KR960011918B1 - 히루딘의 변이체와 그 용도 및 제조방법 - Google Patents
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Abstract
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Description
제 1 도는 3가지 자연성 히루딘 변이체에 대한 아미노산 시켄스의 비교표
제 2 도는 히루딘 또는 그 변이체들을 배양시키기 위한 효모 배지의 상청액 양에 따른 트롬빈 크로모자임에 대한 단백질 분해 활성 억제율을 나타낸 그래프
본 발명은 히루딘 변이체에 관한 것이다.
최소한 3가지의 자연 히루딘 변이체가 문헌(1970, Markwardt; 1976, Petersen et al. ; 1976, Markwardt and Walsmann; 1984,1985,1986, Dodt et al. ; 1986, Harvey et al. ; 프랑스특허 제84-04,755호)에 설명되어 있다.
이러한 3개의 히루딘 변이체에 대한 구조가 제 1 도에 나타나 있다.
제 1 변이체인 HV1은 거머리의 몸에서 추출해낸 히루딘에 해당된다.
제 2 변이체인 HV2(1986, Harvey et al)는 제 1 변이체와는 9개의 아미노산이 서로 다르다.
제 3 변이체인 HV3(1986, Dodt et al)는 32번의 세린 아미노산까지는 HV2와 동일하나, C-말단부위는 추가로 아미노산 Ala63을 보유한다.
이들 시켄스들은 65내지 66개의 아미노산을 포함하고 있으며 두가지 영역으로 구성되어 있다고 볼 수 있다. 즉, 구상의 N-말단부위와 산성의 C-말단부위로 구성되어 있고, N-말단부위는 3개의 2황산염 간교를 포함하며 C말단부위는 프로트롬빈 분자내에 트톰빈에 의한 절단부위와 유사성을 갖고 있다. 이러한 유사성이 암시하는 것은 위치 47을 둘러싸고 있는 부위가 히루딘과 트롬빈이 결합되는 부위일 것이라는 것이다.
더욱이, 자연 히루딘은 위치 63에 황산화된 티로신을 포함한다(1983, Chang). 이 황산화된 티로신은 변이체 HV3내의 위치 64에 다시 나타나며(이하 모든 변이체에 있어서 위치 63이라 칭함) 그 기능은 위치와 관계없이 동일하다.
히루딘의 자연 변이체 시켄스들을 비교 분석하면, 자연 시켄스들의 분자들을 여러 형태로 재조합하여 새로운 변이체들을 만들어 내는 것이 이론적으로 가능하다. HV1과 HV3는 2개의 프롤리 사이에 있는 위치 47에 하나의 리신을 갖는데, 이것은 트롬빈의 활성부위를 억제하는 역할을 할 것으로 추정된다(l984,l985,Doda et al.) HV2는 이 위치에 염기성 잔기대신에 아스파라긴을 가지고 있기 때문에, 이 위치에 리신이나 아르기닌을 대체하여 넣음으로 트롬빈 억제자(1985, Chang)나 히스티딘의 성질과 더욱 유사하게 만든다. 이는 트롬빈기질로서는 적합하지 않지만 히루딘의 억제력을 증가시킬 수 있다.
특히, 티로신(위치 63)의 황산화는 자연 히루딘과 Stone, Horfteenge(1986)의 운동역학에서 제시된 것처럼 활성에 영향을 가질 수 있는 유전자 재조합에 의해 얻은 히루딘과의 차이를 나타낸 것이다. 티로신을 Glu나 Asp와 같은 산성잔기로 대체함으로 원형 단백질을 합성하는 시도를 해 볼 수도 있을 것이다.
본 발명은 위치 47 또는 63에 자연 형태로 존재하는 아미노산과는 다른 아미노산을 보유하는 히루딘 변이체에 관한 것이다.
이러한 변이체는 다음과 같다.
- 아미노산 Tyr63이 산성 잔기 특히, Glu 또는 Asp로 대체된 변이체
- 자연상태의 위치 47에 있는 아미노산이 Arg 또는 His로 대체된 변이체
- 자연상태의 HV2에 있는 Asn47이 Lys로 대체된 변이체
각각의 변이체를 다음과 같이 표기한다.
(Lys47) HV2
(Arg47) HV2
(His47) HV2
(Glu63) HV2
(Asp63) HV2
본 발명에 의한 상기한 변이체 즉 (Lys47)HV2 (또는 rHV2-Lys47)는 다음과 같은 구조를 갖는다.
ILE THR TYR THR ASP CYS THR GLU SER GLY GLN ASN LEU CYS LEU CYS GLU SER ASN VAL GYS GLY LYS CLY ASN LYS CYS ILE LEU GLY SER ASN GLY LYS GLY ASN GLN CYS VAL THR GLY GLU GLY THR PRO LYS PRO GLU SER HIS ASN ASN GLY ASP PHE GLU GLU ILE PRO GLU GLU TYR LEU GLN
Tyr63을 함유하는 여러가지 변이체들이 황산화된 형태나 또는 다른 형태로 사용될 수 있다. 이러한 황산화는 화학적으로 또는 생물학적으로 달성할 수 있다. 본 발명은 생물학적 및/또는 화학적 방법을 사용하여 변이체를 얻을 수 있다. 결국 이러한 변이체들은 합성법에 의해서 또는 반(반)합성법에 의해서, 또는 공지의 유전공학적 기법에 의해서 얻을 수 있다.
따라서, 예를 들면 HV1, HV2 및 HV3와 특히 HV2의 정보를 담은 여러가지 시켄스의 복제 및 발현과 효모 배양물에 해당 히루딘을 생산해내는 것에 관해서는 유럽 특허출원 제 EP-200,656호에 설명되어 있다.
본 발명에 의한 변이체들은 상기한 시켄스들을 변환시킨 후 동일한 기법에 의해 얻을 수 있는데 예를 들면, 지시된 돌연변이 유발법에 의해서도 얻을 수 있다. 특히 시험관내에서 돌연변이 유발에 의한 변이체들은 아스파라긴 47이 리신, 이르기닌 또는 히스티딘으로 대체되어 있으며 티로신 63은 글로타민산으로 대치되어 있다.
특히, 유럽 특허출원 제 EP-A-200,655호에 설명되고, 상기 변이체에 대한 히루딘 시켄스 암호를 담고있는 기능성 발현 블록을 사용하는 것이 가능하다. 이 기능성 DNA 블록들을 벡터 플라즈미드에 의해 이루어진다.
여러가지 상이한 변이체에 해당하는 유전자를 담고 있는 효모에 의한 발현 및 분비를 지시하기 위해서, 유럽 특허출원 제 EP-A-200,655호에 설명된 바와 같이 다음과 같은 요소를 포함하고 있는 효소의 벡터와 변이체가 결합된다.
- 효모의 2μ 플라즈미드 복제원
- ura 3 유전자
- E.coli의 복제된 및 항체에 대한 저항을 나타내는 마커(marker)
- 전사 프로모터, 선도사슬 및 알파인자 전구체에 대한 프리프로 사슬(이러한 사슬은 히루딘 변이체에 대한 암호사슬 바로 상단에 위치하고 파지와 융합된다)
본 발명은 이러한 벡터나 기능성 DNA블록에 의해 형질 전환된 효모 및 히루딘 변이체의 제조응용에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 발명에 의해 효모를 발효시켜 히루딘 변이체를 제조하는 방법 및 숙성 상태나 시험관내에서 숙성될 수 있는 전구체의 형태로 배양지에서 제조된 히루딘의 회수방법에 관한 것이다.
여기서 사용하는 기법은 유럽 특허출원 제 EP-A-200,655호 및 제 EP-87,401649-6호에 아주 상세하게 기술되어 있다. 이렇게 하여 얻은 히루딘 변이체는 유럽 특허출원 제 EP-A-200,655호에 설명한대로 생체내에서 또는 시험관내에서 트롬빈 억제자로서 사용할 수 있다. 특히, 이 변이체들은 그 자체만으로서 또는 결합하여, 의약 조성물로서 사용할 수 있으며, 시험관내 또는 생체내에서 시험 또는 진단의 목적으로 사용할 수 있다. 방사능법, 형광법, 효소법 및 기타 방법의 진단에 있어서는 이 변이체들을 표시하는 것이 유리하다.
본 발명은 제 1 도와 제 2 도에 의거하여 아래 실시예들을 기준으로 이하에서 설명할 것이다. 제 1 도는 히루딘의 3가지 자연 변이체 즉, HV1, HV2 및 HV3의 시켄스를 나타낸 것이며 제 2 도는 히루딘, HV2 또는 그 변이체를 제조하기 위한 효모 배양들의 상청액 분량을 기준으로 하여, 트롬빈의 크로모자임에 대한 단백질분해 활성도의 억제율을 나타낸 것이다.
[실시예 1]
시험관내 돌연변이 유발에 의한 여러가지 HV2 변이체들의 합성
시험관내에서 지시된 돌연변이 유발을 수행하기 위해서는 변형하려 하는 DNA 절편을 복제가능한 형태의 단일나선 파지로 클론한다. 즉 재조합 파지의 게놈은 갈라지면서 돌연변이된 시켄스를 수반하는 합성 올리고뉴클레오티드와 결합된다. 이 올리고뉴클레오티드는 상보성 나선 및 DNA 합성을 위한 프라이머(primer)로서 작용하게 되며, 이렇게 2중 나선화된 DNA는 원하는 돌연변이를 수반하는 파지를 생산할 수용체 세균을 형질전환시키기 위해 사용된다(1983, ZollIer 및 Smith). 유럽 특허 EP-A-158,564호에 설명된 플라즈미드 pTG 720은 대장균내의 히루딘 발현을 위한 벡터이다. 플라즈미드 pTG730은 히루딘의 정보를 담은 시켄스의 하단 부위에 EcoR I을 첨가하여 pTG720으로부터 유도해낸 것이다.
EcoR I 부위는, 한편으로는 EcoR I로 절단하고 또 한편으로는 Cla I로서 절단함으로서 히루딘에 대한 정보 시켄스를 회복시킬 수 있다.
Cla I-EcoR I 절편은 수개의 5-말단 코돈을 제외한 히루딘의 전체 정보 영역을 포함한다. Cla I-EcoR I 절편은 M13TG131일 불리리는 파지 M13 유도체의 Acc I 및 EcoR I 부위 사이에서 복제한다. M13TG131에서 유도되어 이 히루딘 시켄스를 구성하는 파지는 M13TG1919라 명명되었다.
3개의 올리고뉴클레오티드를 합성하였는데 이들은 각각 M13TG1919의 시켄스 5'-GTACACCGAACC-CTGAAAG-3'와 짝지을 수 있으나, 단 원하는 돌연변이에 해당하는 그 중앙부위는 예외이다. 이들 올리고뉴클레오티드의 시켄스들은 다음과 같다.
TG435
5 - 'CTTTCAGGGTGCGGTGTAC -3'
TG436
5 - 'CTTTCAGGTTTCGGTGTAC -3'
TG437
5 - 'CTTTCAGGGCGCGGTGTAC - 3'
상기한 올리고뉴클레오티드들은 M13TG1919의 AAC(Asn)코돈이 CAC(His) 또는 AAA(Lys) 또는 CGC(Arg)로서 각각 대치될 수 있게 계획하였다.
각 올리고뉴클레오티드 120 피코 몰씩을 반응매질 100 피코미크로미터 내에서 부인산반응시켰으며, 부인산반응화된 올리고뉴클레오티드 20 피코 몰은 교잡완충액 25 미크로리터 내에서 파지 M13TG1919의 단일 나선 DNA 1 피코 몰로서 교잡화시켰다.
교잡을 수행한 후에 DNA 혼합체를 클레노우 중합체 분해효소 및 파지 T4 리자게에 작용받게 하였다. 이렇게 처리된 각 혼합체는 인디케이터 세균 JM103(Messing et al.,1981)의 로운(lawns)상에서 대장균균주 71/8(mut L)을 감염시키는데 성공하였다. 감염된 세포들은 더 서서히 자라는 반점을 형성하기 때문에 식별이 가능하였다. 이 코로니들은 완전한 매질내에서 재배양시키고, 곧 홧맨(Whatman) 540지로 이전시켜 돌연변이된 파지를 갖는 세포들을 선별하였다.
이 스크린작업은 위에서 프라이머로 사용한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 동소 발생 부위 교잡에 의해 수행하였다. 원하는 돌연변이된 시켄스를 가진 3개의 파지들을 다음과 같이 회득하였다.
M13TG192l(Asn47+Arg), Ml3TG1924(Asn47+His) 및 M13TG1925(Asn47+Lys).
더욱이, 같은 방법의 실험을 시켄스 5'-ATTGTAACTCTTCTTCTG-3' 를 갖는 올리고뉴클레오티드 TG434로서 수행하였다. 이 올리고뉴클레오티드는 HV2의 정보를 담은 시켄스의 3' 부위에 위치하는 시켄스 5'-CAGAAGAATATTTACAAT와 교잡하며, 짝지워지지 않은 트리플레트는 TAT(Tyr63)코돈을 GAG(Glu)로서 대체하게 계획하였다. 이에 의해 돌연변이된 파지 M13TG1922(Tyr63-Glu)를 얻었다.
[실시예 2]
PTG1828의 Pst I -HindIII 절편을 돌연변이된 절편에 의해 대체함.
플라즈미드 pTG1828(유립 특허출원 제 EP-87-401649.6호에서 설명된 것)는 히루딘 정보 시켄스를 대동하며, 효모의 알파 성 페로몬에 대한 유전자의 프리프로 시켄스가 그에 선행한다. 즉, PCK 프로모터 제어하에 둔다. MFD와 히루딘 사이의 이 융합에 의하여 발현된 단백질은 분비 및 성숙의 정상 효모균 경로를 따르기 때문에 가공된 활성 히루딘이 배양 매질내에 나타난다.
이 플라즈미드는 자연 히루딘 대신에 돌연변이된 히루딘 시켄스를 발현시키기 위하여 상기 사용하였다. pTG1828을 Pst I과 HindIII로서 절단시키면 대략 3.8, 1.9, 1.5, 1.1 및 0.6kb의 규격을 가진 5개의 절편들을 방출시킨다.
상기 최종 절편은 프리프로 히루딘의 융합된 시켄스를 구성한다. 이 절편은 단일 Acc I 부위와 단일 EcoR I 부위만으로서 구성된다. 이 두개의 부위에 의해서 한정된 구역은 수개의 5'-말단 코돈만을 제외한 전체 히루딘 시켄스를 구성한다.
EcoR I 부위나 Acc I 부위를 갖지 않는 벡터의 HindIII 부위와 Pst I 부위 사이에 0.6-kb HindIII-Psti 절편을 삽입하였다.
따라서 이와 같은 방식으로 재 구성시킨 플라즈미드(pTG1960)는 히루딘 시켄스의 시작점과 그 하단에 위치하는 단일 Acc I과 EcoR I으로 절단하면 하나의 절편을 방출하는데 이 절편은 사실상 전체 히루딘 시켄스와 그 플라즈미드의 잔여분을 구성한다.
히루딘 시켄스가 결여된 대형 DNA단편을 겔상에서 정제하고, 이것을 실시예 1에서 설명한 돌연변이된 각 파지의 Acc I/EcoR I 절편 생산물질과 혼합시켰는데, 이것은 지시된 돌연변이 유발에 의해 얻은, 새로운 HV2 변종으로서 프리프로 히루딘을 재구성시키기 위한 것이다. 4개의 새로운 플라즈미드를 선정하였는네 그것은 다음과 같은 것이며, 이들은 돌연변이된 코돈에 있어서만 pTG1960과 상이한 것이다.
pTG1963(Asn47→Arg), pTG1964(Tyr63→Glu), pTG1965(Asn47→His), pTG1966(Asn47→Lys) .
돌연변이된 코돈을 가지고 있는 이 시켄스들은 pst I -HindIII 의 형태로 회수할 수 있으며, 본래의 Pst I -HindIII 절편대신에 벡터 pTG1828로 복제할 수 있다.
이에 따라 다음과 같은 4개의 새로운 플라즈미드가 얻어지며 이들은 시험관 내에서 생성시킨 돌연변이 코돈 만큼만이 전술한 pTG1282과 상이하다.
pTG1977 (Asn47→ARG) , pTG1978 (Tyr63→Glu), pTG1979 (Asn47→ His), pTG1980(Asn47→Lys) .
[실시예 3]
pTG1977, pTG1978, pTG1979 및 pTG1980의 DNA들에 의하여 TGY1sp4을 형질전환시킴.
S.cercvisiae TGY1sp4(Mat α ura 3.251.373.382 his_3.11.15)세포들을 pTG1977, pTG1978, pTG1979 및 pTG1980의 DNA들로서 형질전환시켰으며, ura- 형질전환체들을 각 경우에 얻었다.
이에 의해 4개의 균주 즉, TGY1sp4 pTG1977, TGY1sp4 pTG1978, TGY1sp4 pTG1979 및 TGY1sp4 pTG1980을 얻었다. 그리고 이 4균주에 의해서 얻은 히루딘과 TGY1sp4 pTG1828에 의해서 얻은 히루딘을 비교하였다.
OD 660 0.02의 배양물(YNB+0.5%의 카사미노산) 20ml에 각 균주를 종파시켰다. 30℃에서 48시간 교반시킨후에 배양물을 원심분리하였으며(5000rpm으로 5분간), 상청액을 평가검사하였다.
TGY1sp4 pTG881(HV2 정보 시켄스를 동반하지 않는 플라즈미드)의 배양물을 비교기준으로 하였다. 트롬빈 활성도(합성기질인 베링거 만하임의 크로모자임 TH상에서의 단백질 분해 활성도)에 대한 억제효과를 기준으로 측정하였다. 창성액의 분량을 기준으로 한 억제율은 제 2 도에 표시되어 있다.
여기서 관찰된 바에 의하면, Arg17 및 Lys47 변이체에 의해 발휘되는 억제효과는 최소한 자연 HV2의 억제효과와 동일하다. Glu63 및 His47 변이체는 HV2보다 억제 효과가 약간 적다.
[실시예 4]
트롬빈 활성의 억제
본 발명의 주제인 히루딘 변이체 가치를 더욱 명확히 하기 위해서, 특히 그것을 의약에 적용할 목적으로, 이하에 제시한 비교 실시예들은 변이체 HV2 및 HV2 형태의 다른 2가지 변이체에 대한 억제력을 나타내고있다. 상기 변이체들은 그 위치 47의 아미노산이 Arg 또는 Lys에 의해 교체된 것이다.
이 변이체들에 의한 트롬빈 억제 운동학을 연구하는데 있어서는, J.W.WILLIAMS 및 J.F.MORRISON의 효소학상의 방법론(63, 페이지 437-467,1979)에 설명된 높은 억제도 이론에 바탕을 두었으며 이는 히루딘이 가역적인 트롬빈 억제자이기 때문이다.
사용된 히루딘 변이체들은 95%로 정제하였으며, 인체에 순수한 시그마 트롬빈은, 활성부위의 적정에 의해서 측정할때 92% 이상의 활성도를 가진다. 인체트롬빈의 농도는 매 측정시마다 동일하였으며 5.45*10-9M 이었다.
매질은 0.05M의 나트륨 파이프 완충제, 0.18M의 KC1 및 0.1% PEG를 함유하였으며, pH값은 7.8였고 온도는 37℃로 유지하였다. 트롬빈 기질은 베링거 크로모자임 PL이었다. 트롬빈괴 히루딘에 대해서 다같이 2분간의 사전 인큐베이션 시간을 주었으며 곧 기질과 반응을 시작시켰다. 다음의 표는 일정량의 히루딘으로서 인체 트롬빈(5.5*10-9M)의 동일양을 95% 억제시키는 히루딘 양을 실험적으로 결정하여 그 값을 표시한 것이다.
Claims (13)
- 아미노산 시켄스의 47번째 또는 63번째의 아미노산이 지연상태의 것과 다른 아미노산으로 이루어진 히루딘 변이체.
- 제 1 항에 있어서, 자연상태의 63번째 아미노산 Tyr이 산성 잔기 아미노산 Glu 또는 Asp로 대체되어 있는 히루딘 변이체.
- 제 1 항에 있어서, 히루딘 변이체가 히루딘의 HV1, HV2 또는 HV3의 한 변이체로 이루어진 히루딘 변이체.
- 제 1 항에 있어서, 자연상태의 47번째 아미노산이 Arg 또는 His로 대체되어 있는 히루딘 변이체.
- 제 1 항에 있어서, HV2의 자연상태 47번째 아미노산 Asn이 Lys로 대체되어 있는 히루딘 변이체.
- 제 1 항에 있어서, 아미노산 시팬스가 (Lys47) HV2, (Arg47) HV2, (His47) HV2, (Glu63) HV2 및 (Asp63)HV2 중에서 선택된 히루딘 변이체.
- 제 1 항에 있어서, 다음과 같은 시켄스로 이루어진 히루던 변이체.ILE THR TYR THR ASP CYS THR GLU SER GLY GLN ASN LEU CYS LEU CYS GLU GLY SER ASN VAL CYS GLY LYS GLY ASN LYS CYS ILE LEU GLY SER ASN GLY LYS GLY ASN GLN CYS VAL THR GLY GLU GLY THR PRO LYS PRO GLU SER HIS ASN ASN GLY ASP PHE GLU GLU ILE PRO GLY GLU TYR LEU GLN
- 제 1 항 내지 7 항중 어느 한 항에 있어서, 히루딘 변이체가 황산화되었거나 또는 그렇지 않는 것으로 된 히루딘 변이체.
- 아미노산 시켄스의 47번째의 또는 63번째의 아미노산의 자연상태의 것과 다른 아미노산으로 이루어진 것을 포함하고 있는 히루딘 변이체를 트롬빈 억제자로 이용하는 히루딘 변이체.
- 아미노산 시켄스의 47번째 또는 63번째 아미노산이 자연상태의 것과 다른 아미노산으로 이루어진 것을 포함하고 있는 히루딘 변이체를 항응혈제로 이용하는 히루딘 변이체.
- 아미노산 시켄스의 47번째 또는 63번째의 아미노산이 자연상태의 것과 다른 아미노산으로 이루어진 것을 포함하고 있는 히루딘 변이체를 의약품으로 이용하는 히루딘 변이체.
- 아미노산 시켄스의 47번째 또는 63번째의 아미노산을 자연상태의 것과 다른 것으로 이루어진 것으로 합성공정, 준합성처리 및/또는 유전자 조작을 이용하여 히루딘 변이체를 제조하는 방법.
- 제 12 항에 있어서, 다음의 것들을 포함하고 있는 플라즈미드에 의하거나,- 효모의 2플라즈미드의 복제원,- ura3 유전자,- 대장균내의 복제원과 항생제에 대한 저항성 마커,- 전자 프로모터, 선도(Ieader) 시켄스 및 히루딘 변이체에 대한 정보 시펜스 바로 상단에 일치하여 융합하는 알파 인자 전구체의 프리프로 시켄스,- 히루딘 변이체에 대한 유전자 바로 하단에 위치하는 PGK 유전자의 전사 말단(terminater). 또는 히루딘 변이체를 특정화하는 기능성 DNA 블록에 의해서 사전 형질전환된 효모의 발효를 이용하는 히루딘 변이체 제조방법.
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