Acide désoxyribonucléique synthétique et procédé pour
l'obtenir.
La présente invention concerne des molécules
d'acide désoxyribonucléique (ADN) contenant des séquences de polynucléotides construites artificiellement qui correspondent sensiblement à tout ou partie de l'acide ribonucléique
(ARN) du virus de la fièvre aphteuse et se rapporte, en particulier, à des séquences de polynucléotides codant pour
au moins une protéine. Elle concerne spécialement des molécules d'ADN comprenant des séquences de polynucléotides construites artificiellement codant pour l'ensemble ou une partie d'une ou plusieurs protéines existant dans le virus de la fièvre aphteuse (symbolisé ci-après par VFA) ou son précurseur ou une de ses modifications. De telles molécules d'ADN sont capables d'être exprimées sous forme d'un ou plusieurs polypeptides.
La fièvre aphteuse est l'une des maladies les plus virulentes et contagieuses des animaux d'élevage. Cette maladie est endémique dans différentes régions du monde et peut être observée dans de nombreux pays d'Afrique, d'Asie et d'Amérique du Sud où elle est combattue à des degrés divers par des campagnes d'immunisation. Les régions exemptes de cette affection ne le restent que par des mesures strictes de quarantaine à l'importation et par l'abattage des animaux lorsque la maladie apparaît.
Le virus de la fièvre aphteuse est un virus ARN appartenant au genre Aphtho virus de la famille des Picornaviridae (voir Cooper, P.D. et al., Intervirology, 10,
165-180, 1978). On connaît sept sérotypes de virus de la fièvre aphteuse, à savoir les sérotypes européens A, 0 et C, les sérotypes des territoires d'Afrique du Sud SAT 1, SAT 2 et SAT 3 et le sérotype Asie 1. On a pu identifier un certain nombre de sous-types antigénêtiquem e n t distincts dans chacun de ces sérotypes et du fait que ces sous-types sont tellement distincts, des vaccins de sous-types immunologiquement spécifiques sont nécessaires. Différents variants génétiquement distincts existent pour chaque sérotypes ou sous-types.
Le virus de la fièvre aphteuse comprend une chaîne
<EMI ID=1.1>
VP2, VP3 et VP4 qui constituent les protéines de la capside <EMI ID=2.1>
Strohmaier, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 85,
1640-1645, 1978; Bachrach, H.L. et al., Intervirology. 12,
<EMI ID=3.1>
poids moléculaire d'environ 26.0000, tandis que le poly- <EMI ID=4.1>
peptide VP4 a un poids moléculaire d'environ 8000 et il est généralement considéré qu'il existe environ 60 copies de chacun de ces polypeptides dans le virus. Les autres polypeptides traduits par l'ARN du virus ont probablement un rôle dans la réplication du virus.
La chaîne simple d'ARN du virus de la fièvre aphteuse a un poids moléculaire d'environ 2,6 x 106, ce qui est l'équivalent d'environ 8000 nucléotides, et est de polarité positive agissant comme modèle tant pour la traduction en polypeptides que pour la synthèse de l'ARN. L'un des produits de traduction primaires est une protéine dite P88 qui est ensuite scindée en les quatre protéines de la
<EMI ID=5.1>
ci-dessus, est susceptible de scission lorsque le virus intact est traité au moyen de trypsine, ce qui conduit à une diminution importante du pouvoir infectieux de la plupart des souches du virus de la fièvre aphteuse (Wild, T.F. et
<EMI ID=6.1>
par la trypsine peut aussi atténuer la capacité du virus à stimuler la production des anticorps neutralisants. Il
<EMI ID=7.1>
gène primaire capable d'induire une protection efficace contre l'infection par le virus de la fièvre aphteuse et, en
<EMI ID=8.1> produit l'anticorps neutralisant et assure une protection. efficace contre le virus (Laporte, J. et al., C. R. Acad. Se. Paris, t. 276 Série D, 339-3401, 1973;
Bachrach, H.L. et al., J. Immunology, 115, 1636-1641, 1975). La séparation des protéines naturelles de la capside du virus de la fièvre aphteuse, en particulier de la protéine
<EMI ID=9.1>
nécessaire d'entretenir des conditions très dénaturantes et est généralement considérée par les spécialistes comme nuisibles pour l'entretien du pouvoir immunogène optimal et la production d'un vaccin efficace.
Au moyen des techniques mises au point au cours des cinq dernières années, il est à présent possible d'introduire l'ADN codant pour des protéines non bactériennes dans des cellules bactériennes par l'intermédiaire d'un plasmide ou autre véhicule de clonage (voir, par exemple, Burrell, C.J., et al., Nature, 279, 43-47, 1979). En règle générale, la construction des molécules d'ADN recombinant comprend les stades suivants : obtenir l'ADN modèle codant pour la protéine désirée à partir du parent non bactérien et insérer ce modèle d'ADN hétérologue dans un véhicule de clonage, comme un plasmide bactérien, et ensuite transformer un hôte bactérien approprié à l'aide du plasmide modifié. Une discussion générale de la manipulation des gènes conduisant à la formation de l'ADN recombinant a été publiée par S. Cohen dans Scientific American, 233, 24-33, 1975.
Différents gènes non bactériens ont déjà été introduits et multipliés à l'intérieur de bactéries telles que Escherichia coli, et différentes protéines non bactériennes ont été exprimées par des bactéries suivant la technique de l'ADN recombinant, notamment l'hémagglutinin e des virus de l'influenza (Porter, A.G., et al., Nature, 282, 471-477, 1979) et la protéine du virus de l'hépatite B
(Burrell, C.J. et al., 1979, loc. cit.). Malgré les travaux considérables exécutés au cours des dernières années sur l'ADN recombinant, on manque encore de résultats se prêtant à une application immédiate et pratique, spécialement dans le domaine de l'ADN recombinant mettant en jeu la manipulation du matériel génétique viral.
La présente invention apporte la première description de la synthèse de polypeptides distincts sensiblement équivalents aux protéines de la capside des picornavirus naturels, en particulier aux protéines de la capside du virus de la fièvre aphteuse, ainsi que de la synthèse en série de différents peptides du virus de la fièvre aphteuse comme entités individuelles ou comme produits condensés de parties de deux protéines ou davantage. En outre, l'invention procure le moyen de synthétiser simultanément les protéines immunogènes normalement codées par différents variants du virus de la fièvre aphteuse sans exposer aux risques nombreux de la culture de ce virus.
Suivant l'un de ses aspects, l'invention a pour objet une molécule d'ADN comprenant une séquence de nucléotides correspondant sensiblement à tout ou partie de l'ARN du virus de la fièvre aphteuse ou à ses fragments biologiquement fonctionnels, comme défini ci-après. De préférence, la séquence de nucléotides code pour au moins un polypeptide du virus de la fièvre aphteuse. Une telle molécule d'ADN est susceptible d'être exprimée sous la forme d'un polypeptide reconnaissable comme correspondant sensiblement à une protéine du virus de la fièvre aphteuse. De préférence, la séquence de nucléotides code pour une protéine de structure
<EMI ID=10.1>
variante, peut coder pour l'ensemble des protéines de structure ou de la capside en contiguïté, ce qui permet de les synthétiser sous la forme d'un seul précurseur, par exemple P88, qui peut exiger une stabilisation par des inhibiteurs des enzymes tels que les protéases qui la décomposent en ses protéines constitutives. En variante, la
<EMI ID=11.1>
Suivant une autre variante, la séquence de nucléotides peut coder pour tout ou partie d'au moins deux protéines du virus de la fièvre aphteuse, dont chacune dérive d'un variant différent du virus de la fièvre aphteuse.
Suivant un aspect préféré, la séquence de nucléotides code pour une protéine du sérotype A ou O du virus de la fièvre aphteuse et plus avantageusement le sérotype A10 et, en particulier, la souche 61. En outre, la séquence de nucléotides peut comprendre des séquences de contrôle positionnées en position adjacente, ces séquences de contrôle dérivant soit de l'acide nucléique du virus de la fièvre aphteuse, soit d'une source hétérologue.
Suivant un autre aspect, l'invention a pour objet une molécule d'ADN recombinant comprenant un opéron qui
- comporte des séquences d'initiation et séquences de terminaison, comme défini ci-après, et une séquence de nucléotides codant en substance pour tout ou partie d'au moins une protéine du virus de la fièvre aphteuse, la séquence de nucléotides étant située entre les séquences d'initiation et séquences de terminaison de l'opéron.
L'invention a, en outre, pour objet un véhicule de clonage d'ADN recombinant capable d'exprimer tout ou partie d'une protéine du virus de la fièvre aphteuse comprenant un opéron qui comporte des séquences d'initiation et séquences de terminaison et une séquence de nucléotides codant sensiblement pour tout ou partie d'au moins une fraction du virus de la fièvre aphteuse, la séquence de nucléotides étant située entre les séquences d'initiation et séquences de terminaison de l'opéron.
Suivant un autre aspect, l'invention a pour objet une cellule hôte contenant un véhicule de cl onage d' ADN recombinant et/ou une molécule d'ADN recombinant comme défini ci-dessus.
L'invention a de plus pour objet un antigène pour stimuler la production d'anticorps contre le virus de la fièvre aphteuse chez un mammifère, qui comprend au moins un polypeptide suscitant l'immunité contre le virus de la fièvre aphteuse qui est préparé par expression d'une molécule d'ADN comme défini ci-dessus et qui est produit par une cellule hôte transformée par un véhicule de clonage d'ADN recombinant comme défini ci-dessus,
L'invention a par ailleurs pour objet un procédé pour préparer une molécule d'ADN codant sensiblement pour au moins un polypeptide du virus de la fièvre aphteuse suivant lequel :
(a) on isole de l'ARN monocaténaire du virus de la fièvre aphteuse;
(b) on prépare une première copie monocaténaire de l'ARN du virus de la fièvre aphteuse en ADN;
(c) on prépare une seconde chaîne simple d'ADN complémentaire de la première et fixée à celle-ci par des liaisons hydrogène pour obtenir une double chaîne d'ADN.
La double chaîne d'ADN ainsi obtenue peut être insérée dans un véhicule de clonage après digestion de celui-ci avec une endonucléase de restriction, les extré-mités libres du véhicule de clonage étant unies à la molécule d'ADN pour constituer un véhicule de clonage recombinant. Celui-ci, à son tour, peut être introduit dans une cellule hôte appropriée, par exemple par transformation.
Aux fins de l'invention, les termes utilisés ont les significations suivantes :
Nucléotide : unité d'ADN ou d'ARN comprenant un radical sucre (pentose), un phosphate et une base hétérocyclique azotée. La base est unie au radical sucre par le carbone glycosidique (carbone 1' du pentose) et la base caractérise le nucléotide. Les quatre bases d'ADN sont l'adénine (A), la guanine (G), la cytosine (C) et la thymine (T). Les quatre bases d'ARN sont A, G, C et l'uracile (U).
ADN recombinant : séquence d'ADN en double chaîne hybride comprenant au moins deux séquences de nucléotides d'ADN en double chaîne, la première séquence n'étant pas observée dans la nature en présence de la seconde séquence.
Véhicule de clonage : ADN en double chaîne non chromosomique capable de réplication après introduction dans un m icroorganisme unicellulaire.
Plasmide : véhicule de clonage provenant de virus ou de bactéries.
Gène de structure . séquence de nucléotides d'ADN qui code pour une séquence d'aminoacides caractéristique d'un polypeptide spécifique.
Séquences d'initiation : séquences de nucléotides d'ADN qui régulent l'initiation de la transcription ou traduction. Séquences de terminaison : séquences de nucléotides d'ADN auxquelles la transcription ou traduction cesse. Transcr iption : processus par lequel l'ARN polymérase est amenée à se mouvoir au long de la séquence d'ADN formant l'ARN messager.
Traduction : processus de production d'un polypeptide par un ARN messager.
Opéron : un ou plusieurs gènes de structure qui codent pour l'expression d'un polypeptide et qui sont précédés de séquences d'initiation et suivis de séquences de terminaison.
Expression : processus impliqué dans la production d'un polypeptide à partir d'un gène de structure.
Fragment biologiquement fonctionnel . molécule d'ADN qui code pour des déterminants antigéniques capables de susciter une réponse immunitaire chez un mammifère ou qui code pour une protéine ou partie de protéine qui est nécessaire pourla confirmation convenable d'un déterminant antigénique ou bien qui code pour une protéine ou une partie de celle-ci qui est importante pour le cycle vital du virus de la fièvre aphteuse in vivo et/ou in vitro.
L'invention est décrite davantage ci-après avec référence aux dessins annexés dans lesquels :
Fig. 1 est un schéma de la carte génétique de l'ARN du virus de la fièvre aphteuse et des protéines qui en dérivent; Fig. 2 est un schéma des cartes physiques des trois plasmides recombinants comparées à la carte génétique de l'ARN du virus de la fièvre aphteuse; Fig. 3 est un schéma de la région de structure de gènes de l'ARN du virus de la fièvre aphteuse et montre la partie VFA du plasmide combinant pFA61/t76 alignée avec la région de gènes de structure du virus; Fig. 4 à 7 sont des diagrammes des séquences d'ADN et d'aminoacides indiquées par des lignes épaisses à la Fig. 3:
Fig. 8 est un diagramme comparant les séquences <EMI ID=12.1>
de la fièvre aphteuse; Fig. 9 est un diagramme de la séquence de nucléotides C-terminale de VP3 et de la séquence de nucléo- <EMI ID=13.1>
pFA61/t76; Fig. 10 est un diagramme des séquences de r.ucléotides et d'aminoacides à la jonction de la région codant pour VP2 et VP3 dans le plasmide recombinant pFA61/t76 qui suit directement la séquence de la Fig. 5; Fig. 11 est un schéma de la région de gènes de structure de l'ARN de VFA et montre la partie VFA du <EMI ID=14.1>
gènes de structure de VFA; Fig. 12 est un diagramme de la séquence d'ADN et de la séquence d'aminoacides prévue de la région de gènes de structure de VFA insérée dans le plasmide recombinant pFA61/t76; Fig. 13 est un diagramme de la séquence d'ADN et de la séquence d'aminoacides prévue pour VP4, VP2, VP3 et
<EMI ID=15.1> Fig. 14 est un schéma de la construction du plasmide d'expression pXYl; Fig. 15 est un schéma de l'introduction d'une <EMI ID=16.1> Fig. 16 illustre la construction de plasmides d'expression; Fig. 17 illustre les produits protéiques et poids moléculaires des protéines obtenues par l'expression des plasmides montrés à la Fig. 16; Fig. 18 illustre les séquences d'aminoacides et de nucléotides. C-terminales des protéines montrées à la Fig. 17; Fig. 19 est un diagramme de la séquence de nucléotides de PFA61/t243 correspondant à l'extrémité 3' de l'ARN de VFA comprenant au moins une partie du rajout polyA.
La Fig. 1 est une carte simplifiée de l'ARN du virus de la fièvre aphteuse qui, comme déjà indiqué, a une longueur d'environ 8000 nucléotides. La traduction de l'ARN se fait de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3'. Comme pour de nombreuses molécules d'ARN messager, l'ARN de VFA contient une séquence d'acide polyadénylique à l'extrémité 3'. Il contient, en outre, une suite d'acide polycytidylique d'une longueur d'environ 100 à 200 nucléotides, suivant la souche de virus. La suite d'acide polycytidylique est située à environ 400 nucléotides de l'extrémité 5' de l'ARN
(Rowlands, D.J. étal., J. Virology, 26, 335-343, 1978).
L'ARN de VFA est traduit sous la forme d'une polyprotéine qui est scindée pendant la traduction en différents gros polypeptides appelés produits primaires et identifiés par la lettre "P" et un nombre. Ces produits primaires sont alors scindés, probablement par des protéases
<EMI ID=17.1>
existe des parties d'ARN de VFA qui ne codent pas pour une protéine, mais qui jouent un rôle important dans le cycle vital de VFA in vitro et/ou in vivo, par exemple qui influencent la viabilité du virus.
A partir de l'étude de la cinétique de la traduction de l'information virale en polypeptides, tant dans des cellules infectées par le virus que dans des systèmes synthétisant la protéine sans cellule, il a été possible de déduire l'ordre du génome viral de l'information génétique codant pour les polypeptides majeurs (Doel, T.R. et al.,
<EMI ID=18.1> J. Virol, 33, 59-68, 1980). A partir de ces études, il a été établi que les 550 premiers nucléotides de l'ARN de VFA, à partir de l'extrémité 5', ne paraissent pas coder pour un polypeptide quelconque. Les protéines P16 et P20a sont étroitement apparentées et contiennent le site d'initiation de la traduction de VFA, comme le montre le marquage exclusif par la N-formylméthionine au cours de l'analyse in vitro (Sanger, D.V. et al., 1980 loc. cit.). Le P88 est le produit primaire qui est scindé en VPl-4- A partir d'une évaluation des données connues, le gène pour VP a une longueur d'environ 700 nucléotides et doit se trouver dans la région délimitée par les positions des nucléotides 2300 et 3800.
Il existe différentes techniques pour préparer la molécule d'ADN recombinant conforme à l'invention, dont l'une comprend la synthèse d'une copie d'ADN en chaîne simple (cADN) de l'ARN purifié provenant d'un isolat de virus de fièvre aphteuse virulent complet au moyen d'une transcriptase inverse. Après que la chaîne d'ARN de départ a été dégradée, le cADN est converti en double chaîne (cADN dc) qui est ensuite soumis à un traitement visant à éliminer les boucles d'ADN qui peuvent s'être formées, par exemple au moyen d'une nucléase. Un autre moyen de préparer le cADN en double chaîne est la synthèse chimique suivant les techniques habituelles.
Lorsque le cADN en double chaîne a été produit, le stade suivant consiste dans son insertion dans un véhicule de clonage qui peut être, par exemple, un plasmide bactérien ou un bactériophage. Ce résultat peut être obtenu d'abord par scission de l'ADN du véhicule de clonage purifié à l'intervention d'une endonucléase de restriction comme PstI, qui scinde l'ADN en des sites où les nucléotides complé-mentaires sont agencés en symétrie palindromique. Le cADN en double chaîne de VFA peut être inséré ensuite et lié entre les extrémités libres du véhicule de clonage suivant l'un ou
<EMI ID=19.1>
peuvent être fixés à l'extrémité 3' du véhicule de clonage par un procédé dit du rajout homopolymère, qui consiste à utiliser une transférase terminale. De manière analogue, plusieurs nucléotides "C" sont ajoutés à l'extrémité 3' du cADN du VFA en double chaîne. Le véhicule de clonage augmenté du rajout et le cADN en double chaîne sont alors mélangés ensemble, à la suite de quoi les extrémités cohésives formées par le placement du rajout se soudent les unes aux autres.
Il existe différentes variantes au lieu de l'adaptation d'un rajout. L'une est la digestion du cADN en double chaîne avec des endonucléases formant des terminaisons franches ou cohésives. Les terminaisons franches peuvent être rendues cohésives par digestion avec une exonucléase. Dans un autre procédé, les extrémités franches peuvent être unies directement au moyen d'une ADN ligase. Suivant un autre procédé encore, des oligonucléotides synthétiques peuvent être unis à du cADN en double chaîne à extrémités franches et les nouvelles extrémités peuvent être rendues cohésives par digestion avec une exonucléase ou une endonucléase, avant la liaison à un véhicule de clonage convenablement linéarisé.
Lorsque le cADN de VFA en double chaîne a été soudé à l'ADN du véhicule de clonage, un hôte approprié, par exemple une bactérie, est transformé à l'aide du véhicule de clonage recombinant afin de permettre que l'hôte exprime le cADN en double chaîne de VFA et produise ainsi un ou des polypeptides manifestant le pouvoir antigène de VFA.
On connaît différentes combinaisons hôte-véhicule de clonage qui pourraient être utilisées pour l'expression des protéines de VFA. Par exemple, des véhicules de clonage utiles sont des plasmides bactériens comme pAT153,
(Twigg, A.J., Nature, 283, 216-218, 1980; procuré par le Prof. D. Sherratt, Université de Glasgow, Ecosse), pBR322,
(Sutcliffe, J.G. Cold Spring Harbour Symposium for Quantitative Biology, 43, 77-90, 1978, procuré par le Dr. H. Boyer, University of San Francisco, E.U.A.), et d'autres plasmides d'E. coli et plasmides d'hôtes plus divers. Des bactériophages comme les nombreux dérivés du phage � pourraient convenir aussi. Des hôtes qui peuvent être utilisés sont notamment des bactéries comme des souches de E. coli K. 12, par exemple E. coli HB101, (Boyer, H.W. et al., J. Mol. Biol., 41, 459-472, 1969; procuré par le Dr. H.
Boyer, University of San Francisco, E.U.A.), E. coli X1776, (Curtiss, R. et al., Ann Report Dept. of Microbiology University of Alabama, 1976, 96-106, procuré par le Dr. R. Curtiss III, University of Alabama, Birmingham, E.U.A.), E. coli X2282 (procuré par le Dr. R. Curtiss III) et E. coli MRC1, (procuré par le Dr. S. Bremer, University of Cambridge, England), des souches de Bacillus subtilis et Pseudomonas, de même que des levures et autres champignons et autres organismes unicellulaires. Il est cependant à prévoir que tous les hôtes ne soient pas également efficaces.
Dans chaque véhicule de clonage, divers sites peuvent être accessibles pour l'insertion de la copie d'ADN en double chaîne de VFA, chaque site étant désigné par l'endonucléase de restriction qui scinde l'ADN. Par exemple, l'enzyme PstI coupe le plasmide pAT153 dans le gène codant pour la résistance à la pénicilline. Il existe différentes autres endonucléases qui peuvent être utilisées, notamment HindIII et EcoRI.
La sélection du site sur le véhicule de clonage pour l'insertion du cADNdc du VFA peut être régie par différents facteurs, par exemple la dimension du polypeptide à exprimer et l'emplacement des séquences d'initiation et de terminaison. Par conséquent, tous les sites peuvent ne pas être également efficaces pour un polypeptide donné. Le choix du site peut être régi aussi par le procédé de dépistage initial pour détecter les recombinants, par exemple, comme indiqué, l'enzyme PstI coupe le plasmide pAT153 dans le gène codant pour la résistance à l'ampicilline, de sorte que des colonies de transformants manifestant de la résistance à la tétracycline mais de la sensibilité à l'ampicilline sont susceptibles de contenir au moins une certaine quantité d'ADN complémentaire en double chaîne de VFA.
Il est essentiel que l'ADN complémentaire en double hélice de VFA inséré dans le véhicule de clonage puisse être lu dans la phase correcte. A cette fin, il peut être nécessaire d'insérer des nucléotides supplémentaires, par exemple entre les points de départ de transcription et de traduction du fragment d'ADN complémentaire en double chaîne de VFA dont l'expression est désirée. L'addition de ces nucléotides ne peut évidemment pas former une séquence de nucléotides qui pourrait interrompre la traduction.
L'expression de l'ADN complémentaire en double chaîne de VFa, qui a été inséré dans un véhicule de clonage qui, à son tour, peut être utilisé pour transformer une cellule hôte appropriée, peut être décelée par l'apparition d'une fonction spécifique pour la protéine, c'est-à-dire l'activité immunologique dans le cas de VFA. Différents procédés sont applicables, par exemple le procédé de sélection d'une colonie essentiellement immunologique décrit par S. Eroome et W. Gilbert dans Proc. Nat. Acad. Sci . ,
1978, 75, 2746-2749. Une variante, qui est une technique un peu plus simple, consiste à injecter à un animal de laboratoire l'extrait bactérien brut provenant d'une culture de bactéries transformées à l'aide d'un véhicule de clonage convenablement conçu et à observer la formation d'anticorps appropriés.
Une seconde variante consiste à exécuter une immunoprécipitation d'un extrait brut des cellules bactériennes. Un autre procédé encore est la "technique Maxicell" décrite par Sancar et al., dans J Bact., 1979, 137, 692-693.
La nature du polypeptide produit en conséquence de l'expression par l'hôte de la molécule d'ADN recombinant de l'invention dépend du point d'insertion dans l'ADN du véhicule de clonage, de sorte qu'en pratique il est possible de former un polypeptide précurseur qui comprend un polypeptide codé par l'ADN complémentaire en double chaîne de VFA et un polypeptide supplémentaire codé par l'ADN du véhicule de clonage. Par exemple, si le plasmide pAT153 est coupé par l'enzyme PstI, un polypeptide précurseur comprenant une partie de la pénicillinase et le polypeptide codé par l'ADN complémentaire en double chaîne de VFA peuvent s'exprimer. Le polypeptide précuseur peut être ensuite scindé de manière que le polypeptide de VFA désiré soit séparé de la séquence d'aminoacides superflue.
La coupure initiale est effectuée d'habitude à l'extérieur de l'hôte après la collecte de la culture microbienne suivant des techniques connues du spécialiste. La coupure peut être nécessaire pour que le produit d'expression de VFA puisse exercer l'activité désirée, mais pendant la collecte de la culture microbienne, le fait qu'une séquence d'aminoacides superflue est liée au polypeptide de FVA désiré peut aider à empêcher la dégradation du produit d'expression par des enzymes endogènes. En variante, la coupure peut être effectuée à l'intérieur de l'hôte, ce qui peut être obtenu par insertion dans le véhicule de clonage d'un ADN codant pour les enzymes de coupure désirés.
La production d'un produit de fusion d'un polypeptide codé par l'ADN complémentaire en double chaîne de VFA et d'une fraction, par exemple, de pénicillase, peut augmenter la stabilité de la protéine hybride dans E. coli et même augmenter le pouvoir immunogène de la protéine de VFA.
En variante, les séquences de nucléotides appropriées provenant, par exemple, de l'ARN du VFA peuvent être insérées avant l'ADN complémentaire en double chaîne de VFA pour assurer que cet ADN complémentaire en double chaîne de VFA puisse être exprimé seul et non sous forme de produit de fusion avec un polypeptide de l'hôte.
Lorsque les transformants contenant au moins une certaine quantité d'ADN complémentaire en double chaîne de VFA ont été identifiés, comme indiqué ci-dessus, l'ADN recombinant du véhicule de clonage est purifié, puis est soumis à l'analyse pour la détermination de la quantité d'ADN complémentaire en double chaîne de VFA qui a été insérée. A cette fin, l'ADN recombinant de véhicule de clonage est traité à l'aide de diverses endonucléases de restriction, par exemple EcoRI, PstI, Sali, BglII, BamHl, HindIII et Hinfl, et les produits de digestion peuvent être analysés par électrophorèse sur gel.
En utilisant ces résultats et ceux obtenus quand on soumet les oligonucléotides produits par Tl, formés par digestion de l'ARN de VFA par la nucléase Tl qui est une ribonucléase, à l'hybridation avec les produits isolés de la digestion de l'ADN recombinant par la nucléase de restriction, on peut établir des cartes de l'ADN complémentaire en double chaîne de VFA inséré dans le véhicule de clonage qui sont semblables à celles de la Fig. 2. A partir de ces cartes, il est possible de sélectionner le recombinant qui contient le gène de VFA désiré, <EMI ID=20.1>
Suivant un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé pour établir la carte de la molécule d'ADN recombinant tel que défini ci-dessus, suivant lequel :
(a) on met l'ADN à digérer avec des endonucléases de restriction et on sépare les fragments;
(b) on ajoute des oligonucléotides marqués d'ARN <EMI ID=21.1>
(c) on identifie les produits de la digestion par les endonucléases de restriction avec lesquels les oligo- <EMI ID=22.1>
Les différentes molécules d'ADN peuvent être utiles comme moyens d'investigation pour le diagnotic in vitro de la présence de VFA dans des échantillons biologiques et, en particulier, peuvent être utilisées pour déterminer le sérotype ou sous-type provoquant une apparition de la fièvre aphteuse. A cette fin, les molécules d'ADN peuvent être marquées de manière connue à l'aide d'un isotope radio-actif. En outre, le produit d'expression du véhicule de clonage recombinant peut être utilisé pour le diagnotic sérologique et dans la préparation de vaccins simples ou multivalents contre la fièvre aphteuse, suivant des procédés classiques pour la préparation des vaccins. De tels vaccins sont efficaces pour faire apparaître des anticorps chez les animaux vaccinés et les protéger ainsi contre la fièvre aphteuse.
Suivant un autre aspect, l'invention a pour objet un vaccin pour stimuler la production d'anticorps contre le virus de la fièvre aphteuse chez un mammifère, qui comprend au moins une protéine manifestant un pouvoir immunogène contre VFA qui est produite par une cellule hôte comme défini ci-dessus, outre un excipient vétérinairement acceptable.
Suivant un autre aspect encore, l'invention a pour objet un procédé pour stimuler la production d'anticorps contre le virus de la fièvre aphteuse chez un mammifère, suivant lequel on administre une quantité non toxique et immunologiquement efficace d'un vaccin tel que défini ci-dessus. Par "quantité non toxique immunologiquement efficace", il convient d'entendre une quantité de protéine manifestant un pouvoir immunogène contre le virus de la fièvre aphteuse qui est suffisante pour susciter assez d'anticorps chez un mammifère pour que celui-ci, s'il vient en contact avec une forme virulente du virus de la fièvre aphteuse après la vaccination, ne succombe pas à l'affection, mais qui n'est pas toxique pour le mammifère.
D'autres particularités et caractéristiques de l'invention sont décrites dans les exemples ci-après, qui sont présentés à titre uniquement illustratif et non limitatif du cadre de l'invention.
EXEMPLE 1.-
Préparation de l'ARN de VFA.
On introduit environ 10 ml d'une récolte récente de VFA type A10 (souche A61) (s'obtenant gratuitement sur demande au Animal Virus Research Institute, Pirbright, Angleterre, en satisfaisant aux conditions légales des différents pays) dans du milieu d'Eagle dans chacune de
10 fioles de Roux contenant des monocouches d'environ
108 cellules BHK21. Après agitation modérée pendant 30 minutes, on décante le milieu et on introduit 20 ml de milieu frais dans chaque fiole. Après que l'infection par le virus a détruit les monocouches de cellules (3 à 4 heures), on décante le milieu et on sépare les débris cellulaires par centrifugation à 12.000 g pendant 15 minutes à 4[deg.]C. On rassemble le virus ensuite en un culot par centrifugation à
90.000 g pendant 1 heure à 4[deg.]C.
On remet le culot de virus en suspension dans 2 ml de tampon TNE [10 mM en chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane, (pH 7,5), 150 mM en NaCl
<EMI ID=23.1>
limpide à 1,0% poids/volume de dodécylsulfate de sodium
(DSS) et on le dépose sur un gradient formé au préalable
(saccharose de 15 à 45% poids/volume) dans du tampons TN
(100 mM en chlorhydrate de tris(hydroxyéthyl)aminométhane, pH 7,6, 100 mM en NaCl) et on exécute la centrifugation à
100.000 g pendant 2 heures à 10[deg.]C. On surveille des fractions (1 ml) à 260 nm et on soumet les fractions contenant du virus à l'extraction une fois avec un volume égal de phénol:chloroforme (1:1), puis on précipite la phase aqueuse par addition de 2 volumes d'éthanol et on met à incuber jusqu'au lendemain à 20[deg.]C. On rassemble le précipité d'ARN par centrifugation à 5000 g pendant 30 minutes à 4[deg.]C.
On rejette le liquide surnageant, on égoutte le culot, puis on le dissout dans 0,5 ml de tampon TNES (10 mM en chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane, pH 7,6, 150 mM en NaCl, 1 mM en EDTA et à 0,2% poids/volume de DSS). On dépose la solution sur un gradient de saccharose formé au préalable (5 à 25%) dans du tampon TNES et on exécute la centrifugation à
<EMI ID=24.1>
fractions (0,5 ml) contenant de l'ARN sédimentant à 35 s, on les extrait une fois au phénol-chloroforme, on les précipite par l'éthanol et on redissout les solides comme décrit ci-dessus pour le virus. On précipite la solution résultante par l'éthanol et finalement on redissout les solides dans 0,05 ml d'eau bidistillée.
Synthèse de l'ADN complémentaire en double chaîne (cADNdc).
<EMI ID=25.1>
provenant de Collaborative Research) dans un volume final de
100 ni) contenant du dithiothréitol 0,4 mM, du MgCl2 8 mM, du chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane, pH 8,1,
32
<EMI ID=26.1>
phosphate à 2,5 Ci/mmole provenant de Radiochemical Centre, Amersham), du dTTP 0,2 mM (d-thymidinetriphosphate), du dCTP 0,2 mM (d-cytidinetriphosphate), du dGTP 0,2 mM (d-guano-
<EMI ID=27.1>
transcriptase inverse (procurée par Dr. J. Beard, Life Sciences Inc., Floride). On arrête la réaction par addition d'EDTA (20 mM) et de DSS (0,2% p/v). On dépose un échantillon (2%) de ce mélange après arrête de la réaction en gouttes sur des disques de papier-filtre DE81 de 2,5 cm
(Société Whatman). On les lave abondamment avec du Na2HP04 à 5% (p/v), puis brièvement (5 minutes) à l'eau distillée avant de les sécher et de les passer sur le compteur à scintillations. On peut déduire des résultats un rendement
<EMI ID=28.1>
reste du mélange de réaction au moyen du système phénol-chloroforme et on le précipite à l'éthanol comme décrit ci-dessus, mais en ajoutant de l'acétate de sodium jusqu'à 0,2 M avant l'addition de l'éthanol. On dissout le
<EMI ID=29.1>
à incuber à 70 *C pendant 20 minutes pour éliminer le modèle, à savoir l'ARN de VFA. On neutralise la solution à l'acide acétique et on sépare l'ADN complémentaire à partir de l'ARN dégradé par passage sur une colonne (100 mm x 15 mm) de perles de résine phénol-formaldéhyde dans le chloroforme. On met le culot desséché à nouveau en suspension jusqu' à un
<EMI ID=30.1>
en dithiothréitol, 10 mM en MgCl2, 0,4 mM en dCTP, 0,4 mM en
32
dGTP, 0,4 mM en dATP (5,5 Ci/mmole CaPj-dATP, Radiochemical Centre, Amersham), 0,4 mM en dTTP et contient 36 unités AMV de transcriptase inverse. Après 4 heures d'incubation à
45[deg.]C, on arrête la réaction par addition d'EDTA (20 mM) et de DSS (0,2% p/v). On extrait le mélange au moyen du système phénol-chloroforme, on ajoute du NaCl jusqu'à 0,2 M et on précipite le mélange au moyen de 2 volumes d'éthanol par repos jusqu'au lendemain à -20[deg.]C. On remet le culot desséché
<EMI ID=31.1>
comme entraîneur, on précipite à l'éthanol la substance du pic exclu. L'analyse sur disque de papier DE81, comme décrit précédemment, indique que la synthèse de la seconds chaîne atteint environ 60% du rendement théorique maximum. On remet le culot desséché .de la précipitation par l'éthanol en
<EMI ID=32.1>
échantillon (A) à -20'C, tandis qu'on met le reste (échan-
<EMI ID=33.1>
Société Sigma) pendant 30 minutes à 37*C. On arrête la réaction par extraction avec le système phénol-chloroforme et on précipite la substance de la phase aqueuse par l'éthanol. On remet le culot desséché en suspension dans,
<EMI ID=34.1>
pour éliminer les boucles de l'ADN complémentaire en double chaîne, on chauffe une petite quantité (2%) des échantil-
<EMI ID=35.1>
puis on refroidit les mélanges à 60[deg.]C et on y ajoute à divers moments (0; 0,25; 1 et 14 heures) 3 unités de SI
<EMI ID=36.1>
résistance à la nucléase SI par fixation sur disque de papier DE81 comme décrit ci-dessus. Les résultats prouvent que plus de 53% de l'échantillon A sont résistants à la digestion par la nucléase SI contre 2% de l'échantillon B, si les deux échantillons sont mis à incuber avec la nucléase Sl immédiatement après refroidissement jusqu'à 60[deg.]C. Si la nucléase SI est ajoutée 15 minutes après que les échantil-
<EMI ID=37.1>
81% et 15%, respectivement. Dès lors, le traitement initial par la nucléase SI a effectivement coupé les boucles existant après la synthèse de la seconde chaîne.
Une estimation de la dimension des molécules dans l'échantillon B par électrophorèse sur gel d'agarose indique qu'elles se répartissent entre des copies en pleine longueur
<EMI ID=38.1>
de 200 pb, avec une valeur moyenne de 2000 à 4000 pb. Rajout homopolymère sur plasmide et ADN complémentaire en double chaîne.
(a) Rajout dG sur le vecteur.
<EMI ID=39.1>
plasmide pAT153, à digérer avec l'endonucléase PstI dans les conditions recommandées par le fournisseur de l'enzyme
(Société Boehringer). On arrête la réaction par addition d'acétate de sodium jusqu'à 0,3 M et on exécute la préci-pitation par l'éthanol. On remet le culot desséché en
<EMI ID=40.1>
(200 mCi[8<3>-H]-dGTP/mmole). On ajoute au mélange 2 fil
(38 unités) de transférase terminale (TT) et on met le
<EMI ID=41.1>
tillons après 2,5, 5 et 10 minutes. Dans chaque cas, on arrête la réaction par refroidissement au bain de glace et addition d'EDTA jusqu'à 20 mM. L'analyse par précipitation à l'acide trichloracétique d'un échantillon de 5 fil sur chaque mélange montre que l'incorporation du <3>H dGMP ne se poursuit pas après 2,5 minutes et que la longueur moyenne du rajout homopolymère est à ce moment d'environ 25 nucléotides. On dilue le reste de l'échantillon de 2,5 minutes à
<EMI ID=42.1>
(hydroxyméthyl)aminométhane, pH 8,0 et 1 mM en EDTA) et on l'extrait une fois avec un volume égal de phénol saturé en TE. On extrait la phase aqueuse à quatre reprises à l'éther,
<EMI ID=43.1>
-10[deg.]C. On estime que la concentration en ADN de cette solu- <EMI ID=44.1>
(b) Rajout dC sur ADN complémentaire en double chaîne.
<EMI ID=45.1>
de'boeuf et 0,5 mM en <3>H dCTP (600 mCi[5-<3>H]-CTP/mmole) avec
<EMI ID=46.1>
5 minutes et on détermine l'incorporation par précipitation <EMI ID=47.1>
chacune. Cette analyse indique que la longueur moyenne du rajout homopolymère est d'environ 70 nucléotides après 2 minutes et 160 nucléotides après 5 minutes. On rassemble les deux aliquotes, on les extrait une fois au phénol et quatre fois à l'éther, puis on les précipite par l'éthanol,
<EMI ID=48.1>
Transformation avec du plasmide resoudé et de l'ADN complémentaire en double chaîne.
<EMI ID=49.1>
taire en double chaîne à rajout dC (0,2 à 0,4 pmole) à 65[deg.]C pendant 30 minutes dans 100 ^il de tampon TNE (10 mM en chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane, pH 8,0,
200 mM en NaCl et 1 mM en EDTA). On abaisse la température d'incubation régulièrement jusqu'à 20[deg.]C en 4 heures, puis on
<EMI ID=50.1>
manière qu'elle soit finalement 15 mM en Tris-HCl, pH 7,5,
100 mM en NaCl, 10 mM en MgCl2, 10 mM en CaCl2 et 0,5 mM en
<EMI ID=51.1>
On prépare une culture de E. coli HB101 convenant pour la transformation en inoculant 1 ml d'une culture en phase fixe dans 60 ml de bouillon L (1% de tryptone Bacto Difco, 0,5% d'extrait de levure Bacto Difco et 0,5% de NaCl, pH 7,2) et en agitant le mélange à 37[deg.]C pendant environ
<EMI ID=52.1>
suspension dans 25 ml de MgCl2 0,1 M à 0[deg.]C et on les centrifuge à nouveau. On remet le culot en suspension dans 2 ml de
<EMI ID=53.1> pendant 30 minutes. On mélange doucement environ 0,2 ml d'une telle culture de cellules convenant pour la transformation avec 0,1 ml de pAR153/cADNdc resoudé et on laisse reposer le mélange pendant encore 30 minutes à 0*C, puis 2 minutes à 42*C et enfin 30 minutes à 0*C. On ajoute alors 1 ml de bouillon L et on met le mélange de transformation à incuber pendant 25 minutes à 37[deg.]C. On étale ensuite des échantillons de 0,1 ml du mélange sur des plaques L-Tc
<EMI ID=54.1>
cline de la Société Sigma) et on met les plaques à incuber à
37[deg.]C. A partir des dix plaques, on recueille 150 colonies résistant à la tétracycline qui sont pour environ 87% sensi-
<EMI ID=55.1>
l'insertion de l'ADN complémentaire au site PstI de pAT153. Préparation à grande échelle du plasmide recombinant.
On cultive en masse les transformants contenant les plasmides en introduisant par inoculation 10 ml de culture non agitée dans 500 ml de bouillon L et en agitant le
<EMI ID=56.1>
atteigne environ 1,0. On ajoute ensuite du chloramphénicol
(Société Sigma) jusqu'à 0,1 mg par ml et on agite les cultures à 37[deg.]C jusqu'au lendemain. Après cette multiplication, on rassemble les cellules en un culot par centrifugation à
5000 g pendant 5 minutes à 4[deg.]C. On désinfecte le liquide surnageant et on le rejette, puis on remet le culot de cellules en suspension dans 12 ml de tampon R [50 mM en chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (pH 8,0),
40 mM en EDTA et à 25% de saccharose]. On ajoute du lysosyme et de l'EDTA jusqu'à 1,4 mg par ml et 60 mM respectivement et on met la suspension à reposer sur de la glace pendant 5 minutes. A 16 ml de cette suspension, on ajoute 30 ml de mélange de Triton (à 0,1% de Triton X-100, 62,5 mM en EDTA, <EMI ID=57.1>
pH 8,0) et on laisse reposer le mélange sur de la glace pendant environ 10 minutes ou jusqu'à ce qu'il devienne visqueux. On clarifie le mélange ensuite par centrifugation
<EMI ID=58.1>
ment le liquide surnageant et on ajoute 0,95 g de chlorure de césium et 0,1 ml d'une solution à 10 mg par ml de bromure d'éthidium par ml. On centrifuge à 12.000 g dans un rotor
<EMI ID=59.1>
des plasmides par fluorescence au rayonnement ultraviolet de grande longueur d'onde et on la recueille à la seringue en perçant latéralement le tube. On centrifuge l'ADN de plasmide jusqu'à l'équilibre dans un second gradient chlorure de césium/bromure d'éthidium. On extrait la bande résultante à quatre reprises avec de l'isopropanol saturé en chlorure de sodium et en eau, puis on précipite l'ADN par l'éthanol, on le redissout dans du milieu TE et on le reprécipite. On
<EMI ID=60.1>
Tracé physique de la carte des plasmides recombinants à l'aide d*endonucléases de restriction.
On acquiert les endonucléases de restriction EcoRI, PstI, Sali, BglII et Small de la Société Boehringer; BamHI, HindIII, HinfI, AvaI, Xbal et HincII de la Société Bethesda Research Laboratories et KpnI de la Société New England Biolabs. On met l'ADN de plasmide recombinant purifié à digérer avec ces enzymes dans des conditions de réaction spécifiées par les fabricants. On soumet les produits de digestion à l'analyse par électrophorèse soit dans de l'agarose à 1%, soit dans du gel d'acrylamide à 7% et on les visualise par coloration au bromure d'éthidium et fluorescence dans l'ultraviolet. On utilise comme marqueurs pour la dimension de l'ADN de bactériophage lambda digéré par HindIII (Boehringer) et du plasmide pAT153 digéré par HinfI.
Orientation et repérage d'ADN de VFA inséré dans les plasmides au moyen des oligonucléotides provenant du traitement du
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effectuant une électrophorèse sur gel à deux dimensions. On marque les oligonucléotides avant l'électrophorèse suivant le procédé de Harris (T J R Harris; Nucleic Acids Research,
<EMI ID=62.1>
1 unité de RNase Tl ou bien on les isole d'un gel bidimensionnel puis on les marque en position terminale. Dans le dernier cas, on soumet un produit de digestion de RNase Tl
<EMI ID=63.1>
T J R Harris & F Brown, 1978 loc. cit.) à la séparation par électrophorèse sur gel à deux dimensions et on effectue une
<EMI ID=64.1>
Dans chaque mode opératoire, on élue les oligonucléotides des morceaux de gel suivant le procédé d'écrasement et d'imbibition (A Maxam & W Gilbert: Proceedings of the National Academy of Sciences, E.U.A., 74, 560-564, 1977). L'ordre des oligonucléotides dans le génome est décrit par T J R Harris, K J H Robson & F Brown (J General Virology,
1980, sous presse).
On met l'ADN recombinant purifié à digérer avec des endonucléases de restriction, on sépare les produits sur un gel d'agarose à 1%, puis on les transfère sur un filtre nitrocellulosique suivant le procédé de Southern
(E M Southern: J Molecular Biology, 98, 503-513, 1975). On met le filtre à préincuber dans du tampon d'hybridation (à
40% de formamide, 0,4 M en NaCl, 10 mM en acide pipéra-zine-N,N'-bi�(2-éthanesulfonique)-NaOH, pH 6,4 (PIPES-NaOH,
<EMI ID=65.1>
0,04% de Ficoll [haut polymère synthétique de saccharose et d'épichlorhydrine] à 0,04% de polyvinyl pyrrol idone 400 et 0,04% d'albumine de boeuf) à 50 [deg.]C pendant 2 heures dans un sac en matière plastique scellé avant d'ajouter les oligonucléotides de RNase Tl marqués (75 à 150.000 coups par
<EMI ID=66.1>
milieu 2xSSC (8x250 ml en 6 heures), on le sèche à l'air et on en effectue l'autoradiographie à -70*C sur de la pellicule radiographique Fuji avec écran intensifiant. Résultats.
Les cartes physiques des trois plasmides recombinants, pFA61/t206, pFA61/t243 et pFA61/76, de même que leur alignement et la correspondance avec les gènes de VFA, déduits en application des procédés ci-dessus, sont données à la Fig. 2.
L'orientation du plus gros recombinant, à savoir pFA61/t206 qui contient une séquence d'environ 5800 paires de nucléotides correspondant à environ 73% de la séquence d'ARN de VFA, est déterminée d'abord au moyen d'oligonucléotides de ribonucléase Tl provenant de l'ARN du virus et dont la carte a été préalablement établie (Harris et al.,
1980 loc. cit.) Les oligonucléotides de Tl n* 3, 4 et 20 et
27 sont particulièrement utiles à cette fin en raison de la précision (indiquée à la Fig. 2) avec laquelle leur position dans l'ARN de VFA est connue. L'alignement des autres r�combinants (par exemple pFA61/76) par rapport au recombinant pFA61/t206 et à l'ARN de VFA se détermine par traçage de la carte des fragments d'endonucléases de restriction des recombinants et par hybridation avec des oligoribonucléo tides de Tl provenant de l'ARN du virus.
Deux des recombi-nants montrés à la Fig. 2 contiennent de manière évidente l'information génétique pour différentes protéines du virus
<EMI ID=67.1>
orientation pour l'expression d'un polypeptide consistant en un produit de fusion de la partie N-terminale de la �-lactamase codée par le plasmide et d'un polypeptide déterminé par VFA .
a) EXPRESSION.
Construction d'un vecteur d'expression, pXYl.
On exécute une préparation de plasmide recombinant à grande échelle de pOP 203-13 (à obtenir chez Forrest Fuller, Harvard University, E.U.A.) en appliquant les tech-
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plasmide pAT153 à digérer avec 5 unités d'EcoRI et 5 unités de HindIII, comme ci-dessus. On fait passer les deux échantillons d'ADN alors sur un gel d'agarose. On découpe hors du gel d'agarose le fragment d'ADN de 0,5 kb (kilopaire de bases) de pOP 203-13 et le fragment d'ADN de 3,6 kb de pAT153 et on en exécute l'extraction suivant Vogelstein et Gillespie, Proc. Nat. Acad. Sci., 76, 615-619, 1979. On mélange les fragments d'ADN purifié et on en effectue la liaison au moyen de 0,1 unité d'ADN ligase T4 (Miles) pen-
<EMI ID=69.1>
parée comme ci-dessus) et on étale les cellules sur des
<EMI ID=70.1>
par ml d'ampicilline (Société Sigma)] et on met le tout à incuber à 37*C jusqu'au lendemain. On obtient de nombreux recombinants dont on caractérise l'un plus en détail en traçant la carte de restriction et qu'on désigne pXYl
(Fig. 14). Les fragments d'ADN complémentaire en double
<EMI ID=71.1>
peuvent conduire à l'expression d'une protéine hybride consistant en les premiers huit aminoacides de � -galactosidase, deux aminoacides du site EcoRI et un certain nombre d'aminoacides codés par le fragment d'ADN complémentaire en double chaîne de VFA introduit. Les protéines hybrides ainsi obtenues sont régies par l'opéron lac. La transcription peut être induite (accrue) par addition de
<EMI ID=72.1>
propyle) lorsque le plasmide recombinant se trouve dans une bactérie hôte contenant une quantité suffisante d'un répresseur protéique spécifique. Ceci peut être obtenu par intro-
<EMI ID=73.1>
bactérie hôte (voir Henning et al., Proc. Nat. Acad. Sci..
76, 4360-4364, 1979).
b) Introduction de l'ADN copié en double chaîne du virus de <EMI ID=74.1>
<EMI ID=75.1>
ci-dessus à digérer avec 6 unités d'EcoRI et 1 unité de PstI pendant 1 heure à 37[deg.]C. On obtient ainsi une digestion complète par EcoRI et une digestion qui n'est que partielle par PstI. On isole sur gel d'agarose, comme décrit précédemment, le produit de digestion partielle de 4,0 kb contenant tout l'ADN complémentaire inséré. On ajoute,le produit
<EMI ID=76.1>
2 unités d'EcoRI et de 2 unités de PstI) et on unit les fragments d'ADN ensemble par incubation avec de l' ADN
<EMI ID=77.1>
l' ADN pour transformer des cultures convenables d'E. coli HB101 qu'on met ensuite à croître sur des plaques type L-Tc <EMI ID=78.1>
cline). On obtient de nombreux recombinants qui sont sensibles à l'ampicilline, ce qui indique l'insertion d'un
<EMI ID=79.1>
davantage un tel plasmide recombinant en traçant la carte de restriction et on lui attribue la désignation pWRL 1000
(voir Fig. 15). Ce plasmide contient le promoteur lac et les séquences d'ADN complémentaires de VFA codant pour P88 dans l'orientation correcte.
<EMI ID=80.1>
Pour obtenir l'expression des séquences de VFA, il est nécessaire d'éliminer les segments d'ADN séparant l'ADN
<EMI ID=81.1>
pWRL 1000 purifié à digérer avec 10 unités de SacII et on effectue une précipitation par l'éthanol. On redissout l'ADN sec dans 0,1 ml de tampon (0,1 M en NaCl, 0,005 M en MgCl2, 0,005 M en CaCl2, 0,02 M en chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane, pH 8,1, 0,001 M en EDTA) et on le fait réagir avec 0,2 unité de nucléase Bal 31 (BRL) à 18 "C pendant 15 minutes. On arrête la réaction par addition de
<EMI ID=82.1>
élimine en moyenne 300 paires de base d'ADN des extrémités de l'ADN en double chaîne linéaire. Après précipitation par l'éthanol, on met l'ADN à digérer avec 5 unités d'EcoRI et on effectue une nouvelle précipitation par l'éthanol. On
<EMI ID=83.1>
[(0,06 M en chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane, pH 7,5, 0,008 M en MgCl2 et 0,2 mM en dATP, en dTTP, en dCTP et en dGTP , 0,01 M en P-mercaptoéthanol, 1 mM en ATP et contenant 1,4 unité d'ADN polymérase E. coli (gros frag-
<EMI ID=84.1>
10 minutes. On condense les extrémités franches du plasmide linéaire ensemble au moyen de 0,4 unité d'ADN ligase T4
<EMI ID=85.1>
On obtient un certain nombre de recombinants sur des plaques type L-Tc. On caractérise l'un des recombinants par le tracé de la carte de restriction et on lui donne la désignation
<EMI ID=86.1>
révèle avoir régénéré un site EcoRI à la jonction du promoteur lac et des séquences d'ADN complémentaire de VFA. Les protéines codées par le plasmide, examinées sur la souche AB2480 sensible à l'ultraviolet suivant la "technique Maxicell" (Sancar et al., J.Bact., 137, 692-693, 1979) montrent que pWRL 1004 synthétise de grosses protéines
(50.000 daltons) codées par l'ADN complémentaire de VFA.
d) Construction de plasmides d'expression supplémentaires.
<EMI ID=87.1>
<EMI ID=88.1>
<EMI ID=89.1>
nant une séquence reconnue par EcoRI).. L'introduction du "chaînon" EcoRI (provenant de Collaborative Research) se traduit par l'introduction d'un codon "stop" à une distance
<EMI ID=90.1>
"Maxicells".
<EMI ID=91.1>
de PvuII et 6 unités de PstI et on isole le fragment de 4,0 kb sur gel d'agarose comme décrit précédemment. La moitié de cet ADN est mise en oeuvre avec des cellules convenables de E. coli (conduisant à un plasmide pWRL 1140), tandis qu'on condense l'autre moitié en présence d'un chaînon EcoRI avant de 1.'utiliser pour transformer E. coli.
Un plasmide de ce dernier type se révèle contenir un site EcoRI supplémentaire introduit et est appelé pWRL 1130
(Fig. 16).
Résultats.
Les poids moléculaires et les séquences C-termi-
<EMI ID=92.1>
synthétisés par pWRL 1004, 1120, 1130 et 1140 sont indiqués aux Fig. 17 et 18. La fraction importante synthétisée par pWRL 1004 contient des séquences provenant du polypeptide p52 de VFA et est instable. Les protéines plus petites formées dans pWRL 1120 et 1130 contiennent principalement
<EMI ID=93.1>
"Maxicells". La protéine de 40.000 daltons produite par pWRL 1140 est un produit de fusion contenant les 104 aminoacides C-terminaux de p-lactamase, en plus des séquences de VFA, ce qui se traduit par une stabilisation du polypeptide. Les quatre polypeptides décrits ci-dessus sont synthétisés en quantités croissantes lorsque les bactéries sont
<EMI ID=94.1>
indique que la protéine est produite sous la commande de l'opéron lac. La protéine produite a une dimension identique à celle prévue.
Analyse des séquences de nucléotides.
On prépare des fragments d'ADN à partir des plasmides recombinants par digestion avec des endonucléases de restriction appropriées. On marque les fragments en position terminale de façon convenable et on détermine les séquences de nucléotides comme décrit par A Maxam et
<EMI ID=95.1>
détermine les détails de la région de gènes de structure de l'ARN de VFA, comme illustré à la Fig. 3. Les Fig. 4 à 10, 12 et 13 donnent des détails de l'ADN et des séquences d'aminoacides dans la région de la jonction VP4/VP2 et différentes autres parties des protéines de structure. La Fig. 9 donne des détails de la séquence d'ADN dans la partie
<EMI ID=96.1> Fig. 19 donne la séquence de nucléotides de l'extrémité 3' de l'ARN de VFA qui ne code pas pour une protéine.
EXEMPLE 2.-
On répète les procédés appliqués dans l'exemple 1 pour préparer des plasmides recombinants, mais en utilisant
<EMI ID=97.1>
Virus Research Institute).
Résultats.
La carte physique d'un plasmide recombinant
<EMI ID=98.1>
gènes de VFA, à déduire en application des procédés ci-dessus, sont montrés à la Fig. 11.
REVENDICATIONS
1.- Molécule d'ADN comprenant une séquence de nucléotides correspondant en substance à tout ou partie de
l'ARN du virus de la fièvre aphteuse (dit ci-après VFA).