SU1687032A3 - Способ получени мутеинов гирудина - Google Patents
Способ получени мутеинов гирудина Download PDFInfo
- Publication number
- SU1687032A3 SU1687032A3 SU874203831A SU4203831A SU1687032A3 SU 1687032 A3 SU1687032 A3 SU 1687032A3 SU 874203831 A SU874203831 A SU 874203831A SU 4203831 A SU4203831 A SU 4203831A SU 1687032 A3 SU1687032 A3 SU 1687032A3
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- hirudin
- thrombin
- fragment
- muteins
- codon
- Prior art date
Links
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 title claims abstract description 43
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 title claims abstract description 37
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 title claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims abstract description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 11
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 4
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 claims description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 abstract 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 abstract 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 12
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 10
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 9
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 9
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 9
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 5
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M Pentobarbital sodium Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)[N-]C1=O QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 3
- 101150064974 ass1 gene Proteins 0.000 description 3
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 229960003766 thrombin (human) Drugs 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 2
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 2
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001407 anti-thrombic effect Effects 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 2
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002885 thrombogenetic effect Effects 0.000 description 2
- 101150111329 ACE-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 101710194907 Hirudin-2 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002350 laparotomy Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 101150049514 mutL gene Proteins 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000005164 penile vein Anatomy 0.000 description 1
- 229960002275 pentobarbital sodium Drugs 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 210000001631 vena cava inferior Anatomy 0.000 description 1
- 201000002282 venous insufficiency Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к медицине и может быть использовано при создании фармацевтических препаратов. Цель изобретени - повышение сродства мутеинов к тромбину и упрощение способа. Дл этого с помощью фрагмента ДНК, в котором кодон дл аминокислоты в 47 позиции природной формы гирудина заменен на кодон дл лизина или аргинина, конструируют рекомби- нантные плазмидные ДНК pTG197 или pTG1980 и трансформируют ими реципиен- тный штамм дрожжей S cerevlsial TGVI sp.4. В результате получают штаммы, продуцирующие мутантныи гирудин. 3 абл.
Description
Изобретение относитс к медицине и может быть использовано при создании фармацевтических композиций.
Цель изобретени - повышение сродства мутеинов к тромбину и упрощение способа .
Пример 1. Конструкции различных вариантов гирудина-2 (Г2) мутагенезом in vitro.
Дл осуществлени направленного мутагенеза in itro фрагмент ДНК клонируют в репликативную форму фага, геном рекомби- оантного фага выдел ют и подвергают гибридизации с синтетическим олигонукле- отидом, который несет мутированную последовательность . Этот олигонуклеотид служит затравкой синтеза комплементарной нити. Полученную таким образом двуни- тевую ДНК используют дл трансформации бактерий, которые будут продуцировать фаг, несущий искомую мутацию.
Плазмида pTG720 представл ет вектор экспрессии гирудина в E.coll. Плазмиду
pTG730 получают из pTG720 путем присоединени сайта EcoR1 за кодирующей последовательностью гирудина.
Фрагмент Cla1-EcoR1 покрывает всю область, кодирующую гирудин, без нескольких 5-концевых кодонов. Этот фрагмент Cla l-EcoRI клонируют между сайтами Асс1 и EcoR1 фага М13, называемого М13Т 131. Фаг, происход щий из M13TG131 и содержащий последовательность гирудина, назван M13TG1919.
Синтезируют три олигонуклеотида, каждый из которых способен составить пару с последовательностью 51-ГТАЦАЦЦГААЦН- ЦТГАААГ-31 в M13TG1919, кроме ее центральной области, котора соответствует желаемой мутации. Последовательности этих нуклеотидов вл ютс следующими:
TG435 51-ЦТТТЦАГГГТГЦГГТГТАЦ-31,
TG436 Б ЦТТТЦАГГПТЦГГТГТАЦ-З1, . ТС43751-ЦТТТЦАГТГЦГЦГТТГТАЦ-31.
Эти олигонуклеотиды предназначены дл осуществлени замещени кодона ААЦ
Ё
(асн) в М13Т1919 на ЦАЦ(гис) или ААА(лиз), или ЦГЦ(арг) соответственно.
120 пмоль каждого олигонуклеотида фосфорилируют в 100 мкл реакционной среды и примерно 20 пмоль фосфорилировен- ного олигонуклеотида гибридизуют с 1 пмоль однонитевой ДНК фага М13Т1919.
После гибридизации смеси обрабатывают полимеразой Кленова и лигазой фага 14 и используют дл трансфекции штамма E.coli 71/18 (mutL). Отбирают клетки, которые образуют ионы медленного роста, коло нии пересеивают на полную среду, перенос т на бумагу 540 дл отбора клеток, имеющих мутированные фаги.
Отбор осуществл ют гибридизацией с олигонуклеотидом - затравкой. Таким образом получают три новых фага, имеющих искомую мутированную последовательность: M13TG1921 (асн47- арг), M13TG1924 (асн 47 гис)и M13TG1925 (асн47 - лиз).
С другой стороны повтор ют тот же тип эксперимента с олигонуклеотидом Т434 последовательности5 -АТТГТААЦТЦТТСТТСТГ-31 . Этот олигонуклеотид гибридизуют с последовательностью 5 - ЦАГААГААТАТТТАЦААТ, локализованной в области З1 последовательности, кодирующей Г2 с неспаренным триплетом, предназначенным дл замены кодона ТАТ(тир6 на ГАГ(глу). Таким образом получают мутированный фаг, соответствующий M13TG1922 (тир63- глу).
Пример 2. Замещение фрагмента Pstl-HInd III и (0,6 т.п.о.) в pTG 1828 на мутированный фрагмент.
Плазмида pTG1828 несет последовательность , кодирующую гиридин, которой предшествует последовательность гена полового ферромонэ-альфа дрожжей MFL все это под контроль промотора PGK. Последовательность WFL и гирудина проход т стадию синтеза и созревани в дрожжах, таким образом продуцированный гирудин находитс в культуральной среде.
Эту плазмиду используют дл получени последовательностей мутированного гирудина вместо нативного гирудина.
Гидролиз рестриктазами Pstl и Hlndlll PTG 1828 высвобождает п ть фрагментов размером примерно 3,8; 1.9: 1,5; 1,1 и 0,6 т.п.о. соответственно. Последний фрагмент содержит только один сайт Асс1 и один сайт EcoRL Область, ограниченна этими двум сайтами содержит всю последовательность гирудина без нескольких 51-концевых кодо- нов. Фрагмент Hindlll Pst 0,6 т.п.о. вставлен между сайгами Hlndlll и Pst1 вектора, который не имеет ни сайта EcoR1, ни сайта Асс1.
Таким образом плазмида pTG1960 име ет один сайт Асе 1 и один сайт EcoR1, локв лизованные в начале и конце последов тельности гирудина.
Большой фрагмент ДНК, из последовательности гирудина, очищают в геле и смешивают с продуктом переваривани Асс1 - EcoR1 репликативной формы каждого из мутированных фагов, описанных в примере 1,
0 чтобы реконструировать комбинацию про- про-гирудин с новыми вариантами Г2, полученными направленной мутацией. Отобраны четыре новых плазмида: pTG1963 (асн47-- арг), pTG1964 (тир63- глу), рТ1965
5 (асн47- гис) и рТС1966(асн4Д. лиз), которые отличаютс от pTG1960 только мутированными кодонами.
Эти последовательности, несущие мутированные кодоны, могут быть выделены в
0 виде фрагментов Pstl Hlndlll и повторно клонированы в вектор pTG1826 вместо исходного фрагмента Pst1-Hindlll.
Таким образом получают четыре новых плазмиды: pTG1977 (асн4 арг), pTG1978
5 (тир63- У глу), pTG 1979 (асн47, гис) и pTG 1980 (асн47 лиз), которые отличаютс от pTG1828, описанной выше, только мутаци ми .
Пример 3. Клетки дрожжей TGVIsp4
0 трансформируют с помощью ДНК pTG1977, pTG1978. pTG1979, pTG1980, Трансформанты получают в каждом случае и получают четыре штамма TGVIsp4 pTG1977, TGVIsp4 PTG1978, TGVIsp4 pTG1979 и TGVIsp4
5 pTG1980. Сравнивают продуктивность по гирудину этих четырех штаммов и TGVIsp4 PTG1828.
Засевают 20 мл культуры, после 48 ч выращивани при 30°С клетки центрифуги0 руют (5000 об/мин, 5 мин) и анализируют надосадочные жидкости.
Культуру TGVIsp4 pTG881 (плазмида, не несуща последовательности, кодирующей Г2) используют в качестве контрол .
5Активность надосадочных жидкостей
оценена по их ингибирующему действию на активность тромбина (протеолитическа активность на синтетический субстрат).
Установлено, что ингибирующее дейст0 вне. производимое вариантами арг4 и лиз , не меньше действи нативного Г2. Варианты глу63 и гис47 обладают несколько меньшим ингибирующим эффектом.
Пример 4. Ингибирование действи
5 тромбина.
Используют варианты гирудина, очищенного до 95%, и чистый человеческий тромбин, имеющий процент активности, измеренный титрованием активных центров, оавный 92%. Концентрации тромбина одимаковы во всех измерени х и равны 5,5 -10 М. Реакцию провод т в буфере состава: 0,05 М натрий, рН 7,9, 0,18 М KCI и 0,1 % ПЭГ при 37°С. В течение 2 мин провод т преинкуба- цию дл тромбина и гирудина, потом реак- цию запускают в ход с субстратом.
В табл. 1 приведены величины, определенного экспериментально, количества гирудина , необходимого дл ингибировани 95% такого же количества человеческого тромбина (5,5 М).
Таким образом, сно, что требуетс примерно в четыре раза меньше гирудина Г2 - арг и Г2 - лиз , чтобы ингибировать то же количество человеческого тромбина, в срав- нении с гирудином Г2.
Следовательно, предлагаемые варианты обладают значительно улучшенными ин- гибирующими свойствами по отношению к тромбину.
Пример 5. Фармакологическое изучение двух вариантов гирудина - рекомби- нантных Г2 и Г2-Лиз в сравнении со стандартным гепарином.
Цель изучени .
Оценить два варианта рекомбинантно- го гирудина и сравнить их антитромбиче- скую эффективность со стандартным гепарином.
Экспериментальные услови .
Антитромбическую специфическую активность двух рекомбинантных гирудинов в физиологической сыворотке определ ют по ингибированию протеолитической активности тромбина на хромозные.
Антикоагулирующую активность двух гирудинов сравнивают In vitro в плазме крысы и кролика по продолжительности тром- бинового времени и эффекту анти-Ила хромогенным методом.
Кинетику плазматического исчезновени гирудина после внутренней инъекции большого объема наблюдают путем измерени вли ни анти-Ила с помощью тромби- нового времени и хромогенным методом с помощью калибровочных кривых.
Полученные плазматические концентрации после 30 мин непрерывной внутривенной перфузии у кролика определ ют по тем же методикам.
Антитромбическую активность двух вариантов гирудина и стандартного гепарина изучают на модели Весслера на кроликах и на крысах с тромбопластином как тромбо- генным агентом и на модели стаза у кролика . Лекарство ввод т кролику внутривенно путем непрерывной перфузии большого объема.
Модель Весслера на кролике.
Используют самцов новозеландских кроликов, вес щих 2,5-3 кг. После анестезии с помощью внутривенной инъекции пен- тобарбитала натри (30 мг/кг) каннилируют левую сонную артерию и изолируют две ремных вены, накладывают две слабые лигатуры на каждую из них на рассто нии 2.5 см одна от другой. Затем кролики получают или физиологическую сыворотку или растворы гирудина или гепарина непрерывной перфузией в течение 30 мин при расходе 2,5 мл/ч. За 2 мин до конца перфузии берут пробы артериальной крови, чтобы определить содержание антикоагул нтов в плазме. За 1 мин до конца перфузии делают инъекцию человеческого стандартизованного тромбопластина в дозе 600 нг/кг точно в течение 30 с в аорту через сонную артерию. Спуст 30 с перфузию прекращают и образуют застой крови, сжима лигатуры двух сегментов вен в течение 15 мин. Вскрывают ремные вены и извлекают тромбы, промывают в физиологической сыворотке и взвешивают после тампонировани на фильтровальной бумаге.
Модель Весслера на крысе.
Используют самцов крыс Сираг-Доулей (СД-СОВ) весом примерно 300 г. После анестезии пентобарбиталом натри интрапери- тонеальным путем (30 мг/кг) и срединной лапаротомии высвобождают нижнюю полую вену на 1 см из почечного перекресть . Накладывают две гибкие лигатуры на рассто нии 1 см.
Испытуемые образцы, разбавленные физиологической сывороткой, ввод т внутривенно одним объемом дозой 1 мл/кг за 5 мин 40 с или за 1 мин (гепарин) до реализации венозного стаза. За 40 с до этого стаза ввод т тромбогенный агент в дозе 25 мг/мл/кг в вену пениса в течение 30 мин. Через 10 с после окончани инъекции создают стаз, зажима обе лигатуры, сначала проксимальную , затем дистальную. Состо ние стаза выдерживают в течение 10 мин, потом тромб извлекают, погружают в 0,38%-ный раствор цитрата, сушат на бумаге досуха и взвешивают на следующий день после сушки в течение 1 ч при 50°С.
Модель тромбоза дл засто крови у кролика.
Используют самцов новозеландских кроликов весом 2,5-3 кг. После анестезии путем внутривенного вливани 30 мг/кг пентобарбитала натри канюлируют левую сонную артерию и изолируют две ремные вены, на каждую из них накладывают две слабые лигатуры на рассто нии 2,5 см друг от друга. Затем кроликам ввод т или физиологическую сыворотку, или растворы гирудина , или гепарина непрерывной перфузией в течение 30 мин при расходе 2,5 мл/ч. За 2 мин до окончани перфузии делают отборы артериальной крови, чтобы определить плазматическое содержание антикоагул нтов . После прекращени перфузии создают состо ние стаза, зажима четыре лигатуры (сначала проксимальную, затем дистальную). Стаз сохран ют 2 ч, потом вскрывают ремные вены и извлекают тромбы , промывают в физиологической сыворотке и взвешивают после тампонировани на бумажном фильтре.
Результаты.
Дл каждого препарата маточного раствора с концентрацией 1 мг/кг специфическа антитромбинова активность обоих вариантов гирудина по отношению к человеческому и бычьему тромбинам приведены в табл.2.
Специфическа антитромбинова активность варианта гирудина Г2 составл ет +/-15000 АТЕ/мг и дл варианта Г2-Лиз47 составл ет +/-19000 АТЕ/мг. Эти специфические активности превышают ожидаемые. Специфическа активность идентична дл человеческого и бычьего тромбинов.
Антикоагулирующа активность в плазме крысы и кролика эквивалентна при малых концентраци х обоих гирудинов. Активность варианта Г2-Лиз47 значительно выше при более высоких концентраци х. Количество остаточного тромбина в плазме, определенное с помощью хромогенного субстрата, сравнивают после добавлени обоих гирудинов до 60 АТЕ/мл. Дл лучшей нейтрализации следов остаточного тромбина вариант Г2-Лиз вл етс более эффективным . Это выражено в разнице значений К.
Кинетика исчезновени обоих гирудинов в плазме после внутривенной инъекции большого объема оказываетс сравнимой при определении ее хромогенным методом, но несколько различаетс три определени ее по тромбиновому времени (табл.3).
Гирудины исчезают согласно двум экспонентам . На первой фазе(распределение) с периодом полураспада, равным 3 мин, исходное количество за 5 мин снижаетс до 60% дл обоих гирудинов. На второй фазе
период полураспада равен 16 мин, дл Г2-Лиз и 28 мин дл Г2, если расчет ведут с учетом тромбинового времени, и 28 и 30 мин соответственно, если используют хромогенный метод. Стандартный гепарин исчезает согласно одной экспоненциальной фазе, период полураспада равен 9 мин.
Концентрации двух вариантов гирудина в плазме, полученные после 30 мин непрерывной перфузии внутривенно кролику, наход тс в пр мой зависимости от перфузируемых доз (см. табл.4). Антитромбиновые эффекты. На основании фармакологических анализов видно, что при непрерывной перфузии кролику вариант рекомбинантного гирудина Г2-Лиз имеет более высокую ан- титромбиновую активность, чем Г2 и гепарин . Фармакокинетика обоих вариантов
гирудина вл етс идентичной.
Исследовани показывают, что геморрагическа опасность у кроликов или врем кровотечени у крыс, получивших Г2-Лиз , ниже, чем у получивших стандартный гепарин , дл каждого вида животного при эквивалентных дозах дл модели тромбоза.
Таким образом, изобретение позвол ет получить рекомбинантные мутанты гирудина , обладающие высоким фармакологическим эффектом.
Claims (1)
- Формула изобретени Способ получени мутеинов гирудина, предусматривающий получение фрагментаДНК, кодирующего гирудин с помощью сай- тспецифического мутагенеза, конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей мутеины гирудина, путем клонировани фрагмента в вектор, трасформацию полученной ДНК штаммов-реципиентов , культивирование трансформированных штаммов, выделение и очистку целевого продукта, отличающийс тем, что, с целью повышени сродства мутеинов к тромбину и упрощени способа, получают фрагмент ДНК, в котором кодон дл аминокислоты в 47 позиции природной формы HU2 заменен на кодон дл Lys или Arg, конструируют рекомбинантные плазмидныеДНК , рТС197илирТ61980, а в качестве реципиента используют Sachomicus cerevislae TGVIsp4.168703210 Таблица 1ТТ - тромбиновое врем . SC - хромогенный субстратТаблица2Таблица 3Таблица 4
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR868616723A FR2607517B2 (fr) | 1986-12-01 | 1986-12-01 | Vecteurs d'expression de variants de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU1687032A3 true SU1687032A3 (ru) | 1991-10-23 |
Family
ID=9341393
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU874203831A SU1687032A3 (ru) | 1986-12-01 | 1987-11-30 | Способ получени мутеинов гирудина |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5650301A (ru) |
| EP (1) | EP0273800B1 (ru) |
| JP (1) | JP2567263B2 (ru) |
| KR (1) | KR960011918B1 (ru) |
| AT (1) | ATE73462T1 (ru) |
| AU (1) | AU617989B2 (ru) |
| BG (1) | BG49719A3 (ru) |
| CA (1) | CA1341416C (ru) |
| CS (1) | CS276245B6 (ru) |
| DE (1) | DE3777367D1 (ru) |
| DK (1) | DK173247B1 (ru) |
| ES (1) | ES2032465T3 (ru) |
| FI (1) | FI99211C (ru) |
| FR (1) | FR2607517B2 (ru) |
| GR (1) | GR3004556T3 (ru) |
| HU (1) | HU213871B (ru) |
| IE (1) | IE60544B1 (ru) |
| MC (1) | MC1884A1 (ru) |
| NO (1) | NO177500C (ru) |
| PL (1) | PL157254B1 (ru) |
| PT (1) | PT86233B (ru) |
| RO (1) | RO106890B1 (ru) |
| SU (1) | SU1687032A3 (ru) |
| ZA (1) | ZA879011B (ru) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2628429B1 (fr) * | 1988-03-08 | 1990-12-28 | Transgene Sa | Variants de l'hirudine, leurs utilisations et les procedes pour les obtenir |
| GB8817161D0 (en) * | 1988-07-19 | 1988-08-24 | Ciba Geigy Ag | Modified proteins |
| GB8817160D0 (en) * | 1988-07-19 | 1988-08-24 | Ciba Geigy Ag | Novel proteins |
| US5284768A (en) * | 1988-08-24 | 1994-02-08 | Sanofi | Signal peptide, DNA sequences coding for the latter, expression vectors carrying one of these sequences, gram-negative bacteria transformed by these vectors, and process for the periplasmic production of a polypeptide |
| US5879926A (en) * | 1989-03-31 | 1999-03-09 | Transgene S.A. | Yeast strains for the production of mature heterologous proteins, especially hirudin |
| FR2645174B1 (fr) * | 1989-03-31 | 1994-01-07 | Transgene Sa | Souches de levure ameliorees pour la production de proteines heterologues matures en particulier d'hirudine et procede de preparation d'hirudine correspondant |
| FR2645175B1 (fr) * | 1989-03-31 | 1994-02-18 | Transgene Sa | Souche de saccharomyces cerevisiaeproductrice d'une proteine heterologue et procede de preparation de ladite proteine heterologue par fermentation de ladite souche |
| FR2646437B1 (fr) * | 1989-04-28 | 1991-08-30 | Transgene Sa | Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant |
| FR2656531B1 (fr) * | 1989-12-29 | 1992-04-24 | Sanofi Sa | Promoteur artificiel pour l'expression de proteines dans le levure. |
| US5118790A (en) * | 1990-07-24 | 1992-06-02 | Sri International | Analogs of hirudin |
| ATE140929T1 (de) * | 1990-11-08 | 1996-08-15 | Japan Energy Corp | Hirudinmutante, deren herstellung, antikoagulans, sekretorischer vektor, durch besagten vektor transformierter mikroorganismus und herstellung eines produkts durch besagten mikroorganismus |
| US5837808A (en) * | 1991-08-20 | 1998-11-17 | Baxter International Inc. | Analogs of hirudin |
| US5407822A (en) * | 1991-10-02 | 1995-04-18 | Sanofi | Artificial promoter for the expression of proteins in yeast |
| JP7375012B2 (ja) * | 2019-04-16 | 2023-11-07 | サンゲン バイオサイエンス カンパニー，リミテッド | ヒルジン突然変異体の抽出・精製方法およびその使用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1341417C (fr) * | 1984-03-27 | 2003-01-21 | Paul Tolstoshev | Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine |
| EP0168342B1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-07-03 | Ciba-Geigy Ag | Verfahren zur Herstellung von Thrombin-Inhibitoren |
| DE3429430A1 (de) * | 1984-08-10 | 1986-02-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| DE3445517C2 (de) * | 1984-12-13 | 1993-11-18 | Ciba Geigy | Für ein Hirudin-ähnliches Protein codierende DNA-Sequenz und Verfahren zur Herstellung eines Hirudin-ähnlichen Proteins |
| FR2593518B1 (fr) * | 1985-05-02 | 1989-09-08 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees |
| DE3689525D1 (de) * | 1985-07-17 | 1994-02-24 | Hoechst Ag | Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel. |
-
1986
- 1986-12-01 FR FR868616723A patent/FR2607517B2/fr not_active Expired
-
1987
- 1987-11-25 NO NO874905A patent/NO177500C/no not_active IP Right Cessation
- 1987-11-27 PT PT86233A patent/PT86233B/pt unknown
- 1987-11-27 AU AU81880/87A patent/AU617989B2/en not_active Expired
- 1987-11-27 IE IE323987A patent/IE60544B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-11-30 CA CA000553153A patent/CA1341416C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1987-11-30 DK DK198706276A patent/DK173247B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-11-30 EP EP87402696A patent/EP0273800B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-30 AT AT87402696T patent/ATE73462T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-11-30 ES ES198787402696T patent/ES2032465T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-30 SU SU874203831A patent/SU1687032A3/ru active
- 1987-11-30 RO RO130679A patent/RO106890B1/ro unknown
- 1987-11-30 DE DE8787402696T patent/DE3777367D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-01 PL PL1987269164A patent/PL157254B1/pl unknown
- 1987-12-01 HU HU875394A patent/HU213871B/hu unknown
- 1987-12-01 MC MC871932A patent/MC1884A1/xx unknown
- 1987-12-01 FI FI875295A patent/FI99211C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-12-01 CS CS878732A patent/CS276245B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1987-12-01 BG BG82035A patent/BG49719A3/xx unknown
- 1987-12-01 KR KR1019870013708A patent/KR960011918B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-12-01 ZA ZA879011A patent/ZA879011B/xx unknown
- 1987-12-01 JP JP62305504A patent/JP2567263B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-05-12 GR GR920400903T patent/GR3004556T3/el unknown
-
1995
- 1995-06-07 US US08/480,511 patent/US5650301A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| За вка iNfc 2562088. кл. С 12 N 15/00, 1985. * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SU1687032A3 (ru) | Способ получени мутеинов гирудина | |
| KR0149001B1 (ko) | 플라스미노겐 활성인자 및 히루딘을 포함하는 약제학적 조성물 | |
| US5204323A (en) | Heparin and hirudin antidotal compositions and methods | |
| DK174837B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af hirudin samt transformeret gær som kan anvendes ved fremgangsmåden | |
| JPH05506252A (ja) | 改良トロンビン阻害剤 | |
| JPH11504938A (ja) | クニッツ型プロテアーゼ阻害因子 | |
| CA2072375C (en) | Hirudin analog, method of manufacturing thereof and anti-coagulant composition, and secretion vector, transformed microorganisms containing saidvector and manufacturing method of products which is produced from said microorganism | |
| JP2001518801A (ja) | デンドロアスピン・スカフォルドに基づく二重あるいは多重機能性分子 | |
| CN1678636A (zh) | 溶栓和抗凝双功能融合蛋白及应用 | |
| IE913601A1 (en) | Megakaryocyte maturation factors | |
| JP2002517197A (ja) | プロテアーゼインヒビターペプチド | |
| US5876971A (en) | Thrombin inhibitor from the saliva of protostomia | |
| KR0147294B1 (ko) | 혈액 응고 억제제에 대한 해독제로서의 인자 viii의 용도 | |
| CA2159218A1 (en) | Novel polypeptide having factor xa inhibitory activity | |
| JPH02149527A (ja) | 抗血栓剤 | |
| Ohyama et al. | Anti-thrombotic effects of CX-397, a recombinant hirudin analog, in a canine model of coronary artery thrombosis | |
| JP2002241400A (ja) | 血液体外循環回路用の血液凝固防止のための医薬組成物 |