ES2213754T3 - Particulas quimericas de tipo papilomavirus. - Google Patents
Particulas quimericas de tipo papilomavirus.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UNA PARTICULA DE TIPO PAPILLOMAVIRUS, CARACTERIZADA EN QUE TIENE EPITOPES ESTRUCTURABLES, QUE COMPRENDE UN PRODUCTO DE PAPILLOMAVIRUS L1 Y UN PRODUCTO DE FUSION DE PAPILLOMAVIRUS L2; Y MOLECULAS DE ADN SINTETICO RELACIONADAS, CELULAS HUESPED, METODOS Y VACUNAS.
Description
Partículas quiméricas de tipo papilomavirus.
La presente invención se refiere a partículas
quiméricas de tipo papilomavirus y moléculas relacionadas de ADN
sintético, células huésped, procedimientos y vacunas.
Los papilomavirus infectan los epitelios del
hombre y de una amplia variedad de animales, donde inducen
generalmente la proliferación benigna en el sitio de la infección.
Sin embargo, en algunos casos las lesiones inducidas por ciertos
papilomavirus experimentan una progresión maligna. Existe una fuerte
asociación entre la progresión maligna de las lesiones genitales
humanas y ciertos tipos de papilomavirus del hombre (HPV), tal como
el HPV 16. La infección por uno de estos tipos se considera el
factor de riesgo más significativo en el desarrollo del cáncer
cérvicouterino (del cuello del útero), uno de los cánceres más
habituales de las mujeres en todo el mundo (zur Hausen, H., Science
254:1167 (1991); Schiffman, M.H., J. Natl. Cancer Inst. 84.394
(1992)). la mayoría de los carcinomas cérvicouterinos contienen y
expresan genes tempranos del HPV, tales como E6 y E7, y se ha
mostrado que estos genes poseen una potente actividad transformante
e inmortalizante en células cultivadas (Werness, B.A., Munger. K
& Howley, P.M. (1991) Advances in Oncology, eds DeVita V.T.,
Hellman, S. & Rosenberg, S.A. (Lipponcott, Philadelphia) págs
3-18).
Los papilomavirus son virus de ADN bicatenario
desnudo de alrededor de 55 nm de diámetro, con un genoma de 8 kb
aproximadamente en el centro nucleohistónico (Baker, et al.,
Biophys J 60: 1445 (1991). Las cápsides están compuestas de dos
proteínas codificadas víricamente, L1 y L2, que migran en geles
SDS-PAGE a aproximadamente 55 kDa y 75 kDa,
respectivamente (Mose Larson et al., J. Virol. 61: 3596
(1987)). L1, que es la proteína más importante de la cápside, se
dispone en 72 pentámetros que se asocian con una simetría
T-7 icosaédrica. La función y posición en el
interior del virion de la L2 no está clara (Baker et al.,
Biophys J 60:1445 (1991)).
La proteína L1 tiene la capacidad de
autoensamblaje, de forma que pueden generarse grandes cantidades de
partículas de tipo vírico (VLPs) mediante la expresión de la
proteína L1 a partir de distintas especies de papilomavirus en
diversos sistemas de expresión recombinantes (Hagensee et al,
J. Virol 67:315 (1993); Kirnbauer et al, Proc. Natl. Acad.
Sci USA 89: 12180 (1992); Kirnbauer et al., J. Virol 67:6929
(1993); Rose et al, J. Virol 67:1936 (1993)). Aunque no es
necesario para el ensamblaje, L2 se incorpora a VLPs cuando se
co-expresa con L1 (L1/L2 VLPs) en las células.
La inmunización de conejos con viriones
originales ó L1 VLPs, pero no con la L1 no ensamblada que se expresa
en E.coli, induce títulos altos de anticuerpos séricos
neutralizantes (Christensen, N.D. y Kreider, J. W. J. Virol 64:3151
(1990); Kirnbauer et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 12180
(1992); Pilacinski et al, Bio/Technology 2:356 (1984); Segre
et al, Am. J. Vet. Res. 16:517 (1955)). Los anticuerpos
policlonales y monoclonales generados contra las partículas nativas,
reconocen epítopos que dependen conformacionalmente (Christensen,
N.D. y Kreider, J.W. Virus Res 28:195 (1993); Christensen et
al., J. Virol 64:5678 (1990); Christensen et al, Virology
181:572 (1991)).
Los anticuerpos neutralizantes generados contra
VLPs reconocen también epítopos que dependen conformacionalmente.
Utilizando BPV1 infecciosos, que pueden obtenerse fácilmente a artir
de lesiones bovinas, y un ensayo cuantitativo de infectividad de
BPV1 in vitro (Dvoretzky et al., Virology 103:369
(1980)), los investigadores mostraron que las VLPs procedentes de
los papilomavirus bovinos inducían niveles altos de anticuerpos
neutralizantes (Kirnbauer et al., Proc. Natl Acad Sci USA
89:12180 (1992)). Los anticuerpos neutralizantes se dirigieron
contra los epítopos que dependían conformacionalmente, porque la
desnaturalización de las partículas previa a la inmunización, abolió
la capacidad de la preparación para inducir actividad neutralizante
(id).
Cuando el gen L1 de un aislamiento del HPV16
derivado de una lesión que no se había convertido en cancerosa, se
utilizó para expresar la proteína L1 mayor de la cápside en células
de insectos, mediante báculovirus recombinantes, la L1 se
autoensambló en partículas VLPs, que mostraron una producción (o
rendimiento) tres veces más alta que la que se había obtenido
utilizando la L1 derivada del HPV16 prototípico (aislado
originariamente a partir de una lesión cancerosa), y formaron VLPs
que eran similares morfológicamente a los viriones nativos
(Kirnbauer et al., J. Virol 67:6929 (1993)). La comparación
de las secuencias del ADN identificó un cambio único no conservante
de aminoácidos que era el responsable del ineficiente autoensamblaje
de la L1 prototípica (id). La L1 del clon competente en el
ensamblaje se considera por tanto que es el gen de tipo salvaje, y
el prototipo L1 del clon que es defectuoso en el ensamblaje, un
mutante.
Utilizando VLPs HPV16 de la proteína L1 del tipo
salvaje como antígenos, se desarrolló un ELISA que detectó los
anticuerpos séricos en pacientes infectados con el HPV16 (Kirnbauer
et al, J. Natl. Cancer Inst. 86:494 (1994)). En contraste, ni
las partículas HPV16 desnaturalizadas ni las preparaciones de la
proteína L1 prototípica pudieron detectar estos anticuerpos
(id). Estos resultados demuestran que la proteína L1
prototípica no presenta epítopos conformacionales.
Se descubrió que el suero de conejos producido
contra partículas autoensambladas de tipo vírico HPV16 L1/L2 de tipo
salvaje, evitaba la unión de HPV16 VLP a las moléculas de la
superficie celular (Rodan et al., J. Virol, en prensa,
(noviembre, 1994)). En contraste, la producción del suero de conejo
contra la cepa prototípica de HPV16 L1/L2 no evitó dicha unión
(id). Los datos muestran que la cepa prototípica HPV16 carece
de epítopos conformacionales.
Los conejos inmunizados contra partículas de tipo
papilomavirus (CRPV) de conejos de rabo blanco compuestas de L1 ó
L1/L2 fueron protegidos de una estimulación experimental posterior
mediante CRPV infecciosos (Breitburd et al., 12º Simposium
Internacional sobre Papilomavirus en Amsterdam, en prensa (octubre
1994)). En contraste, los inmunizados con partículas
desnaturalizadas no fueron protegidos (id). Estos hallazgos
están de acuerdo con la conclusión de que las VLPs con epítopos
conformacionales son capaces de inducir una inmunidad
protectora.
Las VLPs compuestas por proteínas de la cápsida,
constituyen candidatas atractivas para vacunas profilácticas con el
fin de evitar la infección por papilomavirus. Sin embargo, no es
probable que estas vacunas VLP tengan efectos terapéuticos contra
las infecciones establecidas de papilomavirus. Las proteínas de la
cápsida, de manera diferente a E6 y E7, no se expresan de forma
detectable en las lesiones que han evolucionado a cancerosas, o en
las células epiteliales basales infectadas, que constituyen las
dianas presumibles en la regresión inmunitaria de los papilomas
A partir de los modelos experimentales, existe
evidencia de que la inmunidad contra las proteínas de los
papilomavirus distintas a las L1 y L2, pudiera ayudar a controlar la
infección debida a éstos. Ya que E6 y E7 se conservan selectivamente
durante la progresión oncogénica, existe la posibilidad de que
péptidos derivados de estas oncoproteínas pudieran servir como
dianas para las respuestas inmunes mediadas celularmente a las
células tumorales que contienen HPV. Estudios en modelos animales
sugieren que la proteína E7 de HPV16 actúa como un antígeno de
rechazo tumoral (Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88:110 (1991); Feltkemp et al., Eur. J. Immunol. 23:2242
(1993)). Además, la frecuencia de la infección por HPV, su
persistencia, y el riesgo de desarrollar cáncer cervicouterino y
otros cánceres relaiconados con el HPV, aumenta en pacientes con
inmunidad celular deprimida (Allout et al., Br. Med. J.
298:153 (1989); Lage et al, Int. J. Cancer 50:45 (1992).
Estas observaciones sugieren que la inmunidad mediada celularmente
es importante en la defensa contra la infección por HPV y el
desarrollo tumoral asociado con ella. La inducción de dicha
inmunidad podría ser terapéutica, así como profiláctica.
Se ha demostrado que los péptidos extraños pueden
incorporarse a las estructuras de tipo cápside vírica y estas
partículas quiméricas pueden utilizarse para presentar los antígenos
extraños al sistema inmunitario. Los ejemplos publicados incluyen la
presentación de los epítopos del rinovirus humano tipo 2 (Francis
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2545 (1990) y de la
gp41 del HIV (Borisova et al, FEBS Lett. 259:121 (1989)) a
las partículas antigénicas del núcleo del virus de la hepatitis B y
la presentación de los péptidos del virus herpes simplex 1 y del
virus de la hepatitis murina (Brown et al., Virology 188:477
(1994)) a las partículas del parvovirus B19. Los químeros de los
parvovirus protegieron a los ratones de la estimulación experimental
con los virus correspondientes. En todos los sistemas anteriores,
las secuencias extrañas se han insertado en proteínas en la
estructura de la cápside y se han limitado a menos de 20
aminoácidos. Sin embargo, un reciente estudio (Miyamura et
al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8507 (1994)) ha demostrado que
la totalidad de los 147 aminoácidos de la proteína de la lisozima de
los huevos blancos de las gallinas pueden ser incorporados a las
partículas de los parvovirus B19 cuando se fusionan a la proteína L1
más pequeña de la cápside. La lisozima permaneció biológicamente
activa y dió lugar a una respuesta inmune cuando se inyectó en los
conejos. En estudios quizás menos relacionados, las partículas del
antígeno superficial del virus de la hepatitis B (que consisten en
estructuras membranosas lipídicas) conteniendo 84 aminoácidos de la
glicoproteína de la envuelta del HIV-1 (Michel
et al., J. Virol. 64:2452 (1990)) y las partículas del tipo
del virus Ty de la levadura conteniendo una parte del bucle V3 del
HIV-1 (Griffiths et al., J. Virol. 65: 450
(1991)) también han mostrado producir una respuesta inmunitaria para
los péptidos insertados cuando se inocularon a los animales.
Respecto a los papilomavirus, se informó recientemente de que las
partículas del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B
conteniendo los péptidos HPV16 E7 (todos con menos de 20
aminoácidos) indujeron anticuerpos peptídicos específicos y
respuestas de las células T-colaboradoras en los
ratones (Tindle et al., Virology 200:547 (1994)).
No se ha informado de partículas quiméricas
basadas en la L1 autoensamblada del papilomavirus, ni se ha descrito
la utilización de L2 como un elemento de emparejamiento de la fusión
vírica, con el propósito de generar VLPs quiméricas. Los estudios de
partículas quiméricas citados anteriormente implican a virus que no
están relacionados con los papilomavirus, y de este modo no se
pueden predecir los resultados de estudios de partículas quiméricas
que involucren a los papilomavirus. Los estudios que utilizan virus
no relacionados con los papilomavirus no pueden predecir si un
papilomavirus L2 que contiene un péptido o una proteína extraños,
pueden co-ensamblarse en partículas con el
papilomavirus L1. Ni pueden estos estudios predecir si cualesquiera
partículas quiméricas resultantes conservarían la capacidad de
inducir o detectar anticuerpos neutralizantes u otras respuestas
inmunes relacionadas.
Las partículas quiméricas pueden actuar como
plataformas para la presentación de antígenos multivalentes. O
pueden servir para el suministro a las células, de proteínas para el
procesamiento a péptidos y la presentación posterior de éstos dentro
del contexto de las moléculas MHC, para dar lugar a una respuesta
inmunitaria mediada celularmente. Las partículas quiméricas
representan una vía con un coste efectivo para generar una vacuna
efectiva para el papilomavirus con un espectro amplio de utilidad.
Alternativamente, las partículas de tipo papilomavirus pueden
aplicarse a la purificación del elemento de emparejamiento de la
fusión y/ó a VLP. O, las partículas pueden operar para suministrar a
las células proteínas intactas y activas, por ejemplo, enzimas o
toxinas o medicamentos.
Según un aspecto de la invención, se proporciona
una partícula de tipo papilomavirus caracterizada porque posee
epítopos conformacionales, que comprenden una proteína L1 del
papilomavirus y un producto de fusión L2 del papilomavirus, el cual
comprende una proteína L2, o un fragmento peptídico de la misma,
unido a un elemento de emparejamiento de la fusión que es una
proteína antigénica distinta que L2, o un fragmento peptídico
antigénico de la misma.
La proteína o péptido antigénico se selecciona
preferentemente a partir de las proteínas o péptidos de agentes
infecciosos.
El elemento de emparejamiento de la fusión Puede
resultar una proteína o péptido del papilomavirus, preferentemente
una proteína o péptido E6 ó E7.
La partícula de tipo papilomavirus de la
invención puede comprender además un producto de fusión que contiene
un dominio de unión de una proteína co-estimuladora
o un receptor accesorio o ligando implicado en la reactividad
inmunológica, por ejemplo B7 (que interactúa con CD28 en las células
T), una molécula de adhesión intercelular (ICAM), un antígeno
funcional de linfocitos (LFA), una molécula de adhesión a la célula
vascular (VCAM-1) o un antígeno termoestable
(HSA).
El producto de fusión L2 del papilomavirus puede
consistir en un producto de fusión L2 del papilomavirus humano o un
producto de fusión L2 del papilomavirus bovino.
El producto de fusión L2 del papilomavirus humano
puede consistir en un producto de fusión de HPV16L2 y el producto de
fusión del papilomavirus L2 bovino Puede resultar un producto de
fusión BPV1L2.
El elemento de emparejamiento de la fusión puede
consistir en fragmentos peptídicos de proteínas de longitud
completa, o sus combinaciones, unidas en tándem.
La proteína o péptido L2 del papilomavirus puede
fusionarse con el elemento de emparejamiento de fusión en su extremo
N ó C.
El producto de fusión L2 del papilomavirus puede
tener insertado el elemento de emparejamiento de fusión entre
aminoácidos de la proteína o péptido L2.
La proteína L1 del papilomavirus Puede resultar
una proteína L1 del papilomavirus humano o una proteína L1 del
papilomavirus bovino. La proteína L1 del papilomavirus humano puede
consistir en un producto HPV16L1 y la proteína L1 del papilomavirus
bovino Puede resultar un producto BPV1L1.
Las partículas de tipo papilomavirus consisten
preferentemente en los productos de fusión de las proteínas L1 y L2,
y pueden ser seleccionadas a partir del grupo formado por HPV16L1 y
HPV16L2-HPV16E7 (de longitud completa), en las que
opcionalmente HPV16E7 se fusiona con el extremo C de HPV16L2;
BPVL1 y BPVL2-HPV16E7 (de longitud completa), en las
que opcionalmente HPV16E7 se fusiona con el extremo C de BPVL2; ó
BPVL1 y BPVL2-HPV16E7 (aminoácidos
1-30), en las que opcionalmente HPV16E7 se fusiona
con BPVL2 entre los aminoácidos 274 y 275 de L2.
La invención proporciona asimismo un
procedimiento para la purificación de una partícula de tipo
papilomavirus, que comprende la etapa de exposición de esta
partícula de tipo papilomavirus a una columna de cromatografía de
afinidad que incluye anticuerpos que se unen al elemento de
emparejamiento de fusión del producto de fusión L2 del
papilomavirus, de la partícula de tipo papilomavirus, que da lugar a
la purificación de ésta.
La invención proporciona además un procedimiento
para la purificación de un elemento de emparejamiento de fusión, del
producto de fusión L2 del papilomavirus, de la partícula del tipo
papilomavirus, que comprende la etapa de aislamiento de esta
partícula, que da lugar a la purificación del elemento de
emparejamiento de fusión.
La invención proporciona además un procedimiento
para el suministro a una célula de un elemento de emparejamiento de
fusión de un producto de fusión L2 de un papilomavirus, de una
partícula de tipo papilomavirus, que comprende la etapa de
administración de dicha partícula a la célula in vitro o
ex vivo, que da lugar al suministro a dicha célula del
elemento de emparejamiento de fusión.
La invención proporciona también una composición
inmunogénica que comprende la partícula de tipo papilomavirus, según
se ha descrito en la presente memoria.
La invención incluye una partícula de tipo
papilomavirus según se ha descrito en la presente memoria, para
utilizarla como una composición farmacéutica. Asimismo, la invención
incluye la utilización de una partícula de tipo papilomavirus según
se ha descrito en la presente memoria, para la preparación de un
medicamento, con el fin de estimular una respuesta inmune en un
mamífero huésped.
La invención proporciona además una molécula de
ADN que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una
proteína L1 del papilomavirus y un producto de fusión L2 del
papilomavirus, el cual producto de fusión comprende una proteína L2
o un fragmento peptídico de la misma unido a un elemento de
emparejamiento de fusión constituido por proteína antigénica
distinta de L2, o un fragmento antigénico peptídico de la misma, la
cual molécula es capaz de dirigir la expresión en una célula
transformada, de las partículas de tipo papilomavirus que poseen
epítopos conformacionales y las cuales partículas comprenden dicha
proteína L1 del papilomavirus y el producto de fusión L2 de
éste.
De este modo, la invención proporciona una
molécula sintética ó más, de ADN, caracterizadas por sintetizar de
forma única o por duplicado un producto L1 y un producto de fusión
L2 del papilomavirus, en los que la molécula o moléculas dirigen la
expresión en una célula huésped transformada de una partícula de
tipo papilomavirus, caracterizada por la posesión de epítopos
conformacionales, que comprende el producto L1 y el producto de
fusión L2 del papilomavirus.
La célula huésped transformada Puede resultar una
célula huésped de un insecto (tal como la célula huésped Sf9 del
insecto), y la molécula o moléculas de ADN puede incluir además un
vector de una célula de insecto (tal como un vector baculovírico), o
la célula huésped transformada Puede resultar una célula huésped de
un mamífero y la molécula o moléculas de ADN pueden comprender
además un vector de una célula de mamífero (tal como un vector del
virus de la vacuna), o la célula huésped transformada puede
consistir en una célula huésped de levadura y la molécula o
moléculas de ADN puede comprender además un vector de una célula de
levadura.
Según otro aspecto de la invención, se
proporciona una célula huésped transformada con la molécula o
moléculas de ADN de la invención.
En formas de realización preferidas de las
células huésped transformadas, la proteína L1 del papilomavirus y el
producto de fusión L2 del papilomavirus, son codificadas en la misma
molécula de ADN. Alternativamente, la proteína L1 del papilomavirus
y el producto de fusión L2 del papilomavirus, pueden ser codificadas
sobre moléculas distintas de ADN.
Según, todavía, otro aspecto de la invención, se
proporciona un procedimiento para la utilización de la molécula o
moléculas de ADN de la invención, que comprende las etapas de:
proveer las condiciones para que la molécula o moléculas de ADN
mencionadas, puedan dirigir la expresión a la que antes se ha
aludido, y recuperar opcionalmente las partículas de tipo
papilomavirus a partir de la célula huésped previamente
transformada.
Según otro aspecto, aún, de la invención, se
proporciona un procedimiento para la producción de una partícula de
tipo papilomavirus, caracterizada porque posee epítopos
conformacionales, que comprende una proteína L1 del papilomavirus y
un producto de fusión L2 del papilomavirus, cuyo procedimiento
comprende la etapa de proveer las condiciones para que la o las
moléculas de ADN mencionadas, dirijan la expresión a la que se ha
aludido anteriormente, en la célula huésped transformada, de la
partícula de tipo papilomavirus, recuperando opcionalmente a ésta a
partir de la célula huésped.
La invención incluye también una composición que
comprende una primera molécula de ADN que codifica una proteína L1
del papilomavirus y una segunda molécula de ADN que codifica un
producto de fusión L2 del papilomavirus, el cual producto de fusión
incluye una proteína L2, o fragmento peptídico de la misma, unido a
un elemento de emparejamiento de fusión que es una proteína
antigénica distinta de L2, o un fragmento antigénico peptídico de la
misma, en la que dichas moléculas son capaces de dirigir la
expresión en una célula transformada, de partículas de tipo
papilomavirus caracterizadas porque tienen epítopos
conformacionales, y en la que dichas partículas comprenden dicha
proteína L1 del papilomavirus y dicha proteína de fusión L2 del
papilomavirus.
Opcionalmente, las moléculas de ADN son:
- (a)
- capaces de dirigir la expresión en una célula transformada de insecto, comprendiendo además el ADN de cada una de dichas moléculas un vector de la célula de insecto,
- (b)
- capaces de dirigir la expresión en una célula transformada de mamífero, comprendiendo además el ADN de cada una de dichas moléculas un vector de célula de mamífero, o
- (c)
- capaces de dirigir la expresión en una célula transformada de levadura, comprendiendo además el ADN de cada una de dichas moléculas un vector de la célula de levadura.
La invención incluye la utilización de una
partícula de tipo papilomavirus tal como se ha descrito
anteriormente en la presente memoria, como una plataforma para la
presentación antigénica multivalente.
La invención incluye asimismo la utilización de
una partícula de tipo papilomavirus tal como se ha descrito
anteriormente en la presente memoria para el suministro a las
células de proteínas, con el fin de procesarlas a péptidos y la
ulterior presentación de éstos en el contexto de las moléculas MHC,
para dar lugar a una respuesta inmunitaria mediada celularmente.
La invención proporciona además una vacuna que
comprende la partícula de tipo papilomavirus anteriormente
mencionada.
La invención se genera debido al resultado
obtenido de que un producto de fusión L2 de un papilomavirus puede
llegar a incorporarse a una partícula de tipo papilomavirus basada
en una proteína L1 de éste, la cual partícula presenta epítopos
conformaiconales. Este resultado fue inesperado.
Un producto de fusión L2 de un papilomavirus
significa la inclusión de una cadena de aminoácidos en la que parte
de la cadena proviene de una secuencia de una proteína L2, y parte,
de otra secuencia proteica (o de otras secuencias proteicas).
Los productos de fusión de L2 se producen
mediante corte y empalme (estructuralmente) de un marco de lectura
abierto para una proteína (o diversas proteínas) próximo a, o en un
marco de lectura abierto para L2.
Para determinar la estructura de este producto de
fusión L2, se utiliza la ingeniería proteica. En un ejercicio
rutinario para los ingenieros de proteínas, generan variantes de la
proteína natural L2. Los cambios que pueden realizar, pueden
consistir en estimaciones cultas basadas en el conocimiento
detallado de la estructura de L2; alternativamente, los cambios
pueden llevarse a cabo basándose puramente en el azar. O una
combinación de información estructural con mutagénesis al azar y
selección, pueden tener resultados impresionantes.
Por ejemplo, la selección de aminoácidos de L2
entre los cuales se realice la inserción de un péptido o proteína de
fusión, puede realizarse basándose en esto. La existencia de una
región en la que la secuencia aminoácida y la longitud varían entre
los papilomavirus, sugiere que aquélla representa una estructura que
no es esencial para la integridad de L2 y/o su incorporación a las
partículas. La capacidad observada para insertar un péptido o
proteína en L2, implica que tal región existe.
La determinación de una estructura para el
producto de fusión L2 se lleva a cabo basándose en la capacidad del
producto de fusión L2 para llegar a incorporarse a una partícula de
tipo papilomavirus que se basa, a su vez, en el producto L1 de dicho
papilomavirus, la cual partícula presenta epítopos
conformacionales.
Los medios preferidos para la determinación de
una estructura incluyen ensayos que miden la eficiencia y/o la
autenticidad de la incorporación de un producto de fusión L2 a una
partícula de tipo papilomavirus que se basa, a su vez, en el
producto L1 de dicho papilomavirus,
La eficiencia y/o autenticidad de la formación de
L1/L2 VLPs está relacionada con la presentación de los epítopos
conformacionales (supra).
La L2 quimérica, se podrá llegar a incorporar, de
este modo, a VLPs basadas en L1, con una eficiencia y/o autenticidad
similar que la de la incorporación de la L2 de tipo salvaje.
Otros medios preferidos para la determinación de
una estructura para el producto de fusión L2 incluyen ensayos que
miden la inducción y/o la detección de anticuerpos
neutralizantes.
La inducción y/o detección de anticuerpos
neutralizantes se relaciona con la presentación de epítopos
conformacionales, a causa de que los anticuerpos neutralizantes son
dirigidos contra los epítopos dependientes conformacionalmente
(supra).
La incorporación de la L2 quimérica no inhibirá,
de este modo, la inducción y/o la detección de los anticuerpos
neutralizantes, mediante las partículas quiméricas de tipo
papilomavirus, cuando se compare con las VLPs L1/L2.
A efectos de la invención, un producto de fusión
L2 quimero es capaz de incorporarse a una partícula de tipo
papilomavirus que se basa, a su vez, en el producto L1 de este
papilomavirus, la cual partícula presenta epítopos conformacionales,
si es identificada mediante los medios anteriormente mencionados o
mediante cualesquiera otros medios que se conozcan en la
técnica.
La estructura de L2 y su elemento de
emparejamiento de fusión (y L1) significa incluir una proteína L2
con una longitud completa (y una proteína L1) y una proteína de
emparejamiento de fusión con una longitud total, y sus fragmentos
peptídicos, si los fragmentos del extremo 5', los fragmentos del
extremo 3' o los fragmentos internos, tienen por lo menos 20
residuos aminoácidos aproximadamente, alrededor de 10 residuos
aminoácidos por lo menos, y preferentemente, por lo menos, 5
residuos aminoácidos aproximadamente. Las variaciones de tipo,
subgrupo y cepa de L2 (y L1), y las variaciones de especie y las
alélicas humanas de la proteína del elemento de emparejamiento de
fusión, se consideran de modo expreso como incluidas en el alcance
de la invención. La invención incluye también variantes
conservadoras de la proteína L2 con longitud completa (y de la
proteína L1) y de la proteína del elemento de emparejamiento de
fusión con longitud total, y de sus fragmentos peptídicos, en las
que aminoácidos conservadores son sustituidos por residuos
aminoácidos de la proteína L2 (y L1) de tipo salvaje y de la del
elemento de emparejamiento de fusión. Para tener en cuenta la
degeneración del código genético, la invención incluye también ADN
que codifica los mismos residuos aminoácidos que el ADN del gen del
elemento de emparejamiento de fusión y de L2 (y L1).
La partícula de tipo papilomavirus quimérica en
si misma se concibe como que incorpora cualquier producto de fusión
L2 con cualquier producto L1 de cualquier papilomavirus, si los
genomas están estrechamente relacionados, o están relacionados de
forma distante, mientras que tiene lugar la incorporación a las
partículas. Así, un producto de fusión L2, por ejemplo, relacionado
con cualquiera de BPV-1, BPV-2,
BPV-4, CRPV, OPV, EEPV, HPV-1,
HPV-5, HPV-6, HPV-8,
HPV-11, HPV-16,
HPV-18, HPV-31 ó
HPV-33, puede incorporarse a las partículas con
cualquier producto L1, por ejemplo, a partir de cualquier de los
virus antes mencionados, o a partir de cualquier tipo, subgrupo o
variación de cepa del papilomavirus.
A causa de que las VLPs presentan epítopos
dependientes conformacionalmente que son necesarios para la
inducción de anticuerpos séricos neutralizantes con un título alto,
los quimeros VLP que contienen productos de fusión L2 pueden operar
de manera profiláctica como subunidades vacunales optimizadas para
estimular la inmunidad humoral, con el fin de evitar la infección
por papilomavirus e impedir, por tanto, el desarrollo de cánceres y
otras patologías asociados a los papilomavirus.
Debido a que resulta improbable que las VLPs se
muestren efectivas como vacunas terapéuticas para inducir la
regresión de lesiones proliferativas existentes debidas a
papilomavirus, tal como se consideró anteriormente, las VLPs
quiméricas pueden funcionar para dirigir esta necesidad largo tiempo
sentida y hasta ahora insatisfecha de desarrollar una vacuna
terapéutica.
Se espera que las VLPs quiméricas se unan
específicamente a los receptores superficiales celulares, se
internalicen y se liberen en el citoplasma, y de este modo, sea más
probable que promuevan la presentación de los péptidos,
conjuntamente con las moléculas MHC de tipo I, para que tenga lugar
la exposición a las células T citotóxicas, con el fin de que se
genere la inmunidad mediada celularmente. Esto contrasta con las
proteínas que no forman complejos, de las que no se esperaría que
penetraran específicamente en las células, o promovieran la
presentación de los péptidos en el contexto de las moléculas MHC de
tipo I, para provocar la respuesta de las células T citotóxicas
(siendo más probable, si es que lo es, promover la presentación de
los péptidos que deben unirse a las moléculas MHC de tipo II y
exponerlos a las células T auxiliadoras).
La inclusión de uno o más elementos de
emparejamiento de la fusión como productos de fusión L2 constituiría
claramente una vía de coste efectivo para generar una vacuna
efectiva del papilomavirus con un amplio espectro de utilidad,
incluyendo la terapia y la mejora en la prevención de las lesiones
clínicas.
El elemento de emparejamiento de la fusión puede
seleccionarse a partir de la lista formada por aquéllos elementos de
emparejamiento de la fusión que darían lugar a un procedimiento para
ampliar las dianas potenciales de una vacuna basada en VLP, por
ejemplo, los péptidos E6 u E7, o los E6 ó E7 de longitud completa,
otras proteínas o péptidos de papilomavirus, o péptidos o proteínas
de otras STO o agentes infecciosos, por ejemplo, Herpes
simple, HIV, Chlamydia trachomatis, Neisseria
gonorrhoeae, y Treponema pallidum.
El producto de fusión L2 no se limita a un único
elemento de emparejamiento de la fusión por molécula de L2, y puede
incluir elementos adicionales de emparejamiento de la fusión,
péptidos adicionales o proteínas de longitud completa o sus
combinaciones, derivadas de las mismas o distintas proteínas unidas
en tándem. Asimismo, más de un producto de fusión L2 puede
co-ensamblarse en una VLP única. Por ejemplo, un
producto de fusión L2 o una VLP quimérica que contiene un epítopo
diana vírico, pueden también tratarse mediante métodos de ingeniería
genética para que contenga un dominio de unión de una proteína
co-estimuladora o un receptor o ligando accesorio
involucrado en la reactividad inmunológica, por ejemplo, B7
(que interactúa con CD28 en las células T), una molécula de adhesión
intercelular (ICAM), un antígeno funcional de linfocitos (LFA), una
molécula de adhesión a la célula vascular (VCAM-1) y
un antígeno termoestable (HSA). (Para dirigir los
co-estimuladores o ligandos a la superficie de VLPs,
véase el Ejemplo 14.)
Se tendrá en cuenta que las cantidades preferidas
actuales de las partículas quiméricas de tipo papilomavirus para que
actúen como vacunas en la prevención y/o tratamiento de
enfermedades, variarán según las composiciones específicas que se
formulen, el modo de aplicación, el sitio particular y el organismo
que vaya a tratarse. Para un huésped dado, pueden determinarse las
dosis utilizando consideraciones convencionales, por ejemplo,
mediante un protocolo de vacunación convencional apropiado.
Alternativamente, las VLPs quiméricas pueden
utilizarse en un procedimiento para su purificación. Las VLPs son
útiles per se como vacunas profilácticas y en el diagnóstico
inmunológico (supra). Brevemente, los anticuerpos para el
elemento de emparejamiento de fusión se generan utilizando técnicas
inmunológicas estándar, construyéndose una columna de cromatografía
de afinidad empleando estos anticuerpos, y las VLPs se purifican
posteriormente en una etapa de cromatografía de afinidad.
O, las VLPs quiméricas pueden utilizarse en un
procedimiento de purificación de un elemento de emparejamiento de
fusión. Por ejemplo, las VLPs que contienen un producto de fusión
L2-E7, pueden ser útiles como medios para la
obtención de E7 correctamente plegada. Se ha informado de que
pacientes con cáncer cérvicouterino muestran un porcentaje mayor de
seropositivos respecto a una E7 conformacionalmente correcta que
respecto a una E7 desnaturalizada, tal como se aísla a partir de las
bacterias (Viscidi et al., Int. J. Cancer 55:780 (1993)). El
sistema utilizado en la transcripción-traducción
in vitro para generar E7 en este informe es laborioso y caro,
y utiliza E7 marcada radioactivamente. Sería ventajoso purificar E7
VLPs quiméricas, y utilizar el material como en un E7 ELISA. Para
evitar complicaciones de reactividad serológica con las L1 ó L2
humanas, deberían utilizarse partículas basadas en BPV. El control
de la seroreactividad de E7, que se correlaciona con el cáncer,
opuesta a la patología precancerosa, se ha propuesto como útil para
seguir el curso de la enfermedad en los pacientes con cáncer
cervicouterino y para rastrear las recurrencias (id).
Opcionalmente, las VLPs quiméricas pueden
utilizarse en un procedimiento de suministro de una proteína intacta
y activa a las células. Esta proteína Puede resultar, por ejemplo,
un enzima, o una toxina o un medicamento. Las VLPs quiméricas se
administran a las células in vitro, in vivo, in
situ, o ex vivo, y la proteína se suministra
posteriormente a la célula, donde funciona según el propósito a que
está destinada, por ejemplo, como un enzima, una toxina o un
medicamento.
Se ha tenido éxito en la generación de partículas
quiméricas de tipo papilomavirus que incorporan la proteína o
péptido E7 fusionado a L2.
Un gen E7 del papilomavirus, cuando se fusionó en
el marco de lectura al extremo 3' del gen L2 o dentro de parte del
marco de lectura abierto de L2, expresó una proteína de fusión
L2-E7 que, en presencia de la proteína L1, se
incorporó a las partículas de tipo vírico. La eficiencia y
autenticidad de la incorporación de L2-E7 a VLPs
fueron similares a la de la proteína L2 de tipo salvaje. Se encontró
que las partículas de tipo vírico BPV L1/L2-E7
inducían anticuerpos neutralizantes de modo tan efectivo como las
partículas BPV L1/L2. Se observó que las partículas quiméricas
provocaban una inmunidad humoral específica para los epítopos del
elemento de emparejamiento de la fusión, porque los conejos
inmunizados con partículas quiméricas L2-E7
generaron anticuerpos dirigidos contra E7.
El haber tenido éxito en la generación de
partículas quiméricas de tipo papilomavirus, abre la puerta a la
fusión, virtualmente, de cualquier proteína o péptido a un producto
L2, para la incorporación a partículas de tipo papilomavirus.
Se llegaron a producir VLPs quiméricas generando
proteínas de fusión L2-E7 y expresando estas
proteínas junto con la L1, mediante bacolovirus recombinantes, en
las células de insectos. Generamos tres VLPs quiméricas: HPV16L1 +
HPV16L2-HPV16E7 (longitud completa), BPVL1 +
BPVL2-HPV16E7 (longitud completa) y BPVL1 +
BPVL2-HPV16E7 (aminoácidos
1-30).
BPV L2 se fusionó en su extremo 3' a HPV16 E7.
HPV16 L2 se fusionó en su extremo 3' a HPV16 E7. Además, los
primeros 30 codones de HPV16 E7 se insertaron entre los codones 274
y 275 de VPV L2.
La co-sedimentación en gradiente
de sacarosa y la co-inmunoprecipitación de L1 y de
los quimeros L2-E7, demostraron la incorporación de
la proteína quimérica en las VLPs.
El microscopio electrónico de transmisión reveló
que las partículas que contenían la proteína de fusión
L2-E7 se ensamblaron con la misma eficiencia que L1
ó L1/L2 VLPs, y eran morfológicamente indistinguibles.
Los ensayos in vitro de neutralización de
BPV1 demostraron que las VLPs quiméricas que contenían BPV L1 eran
capaces de inducir antisueros neutralizantes. Los títulos fueron
comparables a los obtenidos utilizando BPV L1/L2 VLPs. Títulos de
neutralización equivalentes de 30.000, se obtuvieron para las dos
VLPs quiméricas, BPVL1/L2 VLPs y BPVL1/L2-HPV16E7
(longitud completa).
Los conejos inmunizados con partículas quiméricas
L2-E7 generaron anticuerpos dirigidos contra E7,
demostrando la inducción mediante VLPs quimeros de la inmunidad
humoral específica para los epítopos del elemento de emparejamiento
de fusión, y estableciendo también la localización de epítopos de E7
como externos a VLPs.
Tal como se expone en el Ejemplo 1, pueden
generarse baculovirus recombinantes quimeros. Los genes para los
quimeros pueden obtenerse a partir de orígenes genómicos o de cADNs,
mediante síntesis directa, o mediante cualquiera de sus
combinaciones. L2 y los genes de sus elementos de emparejamiento de
fusión pueden amplificarse mediante técnicas PCR recombinantes, por
ejemplo, con oligos que contengan sitios enzimáticos de restricción
y complementariedades que faciliten la fusión y la clonación en
vectores de expresión, transferencia y/o de clonación, por
ejemplo, plásmidos.
Los genes fusionados pueden ser clonados en un
vector de expresión baculovírico. Puede generarse otro vector de
expresión baculovírico que contenga L1. O, los genes fusionados
pueden clonarse en un vector baculovírico de doble expresión que ya
contenga L1.
El ejemplo 2 expone un procedimiento típico para
la selección de baculovirus recombinantes. Un plásmido recombinante
purificado mediante CsCl (o equivalente) Puede resultar
cotransfectado con ADN baculovírico en células Sf9 de insectos,
utilizando Lipofectina (o equivalente). Los baculovirus
recombinantes pueden entonces purificarse en placa (por ejemplo)
utilizando vectores convencionales de baculovirus y procedimientos
de cultivo de células de insectos.
Puede resultar ventajoso utilizar dos únicos
vectores baculovíricos de expresión en vez de un vector baculovírico
de doble expresión, En este caso, las VLPs quiméricas pueden
producirse infectando células Sf9 con dos baculovirus recombinantes,
uno que codifique un producto L1, y el otro, el producto de fusión
L2. La localización de los genes en distintos vectores facilita la
manipulación de las cantidades producidas del producto L1 y del
producto de fusión L2. Este planteamiento permite cambiar la
relación del producto de fusión L2 respecto al producto L1 en una
VLP. Aunque en los viriones originales, L2 es el componente menos
importante comparado con L1, se puede alcanzar una mayor
incorporación del producto de fusión L2 en las VLPs, utilizando dos
vectores únicos de expresión.
Tal como se expone en el Ejemplo 3, las
partículas quiméricas pueden purificarse obteniendo el patrón de
bandas en cloruro de cesio (o equivalente). Las células Sf9 de los
insectos pueden ser infectadas, por ejemplo, con múltiples
infecciones 10 con baculovirus recombinantes. Después de 72 horas
(más o menos), las células pueden recuperarse y tratarse con
ultrasonidos en una solución salina tamponada de fosfato (o
equivalente) durante 60 segundos (más o menos). Después de
clarificación a baja velocidad (o equivalente), los lisados pueden
someterse a centrifugación, por ejemplo, a 110.000 x g durante 2,5
horas mediante una almohadilla de sacarosa al 40% (peso/vol)/PBS
(rotor SW-28). Los sedimentos vueltos s suspender
pueden centrifugarse hasta el equilibrio, por ejemplo, a 141.000 x g
durante 20 horas a temperatura ambiente en un gradiente de CsCl al
10-40% (peso/vol)/PBS. La banda visible puede
recuperarse, centrifugarse otra vez hasta equilibrio utilizando
condiciones idénticas, dializarla extensamente contra PBS, y
conservarla a 4ºC (por ejemplo).
Tal como se expone en el Ejemplo 4, la
co-sedimentación de complejos quimeros puede
establecerse, por ejemplo, mediante centrifugación de gradiente
analítico. Por ejemplo, un gradiente de sacarosa del
12-45 % puede permitir la linearización durante la
noche a 4ºC, y las muestras dializadas pueden formar una capa en la
parte superior, pudiendo centrifugarse el gradiente a 41.000 rpm
(288.000 x g) durante 2 horas en un rotor SW-41. Las
fracciones pueden recuperarse y analizarse respecto a la
co-sedimentación, por ejemplo, mediante
transferencia Western, o co-inmunoprecipitación.
Tal como se expone en el Ejemplo 5, la
co-sedimentación puede establecerse, por ejemplo,
mediante co-inmunoprecipitación.
Tal como se expone en el Ejemplo 6, pueden
producirse antisueros. Esto puede hacerse para llevar a cabo un
ensayo de neutralización de BPV1 (o equivalente) tal como se
describe en Dvoretsky et al, Virology 103:369 (1980). Por
ejemplo, los antisueros pueden producirse de la manera
siguiente. Los conejos pueden inmunizarse mediante inyección
subcutánea de 330 \mul de partículas purificadas en gradiente de
CsCl en PBS, a una concentración de 1 mg/ml. Los conejos pueden
entonces volverse a vacunar con la misma cantidad de partículas dos
semanas y cuatro semanas después de la inyección primaria.
Tal como se expone en el Ejemplo 7, puede
realizarse un ensayo de neutralización (o equivalente) para probar
si las partículas quiméricas BPV1 presentan epítopos
conformacionales. Por ejemplo, diluciones seriales de los
sueros obtenidos 3 semanas después de la segunda inyección de
revacunación, pueden incubarse con aproximadamente 500 unidades
foco-formadoras de virus BPV1 durante 30 minutos,
pudiéndose adsorber el virus a células C127 durante 1 hora, y las
células pueden cultivarse durante 3 semanas. Los focos pueden
entonces teñirse con azul de metileno al 0,5%/carbol fucsina al
0,25% en metanol. Los títulos de neutralización pueden obtenerse
para las VLPs quiméricas y las BPVL1-L2 VLPs de
control. Títulos de neutralización equivalentes indicarán un moldeo
adecuado de las partículas quiméricas, efectivo para los epítopos
conformacionales actuales.
Tal como se expone en el Ejemplo 8, las
partículas quiméricas pueden probarse, por ejemplo, mediante
microscopía electrónica de transmisión. Por ejemplo, las
partículas purificadas pueden adsorberse a cuadrículas revestidas
con carbono, teñidas con acetato de uranilo al 1%, y examinadas con
un microscopio electrónico Philips, modelo EM 400T con una
ampliación de x36.000. La eficiencia de la incorporación, y la
morfología de las partículas quiméricas y de L1 ó de L1/L2 VLPs
pueden compararse y contrastarse. Una eficiencia de incorporación y
una morfología indistinguibles indicará un ensamblaje apropiado de
las partículas quiméricas.
Tal como se expone en el Ejemplo 9, las
partículas quiméricas pueden ensayarse, por ejemplo, para la
inducción de la inmunidad humoral específica para los epítopos del
elemento de emparejamiento de fusión. Por ejemplo, los
conejos pueden ser inoculados con VLPs quiméricas. Los sueros pueden
ser analizados respecto a los anticuerpos, por ejemplo, sometiendo
una muestra del antígeno del elemento de emparejamiento de fusión a
SDS-PAGE y entonces a transferencia Western. Los
sueros inmunes y preinmunes (de control) pueden aplicarse en una
dilución apropiada. La detección de la banda del elemento de
emparejamiento de fusión en la transferencia Western mediante el
suero procedente del conejo inmune, indica la inducción de
anticuerpos específicos para los epítopos del elemento de
emparejamiento de fusión.
Tal como se expone en el Ejemplo 10, las
partículas quiméricas pueden ensayarse, por ejemplo, para la
inducción de inmunidad mediada celularmente, específica para los
péptidos de fusión, por ejemplo, inyectando VLPS quiméricas a
ratones, y midiendo la proliferación de las células T antígeno
específicas.
Tal como se expone en el Ejemplo 11, las
partículas quiméricas pueden ensayarse, por ejemplo, respecto a la
inducción de inmunidad profiláctica contra el estímulo de la
infección, por ejemplo, mediante la inmunización de conejos con VLPs
CRPV quiméricas y VLPs CRPV no quiméricas (control), y la
estimulación consecutiva con CRPV infeccioso, para demostrar que las
fusiones de L2 no abolen la inmunidad profiláctica; o mediante la
inmunización de animales experimentales con VLPs quiméricas que
contienen un agente STD, y la estimulación consecutiva con el agente
STD, y midiendo el aumento de la supervivencia respecto a la
estimulación letal o a la disminución de la infección después de la
estimulación sub-letal.
Tal como se expone en el Ejemplo 12, las
partículas quiméricas pueden ensayarse, por ejemplo, respecto a la
inducción de inmunidad terapéutica contra papilomas
pre-existentes, por ejemplo, inmunizando conejos
(que tienen papilomas pre-existentes) utilizando
VLPs CRPV quiméricas y VLPs CRPV no quiméricas (control), y midiendo
la regresión de los papilomas pre-existentes.
Tal como se expone en el Ejemplo 13, las
partículas quiméricas pueden ensayarse, por ejemplo, para la
inmunoterapia y la prevención inmune de los tumores.
Aspectos particulares de la invención podrán
entenderse más fácilmente haciendo referencia a los ejemplos
siguientes, que pretenden ejemplificar la invención, sin limitar su
alcance a las formas de realización particulares mostradas a título
de ejemplo.
Se generaron tres químeros:
HPV16L2-HPV16E7, BPVL2-HPV16E7 y
BPVL2-HPV16E7 (aminoácidos 1-30).
HPV16L2-HPV16E7 contenía el HPV16E7 de longitud
completa fusionado al extremo C (473 aminoácidos) de HPV16L2.
BPVL2-HPV16E7 contenía el HPV16E7 de longitud
completa fusionado al extremo C de BPVL2 (469 aminoácidos).
BPVL2-HPV16E7 (1-30 aminoácidos)
contenía los primeros 30 aminoácidos de HPV16E7 fusionados en el
medio de BPVL2 entre los aminoácidos 274 y 275.
Los genes quiméricos L2-E7 se
generaron mediante técnicas PCR recombinantes (Higuchi, R. (1990) en
"PCR Protocols; A guide to methods and applications", ed.
Innis, MA, Gelfand, DH, Sninsky, JJ, y White, T.J. (Academic, New
York, pág 177-180). Para los quimeros que contenían
el HPV16E7 con longitud completa, L2 se amplificó con un 5' oligo
que contenía un sitio de restricción enzimática, y un 3' oligo que
era complementario para el E7 5' oligo. En una reacción
independiente, E7 se amplificó con un 5' oligo complementario al L2
3' oligo y un 3'oligo que contenía un sitio de restricción
enzimática. Los genes L2 y E7 se fusionaron entonces en una reacción
de extensión con un segundo iniciador, utilizando sólo los oligos
externos (L2 5', y E7 3'). Para los quimeros que contenían sólo los
aminoácidos 1-30 de HPV16E7, los iniciadores
"internos" codificaron los primeros 30 aminoácidos de
HPV16E7.
Los genes fusionados se clonaron entonces en el
vector baculovírico de doble expresión pSynwtVI- (que ya contenía L1
clonada bajo el promotor polihedrina (Kirnbauer et al,. Virol.
67:6929 (1993)) inmediatamente por debajo del promotor pSyn.
Los químeros BPVL2-HPV16E7 se
clonaron como fragmentos 5'BgIII a 3'BgIII. El quimero
HPV16L2-HPV16E7 se clonó como un fragmento 5' Sstll
a 3'Sstll. Los cebadores utilizados para
BPVL2-HPV16E7 (longitud completa) fueron:
BPVL2 con sentido,
5'GCGGTAGATCTACCTATAAATATGAGTGCACGAAAAAGATAAAACGT3'
(SEC ID nº:1)
y antisentido,
5'GCAATGTAGGTGTATCTCCATGCATGGCATGTTTCCGTTTTTTTCATTTCCTCAACAAGGAGGG3'
(SEC ID nº2)
(SEC ID nº2)
HPV16E7, con sentido,
5'CCCTCCTGTTGAGGAAACGAAAAAAACGGAAACATGCCATGCATGGAGATACACCTACATTGC3'
(SEC ID nº3)
(SEC ID nº3)
y antisentido,
5'CCGCTAGATCTGGTACCTGCAGGATCAGCCATGG3'
(SEC ID nº 4)
Los cebadores utilizados para
BPVL2-HPV16E7 (aminoácidos 1-30)
fueron los siguientes: BPVL2, con sentido: lo mismo que
anteriormente.
Cebador interno, antisentido,
5'CAGTTGTCTCTGGTTGCAAATCTAACATATATTCATGCAATGTAGGTGTATCTCCATGCATGGATGAA
AACACTTCAGGATCTTCCGTGGGC3' (SEC ID nº5)
AACACTTCAGGATCTTCCGTGGGC3' (SEC ID nº5)
Cebador interno, con sentido
5'GCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGATCTCTACTGTTATGAGCAATTAAATGA
CCAAACATTTGAAACCCACTGTATGAAGCAGAAGG3' (SEC ID nº6)
CCAAACATTTGAAACCCACTGTATGAAGCAGAAGG3' (SEC ID nº6)
BPVL2, antisentido
5'CCGCTAGATCTAGGGAGATACAGCTTCTGGCCTTCTTGCCACAACGC3'
(SEC ID nº 7)
Los cebadores utilizados para los quimeros
HPV16L2-HPV16E7 fueron los siguientes: HPV16L2, con
sentido,
5'GCGGTCCGCGGAATATGCGACACAAACGTTCTGCAAAACGCACAAAACGT3'
(SEC ID nº 8)
y antisentido
5'ATCTCCATGCATGGCAGCCAAAGAGAC3' (SEC ID nº 9)
HPV16E7, con sentido,
5'GTCTCTTTGGCTGCCATGCATGGAGAT3' (SEC ID 10)
y antisentido
5'GCTCCGCGGGGTACCTGCAGGATCAGCC3' (SEC ID
nº 11)
Un plásmido recombinante purificado con CsCl se
cotransfectó con ADN de baculovirus (Baculo-Gold;
PharMingen, San Diego, CA) en células Sf9 de insecto (ATCC, CRL
1711) utilizando Lipofectina (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) (Hartig,
P.C. Biotechniques 11:310 (1991)). Los baculovirus recombinantes se
purificaron en placa tal como se describe (Summers, M.D. &
Smith, G.E. (1987). "A Manual of Methods for Baculovirus Vectors
and Insect Cell Culture Procedures", Texas, Agricultural
Experiment Station Bulletin (Tex. Agric. Exp. Stn., College Station,
TX). Vol 1555).
Células Sf9 de insectos se infectaron con
múltiples infecciones (10) con baculovirus recombinantes. Después de
72 horas, las células recuperadas se trataron con ultrasonidos en
una solución salina tamponada de fosfato (PBS) durante 60 segundos.
Después de clarificación a baja velocidad, los lisados se sometieron
a centrifugación a 110.000 x g durante 2,5 horas mediante una
almohadilla de sacarosa al 40% (peso/vol)/PBS (rotor
SW-28). Los sedimentos vueltos s suspender se
centrifugaron hasta alcanzae el equilibrio a 141.000 x g durante 20
horas a temperatura ambiente en un gradiente de CsCl al
10-40% (peso/vol)/PBS. La banda visible se recuperó,
se centrifugó hasta equilibrio otra vez utilizando condiciones
idénticas, se dializó extensamente contra PBS, y se conservó a
4ºC.
Para determinar si la proteína de fusión
L2-E7 se incorporó a las partículas, se llevó a cabo
una centrifugación de gradiente analítico tal como se ha descrito
previamente (para la determinación del co-ensamblaje
de L1 y L2 (Kirnbauer et al,. Virol. 87:6929 (1993)).
Brevemente, se permitió que un gradiente de
sacarosa del 12-45 % se linearizara durante la noche
a 4ºC, y las muestras dializadas formaron una capa en la parte
superior, y el gradiente se centrifugó a 41.000 rpm (288.000 x g)
durante 2 horas en un rotor SW-41. Las fracciones se
recuperaron. Las fracciones se analizaron mediante
SDS-PAGE con tinción de Coomassie (L1) o
transferencia Western con un Ab policlonal
anti-BPVL2, o Ab policlonal
anti-HPV16E7, anti IgG de conejo marcada con
I^{125}.
La asociación de la L2-E7
quimérica con las partículas de tipo vírico se estableció mediante
co-sedimentación.
Para obtener evidencia de que las proteínas de
fusión L2-E7 formaban complejos estables con L1, se
llevaron a cabo experimentos de
co-inmunoprecipitación.
Brevemente, preparaciones VLP de
BPVL1/L2-HPV16E7 (longitud completa) y
BPVL1/L2-HPV16E7 (aminoácidos 1-30)
se inmunoprecipitaron en PBS, Triton® X-100 al 1%,
con Mab 5B6 anti-L1 (Roden et al., J. Virol.,
en prensa, (noviembre, 1994)), Ab policlonal
anti-L1, suero preinmune o un Ab irrelevante
(anti-E1A Mab) y proteína
A-Sepharose y se sometieron a
SDS-PAGE. Las proteínas se inmunotransfirieron y
sondearon con anti-BPVL2, o suero
anti-HPV16E7, o un anti-HPV16E7 Mab
(Triton Diagnostics, Alameda, CA).
La asociación de la L2-E7
quimérica con las partículas de tipo vírico se estableció mediante
co-inmunoprecipitación.
Se inmunizaron conejos mediante inyección
subcutánea de 330 ul de partículas purificadas en gradiente de CsCl,
en PBS con una concentración de 1 mg/ml. Los conejos se revacunaron
con la misma cantidad de partículas dos semanas y cuatro semanas
después de la inyección primaria.
Se llevó a cabo un ensayo de la formación de foco
tal como se describe en Kirnbauer et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89:12180(1992).
Brevemente, diluciones seriales de conejos
obtenidas 3 semanas después de la segunda inyección de revacunación,
se incubaron con aproximadamente 500 unidades
foco-formadoras de virus BPV1 durante 30 minutos,
adsorbiéndose el virus a células C127 durante 1 hora, cultivándose
las células durante 3 semanas (Dvoretzky et al., Virology
103:369 (1980)). Los focos se tiñeron entonces con azul de metileno
al 0,5 %/carbol fucsina al 0,25 % en metanol.
Se obtuvieron títulos de neutralización
equivalentes de 30.000 para las VLPs BPVL1/L2 y las VLPs
BPVL1/L2-HPV16E7 (de longitud completa)
quiméricas.
Se aplicó la microscopía electrónica de
transmisión tal como se describe por Kirnbauer et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89:12180(1992).
Brevemente, las partículas purificadas se
adsorbieron a cuadrículas revestidas con carbono, se tiñeron con
acetato de uranilo al 1 %, y se examinaron con un microscopio
electrónico Philips, modelo EM 400T con una ampliación de
x36.000.
Se encontró que las partículas que contenían la
proteína de fusión L2-E7 eran indistinguibles de las
VLPs L2 ó L1/L2 en términos de morfología y eficiencia de
incorporación.
Los conejos inoculados con partículas de tipo
papilomavirus BPVL1/L2-HPV16E7 produjeron
antisueros que reconocieron E7.
Para analizar los sueros respecto a la
especificidad de E7, 2,5 \mug de HPV16E7 y 2,5 \mug de BSA
(control), se sometieron a SDS-PAGE y entonces a
transferencia Western. Sueros inmunes e preinmunes (control) se
aplicaron a una dilución de 1:10.
El suero procedente de los conejos inmunes
detectó específicamente la banda proteica HPV16E7 en un ensayo de
transferencia Western, indicando la inducción de anticuerpos
específicos para los epítopos de E7.
Se ensayaron las partículas quiméricas respecto a
la inducción de inmunidad mediada celularmente específica para los
péptidos E7, por ejemplo, inyectando VLPs quiméricas en ratones, y
midiendo la proliferación de células T
antígeno-específicas.
Las partículas quiméricas se ensayaron respecto a
la inducción de inmunidad profiláctica contra el estímulo de la
infección, por ejemplo, mediante la inmunización de conejos con VLPs
CRPV quiméricas y VLPs CRPV no quiméricas (control), y la
estimulación consecutiva con CRPV infeccioso, para demostrar que las
fusiones de E7 no abolen la inmunidad profiláctica; o mediante la
inmunización de animales experimentales con VLPs quiméricas que
contienen un agente STD, y la estimulación consecutiva con el agente
STD, y midiendo el aumento de la supervivencia respecto a la
estimulación letal o a la disminución de la infección después de la
estimulación sub-letal.
Las partículas quiméricas se ensayaron respecto a
la inducción de inmunidad terapéutica contra papilomas
pre-existentes, por ejemplo, inmunizando conejos
(que tienen papilomas pre-existentes) utilizando
VLPs CRPV-E7 quiméricas y VLPs CRPV no quiméricas
(control), y midiendo la regresión de los papilomas
pre-existentes.
Las partículas quiméricas se ensayaron respecto a
la capacidad para prevenir el desarrollo tumoral o tratar tumores
existentes, por ejemplo, en animales experimentales tales como
ratones, utilizando células tumorales que expresaran, por
ejemplo, E7. Los animales se inmunizaron con, por
ejemplo, VLPs quiméricas L2-E7, y se ensayaron
respecto al desarrollo de células tumorigénicas inoculadas que
expresaban, por ejemplo, E7. Este planteamiento se ha
mostrado que funciona para los animales inmunizados con la E7 que no
forme complejos y una proteína co-estimuladora (Chen
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:110 (1991)).
Puede resultar deseable que ciertas moléculas,
tales como los co-estimuladores o ligandos que se
unen a las superficies celulares, se encuentren en la superficie de
las VLPs quiméricas. Roden et al,. J.Virol., en prensa
(noviembre 1994) determinó que las regiones de L2 se localizan en la
superficie de VLPs. Un péptido compuesto por los aminoácidos
44-173 de BPV L2, cuando se inoculó a los ratones,
indujo anticuerpos neutralizantes que fueron activos a una dilución
de 1:1000. Estos resultados indican que regiones de L2 especifican
epítopos neutralizantes, y que estas regiones son por tanto
accesibles a la superficie de los viriones nativos.
Consecuentemente, la fusión de un polipéptido no-L2
a una de estas regiones, daría lugar a dirigir este polipéptido a la
superficie de una VLP quimérica.
Aunque se han descrito en detalle unas formas de
realización particulares de la invención, resultará evidente para
los expertos en la materia que estas formas de realización
constituyen ejemplos, y no limitaciones, y que el verdadero alcance
de la invención es el definido en las reivindicaciones adjuntas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: The United States of America
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Partículas quiméricas de tipo papilomavirus
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 11
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DIRECCIÓN: Knobbe, Martens, Olson and Bear
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 620 Newport Center Drive 16^{th} Floor
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Newport Beach
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: CA
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CP: 92660
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: FastSEQ Versión 1.5
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FECHA DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
- (viii)
- DATOS DE ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Ways Vensko, Nancy
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 36,298
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE DOCUMENTO: NIH032.001CP2
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE CONTACTO:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 619-235-8550
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FAX: 619-235-0176
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TELEX:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGGTAGATC TACCTATAAA TATGAGTGCA CGAAAAAGAG TAAAACGT
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 64 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCATGTAGG TGTATCTCCA TGCATGGCAT GTTTCCGTTT TTTTCGTTTC CTCAACAAGG
\hfill60
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGG
\hfill64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 64 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCTCCTTGT TGAGGAAACG AAAAAAACGG AAACATGCCA TGCATGGAGA TACACCTACA
\hfill60
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGC
\hfill64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGCTAGATC TGGTACCTGC AGGATCAGCC ATGG
\hfill34
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 92 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTTGTCTC TGGTTGCAAA TCTAACATAT ATTCATGCAA TGTAGGTGTA TCTCCATGCA
\hfill60
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGATGAAAA CACTTCAGGA TCTTCCGTGG GC
\hfill92
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 102 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCATGAATAT ATGTTAGATT TGCAACCAGA GACAACTGAT CTCTACTGTT ATGAGCAATT
\hfill60
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAATGACCAA ACATTTGCAA ACCCACTGTA TGAAGCAGAA CC
\hfill102
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 47 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGCTAGATCTAGGGAGATA CAGCTTCTGG CCTTGTTGCC ACAACGC
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGGTCCGCG GAATATGCGA CACAAACGTT CTGCAAAACG CACAAAACGT
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCTCCATGC ATGGCAGCCA AAGAGAC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCTCTTTGG CTGCCATGCA TGGAGAT
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 11:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTCCGCGGG GTACCTGCAG GATCAGCC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (29)
1. Partícula de tipo papilomavirus que posee
epítopos conformacionales y que comprende una proteína L1 del
papilomavirus y un producto de fusión L2 del papilomavirus,
comprendiendo dicho producto de fusión una proteína L2, o un
fragmento peptídico de la misma, unido a un elemento de
emparejamiento de la fusión que es una proteína antigénica distinta
de L2, o un fragmento antigénico peptídico de la misma.
2. Partícula de tipo papilomavirus según la
reivindicación 1, en la que la proteína o péptido antigénico se
selecciona de entre las proteínas o péptidos de agentes
infecciosos.
3. Partícula de tipo papilomavirus según la
reivindicación 2, en la que dicho elemento de emparejamiento de la
fusión es una proteína o péptido del papilomavirus, preferentemente
una proteína o péptido E6 ó E7.
4. Partícula de tipo papilomavirus según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además un
producto de fusión que contiene un dominio de unión de una proteína
co-estimuladora o un receptor accesorio o ligando
implicado en la reactividad inmunológica, por ejemplo B7 (que
interactúa con CD28 en las células T), una molécula de adhesión
intercelular (ICAM), un antígeno funcional de linfocitos (LFA), una
molécula de adhesión a la célula vascular (VCAM-1) o
un antígeno termoestable (HSA).
5. Partícula de tipo papilomavirus según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho
producto de fusión L2 del papilomavirus es un producto de fusión L2
del papilomavirus humano o un producto de fusión L2 del
papilomavirus bovino.
6. Partícula de tipo papilomavirus según la
reivindicación 5, en la que dicho producto de fusión L2 del
papilomavirus humano es un producto de fusión de HPV16L2 y dicho
producto de fusión del papilomavirus L2 bovino es un producto de
fusión BPV1 L2.
7. Partícula de tipo papilomavirus según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho
elemento de emparejamiento de la fusión consiste en fragmentos
peptídicos de proteínas de longitud completa, o sus combinaciones,
unidas en tándem.
8. Partícula de tipo papilomavirus según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha
proteína o péptido L2 del papilomavirus se fusiona con el elemento
de emparejamiento de fusión en su extremo N ó C.
9. Partícula de tipo papilomavirus según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho producto
de fusión L2 del papilomavirus posee un elemento de emparejamiento
de fusión inserto entre aminoácidos de la proteína o péptido L2.
10. Partícula de tipo papilomavirus según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha
proteína L1 del papilomavirus es una proteína L1 del papilomavirus
humano o una proteína L1 del papilomavirus bovino.
11. Partícula de tipo papilomavirus según la
reivindicación 10, en la que dicha proteína L1 del papilomavirus
humano es una proteína HPV16L1 y dicha proteína L1 del papilomavirus
bovino es una proteína BPV1L1.
12. Partícula de tipo papilomavirus según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la
partícula está formada por la proteína L1 y el producto de fusión de
L2, y se selecciona de entre el grupo formado por:
- (1)
- HPV16L1 y HPV16L2-HPV16E7 (de longitud completa), en las que opcionalmente HPV16E7 se fusiona con el extremo C de HPV16L2;
- (2)
- BPVL1 y BPVL2-HPV16E7 (de longitud completa), en las que opcionalmente HPV16E7 se fusiona con el extremo C de BPVL2; y
- (3)
- BPVL1 y BPVL2-HPV16E7 (aminoácidos 1-30), en las que opcionalmente los aminoácidos 1-30 de HPV16E7 se fusionan con BPVL2 entre los aminoácidos 274 y 275.
13. Procedimiento para la purificación de una
partícula de tipo papilomavirus según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, que comprende la etapa de exposición de la
partícula de tipo papilomavirus según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12 a una columna de cromatografía de afinidad
que incluye anticuerpos que se unen al elemento de emparejamiento de
fusión del producto de fusión L2 del papilomavirus de la partícula
de tipo papilomavirus, que da como resultado la purificación de
dicha partícula.
14. Procedimiento para la purificación del
elemento de emparejamiento de fusión, del producto de fusión L2 del
papilomavirus, de la partícula del tipo papilomavirus, según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende la etapa de
aislamiento de dicha partícula del tipo papilomavirus, según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que da como resultado la
purificación de dicho elemento de emparejamiento de fusión.
15. Procedimiento para el suministro a una
célula del elemento de emparejamiento de fusión del producto de
fusión L2 de un papilomavirus, como parte de la partícula de tipo
papilomavirus según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que
comprende la etapa de administración de dicha partícula a dicha
célula in vitro o ex vivo, que da como resultado el
suministro a dicha célula de dicho elemento de emparejamiento de
fusión.
16. Composición inmunogénica que comprende la
partícula de tipo papilomavirus, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12.
17. Partícula de tipo papilomavirus según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para su utilización como
una composición farmacéutica.
18. Utilización de una partícula de tipo
papilomavirus según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para
la preparación de un medicamento, con el fin de estimular una
respuesta inmune en un mamífero huésped.
19. Molécula de ADN que comprende una secuencia
de ácido nucleico que codifica una proteína L1 del papilomavirus y
un producto de fusión L2 del papilomavirus, comprendiendo dicho
producto de fusión una proteína L2 o un fragmento peptídico de la
misma unido a un elemento de emparejamiento de fusión constituido
por una proteína antigénica distinta de L2, o un fragmento
antigénico peptídico de la misma, en la que dicha molécula es capaz
de dirigir la expresión en una célula transformada de partículas de
tipo papilomavirus que tienen epítopos conformacionales y en la que
dichas partículas comprenden dicha proteína L1 del papilomavirus y
el producto de fusión L2 del papilomavirus.
20. Molécula de ADN según la reivindicación 19,
en la que la molécula de ADN es capaz de dirigir la expresión en una
célula de insecto transformada, y el ADN comprende además un vector
de célula de insecto, o en la que la molécula de ADN es capaz de
dirigir la expresión en una célula transformada de mamífero,
comprendiendo además el ADN un vector de la célula de mamífero, o en
la que la molécula de ADN es capaz de dirigir la expresión en una
célula transformada de levadura, comprendiendo además el ADN un
vector de la célula de levadura.
21. Célula huésped transformada con una o más
moléculas de ADN que codifican conjuntamente una proteína L1 del
papilomavirus y un producto de fusión L2 del papilomavirus,
comprendiendo dicho producto de fusión una proteína L2, o un
fragmento peptídico de la misma, unido a un elemento de
emparejamiento de fusión que es una proteína antigénica distinta de
L2, o un fragmento antigénico peptídico de la misma, en la que
dicha molécula o moléculas dirige o dirigen la expresión de
partículas de tipo papilomavirus que tienen epítopos
conformacionales y en la que dichas partículas comprenden dicha
proteína L1 del papilomavirus y el producto de fusión L2 del
papilomavirus.
22. Célula huésped según la reivindicación 21, en
la que la proteína L1 del papilomavirus y el producto de fusión L2
del papilomavirus son codificados sobre la misma molécula de
ADN.
23. Célula huésped según la reivindicación 21, en
la que la proteína L1 del papilomavirus y el producto de fusión L2
del papilomavirus son codificados sobre distintas moléculas de
ADN.
24. Procedimiento para la producción de una
partícula de tipo papilomavirus, que posee epítopos
conformacionales, que comprende una proteína L1 del papilomavirus y
un producto de fusión L2 del papilomavirus, comprendiendo dicho
producto de fusión una proteína L2, o un fragmento peptídico, unido
a un elemento de emparejamiento de fusión que es una proteína
antigénica distinta de L2, o un fragmento antigénico peptídico de la
misma, comprendiendo dicho procedimiento la provisión de las
condiciones para que la célula huésped según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 23, exprese dicho ADN, produciendo de este
modo dicha partícula.
25. Procedimiento según la reivindicación 24, que
comprende además la recuperación de dicha partícula a partir de
dicha célula huésped.
26. Composición que comprende una primera
molécula de ADN que codifica una proteína L1 del papilomavirus y una
segunda molécula de ADN que codifica un producto de fusión L2 del
papilomavirus, comprendiendo dicho producto de fusión una proteína
L2, o un fragmento peptídico de la misma, unido a un elemento de
emparejamiento de fusión que es una proteína antigénica distinta de
L2, o un fragmento antigénico peptídico de la misma, en la que
dichas moléculas son capaces de dirigir la expresión en una célula
transformada de partículas de tipo papilomavirus que tienen epítopos
conformacionales, y en la que dichas partículas comprenden dicha
proteína L1 del papilomavirus y dicha proteína de fusión L2 del
papilomavirus.
27. Composición según la reivindicación 26, en la
que las moléculas de ADN son capaces de dirigir la expresión en una
célula de insecto transformada, y el ADN de cada dicha molécula
comprende además un vector de célula de insecto, o en la que las
moléculas de ADN son capaces de dirigir la expresión en una célula
transformada de mamífero, comprendiendo además el ADN de cada una de
dichas moléculas un vector de célula de mamífero, o en la que las
moléculas de ADN son capaces de dirigir la expresión en una célula
transformada de levadura, comprendiendo además el ADN de cada una de
dichas moléculas un vector de la célula de levadura.
28. Utilización in vitro o ex vivo
de una partícula de tipo papilomavirus según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, como una plataforma para la presentación
antigénica multivalente.
29. Utilización in vitro o ex vivo
de una partícula de tipo papilomavirus según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, para el suministro a las células de
proteínas con el fin de procesarlas a péptidos y la ulterior
presentación de dichos péptidos en el contexto de las moléculas MHC,
para provocar una respuesta inmunitaria mediada celularmente.
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