FR2490239A1 - Molecule d'acide desoxyribonucleique comprenant une sequence de nucleotides correspondant a des proteines du virus de la fievre aphteuse, son procede d'obtention et vaccin obtenu - Google Patents
Molecule d'acide desoxyribonucleique comprenant une sequence de nucleotides correspondant a des proteines du virus de la fievre aphteuse, son procede d'obtention et vaccin obtenu Download PDFInfo
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Abstract
MOLECULE D'ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE COMPRENANT UNE SEQUENCE DE NUCLEOTIDES CORRESPONDANT A DES PROTEINES DU VIRUS DE LA FIEVRE APHTEUSE, SON PROCEDE D'OBTENTION ET VACCIN OBTENU. LA MOLECULE COMPORTE UNE SEQUENCE CORRESPONDANT A TOUT OU PARTIE DE L'ACIDE RIBONUCLEIQUE DU VIRUS DE LA FIEVRE APHTEUSE ET CODANT NOTAMMENT POUR L'OBTENTION D'AU MOINS UNE PROTEINE DE CE VIRUS. LA MOLECULE PEUT ETRE INSEREE DANS UN VECTEUR DE CLONAGE CAPABLE D'EXPRIMER LA MOLECULE D'ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE, APRES TRANSFORMATION, PAR CE VECTEUR OU SUPPORT, D'UNE CELLULE HOTE CONVENABLE. LE PRODUIT D'EXPRESSION PEUT ETRE INCORPORE A UN VACCIN DESTINE A STIMULER LA PRODUCTION D'ANTICORPS CONTRE CE VIRUS. ON DECRIT EGALEMENT L'ETABLISSEMENT D'UNE CARTE DE CES PROTEINES. APPLICATION EN MEDECINE VETERINAIRE.
Description
La présente invention concerne des molécules d'acide désoxyribonucléique
(ADN) comprenant des séquences
de polynucléotides artificiellement construites et corres-
pondant essentiellement à la totalité ou à une partie de l'acide ribonucléique (ARN) du virus de la fièvre aphteuse (VFA), et, en particulier, l'invention concerne des séquences de polynucléotides codant pour la production d'au-moins une protéine. Elle concerne particulièrement
des molécules d'ADN comprenant des séquences de poly-
nucléotides artificiellement construites codant pour
l'obtention de la totalité ou d'une partie d'une ou plu-
sieurs protéines apparaissant dans le virus de la fièvre
aphteuse, ou son précurseur ou une de ses modifications.
De telles molécules de ADN sont capables d'être exprimées
sous forme d'un ou plusieurs polypeptides.
La fièvre aphteuse (FA) est l'une des maladies
les plus virulentes et contagieuses des animaux de ferme.
La maladie est endémique dans plusieurs zones du globe et peut être rencontrée dans de nombreux pays d'Afrique, d'Asie et d'Amérique du Sud, o elle est maîtrisée à divers -degrés par des programmes d'immunisation. Les pays dans lesquels la maladie ne sévit pas,ne restent à l'abri que par de stricts contrôles des importations et par des quarantaines, ainsi que par l'application de l'abattage
lorsque de premières manifestations apparaissent.
Le virus de la fièvre aphteuse est un virus à acide ribonucléique (ARN) classé comme membre du genre
Anthovirus de la famille des Picornaviridae (voir P.D.
Cooper et collaborateurs, Intervirology, 10, 165-180,
1978). Il existe sept sérotypes connus. de VFA, les séro-
types européens A, O et C, les sérotypes des territoires de l'Afrique du Sud SAT 1, SAT 2 et SAT 3, et le sérotype
d'Asie 1. On admet dans chacun de ces sérotypes, l'exis-
tence d'un certain nombre de sous-types distincts du point de vue antigènes et lorsque les sous-types sont ainsi distincts, il faut des vaccins.correspondant à des sous-types immunologiquement spécifiques. Pour chaque sérotype ou sous- type, il existe plusieurs variantes
distinctes du point de vue génétique.
Le virus de la fièvre aphteuse comprend un seul brin d'ARN et quatre polypeptides principaux, à savoir VP1, VP2, VP3 et VP4, qui forment les protéines de la capside ou coque du virus. A la protéine désignée ici par VP1, d'autres personnes travaillant dans ce domaine donnent
diverses désignations comme VP3, VPTHr et VPT (voir H.L.
Bachrach et coll., J. Immunology, 115, 1636-1641, 1975; K. Strohmaier et coll., Biochem. Biophys. Res. Comm., 85, 1640-1645, 1978; H.L. Bachrach et coll., Intervirology, 12, 65-72, 1979). Chacun des polypeptides VP1, VP2 et VP3 possède un poids moléculaire d'environ 26 000, cependant que VP4 a un poids moléculaire d'environ 8 000, et l'on considère généralement qu'il existe environ 60 exemplaires de
chacun de ces polypeptides dans le virus. Les autres poly-
peptides provenant de i'ARN du virus ont probablement
un rôle dans la réplication du virus.
Le brin unique de 1'ARN du virus de la fièvre aphteuse possède un poids moléculaire d'environ 2,6 x 106, ce qui équivaut à environ 8000 nucléotides, et il possède une polarité positive en jouant le rôle de matrice pour la translation dans des polypeptides et pour la synthèse de i'ARN. L'un des produits primaires de translation est une protéine appelée P88, qui est par la suite clivée pour
produire les quàtre protéines de capside VP1 à VP4.
La protéine de capside VP1, précitée, est susceptible de subir un clivage lorsqu'un virus intact est traité par de la trypsine, ce qui donne une grande diminution du pouvoir infectieux de la plupart des souches
de VFA (T.F. Wild et F. Brown, J. Gen. Virology, 1, 247-
250, 1967). Un traitement par la trypsine peut également diminuer la capacité du virus à stimuler la production d'un anticorps de neutralisation. Il apparaît ainsi que VP1 semble bien être l'immunogène primaire capable de susciter une protection efficace contre l'infection par le virus de la fièvre aphteuse et, en fait, VP1 séparé
des particules de virus produit de l'anticorps de neutra-
lisation et suscite une protection efficace contre le virus (J. Laporte et coll., C.R. Acad. Sc. Paris, t. 276 série D, 3399-3401, 1973; H.L. Bachrach et coll., J. Immunology, 115, 1636-1641, 1975). La séparation des protéines naturelles de capsides du virus de fièvre aphteuse, notamment VP1, afin d'obtenir un vaccin plus sûr,a nécessité l'utilisation de conditions fortement dénaturantes et elle est généralement considérée par les experts en ce domaine comme étant désavantageuses pour le maintien d'un caractère immunogène optimal et pour la
production d'un vaccin efficace.
En utilisant les techniques développées au cours des cinq dernières années, il est maintenant possible d'introduire l'acide désoxyribonucléique (ADN) codant pour l'obtention de protéines non bactériennes dans des cellules de bactéries en passant par l'intermédiaire d'un plasmide
ou d'un autre vecteur de clonage (voir, par exemple C.J.
Burrell et coll., Nature, 279, 43-47, 1979). En général, la construction des molécules d'ADN recombinant comporte les étapes consistant à obtenir du parent non bactérien la matrice de ADN codant pour l'obtention de la protéine voulue et à insérer ce morceau d'ADN hétérologue dans un vecteur de clonage, comme un plasmide bactérien, puis à transformer un hôte bactérien approprié à l'aide du plasriide modifié. Une étude générale de la manipulation des gênes conduisant à la formation d'ADN recombinant a été publiée par S. Cohen dans Scientific American, 233,
24-33, 1975.
Plisieurs gênes non/bactériens ont été insérés et ont multiplié dans des bactéries comme Escherichia coli, et plusieurs protéines non bactériennes ont été-exprimées par des bactéries en utilisant la technologie de l'ADN recombinant, y compris l'hémagglutinine des virus de l'influenza (A.G. Porter et coll., Nature, 282, 471-477, 1979) et la protéine du virus de l'hépatite B (C.J. Burrell
et coll., 1979, op. cit.). Malgré la quantité consi-
dérable de travail effectuée au cours des récentes années dans la recherche concernant l'ADN recombinant, on manque considérablement de résultats pouvant conduire à une application immédiate et pratique, notamment dans le domaine de l'ADN recombinant qui implique la manipulation
du matériel génétique des virus.
La présente invention représente le premier exposé sur la synthèse de polypeptides individuels qui équivalent sensiblement à des protéines naturelles de capsides de picornavirus, en particulier des protéines de capsides de virus de la fièvre aphteuse, et aussi pour la synthèse en série de plusieurs polypeptides de virus de fièvre aphteuse à titre d'entités individuelles ou de produits de fusion de parties de deux ou plusieurs protéines. En outre, la présente invention propose le moyen pour la synthèse simultanée des protéines immunogènes dont la production est normalement codée par différents variants du virus de la fièvre aphteuse, sans les nombreux
risques associés à la culture de ce virus de la fièvre aphteuse.
Selon un aspect de la présente invention, celle-
ci propose une molécule d'ADN comprenant une séquence de nucléotides correspondant sensiblement à la totalité ou à une partie de l'ARN du virus de la fièvre aphteuse ou à des fragments biologiquement fonctionnels de cet acide, comme
défini ci-après. De préférence, la séquence des nucléo-
tides code pour l'obtention d'au moins un polypeptide du virus-de la fièvre aphteuse. Une telle molécule d'ADN est capable d'être exprimée sous forme d'un polypeptide reconnaissable comme correspondant sensiblement à une protéine du virus de la fièvre aphteuse. De préférence, la séquence des nucléotides code pour l'obtention d'une protéine de la structure de ce virus de la fièvre aphteuse,
comme VP1 ou, en variante, elle peut coder pour l'obten-
tion de la totalité des protéines de structure ou de capside, permettant en même temps d'en effectuer la synthèse sous forme d'un précurseur, par exemple sous forme de P88 qui peut nécessiter une stabilisation par des inhibiteurs des enzymes comme des protéases qui la décomposent en ses protéines constituantes. En variante, la séquence des nucléotides peut coder pour l'obtention de VP1 voisin de la totalité ou d'une partie de l'une quelconque des protéines VP2, VP3 et VP4, et notamment la séquence code l'obtention de VP1 seul ou avec la totalité ou une partie de VP3. Dans une autre possibilité encore, la séquence des nucléotides peut coder pour l'obtention de la totalité ou d'une partie d'au'moins deux protéines du virus de la fièvre aphteuse, dont chacune provient d'un variant différent de virus de la fièvre aphteuse.
Selon un aspect préféré, la séquence des nucléo-
tides code pour l'obtention d'une protéine de sérotype A ou O du virus de la fièvre aphteuse, encore mieux du sérotype A10 et notamment du brin 61. En outre, la séquence des nucléotides peut comporter des séquences de contrôle placées à son voisinage, de telles séquences de contrôle provenant de l'acide nucléique du virus de la fièvre aphteuse,
ou provenant d'une source hétérologue.
Selon-un autre aspect de la présente invention,
celle-ci propose une molécule d'ADN recombinant compre-
nant un opéron comportant des séquences d'amorçage et des
séquences de terminaison, selon la définition donnée ci-
après, et une séquence de nucléotides codant essentielle-
ment pour l'obtention de la totalité ou d'une partie d'au.moins une protéine du virus de la fièvre aphteuse, la séquence des nucléotides étant placée entre les séquences d'amorçage et les séquences de terminaison de l'opéron. L'invention propose également un vecteur de clonage d'ADN recombinant, capable d'exprimer la totalité ou une partie d'une protéine du virus de la fièvre aphteuse, et qui comprend un opéron ayant des séquences d'amorçage et des séquences de terminaison, et une séquence de nucléotides codant essentiellement pour l'obtention de la totalité ou d'une partie d'au moins une portion du virus de la fièvre aphteuse, la séquence dès nucléotides étant placée entre les séquences d'amorçage et les séquences de
terminaison de l'opéron.
Selon un autre aspect de l'invention, celle-ci propose une cellule hôte contenant un vecteur de clonage de 1'ADN recombinant et/ou une molécule d'ADN recombinant,
comme définie ci-dessus.
L'invention englobe également un antigène destiné à stimuler la production des anticorps de lutte contre le
virus de la fièvre aphteuse chez un mammifère, cet anti-
gène comprenant au moins un polypeptide présentant un caractère d'immunogénicité, à l'égard du virus de la fièvre aphteuse et qui est préparé par l'expression d'une molécule d'ADN, comme définie ci-dessus et qui est produit par une cellule hâte transformée à l'aide d'un
vecteur de clonage d'ADN recombinant, comme défini ci-
dessus. L'invention présente en outre un procédé pour préparer une molécule d'ADN codant essentiellement pour l'obtention d'au moins un polypeptide du virus de la fièvre aphteuse, procédé selon lequel: (a) on isole de l'ARN à un seul brin du virus de la fièvre aphteuse; (b) on prépare un premier brin unique d'ADN complémentaire du brin unique d'ARN du virus de la fièvre aphteuse; (c) on prépare un second brin unique d9ADN complémentaire
du premier brin d'ADN et relié à lui par des liai-
sons hydrogène afin de produire un double brin d'ADN.
Le double brin d'ADN ainsi produit peut être inséré dans un vecteur de clonage après digestion du 3C vecteur de clonage par une endonucléase de restriction, les extrémités libres du vecteur de clonage étant reliées à la molécule d'ADN de façon à former un vecteur de clonage recombinant. Celui-ci peut être inséré,à son tour, dans une cellule hôte convenable, par exemple par une transformation. 1 Tels qu'on les utilise ici, les termes énumérés ci-après ont les significations suivantes: Nucléotide: unité d'ADN ou d'ARN comprenant un fragment sucre (pentose), un phosphate et une base hétérocyclique azotée. La base est reliée au fragment sucre par le carbone glycosidique (carbone 1' du pentose) et la base caractérise le nucléotide. Les quatre bases de l'ADN sont l'adénine (A), la guanine (G), la cytosine (C) et la thymine (T). Les quatre bases d'ARN sont A, G, C et
l'uracile MJ).
ADN recombinant: une séquence d'ADN hybride à double brin comprenant au moins deux séquences de nucléotide d.'ADN à double brin, la première séquence ne se trouvant pas dans la nature associée à la seconde
séquence.
Vecteur de clonage; ADN à double séquence non chromosomique capable de réplication, lorsqu'il est placé
dans un microorganisme uni-cellulaire.
Plasmide: vecteur de clonage provenant de
virus ou de bactéries.
Gène de structure: séquence de nucléotides d'ADN qui code pour l'obtention d'une séquence d'amino-acides
caractéristiques d'un polypeptide spécifique.
Séquences d'amorçage séquences de nucléotides d'ADN qui commandent ou contrôlent l'amorçage de la
transcription ou 'translation.
Séquences de terminaison: séquences de nucléotides
d'ADN auxquelles la transcription ou la translation cesse.
Transcription: Processus de production d'un
polypeptide à partir d'ARN messager.
Translation: Processus selon lequel de 1'ARN-
polymérase est obligé de se déplacer le long de la séquence
d'ADN en formant de l'ARN messager.
Opéron: un ou plusieurs gènes de structure codant pour l'expression de polypeptides, cet ensemble étant précédé par des séquences d'amorçage et suivi par
des séquences de terminaison.
Expression:'Processus impliqué dans la production
d'un polypeptide à partir d'un gène de structure.
Fragment biologiquement fonctionnel: molécule
d'ADN qui code pour l'obtention de déterminants anti-
géniques capables de provoquer une réponse d'immunité chez un mammifère ou qui code pour l'obtention d'une protéine
ou d'une partie de protéine nécessaire pour la confirma-
tion appropriée de déterminant antigénique, ou qui code pour l'obtention d'une protéine ou d'une partie de protéine qui est importante dans le cycle de la vie du virus de la
fièvre aphteuse, in vivo et/ou in vitro.
L'invention sera maintenant décrite par référence aux figures d'accompagnement dans lesquelles: la figurer est un schéma de la carte génétique de l'ARN du virus de la fièvre aphteuse et des protéines qui en proviennent; la figure 2 est un schéma des cartes physiques de trois plasmides recombinant, en comparaison de la carte génétique de l'ARN du virus dela fièvre aphteuse; la figure 3 est un schéma de la région des gènes de structure de lARN du virus de la fièvre aphteuse, et elle montre la partie, dans ce virus, du plasmide recombinant pFA61/t76 aligné avec la région du gène de structure de ce virus-; les figures 4 à 7 sont des schémas des séquences d'ADN et des acides aminés représentées par des lignes épaisses sur la figure 3; la figure 8 est un schéma comparant les séquences des acides aminés à terminaison azote de VP1 provenant de cinq souches de virus dela fièvre aphteuse; la figure 9 est un schéma d'une séquence de nucléotides à terminaison carbone de VP3 et d'une séquence de nucléotides à terminaison azote de VP1 dans le plasmide
recombinant pFA61/t76; -
la figure 10 est un schéma des séquences des nucléotides etacidesaminés à la jonction de la région codant pour l'obtention de VP2 et de VP3 dans le plasmide recombinant pFA61/t76, séquence qui part directement de la séquence représentée sur la figure 5; la figure 11 est un schéma de la région des gènes de structure de i'ARN de virus de la fièvre aphteuse, et elle montre la partie du plasmide recombinant pFO1BFS/ t251 de ce virus alignée avec la région du gène de structure de ce virus; la figure 12, ensemble des figures 12e à 12e, est un diagranre de la séuence de SD* et de la séquence des acides amJnés prévus -pouxr la région du gène de structure de virus de la fièvre aphteuse insérée dans le plasmide recombinant pFA A61/t76; la figure 13, ensemble des figures 13a A 13e, est un schna de la sécuence de ADN et de-la scuence des acides arinés prévus pour \VP, VP2, VP3 et VP1 insérés dans le plasmide recombinant pFA A61/t76; la figure 14 est un schéma de la construction du plasmide d'expression pXY1; - la figure 15 est un schéma de l'introduction d'une copie d'ADN à double brin de VFA dans le plasmide pXYl; la figure 16 illustre la construction de plasmides d'expression; la figure 17 illustre les produits protéiniques et les poids moléculaires des protéines produites par l'expression des plasmides représentés sur la figure 16;
la figure 18 illustre les séquences de nucléo-
tides terminés par du carbone et des acides aminés des protéines représentées sur la figure 17; la figure 19 est un schéma de la séquence des nucléotides de PFA61/t243 correspondant à l'extrémité 3' de l'ARN du virus de la fièvre aphteuse et comprenant au moins une partie de queue de poly A. En se référant à la figure 1, on voit que celle-ci montre une carte génétique simplifiée de l'ARN et des
protéines du virus de la fièvre aphteuse. Comme antérieure-
ment indiqué, cet ARN a une longueur d'environ 8000
nucléotides. La translation de l'ARN, s'effectue de l'extré-
mité 5' à 3'. Comme dans le cas de nombreuses molécules de ARN messager, l'ARN du virus de la fièvre aphteuse (ARN de VFA) contient une séquence d'acide polyadénylique /poly(A)7 à l'extrémité 3'. Il contient en outre un groupe d'acide
polycytidylique d'environ 100 à 200 nucléotides de lon-
gueur, selon la souche de virus. Le groupe d'acide poly-
cytidylique est situé à environ 400 nucléotides de l'extré-
mité 5' de 'ARN (D.J. Rowlands et coll., J. Virology, 26,
335-343, 1978).
L'ARN du virus de la fièvre aphteuse est translaté sous forme d'une polyprotéine, qui est clivée pendant la translation pour donner plusieurs gros polypeptides appelés produits primaires et qui sont désignés par "P" et un nombre. Ces produits primaires de translation (PP) sont ensuite clivés, probablement par des protéases de virus codés pour donner des produits polypeptidiques ultimes comme VP1. Il existe des parties de i'ARN de virus de la fièvre'aphteuse qui ne codent pas la production d'une protéine mais jouent un rôle important dans le cycle de la vie de ce virus in vitro et/ou in vivo, par exemple
elles influent sur la viabilité du virus.
De l'étude de la cinétique de translation virale dans des polypeptides dans des cellules infectées par des virus et dans des systèmes de synthèse de protéines sans cellules, on a déduit l'ordre, dans le génome viral, de l'information génétique codant l'obtention des principaux polypeptides (T.R. Doel et collaborateurs, J. Gén. Viral., 41, 395-404, 1978; D.V. Sanger et coll., J. Virol, 33, 59-68, 1980).A partir de ces études, on a trouvé que les 550 premiers nucleotides de 'ARN du virus de la fièvre aphteuse, à partir de l'extrémité 5', ne semblent pas coder l'obtention d'un polypeptide quelconque. Les protéines P16 et P20a sont étroitement apparentées et contiennent le site d'amorçage de la translation du virus de là fièvre aphteuse, comme montré par un marquage exclusif avec de la N-formyl méthionine au cours d'une analyse in vitro (D.V. Sanger et coll., 1980, àp. cit.). P88 est le produit primaire qui est scindé en VP14. D'après une évaluation de l'art antérieur, le gène pour VP1 comporte approximativement 700 nucléotides et doit se situer dans la région (R sur la figure-1) limitée par les
positions des nucléotides 2300 et 3800.
Il existe diverses techniques pour préparer la molécule d'ADN recombinant selon l'invention, dont
l'une comporte les étapes consistant à effectuer la syn-
thèse d'une nouvelle copie d'ADN à brin unique (cADN) de l'ARN purifié à partir d'un isolat de virus virulent et entier de la fièvre aphteuse, en utilisant une enzyme transcriptase inverse. Après dégradation du brin de ARN d'origine, le cADN est transformé en une copie d'ADN à double brin (ds cADN), qui est ensuite traitée pour enlever les boucles éventuellement formées par l'ADN en utilisant, par exemple, une enzyme de type nucléase. Un autre procédé pour préparer le cADN à double brin consiste
à passer par une synthèse chimique en utilisant des techni-
ques bien connues en pratique.
Une fois le cADN à double brin produit, l'étape suivante consiste à l'insérer dans un vecteur ou support
de clonage, qui peut être par exemple un plasmide bacté-
rien ou un bactériophage. On peut y parvenir en clivant
tout d'abord l'ADN du vecteur de clonage purifié, en utili-
sant une endonucléase de restriction, qui est une enzyme comme Pst 1, qui clive l'ADN à des sites dans lesquels des nucléotides complémentaires sont disposés en symétrie de rotation. Le cADN à double brin du virus de lar fièvre aphteuse peut ensuite être inséré entre les extrémités ouvertes du vecteur de clonage et leur être relié par l'un des divers procédés. Par exemple, plusieurs nucléotides "G" peuvent être fixés à l'extrémité 3' du vecteur de clonage par un procédé appelé terminaison d'homopolymères et qui implique l'utilisation d'une enzyme transférase terminale. D'une façon semblable, on ajoute plusieurs nucléotides "C" à l'extrémité 3' de cADN à double brin du virus de la fiè"vre aphteuse. On mélange ensuite le vecteur de clonage ainsi terminé et la copie d'ADN à double brin, de sorte que les terminaisons cohésives formées par l'opération de terminaison ou de
formation d'une queue fusionnent ensemble.
A la place de la formation "d'une terminaison" ou de "queue", il existe plusieurs autres possibilités.
L'une implique une digestion de ds cADN par des endo-
nucléases formant des terminaisons émoussées ou cohésives.
Des terminaisons émoussées peuvent être rendues cohésives par digestion par des exonucléases. Dans une autre méthode, on peut directement relier des extrémités émoussées en utilisant comme enzyme une ADN-ligase. Dans une autre méthode encore, on peut relier des oligonucléotides de synthèse à du ds cADN à extrémités émoussées et rendre les nouvelles extrémités cohésives par digestion par de l'exonucléase ou de l'endonucléase, avant ligaturation
à l'aide d'un vecteur de clonage linéarisé approprié.
Apres fusion du cADN du virus de la fièvre aphteuse
à double brin avec l'ADN du vecteur de clonage, on trans-
forme un hôte approprié, comme une bactérie, avec le vecteur de clonage recombinant, de façon à permettre à l'hôte d'exprimer le ds cADN du virus de la fièvre aphteuse, et de produire ainsi un ou des polypeptides présentant de
l'antigénicité à l'égard du virus de la fièvre aphteuse.
Il existe plusieurs combinaisons hôtes-vecteurs de cbnage pouvant servir à l'expression de protéines du virus *de la fièvre aphteuse. Par exemple, des vecteurs utiles de clonage comprennent des plasmides bactériens comme pAT 153 (A.J. Twigg, Nature, 283, 216-218, 1980; que l'on peut obtenir en s'adressant au Professeur D.
Sherratt, Université de Glasgow, Ecosse); pBR 322 (J.G.
Sutcliffe, Cold Spring Harbour Symposium for Quantitative Biology, 43, 7790, 1978; que l'on peut obtenir en s'adressant au Dr H. Boyer, Université de San Francisco, Etats-Unis d'Amérique); d'autres plasmides de E. coli et
des plasmides d'une très large gamme d'hôtes. Des bactério-
phages, comme les nombreux dérivés du phage B, peuvent également convenir. Des hôtes utilisables comprennent des bactéries comme des souches de E. coli K.12, par exemple E.coli HB101 (H.W. Boyer et coll., J. Mol. Biol., 41, 459-472, 1969; que l'on peut obtenir en s'adressant au Dr H. Boyer, Université de San Francisco, Etats-Unis d'Amérique); E. coli X 1776 (R. Curtis et coll., Ann Report Dept. of Microbiology University of Alabama
/rapport annuel du département de microbiologie de l'Uni-
versité de Alabama7, 1976, 96-106; que l'on peut obtenir en s'adressant au Dr R. Curtiss III, Université d'Alabama, Birmingham, Etats-Unis d'Amérique); E. coli X 2282 (que l'on peut obtenir en s'adressant au Dr R. Curtiss III) et E. coli MRC1 (que l'on peut obtenir en s'adressant au Dr S. Bremer, Université de Cambridge, Grande-Bretagne); des souches de Bacillus subtilis et de Pseudomonas, ainsi que des levures et autres champignons, et d'autres organismes unicellulaires. Cependant, on doit seulement
s'attendre à ce que tous les hôtes ne soient pas égale-
ment efficaces.
Dans chaque vecteur de clonage, divers sites peuvent être disponibles pourl'insertiondu cADN à double brin du virus de la fièvre aphteuse, chaque site étant désigné par l'endonucléase de restriction, enzyme qui clive l'ADN. Ainsi, par exemple, l'enzyme Pst 1 clive le
plasmide pAT 153 dans le gène codant la résistance à l'aI-
picilline. Il existe plusieurs autres endonucléases que l'on peut utiliser comme enzymes, notamment Hind III
et Eco R1.
Le choix du site, sur le vecteur de clonage, pour insérer la copie d'ADN à double brin du virus de la fièvre aphteuse peut être régi par divers facteurs, par exemple la dimension du polypeptide à exprimer et l'emplacement des séquences d'amorçage et de terminaison. Donc, tous les sites risquent de ne pas être également efficaces pour l'obtention d'un polypeptide donné. Le choix du site
peut également être régi par la méthode du dépistage ini-
tial ou "criblage" que l'on utilise pour détecter des recombinants, par exemple, comme indiqué, Pst 1 clive le plasmide pAT 153 dans le gène codant la résistance à
l'ampicilline;ainsi des colonies de transformants présen-
tant de la résistance à la tétracycline mais de la sensibilité à l'ampicilline risquent de contenir au moins S un peu de copie 1'ADN à double brin dû virus de la fièvre aphteuse. Il est essentiel que la copie d'ADN à double brin du virus de la fièvre aphteuse insérée dans le vecteur de clonage puisse être lue en phase correcte. Pour y parvenir, il peut s'avérer nécessaire d'insérer des nucléotides supplémentaires, par exemple entre les points de départ de transcription et de translation des fragments de copie d'ADN à double brin de virus de la fièvre aphteuse dont on désire l'expression. L'addition de tels nucléotides ne doit, bien entendu, pas former une séquence de nucléotides
risquant d'interrompre la translation.
L'expression de la copie d'ADN à double brin du virus de la fièvre aphteuse, qui a été inséré dans un vecteur de clonage, lequel a servi à son tour à transformer
une cellule hôte convenable, peut se déceler par l'appari-
tion d'une fonction spécifique de la protéine, c'est-à-dire une activité immunologique dans le cas du virus de la fièvre aphteuse. On dispose de plusieurs procédés, par exemple le procédé essentiellement immunologiquede détection ou de "filtrage" des colonies, décrit par S. Broome et W. Gilbert dans Proc. Nat. Acad. Sci., 1978, 75, 2746-2749. Une autre technique et qui est un peu plus simple, consiste à injecter à un animal de laboratoire l'extrait bactérien brut provenant d'une culture de bactéries trans-
forméEsà l'aide d'un vecteur de clonage ayant subi des opérations appropriées de génie génétique et à effectuer
des essais pour déceler la formation d'anticorps appropriés.
Une seconde possibilité consiste à effectuer une immunopré-
cipitation d'un extrait brut des cellules bactériennes.
Un autre procédé encore est la "technique des maxi-
cellules", décrite par Sancar et coll., dans J. Bact.,
1979, 137, 692-693.
La nature du polypeptide produit comme résultat de l'expression par l'hôte de la molécule d'ADN recombinant de l'invention va dépendre du point d'insertion, dans l'ADN, du vecteur de clonage, de sorte qu'en pratique, il peut se former un polypeptide précurseur qui comprend un nolypeptide codé par la copie d'ADN à double brin du
virus de la fièvre aphteuse et un polypeptide supplémen-
taire codé par 1'ADN du vecteur de clonage. Ainsi, par exemple, si le plasmide pAT 153 est clivé par Pst 1, on peut obtenir comme expression un polypeptide précurseur comprenant une partie de l'enzyme pénicillinase et le polypeptide codé par la copie d'ADN à double brin du virus de la fièvre aphteuse. Le polypeptide précurseur peut ensuite être sélectivement clivé afin de séparerde la -1' séquence des acides aminés superflus,le polypeptide du virus de la fièvre aphteuse voulu. Habituellement, le clivage sera effectué à l'extérieur de l'hôte après récolte de la culture microbienne, par des techniques bien connues des experts en ce domaine. Un clivage peut s'avérer nécessaire pour que le produit d'expression du virus de la fièvre aphteuse puisse exercer l'activité voulue. Cependant, pendant la récolte de la culture microbienne, le fait qu'une séquence d'acides aminés superflus soit liée aux polypeptides requis du virus de la fièvre aphteuse, peut contribuer à éviter une dégradation du produit d'expression par des enzymes endogènes. En variante, un clivage peut être effectué au sein de l'hôte; on peut y parvenir en insérant, dans le véhicule de clonage, de l'ADN codant
pour les enzymes de clivage souhaitées.
La production d'un produit de fusion d'un poly-
peptide codé par la copie d'ADN à doubls- brin du virus de fièvre aphteuse et d'une partiepar exemple, de l'enzyme pénicillinase peut augmenter la stabilité de la protéine hybride dans E. coli et même amplifier le caractère
immunogène de la protéine du virus de la fièvre aphteuse.
En variante, on peut insérer, avant la copie d'ADN à double brin du virus de la lièvre aphteuse, des séquences de nucléotides appropriés, provenant par exemple de 1'ARN du virus de la fièvre aphteuse, afin de garantir que la copie d'ADN à double brin du virus de la fièvre aphteuse puisse s'exprimer seule et non pas comme un produit de fusion avec un polypeptide de l'hôte. Lorsque l'on a identifié des transformants contenant au moins un peu de copie d'ADN à double brin de virus de fièvre aphteuse, comme expliqué ci-dessus, on purifie l'ADN du vecteur de clonage recombinant et on l'plv',vse ensuite pour déterminer combien de copies d'ADN à double brin du virus de la fièvre aphteuse ont été insérées. Pour ce faire, on traite l'ADN du védteur de
clonage recombinant avec plusieurs endonucléases de restric-
tion différentes,par exemple Eco Rl, PsL 1, Sal 1, Bgl II, Bam Hi, Hind III et Hinf 1, et l'on peut analyser par électrophorèse sur gel les produits de digestion. En utilisant ces résultats, avec ceux obtenus lorsqu'on laisse des oligonucléotides Tl, produits par digestion de 1'ARNf du virus delafièvre aphteuse par RNase ou nucléase Tl, former des hybrides avec des produits de digestion séparés par une endonucléase de réduction de l'ADN recombinant, on peut
produire des cartes de la copie d'ADN à double brin du vi-
rus de lafièvre aphteuse insérée dans le vecteur de clonage, semblables à celles représentées sur la figure 2. Sur cette figure 2, la ligne "ARN de VFA" (acide ribonucléique du virus de la fièvre aphteuse) montre schématiquement la position des oligonucléides obtenus après traitement par T1-RNase (les lignes ondulées représentant une certaine incertitude de position). Sur les autres schémas en trait fin de cette figure 2, les sites de restriction sont désignés comme suit: E = Eco Ri; H: Hind III, S Sal 1; K: KPn 1; B: Bam Hl; P = Pst 1; G = Bgl II; F Hinf 1 les rectangles ouverts désignent des séquences du virus de la fièvre aphteuse et les lignes isolées des séquences provenant du plasmide pAT 153. A partir de telles cartes, il est possible de choisir le recombinant qui contient le gène du virus de la fièvre aphteuse voulu, par exemple le gène codant l'obtention de VP On notera que sur la figure 1, la ligne inférieure (PF, c'est-à-dire les produits finals bien caractérisés) présente un schéma des divers produits
obtenus, notamment des protéines de capside (PC).
Selon un autre aspect de l'invention, celle-ci propose un procédé pour dresser la carte de la molécule d'ADN recombinant, comme définie cidessus, procédé selon lequel:
(a) on soumet l'ADN à une digestion par des endo-
nucléases, enzymes de restriction, et l'on sépare les produits obtenus; (b) on ajoute des oligonucléotides marqués d'ARN du virus de la fièvre aphteuse produits par digestionpar de la ribonucléase Tl (c) on identifie les produits de digestion par les endonucléases de restriction avec lesquels les oligonucléotides, résultant d'une digestion
par T1,ont formé des hybrides.
Les diverses molécules d'ADN peuvent servir de sonde pour reconnaître in vitro la présence d'échantillons biologiques du virus de la fièvre aphteuse, et elles peuvent en particulier servir à déterminer le sérotype ou le
sous-type provoquant une apparition de la fièvre aphteuse.
Pour cela, les molécules d'ADN peuvent être marquées, de façon connue, à l'aide d'un isotope radio-actif. En outre, le produit d'expression du vecteur de clonage recombinant peut servir à une détermination sérologique et à préparer des vaccins simples ou multivalents contre la fièvre aphteuse, par des procédés bien connus dans le domaine de
la fabrication des vaccins. De tels vaccins peuvent effi-
cacement stimuler la formation d'anticorps chez les ani-
maux vaccinés et les protéger ainsi contre la fièvre aphteuse. Selon un autre aspect de l'invention, celle-ci propose un vaccin destiné à stimuler la production des anticorps de lutte contre le virus de la fièvre aphteuse chez un mammifère, ce vaccin comprenant au moins une protéine présentant un caractère d'immunogénicité à l'égard du virus de la fièvre aphteuse et qui est produite par une cellule hôte, comme définie ci-dessus, avec un
excipient ou véhicule acceptable dans le domaine vétéri-
naire. Sélon encore-un autre aspecttde l'invention, celle-ci propose un procédé pour stimuler la production d'anti-corps contre le virus de la fièvre
aphteuse chez un mammifère, procédé selon lequel on admi-
nistre une quantité non-toxique et immunologiquement
efficace d'un vaccin, tel que défini ci-dessus. L'expres-
sion "quantité non toxique et immunologiquement efficace" sert à désigner une quantité de protéines présentant un caractère d'immunogénicité contre le virus de la fièvre aphteuse suffisant pour stimuler chez un mammifère la production d'une quantité suffisante d'anticorps pour que ce mammifère, s'il vient après la vaccination au contact d'un virus virulent de la fièvre aphteuse, ne succombe pas à la maladie, cette quantité n'étant cependant pas
toxique pour le mammifère.
D'autres caractéristiques de l'invention sont décrites dans les exemples suivants, qui sont présentés à titre illustratif seulement et ne doivent pas être considérés comme limitant d'une façon quelconque le cadre
de la présente invention.
EXEMPLE 1
Préparation de 1'ARN du virus de la fièvre aphteuse On ajoute environ 10 ml d'une récolte récente du virus de la fièvre aphteuse de type A10 (souche A61) (que l'on peut librement obtenir si on la demande à "Animal Virus Research Institute" (Institut de recherche sur les virus des animaux), Pirbright, Grande-Bretagne, en se soumettant cependant aux exigences de la loi-de chacun des pays en cause) dans du milieu de Eaglp à chacun de 10 flacons de Roux contenant des monocouches d'environ 108 cellules BIK21. Après 30 minutes de secousses modérées, on décante le milieu et l'on ajoute dans chaque flacon 20 ml de milieu frais. Lorsque l'infection par le virus a détruit les monocouches cellulaires (3 à 4 heures), on décante le milieu-et l'on enlève les débris de cellules par centrifugation à 12000 g durant 15 minutes à 4 C. On fait ensuite tourner à 90 000 g durant une heure à 4 C le virus pour obtenir un culot de centrifugation. On met à nouveau ce culot de centrifugation du virus en suspension dans 2 ml de tampon TNE (10 mM de tris-HC1 (pH 7,5), 150 mM de NaCl et 1 mM de EDTA (acide éthylène diamine tétraacétique)), et l'on clarifie la suspension
par 10 minutes de centrifugation à 20 C à environ 5000 g.
On ajoute du dodécylsulfate de sodium (DSS) de façon à obte-
nir dans la liqueur surnageante clarifiée une concentration de 1 % en poids/volume de DSS, et l'on introduit dans un tampon TN (100 mM de trisHCl à pH 7,6; 100 mM de NaCl) présentant un gradient préformé (15 à 45 % en poids/volume de saccharose) et l'on fait tourner à 100 000 g durant 2 heures à 10 C. On examine à 260 nm des fractions d'un ml chacune, et l'on extrait les fractions contenant du virus une fois avec un égal volume d'un mélange 1:1 de phénol et de chloroforme, puis l'on précipite la phase aqueuse par addition de deux volumes d'éthanol et on laisse incuber durant 16 heures environ à 20 C. On centrifuge le précipité d'ARN à 5000 g durant 30 minutes à 4 C pour obtenir un culot de centrifugation. On jette le liquide surnageant, on fait égoutter le culot que l'on dissout ensuite dans 0,5 ml de tampon TNES (10 mM de tris-HC1 à pH 7,6; 150 ml de NaCl; 1 mM de EDTA; et 0,2 % en poids/volume de DSS). On introduit cette solution dans du TNES présentant un gradient préformé (5 à 25 %) de saccharose et l'on centrifuge à 200 000 g durant 3,5 heures à 20 C. On groupe les fractions (0,5 ml) contenant de l'ARN sédimentant à 35S, on extrait une fois avec un mélange phénol-chloroforme, on précipite à l'éthanol et l'on redissout comme décrit ci-dessus pour le virus. On soumet la solution résultante à une précipitation par de l'éthanol et finalement on dissout dans 0,05 ml d'eau
doublement distillée.
2O Synthèse de l'A complémentaire à double brin On fait incuber à 30 C durant 2 heures 10 ag d'ARN du virus de la fièvre aphteuse et 0,5 fg d'oligo-dT (12-18) amorceur (obtenu chez Collaborative Research) dans un volume final de 100 pl contenant 0,4 mM de dithiothréitol, 8 mM de MgC12, 50 mn de tris-HCl à pH 8,1, 148 mM de NaCl, 0,2 mM de dATP (2,5 Ci/mM /a32p _-dATP; obtenu chez Radiochemical Centre, Amersham),0,2 mM de dTTP, 0,2 mM de dCTP, 0,2 mM de dGTP, 4 mM de Na4P207 et 28 unités de transcriptase inverse du virus AMV (produit fourni par le Dr J. Beard, Life Sciences Inc., Floride). On arrête la réaction en ajoutant 20 mM de EDTA et 0,2 % en poids/ volume de DSS. On soumet unéchantillon (2 %) de ce mélange réactionnel final à des essais à la touche sur des
disques de papier DE81 de 2,5 c'L (obtenu chez Whatman).
On les lave de façon poussée dans une solution à 5 % (en poids/volume) de Na2HPO4, puis brièvement (5 minutes) dans de l'eau distillée avant de les sécher et d'effectuer un comptage par scintillation. On calcule d'après ce mode opératoire un rendement total d'environ 2/g de copie de ADN. On soumet le reste du mélange réactionnel à une extraction par un mélange phénol-chloroforme et à une précipitation à l'éthanol, comme décrit cidessus, sauf que l'on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une teneur de 0,2 M avant d'ajouter l'éthanol. On dissout le culot de centrifugation desséché dans 100 ul de NaOH 0,1 M et / l'on fait incuber durant 20 minutes à 70 C pour enlever
le modèle, c'est-à-dire i'ARN du virus de la fièvre aphteuse.
On neutralise la solution avec de l'acide acétique et l'on sépare la copie d'ADN de l'ARN dégradé par passage dans une colonne (100 x 15 mm) de perles comportant du phénol-chloroforme. On remet en suspension le culot desséché, jusqu'à un volume final de 901l, dans 50 mM de tris-HCl, pH 8,3; 20 mM de dithiothréitol, 10 mM de MgC12; 0,4 mi de dCTP; 0,4 mM de dGTP; 0,4 mM de
2 3
dATP (5,5 Ci/mM /a P/-dATP; nadiochemrical Centre, Amersham), 0,4 mnl de dTTP et 36 unités de transcriptase inverse du virus AMV. Apres 4 heures d'incubation à 45 C, on arrête la réaction par l'addition de 20 mM de EDTA et de 0,2 % en poids/volume de DSS. On extrait le mélange avec du phénol-chloroforme, on ajoute du NaCl jusqu'à 0,2 M, et l'on précipite le mélange avec deux volumes d'éthanol en laissant reposer durant 16 heures environ à -20'C. On remet le culot desséché en suspension dans 2001Pl de 50 mM de NaCl, 0,1 % en poids/volume de DSS et l'on fait passer sur une colonne de "Sephadex G100", comme décrit ci-dessus. On précipite à l'éthanol la crête exclue, en opérant en présence de 200 pg de glycogène comme support. Une analyse sur des disques de papier DE81, comme décrit ci-dessus, indique que la synthèse du second brin a représenté environ 60 % du rendement théorique maximal. On remet en suspension le culot ou la pastille desséchée, que l'on a obtenu après précipitation dans l'éthanol, dans un volume final de 200 pl de tampon SI (25 mM d'acétate de sodium(pH 4,6); 150 mM de NaCl et 1 mM de ZnSO4). On conserve à -200C un échantillon (28 pl) de la suspension (échantillon A) cependant qu'on fait incuber le reste (échantillon B) avec 5 unités de
nucléase S1 (obtenue chez Sigma) durant 30 minutes à 37 C.
On arrête la réaction par extraction avec du phénol-
chloroforme et l'on soumet la phase aqueuse à une précipi-
tation à l'éthanol. On remet le culot desséché de centri-
fugation en suspension dans 20f1 de H2O. Pour vérifier
l'efficacité du traitement par la nucléase en vue d'enle-
ver les boucles de la copie d'ADN à double brin, on chauffe une faible quantité (2 %) des échantillons A et B dans du tampon Si à 100iC durant 6 minutes, on refroidit jusqu'à 600C et l'on ajoute 3 unités de Si à des moments variables (0; 0,25; 1 et 14 heures) puis l'on fait incuber durant 30 minutes à 370C. On vérifie la résistance à Si par fixation sur des disques de papier DE81, comme décrit ci-dessus. Les résultats montrent que plus de 53 % de l'échantillon A résistent à une digestion par Si, en comparaison de moins de 2 % de l'échantillon B, lorsqu'on fait incuber tous les deux avec Si, immédiatement après refroidissement à 60 C. Si l'on ajoute S1 1/4 d'heure après avoir placé les échantillons à 600C, ces nombres
montent à 81 % et 15 %, respectivement. Donc, le trai-
tement initial par S1 a effectivement clivé les boucles présentes après la synthèse du second brin. Une estimation de la dimension des molécules de l'échantillon B par électrophorèse sur gel d'agarose montre que les molécules se distribuent entre des copies à pleine longueur (c'est-à-dire environ 8000 paires de bases),jusqu'à moins de 200 paires de bases,avec une
valeur moyenne de 2000 à 4000 paires de bases.
Terminaison, à l'aide d'un homopolymère, d'un plasmide et d'une copie d'ADN à double brin (a) Terminaison du vecteur à l'aide de dG On soumet environ 7 ug du vecteur, le plasmide pAT153, à une digestion avec de l'endonucléase Pst 1 dans les conditions recommandées par les fournisseurs de
l'enzyme (Boehringer). On arrête la réaction par l'addi-
tion d'acétate de sodium jusqu'à 0,3 M et l'on précipite à l'éthanol. On remet le culot de précipitation desséché en suspension dans 100,1l de tampon de terminaison dG (100 mM de cacodylate de sodium-HCl; pH 7,1), 5 mM de MgC12, 50/g par ml d'albumine de bovin et 1 M de dGTP (200mCi/83-H/dGTP/mM). On y ajoute 2 p1 (38 unités) de transférase terminale (TT) et l'on fait incuber le mélange à 37 C. On retire des échantillons au bout de 2,5 minutes, 5 minutes et 10 minutes. Dans chaque cas, on arrête la réaction par refroidissement sur de la glace et on ajoute de l'EDTA jusqu'à 20 mM. Une analyse, par précipitation à l'acide chloracétique, d'un échantillon de 5 1pl de chaque prélèvement montre qu'il.ne se produit plus d'incorporation de 3H dGMP après 2,5 minutes, et que la longueur moyenne de la queue d'homopolymère est alors
d'environ 25 nucleotides. On dilue le reste de l'échantil-
lon obtenu après 2,5 minutes jusqu'à 100/1 avec du tampon TE (10 mM de tris-HC1; pH 8,0; 1 mM de EDTA) et l'on extrait une fois avec un volume égal de phénol saturé de TE. On extrait quatre fois, avec de l'éther, la phase aqueuse; on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à 0,3 M et l'on précipite l'échantillon par de l'éthanol. On remet le culot de précipitation desséché en suspension dans 40/l de H20 et l'on conserve à 10 C. On estime que la concentration de 1'ADN dans cette solution finale
est d'environ 15/g/ml.
(b) Terminaison par dC de la copie d'ADN à double brin: On fait incuber environ 0,4,g de copie d'ADN à double brin dans du tampon de terminaison dC (100 mM de cac6dylate de sodium-HCl (pH 7,1); 1 mM de CoC12; 0,1 mM de DTT (dithiothréitol), 50/g par ml de sérum albumine de bovin; 0,5 mM de 3H dCTP (600 mCi/5-H7-CTP/ mM) avec 1 pl/ de TT (19 unités). On enlève au bout de 2 et de 5 minutes les parties aliquotes qu'on analyse, pour déterminer une incorporation, par précipitation d'un échantillon de 5 l de chaque partie aliquote à l'aide de TCA (acide trichloracétique). Cela indique que la longueur moyenne de la queue 'homopolymère est d'environ nucleotides après 2 minutes et de 160 nucleotides après 5 minutes. On groupe ces deux parties aliquotes, on les extrait une fois au phenol, on les extrait quatre fois à l'éther, on précipite à l'éthanol, on redissout
dans 50pl de H20 et on conserve à -10 C.
Transformation avec du plasmide fusionné et de la copie d'ADN double brin On fait incuber à 65 C durant 0,5 heure, environ 0,121g de plasmide pAT153 à terminaison par dG (0,05 pmole) et 0,1 g de copie d'ADN double brin à terminaison par dC (0,2-0,4 pmole) dans 100 pl de tampon TNE (10 mmoles de tris-'C1, pH 8,0; 200 mM de NaCl; 1 mM de EDTA). La température du milieu d'incubation tombe doucement jusqu'à C en une période de 4 heures puis passe rapidement à
0 C. On dilue la solution jusqu'à 200/l contenant, finale-
ment, 15 mM de tris-HC1, pH 7,5; 100 mM de NaCl; 10 mM de MgC12; 10 mM de CaCl2; 0,5 mM de EDTA, et l'on conserve
à 0 C durant 3 heures environ.
On prépare une culture de E. coli HB101, compétente pour une transformation, en inoculant 1 ml d'une culture en phase stationnaire à 65 ml de bouillon L (1% de Bacto Tryptone Difco, 0,5 % d'extrait de levure Bacto de Difco et 0,5 % de NaCl, pH 7,2) et en secouant à 37 C durant J heures environ, après quoi la valeur de
* A650 est de 0,4. On soumet les cellules à une centrifuga-
tion à 3 000 g durant 5 minutes à 4 C pour obtenir un culot. On remet les cellules en suspension dans 25 ml de
solution 0,1 M de MgCl2 (0 C) et l'on centrifuge à nouveau.
On remet le culot de centrifugation en suspension dans 2 ml de solution 0, 1 M de CaCl2 {(0 C) et l'on abandonne durant minutes à 0 C. On mélange doucement 0,2 ml
environ de ces cellules compétentes pour une trans-
formation avec 0,1 ml de pAT153/copie d'ADN double brin ayant fusionné, et l'on abandonne durant 30 minutes supplémentaires à 0 C, puis durant 2 minutes à 42 C et enfin durant 30 minutes à 0 C. On y ajoute 1 ml de bouillon L et l'on fait ensuite incuber le mélange de transformation à 37 C durant 25 minutes. On étale dix échantillons de 0,1 ml de ce produit sur des plaques L-Tc (bouillon L + 1,5 % de gélose et 15 ig/ml de tétracycline (que l'on obtient chez Sigma)), et l'on fait incuber durant 16 heures environ à 37 C. De ces dix plaques, on obtient 150 colonies capables de résister à la tétracycline, dont environ 87 % sont sensibles à l'ampicilline (100ug/ml; Sigma), ce qui suggère une insertion de la copie d'ADN au
site Pst 1 de pAT 153.
Préparation à grande échelle d'un plasmide recombinant On cultive en vrac les transformants contenant les plasmides en inoculant 10 ml de cuIture stationnaire à 500 ml de bouillon L et en secouant à 37 C durant 4 heures environ jusqu'à ce que l'indice A590 atteigne environ 1,0. On ajoute alors du Chloramphénicol (obtenu chez Sigma) jusqu'à 0,1 mg/ml, et l'on secoue les cultures à 37 C durant 16 heures environ. Après cette étape d'amplification, on centrifuge à 5000 g durant 5 minutes à 4 C les cellules. On désinfecte le liquide surnageant que l'on jette, et l'on remet en suspension le culot de centrifugation de cellulesdans 12 ml de tampon R (50 mM
de tris-HC1 (pH 8,0); 40 mM de EDTA; 25 % de saccharose).
On ajoute ensuite du lysosyme jusqu'à 1,4 mg/ml et EDTA jusqu'à 60 mM, et on abandonne la suspension sur de la glace durant 5 minutes. A 16 ml de la suspension, on ajoute 30 ml de mélange à base de Triton (0,1 % de "Triton X-100"; 62 mM de EDTA; 50 mM de tris-HCl à pH 8,0), et l'on abandonne le mélange sur de la glace durant 10 minutes environ ou jusqu'à ce qu'il devienne visqueux. On clarifie ensuite le mélange en le centrifugeant à 48000 g durant minutes à 4 C. On décante soigneusement le liquide surnageant et l'on ajoute 0,95 g de CsCl et 0,1 ml d'une solution à 10 mg/ml de bromure d'éthidium. On centrifuge à 12 000 g dans un rotor Beckman 50Ti à 20 C durant 40 heures. On a rendue visible la bande du plasmide par fluorescence ultraviolette à grande longueur d'onde et on l'a enlevée à l'aide d'une seringue en perçant le côté du tube. On a centrifugé l'acide désoxyribonucléique (ADN) du plasmide jusqu'à équilibre dans un second gradient de CsCl/bromure d'éthidium. On a extrait la bande résultante quatre fois avec du propanol-2 saturé de NaCl et H20, puis on l'a précipitepar de l'éthanol, dissous à nouveau dans du tampon TE et reprécipité. On a remis le culot final de centrifugation, desséché, en suspension dans 200 /l de tampon TE et on a conservé
le tout à 4 C.
Etablissement, à l'aide d'endonucléases de restriction, d'une carte physique des plasmides recombinants On a acheté chez Boehringer les endonucléases de restriction Eco RI, Pst 1, Sal 1, Bgl II et Sma I; on a acheté chez Bethesda Research Laboratories Bam HI, Hind III, Hinf I, Ava I, Xba I et Hinc II; et l'on a acheté Kpn I chez New England Biolabs. On a soumis l'ADN de plasmide recombinant purifié à une digestion par ces enzymes en utilisant les conditions de réaction spécifiées par les fournisseurs. On a soumis les produits de digestion à une analyse par électrophorèse sur un gel à 1 % d'agarose ou à 7 % d'acrylamide, et l'on a rendu visible
par coloration à l'aide de bromure d'éthidium et fluores-
cence ultraviolette. On a utilisé comme marqueurs de dimensions de l'ADN lambda de bactériophage qui a été soumis à une digestion par Hind III (Boehringer) et pAT153 de plasmide qui a été soumis à une digestion par Hinf I. Orientation et obtention d'une carte d'ADN dg virus de la
fièvre aphteuse inséré dans des plasmides à l'aide d'oligo-
nucléotides de ribonucléase TI provenant du virus de la fièvre aphteuse On a préparé par électrophorèse à deux dimensions sur gel des oligonucléotides de ribonucléase (RNase) T1 marqués par 32p à l'extrémité 5' pour servir d'éléments de recherche. Les oligonucléotides ont été marqués avant l'électrophorèse par le mode opératoire de Harris (T J R Harris; Nucleic Acids Research, 7, 1765-1785; 1979) en utilisant 1 à 5 g d'ARN et une unité de ribonucléase T1,
ou bien on les a isolés à partir d'un gel à deux dimen-
sions et l'on en a marqué l'extrémité. Dans ce dernier mode opératoire, on a séparé par électrophorèse sur gel à deux dimensions un produit de digestion, par de la ribonucléase TI, de 1001g d'ARN marqué in vivo par 32p (D.J. Rowlands, T J R Harris et F Brown; 1978; op. cit.) et l'on a utilisé une autoradiographie du gel pour
localiser les oligonucléotides. Dans chaque mode opéra-
toire, on a élué les oligonucléotides des morceaux de gel
par la méthode "crush and soak" (écraser et tremper) (A.
Maxam et W Gilbert: Proceedings of the National Academy
of Sciences, Etats-Unis d'Amérique, 74, 560-564; 1977).
L'ordre des oligonucléotides sur le génome est décrit par T J R Harris, K J H Robson et F Brown (J General Virology,
1980, sous presse).
On a soumis de l'ADN recombin&nt purifié à une digestion par des endonucléases de restriction;on a séparé les produits sur un gel à t % d'agarose (gélose) et l'on a ensuite transféré les produits sur un filtre de nitrocellulose par la méthode de Southern (E M Southern: J Molecular Biology, 98, 503-513; 1975). On a soumis le
filtre à une incubation préalable dans du tampon d'hybri-
disation (40 % de formamide, 0,4 M de NaCl, 10 mM de PIPES-NaOH à pH 6,4, 101g/ml d'AN-transfert de E.coli; 0,5 % de DSS (dodécylsulfate de sodium); 0,04 % de "Ficoll" /polymère synthétique à poids moléculaire élevé
de saccharose et d'épichlorhydrine7; 0,04 % de polyvinyl-
pyrrolidone 400; 0,04 % d'albumine de bovin) à 50 C durant 2 heures dans un sac de matière plastique fermé, avant l'addition des oligonucléotides de ribonucléase T1 marqués (75 à 150 000 coups par minute). Au bout de 16 heures, on a lavé le filtre à 40 C dans 2xSSC (8 x 250 ml en 6 heures); on l'a séché à l'air puis autoradiographié à -70 C en utilisant une pellicule Fuji XR et un écran d'intensification. Résultats La figure 2 montre les cartes physiques de trois plasmides recombinants, pFA61/t206; pFA61/t243 et pFA61/76, et leur alignement et leur correspondance avec les gènes
du virus de la fièvre aphteuse, ces renseignements prove-
nant de déductiors faisant suite à l'application des procédés ci-dessus. On a tout d'abord déterminé l'orientation du pFA 61/t206, recombinant le plus gros, contenant une séquence d'environ 5800 paires de nucléotides correspondant à environ 73 % de la séquence d'ARN du virus de la fièvre aphteuse, en utilisant des oligonucléotides de ribonucléase T1 provenant de 1'APN du virus et ayant auparavant fait l'objet de l'établissement d'une carte sur cet ARN (Harris et coll., 1980, op. cit.). Les oligonucléotides T1 ne3, 4 et 20 et 27 ont été particulièrement utiles à cette fin en raison de la précision (indiquée sur la figure 2) avec laquelle on connait leur position dans i'ARN
du virus de la fièvre aphteuse (ARN-VFA sur la figure 2).
On a déterminé l'alignement d'autres recombinants (par exemple, pFA61/76' par rapport au recombinant pFA61/t206 et à l'ARN du virus de la fièvre aphteuse, Hi établissant la carte des fragments, obtenus à l'aide d'endonucléase de restriction, des recombinants et par hybridisation avec des oligoribonucléotides T1 provenant de l'ARN du virus. Deux des recombinants prOssentés sur la figure 2
contiennent clairement l'information génétique pour l'ob-
tention de plusieurs protéines du virus de la fièvre
aphteuse, et notamment VP1.
Le recombinant pFA61/t206 contient VP1 en une orientation destinée à l'expression d'un polypeptide consistant en un produit de fusion de la partie terminale azotée de e-lactamase codée dans le plasmide et d'un polypeptide déterminé par le virus dela fièvre anhteuse.
a) EXPRESSION Construction d'un vecteur d'expression, pXYl(fig.14) On a effectué une préparation à grande échelle de plasmide recombinant pOP 20313 (que l'on peut obtenir
en s'adressant à Forrest Fuller, Harvard University, Etats-
Unis d'Amérique) en utilisant les techniques décrites ci-
dessus. On a soumis un microgramme d' ADN de plasmide purifié à une digestion par 5 unités de ECoRI et 5 unités de Hind III durant une heure à 37 C. On a également soumis 1 1g du plasmide pAT153 à une digestion avec 5
unités de ECoRI et 5 unités de Hind III comme ci-dessus.
On a ensuite traité les deux échantillons d' ADN sur un gel d'agarose. On a découpé sur le gel d'agarose le fragment d'ADN de 0,5 kb (paires de kilobases) de pOP203-13 et le fragment d'ADN de 3,6 kb de pAT153, et l'on a soumis à une extraction par le procédé de Vogelstein et Gillespie, Proc. Nat. Acad. Sci., 76, 615-619; 1979. On a mélangé les fragments d'ADN purifies et on les a ligaturés avec 0,1 unité de ADN-ligase T4 (Miles) durant 16 heures à C. On a utilisé l'ADN ligaturé pour transformer une culture compétente de E.coli HB 101 (préparée comme décrit ci-dessus) et l'on a placé les cellules sur des
plaques de L-Ap (bouillon L plus 1,5 % de gélose ou agar-
agar et 100 pg/ml d'ampicilline (obtenue chez Sigma)) et l'on a fait incuber durant 16 heures environ à 370C. On a obtenu de nombreux recombinants, dont l'un a été encore caractérisé par établissement d'une carte à l'aide d'enzymes de restriction et a été appelé pXY1 (figure 14). Des fragments de copie d'ADN à double brin de virus de la fièvre aphteuse introduits comme clone dans le site unique de pXY1 déterminé à l'aide de EcoRI peuvent aboutir à l'expression d'une protéine hybride consistant en les premiers huit amino-acides de e-galactosidase, 2 acides aminés provenant du site d'action de EcoRl et un certain nombre d'acides aminés dont la formation a été codée par l'introduction du fragment de copie d'ADN à double brin provenant du virus de la fièvre aphteuse. Les protéines hybrides ainsi produites seront sous le contrôle ou la commande de l'opéron "lac" (la crosse). Une transcription peut être induite (augmentée) par l'addition de 30 1g/ml de IPTG(isopropyl 1-thio-e-Dgalactopyranoside) lorsque le plasmide recombinant se trouve dans une bactérie hôte contenant des quantités suffisantes d'une protéine à effet
spécifique de répression. On peut y parvenir par l'in-
troduction d'un facteur F', contenant une mutation "Lac lqI dans la bactérie hôte (voir Henning et coll.,
Proc. Nat. Acad. Sci., 76, 4360-4364, 1979).
b) Introduction de la copie d'ADN à double -brin, du virus de la -fièvre aphteuse, dans pXY1 On a soumis 2 jg de pFA61/t76, préparé comme décrit ci-dessus, à une digestion avec 6 unités de EcoRl et 1 unité de Pst 1 durant 1 heure à 370C. Cela a abouti à une digestion complète avec EcoRl, mais seulement à une digestion partielle avec Pst 1. On a isolé le produit de digestion partielle de4,0 Kb (kilo-bases),contenant la totalité de la copie d'ADN insérée, sur un gel d'agarose comme décrit antérieurement. On a ajouté ce produit à 2,01?g de pXY1 (découpé à l'aide de deux unités de Eco R1 et de deux unités de Pst 1) et l'ona relié ensemble les fragments d'ADN par incubation avec de l'ADN-ligase T4 (0,05 unité) durant 16 heures à 15 C. On a utilisé l'ADN pour transformer des cultures compétentes de E.coli HB101 que l'on a ensuite fait croître sur des plaques "L-Tc"'(bouillon de L plus 1,5 % d'agar-agar ou gélose et 10 pg/ml de tétracycline). On a obtenu de nombreux recom- binants qui ont été sensibles à l'ampicilline, ce qui indique l'insertion d'un fragment d'ADN dans le site de pXY1 de reconnaissance spécifique de l'enzyme Pst. On a
encore caractérisé un tel plasmide recombinant par éta-
blissement d'une carte à l'aide d'enzymesde restriction et l'on a appelé ce plasmide pWRL 1000 (figure 15). Ce plasmide contenait le promoteur "Lac" et les séquences de copie d'ADN du virus de la fièvre aphteuse codant pour p88
dans l'orientation correcte (flèche VFA sur la figure 15).
c) Construction du plasmide d'expression, pWRL Pour réaliser l'expression des séquences du virus de la fièvre aphteuse, il a été nécessaire d'enlever les segments d'ADN séparant la copie d'ADN du virus de la fièvre aphteuse du promoteur lac. On a soumis 1 1g de pWRL 1000 purifié (7,3 kB) à une digestion avec 10 unités de Sac II et l'on a précipité à l'éthanol. On a redissous l'ADN sec dans 0,1 ml de tampon (0,1 M de NaCl; 0,005 M de MgCl2; 0,005 M de CaC12; 0,02 M de tris-HCl, pH 8,1; 0,001 M de EDTA) et l'on a fait réagir avec 0,2 unité de nucléase Bal 31 (BRL) à 18 C durant 15 minutes. On a arrêté la réaction par l'addition de 0,5 1 de 0,5 M de EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique). Dans ces conditions, Bal 31 enlève en moyenne 300 paires de bases d'ADN des extrémités de l'ADN à double brin linéaire. Après précipitation à l'éthanol, on a fait digérer l'ADN avec 5 unités de EcoRl et l'on a à nouveau précipité à l'éthanol. On a repris
l'ADN dans 40/1 de tampon Polymérase I (0,06 M en tris-
HC1, pH 7,5, 0,008 M en MgCl2; 0,2 mM de dATP, 0,2 mn
de dTTP, 0,2 mM de dCTP, 0,2 mM de dGTP, 0,01 M de e-
mercaptoéthanol; 1 mM de ATP et 1,4 unité de ADN-polymé-
rase de E.coli (gros fragment)) et lton a fait incuber 10 minutes à 10 C. On a ensuite ligaturé ensemble les extrémités émoussées du plasmide linéaire, à l'aide de 0,4 unité d'ADN-ligase T4 durant 16 heures à 15 C, et l'on a utilisé ce plasmide pour transformer E.coli AB2480 (obtenu chez P. Emmerson, Université de Newcastle, Grande- Bretagne)contenant F' Lac Iq. On a obtenu un certain nombre de recombinants dans des plaques L-Tc. On a caractérisé l'un des recombinants par établissement d'une carte à l'aide d'enzymes de restriction et on l'a appelé pWRL 1004 (figure 16; 4, 8 kB). On a trouvé, à la suite de l'établissement de la carte à l'aide d'enzymes de
restriction, que pWRL 1004 a régénéré un site de recon-
naissance spécifique de Eco RI (site sensible à Eco RI ou "site de Eco RI")à la jonction du promoteur Lac et des
séquences de copie d'ADN du virus de la fièvre aphteuse.
On a examiné par la "Maxicell Technique" (technique des très grandes cellules) (Sancar et coll., J. Bact.,137, 692-693, 1979) les protéines codées dans le plasmide dans
la souche, sensible à l'ultraviolet, AB2480, et l'on a trou-
vé que pWRL 1004 effectue la synthèse de grosses protéines (50 000 daltons) dont la formation est codée par la copie
d'ADN du virus de la fièvre aphteuse.
d) Construction de plasmides d'expression supple-
mentaires On a fait digérer 1/g de pWRL 1004 (4,8 kB)
avec 6 unités de Pvu II et l'on a ligaturé avec de l'ADN-
ligase T4 en présence de 0,2 1g de fragments d'ADN de
synthèse (contenant une séquence reconnue par Eco RI).
L'introduction de Eco RI " linker" (que l'on obtient chez Collaborative Research) aboutit à l'introduction d'un
codon "d'arrêt" éloigné de quatre acides amines de l'extré-
mité carbonée de VP1. On a appelé ce plasmide pWRL 1120 (4,8 kB; figure 16) et il a produit une protéine de 29 000 daltons contenant VP1, lorsqu'on a effectué un
examen dans des "Maxicells" (très grandes cellules).
On a fait digérer 2 1g de pWRL 1004 par 6 unités de Pvu II et 6 unités de Pst I,et l1 fragment de 4,0 Kb isolé à partir d'un gel d'agarose a été antérieurement décrit. La moitié des cellules, compétentes pour l'ADN, de E. coli a donné un plasmide pWRL 1140 (de 4,0 Kb, figure 16) cependant que l'on a ligaturé l'autre moitié en présence d'un "EcoR1 linker" avant de les utiliser pour transformer E.coli. On a trouvé qu'un plasmide de ce dernier type présente un site de Eco RI supplémentaire introduit, et ce plasmide a été appelé pWRL 1130 (4,0 Kb;
figure 16).
Résultats La figure 17 montre un schéma de structure et une indication sur la dimension (nombre des acides aminés (AA); poids moléculaire (P}i, en kilo-daltons) des polypeptides principaux dont la synthèse est codée dans
les plasmides pWRL 1004, pWRL 1120, pWRL 1130 et pWRL 1140.
La grande partie synthétisée par pWRL 1004 a contenu des séquences du polypeptide p52 du virus de la fièvre aphteuse et est instable. Les protéines plus petites produites dans les plasmides pWRL 1120 et 1130 contiennent principalement des séquences VP1 et semblent stables dans des "Maxicells" (très grandes cellules). La protéine de 40 000 daltons (40 K) produite par pWRL 1140 est un produit de fusion contenant les 104 acides aminés de terminaison carbonée de e-lactamase /'"-Lac, 104 au") en plus des séquences du virus de la fièvre aphteuse et elle a abouti à une stabilisation du polypeptide. La figure 18 montre les séquences à carbone terminal des protéines dont la synthèse est codée dans les plasmides pWRL 1120 (2; séquence du virus de fièvre aphteuse hors cadre); du plasmide pWRL 1130 (3; hors cadre dans la e-lactamase) et le plasmide pWRL 1140 (4; dans le cadre en cas d'utilisation de la e-lactamase). Dans le cas du plasmide pWRL 1004 (1), le ribosome, après translation dos séquences p52 du virus de la fièvre aphteuse, va rencontrer une séquence poly C (proline) et se terminer après 11, 32 ou 106 acides aminés ("a) selon le cadre de lecture. On a obtenu la synthèse, en des quantités croissantes, de l'ensemble des quatre polypeptides décrits ci-dessus, lorsqu'on a cultivé les bactéries en présence de 301ug/ml de IPTG, ce qui montre que la protéine a été produite sous la commande de l'opéron lac. La dimension de la protéine produite a été la même
que ce qui avait été prédit.
Analyse des séquences de nucléotides On a préparé des fragments duADN à partir des
plasmides recombinants, par digestion avec des endo-
nucléases de restriction appropriées. On a marqué de façon appropriée les extrémités des fragments et l'on a déterminé les séquences des nucléotides selon les modes opératoires décrits par A Maxam et W Gilbert (1977; op. cit.).. A partir de cela, on a déterminé des détails de la région des gènes de structure de l'ARN du virus de la fièvre aphteuse, comme représenté sur la figure 3, sur laquelle les flèches grasses indiquent l'étendue et la direction des séquences, cependant que le segment de 200 paires de base$(200 BP) indique l'échelle. La figure 4 présente des détails sur l'ADN et la séquence des acides aminés dans la région de la jonction VP4 /VP2. Les figures 5 à 7 montrent des détails sur l'ADN et la séquence des acides aminés dans la partie terminale de VP2; dans la partie moyenne de VP3 et dans la région suivant VP1, respectivement. La figure 8 montre une comparaison des séquences des acides aminés à terminaison NH2 de VP, provenant des souches
A61, A12, 01K' 01B' C3R du virus de la fièvre aphteuse.
Les acides aminés soulignés dans la séquence de A61 sont ceux qui sont communs à l'ensemble des cinq souches. Les
amino-acides soulignés dans les séquences des autres sou-
ches sont ceux qui sont homologues entre la souche en cause et A61, l'homologie étant indiquée au bas de la figure 8. La figure 9 montre des détails de la séquence
d'ADN de la terminaison carbonée de VP3 et de la termi-
naison azotée de VPI' La fiacure 10 présente les séquences des nucléotides et des acides aminés à la jonction de la région codant pour VP2 et VP3, séquences suivant directement l'extrémité de la séquence apparaissant à la figure 5. La figure 12 présente la séquence des nucleotides de PFA61/t76 comprenant les jonctions de VP4/2, VP2/3 et VP3/1 ainsi que la séquence des acides aminés produits à partir d'un cadre correct de lecture qui est souligné. Sur la figure 12, des ** indiquent la présence d'un codon d'arrêt et des ---
désignent la présence d'un nucléotide non déterminé, ce-
pendant que A désigne une région pour laquelle un cadre correct de lecture n'est pas connu et que B montre la présence éventuelle d'une extrémité à terminaison carbone de VP1. La figure 13 présente la séquence des nucléotides et la séquence des acides arihé prédits pour pFA61/t76, en montrant la totalité de p88 avec les jonctions de VP4/VP2; VP2/VP3 et VP3/VP1; cependant que "position"
indique la position de la terminaison azotée de VP1.
La figure 19 montre la séquence des nucléotides de pFAlOt/243 correspondant à l'extrémité 3' de l'ARN du'virus de la fièvre aphteuse, comportant au moins une partie de la queue poly A et qui ne code pas la production d'une protéine. Sur cette figure 19, les chiffres 1, 2 et 3 désignent l'erplacement de codons d'arrêt dans trois phases de lecture, cependant que... indiquent une séquence qui n'est pas clairement établie.
EXEMPLE 2
On a répété les procédés utilisés dans l'exemple 1 pour préparer des plasmides recombinants, sauf que la souche du virus de la fièvre aphteuse utilisée a été O1BFS (également disponible sur demande adressée à Animal Virus
Research Institute).
Résultats La figure 11 montre la carte physique d'un plasmide recombinant pFO1BFS/t251 et son alignement et sa correspondance avec les gènes du virus de la fièvre aphteuse, les renseignements étant déduits de l'application des procédés ci-dessus. Sur cette figure 11, ARN VFA indique l'acide ribonucléique du virus de la fièvre aphteuse; PP désigne les produits primaires et PCF les produits de
clivage finals.
Claims (31)
1. Molécule d'acide désoxyribonucléique (ADN), caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence de nucléotides correspondant essentiellement à la totalité ou à une partie de l'acide ribonucléique (ARN) du virus
de la fièvre anhteuse.
2. Molécule d'acide désoxyribonucléique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence de nucléotides codant essentiellement pour l'obtention d'au moins une protéine du virus de la fièvre aphteuse.
3. Molécule d'acide désoxyribonucléique selon la revendication 2, caractérisée en ce que la séquence des nucléotides code essentiellement pour l'obtention d'un précurseur des protéines de capside du virus de la fièvre aphteuse.
4. Molécule d'acide désoxyribonucléique selon la revendication 2, caractérisée en ce que la séquence des nucléotides code essentiellement pour l'obtention de
la protéine p88 du virus de la fièvre aphteuse.
5. Molécule d'acide désoxyribonucléique selon la revendication 2, caractérisée en ce que la séquence des nucléotides code essentiellement pour l'obtention des protéines VP1, VP2, VP3 et VP4 du virus de la fièvre aphteuse
6. Molécule d'acide désoxyribonucléique selon la revendication 2, caractérisée en ce que la séquence des nucléotides code essentiellement. pour l'obtention, de manière contiguë, des protéines VP4, VP2, VP3 et VP1
du virus de la fièvre aphteuse.
7. Molécule d'acide désoxyribonucléique selon la revendication 2, caractérisée en ce que la séquence des nucléotides code essentiellement pour l'obtention de
la protéine VP1 du virus de la fièvre aphteuse contiguë.
avec la totalité ou avec une partie de l'une quelconque des protéines VP2, VP3 et VP4*
8. Molécule d'acide désoxyribonucléique selon la revendication 2, caractérisée en ce que la séquence
des nucléotides ne code essentiellement que pour l'ob-
tention de la protéine VP du virus de la'fièvre aphteuse, seule ou contiguë avec la totalité ou avec une partie de
la protéine VP3.
9. Molécule d'acide désoxyribonucléique selon la revendication 2, caractérisée en ce que la séquence des nucléotides code essentiellement pour l'obtention de
la protéine VP1 du virus de la fièvre aphteuse.
10. Molécule d'acide désoxyribonucléique selon la revendication 2, caractérisée en ce que la séquence des nucléotides code essentiellement pour l'obtention de
la protéine VP2 du virus de la fièvre aphteuse.
11. Molécule d'acide désoxyribonucléique selon la revendication 2, caractérisée en ce que la séquence des nucléotides code essentiellement pour l'obtention
de la protéine VP3 du virus de la fièvre aphteuse.
12. Molécule d'acide désoxyribonucléique selon la revendication 2, caractérisée en ce que la séquence des nucléotides code essentiellement pour l'obtention de
la protéine VP4 du virus de la fièvre aphteuse.
13. Molécule d'acide désoxyribonucléique selon la revendication 2, caractérisée en ce que la séquence des nucléotides code essentiellement pour l'obtention de la totalité ou d'une partie d'au-moins deux protéines du virus de la fièvre aphteuse provenant-d'un ou plusieurs
variants différents du virus de la fièvre aphteuse.
14. Molécule d'acide désoxyribonucléique selon la revendication 13, caractérisée en ce que les protéines du virus de la fièvre aphteuse, ou les parties de ces protéines, sont des protéines VP1 provenant de différents variants
du virus de la fièvre anhteuse.
15. Molécule d'acide désoxyribonucléique selon
l'une quelconque des revendications 9, 10, 11 ou 12,
caractérisée en ce que la séquence des nucléotides est
essentiellement celle représentée sur la figure 13.
16. Molécule d'acide désoxyribonucléique selon
l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisée
en ce que la séquence des nucléotides code pour l'obten-
tion d'un fragment biologiquement fonctionnel.
17. Molécule d'acide désoxyribonucléique selon
l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisée
en ce que la séquence des nucléotides correspond à l'acide ribonucléique ou code pour l'obtention d'une protéine de sérotype A ou de sérotype 0 du virus de la fièvre aphteuse.
18. Molécule d'acide désoxyribonucléique selon la revendication 17, caractérisée en ce que la séquence des nucléotides code pour l'obtention d'une protéine de sérotype A, sous-type AlO,souche 61,du virus de la
fièvre aphteuse.
19. Molécule d'acide désoxyribonucléique recom-
binant, caractérisée en ce qu'elle comporte un opéron comportant des séquences d'amorçage, des séquences de
terminaison et une séquence de nucléotides codant essen-
tiellement pour l'obtention de la totalité ou d'une partie d'au moins une protéine du virus de fièvre aphteuse, la séquence des nucléotides étant située entre les séquences
d'amorçage et les séquences de terminaison de l'opéron.
20. Molécule d'acide désoxyribonucléique recombinant, selon la revendication 19, caractérisée en ce que la séquence des nucléotides comprend une molécule d'acide désoxyribonucléique selon l'une quelconque des
revendications 2 à 18.
21. Vecteur de clonage d'acide désoxyribonucléique recombinant, capable d'exprimer la totalité ou une partie d'une protéine du virus de la fièvre aphteuse, caractérisé
en ce qu'il comprend une molécule d'acide désoxyribonu-
cléique recombinant selon l'une des revendications 19 ou 20.
22. Cellule hôte caractérisée en ce qu'elle contient au moins un vecteur de clonage d'acide recombinant
selon la revendication 21.
23. Antigène, caractérisé en ce qu'il est produit par une cellule hôte transformée par introduction d'un vecteur de clonage d'acide désoxyribonucléique recombinant selon la revendication 21 pour stimuler chez un mammifère la production d'anticorps destinés à combattre le virus de la
fièvre aphteuse.
24. Vaccin pour stimuler chez un mammifère la production d'anticorps destinés à combattre le virus de la fièvre aphteuse, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une protéine présentant de l'immunogénicité à l'égard du virus dé la fièvre aphteuse et qui a été produite par une cellule hôte selon la revendication 22, avec un
véhicule ou excipient acceptable du point de vue vétérinaire.
25. Procédé pour préparer une molécule d'acide
désoxyribonucléique selon l'une quelconque dès revendications
1 à 18, caractérisé en ce qu'il comporte.: (a) l'isolement d'un acide désoxyribonucléique à un seul brin du virus de la fièvre aphteuse; (b) la préparation d'un premier brin unique d'acide désoxyribonucléique complémentaire de l'acide ribonucléique à un seul brin; et (c) la préparation d'un second brin d'acide désoxyribonucléique complémentaire du premier brin d'acide
désoxyribonucléique et lié à lui par des liaisons hydrogène.
26. Procédé pour préparer un vecteur de clonage
d'acide désoxyribonucléique recombinant selon la revendi-
cation 21, caractérisé en ce qu'il comprend: (a) le clivage d'un vecteur de clonage pour produire des extrémités libres;
(b) l'insertion de la-molécule d'acide désoxy-
ribonucléique, telle qu'elle a été préparée selon la revendication 25, en un endroit situé entre les extrémités
libres du vecteur de clonage, mais qui n'est pas nécessai-
rement voisin de ces extrémités; et (c) la jonction, par des procédés connus, de la molécule d'acide désoxyribonucléique aux extrémités du
vecteur de clonage.
27. Procédé pour préparer une cellule hôte selon la revendication 22, _caractérisé en ce qu'il comprend la transformation d'une cellule hôte à l'aide d'un vecteur de clonage d'acide désoxyribonucléique recombinant,
tel qu'il est préparé selon la revendication 26.
28. Procédé pour établir la carte de la molé-
cule d'acide désoxyribonucléique recombinant selon l'une
quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce
qu'il comprend: (a) la digesLion de l'acide désoxyribonucléique avec des endonucléases, enzymes de restriction, et la séparation des produits obtenus; (b) l'addition d'oligonucléotides marqués d'acide ribonucléique de virus de fièvre aphteuse, produits par digestion à l'aide de ribonucléase T1; et (c) l'identification des produits de digestion par l'endonucléase de restriction avec lesquels les
oligonucléotides T1 ont formé des hybrides.
29. Molécule d'acide désoxyribenucléique selon
l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisée
en ce qu'elle est préparée par le procédé selon la
revendication 25.
30. Vecteur de clonage d'acide désoxyribonucléique recombinant selon la revendication 21, caractérisé en ce
qu'il est préparé par le procédé selon la revendication 26.
31. Cellule hôte selon la revendication 22, caractérisée en ce qu'elle a été préparée par le procédé
selon la revendication 27.
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| EP0068693A2 (fr) * | 1981-06-16 | 1983-01-05 | Genentech, Inc. | Production d'un vaccin contre la fièvre aphteuse à partir d'antigènes entraits micro-biologiquement |
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1981
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- 1981-09-18 DE DE19813137300 patent/DE3137300A1/de not_active Withdrawn
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US4140763A (en) * | 1976-09-08 | 1979-02-20 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Vaccine for foot and mouth disease |
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Also Published As
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