CN1678636A - 溶栓和抗凝双功能融合蛋白及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及溶栓和抗凝蛋白的融合蛋白及其连接肽，更具体地说，本发明涉及抗凝蛋白与具有纤溶酶原激活作用的蛋白质分子通过能被凝血因子识别并裂解的氨基酸序列作为连接肽连接而成的融合蛋白，该融合蛋白的医药学用途，能被凝血因子识别序列的连接肽用于连接溶栓和抗凝两种蛋白的用途。
Description
溶栓和抗凝双功能融合蛋白及应用 技术领域
本发明涉及溶栓和抗凝蛋白的融合蛋白及其连接肽， 更具体地 说， 本发明涉及抗凝蛋白与具有纤溶酶原激活作用的蛋白质分子通 过能被凝血因子识别并裂解的氨基酸序列作为连接肽连接而成的融 合蛋白， 该融合蛋白的医药学用途， 能被凝血因子识别序列的连接 肽用于连接溶栓和抗凝两种蛋白的用途。 背景技术
心血管疾病是人类近年面临的头号杀手。 目前临床应用于血栓治 疗的主要溶栓药物有尿激酶和组织型纤融酶原激活剂， 主要抗凝药 物有肝素和水蛭素。 虽然溶栓治疗对降低血栓病人的死亡率起到了 重要作用， 但溶栓治疗过程中产生的细小凝血块进入血液循环容易 引发再次栓塞。 因此， 临床上通常采用肝素或水蛭素作为抗凝药物 与溶栓药物进行组合治疗。
然而， 溶栓药物和抗凝药物在临床上常常因选择性不强而在全 身发生溶血和抗凝作用， 因而引起系统出血。
更具体地讲， 组织型纤溶酶原激活剂 （t-PA )、 链激酶（S ：)、 尿激酶（UK )、 尿激酶样纤溶酶原激活剂 （u-PA )具有活化纤溶酶 原的作用， 活化的纤溶酶在溶解血栓部位纤维 白的同时也不同程 度地引起了系统非血栓部位出血等不同副作用。 葡激酶（ SAK， Staphylokinase )是新一代天然的纤溶酶原激活剂， 对血栓具有一定 的选择性。
水蛭素（Hirudin, HV )是新一代天然抗凝小分子蛋白药物， 对 凝血酶具有高的亲和性和选择性抑制作用。 然而， 水蛭素在临床上 容易引起系统出血， 并且水蛭素没有相应的对抗剂。
因此， 在提高溶栓治疗效果的同时， 如何提高溶解血栓药物的选
择性， 从而降低药物的副作用至关重要。 提高药物的靶向性从而提 高血栓部位药物的局部浓度、 降低非血栓部位的药物浓度或药物活 性对提高治疗效果和減少系统出血等副作用具有重要意义。 国内外 报道的融合蛋白均不能降低系统出血等任何副作用。
为此， 进一步尝试开发具有溶栓和抗凝双功能药物是目前抗血栓 药物开发的焦点之一。 为获得溶栓和抗凝的双功能， 国内外对水蛭 素与 SAK、 SK的融合方法进行了研究， 结果表明， 如果水蛭素的 N 末端与 SAK或 SK的 C末端融合，则水蛭素的抗凝血酶的活性均告 丧失， 仅保留了溶栓蛋白的活化纤溶酶原活性或部分该活性； 如果 水蛭素的 C末端与 SAK的 N末端相连，因 SAK的 N末端在体内迅 速降解， 融合蛋白尚未起到双功能作用就发生了降解。 因此， 开发 能同时具有溶栓和抗凝活性的融合蛋白对于血栓治疗具有重要意 义。 发明目的
本发明的目的在于开发并提供一种能同时具有溶栓和抗凝功能 的融合蛋白。 发明内容
本发明现已发现 , 通过用含有能被凝血因子识别序列的连接肽 可有效的将溶栓蛋白和抗凝血蛋白连接起来而成的融合蛋白， 该融 合蛋白具有如下的特征： 融合蛋白保持溶栓蛋白的活化纤溶酶原活 性而保留溶栓功能； 抗凝血蛋白如水蛭素的 N末端与溶栓蛋白的 C 末端相连时， 完整的融合蛋白在体外和血液系统非血栓部位没有抗 凝活性， 从而避免或減小了因抗凝血蛋白如水蛭素引起的系统出血 的副作用； 利用抗凝血蛋白如水蛭素的 C末端与凝血酶的强亲和力 赋予融合蛋白靶向性， 从而提高药物蛋白在血栓部位的局部浓度、 降低临床用药量； 融合蛋白随血液循环到达血栓部位后， 血栓部位
特有的、 参与血栓形成的凝血因子可迅速在设计的识别位点降解融 合蛋白， 锋放出游离的溶栓蛋白和抗凝蛋白， 获得完整的抗凝和溶 栓两种活性。 本发明基于上述特征的发现现已完成。
因此， 本发明第一方面涉及含有溶解血栓蛋白， 抗凝血蛋白及 连接肽的融合蛋白。
本发明再一方面涉及制备含溶解血栓蛋白和抗凝血蛋白的融合 蛋白的方法，其包括将溶解血栓蛋白基因与抗凝蛋白基因用含 IEGR 或 GPR序列对应碱基连接成融合蛋白基因，然后融合蛋白基因在大 肠杵菌， 酵母或动物细胞体系中表达而得到融合蛋白。
本发明再一方面涉及含有融合蛋白及药用载体或赋形剂的药物 組合物。
本发明再一方面涉及含有凝血因子识别序列的连接肽在制备含 有溶解血栓和抗凝血蛋白的融合蛋白中的用途。
本发明再一方面涉及能被凝血因子识别并裂解序列的连接肽作 为溶解血栓和抗凝血蛋白的连接剂。
本发明再一方面涉及治疗与血栓形成有关的疾病与症状的方 法， 其包括给予血栓患者治疗有效量的融合蛋白。 附图说明
结合附图举例进一步说明本发明， 不构成对本发明的限制。
图 1 融合蛋白的连接示意图。
图 2 融合蛋白基因、 葡激酶 (SAK)基因、 水蛭素（HV2 )基因 的电泳图。
根据本发明， 术语 "溶栓蛋白" 是指可促使血栓溶解的蛋白， 如葡激酶（SAK )， 组织型纤溶酶原激活剂 （t-PA )、 链激酶（SK)、 尿激酶（UK)、 尿激酶样纤溶酶原激活剂（u-PA )、 蛇毒等具有活化 其它溶血因子或直接具有溶栓作用的蛋白， 或它们的突变体。 优选 葡激酶（SAK )或其突变体。
根据本发明， 术语 "抗凝蛋白" 或 "抗凝血蛋白" 是指能够抗 凝血的蛋白， 如水蛭素、 抗凝血酶 III、 蛇毒等， 或它们的突变体。 优选水蛭素或其突变体。
根据本发明， 术语 "凝血因子识别序列的连接肽" 是指氨基酸 四肽序列 IEGR ( IleGluGlyArg )或含有 IEGR的肽段， 或氨基酸 三肽序列 GPR ( GlyProAr )或含有 GPR的肽段。
根据本发明， 术语 "与血栓形成有关的疾病与症状" 是指由血 栓引起的任何疾病或症状， 如脑血栓、 动脉血栓、 中风、 动脉粥样 硬化等。
根据本发明， 术语 "患者" 是指哺乳动物， 尤其是人。
根据本发明， 本发明的融合蛋白优选为葡激酶与水蛭素通过连 接肽 GSIEGR连接而成的融合蛋白 SFH ( SAK-GSIEGR-HV2 ), 织 型纤溶酶原激活剂 （t - PA )与水蛭素通过连接肽 PRIEGR连接而 成的融合蛋白 （ tPA-PRIEGR-HV2 )或葡激酶与水蛭素通过连接肽 GSGPR连接而成的融合蛋白 （ SAK - GSGPR - HV2 )。
根据本发明， 本发明的融合蛋白可在大肠杆菌、 毕赤酵母、 酿 酒酵母或动物细胞中表达， 优选在大肠杆菌或酵母中表达。
下面的实施例用来进一步说明本发明， 但并不意味着对发明的 任何限制。 实施例 1 SAK-GSIEGR-HV2融合蛋白 （SFH ) 的制备及其溶栓 和抗凝活性
在 SAK基因两端分别加上 EcoR I和 BamH I酶切位点， 构建 不带终止密码子的葡激酶 SAK基因到载体 pB V220, 得 pBVSAK; 用 PCR方法在水蛭素基因前加上 BamH I晦切位点和 FXa识别氨 基酸序列 （ GSIEGR) 的编码碱基， BamH I酶切位点和 FXa识别 氨基酸序列 （GSIEGR ) 的编码碱基的加入方法采用引物合成方法 合成到水蛭素基因上游 5，端之前， 合成的引物为 5，-CG GGA TCC
ATC GAA GGT CGT ATT ACT TAC ACT GAT TGT ACA GAA TCG-3', 水蛭素下游引物合成带有 Pst I酶切位点； 用 BamH I和 Pst I双酶切带 FXa识别序列的水蛭素基因， 同时 BamH I和 Pst I 双酶切上述 pBVSAK 载体， 将酶切回收水蛭素基因片段连接到 pBVSAK载体， 得 pBVSFH质粒， 连接示意见图 1。 也可以是拼接 重叠 PCR方法连接上述两个基因片段。 将 pBVSFH质粒转化到大 肠杆菌， 42°C温度诱导表达。经离子交换、凝胶过滤得到纯度为 96% 以上的目的融合蛋白 （SFH ), 融合蛋白含 SAK氨基酸序列、 FXa 识别序列 GSIEGR、水蛭素氨基酸序列三个功能区。融合蛋白（ SFH ) 的氛基酸序列为
1 sssfdkgkyk kgddasyfep tgpylmvnvt gvdgkgnell sphyvefpik 61 pgttltkeki eyyvewalda taykefrvve ldpsakievt yydknkkkee
101 sfpitekg fvvpdlsehi knpgfnlitk viiekkgsie gritvtdcte sgqdlclceg 161 snvcgkgnkc ilgsngeenq cvtgegtpkp qshndgdfee ipeeylq 纯化的融合蛋白以发色底物（S-2251 ) 法测定融合蛋白的溶栓 活性， 通过卡拉胶豫导的小鼠尾部栓塞模型， 融合蛋白 SFH较 SAK 具有显著的抗凝活性。 具体讲， 卡拉胶诱导 24小时， 每 8小时腹部 给药 SAK为 1.2mg/kg，尾部血栓抑制率为 36.6%, 等摩尔数给药融 合蛋白 SFH为 1.8mg/kg, 尾部血栓抑制率为 100%。 诱导 36小时 后， 上述同样给药剂量和方式， SAK和 SFH对尾部血栓的抑制率分 别为 18.2%和 90%。 进一步具体结果见表 1至表 3。 发色底物（S - 2251 ) 法测定融合蛋白 （SFH )和游离葡激酶（SAK)
的溶栓活性（ n = 3， Δ OD40s )
反应时间 SAK SFH
5min 0.357 ¾.22 0.394 ¾.01
注： 融合蛋白和游离葡激酶均为 2nM。
表 2 FXa活化融合蛋白 （ SFH ) 的抗凝活性
无 FXa因子作用 0
0.2U的 FXa活化 10分钟 2560ATU
注： 5.8 y g融合蛋白 SFH， 0.2U的 FXa, 37。C作用 lOmin, 活性测定采用凝块法。
表 3 融合蛋白 （SFH )和游离葡激酶 ( SAK )在体内的抗凝活性（n = 10 ) 每組动物数
卡拉胶诱导时间 SAK SFH
(只）
24小时 10 36.6% 100%
36小时 10 18.2% 90% 注： 每 8小时腹部给药 SAK为 1.2mg/kg， 等摩尔数给药融合蛋白 SFH为 1.8mg/kg, 实验动物为昆明小鼠（抗凝活性以药物对卡拉胶诱导的小鼠尾部栓塞的抑制率表示）。 表 1表明融合蛋白 (SFH)与游离的葡激酶（ SAK )具有等同的溶 栓活性；表 2表明 采用凝块法测定抗凝活性，完整的融合蛋白（ SFH ) 没有抗凝活性， 而在凝血因子 FXa作用下， 通过释放出水蛭素而表 现出全部的抗凝活性 (表 2 ); 表 3证明融合蛋白 SFH具有显著的 抗凝活性。 因此， 本发明的融合蛋白具有确切的抗凝和溶栓的双功 能活，生。 实施例 2 tPA-PRIEGR-HV2融合蛋白的制备
在 tPA基因上下游分别加上 Xho I和 Avr II酶切位点， 构建不 带终止密码子的 tPA基因到 pPIC9载体； 用 PCR方法在水蛭素基 因上游加上 Avr II酶切位点和 FXa识别氨基酸序列的编码碱基, Avr II酶切位点和 FXa识别氨基酸序列的编码碱基的加入方法采用引物 合成方法合成到水蛭素基因上游 5，端之前， 水蛭素下游引物合成带 有 Not I酶切位点； 用 Avr II和 Not I双酶切带 FXa识别序列的的
水蛭素基因并连接到上述构建的带 tPA基因的 pPIC9载体的 tPA下 游， 构成融合基因 PAFH, 得质粒 pPAFEL 用 BamH I和 Sal I双酶 切 pPAFH和 pPIC9K质粒， 将 PAFH基因构建到 pPIC9K, 得 ρΡΑΙΉ-Κ基因。 线性化 pPAFH-K质粒， 电转化并重组到酵母基因 组， 甲醇诱导表达。 融合目的蛋白含 tPA氨基酸序列、 FXa识别序 列、 水蛭素氨基酸序列 个功能区。 实施例 3 SAK-GSLGPR-HV2 融合蛋白 （STH ) 的制备及其溶栓 和抗凝活性
在 SAK基因两端分别加上 EcoR I和 BamH I酶切位点， 构建 不带终止密码子的葡激酶 SAK基因到载体 pBV220, 得 pBVSAK; 用 PCR 方法在水蛭素基因前加上 BamH I 酶切位点和凝血酶 ( FXIIa )识别氨基酸序列的编码碱基， BamH I酶切位点和凝血酶 ( FXIIa )识别氨基酸序列（ GSLGPR)的编码碱基的加入方法采用 引物合成方法合成到水蛭素基因上游 5，端之前， 水蛭素下游引物合 成带有 Pst I酶切位点；用 BamH I和 Pst I双酶切带凝血酶（ FXIIa ) 识别序列的水蛭素基因，同时 BamH I和 Pst I双酶切上述 pBVSAK 载体， 将酶切回收水蛭素基因片段连接到 pBVSAK 载体， 得 pBVSTH质粒， 酶切鉴定。 也可以是拼接重叠 PCR方法连接上述两 个基因片段。将 pBVSTH质粒转化到大肠杆菌， 42 °C温度豫导表达。 经离子交换、凝胶过滤得到纯度为 96%以上的目的融合蛋白（ STH ), 融合蛋白含 SAK氨基酸序列、 凝血酶（FXIIa )识别序列、 水蛭素 氨基酸序列三个功能区。
Claims (13)
- 权 利 要 求1. 融合蛋白， 其含有溶解血栓蛋白， 抗凝血蛋白及连接肽。
- 2. 权利要求 1的融合蛋白，其中溶解血栓蛋白选自葡激酶（SAK), 组织型纤溶酶原激活剂 （t-PA )、 链激酶（SK)、 尿激酶（UK：)、 尿 激酶样纤溶酶原激活剂（u-PA )、 蛇毒等具有活化其它溶血因子或直 接具有溶栓作用的蛋白， 或它们的突变体。
- 3. 权利要求 2的融合蛋白， 其中溶解血栓蛋白为 SAK或其突变 体。
- 4. 权利要求 1的融合蛋白， 其中抗凝血蛋白选自水蛭素、 抗凝血 酶 III、 蛇毒等， 或它们的突变体。
- 5. 权利要求 4的融合蛋白，其中抗凝血蛋白为水蛭素或其突变体。
- 6. 权利要求 1的融合蛋白， 其中连接肽为能被凝血因子识别的氨 基酸序列， 或含有能被凝血因子识别序列的氨基酸序列。7- 权利要求 6的融合蛋白， 其中连接肽为能被凝血因子 FXa识 别的氨基酸序列 IEGR或含有它的肽段。
- 8. 权利要求 6的融合蛋白， 其中连接肽为能被凝血因子 Mia (凝 血酶）识别的氨基酸序列 GPR ( GlyProArg )或含有它的肽段。
- 9. 权利要求 1 的融合蛋白， 其为葡激酶与水蛭素通过连接肽 GSIEGR连接而成的融合蛋白（ SAR - GSIEGR - HV2 ), 组织型纤 溶酶原激活剂 （t - PA )与水蛭素通过连接肽 PRIEGR连接而成的 融合蛋白 （ tPA-PRIEGR-HV2 ) 或葡激酶与水蛭素通过连接肽 GSGPR连接而成的融合蛋白 （ SAK - GSGPR - HV2 )。10- 权利要求 1 的融合蛋白， 其为葡激酶与水蛭素通过连接肽 GSIEGR连接而成的融合蛋白 （ SAR - GSIEGR - HV2, 或 SFH )。
- 11. 制备含溶解血栓蛋白和抗凝血蛋白的融合蛋白的方法， 其包括 将溶解血栓蛋白基因与抗凝蛋白基因用含 IEGR或 GPR序列对应碱 基连接成融合蛋白基因， 然后融合蛋白基因在大肠杆菌， 酵母或动 物细胞体系中表达而得到融合蛋白。
- 12. 含有融合蛋白及药用载体或赋形剂的药物组合物。
- 13. 能被凝血因子识别序列的连接肽在制备含有溶解血栓和抗凝血 蛋白的融合蛋白中的用途。
- 14. 能被凝血因子识别并裂解序列的连接肽作为溶解血栓和抗凝血 蛋白的连接剂。
- 15. 治疗与血栓形成有关的疾病与症状的方法， 其包括给予血栓患 者治疗有效剂量的融合蛋白。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: WUHAN OPTICAL VALLEY RENFU BIOPHARMACEUTICAL CO., Free format text: FORMER OWNER: BEIJING HAITAI LIANHE PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY DEVELOPMENT CO., LTD. Effective date: 20120816 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| C56 | Change in the name or address of the patentee |
Owner name: EMISSION AND RADIATION MEDICAL RESEARCH INSTITUTE Free format text: FORMER NAME: RADIATION MEDICINE INST., MILITARY MEDICINE ACADEMY, P.L.A. |
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Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: HAIDIAN, BEIJING TO: 100850 HAIDIAN, BEIJING |
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Address after: Taiping Road, Beijing, China No. 27 Patentee after: INSTITUTE OF RADIATION MEDICINE, ACADEMY OF MILITARY MEDICAL SCIENCES, PLA Patentee after: Beijing Haitai Joint Medical Technology Development Co.,Ltd. Address before: Taiping Road, Beijing, China No. 27 Patentee before: Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Military Medical Sciences Patentee before: Beijing Lu Yin Li Hua Pharmaceutical Science Technology Development Co.,Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20120816 Address after: 100850 No. 27 Taiping Road, Beijing Patentee after: INSTITUTE OF RADIATION MEDICINE, ACADEMY OF MILITARY MEDICAL SCIENCES, PLA Patentee after: WUHAN OPTICS VALLEY HUMANWELL BIO-PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Address before: Taiping Road, Beijing, China No. 27 Patentee before: INSTITUTE OF RADIATION MEDICINE, ACADEMY OF MILITARY MEDICAL SCIENCES, PLA Patentee before: Beijing Haitai Joint Medical Technology Development Co.,Ltd. |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20070221 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |