲナーゼ 阻害剤の１ｉｉｌｌ胞内生産を指揮できるものである。明′ｉａ凹及び特許請求 の範囲の中で用いられているような“生物学的に同等”という用語は、本発明の 簡易ＤＮＡ配列用いて生産される阻害剤は、同−型のコラゲナーゼにより誘導さ れる組織損傷を妨げることはできる′が、必ずしも天然のヒトコラゲナーゼ阻害 剤、特に、ヒト皮Ｆ：４Ｒ維芽細胞培養から分離されたヒトコラゲナーゼ阻害剤 と同等でなければならないことを意味する。

本発明の第１の最良の簡易ＤＮＡ配列は次の様なヌクレオチド配列をもつ。

１０２０コ０４０５０６０ ＧττＣτ＋″ＧＣτＧ　τＧＧＣ”：ＣλτλＧ　ＣＣＣＣλＧζλＧＧ　Ｇ ｅｅτＧＣλＣ；τ　ＧＴＧＴｃｃ；入ＣＣＣＣＡＣロＣλb入Ｇ ７ｏ　ε０　９０　１ｏｏ　ｌ工０　１２０ｋＣＧＧＣＣＴ−、Ｃフ　ＧＣＡＡ ＴＴＣ（Ｓλ　ＣＣ？ＣＧＴＣλτＣＡＧＧＧＣ口λＡＧ？　ＴＣＧＴＧＧＧＧ 入Ｃ：　ＡＣＣＡＧＡＡf？（ １３０１４０１５０１６０１７０Ｌ８０λλＣＣλＧＡＣＣ入　Ｃ口ττλτλ ＣＣλ　ＧＣＧτ〕入τＳ入Ｇ　入フＣλλＧλτＧλ　Ｃロλ入Ｇλ７ＧフＡ 　τλ人λＧＧＧフ■b １９０２００２１０２：！０　２コ０　２４゜ＣλλＧＣＣＴＴλＧ　ＧＧＧλ τＧ（Ｃ１：ＧＣτＧ入ＣＡＴＣ：ＧＯττＣＧＴＣ）λＣλ　ＣＣＣＣ１１： Ｓ（：ＡＴ　ＣｔＧｋＧＱAＣＴＧＴＣ ２５０２６０２７０２ｓ０２９０３００τＧＣＳＧλＴ入ＣＴ　ＴＣＣλＣλＧ ＧＴＣＣＣλＣλＡＣＣＧＣλＧＣＯＡＧＯＡＣＴ　Ｔ”：ＣτＣλττＧＣＴ ＧＧλλ人ＡＣＴＧ５５’　５６０　５７０　５ａ０　５９０ＧλＣζこλＧＧ ＧＣτＧ”；：ＧｃλＣ二″＋ＧＧＣλＧＴＣＣ；”：Ｇ　ＣＧＧ）ＣＣＣＣ１ １τλＧｅｅフＧλλＴ　ｃ＝τＱ（：＋RＧ入 ６１０　６２０　６コ０　６４０　６５０Ｇ？０ＧＡＡＧＣｒＧ　λ入ＧＣＣ７ ”−ＣＡＣＡＧＴＧＴＣ口、、ＣＣＣ）ＣフτＣＣＣλＣτＣご；λτＣττフ 　ＣフτＣＣ；ＳλＣ■ ６７０６ａＯ６９０フＯ０ 入τＧλλλ：λλ入　ＧλＧττ入Ｃ；λｃ　ｃこ入ＧこλＡλλＡ　λ入λ λＡＡＧＧλλ　Ｔフにの中で、次のヌクレオチドは、下に示すような省略であ られされている。

ヌクレオチド　１−一旦 デオキシアデニル酸　Ａ デオキシグアニル酸　Ｇ デオキシシチジル酸　Ｃ チミジル酸　Ｔ 本発明の第２の最良の簡易ＤＮＡ配列は、次のヌクレオチド配列をもつ。

この第２の配列において、読み取り枠はヌクレオチドの１番から４３２番目に存 在している。この読み取り枠の最初のメチオニンは、ヌクレオチド４９番から５ １番に９番目から１１４番目により指令されるアミノ酸配列は、注目されるべき である。この配列は、ヒト蛋白のリーダーペプチドであると信じられる。

第３の最良の簡易ＤＮＡ配列は、次のヌクレオチド配列をもつ。

ＧＧＣＣλτＣＧＣＣＧＣＡＧＡフＣＣλＧ　ＣＧＣ’：：入ＧλＧλ　Ｇ入Ｃ 入Ｃ口λＧλＧ　λ入ｃｃｃ入ＣＣλフ　ＧＧＣＣＣＣＣτ■■ ７０　εＯ’９０　１００　ＬＬＯＬ２０ＧλＣＣ：Ｃ：ＧＧＣ７：Ｃ”：ＧＣ λ？ＣＣＴＧＴ　ＴＧＴ”：ＧＣ”　ＧフＧＧｃフＧλτλ　Ｇｃ：：：λＧＣ λＧ　ＧＧＣＣフＧζ■b： １３０　１４０　１５０　１６０　１７０　Ｌε０τＧτＧＴＣＣ’Ｃ；ｓＣＣ ＣＣ入ＣＣＣＡＣＡ　ＧλＣＧＧＣＣ’？’：ＣＴＧＣＡＡＴ”：Ｃ’：Ｓ　Ａ ＣＣ？ＣＧ？ＣＡＴ　ＣλＧＧfＣ二λ入Ｇ １９０　２００　２Ｌ０　、　２ス０　２コ０　２４０ττＣＧτ”ａＧＧｓλ 　ＣλＣＣλＧλＡＧフ　ＣλλＣ：λＧλＣ：　λＣＣフフλフλＣｃ　λＧ ＣクフτλτＧλ　Ｇ入τロλλＧ■tＧ ３ＬＯ３２０３３０３４０３５０３６０４９０５００５１０５２０５３０’　５ ４０ＧＧＣ：ＧτＧλＧＧ　λ入τＱＣλＣλＧフ　σフ７７ＣＣＣτＧフ　τ τλフＣＣλフＣＣＣ：フＧこλλ入ζフ　ＧＣλＧ入Ｇ７ＧＧ■ 人ＣフＣλτフＧＣで　τりτＧＧλＣＳＧλ　ＣＣλＧζフＣ：フＣＣλ入Ｇ ＧＣτＣフＧ　λλλλＧＧＧζフフ　Ｃ口λＧτ口：Ｃクc ６１０　６２０　・　６３０　６４０　６５０　６６０ＣλＣＣ？：Ｇ（：）　 Ｇ（ＣτＧＣＣＴＣＧ　ＧＧλＧＣＣ入ＧＧＧ　Ｃ）ＧτＣＣλＣ口τ　ＧＧＣ λＧフＣ；Ｃフ　ＧＣＧＧフＣ；ＣfＧ ６７０　６ａＯ６９０７００フ１０　７２０７３０　７４０　７５０　フロ０　 フッ０　７８０ＣτＣＴＣ入τＣτフ　τＣＴ’Ｔ（ＣＧ　ＧＡＣλ入τＣλ六 入τλλ　λＧλＧτ）λＣ二Ａ　Ｃ：’−λＧζλ入入入　入六入Ａλλ`Ｃ Ｇ入 この第３の配列は、第２の配列の５′非翻訳領域及び第１の配列の３′領域を含 む。この第３の配列は微生物又は浦乳類の発現系で成熟ヒトコラゲナーゼ阻害剤 類似のメタロプロテイナーゼのａ胞内生産を指揮できることが想像される。

現在、動物細胞でのメタロブＯテイナーゼ阻害剤の発現について、第４の最良の ＤＮＡ配列を使用した方法が最も好ましい。この配列の解読鎖は次の様に読まれ る。

ＧＧＣＣＡＴＣ３＋：：：　ＧＣＡＧ入フＣ；λＧ　ＣＧＣＣ口Ａ（ｌλＧλ　 ＧλＣλＣＣＡＧＡＧ　λλＣＣＣＡＣＣλＴ　Ｃ４ＣＣＣF；：τ”ニ アｏ　ε０　９０　１００　１１０　１２０ＧＡＧＣ＝；”：ＴＣａＧ　Ｃ’： ：Ｃ：ＧＧＣ；ｓ：　Ｃ−−ＧＴＴＣ；フッＧ　ＣτＧτＧＧＣ）Ｇλ　τ、％ ＧＣＣＣＣＣλＧＣλＧfＧＣＣＴＧＣ １コ０　１４０　１５０’　１６０　１７０　１ａＯλ（ニ）Ｇ７ＣＴＣ二　Ｃ ＡＣ；’：、ＣλＣＣ”ニー　ＡＣλＧλＣＧＧＣＣＴＴＣフＧＣＡＡＴＴ　Ｃ ＣＧＡＣＣ”ｒＣＧＴ　Ｃλ”ＩbＱＧＧＧＣＣ １９０２００２１０２２０２ＸＯ２４０λλＧτ；ＣＧフＧＧＣＧＡＣλＣＣλ Ｃλ　λＧτＣλλＣ二λＧ　λＣ口λにフτλτ　ＡＣＣλＧＣＧττλ　τ Ｃ入Ｇ入フＣλλＧ２５０　２６０　２７０　２日０　２９０　３００人τＧ； ％Ｃ：λＡＧλ　τＧτ入τλλＡＧＧ　ＧττＣＣλλＧＣ：　ττλＧＧＧ ＧλτＧ　ＣＣ５Ｃフクλζλτ　Ｃ＝Ｗττ：Ｇ■b ３１０１２０ココ０　３４０　１５０　コロ。

τλＣλＣＣＣ：ＣＧ　ＣＣλτＧＧλＧλＧ　τＣフＣフＧＣＧＧλ　τλＣ フτＣロλＣλ　ＧＧτＣ；；λＣλ入　ＣＣＳｃλＧＣＧ■f コア０　コ８ｏ　コ９０　４００　４１０　４２０ＧＡＧτττＣフＣλ　τフ ＧＣフＧＧλ入Ａ　λＣτＣＣλＧＯＡτ　ＧＧ入ＣフＣフτＧご　ＡＣλτＣ 入ＣフλＣＣフＧＣλＧτττb ４コ０　４４０　４５０　４６０　４フ０　４ａＯＧＴＧＧｃ？ＣＣＣＴ　ＧＯ ＡＡＣλＧＣ口τ　ＧｋＧＣ？ＴＡＧＣＴ　ＣＡＧＣＧＣＣＧＧＧ　ＧＣＴＴＣ ＡＣＣＡλ　ＧＡＣ：ＴＡＣＡb’：’ ＧＴτＧＧζτＧフＧ　ＡＧＯλＡτＧＯＡＣ八ＧτＧＴτ７（（ＣτＧＹτＴ 入τＣ：λ　τＣＣＣＣτＧＣλλ　入ＣτＧζ入ＧλＧτ６〕０　６ａＯ６９ ０゛　７００　７１０　７２０７３０　フ４０　フ５０　７６０　７７０　フａ Ｏ本発明の実施において、蛋白配列中′のいくつかのアミノ酸の変化は、蛋白の 基本的な性質には影響しないことを記憶せねばならない。それ故、同一のアミノ 酸配列及びメタロプロテイナーゼ阻害剤活性をももつ類似のアミノ酸配列の細胞 内生産を指揮できる他の簡易ＤＮＡ配列は本発明の範囲に含まれるものである。

これらの類似のアミノ酸配列のいくつかは本質的には天然のヒトメタロブＯテイ ナーゼ阻害剤と相同であるが、一方、メタロプロテイナーゼ阻害剤として掠能す ることができる他のアミノ酸配列は、天然の阻害剤と本質的な相同性は示さない ことが予期される。ここで用いられているような“本質的な相同性″という用語 は、天然のメタロプロテイナーゼ阻害剤との相同性の程度が、５０％を越えるこ と、望ましくは６０％、８０％を越えることを意味する。ここで議論されている ような相同性のパーセントは、参考文献としてここに特に引用するアトラス（１ ９７２年）国立生化学研究財団、ワシントンＤ、Ｃ。

中でＭ、Ｏ，デイホフにより述べられているように、整列を補助するために１０ ０個のアミノ酸に４個のギャップが導入されるとき、比較する配列中の同一のア ミノ酸残基を並べた２つの配列の小さな部分に見い出されるアミノ酸残基のパー セントとして計算される。

上で注意したように、本発明の簡易ＤＮＡ配列は合成的に作製される。これらの ポリヌクレオチド配列の合成作製方法は、一般的に、この技術、習熟している者 には特にこの明：ａ書に記載された開示に徴せば明らかなことである。ポリヌク レオチド合成に関した技術の現在の状態の例として、参考文献でこの中で引用す るジャーナル・オプ・アメリカン・ケミカル・ソサイエテイ第１０３巻、３１８ ５ページ（１９８１年）のＭ、Ｄ、マチウシとＭ、Ｈ，カルザース及びテトラベ ロン・レターズ第２２巻、１８５９べ−ジ（１９８１年）のＳ、Ｌ、ビューケー ジとＭ、Ｈ，カルガースが挙げられる。

加えて、簡易ＤＮＡ配列は、天然の配列の断片、即ち、天然に生じ、本発明者に より初めて分ｍｖ４製されたポリヌクレオチドの断片でも良い。ある形態におい て、簡易ＤＮＡ配列は、ＣＤＮＡライブラリーから分離された制限断片である。

この最良の形態では、ｃＤＮＡライブラリーはヒト皮ＦＪ繊維芽細胞から作製さ れる。

より好ましい形態では、簡易ＤＮＡ配列は、ヒトのゲノム・ライブラリーから分 離される。この形態に役に立つようなライブラリーの例は、参考文献として特に 引用されたローン等、！亜第１５巻、１１５７−１１７４ベージ（１９７８年） に述べられている。

又上記のように、本発明は、ここに述べられている簡易ＤＮＡ配列の少なくとも １個を各々含む一連のベクターに関する。望みのメタロブロティナーゼ阻害剤を 大量に生産する宿主微生物の能力を増加させるために簡易ＤＮＡ配列の追加コピ ーが単一のベクターに含まれることが予期される。

さらに、本発明のクローニング・ベクターは、簡易ＤＮＡ配列の前あるいは後に 補足的なヌクレオチド配列を含む。これらの補足的配列は、簡易［）ＮＡ配列の 転写を妨害せず、これ以降に充分述べられているようにある実施例では、活性３ 次構造をとらせるため、得られたメタロプロテイナーゼ阻害剤のアミノ酸の１次 構造の能力、又、転写、翻訳を増強させるものである。

本発明の最良のベクターは、図１に記載されている。

このベクター、ｐＵｃ９−Ｆ５／２３７Ｐ１０は、上述の最良のヌクレオチド配 列を含む。ベクターｐＬＪＣ９−Ｆ　５　／　２３７　Ｐ　１０　ハ、受託番号 第５３００３号ノモノトメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カル チャー・フレクションに寄託されたＣ６００／ｐＬＩｃ９−Ｆ５／２３７Ｐ１０ １胞内に存在している。

メタロブロティナーゼ阻害剤を暗号化するヌクレオチド配列は図１で領１ｉｉＡ として示されている。プラスミドＤＵＣ９−Ｆ５／２３７Ｐ１０は又、領域Ａの 簡易ＤＮＡ配列の前後に補足ヌクレオチド配列を含む。これらの補足配列はそれ ぞれ領域Ｂ及びＣと同定さ、れる。

より好ましい形態においては、前あるいは後の補足配列の一方又は両方が、補足 配列の除去に適当なＩ１１限エンドヌクレアーゼによるベクターの処理で図１の ベクターから除去される。口１で領域Ｃとして同定された簡易Ｄ−ＮＡ配列に続 く補足配列は、適当な制限エンドヌクレアーゼ、望ましくはＨｏ１ＡＩでベクタ ーを処理することにより除去され、続いて、合成オリゴヌクレオチドを用いて領 域Ａの３端が再構築され、Ｔ−４ＤＮＡリガーゼでベクターの連結がおこなわれ る。図１で領１４Ｂとさ最良の形態では、本発明の簡易ＤＮＡ配列を含み、発現 することができるクローニング・ベクターは、各種の操作成分を含む。ここで述 べられているこれらの“操作成分”は、少なくとも１個のプロモーター、少なく とも１個のシャイン・ダルガノ配列、少なくとも１個の終止コドンを含む。好ま しくは、これらの°°操作成分″は又、少なくとも１個のオペレーター、少なく とも１個のリーダー配列、及び、細胞内空間から移送される蛋白に関して、少な くとも１個の調節因子及びベクターＤＮＡの適正な転写とそれに続く翻訳に必要 なあるいは望ましい他のＤＮＡ配列を含む。

ここで述べられている簡易ＤＮＡ配列の１個又はそれ以上を含む他の既知のある いは目下発見されていないベクターを使用するときに、本発明がさらに具体化さ れることが想像される。特に、これらのベクターが次の性質のうちのいくつか又 は全てをもつことが好ましい＝（１）Ｒ小数の宿主生物の配列をもつ、１２１　 望みの宿主中で安定である、（３）　望みの宿主中で、高コピー数で存在可能で ある、（４）調節可能なプロモーターをもつ、（５）簡易ＤＮＡ配列が挿入され ている場所とは別のプラスミドの一部に存在する選択特性をコードする少なくと も１個のＤＮＡ配列をもつ、及び（６）　ベクターに組込まれる。

次のクローニングベクターのリストは、上述の基準を満たすために容易に変える ことができるベクターを述べており、それ故、本発明に使用しやすい。そのよう な変化は容易に、入手可能な文献及びこの中の教訓による技術に普通に精通する 者により成就される。上に確認された性質をもち、それ故、本発明への使用に適 する別のクローニング・ベクターが現在存在し、発見されるであろうことを理解 すべきである。これらのベクターは又、必要な操作成分と共に簡易ＤＮＡ配列が 導入された新しい一連のクローニング・ベクターの範囲内にあると予想され、変 化したベクターは本発明の範囲 １ユ 宿主　ベクター　注 入１ｔａ　ｐＵＣ８多くの選択レプリコンが特徴を調べられｐＬＪｃ９　ている 。

Ｂ、アミロリ力ファシ　ホック３１９８４年アカデミツク・ブレスＢＤ８ ＢＤ８ Ｔ１２７ シュードモナス属　Ｒ３Ｆ１０１０　あるベクターはキサントモナスとアグロＰ 、アエルギノサ　Ｒｍｓ１４９　バクテリウムを含むグラム陰性菌の広い艶２士 ダ　ｐＫＴ２０９　宿主域で役立つＫ２ ５ａ７２７ １）ＪＬＪｌｏ　ア等（１９８４年）ジャーナル・オブ・１）ＪＬＪ１６　バク テリオロジー第１５９巻４６５−ｐＪＬＪ１３　４７１ページ ン、ジョーンズ、ブローチ４１９８２年Ｃ３ＨＬのポットシュタインとディビス 内に含まれ、以下にさらに充分に述べられている組換えＤＮＡ法を使用すること が可能である。

上のリストに加えて、実施例２に述べられているような大腸菌のベクター系が、 クローニング・ベクターとして具体的に好ましい。さらに、グラム陰性菌の広い 範囲で独立的にｍｉするいくつかのベクタープラスミドが、シュードモナス汎の 宿主でのクローニング媒体としては使用しやすい。これらは、それぞれ参考文献 として引用されているが、バイオテクノロジー１９８３年５月、２６９−２７５ ページに、Ｒ，Ｃ，ティト、Ｔ、Ｊ、クローズ、Ｒ，Ｃ，ルンドクウイスト、Ｍ 、ハギャ、Ｒ，Ｌ。

科学における遺伝子工学）、ブレーガー出版、ニューヨーク州ニューヨーク、１ ６３−１８５ページ（１９８１年）にＮ、Ｊ、バノポロスにより、カレント・ト ビツク・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イミュノロジ二第９６巻３１− ４５ページ（１９８２年）にに、サカグチにより述べられている。

特に好ましい構築では、参考文献としてあげているよ境及び商業上重要なプラス ミド）、Ｋ、Ｎ、ティミスとＡ、プーラ−編、エルゼビア／ノース・ホランド・ バイオメディカル・プレス（１９７９年）の中で、Ｍ、バグダサリアン、Ｍ、Ｍ 、バグダサリアン、Ｓ、コールマンとに、Ｎ、ティミスにより述べられている。

プラスミドＲ３Ｆ１０１０及びその誘導体が使用されている。

Ｒ３Ｆ１０１０の利点は、簡単に大腸菌と５）Ｘ一旦エニス風の両者に形質転換 され、安定に保持される比較的小さな、高コピー数のプラスミドであることであ る。この系では、参考文献としてあげられているが、カレント・トピックス・イ ン・マイクロバイオロジー・アンド・イミュノＯジー第９６巻、３１−４５ペー ジ（１９８２年）のに、サカグチと、バイオテクノロジー１９８４年２月、１６ １−１６５ページのＧ、Ｌ、グレイ、Ｋ、Ａ、マツケオウン、Ａ、Ｊ、Ｓ、ジョ ーンズ、Ｐ、Ｈ，ジ−バーブとＨ，Ｌ、ハイネ力−により述べられているように 、大腸菌ｔｒｐプロモーターはシュードモナスのＲＮＡポリメラーゼにより直ち にＦａ　Ｈされるの・で、大腸菌について述べられているようにＴａｃ発現系を 用いることが望ましい。転写活性は、プロモーターを例えば、大腸菌又はＰ、ア エルギノサのｔｒｐプロモーターに交換することによりさらに最大化される。

最良の形態では、Ｐ、アエルギノサは、細胞内産物あるいはプロセシングと細胞 からの運搬に影響を及ぼすリーダー配列と共役した産物としてメタＯブＯテイナ ーゼ阻害剤を合成するベクターで形質転換される。この形態では、これらのリー ダー配列は、むしろβ−ラクタマーゼ、ＯｍＤＡ蛋白、天然に存在するヒトの信 号ペプチド及びシュードモナスのカルボキシペプチダーゼＧ２がら成るグループ から選択される。翻訳は実施例２で述べられているように、メタロプロテイナー ゼ阻害剤を細胞内で発現させる宿主の高度に発現する蛋白の開始部位同様、大腸 菌蛋白の翻訳開始と一緒になっている。

宿主のシュードモナス民で制限系のない菌株が得られない場合、大腸菌から分離 されたプラスミドでの形質転換の効率は低い。それ故、参考文献としてあげられ たＭ。

バグダサリアン等、ブラスミズ・オブ・メーイカル・エンバイアメンタル・アン ド・コマーシャル・インポータＺノ、４１１−４２２ページ、ティミスとプーラ −編、エルゼビア／ノース・ホランド・バイオケミカル・プレス（１９７９年） に述べられているように、望みの宿主での形質転換の前に、シュードモナスのク ローニング・ベクターを別の種のｒ−ｍ＋株に移すことが望まれる。

さらに、バチルス属の宿主での好ましい発現系は、クローニング媒体としてプラ スミド１）ＬＪＢｌｌｏを用いることを包含する。他の宿主ベクター系での場合 同様、バチルスの場合、細胞内あるいは分泌蛋白として本発明のメタロプロテイ ナーゼ阻害剤を発現することができる。

本形態は両方の系を含（。バチルス及び大腸菌の両者で複製するシャトル・ベク ターは、ジエネテイツク・エンジニアリング（遺伝子工学）第２巻、セットロー とホランダー編、ブレナム、プレス、ニューヨーク州ニューヨーク、１１５−１ ３１ページ、（１９８０年）にり、ダブナラ、■、グリクザン、Ｓ、コンテント とＡ、Ｇ、シドクマーが述べているように各種遺伝子を構築し試験す−ることに より１ｄられる。旦、ズブチリスからのメタＯブＯテイナーゼ阻害剤の発現と分 泌のために、α−アミラーゼの信号配列がメタロブＯテイナーゼ阻害剤の（１１ 号領域と一緒にきれる。メタロプロテイナーゼ阻害剤の合成のため、簡易ＤＮＡ 配列は、α−アミラーゼのリーダー配列のリポソーム結合部位に翻訳的につなが れる。

これらの構築物のいずれかの転写は、α−アミラーゼのプロモーター又はその誘 導体により指揮される。この誘導体は、天然のα−アミラーゼ・プロモーターの ＲＮＡポリメラーゼｍ　Ｈ配列を含むが、同様にｌａｃオペレーター領域を組込 んでいる。ペニシリナーゼ遺伝子のプロモーターとｌａｃオペレーターから構築 された類似の雑種プロモーターは、ジエネテイクス・アンド・バイオテクノロジ ー・オブ・バチリ（バチルスの遺伝学と生物工学）、Ａ、Ｔ、ガネサンとＪ、Ａ 、ホック編、アカデミツクプレス、２４９−２６３ページ（１９８４年）でり、 Ｇ、ヤンスラとヘナーにより述べられているように調節様式でバチルス宿主の中 で機能することが示されている。１ａｃ１９のｔａｃｔ遺伝子も又、調節を果た すために含まれる。

クロストリジウムでの発現のための好ましい構築は、ジャーナル・オブ・バクテ リオロジー、第１５９巻、４６０−４６４ページ（１９８４年）に述べられてい るり、Ｌ、ヘーフナー等の方法でＣ，パーフリン°ンスに形質転換されたプラス ミドｐＪＬ１１２（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、第１５９巻、４６５ −４７１ベージ（１９８４年）にＣ，Ｈ，スクワイ７等により述べられている） である。転写は、テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーターにより指運される 。翻訳は、伯の宿主で用いるのに適しているベクターで上に概略した方法に全く 類似した様式で、この同じｔｅｔ　遺伝子のシャイン・ダルガリ配列に連結され ている。

酵母に導入された外来ＤＮＡの保持は、数種の方法で果たされる（モレキュラー ・バイオロジー・オ　・　・イースト・サツカロマイセス（酵母サツカロマイセ スの分子生物学）、コールド・スプリング・ハーバ−研究所、ストラサン、ジョ ーンズとブローチ編、６０７−６３６ベージ、（１９８２年）中の、Ｄ、ポット スタインとＲ，Ｗ、ディビス）。サツカロマイセス属の宿主生物を用いた１つの 好発現系は、２μｍプラスミド上に抗コラゲナーゼ週伝子をもつ。２μサークル の利点は、ｃ　ｉ　ｒ’株に導入されると、比較的高コピー数で安定であること である。これらのベクターは好ましくは、複製１つのＤＢＲ３２２からの抗生物 質耐性マーカーを組込んでいる。加えて、プラスミドは、酵母のＬＥＵ２変異体 で同一目的を果たすために２μの配列と酵母のＬＥＵ２遁伝子をもつ。

酵母ＧＡＬＩ遺伝子の調節プロモーターは、簡易ＤＮＡ配列遺伝子の転写を指揮 するのに適合している。

酵母での簡易ＤＮＡ配列の翻訳は、酵母α−因子の分泌を指揮するリーダー配列 につなげられる。これは、酵母内で処理され、メタロブロティナーゼ阻害剤を分 泌させる融合蛋白の形成を引き起こす。かわって、メチオニル・メタロブロティ ナーゼ阻害剤が細胞内含有物として翻訳される。

酵母でのメタロプロテイナーゼ阻害剤をコードするｍＲＮＡの翻訳は実燕例２に 明らかにされているように、原核生物の偏りを調整されているｐｕｃｓ−Ｆｉｃ に存在する配列を用いるよりも、ｒｆｆＦｆｌのコドン使用を用いた方がより効 率的であることが予想される。このため、７ｔｈｌｌｌ１部位で始まる簡易ＤＮ Ａ配列の５′端の部分は、再合成される方が好ましい。新しい配列は、酵母で最 も頻繁に使用されるコドンを与える。この新しい配列は好んで次のヌクレオチド 配列をもつ。

ｇｉＡＩ ５°ＧＡＴ　ＣＣＧ　ＴＧＣＡＣＴ　ＴＧＴ　ＧＴＴ　ＣＣＡ　ＣＣＡ　ＣへＣ ＣＣＡ　ＣＭ　ＡＣＴ　ＧＣＴ　ＴＴＣＴＧＴ　ＡＡＣＴＣs　Ｇｌ’ｌＣＣ ＧＣＡＣＧ　ＴＧＡ　ＡＣＡ　ＣＡＡ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　ＧＴＧ　ＧＧＴ　ＧＴ Ｔ　ＴＧＡ　ＣＧＡ　ＭＧ　ＡＣＡ　ＴＴＧ　ＡＧＡＣＴＣfＡ　３゜ 上のリスト及び説明に含まれる個々のクローニング・ベクターと系の試験かられ かるように、各種の操作成分が本発明のベクターのそれぞれに存在する。必要と されるかもしれない別の操作要素を当業者は特に水明１［１？ｌＢ記載の教示に 照らしてじようどう手段を用いてこれらのベクターに付加されることが予想され る。

実際に、これらのベクターのそれぞれを簡単に分離、集合、置換させる方法で構 築することができる。これは、これらの成分とメタロブロティナーゼ阻害剤の暗 号領域の屯合わせからかなり多くの機能的な遺伝子の集合、を容易にする。さら に、これらの成分の多くは、１種以上の宿主に応用することができる。

少なくとも１ｇの選択マーカー及び簡易ＤＮＡ配列の転写を開始できる少なくと も１個のプロモーター配列に加えて、予想される宿主微生物にｇＨＲされる少な くとも１個の複製開始点がこれらのベクターに含まれることが予想される。ある 程度好ましい形態でのベクターは、調節因子として機能することができるＤＮＡ 配列（“オペレーター″）と、調節蛋白をコードすることができる他のＤＮＡ配 列を含むことがさらに予想される。この一連のベクターで、ベクターはさらに、 リポソーム結合部位、転写終了暗号及びリーダー配列を含む。

ある形態におけるこれらの調節因子は、ある環境条件の存在で簡易ＤＮＡ配列の 発現を妨げ、他の環境条件下で簡易ＤＮＡ配列によりコードされる蛋白の転写と それに続く発現をさせる。特に、簡易ＤＮＡ配列を発現させるようなベクターへ 挿入される調節部分は、例えば、イソブＯピルヂオーβ−ｄ−ガラクトシドなし では生じないことがむしろ選ばれる。この場合、簡易ＤＮＡを含む形質転換され た微生物は、メタロブ０テイナーゼ阻害剤の発現の開始前に、望ましい密１度ま で生育される。この形態において、望むプロテアーゼ阻害剤の発現は、望む密度 に達した後にＤＮＡ配列の発現をさせることのできる微生物環境に基質を添加す ることにより誘導される。

加えて、ベクターの中あるいは簡易ＤＮＡ配列の５′端に存在する適正な分泌の リーダー配列、介在する転写又は翻訳の終了信号なしに、プロテアーゼ阻害剤の 発現を指揮できるヌクレオチド配列の開始部分に直接隣接するような位置にある リーダー配列がむしろ選ばれる。リーダー配列の存在は次の理由のうちの１つ又 はいくつかのために望まれる。１）　リーダー配列の存在は、最初の産物の成熟 組換えメタロブロティナーゼ阻害剤への宿主の処理を促進する。２）　リーダー 配列の存在は測胞質の外のメタロブロティナーゼ阻害剤を指揮することにより、 組換えメタ０プロテイナーゼ活性剤の精製を促進する。

３）　リーダー配列の存在は、細胞質外のメタロプロテイナーゼ阻害剤を指揮す ることにより、組換えメタロプロテイナーゼ阻害剤の活性構造への折りたたみの 能力へ影響を及ぼす。

特に、リーダー配列は、リーダー配列を除去するためを指揮し、潜在的なメタロ ブ０テイナーゼ阻害剤活性をもつアミノ酸配列をもポリペプチドを残す。ある種 の宿主微生物では、適当なリーダー配列の存在は、大賜菌の場合のように完全な 蛋白をベリプラズマへ移送させる。

ある酵母とバチルス及びシュードモナスの菌株の場合に適当なリーダー配列は、 細胞膜を通って細胞外の培地へ蛋白を移送させる。この場合、蛋白は細胞外蛋白 から精製される。

第３に、本発明によりｉｌ［されるいくつかのメタロプロテイナーゼ阻害剤の場 合、リーダー配列の存在は完全な蛋白が活性構造を呈するために折りたたまれる 環境に所在し、その構造が適当なメタ０プロテイナーゼ活性をもつのに必要であ る。

さらに、操作成分には限定はされないが、リポソーム結合部位及び外来蛋白の微 生物での発現に必要な他のＤ’ＮＡ配列を含んでいる。ここで！！諭されている ような操作要素は、以前の文献及びこの明ｓ四による技術に習熟した者によりル ーチンに選択される。これらの操作成分の一般的な例は、Ｂ、レーウィン　ジー ン（遺伝子）、ウィリー＆サンズ、ニューヨーク（１９８３年）に述べられてい る。適当な操作成分の各種の例は、上で議論したベクターに認められ、前述のベ クターの基本的な性質をに１論した出版物の総説により明らかにされる。

本発明の１つの好ましい形態において、付加的なりＮＡ配列は、メタロブロティ ナーゼ阻害剤をコードしている簡易ＤＮＡ配列のすぐ前に所在している。付加的 ＤＮＡ配列は、翻訳の連結者として機能することができる、即ち、ＤＮＡ配列は 、メタロプロテイナーゼ阻害剤のリポソーム結合部位に隣接したリポソームを正 しい位置におかせるＲＮＡを暗号化する。

上に議論したクローニング・ベクターの全ての必要なそして望みの構成因子の合 成及び／又は分離に関して、ベクターは、一般的に知られている方法で集められ る。

そのようなベクターの集合は、技術者によりおこなわれる義務と仕事の範囲内で 、それ自体、過度の実験なしにおこなわれると信じられている。例えば、類似の ＤＮＡ配列は、ショーナー等、プロシー−イン　ス・オブ・ザニムと先υＬ−乙 すシヒ！」フ≧」ヱ」クツ−ｊにｔＪｓＡ第８１巻５４０３−５４０７ページ（ １９８４年）に述べられているように、適当なりローニング・ベクターに連結さ れる。

本発明のクローニング・ベクターの１築について、簡易ＤＮＡ配列とそれに付随 する操作要素の多重コピーがそれぞれのベクターに挿入されていることをさらに 注目すべきである。そのような形態において、宿主生物は、望むメタロプロテイ ナーゼ阻害剤をベクターあたり大量に生産する。ベクターに挿入されたＤＮＡ配 列の多重コピー数は、大きさのため、得られたベクターの適当な宿主微生物への 移行とその中での複製及び転写の能力によってのみ限定される。

さらに、クローニング・ベクターは、薬剤耐性マーカーあるいは、宿主微生物に より選択的な特徴の発現を引き起こさせる他のマーカーのような選択マーカーを 含むことが好まれる。本発明の特に好ましい形態では、アンピシリン耐性週伝子 がベクターｐＵｃ９−Ｆ５／２３７Ｐ１０に含まれている。

そのような薬剤耐性あるいは他の選択マーカーは、形質転換体の選択を部分的に 促進するようである。ざらに、クローニング・ベクター上のそのような選択マー カーの存在は、培養培地中で雑菌が増殖するのを防ぐのに役立つ。この形態にお いて、そのような形質転換された宿主微生物の耗砕培養は、生存のために誘導さ れた表現型を必要とする条件下で微生物を培養することで得られる。

この形態において、３′非翻訳配列を集合させるために、暗号領域の３′端を再 構築するのが望ましいということは注目に値する。ブＯシーディンゲス・オブ・ ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳＡ第７８巻、４９３６ −４９４０ページ（１９８１年）にＲ，ゲンツ、Ａ、ランブナ−、Ａ、Ｃ，Ｙ、 チャン、Ｓ、Ｈ，コーエンとＨ，ブヤードにより同定されているように、ｍＲＮ Ａを安定化し、あるいはその転写を強め、そして、ベクターを安定化する強力な 転写終了信号を準備する配列が、これらの非翻訳配列に含まれる。

この発明は、又、メタロプロテイナーゼ阻害剤の生産に関する組換えＤＮＡ法に 関する。一般的に、その方法は、以下を含む。

（２）　メタロプロテイナーゼ阻害剤活性をもつ蛋白を生産するために宿主微生 物を指揮できる簡易ＤＮＡ配列を調製すること。

０　宿主微生物へ移され、そこで複製できるベクターへの簡易ＤＮＡ配列のクロ ーニング。そのようなベクターは、簡易ＤＮＡ配列に対しての操作成分を含む。

（へ）　簡易ＤＮＡ配列及び操作成分を含むベクターのメタＯブＯテイナーゼ阻 害剤蛋白を発現できる宿主微生物への移行。

（へ）　ベクターの増幅と阻害剤の発現に適当な条件下での宿主微生物の培養。

及び （ｅ）　［ｉｌ　阻害剤の回収、及び （ｉｉ）　阻害剤に活性３次構造をとらせること。それによりメタＯプロテイナ ーゼ阻害剤活性をもつようになる。尚、（ｅ）ｌｉｌ又は（ｅ）　（ｉｉｌのい ずれを先きに行って良い。

この方法において、簡易ＤＮＡ配列は、上述の合成又は、天然に存在するポリヌ クレオチドである。本方法の好ましい形態では、簡易ＤＮＡ配列は次の様なヌク レオチド配列をもつ。

Ｌｏ　２０　３０　４０　５０　６０ Ｇ″：τＧττＧＣτＧ　τＧＧこτＧλτλＧＣ二口こλＧこλＧＯＧＣ’： τＧＣ入Ｃ；）　ＧＴＧτＣＣｌ−λＣＣＣａｌ：λＣ；；■b入Ｇ ７０　８０　９０　ＬＣｉＯＬＬＱ　１２０λＣりＧＣ；ττＣτ　ＧＣλλτ τＣ；Ｓλ　Ｃ；τＣ５τＣλ：ＣλＧＧＣ’Ｃ口λλＱ７　τＣＳτＧＧＧＧ λＣＡＣＣλＧ；−−Ｇ■b Ｌ３０　Ｌ４０　１５０　１６０　１７０　ｉＳＯλλＣ；λＧλこ；λ　Ｃ； τフλτλＣロ入　ｃＣＳフτλ＋４　：％Ｇ　ＡＴＣλλＧλτり入　Ｃ；λ ＡＧλ”ＦＱτλ　ＴλλλＧfＧττＣ １９０２００２ユ０　２２０　２’０　２４０Ｃ：’ＡＣＺ；”：’：？、Ｇ　 Ｃ−ＣＧ？ＴＧＣＣ’ＪＣＴＧＡＣλτＣ口ＧＳ　ＴＴＣＧＴＣＴλＣＡ　Ｃ’ ｌ’：：ＣＳＣ：λＴ　ＧfＡＧＡＧＴＣ：ＴＣ ２５０２６０２フ０　２：０　２９０　３００τＧＣＧ口λ：λＣ’Ｔ　ＴＣＣ λＣλＣ４フＣにλＣλ入ＣＣ：ｊ’＋　入ＧＣＳλＣ−ＧλＧτ　ττＣτＣ λフτＧＣＴＧＧλλλλbτＧ ３１０　３２ｏ　３コ０　３４０　３５０　３６０ττλＧＣＴＣＡＧＣＧＣＣ ＧＧＧＧＣττ　ＣλＣＣλＡＧλＣ；　τλＣλＣフＧττＧＧＣτＣτＧ入 ａＳλ　λτＧＣλＣλＧτＧ４コ０　４４０　４５０　４６０　４７０　４８ ０τττＣＣ口τＧ７″：　ＴλτにλＴＣＣＣＣ７６こλλＣフＧＣλＧλＧ ＴＧＧＣλ　ＣτＣλττＣ，＝ττ　Ｃ７ＧＧλＣＧＧＡＣ４９０５００５１ ０５２０５コ０　５４０ＣλＧＣＴＣＣフＣＣλλＧＧＣτＣτＧ入　λλλＧ ＧＧＣフτＣＣλＧτＣＣＣＧτＣＡＣＣττＧＣ口ＴＧ　（ＣＴＧＣＣＴＣＳ ＧＧλＧＣニ入ＧＧＧＣτＧτにλＣ；τＧ　ＧＣλＧτＣＣ；）Ｇ　ＣＳＧフ Ｃ；口λαλ　丁λＧにでＧλ六τ　にτＧＣＣロＧＧλＧ７ＧＧＡＡＧＣＴＧ 　）−’ｔＧｃｃ−，ＧＣＡＣ八ｇτＧＴＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＣＣＣＡＣＴＣ ＣＣλＴＣＴＴＴ　ＣＴ？ＣＣＣ４ＡbＡ ６７０　６ａＯ６９０７００ 人τＧλλλＴλλ入　ＣλＧττ入ＣＣλＣＣＣλＧＣλλλλλ　入λλλ λ入ＧＧλＡ　ττＣ本方法で役に立つと予想されるベクターは上述のベクター である。最良の形態では、クローニングベクターｐＵＣ９−Ｆ５／２３７Ｐ１０ が、明らかにされた方法で用いられている。

得られたベクターは、それから適当な宿主微生物に移される。異ＦＪ　Ｄ　Ｎ　 Ａを取り込み、それらの遺伝子及び付随する操作成分を発現する能力をもつ微生 物は選択される。宿主微生物には嫌気性菌、通性嫌気性菌あるいは好気性菌が選 択される。この方法に用いられる特定の宿主は酵母とａ菌を含む。特定の酵母に はサツカロミセス届、特に丸りユニえ欠λ二上ｙＸｌユが含まれる。

特異的な細菌には、バチルス、エッシエリヒア、λニードモナス属のものが含ま れる。各種の他の好ましい宿主は表工に述べられている。本発明の他のかわりに なる好ましい形態において、パ　ルス・ズブチ貫ス、エツシエリヒア・コリ又は シュードモナス・アエルギノサが宿主微生物として選択されている。

宿主生物を選択した後、ベクターが一般的に既知の方ニーヨーク州コールド・ス プリング・ハーバ−（１９８０年）に見い出される。ある形態において、温度調 節が上述の操作要素の使用による遺伝子発現を調節する手段として予想されると きには、形質転換は低温でおこなわれるのが望ましい。別の形態で、浸透圧調節 因子がベクターに挿入されているならば、形質転換の間の塩儂度の調節は、合成 遺伝子の適当なコントロールを保証するのに必要である。

組換えメタロブロティナーゼ阻害剤が最終的に酵母で発現されることが予想され るならば、まずクローニング・ベクターは、大股菌に移され、そこで複製され、 増幅の後に、そこから回収精製されるのが望ましい。ベクターはそれからメタロ プロテイナーゼ阻害剤の最終的な発現のために酵母に移される。

宿主微生物はメタロプロテイナーゼ阻害剤の発現に適当な条件下で培養される。

これらの条件は一般的には宿主生物にに特異的で、そのような生物の生育条件に 関し８版、ウィリアムス＆ウイルキンス・カンパニー、メリーランド州バルチモ アに従い、技術者により確実に決定される。

ベクターに挿入されたあるいは存在する操作要素に依存するＤＮＡ配列の発現の 調節に必要な条件は、結果として、形質転換と培養段階である。ある形態におい て、ＤＮＡ配列の発現を阻害する適当な調節条件の存在下で高密度まで細胞が生 育される。最適細胞密度に達すると、環境条件は、ａ易ＤＮＡ配列を発現するの に適した条件に変化する。それ故、メタロプロテイナーゼ阻、害剤の生産は、ｇ １重密度近くまで宿主細胞を生育した次の時期に起き、その結果得られたメタロ ブロティナーゼ阻害剤は、発現に必要な調節条件が誘導された後にある程度の時 間で回収されることが予期される。

本発明の好ましい形態において、組換えメタロプロテイナーゼ（！ｌ害剤は、回 収に続いて、活性構造の仮定の前に７５製される。再び折りたたまれた蛋白の鳥 取Ｏの回収が蛋白が最初にＲ’Ａされると促進されると発明者は信じるのでこの 形態が好ましい。しかし、別の形態では、メタロプロテイナーゼ明害剤は、ｖｉ 調製前その活性構造を仮定するために折りたたまれた状態に戻される。またさら に別の形態では、メタＯブロティナーゼ阻害剤は、培養培地からの回収について 、その再び折りたたまれた活性のある状態を仮定することがおこなわれた。

ある周囲環境では、メタロプロティナーゼ阻害剤は、宿主微生物の中で発現し、 ａｌｌ堅壁は膜を通りあるいはべりブラズムへ蛋白を移送するために正しい活性 構造を呈する。これは一般的に、適当なリーダー配列をコードするＤＮＡが組換 え蛋白をコードするＤＮＡに接していると起ぎる。本発明の好ましいメタロブロ ティナーゼ阻型を呈する。数多くの信号ペプチドの構造は例えばヌクレイツク・ アミド・リサーチ第１２巻、５１５−５１６４・１９８４年にＥ、Ｅ、マリオン 、ワトソンにより公表されている。簡易ＤＮＡと共に、これらのリーダー配列は 、細胞膜を通って移動し、細胞から反出されると切断されるリーダー配列部分を もつ融合蛋白の細胞内生産を指揮する。

好ましい形態では、大腸菌ＯｍｐＡ蛋白の信号ペプチドは、リーダー配列として 使用され、メタロプロテイナーゼ阻害剤構造をコードする簡易ＤＮＡ配列に続く 位置に所在する。

さらに好ましいリーダー配列としてβ−ラクタマーゼ、カルボキシペプチダーゼ Ｇ２及びヒト信号蛋白のものが含まれる。これら及び他のリーダー配列が述べら れている。

メタロプロテイナーゼ阻害剤が正しい活性構造をとらないと、形成されているジ スルフィド結合及び／あるいは、生じた非共有的な相互作用が最初に例えば塩酸 グアニジン及びβ−メルカプトエタノールのような変性剤及び還元剤により、コ ントロールされた条件下でこれらの試薬の希釈及び酸化に続いて活性構造を呈す る前に破壊される。

ここで予想される転写終了信号はベクターを安定化するのに役立つ。特に、プロ シー−インゲス・オブ・ナショナル、・アカデミ−・オブ・サイエンス・オプＵ ＳＡ第７８巻、４９３６−４９４０ページ（１９８１年）にゲンツ等により述べ られている配列は、本発明への利用が予想される。

本発明の明りＩｌ書の和学的問題あるいは環境への応用は、ここに含まれる明細 書に従った技術に習熟した者の能力の範囲内であることは理解されるべきである 。本発明の生産の実施例及び分離と製造に関する代表的な過程は次の例に表わさ れている。

実施例 １Ｊ１１ユ ＨＥＦ−８Ａ謀６芽細胞からのポリ（Ａ＋）ＲＮＡの調製 ）−ＩＥＦ’−３Ａ細胞が７５ｏ＋＋２Ｔ−フラスコで、コンフルエント近くま で生育された。細胞はダルベツコのリン閣纒衝化塩溶液で２度洗浄され、２Ｉｄ ！の１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ　（ＢＤＨケミカルスＬｔｄ、、プール、英国から入 手）、５１１１８　ＥＤＴＡ及び２０１１９／ｌｄプロテアーゼＫ（ベーリンガ ーマンハイム・バイオケミカルス、インディアナ州インディアナポリスから入手 ）を含む１０ｍ）ｌＴｒ　ｉ　ｓ、ｐＨ７，５を添加することにより集められた 。

それぞれのフラスコを相続いてこの同じ溶液でさらに１−を用いて洗浄した。

細胞回収からプールした液体がプロテアーゼにで７０μｇ／ｄにされ、４０℃で ４５分間保温された。蛋白分解処理された溶液は、５Ｍの保存液を添加すること により、Ｎ８０１９度１５０＋ａＨにされ、続いて等辺のフェノール：クロロホ ルム１：１で抽出された。水層が等量のクロロホルムで再抽出された。２容のエ タノールが水層に添加され、１晩−２０℃で保温された。沈澱した核酸は、ベッ クマンＪ２−２１遠心認（ベックマン・インストルメンツ、カリフォルニア州パ ロアルト）で１７５００Ｘ（Ｉで１０分間遠心することにより回収された。そし て２５ＩＬｌのｏ、ｉ％（ｗ／ｖ）ＳＤＳに再溶解サレタ。Ｊ　（７）溶液は再 び等辺のクロロホルムで抽出された。水層に２容の冷却したエタノールが添加さ れ、−２０’Ｃに２時間保存された。沈澱が１００００ｃｏで１５分間の遠心に より集められ、１０ｍ１の１ｍＨＴｒ　ｉ　ｓ、　０．５ｍＨＥＤＴＡ、０．１ ％ＳＤＳ、ｐＨ７，５に再溶解された。

ＲＮＡは、この溶液から、１０ｍの４ＭＬｉＣｊ！、２０　ｍＨｌ　ｍナトリウ ムｐ）１５．０を添加することにより再沈澱され、−２０℃で１８時間保温され た。沈澱は再び遠心により回収され、１＋ｎＮ　Ｔｒ　ｉ　ｓ、　Ｏ，！ＭＮＥ ＤＴＡ　Ｏ，１％ＳＤＳ　ｐＨ７，５に再溶解する前に２Ｍ　ＬｉＣｊ！で２度 洗浄された。この溶液は一７０℃で保存された。

オリゴｄＴセルロースによるクロマトグラフィー上で調製された全細胞ＲＮＡは エタノールで沈澱され、０．５Ｍ　ＮａＣ１に再溶解された。０．４５１！Ｉｇ ／ｄのＲＮＡ５ｍが洗浄されたタイプ■オリゴｄＴセルロースキーから入手）の １ａｅカラムに充填された。カラムはそれから１０ｄの０．５Ｍ　ＮａＣ１で洗 浄され、２．０−の滅菌水で溶出された。ＲＮＡの溶出されたポリ（Ａ＋）画分 は、エタノールで沈澱され、Ｉ　ＩｙＩ／ｒｔｄｌ溶液になるように、１ｍＨＴ ｒ　ｉ　ｓ、０．１ｍＨＥＤＴＡ。

ＤＨ８，０に溶解された。これは−７０℃で保存された。

ｃＤＮＡ合成 ポリ（Ａ＋）ＲＮＡは、ＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンスｒｎｃ、フロリダ 州Ｓ（、ピータースバーグから入手）によるＣＤＮＡ合成の鋳型として用いるた めにオリゴｄＴ（ＰＬバイオケミカルズ、ウイススコンシン州ミルウオーキから 入手）で準備された。合成反応に続いて、ＲＮＡは、０．１容の３Ｎ　ＮａＯＨ の添加により加水分解され、６７℃で１０分間保温された。溶液はそれから中和 され、ｃＤＮＡは、バイオゲルＡ１．５　（バイオラッド・ラボラトリ−、カリ フォルニア州すッチモンドから入手）の０．７Ｘ２ＳｒＪカラムで、１０ｍＨＴ ｒｉｓ、５ｎ＋ＨＥＤＴＡ、１％５ＤＳ１ｐＨ７，５の溶液によるゲル濾過クロ マトによりｖＩ製された。ｃＤＮＡを含む画分が集められ、エタノール沈澱によ り濃縮された。

ｃＤＮＡにｄＧのテイルがつけられ、上述の方法を用いたゲル濾過によりｔｉ？ ｇされた。Ｍ２鎖の合成は、オリゴｄＣで準備され、ＤＮＡポリメラーゼの大（ フレノウ）断片（ベーリンガー・マンハイムから入手）を用いた開始反応で重合 された。第２鎖の合成に続いて、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼエ（ベーリンガー・ マンハイムから入手）が添加され、平滑末端を形成するために、保温が続けられ た。２本１ｃＤＮＡはクロマトグラフィーにより再精製された。ＣＤＮＡの中に あるＥＣＯＲＩ制限部位は、ニューイングランド・バイオラボ、マサチューセッ ツ州ベバリーから入手したＥＣＯＲＩメチラーゼの作用により修飾された。ｃＤ ＮＡは再び［７され、合成ＥｃｏＲＩリンカ−に連結された。最終的に、末端は エンドヌクレアーゼで削られてｃＤＮＡはゲル濾過でＭＷされた。このＤＮＡは 、試験管内でパッケージングされたλＱｔ１０ＤＮＡの唯一のＥＣＯＲ１部位に 連結され、ＤＮＡクローニング・テクニクス・ア・プラクティカル・アプローチ （ＤＮＡクローニング技術、実際の研究方法）、Ｄ、Ｍ、グローバー編、ＩＲＬ プレス、オックスフォード（印刷中）でＴ、Ｖ、ヒューン、Ｒ，Ａ’、ヤングと Ｒ，’Ｗ、ディビスにより述べられている方法に従い大腸菌１−１ｆ　ＩＡ株の 感染に使用された。、およそ２５０００の組換え体がこの方法で増幅された。

入り二二ニ之ｌ 対象の配列を含む組換え体ファージは、これ以降Ｆ［ＢＡＣとして引用される望 みのメタロプロテイナーゼ阻害剤の１次溝造部分を明号化する合成オリゴヌクレ オチドに対する選択的なハイブリダイゼーションにより選択された。蛋白配列の これらの部分は、Ｇ、Ｐ、ストリッタリンとＨ，Ｇ、ウェルガス、ジャーナル・ オブ・バイオロジカル・ケミストリー第２５８巻、１２２５２−１２２５８　（ １９８３年）により公表された文献に述べられているものと一部が相当する。組 換え体ファージｏｆｕ　／　１５０ｕｒｍペトリ皿の密度でプレートにまかれた 。

ファージはニトロセルロースｌｉ紙（ＢＡ８５、シュライヒヤー＆シュエルＩｎ ｃ、ニューハンプシャー州キーン）上に移し取られ、ＤＮＡは、サイエンス第１ ９６巻、１８０−１８２ページ＜１９７９年）の中でベントンとディビスにより ；ボへられているように変性同定された。

この方法を用いて、註紙は順にそれぞれ１０から１５分間、０．５〜Ｉ　ＮａＣ Ｊ、それから１．０ＭＴｒｉｓ　１．５Ｍ　ＮａＣ１ｐＨｓ、Ｏで処理され、そ して最後に２ＸＳＳＰＥに浸された。（２ＸＳＳＰＥは、０．３６Ｍ　ＮａＣｆ 、２０＋１１８　Ｎａ８２　Ｐ”０４．２０１ＨＥＤＴＡ　ｐＨ７，４である） 。濾紙は乾燥され、７５゛から８０’で３から４時間焼かれた。重複した濾紙は それぞれのプレートから作られた。’ａｍは、０．１×ＳＥＴ、０．１５％Ｎａ ＰＰ１及び１×デンハルト溶液を含む５ＸＳＳＰＥ中で３７℃で１−３時間予め ハイブリダイズされた。油紙はそれから、７２時間、３７℃で、比活性的１０６ ｃｐｍ　／ｐｍｏｌｅ　（７）５’末端標識した５１ｍｅｒオリゴヌクレオチド を５Ｘ１０５Ｃ１）ＩＩ　／ｄ含む同溶液中でハイブリダイズされた。ハイブリ ダイゼーションに続いて、濾紙は６回０．ｌＸ５ＥＴと０．０５％ビロリン酸ナ トリウムを含む５ＸＳＳＰＥで３７℃で洗浄され、それから、３度２ｘＳＳＰＥ で２１℃で洗浄された。

これらはその後乾燥され、−７０’でコダックのライトニング・プラス・インテ ンシファイングスクリーンを用いて、コダックＸＡＲ−５フィルム上でオートラ ジオグラフがおこなわれた。重複した濾紙から明らかに見ることができる信号が プラーク精製のためのファージを釣るのに使用された。プラーク精製段階の濾紙 の調製とハイブリダイゼーションの方払は上と同じであった。洗浄方法は、３７ ℃で２ＸＳＳＰＥの６回交換に簡略化された。

縁り返しのブレーティングによりＩｔｔｌされた６個の単離体がそれから次のプ ローブでの試験のために大Ｐ５ｒｌｒ０６００株の単相の上にまかれた。

（対照プラークに対するものとして）分離したもののそれぞれに対する１７−ｍ ａｒの選択的ハイブリダイゼーションは、プラーク精製に使用したのと同一条件 下で観察された。プローブＣは、ハイブリダイゼーション中の５ＳＰＥＥ度が４ ×に減少したことを除いて類似の試験に用いられた。さらに、それぞの単離体は 、対照プラークでよりもより強いプローブとのハイブリグイピージョンを決定し た。

ファージ精製とＣＤＮＡの特徴づけ ６個の単離されたファージのそれぞれの１汗は、プレートストック法により決定 され、連続のＣ５ＣＬブロツク・バ　−１　ル・５°エ　テ　（遺伝子工学マニ ュアル：先進的な細菌遺伝学）１９８０年、コールド・スプリング・ハーバ−研 究所の中でＲ，Ｗ、ディビス、Ｄ、ポットスタイン、Ｊ、Ｒ，ロスにより述べら れているように、５０％ホルムアミドに対して透析することによりこれらから抽 出された。それぞれの単離体からのＤＮＡは、ＥＣ０ＲＩで消化され、その産物 はアガロース・ゲル電気泳動により解析された。大きなりローンの１つ、λＦＩ ＢＡＣ５の挿入は、Ｓａ１■、ト１ｉｎｄｌｌ。

ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＦ！　Ｉに対する内部部位を欠くことがわかった。ＣＤＮ Ａ挿入は、これら４種の酪素で一諸にλＦＩＢＡＣ５ＤＮＡとλの腕を消化する ことにより明らかとなった。断片がそれからエタノール沈澱され、さらに精製す ることなしにプラスミド１）ＵＯ３のＥＣｏＲＩ部位にＡ　ｍされた。これらの プラスミドは、その後、大腸菌ＪＭ８３株を形質転換するのに使用された。形質 転換体は、アンピシリンを含む平板で選択された。数置の形質転換体のプラスミ ドが精製され、ＥＣ０ＲＩ消化産物に基づいて特徴が調べられた。アガロースゲ ル電気泳動でλＦＩＢＡＣ５の挿入と共に移動する挿入をもつ１個が選択された 。このプラスミドは、ＤＬＪＣ９−Ｆ５／２３７Ｐ１０と命名された。

マツピン　とサブクローニン ＰｓｔＩ部位に関してマツプされた。ＥＣＯＲＩとＰｓｔｌの２重消化は、３ケ 所内部°にｐｓｔｌ認識部位があることを示した。完全な挿入と成分断片がＭ１ ３バクテリオファージｍｐ１９とｍｐ＋ｓにそれぞれサブクローニングされた。

断片のシーケンシングが、プロシー一ジ（１９７７年）の中で、サンガー等、Ｆ 、サンガー、Ｓ、ニツクレンとＡ、Ｒ，コールソンにより述べられたジデオキシ ヌクレオチド法によりおこなわれた。

ｐＬＪＣ９−Ｆ５／２３７Ｐ１０のＤＮＡ挿入の配列は、ヒト皮Ｇ　ＥＲＲ雑芽 細胞から分離されるものと生物学的に等しい成熟綴維芽細胞コラゲナーゼ阻害剤 の１次構造を暗号化する読み取り枠を示した。配列の顕著な特徴は、（１）　挿 入はＥＣＯＲＩ制限部位及びクローニング法と一致したＧ／ＣおよびＡ／Ｔのホ モポリメリック領域に隣接する。

（２）　暗号鎖は、文月いた技術で一致して、５′端にポリ０１３′端にポリＡ をもつ５′から３′に通常通し存在する。

（３）　ポリＣ領域の３′端にすぐに隣接する配列ＧＴＴＧＴＴＧの最初のＧが ヌクレオチドの第１番と考えられるならば、ヌクレオチド第３４番から始まりヌ クレオチド第５８５番まで続く、成熟ヒト繊緒芽細胞コラゲナーゼ阻害剤の１次 構造を暗号化する読み取り枠が存在する。

（４）　ヌクレオチド５８６番から５８８番の終止コドンＴＧＡは、成熟蛋白の ものと同一の翻訳産物のカルボキシ末端を決定する。

（５）　ヌクレオチド１番から３３番は、プロセシングされた蛋白の１次１．Ｊ 　ＪＡＭには見られないが、おそらく、分志蛋白のリーダーペプチドの性質をも つ部分のアミノ酸配列を定義する。

（６）３ケ所のＰｓｔＴ部位は、最初の塩基ヌクレオチドが２９８．３２７及び ４４８岳である。

（７）　ヌクレオチド７８番から始まる制限酵素下ｔｈｌｌｌｌの唯一の認Ａ　 Ｒ列がある。及び（８）　ヌクレオチド２２７番から始まる制限エンドヌクレア ーゼＮｃｏ　Ｉの唯一の認識配列がある。

ヌクレオチド１番から７０３番の配列及び制限部位の解析が示されている。

番号　部位　断片　断片の端 ＡＣＣＩ（ＧＴＩ／ＷＡＣ）　１　２１４　４９５（６９，，８）　２Ｍ　７０ ９２１４（３０，２）　１　２１４ ＡＬＵＩ　（ＡＧＣ丁）　４　３５８　３５８（５０，５）　１　３５８３６３ 　１２４（１７，５）　４８２　６０６４８２　１１９（１６，８）　３６３　 ４８２６０６　１０３（１４，５）　６０６　７０９５（０，７）　３５８’　 ３６３ ＡＶＡ　１（ＣＯＣＧＰＧ）　１ ５３６　５３６（７５，６）　１　５３６１７３（２４，４）　５３６　７０９ ＡＶΔ２（ＧＧＲＣＣ）　３ ２５７　２５７（３６，２）　１　２５７４７７　２２０（３１，０）　２５γ 　４１γ５７２　１３７（１９，３）　５７２　７０９９５（１３，４）　４７ ７　５７２ ８Ｂｖｌ　（ＧＣＴＧＣ）　Ｉ ２６９　４４０（６２，１）　２６９　７０９２６９（３７，９）　１　２６９ ＢＳ丁　Ｎ１（ＣＣＲＧＧ）　３ ３４４　３４４（４８，５）　１　３４４５４４　２００（２８，２）　３４４ 　５４４５５７　１５２（２１，４）　５５７　７０９１３（１，８）　５４４ ５５７ 番号　部位　断片　断片の端 ＤＤＥ　１（ＣＴＮＡＧ）　４ １８６　３４４（４８，５）　３６５　７０９３５５　１８６　（２６，２）　 １　１８６３６０　１６９　（２３，８）　１８６　３５５３６５　５　（０， ７）　３６０　３６５５　（０，７）　３５５　３６０ ＥＣＯＲ１（ＧＡＡＴＴＣ）　１ ６９８　６９８　（９８，４）　１　６９８１１　（７，６）　６９８　７０９ ＦＮＵ４Ｈ１（ＧＯＩＧＣ）　２ ｉ％　４４０（５２，１）　２６９　７０９２６９　１９６（２７，６）　１　 １９６７３（１０，３）　１９６　２６９ ＦＯに１（ＧＧＡＴＧ）　４ １９２　２７４（３８，６）　４３５　７０９２０４　１９２（２７，１）　１ 　１９２３０３　１３２（１８，６）　３０３　４３５４３５　９９（１４，０ ）　２０４　３０３１２（１，７）　１９２　２０４ ＨＡＥ　２（ＰＧＣＧＣＱ）　１ ３６８３６８（５１，９）　１　３６８３４１（４８，１）　３６８　７０９ 番号　部位　断片　断片の端 ＨＡＥ　３（ＧＧＣＣ）　３ ３０　６１６（８６，９）　９３　７０９６３’　３０（４，７）　３０　６３ ９３　３０（４，２）　６３　９３ ３０（４，２）　１　３０ Ｈ（ｄ　ＡＩ（ＧＲＧＣＲＣ）　１ ５５２　５５２　（７７，９）　１　５５２１５７（２２，１）　５５２　７０ ９ ＨＨＡ　１（ＧＣＧＣ）　１ ３６９　３６９（５２，０）　１　３６９３１１Ｏ（４８，０）　３６９　７０ ９ＨＩＮＣ２（ＧＴＱＰＡＣ）　１ １１８　５９１（８３，４）　１１８　７０９１１８（１６，６）　１　１１８ ＨＩＮＦ　１（ＧＡＮＴＣ）　’　２ ３０８　３０Ｂ（４３゜４）　１　３０８５８７　２７９（３９，４）　３０８ 　５８７１２２（１７，２）　５８７　７０９ １１ＰＡ　２（ＣＣＧＧ）　４ ２０７　２２４ｒ３１．６）　３７２　５９６３７２　２０７（２９，２）　１ 　２０γ５９６　１６５（２３，３）　２０７　３７２６５４　５８　（８，２ ）　５９６　６５４５５　（７，８）　６５４　７０９ 番号　部位　断片　断片の端 ＨＰＨ１（ＧＧＴＧＡ）　２ ３８０　３８０（５３，６）　１　３８０５１９　１９０（２６，８）　５１９ 　７０９１３９（１９，６）　、’＞８０　５ｉ９Ｈ８０２（Ｇｉへ、ＡＧＡ） 　１ ６５０’６５０（９１，７）　１　６５０５９（８，３）　６５０　７０９ ＨＮＬ　１（ＣＣＴＣ）　５ ｓ１１９３（２７，２）　８１　２７４２７４　１７４（２４，５）　５３５　 ７０９４０３　１３２（１８，６）　２７４　４０６４８６　８１（１１，４） 　１　、　８１５３５　８０（１１，３）　４０６　４８６４９（６，９）　４ ８６　５３５ Ｈ５丁　２（ＣＣ丁ＮＡＧＧ）　１ １８５　５２４（７３，９）　１８５　７０９１８５（２６，１）　１　１８５ ８ＣＩ　１（ＣＣ３ＧＧ）　２ ３７２　３７２（５２，５）　１　３７２５９５　２２３（３ｉ、５）　３７２ 　５９５１１４（１６，１）　５９５　７０９ ＮＣＯ１（ＣＣＡＴＧＧ）　１ ２２７　４８２（６８，０）　２２７　７０９２２７（３２，０）　１　２２７ 番号　部位　断片　断片の端 ＮＳＰ　８２（ＣＶＧＣＷＧ　）　１ ｉ９７　５１２（７２，２）　ｔ９７　７０９１９７（２７，８）　１　１９７ ＰＳ丁　１　（ＣＴＧＣＡＧ）　３ ２９８　２９８（４２，０）　１　２９８３２７　２６１（３６，８）　４４８ 　７０９４４８　１２１（１７，１）　３２７　４４８２９（４，１）　２９８ 　３２７ ＳＡＤ　１（ＣＣ丁ＮＡＧＧ）　１ １８５　５２４（７３，９）　１８５　７０９１８５（２６，１）１　１８５ ＳＡＵ　３Ａ（ＧＡＴＣ）　１ １５０　５５９（７８，８）　１５０　７０９１５０（２１，２）　１　１５０ ＳＡυ９６１（ＧＧＮＣＣ）　５ ２９　２２０（３１，０）　２５７　４７７９２　１６５（２３，３）　９２　 ２５７２５７　１３７（１９，３）　５７２　７０９４７７　９５（１３，４） 　４７７　５７２５７２　６３（８，９）　２９　９２ ２９（４，１）　１　２９ 実話例２．六Ｆｊｚｍにおけるコラゲナーゼ阻害剤の発現この実７１ｉ！例にお いて、簡易ＤＮＡ配列をクローン化したＣＤＮＡの５′端に連結する最良の方法 が述べられる。

これには、暗号配列内の特定の点でヌクレオチドを切断し、その切除及び組換え を許すような方式で合成オリゴヌクレオチドによる（即ち、有効な制限部位を組 み込むことにより）暗号配列の望む部分を再構築することが含まれる。

暗号領域の５′端を削除することは、５′方向にＴｔｈｌｌｌＩ部位からのびる ＤＮＡの両鎖を合成し、ＢａｍＨＩの付き出しで終わることによりおわる。

ＦＩＢＡＣＡと引用されるこの合成オリゴヌクレオチドは、次の性質をもつ。

〔１）　コドンの選択は、高度に発現される細菌の蛋白の遺伝子に最も頻繁に見 い出されるものに偏っている。

＋２１　１訳が開始されるメチオニンのコドンは、ヒトのプロセシングを受けた ＦＩＢＡＣの暗号領域を始めるシスティンのすぐ上流に準備される。

（３１ＢａｍＨＩ部位とメチオニンコドンとの間隔は、ｐｕｃｓにクローニング されたとき、ＦＩＢＡＣの暗号領域がβ−ガラクトシグーゼ遺伝子の５′端をも った枠内にあることを示す。

（４）　枠内の終止コドンとシＡフィン・ダルガノ配列も又存在する。β−ガラ クトシダーゼの７ミノ末端部分に対Ｊるこの枠の翻訳は、ＴＡΔコドンで終了し 、ＦＩＢＡＣの翻訳は次のＡＴＧで始められる。

（５）　コドンは、ＦＩＢＡＣの開始コドンがＧで始まる１−１ｉＡ１部位をつ くるように選択された。

（６１Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ配列の３′端から１塩基離れてＰｖｕ　Ｉ部位が存在す る。

ＦＩＢＡＣＡの楢造は、 ＧＡ　’ｒＣＣＧＣＧ　ＡＴＧ　Ｃ−ＧＡ　Ｇ？’Ｇ　ＴＡＡ　Ｇλλ　ＡＴＧ 　ＴＧＣＡＣＴＧ　（ＧＣＴＡＧ　ＣＣＴ　（ＡＣＡＴＴ　ＣＴＴ　ＴＡＧ　Ａ ＣＧ　ＴＧＡ”、ＧＣＧＴＴ　ＣＣＧ　ＣＣＧ　ＣλＴ　ＣＣＧ　ＣＡＧ　ＡＣ Ｔ　ＧＣ”ｌ’　τＴｃＡＣＧ　ＣＡＡ　ＧＧＣＧＧＣＧＴＡ　ＧＧＣＧＴＣＴ ＧＡ　ＣＧｋ　ＡＡＧＴＧＣλλＣＴＯτＧλＣＣ ＡＣＧ　ＴＴＧ　ＡＧＡ　ＣｒＧ　ＧＡＦＩＢＡＣＡは、一連の４ｇ！の成分の オリゴヌクレオチドとして、ＡＢＴ　ＤＮＡ合成機を用いて合成された。

成分オリゴヌクレオチドＦＡＩは、 ＣＡＴＣＣＧＣＧ八Ｔへ　ＣＧＧＡＧ　ＴＧＴＡＡ　ＧＡＡＡＴ　ＧＴＧＣＡ　 ＣＴＴＧＣである。

成分オリゴヌクレオチドＦＡ２は、 ＧＧＡＡＣＧ　ＣＡＡＧＴ　ＧＣＡＣＡ　ＴＴＴＣＴ　ＴＡＣＡＣＴＣＣＧＡ　 ＴＣＧＣＧである。

成分オリゴヌクレオチドＦＡ３は、 ＧＴＴＣＣＧＣＣＧ　ＣＡＴＣＣＧＣＡＧＡ　ＣＴＧＣＴ　ＴＴＣＴＧ　ＣＡＡ ＧＴ　ＣＴＧＡＣＣである。

成分オリゴヌクレオチドＦＡ４は、 へＧＧ丁ＣＡＧＡＧＴ　ＴＧＣＡＧ　ＡＡＡＧＣＡＧＴＣＴ　ＧＣＧＧＡ　ＴＧ ＣＧＧ　Ｃである。

ＦＩＢＡＣ遺伝子の暗号部分の残りは、ｐｔＪＣ９−Ｆ５／２３７Ｐ１０のＴｔ ｈｌｌｌＩとＥＣＯＲＩによる２重消化により生じた３’７ｔｈｌｌ１１からＥ ＣＯＲｒの１析片として分岨された。

合成リンカ−が７ｔｈｌｌ１１からＥＣＯＲＩの断片の３′端を５ａｌｌ部位に 連結するために作製された。

これらのオリゴヌクレオチドは、Ｓａｌ■部位を再作製し、ＥＣＯＲＩ部位をこ わすように考えられている。リンカ−はオリゴヌクレオチドリンカーＡ１とリン カ−Ａ２から成る。

リンカ−Ａ１は、ＡＡＴＴＧＧＣＡＧである。

リンカ−Ａ２は、ＴＣＧＡＣ丁ＧＣＣである。

これらのオリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドＦＡＩ−ＦＡ４は、別々にキ ナーゼで処理され、等モル比で、ｃＤＮＡ（７）Ｔｔｈ　ｌ　Ｉ　Ｉ　Ｉ−Ｅｃ ｏＲＩ３’端及び３ａｍＨＩ／Ｓａ　Ｉ　Ｉ切断ｍＤ　Ｉ　９ＲＦＤＮＡとアニ ールされた。連結されたＤＮＡは、ＪＭ１０５にトランスフェクトするのに使用 される。プラークは、ＩＰＴＧと、Ｘ−ｇａｌの存在下での色とオリゴヌクレオ チドＦＡ２に対するハイブリダイゼーションにより釣られる。数個の陽性プラー クがシーケンスされるべきである。計画された配列を含むプラークは、ＢａｍＨ Ｉ／Ｓａ　ｌ　１消化のｐｕｃｓにサブクローニングされる。この構築物におけ るＦＩＢＡＣＩ伝子の翻訳は、β−ガラクトシダーゼで始められる翻訳に続く。

この発現ベクターはｐｕｃｓ−Ｆｉｃとして引用される。

他の高度に発現される蛋白で開始される翻訳につながったＦＩＢＡＣの翻訳は似 たように整えられる。例えば、シャイン・ダルガノ配列と開始メチオニンを含む ＱｍｐＡｉη伝子の一部が合成された。この配列は、ＯｍｐＡ蛋白の完全な信号 ペプチドを暗号化し、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、Ｐｖｕ　ＩＡび５ｔｕＩを含む 使いやずい制限部位を有していた。意味をもつ鎖の配列は １０　２０　コ０　４０　５０　６０ フＯε０　９０　１００　１１０ ＧＣＧＣλα℃ＣフＣＴＧＧＴんり講α＝７Ｅ：　５１５Ｍ　詰 ＨＴＡＮ　ＸＴ− 人　Ｕ　工　Ｌ　Ｎυ この配列はこれ以降、０ｆｆｌＡリーダーとして記載される。ＯｍρＡとのＦＩ ＢＡＣの翻訳の組合わせは、ｐｕｃｓ−Ｆｉｃをｐｖｕ　１及び５ａｌｌで切断 し、暗号領域を分■することにより達せられる。０ｍ１）Ａり一ダーから分頌さ れたＥＣＯＲＩからＰＶＬＪ　ＩＫ片と共にこれは、ＥｃｏＲＩ／Ｓａ　ｌ　Ｉ 切断のｐｕｃａにクローニングされる。先の実茄例でのように、転写は、Ｉａｃ プロモーターにより動かされ、Ｉａｃオペレーターで１ａｃＩ遺伝子産物により 調節される。この１１８ＡＣｉ現ベクターは、ｐｕｃａ−Ｆ１０ｒｒ＋ｐＡｒＣ と呼ばれる。

内側の細胞膜を通ってＦＩＢＡＣの移送をさせるために、適当なリーダー配列が ＦＩＢＡＣのアミノ末端に付加される。そこで産生される蛋白は、移送され、プ ロセシングされて、放熱した形態となる。

そのような移送をおこなわせるために、ＦＩＢＡＣの構造領域に続いて大腸菌０ ｍ１）Ａ蛋白の信号ペプチドを暗号化するＦＩＢＡＣ遺伝子が作製される。この 特殊なＦＩＢＡＣ遺伝子は、変えられたＦＩＢＡＣ暗号領域の５′端に枠内の終 止コドンを有する必要がある。これを達成するため、ＨＱｉＡ１部位からＮＧｏ 　１部位までひろがるｐＬＩｃ８−Ｆｉｃの５′暗号領域の部分が分離される。

上流配列は、３ａｍＨｒ及びＨｇ１ＡＩの付着末端をもち、内側にＳｔｕ　１部 位を含むリンカ−として再合成される。これは２種類のオリゴヌクレオチド、リ ンカ−Ｂ１とリンカ−Ｂ２として合成される。

リンカ−Ｂ１は、ＧＡＴＣＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣ八である。

リンカ−Ｂ２は、ＧＧＣＣＴＧＧ　である。

リンカ−Ｂ１及びＢ２は別々にキナーゼで処理され、′　等モル１とで、上述の Ｈｇ１Ａ　Ｉ−Ｎｃｏ　ｌ断片及びＢａｍＨＩ／Ｎｃｏ　Ｉ切１ｇ１ＤＵＣ８− Ｆｉｃにアニールされる。得られた描築物は、β−ガラクトシダーゼのアミノ末 端の翻訳に伴う枠内にＦＩＢＡＣの暗号配列を有する。この配列の翻訳物は、Ｆ ＩＢＡＣとの融合蛋白を生成する。このプラスミドはＤＵＣ８−Ｆｆと呼ばれる 。

ＯｍｐＡリーダー配列のＦＩＢＡＣの暗号領域への接着は、ＥｃｏＲｌ／Ｓｔｕ 　Ｉ切断ｐＨｃ８−Ｆｆを過剰の精製されたＯｍｐＡリーダーのＥｃｏＲｌ−３ ｔｕ　１断片に連結することにより完了される。形質転換の後数個のコロニーか らのプラスミドがハイブリダイゼーションにより、特性が調べられた。ＯｍｐＡ リーダー断片を組み込んでいるプラスミドはさらに、構造を確認スるために特性 が調べられた。このプラスミド、ｐＬＩｃ８−ＦＯｍｌ）Ａ１は、大腸菌Ｏｍｐ Ａ蛋白の信号ペプチドから始まり、ヒトＦＩＢＡＣで終わる融合蛋白の合成を指 揮する。蛋白のＯｍｐＡ部分に存在する信号は、蛋白の細胞質からの移動及びＦ ＩＢＡＣの１次構造の適切なり所を起こさせる。蛋白あるいは核酸レベルでのリ ーダー配列度が影響されるならば、遺伝子は、いくつかの既知の大腸菌リーダー 配列を暗号化するように変えられなければならない。

Ｓ２１論されている全ての遺伝子の転写が１８Ｃプロモーターによりおこなわれ る。翻訳開始部位の場合でのように、遺伝子のプロモーター及びオペレーター領 域は、交換される。Ｆ　Ｉ　ＢＡＣは又、λＰ［プロモーターとオペレーター（ ｏｌ）及びＥ、アマン、Ｊ、ブロシウスとＭ。

タシュネ　ジーン第２５巻、１６７−１７８ページ（１９８３年）に述べられて いるような雑種プロモーター・オペレーターＴａｃを組み込んだベクターから発 現される。リポソーム結合部位構造領域と３′非翻訳配列を含む遺伝子の部分の 削除及びＰ、又はＴａｃプロモーターを含む変えられたベクターへの挿入には、 ｐｕｃａ−ＦｌｏｍｐＡ　ｉ　ｃとｐｕｃａ−ＦｌｏｍｐＡ　ｌのこれらの構造 に隣接する独特の１ＩＩＪ限部位が利用される。

ＥＣＯＲＩから３ａｌｌへの断片の同様に消化されたプラスミドｐｏｐｓへの挿 入は、λＰ、プロモーターに支配されるこれらの遺伝子の転写をおこさせる。転 写制御は、この同じプラスミド上にあるＣｌ８５７変異の長所により温度感受性 である。

Ｔａｃプロモーターの転写単位への類似の遺伝子断片の挿入は、最初に分離され たＥｃｏＲＶから５ａｌｌの断片により行なわれる。これは、ＢａｍＨＩとＲｖ ｕｌｌの部位に隣接し、ｌａｃオペレーターを含む合成のＴＱＣプロモーター配 列と共に、ｐＢＲ３２２又はその読尋体のＢａｍＨｌ−３ａ　ｌ　１部位に挿入 される。この場合のＭ　４１体は、ＩａＣＩ遺伝子又は■９遺伝子のいずれかを 含むプラスミドをさず。

大ｌ１９ｍとは別の宿主微生物でのＦＩＢＡＣの発現が考えられる。解団及びバ チルス、シュードモナスとクロスＥ匹乏ユ込屈の細菌がそれぞれ苔しい利点を示 す。上にｌＩ！！略した過程は容易に他に適合する。

一般的に、どの微生物の発現ベクターも上記の大腸菌のベクターと類似の性質を 具体化する。ある場合において、上で議論された特異的な遺伝子緯築物を直接的 に新しい宿主と両立できるベクターの中に簡単に移ずことが可能である。伯の場 合には、遺伝子の操作又は構造成分を変えることが必要であるか又は望ましい。

実店例３ とトコラゲナーゼ阻害剤は、各種の微生物で発現された後に、簡単に［１される 。それぞれの場合において、混在する蛋白のスペクトラムは異なる。それ故、適 当な精製段階が、他の蛋白からのそして同様な仕事の他の方法からのヒトコラゲ ナーゼ阻害剤の良好な分離を与えることが既に知られている各種の段階から選択 される。

阻害剤が微生物から分泌されないとすると、組換え体微生物の内部で含有体を形 成する。これらの形態は、フレンチプレスで細胞を破砕した後に、分別遠心によ り他アニジンか８Ｍ尿素で可溶化され、そして阻害剤蛋白は、亜硫酸ナトリウム とシスティンの反応により、より完全に可溶化される。この段階の次に、システ ィンは、ジチオスレイトールでその還元型に戻される。阻害剤蛋白が含有体から 可溶化されると、折りたたまれていない阻害剤に対する抗体を用いたイミュノア フイニテイクロマト再び折りたたまれる。阻害剤が再び折りたたまれた後あるい は、阻害剤が微生物から分泌されないならば、他の蛋白からの精製が各科の方法 によりおこなわれる。初期段階には、５０にダルトンで分離する膜を通すに外瀘 過又は硫安分画が含まれる。伯の有効な方法には、限定はされないが、イオン交 換クロマトグラフィー、ゲル３Ｍ、ヘパリン−セファロースクロマトグラフィー 、逆相クロマトグラフィー、あるいは亜鉛キレートクロマトグラフィーが含まれ る。これら全てがうまく精製に用いられる。

さらに高い分離能をもつ段階が、疎水的相互作用によるクロマトグラフィー又は イミュノアフイニテイークロマトグラフイーである。精製後、メタロプロテイナ ーゼ阻害剤は少なくとも９０−９５％の純度である。

１展亘Ａ ヒト羊水からのコラゲナーゼ阻害剤の精製廃棄された羊水診断試料から得られた ヒト羊水が集めステムで１００ｋＤの排除フィルターを通す限外濾過に６１がか けられた。溶出液はミリポア社の１０ｋＤ排除フイルターに続いてアミコンｐＨ ／ｌ−１０膜を通すことにより濃縮された。濃縮羊水１０７！が、ｐＨ７，６， ０、０５Ｍ　Ｈｅｐｅｓ　、　１Ｍ塩化ナトリウム、０．０１Ｍ塩化カルシウム 及び０．０２％窒化ナトリウム（全ての堕品はシグマ・、ケミカル・カンパニー から入手された）で平衡化されたＬＫＢ社のウルトロゲルＡＣＡ５４の２．５Ｘ １００ｃｉカラムを通して溶出されたａ阻害剤を含む両分が回収されｏ、ｏｉＭ ｓ化カルシカルシウム０２％窒化ナトリウムを含むｐＨ７，５の０．０２５Ｍ　 Ｉ＋（！ｐｆ３ｓ緩衝液に透析され、同暖街液で平衡化された１、５Ｘ２８ｃｍ のヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシアＩｎｃ、から入手）カラム にのせられた。このカラムは、上記１ｍ液１ｊ！で洗浄され、０から０．３Ｍの 塩化ナトリウムの直線濃度勾配で溶出された。約０．１から０．１５Ｍ塩化ナト リウムで溶出される阻害剤活性の量大のピークの両分が集められ、１１Ｉｒ２に 濃縮されて、０．０５％トリフロオロ酢Ｒ（アルドリッチ・ケミカル・カンパニ ー）で平衡化されたシンクロバックｒｐ８；！相ＨＰＬＣカラムにかけられた。

カラムは０から４０％のアセトニトリルの直線勾配で１分間あたり１／２％で溶 出された。全ての両分が直ちに、アセトニトリルを除くために、サバント・スピ ード−バック・コンセン１−レータ−で乾燥され、アッセイの前に、ｐＨ７，５ の０　、　Ｉ　Ｍ　１ｌｅｐｅｓに最溶解すレタ。阻害剤ハ、３２から３８％の アセトニトリルで溶出した。阻害剤を含む両分が集められ、１００μｌがバイオ ラッドバイオミル−Ｔ　Ｓ　Ｋ　２５０　＋−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃゲル濾過カラムで 溶出された。阻害剤活性の回収ピークは阻害剤を０．１ｑ含んでおり、ＳＤＳポ リアクリルアミドゲル電気泳動により判定すると９５％以上の純度であった。

実施例５ ヒト胎児皮Ｐ２繊維芽細胞無血清培地からの繊維芽糊胞コラゲナーゼ阻害剤の精 製 ヒト胎児皮口繊帷芽細胞が、無血清組織培養培地で生育された。この培地１０１ が集められ、０．０２％窒化ナトリウムと０．０１Ｍ塩化カルシウムを含むｐＨ ７，５の０．０２Ｍ　１ｌｃｐｅｓ緩ＦＢ液に対し、透析されて、同駿衝液で平 衡化されたヘパリン・セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシアＩｎｃ、）の２． ８Ｘ４８Ｑ＋ｌカラムに充填された。カラムはこのＩＩ液２１で洗浄され、０か ら０．３〜１の塩化ナトリウムを含むこの緩衝液の直線勾配で溶出された。得ら れた両分は、ヒト繊維芽ｐＨｌ胞コラゲナーゼを聞書する能力により阻害剤の存 在が試論された。

活性のピークに相当する両分は、０．１５Ｍ塩化ナトリウム付近で得られたもの である。これらの画分は約５−までアミコンＹＭ１０フィルターを通す限外濾過 により濃縮され、濃縮液は、１％トリフルオロ酢芯で平衡化された２５０Ｘ４． １ｍのシンクロバックｒ　ｐ−ａ逆相ＨＰＬＣカラムに４回に分けて充填された 。カラムは、０．１％トリフルオロ酢酸中の０から６０％アセトニトリルの直線 勾配で溶出された。勾配は１分間あたり１／２％アセトニトリルで運転された。

阻害剤は、２６から２９％のアセトニトリルの間で２個の鋭いピークで溶出した 。全ての両分が直ちにサバント・スピード・バック・コンセントレータ−でＶｌ 　ｊＮされ、ｐＨ７，５の０゜１　Ｍ　ＨｅＤｅＳに再溶解され、検定された。

少なくとも１゜２　ｔａｇのコラゲナーゼ阻害剤が回収され９０−９５％゛の純 度であった。この物質は、１７．５％還元ＳＤＳゲルで泳動すると単一のバンド を与える。システィンのカルボキシメチレーションと同一条件下での同−ＲＰ− ８カラムによる溶出の後、阻害剤は、蛋白のシーケンシングに適した均一性をも つ。

１比玉玉 ヒトコラ−ゲナーゼ阻害剤は、微生物でのその遺伝子の発現と微生物により生産 された伯のほとんどの蛋白からのコラゲナーゼ阻害剤の分離の後、その変性状態 から元の構造に容易に戻れると予想される。Ｌ二盈之エヱユ飾の醇素学）第１巻 、Ｒ，Ｂ、フリートマンとＨ，Ｃ。

ホーキンス編、１５８−２０７ページ（１９８０年）の中の゛ジスルフィド結合 の１ｒでＲ，Ｂ、フリートマンとり、Ａ、ヒルジンにより述べられているように 他のジスルフィドを含む蛋白の再生に必要な条件から類推することにより、ヒト ・コラゲナーゼ阻害剤の再生は、ｐＨ８゜Ｏかそれ以上の溶液中でおきる。この ｐＨで、蛋白のシスティンは、部分的にイオン化され、そしてこの条件は、元の ジスルフィド結合の対合の達成に必要である。

用害剤澗度は、比較的低く、再生過程を妨害する分子間ジスルフィド結合をした 集合体の形成を最少化する０、ｌ＋ｓ／−以下であった。

再生されていない（還元された）構造に比較して、再生されたく自然の）ジスル フィド結合をもつ構造の安定性は、溶液の酸化・還元能及び他の酸化−還元活性 分子の溌度の両者に依存するのでａ化還元能は、還元型：び生型グルタチオンの 比１ｏに等向の能力を与える酸化還元Ｍ　Ｎ　Ｚで緩衝化されることが予想され る。還元グルタチオンの好ましい淵度範囲は０．１からｉ、ＱｍＨである。

より高濃度では、蛋白と混合ジスルフィドを形成し、再生された（自然の）構造 の収ａが減少する。非再生蛋白と天然構造の相対的な安定性及び再生の速度と回 収ａは又、アドバンス・イン・プロティン・ケミストリー（蛋白化学の進歩）第 ３３巻、１６７−２３６ページ（１９７９年）のＰ、Ｌ、ブリバロフ“蛋白、小 球状蛋白の安定性”に議論されているように、ｐＨ１温度、水素イオン緩衝液の 型、イオン強度及び特別な陽イオン又は陰イオンの存在の有無のような他の溶液 の変数に依存している。

これらの条件は、それぞれの蛋白で変化し、実験的に決定される。（非再生に対 して）天然の構造に強く結合しやずく、天然の（再生）蛋白からその後簡単に分 離される分子の添加は、再生の収はだけでなく速度も増加することが予想される 。これらの分子には、天然構造に対して生じた単々ローン抗体及び韻乳類のヱ素 コラゲナーゼあるいはゲラチナーゼのような強く天然のコラゲナーゼ阻害剤に結 合ザる他の蛋白が含まれる。

実旅例７ ここに述べられている落２の最良配列、即ち、ＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＧＣＡＧＡ ＴＣＣＡＧ　ＣＧＣＣＣＡＧＡＧＡ　ＧＡＣＡＣＣＡＧＡＧ　ＡＡＣＣ（：ＡＣ ＣＡＴ　ＧＧＣ（ＣＣＣＴsＴ’ ＨＦＸＢＩ！ＨＮＳ Ａ　ＮＨ工Ｍ　ＣＡ ＥＵＯＮＥ入　ＯＵ コ１２１２１１１ ＧＡＣＣＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＣ；ＡＴＣＣＴＧＴＴＧＴＴＧＣＴ　ＧＴＧＧ ＣＴＧＡＴＡ　ＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧ　ＧＧ（ＣτＧＣλＣb Ｂ　ＳＥ’　５Ｈ τＧτＧＴＣＣＣλＣＣＣＣＡＣＣＣＡＣ，％　ＧλＣＧＧＣＣＴτＣＴＧＣ入 ＡＴτＣＣＧ　ＡｃｅτＣＧＴＣ入ＴＣλＧＧＧＣＣＡＡＧＨＴＭ　Ｓと Ａ　Ｔ　Ｎ　λＡ Ｅ　ＨＬ　ＵＥ ３　１　Ｌ　１３ １９０　２００　２１０　２２０　２コ０　２４０２５０　２６０　２７０　２ ８０　２９０　コ００ＵＥ　にλ　ＵＰ　Ｋ　Ａ　Ｃ ３１０３２０コ３０　３４０　３５０　３６０ＡＣＣＣＣＣ（＜ＣＡ　ＴＧＧＡ ＧＡＧＴＧＴ　ＣＴＧＣＧＧＡＴＡＣＴＴＣＣＡＣλＧＧＴ　ＣＣＣＡＣλλＣ ＣＧ　ＣＡＧＣＧＡＧＧλf 醒　Ａ　ＢＭ Ｃｖ　Ｂ　醒 ３７０　コ８０　３９０　４００　４１０　４２０Ｔ　Ｋ　Ｎ　Ｔ ４コ０ は次の制限部位をもっ： 番号　部位　断片　断片の端 ＡＣＣＩ　（ＧＴＶＷ八Ｃ） へ ２９５　２９５（６８，３）　１　２９５１３７（３１，７）　２９５　４３２ ＡＶＡ　２（ＧＧＲＣＣ） ３３８　３３８（７８，２）　１　３３８９４（２１，８）　３３８　４３２ ＢＢＶ　１　（ＧＣＴＧＣ） ３５０　３５０（Ｃ１１，０）　ｉ　３５０８２（１９，０）　３５０　４３２ ＢＩＮ　１　（ＧＧＡＴＣ） １４　４１８（９６，８）　１４　４３２１４（３，２）　１　１４ ＢＳＴ　Ｎ１（ＣＣＲＧＧ） ６５　３６０（８３，３）　６５　４２５４２５　６５（１５，０１６５ ７（１，６）　４２５　４３２ ＤＤＥ　１（ＣＴＮＡＧ） ２６７　２６７（６１，８）　１　２６７１６５（３８，２）　２６７　４３２ 番号　部位　断片　断片の端 Ｆ１４Ｕ！ＩＨ１（ＧＣＮＧＣ） ８　２６９（６２，３）　８　２７７ ２７７　８２（１９，０））　３５０　４３２３５０　７３（１６，９）　２７ ７　３５０８（１，９）　１　８ ＦＯＫ　１（ＧＧＡ丁Ｇ） ７６　１９７（４５，６）　７６　２７３２７３　９９（２２，９）　２８５　 ３８４２８５　７６（１７，６）　ｉ　７６ ３８４　４８（１１ｊ）３８４　４３２１２（２，８）　２７３　２８５ ＨＡＥ　２（ＰＧＣＧＣＱ） １９　４１３（９５，６）１９　４３２１９（４，４）　１　１９ ＨＡＥ　３（ＧＧＣＣ） １　２５８（５９，７）　１７４　４３２５１　６０（１３，９）　５１　１１ １１１１　５０（１１，６）　１　５１ １４４　３３（７，６）　１１１　１４４１７４　３０（６，９）　１４４　１ ７４１（０，２）　１　１ 番号　部位　断片　断片の端 ＨＨＡ　１（ＧＣＧＣ） ２０　４１２（９５，４）　２０　４３２２０（４，６）　１　２０ ＨＩＮＣ２（ＧＴＱＰＡＣ） １９９　２３３（５３，９）　１９９　４３２１９９（４６，１）　１　１９９ ＨＩＮＦ　１（ＧＡＮＴＣ） ３８９　３８９（９０，０）　１　３８９４３（１０，０）　３８９　４３２ ＨＰＡ　２（ＣＣＧＧ） ２８８　２８８（６６，７）　１　２８８１４４（３３，３）　２８８　４３２ ）ＩＮＬ　１（ＣＣＣｏ１ １６２　１９３（４４，７）　１６２　３５５３５５　１６２（３７，５）　１ 　１６２７７（１７，８）　３５５　４３２ Ｈ３丁　２（ＣＣＴＮＡＧＧ） ２ら６　２６６（６１，６）　１　２６６１６６（３８，４）　２６６　４３２ 番号　部位　断片　断片の端 ＮＣＯ１（ＣＣ八へＧＧ） ４７　２６１（６０，４）　４７　３０８３０８　１２４（２８，７）　３０８ 　４３２４７（１０，９）　１　４７ ＮＳＰ　８２（ＣＶＧＣＷＧ　） ２７８　２７８（６４，４）　１　２７８１５４（３５，６）　２７８　４３２ ＰＳＴ　１　（ＣＴＧＣＡＧ） ３７９　３７９（８７，７）　１　３７９４０８　２９（６，７）　３７９　４ ０８２４（５，６）　４０８　４３２ ＳＡＤ　１　（ＣＣＴＮＡＧＧ） ２６６　２６Ｇ（６１，６）　１　２６６１６６（３８，４）　２６６　４３２ ＳＡＤ　３Ａ（ＧＡＴＣ） １４　２１７（５０，２）　１４　２３１２３１　２０１（４６，５）　２３１ 　４３２１４（３，２）　１　１４ 番号　部位　断片　断片の端 ５ＡＵ９６１　（ＧＧ：（ＣＣ） ５１　１６５（３３，２）　１７３　３３Ｂ１１０　９４（２１，８）　３３８ 　４３２１７３　６３（１４，６）　１１０　１７３３３８　５９（１３，７） 　５１　１１０５１（１１，８）　１　５１ ＳＣＲＦｌ（ＣＣＮＧＧ） ６５　３６０（８３，３）　６５　４２５４２５　６５（１５，０）　１　６５ ７＜ｉ、６）　４２５　４３２ ＳＦＡ　Ｎ１（ＧＡＴＧＣ） ７５　１９９（４６，１）　７５　２７４２７４　１５８（３６，６）　２７４ 　４３２７５（１７，４）　１　７５ ＳＴＹ　１（ＣＣＲＲＧＧ） ４７　２６１（６０，４）　４７　３０８３０８　１２４（２８，７）　３０８ 　４３２４７（１０，９）　１　４７ ■丁Ｈ１ｌ＋　１（ＧＡＣＮＮＮＧＴＣ）１６０　２７２（６３，０）　１６０ 　４３２１６０（３７，０）　１　１６０ 番号　部位　断片　断片の端 ＸＨＯ２（ＰＣ八へＣＱ） １３　４ｉ９（９７，０）　１３　４３２１３（３，０）　１　１３ 以下のものは出現しない： ＡへＴ　２　ＡＦＬ　２　ＡＦＬ　３　ＡＨＡ　２ＡＨＡ３　ＡＬＵＩ　’　Ａ ＰＡＩ　八５Ｕ２ＡＶＡ　Ｉ　ＡＶＡ　３　ＡＶＲ２ＢＡＬ　ＩＢＡＨＨＩ　Ｂ ＡＮ　Ｉ　ＢＡＮ　２　ＢＣＬ　ＩＢＧＬ　Ｉ　ＢＧＬ　２　ＢＳＨＩ　ＢＳＰ 　１２８６ｎｓｓｌｌ　Ｉ　ＢＳＴ　Ｅ２　ＣＦＲＩ　ＣＬＡ　ＩＥＣＱ　Ｉｌ ｌ　ＥＣＯＩ’ｉ５　Ｆｉｌｌ；Ｄ　２　ＧＤＩ　２ＨＡＥ　Ｉ　ＨＧＡ　Ｉ　 ＨＧＩ　ＡＩ　ＨＧＩ　ＣＩＨＧＩ　０１　ＨＧＩ　Ｊ２　１１１Ｎ０３　８Ｐ Ａ　ＩＨＰＨＩ　’　ＫＰｔｌｌ　８８０２　ＨＬＵＩＨ３Ｔ　Ｉ　ＮＡＥ　Ｉ 　ＮＡＲＩ　ＮＣＩ　ＩＨＯＥ　Ｉ　ＮｔｌＥ　Ｉ　８０丁　Ｉ　ＮＲＵ　ｌＮ ５Ｐ　ＣＩ　ＰＶＵ　Ｉ　ＰＶＵ　２　ｒｔｒ＋ｕ　１Ｒ３Ａ　Ｉ　ＳＡＣＩ　 ＳＡＣ２ＳＡＬ　ｌ５ＣＡ　１　３８八　ｉ　ＳＮＡ　Ｉ　５ｔｉＡ　ＢＩＳＰ εＩ　５ＰＩＩ　Ｉ　ＳＳＰ　Ｉ　ＳＴＵ　ＩＴＡＱ　Ｉ　ＸＢＡ　Ｉ　ＸＩＯ Ｉ　ＸＨ八　３ＨＮ　１ このＣＤＮＡの顕著な特徴は、 １、暗号鎖は、５′端にポリＣ領域をもつ５′から３′方向へ存在する。

２、配列ＧＧＣＣＡＴ　ＣＧＣ’ＣＧＣの最初のＧをヌクレオチドの第１番と考 えるならば、読み取り枠はヌクレオチド１から、この部分的ｃＤＮＡの３′端で あるヌクレオチド４３２に存在する。

３、この読み取り枠の最初のメチオニンはヌクレオチド４９から５１に暗号化さ れ、翻訳の開始部位をあられす。

４、ヌクレオチド４９から１１４で示されるアミノ酸配列は、成熟蛋白の１次構 造には見られないが、ヒト蛋白のリーダーペプチドの配列である。

５、ヌクレオチド８２から４３２の配列は、実施例１の第１の配列の挿入のヌク レオチド１から３５１の配列と同一である。

６、成熟蛋白のアミノ酸配列は、糖の付着の２個のコンセンサス配列を示す。ヌ クレオチド２０２から２１０の−Ｎ−Ｑ−Ｔ及びヌクレオチド３４６から３５４ の−Ｎ−Ｒ−８−１これらの配列は、成熟蛋白のそれぞれ３０から３２及び７８ から８０のアミノ酸残基である。

両方の部位はヒトの阻害剤蛋白ではグリコジル化されている。

衷」Ｕ１旦 大ｖＡ菌で、Ｆ　Ｉ　ＢＡＣ遺伝子の転写と翻訳を司どる一連の発現ベクターが 構築された。

Ａ３発現ベクターＣＦ　：　ｂ５１ これらの構築ベクターの最初は、その転写がｌａｃプロモーターとオペレーター により司ざどられ、８ＩＤされるように編成されたヒト繊維芽１８胞コラゲナー ゼ阻害剤（ＦＩＢＡＣ”）の暗号領域を含むプラスミドｐＵＣ８の誘導体である 。このベクターｐＦ　ｉ　ｂ５１は、発現ベクターｔ）ＬＪＣ８−Ｆ　ｉ　ｃの 集合のため実施例２に概略された方法を少し修正して作製された。

暗号領域の５′端の削除は、ヌクレオチド９３のＨａｅ■部位からヌクレオチド ６９８に始まる３′側ＥＣＯＲ１部位にひろがるＤＮＡ断片を単離することによ りなされる。５′端の再構築は、オリゴヌクレオチドＦＡ３及びＦＡ４がそれぞ れ、再構築物をＨａｅｎＩ認識部位へひろげるために１２塩基に長さをそろえら れた以外は述べられたようにおこなわれた。その結果、ＦＩＢＡＣＡ’の構造が 創られた。

Ｇ入　ＴＣＣＧＣＧ　Ａフｅ　ＧＧＡ　ＧτＧ　τλ入　ＧλλＧ　ＣＧＣＴＡ Ｇ　ＣＣ？　ＣＸＣＡＴτ　Ｃ？フ入τり　ＴＣＣ入Ｃフ　τＧζ　Ｃτフ　Ｃ ＣＧ　ＣＣＧ　Ｃ入ττλｃ　Ａｃ’：、　τＧ入　入Ｃコ　ＣλＡ　ＧＧＣＣ ＧＣＧτλＣＣＧ　ＣλＧ　ＡＣフ　ＧＣフ　ττＣτＧＣ入λＣτＣフＧ：ａ ＣＧτＣτＣλ　ＣＳ入　λ入Ｇ　λＣり　ττＧ　λＧλＧＡＣＣＴＧＧτＧ ＡＴＣＡＬＡＧ ＣτＧ　ＧＡＣＧＡＣＴＡＧ　ＴＣＣＣＦＩＢＡＣＡ’　の顕著な特徴は、実施 例２に述べられたそのままである。

Ｈａｅｍ−ＥｃｏＲｌ断片の３′端に５ａｌ１部位をつけるために、合成リンカ −が作製された。これらのオリゴヌクレオチドは、５ａ１１部位をつくり、その ＥＣＯＲ１部位を破壊するために設計された。さらに、リンカ−は、内部にＫｐ ｎ　１部位をもたせるために、元の記載から修飾された。新しいリンカ−は、オ リゴヌクレオチド゛修飾リンカ−Ａ１″及び“修飾リンカ−Ａ２″から成る。

修飾リンカ−Ａ１は、ＡＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧ。

修飾リンカ−Ａ２は、ＴＣＧＡＣＴＧＧＴＡＣＣ。

Ｍ１３ｍｐ１９への連結、クローニング及び選択は、基本的には前の実施例に述 べられている通りであった。

ＦＩＢＡＣの暗号領域は、３ａｍＨ１と）−１ｉｎｄｌｌ（７）消化により、計 画された配列をもつクローンから取り除かれ、ｐｕｃｓのこれらの制限部位にサ ブクローニングされた。得られたプラスミドがｐＦ　ｉ　ｂ５１である。このプ ラスミドにおいて、ＦＩＢＡＣ遺伝子の転写は、Ｉａｃプロモーターによりつか さどられる。メチオニルＦＩＢＡＣの翻訳は、β−ガラクトシダーゼで始まる翻 訳に共役している。　。

Ｂ３発現ベクターｐＦ　ｉ　ｂ５５ 成熟ＦＩＢＡＣ暗号配列の５′端に＋−＋ｏｔＡｔ制限部位を作製することは、 完全なＦＩＢＡＣ暗号配列を暗号配列内の５５２位置のもう１つのｈｌｉＡ１部 位を除いて、ＨＱ　ｉＡ　Ｉ／Ｓａ　ｌ　Ｉ、Ｋｐｎ　Ｉ又はＨｉ　ｎｄＩ［［ ｋ。

よるプラスミドｐＦ　ｉ　ｂｓｌの２重消化により、軽便なにより述べられたよ うに、試験管内でのオリゴヌクレオチドによる部位特異的突然変異誘発を用いて 除去された。

上）ボのような翻訳的に１ａＣ７に共役するｍｅｔ−ＦＴＢＡＣｉ伝子を含むバ クテリオファージｍｐ１８の誘導体から分離された１本鎖ＤＮＡは、合成オリゴ ヌクレオチドＧＧＧＣＴＴＴＧＣＡＣＣＴＧＧＣＡＧにアニールされた。このオ リゴヌクレオチドは、１個の誤対合をもつＨｏｌＡｌ部位を介してＦＩＢＡＣ暗 号領域にアニールする。得られたＤＮＡは、それから大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ のフレノウ断片、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及び４種のデオキシヌクレオチド・３・リ ン酸全ての混合物とインキュベートされた。

得られた共有結合の閉環状２本鎖ファージＤＮＡは、大腸菌ＪＭ１０７株トラン スフェクトするのに用いられた。プラークは、６ＸＳＳＣ中５８℃で、上に示さ れた変異オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによる変異配列の 存在が試験された。

選択りＯ−ンは、アミノ酸第１７３番のロイシンのコドンがＣＴＧのかわりにＣ ＴＴであった。このクローンの暗号領域は、ＢａｍＨ１−Ｈｉ　ｒｚｊｎＩ断片 として切り出され、同様に消化されたｐＬＩｃ８に連結された。得られたプラス ミドＤＦ　ｉ　ｂ５５は、より容易に動かせるＦＴＢＡＣ暗号領域同様、ｐＦ　 ｉ　ｂ５１の全ての性質をβ−ガラクトシダーゼ又は他の大腸菌の蛋白に翻訳上 つながった交互の方法が同様に構築される。１つの具体例として、プラスミドｐ Ｆ　ｒ　ｂｓｌに対する発現という観点の調節に類似した（即ちｐｕｃｓのｌ　 ａｃＺにつながった翻訳をするＦＩＢＡＣ）、しかし、交互の翻訳のカップラー を用いるクローンが考えられた。

ｐＦ　ｉ　ｂ５６を作製するために、次のＤＮＡの断片が合成された： 註λ工ａａｄ　立ひ工ｅ二ｄ ５１　人ＡττＣＣＡＡＧＧＡＧ六入λτ入入入ＴＧ″：Ｇ（：Ａ３”ｇｅ　Ｉ λＸ　ａｒ、ｄ　腔Ｒ工ｓｒ、！５’ＣＡττ）入τ↑τｃ’ｒｃｃττＧＧ３ ’この２本鎖のＥｃｏＲＩ／ＨＱ　ｉＡＩ断片は、それから、ＨＱｉＡＩ／Ｈｉ ｎｄＩＩＩ　ＦＩＢＡＣ暗号配列と、ＥＣＯＲＩとＨｉ　ｎｄＩ［Ｉで消化され たプラスミドｐＵｃ８に合わせられ連結された。得られたプラスミドはｐＦ　ｉ 　ｂ５６と呼ばれた。このプラスミドが大腸菌ｐＦ　ｉ　ｂ５６株ＬｔＪＭ１０ ７／ｐＦ　ｉ　ｂｓｌあるいはＪＭｌ　０７／ｐＦ　ｉ　ｂ５５よりもメチオニ ンＦＩＢＡＣでさえ発現が誘導される。これから、ｐＦ　ｉ　ｂ５６の翻訳のカ ップラーは、ＤＦ　ｉ　ｂｓｌのよりも効果的であると結論された。

０、現ベクターＤＦ　ｉ　ｂｌ　０　びｐＦ　ｉ　ｂｌ　１発現されたＦＩＢＡ Ｃを大腸菌のペリプラズムへ向けるために、リーダーペプチドがＦＩＢＡＣのア ミノ末端に付加される。リーダーペプチドは、内側の細胞膜の外へ有効蛋白を輸 送させる。細胞のプロセシングは信号ペプチドを除去し、ＦＩＢＡＣの成熟型を 回収する。

２個の信号配列が個別にこの目的のためにＦＩＢＡＣに融合された。それらは、 大腸菌０ｍ１）Ａ及びｐｈｏ３遺伝子産物のリーダーペプチドである。０ｍ１） ＡＬ−ＦＫＢＡＣ及びｐｈｏＳ、−Ｆ　Ｉ　ＢＡＧの両融合蛋白は、大ＷＡ菌の ペリプラズムに局在させ、ｏｍｐＡ又はｐｈｏｓのリーダー断片と天然のＦＩＢ ＡＣに対する融合の蛋白分解プロセシングをさせる信号を含む。

プラスミドｐＦｉｂ１０は、ＯｍＤＡｌ　−Ｆ　Ｉ　ＢＡＣ融合蛋白の暗号配列 がその中に挿入されているようなｐＵｃ８の誘導体である。さらに、ｏｍｐＡｉ 伝子の５′非翻訳配列が含まれている。このプラスミドの転写は、ｐＵｃ８のｌ ａｃプロモーター／オペレーターにより司さどられる。翻訳は、ｏｍｐＡリーダ ー配列が始まるメチオニン・コドンで開始され、ｏ　ｍ　ｐＡ　遺伝子に見られ るシャイン・ダルガノ配列を用いる。

プラスミドは、ＯＦ　ｉ　ｂ５５のＨｏ１ＡＩ／Ｈｉｎｄｌｎ断片に含まれるＦ ＩＢＡＣ暗号配列をｏ　ｍ　ｐ　、Ａ、リーダーペプチドを暗号化する合成オリ ゴヌクレオチド及びＥＣＯＲＩ／Ｈｉ　ｎｄＩ［消化のｐＵｃ：８と共に連結す ることにより構築された。合成オリゴヌクレオチドの暗号類は、 Ｇ六入入ＡＡＧＡＣＡＧＣＴ入τＣＧＣＧＡＴＣＧＣＡＧＴＧＧＣへＣＴＧＧＣ τＧＧττＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴ、ＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣτ４種のオリゴヌクレ オチド、それぞれの鎖当り各２種合成した。全体として、２本ＩＫＤＮＡの性質 は、＠　暗号類の５′端がＥＣ０ＲＩの付着末端で３′端がＨｇ１Ａ１の付着末 端。

Ｕ　ＨａｉＡ１部位で連結されると、Ｆ　Ｉ　ＢＡＣ遺伝子を枠内にもつｏｍｐ Ａ遺伝子産物のリーダーペプチドを暗号化する読み取り枠。

（ハ）　通常ｏｍｐＡ遺伝子に見られるリポソーム結合部位を含む翻訳部分に対 する５′非暗号配列。

（へ）　内部の独特のｐｖｕ　１部位。

プラスミドｐＦ　ｉ　ｂｌ　１は、プラスミドｐＫＫ２２３−３の誘導体で、ｐ ｌＪｃ８部分がプラスミドｐＫＫ２２３−３の４５５０ｂｐのＥｃｏＲＩ／Ｈｉ 　ｎｄｌｌ断片に置換されていることを除いてｐＦｉｂｌｏと同一である。

このプラスミドにおいて、転写は雑種ｔａｃプロモーター／オペレーターにより つかさどられ調節される。さらに、このプラスミドは、高度の発現系においてプ ラスミドを安定化させる転写ターミネータ−を含む。

Ｅ、　現ベクターρＦｉｂ１３ プラスミドｐＦｉｂ１３において、Ｏｍ　ｐＡ　１配列の５′非暗号領ｔａハ、 除去され、ｏ　ｍ　ｐＡ　ｔ　Ｆ　Ｉ　Ｂ　Ａ　Ｃ融合遺伝子は、プラスミドｐ ＬＩｃ８で発現するように直接的にｌ　ａｃｚ遺伝子のＮ末端部分に翻訳上つな げられている。これは、プラスミドｐＦｉｂｉＱのＥＣＯＲＩ／Ｐｖｕ　Ｉ　（ ３２００ｂＤ）断片をここに示した合成オリゴヌクレオチドに連結することによ り完成された。

Ｔ　ＡＴＣＧＣＧＡ　τ　３′ ５’　ＣＧＣＧｋＴｋＧＣＴＧＴＣＴＴＴＴＴＣｋＴＴＴｋＴＴＴＣＴ’ＣＣＴ 大腸菌ｐｈｏＳ遺伝子はリン酸結合蛋白をコードし、ジャーナル・オブ・陽画テ リオロジー第１５７巻、７７２−７７８ページ＜１９８４年）に８．Ｄ、スーリ ン等により述べられ、シーケンスされた。この蛋白は、蛋白をベリプラズマに向 かわせる２５アミノ酸のリーダー配列をもつペリプラズマ蛋白である。リーダー 配列は、成熟ｐｈｏＳ蛋白のみがペリプラズムに残るように翻訳過程の間に蛋白 分解により除去される。我々は以下に示すようにＥＣＯＲＩ及びｌ−１ｉＡＩ末 端をもった２重鎖ＤＮＡ断片としてｐｈｏＳリーダー配列を合成した。

ＡＡＣＴＧＴＴＧＴＣＧＣＣＧＣＧＡＣＣＴＴＡτ　３１ＧＴＧＧＴＡＣＧＣＡ Ｔ入λＣτＴＴＣ入τＧ　３’Ｃ１ａ工ｅｎｄ　Ｈａｕ工ｅｒ＋ｄ ５’　ＣＧｋＴＧｋＧＴＧＣＴＴＴＣＴＣＴＧＴＧＴＴＴＧＣＧＴＧＣｋ　３” ！（ａｉＡ工＠ｎｄ　ＣＬａＡ工＠ｎｄ５’　ＣＧＣＡＡＡＣＡＣＡＧＡＧＡＡ ＡＧＣＡＣＴＣＡＴ　コ１これらの断片は、ｐｈｏＳリーダーの中にあるＣｌａ ｌ部位で連結された。これらの断片は、同時に上述のＨＱｉＡＩ／ＨｉｎｄＩ［ Ｉ　ＦＩＢＡＣ暗号断片とＥｃｏＲＩ及び＠　ｉ　ｎｄｎｌで消化されたプラス ミドｐＫＫ２２３−３に合わせられた。得られたプラスミドがｐＦ　ｉ　ｂ３１ と呼ばれた。

実施例９ 大腸菌におけるＦ　ＩＢＡＣ遺伝　の 上述のプラスミドをもつ大腸菌ｍ胞により産生きれるＦＩＢＡＣの量と形態を定 性的に決定するのに３つの方法が用いられた。それらは、 （１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により解析され続いてニトロセルロ ースペーパーに結合された（ウェスタン・プロッティング）ＦＥＢＡ０３Ｍ伝子 のｍ　Ｑ後産生された大腸菌蛋白に対するＦＩＢＡＣ抗体の特異的反応。

（■　ＦＩＢＡＣ遺伝子の誘導に続り３５Ｓ−システィン、３５Ｓ−メチオニン 又は　Ｓ０４　での大腸菌蛋白の標識。

（３）　抗体結合又は放射活性標識なしての大腸菌蛋白及びＦＩＢＡＣを含むＳ ＤＳポリアクリルアミドゲルの検査。

これらの方法は、それぞれの菌株により産生きれるＦＩＢＡＣの旦の比較だけで なり、機能的なメタロプロテイナーゼ阻害の必要なしに発現されたＦＩＢＡＣの 精製にも用いられる。実施例８で議論された全てのプラスミドは、大腸菌ＪＭ１ ０７株で発現された。大腸菌でのＦＩＢＡＣの発現は、細胞内膜の外側への蛋白 の輸送を計画されたこれらの系の中ではかなり大きかった。これＦＩＢＡＣの成 熟形態を得るための０ｍ１）ＡＬ−ＦＩＢＡＣの融合蛋白のプロセシングは、部 分的に、細対数増殖期の初期にＩ　ＰＴＧで誘導された細胞は、プロセシングを 受けたＦＩＢＡＣと受けていないＦ　Ｉ　ＢＡＣの混合物を蓄積するが一方、対 数増殖期の後期で誘導された細胞培養は、プロセシングを受けたＦＩＢＡＣのみ を蓄積する。ｐｈＯ３１−Ｆ　Ｉ　ＢＡＣｉＪ合蛋白を発現する株は、全く生育 相に依存しないで蛋白をプロセシングすると思われる。

実施例８に述べられた全ての発現ベクターが選択マーカーとしてアンピシリン耐 性をもつ。生産のためには、テトラサイクリン耐性マーカーをもつことが好まし い。

一般に発現ベクターとして有効なプラスミドが、テトラサイクリン耐性マーカー を付けて構築された。このプラスミドは、切りつめられたテトラサイクリン耐性 遺伝子が、１）ＢＲ３２２に適合された完全に機能するｔｅｔ’遺伝子と置き換 えられているｐＫＫ２２３−３の誘導体である。

１１且ユ及 陽画で　現されたＦＩＢＡＣの 組換えヒトコラゲナーゼ阻害剤（ＦＩＢＡＣ）は、プラスミドｐＦｉｂｌｌで形 質転換された大腸菌ＪＭ１０７株から精製された。この株、ＪＭ１０７／ｐＦ　 ｉ　ｂｌ　１では、ＦＩＢＡＣは、不溶性の凝集体として蓄積される。本実燕例 では、細胞の生育、ＦＩＢＡＣ遺伝子発現の誘導、Ｓｌ［ｌ胞の回収及び全ｍ胞 抽出物の不溶性画分からのＦＩＢＡＣの精製についての条件が述べられている。

同一ブＯトコールは又、全細胞抽出物の可溶性画分からのＦＩＢＡＣの濃縮にも 用いられる。

Ａ、不溶性画分 １００μ９／ｄアンピシリンを含むルリアブロースに初期ｏＤ６ｏｏ＝０．１５ 〜０．２０で１晩培養のＪＭｌ　０７／ｐＦ　ｉ　ｂ　ｌ　ｌが接種された。振 盪フラスコ細胞培養は３７℃で０Ｄ６ｏｏ−１，５まで生育され、その時点で、 培地に終Ｇ！０．５ｍＨのＩ　ＰＴＧで添加された。３７℃でのインキュベーシ ョンがさらに２．５から３＠間続けられた。細胞培養液はアイスバスの中で４℃ まで急冷され、遠心によりＩＩＩ胞が回収された。上述のように生育された１ｊ ！培養液から、平均３９（湿重量）の細胞が得られた。細胞は冷却した融解用の ｌ溶液（５０ＩＩＩＨＭＥＳＳｐＨ６，０１４ｍＭ　ＥＤＴＡ）で１度洗浄され 、それから、終濃度０．２６９細胞／ｄになるように同！！１ｉｉｉｌに再懸濁 された。細Ｙ＆懸濁液は次の過程まで一７０℃で凍結された。

全細胞抽出物はフレンチプレスセル（ＳＬＭ−アミンコ、モデ）Ｌｔ＃ＦＡ−０ ７９、ピストン＃ＦＡ−０７３，２ｏｏｏｏｐｓｔ　ｉで操作、ＳＬＭインスト ルメンッＩｎｃ、イリノイ州つルバナ）に２度細胞懸濁液を通すことでｍｌされ た。得られた細胞抽出物は、氷上で２−３時間（湿重１）１ｇの細胞あたり１０ μ９のＤＮａｓｅｌとインキュベートされた。その後、少旦ずつにわけられて次 の操作まで一７０℃で凍結保存された。

細胞抽出物の上清と沈澱の両分は、エツベンドルフのマイクロ遠心回で４℃、３ ０分間細胞抽出物５ｄを遠心することにより得られた。１りられた沈澱が５Ｑｍ ＨＴｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！、ｐＨ８，０，４ｍＨＥＤＴＡ、５０ｍ１（ＤＴＴ３ ＆！で２度洗浄された。これらの洗浄上清が集められ分析のために保存された。

洗浄された沈澱は５０ａ＋ＨＭＥＳ％ｐＨ６，０，４ｍＨＥＤＴＡ、５０ｍ１４ 　ＤＴＴ。

１０Ｍ尿素３ｍに再懸濁することで可溶化され、１５分間空温で保温された。蛋 白のカルバミル化が尿素可溶化のために起きるので、全蛋白のアミノ基に対して １００倍過剰の適当な核分子を添加することにより、副反応は抑えられた。得ら れた溶液は、エツペンドルフのマイクロ還心機で４℃、１５分間遠心することに より不純物が除去された。上清は基本的に、可溶化法からの全ての蛋白を含み、 解析のために保存された。残りの少母の沈澱物はほとんどの細胞壁残渣と数種の 蛋白（ＦＩＢＡＣはない）から成る。この部分は捨てられた。

上述のように調製された各種画分中のＦＩＢＡＣの同定は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ及 び抗Ｆ　ＩＢＡＣ抗体を用いたウェスタン・プロット試験によりおこなわれた。

Ｉ　ＰＴＧで誘導されたＪＭＩ　０７／ｐＦ　ｉ　ｂ　ｌ　ｌから得られた全細 胞抽出蛋白の５ＤＳ−ゲルによる解析は、非誘導ＪＭ１０７／ｐＦ　ｉｂｌ　１ の細胞抽出物のゲルパターンには存在しない約２００００ダルトンの分子世の蛋 白バンドの存在を示す。２００００ダルトンの蛋白及びおそら＜ＦＩＢＡＣの分 解産物の少し速く移動するバンドがウェスタン・プロット分析で抗ＦＩＢＡＣ抗 体と反応する。この蛋白がＩＰＴＧｍ５に依存して存在すること、分子ｍ及び抗 ＦＩＢＡＣ抗体との反応性は、蛋白が発現された粗換えＦＩＢＡＣであることを 示唆する。

Ｉ　ＰＴＧ誘導ＪＭ　１０７／ＤＦ　ｉ　ｂ　１１から１９られた細胞抽出上清 及び沈澱洗浄液の分析の結果にはほとんどＦＩＢＡＣは含まれていなかった。し かし、尿素−ＤＴＴ可溶化細胞抽出沈澱画分に大部分のＦＩＢＡＣが見い出され た。これは、Ｉ　Ｐ　Ｔ　Ｇ　Ｍ　ｎによ１ｐＦＩＢＡｃが不溶性画分に蓄積し 、洗浄された細胞抽出物の沈澱から実質的に精製された形態で分離されたと解釈 された。

尿素−ＤＴＴ可溶化細胞抽出物の沈澱画分は、ＣＭ−クロマトグラフィの開始物 質として用いられた。可溶化細胞抽出沈澱画分１．２ｍ（１６ｍ！７蛋白）は、 冷却されたＣＭ−緩衝液（５０ＩＴｈ）Ｉ　ＭＥＳ、Ｉ）１４６．０．６Ｍ尿素 、１４−ｍＨ２−ＭＥ）で２５ｍ１まで希釈された。試料はそれから、４℃で０ Ｍ緩衝液で予め平衡化したカルボキシメチル・セルロース・カラム（２５Ｘ１３ ０＋＋ｍ）に充填された。試料充填後、カラムは、ＣＭ　Ｍ溶液でＡ２８ｏが基 準線に戻るまで洗浄された。吸着された蛋白は、０Ｍ緩衝液中の塩化ナトリウム の直線濃度勾配（０−２００ｍＭ）で溶出された。全勾配Ｍは４００ｍ１、流速 は２６ｄ／ｈｒ、５ｄの分画ｍで集められた。“通り抜け”画分５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅで分析された。これらの両分の電気泳動及び免疫学的分析の結果、いくらか分 解されたＦ　Ｉ　ＢＡＣを含む組換えＦＩＢＡＣは、伯に検出される蛋白なしに 約１２０ｍＨＮａＣ，！！で７出されることがわかった。用いたりＯマドグラフ ィーの条件下で、非ＦＩＢＡＣ蛋白は、０Ｍカラムには吸着せず“通り抜け”画 分に見い出された。

この方法で得られた０Ｍ精製にＦ　Ｉ　ＢＡＣの量は、全細胞蛋白の１．３％を 示すと計算された。分列及び精製を通して定量にはブラッドフォードの蛋白アッ セイが使用された。

５０ｒＤＨＹＥＳ　６Ｍ尿素、１４ｍＨ２−メルカプトエタ　−ル中の精ＩＦ　 ＩＢＡＣ２ｍｉ（１００μｇ）がセントリコン遠心により２００μｌまで２縮さ れ、Ｔｒｉｓの終濃度が０．５Ｍまで２Ｍ　Ｔｒｉｓ）（Ｃ！、ｐＨ３，５ヲ添 加’ｔ　ルコとｔ、：Ｊ：’ｌＨ８，５に調製された。ＦＩＢＡＣのシスティン 残基は、３日−酢酸ヨードを用いてカルボキシメチル化された。アルキル化反応 混合液は逆相ＨＰＬＣにより脱塩された。修飾ＦＩＢＡＣは３０％アセトニトリ ルで溶出し、分析のために回収された。１−ＩＰＬｃから分離された修飾Ｆ　Ｉ 　ＢＡＣの溶液は５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析に用いられた。

カルボキシメチル化に使用されたＣＭ精製Ｆ　Ｉ　ＢＡＣ（開始物質）とアルキ ル化とＨＰＬＣ脱塩後のＦＩＢＡＣの比較は、ＳＯ３のゲルで、修飾されたＦＩ ＢＡＣは非修飾のＦＩＢＡＣよりもわずかに遅く移動することを示した。これは 、特にＦＩＢＡＣに存在する修飾されたシスティンの実質的な数という点から異 常な観察ではない。

カルボキシメチル化されたＦＩＢＡＣは、それから、自動エドマン分解のために 、アプライド・バイオシステムズ（モデル４７０Ａ）の気相蛋白シーケンサ−（ フォスター・シティ、ＣＡ）に充填され、最初の２４残基のアミノ酸が同定され た。ニドフン分解の最初の６サイクルのシーケンシングのデータが下の表に示さ れている。

ｙｉ製ＦＩＢＡＣのＮ末端アミノ酸配列（Ｃ−Ｔ−Ｖ−Ｐ−Ｐ・・・）は、天然 のＦＩＢＡＣで以前に決められていたものと同一であることをデータは明らかに 示した。それ故、成熟ＦＩＢＡＣ蛋白を産生ずるようにそのＡｌａ−Ｃｙｓ結合 でｏｍｐＡ−Ｆ　Ｉ　ＢＡＣ融合蛋白を切断することにより、ＤＦｉｂｌｌは適 正に組換えＦＩＢＡＣをプロセシングすると結論される。

精製された組換えＦＩＢＡＣのＮ末端 アミノ酸配列の分析 （システィン残塁は蛋白のシーケンシングの前に３Ｈ−酢酸ヨードで標識された 。） サイクル　Ｈ−ＣＰＭ　圧工且ユΔＡ且１１　１１４７０　ＣＹＳ ２　３８５　ＴＨＲ ３１２６９０ＣＹＳ ４　３３９　ＶＡＬ ５　１４５　ＰＲＯ ６２５５ＰＲＯ ８、可溶画分 開始物質に付加的な混り物があるために、ここで議論された方法は、最初には、 ＦＩＢＡＣの均一な標品を結果として得られない。しかしながら、方法は、ＦＩ ＢＡＣをその天然のコンフォメーションへ再生させるのに充分な精製を準備する 。次の精製過程は、分離方法を完全にするために使用される。

本実施例では、先の実施例の通り、細胞の生育、誘導、回収及び全細胞抽出物の 調製が述べられる。細胞抽出物のどの画分からもＦＩＢＡＣを精製するために現 在の方法の能力を決定するため、ホモジネートの遠心分画が除かれた。かわって 、全細胞抽出物は、１０Ｍ尿素、４ｍＨＥＤＴＡ、５０ｍ１４　ＤＴＴ１５０ｍ ＨｆｖｌＥｓ、ｐＨ６，０に調製され、２２℃で１５分間保温された。その後、 溶液は、エツベンドルフのマイクロ遠心機で４℃１５分間遠心された。沈澱は除 去され、上清かＣＭ綴１液（５０ｍＨＭＥＳ、ｐｌ（６，Ｏ１６〜１尿素、１４ ａ＋Ｈ２−メルカプトエタノール）で希釈され、先の実施例でのようにカルボキ シメチルセルロースでクロマトグラフにより分画された。ＦＩＢＡＣはいくらか の分解されたＦＩＢＡＣ及び数種の免疫学的には無関係の混在物質と共に約１２ ０１）ｌの塩で溶出された。５ＤＳ−ＰＡＧＥによるＦＩＢＡＣの純度の算出は 、この両分では全蛋白の５０％以上であることを示した。この水準の純度で、以 下の再生法を用いてＦＩＢＡＣを天然のコンフォメーションに再生することは可 能であった。再生されたＦＩＢＡＣは完全にメタロプロテイナーゼ阻害剤として 機能し、さらに陰イオン交換クロマトグラフィにより精製された。

陰イオン交換クロマトグラフィは、６００　ｍＭ尿素、５Ｑ＋ｎＨＴｒ　１ｓ１ ｐ１１９．６で平衡化されたワットマンＤＥ−５２（ワットマン　Ｉｎｃ、ニュ ーシャーシー州りリフトン）の１０１０Ｘ１００Ｉカラムでおこなわれた。不純 な再生されたＦＩＢＡＣを含む溶液は、５Ｎ−ＮａＯＨの滴下によりＤＩ＋９． ６まで滴定され、ＤＥＡＥセルロースに充填された。通り抜は画分の分析は、Ｆ ＩＢＡＣが保持されないことを示した。免疫学的に無関係な混入物質はマトリッ クスに結合し、それにより溶液から除去された。通り抜は画分は以下に示すよう に０Ｍセルロースカラムで濃縮された。

陰イオン交換カラムの通り抜は画分は、５Ｎ−ＨＣ１添加によりｐ）１７．５ま で滴定された。この溶液が、６゜０ｍ１（尿素、５０ｍＨＴｒ　ｉ　ｓ、　ｐＨ ７、５で予め平衡化したＣＮ３−セルロースカラム（２５Ｘ１３０ｉｍ）に充填 された。カラムはこの同じ緩衝液で、蛋白が全て溶出液に吸光的にＬ！！察され なくなるまで洗浄された。ＦＩＢＡＣは２５０ｍＨＮａＣ１を含む上記の緩衝液 で溶出された。

蛋白ピークが回収さ、　５０ｍＨＴｒ　ｉ　ｓ、　ｐＨ７，５１Ｃ対して平衡と なるまで透析された。

得られたＦＩＢＡＣに対する電気泳動、免疫学的、及Ｔｙｉｆｌ能試験により、 ９０％以上の純度の活性のある再生されたコラゲナーゼ阻害剤であることが示さ れた。わずかに検出される混入物質は、細胞抽出物の沈澱からの精製にあるので ＦＩＢＡＣの分解産物である。この混入物質の同一のアミノ末端配列とその明白 な分子量のため、蛋白分解部分はカルボキシ末端近くにあるものと結論された。

この物質は、さらに精製することで除去される（例えば、再生ＦＩＢＡＣの高分 解能イオン交換クロマトグラフィあるいアファニテイクロマトグラフィ）。

遺伝子発現及び蛋白輸送のベクターが構築される別の生物は′ＦｆＦｆ！Ｌサツ カロミセス・セレビシェである。Ｂ母のα因子は、１１ｆ胞内で産生され生育培 地に移送される接合ホルモンである。単一ペプチド配ダ１がこの輸送をつかさど る。ＦＩＢＡＣ１号配列は、酵母α−因子のリーダー配列にＦ　Ｉ　ＢＡＣを融 合させるために酵母の発現ベクターにクローニングされた。プラスミドは、まず ｐＧｓ３８５のＭ　８体として作製された。プラスミドｐＧｓ３８５は次の特徴 をもつ。

に）　プロモーター、リーダーペプチド、ポリアゾニレ−ジョン信号及び転写終 了信号を含む酵母α因子の部分を含む。

（ハ）　２個の最も離れたＨ　ｉ　ｎｄＩ［１部位の間にあるα因子遺伝子の部 分が欠失され、独特のＨｉｎｄｍ部位が作製された。

（へ）　ＨｉｎｄＩ［１部位の３′に独特の５ａｌ１部位を含む。

ゆ　大腸菌で複製と選択をさせるため、ｐＢＲ３２２の複製起源とアンピシリン 耐性遺伝子をもつ。

プラスミドｐＧＳ３８５は、ｌ−１ｉｎｄＩ［［と５ａｌｌＦ消化された。ｌ− １ｉｎｄＩ［１部位は、α因子のリーダー配列のカルボキシ末端を決定する。合 成オクタヌクレオチド５’−ＡＧＣＴＴＧＣＡ−３’が、α因子のＣ末端とＦＩ ＢＡＣのＮ末端をａ浪しするのに使用された。α因子の転写−翻訳配列は、この ベクターでの遺伝子発現をシ」かす。完全なα因子−ＦＩＢＡＣ融合遍伝子がＥ ＣＯＲＩ消化により切り出され、ＶｆＦ＆ｕ　ｒ　ａ　３１伝子を含むプラスミ ドｐＢＲ３２２のｇ　Ｅ４体であるプラスミドＹｉｐ５に挿入された。このプラ スミドは、ｕｒａ３の中の独特のｓｔｕ　ｒ部位で消化し、染色体ｕｒａ３ｆｆ ｌに完全なプラスミドを組込ませるためにＳ、セレビシェに形質転換する発現ベ クターとして使用するのに適している。そのようなＹｉｐ５のα−ＦＩＢＡＣ融 含誘専体の組込み体が得られ、ここでコロニー検索技術により決定されるように 免疫反応性物質を産生じ分泌した。

実施例１２ 動物細胞における組１えＬＬＥＬＡ　のＦ　Ｉ　ＢＡＣ生産のための動物細胞に おける２つの発現系が提出されている。第１のものには、ｃ　ｏ　ｓ　−１細胞 で転写をさせるようにＳＶ４０後期プロモーターを組込んでいる。この発現系は 、元来、Ｃ０８−１細胞における発現、蛋白合成、翻訳後修飾、ＦＩＢＡＣの輸 送を研究するのに役立つ。この系は速くて簡便ではあるが、Ｃ０８−１猿細胞系 列に限定される。ＳＶ４０発現プラスミドは、ジャーナル・オブ・ピロロジー第 ４５巻、７７３−７８１ページ（１９８３年）にＪ、スブラーギュ、Ｊ、Ｈ，コ ンドラ、Ｈ，アンピシリンとＲ，Ａ、ラザリーンにより詳細に述べられている構 築プラスミドｐＪｃ１１９の誘導体である。天然に生ずる信号配列を含む完全な Ｆ［ＢＡＣ暗号領域が部分的なＣＤＮＡクローンから集められた。リーダーペプ チドの開始メチオニンと一致するＮｃｏ　Ｉ部位が短い合成オリゴヌクレオチド を介してｐＪＣ１１９の独特のＸｈｏ　Ｉ部位に連結された。完全なＦＩＢＡＣ 暗号領域と３′非非翻訳列がＳＶ４０後期プロモーターにより転写がっがざどら れるこの部位に挿入される。プラスミドはそれ故、ＳＶ４０の複製起源、ｐＢＲ ３２２の複製起源及びアンピシリン耐性選択マーカーを含む。

第２の系は、ヒトの細胞系列からの安定で速読的なＦＩＢＡＣの発現をもたらす ので、動に！胞におけるＦＩＢＡＣの産生にむしろ用いられる。このベクターは 、セル・バイオロジー第９７巻、１３８１−１３８８ページ（１９８３年）の中 で、Ｒ，Ｚ、フローキウィツク、Ａ、スミス、Ｊ、Ｅ、バーブマンとＪ、に、’ ｏ−ズにより述べられているｐＢＰＶ５２−１のｍ９体である。このプラスミド は、ウシパピローマウィルスのｉｔ起源、ｐＢＲ３２２の複製起源、β−ラクタ マーゼ遺伝子及びＢＰＶＤＮＡの６９％形質転換断片を特徴とする。

ＳＶ４０の複製起源及び初期プロモーターがこのプラスミドにクローニングされ る。ヒト細胞内でのベクターの複製を妨げるｐＢＲ３２２の配列は取り除かれる 。前記のプラスミドでのように、ＦＩＢＡＣｃＤＮＡの完全な［１ｇ号部分が、 ＳＶ４０初期プロモーターによる転写がおこなわれるように挿入される。

これらの細胞での発現及び分＄に続く培地からのＦＩＢＡＣの精γ１は、基本的 には前に実施例４及び同５で述べられたように可能である。

実施例１３ 旦よりＡぷ」υ１生 ２種類の試験がＦＩＢＡＣの再生を追跡するのに使用された。両試験とも、天然 構造としてのＦＩＢＡＣの泳能的能力の出現を測定する。第１の試験は、ヒト繊 維芽ｔａ１１０コラゲナーゼの１４ｃ標寵したコラーゲンの分解能に対する試料 の阻害効果を測定する阻害試験である。第２の試験は、ヒト・コラゲナーゼへの 再生ＦＩＢＡＣの結合を測定する改良ＥＬＩ　ＳＡである。

コラゲナーゼ結合ＥＬＩＳＡは、それによりＦＩＢＡＣ活性が検出される基本的 な試験である−ここでは、コラゲナーゼは、９６穴のイムロン■プレートに４℃ で１晩コートされる（１．０μ９／ｕｒｎ　５０ｍＮＴｒｉｓ　Ｉ）！１８．２ ．５ｍＨＣａＣｊ！　、１００μｊ！／ウェル）。３％ＢＳＡを含む洗浄緩衝液 （５０ａ＋ＨＴｒ　ｉ　ｓ、　ａｌ１７．５．５ｍ１４　ＣａＣｌ２．０．０２ ％Ｔｗｅｅｎ　−２０）でウェルあたり１５０ｕＪｌを用いて４５分間ウェルを ブロックした後、ＦＩＢＡＣ標準試料の各種希釈又は、ブロッキング緩衝液で希 釈した未知試料をウェルへ入れる（１００μｍ／ウェル）。４５分間の保温（３ ７℃）の後、ウェルを３度洗浄緩衝液で洗浄する。

アフイニティｖｉ製したウサギ及び抗Ｆ　Ｉ　ＢＡＣ抗体をウェルに添加しく　 １／１００希釈、１００μｍ／ウェル）、３７℃４５分間インキュベートする。

ウェルを再洗浄し、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギｌ０Ｇ（シグマ、 洗浄瑳衝液で１／１０００希釈）をウェルに加える（１０ｏμｉ／ウエル）。３ ７℃で１時間のインキュベーションの後、最後の洗浄をおこない、アルカリホス ファターゼ基質（シグマ、＃１０４−１０５．１ｍｙ／ｒｄ　１０％ジェタノー ルアミン、１００！Ｉ＋ｉ４　Ｍｇｃｊ！２　、ｐＨ９，８）をウェルに添加す る。発色は、タイターチック・マルチスキャンＭＣＥＬＴＳＡリーダー（フロラ ラボラトリーズ）を用いて４９５　ｎｍで測定される。天然のＦＩＢＡＣは、未 知試料が定ｍされる際の標準曲線を供する。

コラゲナーゼ阻害試験で、１４Ｃ標識したモルモットの反日コラーゲンのペレッ ト（２５μｍ１／ペレット−２１００ｃａｌが５０μｌのトリプシン活性化コラ ゲナーゼ（約７５μｇ／Ｉ！ｄｌ　５０ｍＨＴｒｉｓ、ｐＨ７，５，１０ｍＷ　 ＣａＣｆ２　）で消化され、　Ｃが溶液中に出される。

（消化速度に依存して）１から３時間ペレットをインキュベートした後、反応を １００μｌのＴｒｉ８１ｍ液を加え１０分間１００００　ｒｕ＋で遠心すること により停止する。上清が３ｄのシンチレータ−の入っているシンチレーション・ バイアル瓶に入れられカウントされる。コラーゲンのベレットに添加する前に標 品又は精製ＦＩＢＡＣの各希釈液５０μｌとコラゲナーゼを予めインキュベート すると、コラーゲンの消化と１４ｃの溶液への放出が阻害される。未知試料の阻 害活性の定量は試論に用いた活性コラゲナーゼの量に依存する。これから、未知 試料の活性は、阻害剤と酵素のモル比が１：１と仮定して計算される。

これらの試験を用いて、蛋白２度、酸化ゲルタデオン濃度、ｐＨ及び温度に関す る再生過程の効率が試された。

これらのパラメーターの全ての組合わせが徹底的に試されたわけではないが、効 率的な再生をさせる方法が開発された。

ＦＩＢＡＣの再生は再生がおこなわれる際のＦＩＢＡＣ儂度に大きく依存する。

酸化条件下では希釈溶液はジスルフィド結合の形成を妨げ、結果として凝集体の 沈澱を引きおこす。

精製された組換えＦＩＢＡＣは、以下に述べるプロトコールに従うことにより、 再生され、蛋白１００％の回収で可溶性のままである。

（１１６Ｍ尿素５０ｍＨＭＥＳ、　Ｉ）Ｈ６，０１４ＩＩＩＭ２−メルカプトエ タノール中の希釈精１１Ｆ　ＩＢＡＣ（３００μ９／ｒｄ以下）が７０ｍ１酸化 グルタチオン存在下でインキュベートされる。

（２）！温で１０分間の保温の後、試料は５０ｍＨＴｒ　ｉ　ｓ、　ｐＨ９，０ で１０倍に希釈される。

ＦＩＢＡＣと分解されたＦＩＢＡＣの両者の存在を示す。

分解されたＦＩＢＡＣは、ｖｌ”Ａ法からずっと存在し、再活性化法の間にさら に分解するようには思われない。

この可溶化ＦＩＢＡＣはコラゲナーゼ結合活性（ＥＬＩＳＡ）とコラゲナーゼ阻 害活性の両者をもつことが示された。蛋白辺に対する活性の良は、コラゲナーゼ 阻害試験により決定されたように９０９６以上であると思われる。この数字は、 試験の中の推測されたコラゲナーゼ量に基づく計算に由来する。これは眠算だが 、５０％を下回るとは信じられない。ＦＩＢＡＣ標品に対し測定された結合活性 は、異なる試料の相対的な再活性化の追跡を可能にする。

再生過程は又、５０％純度のＦＩＢＡＣ標品での研究でも示された。許容される 混入蛋白の性質と量はまだ不確かであるが、少なくとも回収は５％以下の純度で 得られる活性ＦＩＢＡＣが精製なしに全細胞抽出物に検出される。

各種の改良変法が本発明の過程及び産物になされることは明らかである。それ故 、本発明は請求の範囲と及びそれと実質に同一である本発明の改良及び変法をも 包含するものである。

国際調査報告 ＰＣＴ／ＵＳ８６１００３０２ １Ｒｎ＝ＡＩ１１６ＡＩＩＡＩ１０１ｉｅＪｂｅ＋＋Ｎ１１．ＰＣＴ／ＬＩＳＳ ６１０’０３０２ＰＣＴ／１１５８６１００３０２ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｔｏ　Ｆｏｒｍ　ＰＣＴ／ＩＳＡ／２リ　Ｐａｒｔ　Ｉ ＩＫｅｙ　Ｗｏｒｄｓ　ｕｔｉｌｉｚｅｄ　ｔｏ　５ｅａｒｃｈ　ｔｈｅ　ｃｏ ｍｐｕｔｅｒ　ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｌ１ｌＩＩＴ１１ａｌｉｌｌｌｌａｌＡｌ ｌＩｌｌｅ劃１１ＱＮａ、ｐ（７／Ｕ３１１，６／ＱＱ３ｎ２

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．メタロプロティナーゼ阻審害剤の細胞内生産を指揮できる一連のヌクレオチ ドを含む簡単なＤＮＡ配列。
2. ２．前記配列がコラゲナーゼ阻審剤の細胞内生産を指揮できるところの請求の範 囲第１項記載の簡単なＤＮＡ配列。
3. ３．前記ヌクレオチド配列が、 【配列があります】 であるところの請求の範囲第１項記載の簡単なＤＮＡ配列
4. ４．前記配列がヒト皮膚繊維芽細胞から分離できるコラゲナーゼ阻審剤と生物学 的に同等のものを細胞内生産できるところの請求の範囲第２項記載の簡単なＤＮ Ａ配列。
5. ５．メタロプロティナーゼ阻審剤の細胞内生産を指揮できるヌクレオチド配列を 含む組替えＤＮＡクローニング・ベクター。
6. ６．前記ベクターが次のヌクレオチドの一部を少なくとも含むヌクレオチド配列 から成るところの請求の範囲第５項載のベクター。 【配列があります】
7. ７．ベクターＰＵＣ９−Ｆ５／２３７Ｐ１０。
8. ８．（ａ）宿主微生物にメタロプロテイナーゼ阻審剤活性をもつ蛋白を生産させ ることができる簡単なＤＮＡ配列の調整。 （ｂ）宿主微生物に移されその中で複製することができる簡単なＤＮＡ配列を操 作できる成分をもつベクターへの簡単なＤＮＡ配列のクローニング。 （ｃ）簡単なＤＮＡ配列と操作成分を含むベクターのメタロプロティナーゼ阻審 剤蛋白を発現できる宿主微生物への移行。 （ｃ）ベクターの増幅と阻審剤の発現に適当な条件下での宿主微生物の培養。 （ｅ）（ｉ）阻審剤の回収。 （ｉｉ）阻審剤にメタロプロティナーゼ阻審剤活性をもつような活性のある３次 構造をとらせること。 から成るメタロプロティナーゼ阻審剤の微生物生産のための組換えＤＮＡ法。
9. ９．前記メタロプロティナーゼ阻審剤がコラゲナーゼ阻審剤であるとこるの請求 の範囲第８項記載の方法。
10. １０．前記の簡単なＤＮＡ配列が次の配列の一部を含むところの請求の範囲第８ 項記載の方法。
11. １１．前記の簡単なＤＮＡ配列を含むベクターがＰＵＣ９−Ｆ５／２３７Ｐｌ０ であるところの請求の範囲第８項記載の方法。
12. １２．前記宿主微生物が細菌であるところの請求の範囲第８項記載の方法。
13. １３．前記細菌がバチルス属の類であるところの請求の範囲第１２項記載の方法 。
14. １４．前記細菌がバチルス・スブチリスであるところの請求の範囲第１３項記載 の方法。
15. １５．前記細菌がエツシエリヒア・コリ（大腸菌）であるところの請求の範囲第 １２項記載の方法。
16. １６．前記細菌がシユードモナス属の類であるところの請求の範囲第１２項記載 の方法。
17. １７．前記細菌がシュードモナス アエルギノサであ るところの請求の範囲第１６項記載の方法。
18. １８．前記宿主微生物が酵母であるところの請求の範囲第８項記載の方法。
19. １９．前記酵母がサツカロマイセス セレビシエであ るところの請求の範囲第８項記載の方法。
20. ２０．前記阻審剤が、前記の活性のある３次構造を呈する以前に回収されるとこ ろの請求の範囲第８項記載の方法。
21. ２１．前記阻審剤が回収以前に前記の活性のある３次構造を呈するところの請求 の範囲第８項記載の方法。
22. ２２．請求の範囲第８項記載の方法により生産されるヒト皮膚繊維芽細胞から分 離されるコラゲナーゼ阻審剤と生物学的に同等であるメタロプロティナーゼ阻審 剤。
23. ２３．ＡＴＣＣ受託番号第５３００３号の微生物Ｃ６００／ＰＵＣ９−Ｆ５／２ ３７ＰｌＯ。
24. ２４．前記ヌクレオチドを配列が であるところの請求の範囲第１項記載の簡単なＤＮＡ配列。
25. ２５．（ａ）宿主動物細胞にメタロプロティナーゼ阻審剤活性をもつ蛋白を生産 させることができる簡単なＤＮＡ配列の鋼製。 （ｂ）宿主動物細胞に移され、その中で複製することができる、簡単なＤＮＡ配 列を操作できる成分をもつベクターへの簡単なＤＮＡ配列のクローニング。 （ｃ）簡易ＤＮＡ配列及び操作成分を含むベクターのメタロプロティナーゼ阻審 剤を発現できる宿主動物細胞への移行。 （ｄ）阻審剤の発現に適当な条件下での宿主動物細胞の培養。 （ｅ）（ｉ）阻審剤の回収。 （ｉｉ）阻審剤に活性のある３次構造をとらせることにより、メタロプティナー ゼ阻審剤活性をもたせること。 から成る動物細胞からのメタロプロティナーゼ阻審剤の生産のための組換えＤＮ Ａ法。
26. （２６）前記ベクターが動物細胞宿主に移行される以前に微生物宿主中で増幅さ れるところの請求の範囲第２５項の方法。
27. （２７）前記ベクターが次のＤＮＡ配列の一部を含むところの請求の範囲第２６ 項記載の方法。 【配列があります】発明の詳細な説明