CN113150168A - 一种qk纤溶酶基因-水蛭素融合蛋白的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种QK纤溶酶基因‑水蛭素基因融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：以QK纤溶酶的基因序列、水蛭素的基因序列为模板，经过扩增拼接取得融合基因序列，构建重组表达质粒，将重组表达质粒转回到感受态细胞中，筛选出高效表达蛋白菌株，扩大培养细胞和诱导表达融合蛋白，得到QK纤溶酶基因‑水蛭素融合蛋白。本发明的QK纤溶酶‑水蛭素融合蛋白既保留了QK纤溶酶的靶向溶栓功效，又能发挥水蛭素的抗凝作用；不但抑制蛋白水解酶的降解，而且增大蛋白分子量，降低肾小球通过率，使得药物半衰期得以延长，在临床上就可以降低使用剂量或减少注射频率。

Description

一种QK纤溶酶基因-水蛭素融合蛋白的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及血栓治疗领域。更具体地说，本发明涉及一种QK纤溶酶基因-水蛭素融合蛋白。
背景技术
心脑血管系统疾病已经成为威胁人类健康的重要杀手，其中急性心肌梗塞位于西方发达国家死亡疾病之首，血栓形成是该类疾病的一个重要诱因，溶栓疗法是其治疗的最主要手段，在溶栓治疗过程中，为防止溶栓后再栓塞的发生。溶栓和抗凝药物联合应用是临床上治疗血栓相关性疾病的重要给药方案，而出血倾向是血栓治疗的主要副作用。
发明内容
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种QK纤溶酶基因-水蛭素基因融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：以QK纤溶酶的基因序列、水蛭素的基因序列为模板，经过扩增拼接取得融合基因序列，构建重组表达质粒，将重组表达质粒转回到感受态细胞中，筛选出高效表达蛋白菌株，扩大培养细胞和诱导表达融合蛋白，得到QK纤溶酶基因-水蛭素融合蛋白。
根据本发明的一个优选实施例，所述的QK纤溶酶基因-水蛭素基因融合蛋白的制备方法中，以QK纤溶酶的基因序列、水蛭素的基因序列为模板，经过扩增拼接取得融合基因序列，包括以下步骤：
将QK纤溶酶的基因序列和水蛭素的基因序列分别进行扩增，得到两个扩增片段，分别进行Kpn I酶切处理，得两个酶切产物，再利用连接酶对两个酶切产物进行融合处理，得到融合基因序列。
根据本发明的一个优选实施例，所述的QK纤溶酶基因-水蛭素基因融合蛋白的制备方法中，将QK纤溶酶的基因序列和水蛭素的基因序列分别进行扩增，包括以下步骤：
QK纤溶酶的基因序列含有调控序列、信号肽序列、前肽序列、成熟肽序列以及终止序列；
扩增QK纤溶酶的的基因序列中的调控序列、信号肽序列、前肽序列及成熟肽序列，除去终止序列、在3′端引入kpnI酶切识别位点，5′端引入BanH I酶切位点。
根据本发明的一个优选实施例，所述的QK纤溶酶基因-水蛭素基因融合蛋白的制备方法中，以QK纤溶酶的基因序列、水蛭素的基因序列为模板，经过扩增拼接取得融合基因序列，包括以下步骤：
在5′端引入Kpn I酶切位点以及起始密码ATG，3′端为TAG、TAA两个终止密码及EcoR I酶切位点。
根据本发明的一个优选实施例，所述的QK纤溶酶基因-水蛭素基因融合蛋白的制备方法中，构建重组表达质粒，包括以下步骤：
对融合基因序列进行PCR扩增，得到融合基因片段；
将融合基因片段用BanH I、EcoR I进行双酶切，作为供体；
枯草杆菌质粒用BamH I、EcoR I进行双酶切，电泳，回收大片段作为载体；
所述供体、所述载体通过T4连接酶连接，得到融合基因片段在枯草杆菌中的重组表达质粒。
根据本发明的一个优选实施例，所述的QK纤溶酶基因-水蛭素基因融合蛋白的制备方法中，将重组表达质粒转回到感受态细胞中，筛选出高效表达蛋白菌株，包括以下步骤：
将重组表达质粒加到感受态细胞中，冰浴20-50min，42℃水浴热激80-100s，加培养基培养，离心，取菌体涂布平板，挑取单菌落，接种至摇瓶进行培养，得发酵液；
对发酵液进行离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳，并测定发酵液的纤溶酶酶活和抗凝性，筛选出高效表达蛋白菌株。
本发明的一个优选实施例还提供了QK纤溶酶基因-水蛭素融合蛋白在制备溶栓药物中的应用。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明将QK纤溶酶的基因片段和水蛭素的基因片段进行融合，得到融合基因，将融合基因和枯草杆菌质粒进行双酶切，用连接酶进行连接，得到含融合基因的重组质粒。将重组质粒加入枯草杆菌感受态细胞，进行转化，挑取单菌落进行筛选鉴定，将筛选鉴定后的菌株进行发酵表达，得到溶栓抗凝双功能的融合蛋白。
本发明的QK纤溶酶-水蛭素融合蛋白既保留了QK纤溶酶的靶向溶栓功效，又能发挥水蛭素的抗凝作用；不但抑制蛋白水解酶的降解，而且增大蛋白分子量，降低肾小球通过率，使得药物半衰期得以延长，在临床上就可以降低使用剂量或减少注射频率。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明中实施例2中QK纤溶酶、水蛭素以及QK纤溶酶-水蛭素融合蛋白的纤溶效果示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变形。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。
实施例1
1、QK纤溶酶基因的扩增
QK纤溶酶基因包括调控序列(1473bp)、结合位点序列(SD序列)、起始密码子(CTG)、信号肽(29个氨基酸组成)、77个氨基酸组成的前肽---275个氨基酸组成的成熟肽---3个连续的终止密码子(TAA、TAG、TAA)。
扩增QK纤溶酶的调控序列、信号肽(SP)、前肽(Pro)及成熟肽，除去终止序列、在3′端引入kpnI酶切识别位点，5′端引入BanH I酶切位点。
2、水蛭素(Hir)基因的扩增
Hir基因全长228bp,分成六个片段(十二条寡核苷酸链)。
扩增Hir带终止子的结构基因片段，在5′端引入Kpn I酶切位点以及起始密码ATG，3′端为TAG、TAA两个终止密码及EcoR I酶切位点。
3、融合基因片段的获取
将前面步骤1和步骤2得到的两个扩增片段，用Kpn I酶切，将酶切产物用T4连接酶进行连接反应，得到完整的QK-Hir融合基因片段。
4、融合基因片段的扩增
以步骤3得到的产物为模板进行PCR扩增，得到大量融合基因片段。
5、连接载体
将PCR得到的融合基因片段用BanH I、EcoR I进行双酶切，作为供体；
枯草杆菌质粒pWB980用BamH I、EcoR I进行双酶切，电泳，回收大片段作为载体；供体、载体通过T4连接酶连接得到QK-Hir融合基因在枯草杆菌中的重组表达质粒pWB980。
6、枯草杆菌感受态细胞的制备
使用CaCl2处理法，制备枯草杆菌感受态细胞。
7、连接产物的转化
将加入步骤5中得到的重组表达质粒加到3.6得到的感受态细胞中，冰浴30min后，42℃水浴热激90s，加LB培养基培养5h，离心，取菌体涂布LB平板，挑取单菌落，接种至摇瓶进行培养，得摇瓶发酵液。
8、表达产物的鉴定
将摇瓶发酵液进行离心，取上清液测定发酵液的纤溶酶酶活(纤维蛋白平板法)和抗凝性。
实施例2
(1)抗凝效果
取2mL离心管，每管分别加入0.1mL浓度为20mM的QK、Hir、QK-Hir。分别依次向各管加入0.9mL的SD大鼠新鲜血液并混匀，随即观察各管血液凝固情况记录凝固时间。结果显示QK纤溶酶-水蛭素融合蛋白(QK-Hir)抗凝效果显著优于单独的QK纤溶酶(QK)和水蛭素(Hir)。
表1 QK纤溶酶、水蛭素以及QK纤溶酶-水蛭素融合蛋白的抗凝效果数据
蛋白酶(20mM) 凝固时间(Min)
QK 1.7
Hir 2.3
QK-Hir 3.1
(2)纤溶效果
用无抗凝剂的真空采血管取2mL大鼠新鲜血液，室温下自然凝固2h后取出凝血块，用生理盐水清洗后置于4℃保存备用。取孔板，分别加入1mL 20mM的QK、Hir、QK-Hir。分别依次向各管加入制备好的SD大鼠血凝块，在放入前称取各血凝块重量，随后放入37℃气浴恒温摇床上，180rpm,每隔1h观察各管血凝块溶解情况。如图1所示，结果显示融合蛋白QK-Hir的纤溶效果优于单独的Hir和QK。
水蛭素的基因序列如下：
>MH672572.1Macrobdella decora hirudin mRNA,complete cds
ATGTTCTCTACCAAGGTCCTTGTTTTTGCTGCCCTGTGCATTTGCTTGACCCATGCAATGACCTATAAGGATTGCACAGCCGATACCACGACTGGATGCTTATGCGGGGGGCATCTCTGCACTGGAGCCTGTGCAAATGACAAGTGCAACAAAAATGATAGGGGAACCTACGTCAAACAGACCGTCGACGACGTCTTTGAAAGTTTTTCATTGGATGGGGAGAATTAA
QK纤溶酶由枯草杆菌Bacillus subtilis QK02菌种发酵制得，该菌种己由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，位于湖北武汉，其保藏编号为CCTCC NO:M 203078，保藏日期为2003年11月17日。
QK纤溶酶的基因序列如下：
>AJ579472.2Bacillus subtilis qk gene for subtilisin
GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTAACGTTAATCTTTACGATGGCGTTCAGCAACATGTCTGCGCAGGCTGCCGGAAAAAGCAGTACAGAAAAGAAATACATTGTTGGATTTAAACAGACAATGAGTGCCATGAGTTCCGCCAAGAAAAAGGATGTTATTTCTGAAAAAGGCGGAAAGGTTCAAAAGCAGTTTAAGTATGTTAACGCAGCCGCAGCAACATTGGATGAAAAAGCTGTAAAAGAATTGAAACAAGATCCGAGCGTTGCATATGTGGAAGAAGATCATATTGCACATGAATATGCGCAATCTGTTCCTTACGGCATTTCTCAAATTAAAGCGCCGGCTCTTCACTCTCAAGCTACACAGGCTCTAACGTAAAAGTAGCTGTTATCGACAGCGGAATTGACTCTTCTCATCCTGACTTAAACGTCAGAGGCGGAGCAAGCTTCGTACCTTCTGAAACAAACCCATACCAGGGACGCAGTTCTCACGGCACACACGTAGCCGGTACGATTTCCGCTTTTAATAACTCAATCGGTGTTCTGGGCGTAGCGCCAAACGCATCGTTATATGCAGTAAAAGTTCTTGACTCAACAGGAAGCGGCCAATACAGCTGGATTATTAACGGCATTGAGTGGGCTATTTCCAACAATATGGATGTTATCAACATGAGCCTTGGCGGACCTTCTGGATCTACAGCTCTGAAAACAGTCGTTGATAAAGCAGTTTCCAGCGGTATCGTCGTTGCTGCCGCTGCCGGAAACGAAGGTTCATCGGGCAGCACAAGCACAGTCGGCTACCCTGCAAAATATCCTTCTACCATTGCGGTAGGTGCGGTAAACAGCAGCACCCAAAGAGCTTCATTCTCAAGCGCAGGTTCTGAGCTTGATGTAATGGCTCCTGGCGTGTCCATCCAAAGCACACTTCCTGGAGGCACTTACGGTGCTTACAACGGAACGTCAATGGCGACTCCTCACGTTGCCGGAGCAGCAGCGCTAATTCTTTCTAAGCATCCGACTTGGACAAACGCGCAAGTCCGTGATCGTTTAGAAAGCACTGCAACATATCTTGGAAACTCTTTCTACTATGGAAAAGGGTTAATCAACGTACAAGCAGCTGCACAATAATAG
QK纤溶酶-水蛭素融合基因序列如下
Figure BDA0002922501840000071
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (7)

1.一种QK纤溶酶基因-水蛭素基因融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以QK纤溶酶的基因序列、水蛭素的基因序列为模板，经过扩增拼接取得融合基因序列，构建重组表达质粒，将重组表达质粒转回到感受态细胞中，筛选出高效表达蛋白菌株，扩大培养细胞和诱导表达融合蛋白，得到QK纤溶酶基因-水蛭素融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的QK纤溶酶基因-水蛭素基因融合蛋白的制备方法，其特征在于，以QK纤溶酶的基因序列、水蛭素的基因序列为模板，经过扩增拼接取得融合基因序列，包括以下步骤：
将QK纤溶酶的基因序列和水蛭素的基因序列分别进行扩增，得到两个扩增片段，分别进行Kpn I酶切处理，得两个酶切产物，再利用连接酶对两个酶切产物进行融合处理，得到融合基因序列。
3.根据权利要求2所述的QK纤溶酶基因-水蛭素基因融合蛋白的制备方法，其特征在于，将QK纤溶酶的基因序列和水蛭素的基因序列分别进行扩增，包括以下步骤：
QK纤溶酶的基因序列含有调控序列、信号肽序列、前肽序列、成熟肽序列以及终止序列；
扩增QK纤溶酶的基因序列中的调控序列、信号肽序列、前肽序列及成熟肽序列，除去终止序列、在3′端引入kpnI酶切识别位点，5′端引入BanH I酶切位点。
4.根据权利要求2所述的QK纤溶酶基因-水蛭素基因融合蛋白的制备方法，其特征在于，以QK纤溶酶的基因序列、水蛭素的基因序列为模板，经过扩增拼接取得融合基因序列，包括以下步骤：
在5′端引入Kpn I酶切位点以及起始密码ATG，3′端为TAG、TAA两个终止密码及EcoR I酶切位点。
5.根据权利要求1所述的QK纤溶酶基因-水蛭素基因融合蛋白的制备方法，其特征在于，构建重组表达质粒，包括以下步骤：
对融合基因序列进行PCR扩增，得到融合基因片段；
将融合基因片段用BanH I、EcoR I进行双酶切，作为供体；
枯草杆菌质粒用BamH I、EcoR I进行双酶切，电泳，回收大片段作为载体；
所述供体、所述载体通过T4连接酶连接，得到融合基因片段在枯草杆菌中的重组表达质粒。
6.根据权利要求1所述的QK纤溶酶基因-水蛭素融合蛋白的制备方法，其特征在于，将重组表达质粒转回到感受态细胞中，筛选出高效表达蛋白菌株，包括以下步骤：
将重组表达质粒加到感受态细胞中，冰浴20-50min，42℃水浴热激80-100s，加培养基培养，离心，取菌体涂布平板，挑取单菌落，接种至摇瓶进行培养，得发酵液；
对发酵液进行离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳，并测定发酵液的纤溶酶酶活和抗凝性，筛选出高效表达蛋白菌株。
7.一种如权利要求1-6制备得到的任一所述的QK纤溶酶基因-水蛭素融合蛋白在制备溶栓药物中的应用。
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