MXPA00003358A - Formulaciones de vacuna del capsomero del virus de papiloma y metodo de uso.?? - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a formulaciones de vacuna que comprenden capsómeros virales con métodos para su producción. También se describen métodos terapéuticos y profilácticos de uso para las formulaciones de vacuna.

Description

FORMULACIONES DE VACUNA DEL CAPSOMERO DEL VIRUS DE PAPILOMA Y MÉTODO DE USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a las formulaciones de vacunas conteniendo proteínas de virus de papiloma, como proteínas de fusión, proteínas truncadas o proteínas de fusión truncadas. La invención además comprende los métodos para producir capsómeros de las formulaciones, así como a los métodos profilácticos y terapéuticos para su uso.

ANTECEDENTES Las infecciones con ciertas cepas de alto riesgo de virus de papiloma genital en humanos (HPV) , por ejemplo, HPV 16, 18 ó 45, son consideradas el factor de riesgo principal para la formación de tumores malignos del tracto anogenital. De las malignidades posibles, el carcinoma genital es con mucho el más frecuente; de acuerdo con un estimado de la Organización Mundial de la Salud (OMS), casi 500,000 nuevos casos de la enfermedad ocurren al año. Debido a la frecuencia con la que ocurre esta patología, la conexión entre infección por HPV y carcinoma cervical se ha examinado exhaustivamente, dando origen a diversas generalizaciones. Por ejemplo, se sabe que las lesiones precursoras de neoplasia intraepitelial cervical (NIC) son causadas por infecciones por virus de papiloma [Crum, New Eng. J. Med. 310: 880-883 (1984)]. El D?A de los genomas de ciertos tipos de HPV, incluidas, por ejemplo, las cepas 16, 18, 33, 35 y 45, ha sido detectado en más de 95% de biopsias de tumor de 5 pacientes con esta anomalía, así como en líneas de células primarias cultivadas de los tumores. Se ha encontrado que aproximadamente 50 a 70% de las biopsias de células de tumor ?IC incluyen el D?A proveniente solo de HPV 16. Los productos proteínicos de los genes tempranos de HPV 10 16 y HPV 18, E6 y E7, han sido detectados en 'líneas de células de carcinoma cervical así como en queratinocitos humanos transformados in vi tro [Wettstein, y col., en PAPILLOMA VIRUSES A?D HUMAN CÁNCER, Pfister (Ed.) , CRC Press: Boca Ratón, FL 1990 pp 155-179] y un porcentaje significativo de pacientes con carcinoma tienen anticuerpos anti-E6 ó anti-E7. Se ha demostrado que las proteínas E6 y E7 participan en la inducción de la síntesis de DNA celular gfc en células humanas, la transformación de queratinocitos humanos .y otros tipos de células, y la formación del tumor en ratones transgénicos [Arbelt, y col., J. Virol . , (58:4358- 4364 (1994); Aue arakul, y col., Mol . Cell . Bi ol . 14 : 8250- 8258 (1994); Barbosa, y col, J. Virol . 55:292-298 (1991); Kaur, y col., J. Gen. Virol . 70:1261-1266 (1989); Schlegel, y col., EMBO J. , 7:3181-3187 (1988)]. Parece ser que la expresión constitutiva de las proteínas E6/E7 es necesaria para mantener la condición de transformación de los tumores positivos para HPV. A pesar de la capacidad de algunas cepas de HPV para inducir fenotipos neoplásticos in vivo e in vi tro, todavía otros tipos de HPV causan verrugas genitales benignas como condiloma acuminado y solo en raras ocasiones está asociado con tumores malignos [Ikenberg, In Gross, y col., (eds.) GENITAL PAPILLOMA VIRUS INFECTIONS, Springer Verlag: Berlín, pp. 87-112]. Las cepas de bajo riesgo de este tipo incluyen, por ejemplo, HPV 6 y 11. Es muy frecuente que los virus de papiloma genital sean transmitidos entre humanos durante contacto sexual que en muchos casos da origen a infección persistente en la membrana mucosa anogenital. Aunque esta observación sugiere que la infección primaria induce una respuesta inmune inadecuada o que el virus ha desarrollado la capacidad de evitar observación inmunitaria, otras observaciones sugieren que el sistema inmunitario esta activo durante la manifestación primaria así como durante el progreso maligno de las infecciones por virus de papiloma [Altmann y col., en VIRUSES AND CÁNCER, Minson y col., (eds.) Cambridge University Press, (1994), pp. 71-80. Por ejemplo, la manifestación clínica de infección primaria por virus de papiloma de conejo y bovino puede prevenirse mediante vacunación con extractos de verruga o proteínas estructurales virales [Altmann, y col., supra; Campo, Curr. Top. In Microbiol and Immunol . 186: 255-266 (1994); Yindle y Frazer, Curr. Top. In Mi crobiol and Immunol . 186: 211-253 (1994)]. Los roedores previamente vacunados con recombinantes de vacuna que codifican para las proteínas tempranas de HPV 16 E6 ó E7, o con los péptidos sintéticos de E6 ó E7, están de la misma manera protegidos de formación de tumor después de la inoculación de las células autólogas transformadas del HPV 16 [Altmann, y col., supra; Yindle y Frazer, y col., supra]. La regresión de las verrugas puede ser inducida por la transferencia de linfocitos de los animales regresores después de inyección por virus de papiloma animal. Por último, en pacientes inmunosuprimidos como pueden ser, por ejemplo, recipientes de trasplantes de órganos o personas infectadas con VIH, es elevada la incidencia de verrugas genitales, NIC, y cáncer anogenital. A la fecha no han sido descritas vacunaciones de HPV que " contengan la proteína tardía Ll del virus de papiloma humano en la forma de capsómeros que sean adecuados para propósitos profilácticos y terapéuticos. Dado que la proteína Ll no está presente en lesiones genitales malignas, la vacunación con la proteína Ll no tiene ningún potencial terapéutico para estos pacientes. La construcción de proteínas quiméricas, conteniendo residuos de aminoácidos de la proteína Ll y, por ejemplo, la proteína E6 ó E7, que dan origen a capsómeros quiméricos, combina las funciones profilácticas y terapéuticas de una vacuna. Un método para la producción a alto nivel de capsómeros quiméricos, por tanto, sería particularmente deseable, en vista de las ventajas posibles que ofrecen una vacuna para intervención profiláctica y terapéutica. De esta manera, existe una necesidad en la técnica de proporcionar formulaciones de vacuna que puedan prevenir o tratar infección por HPV. Los métodos para producir formulaciones de vacunas que superen los problemas conocidos en la técnica para estar asociadas con la expresión y purificación de la proteína de HPV recombinante evidentemente serán útiles para tratar la población de personas ya infectadas con HPV así como útiles para inmunizar las poblaciones de individuos susceptibles a la infección por HPV.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención ofrece las formulaciones de vacuna terapéuticas y profilácticas conteniendo capsómeros quiméricos de papiloma humano. La invención también proporciona los métodos terapéuticos para el tratamiento de pacientes infectados con HPV así como los métodos profilácticos para prevenir infección por HPV en un individuo susceptible. También se contemplan los métodos para la producción y purificación de capsómeros y proteínas de la invención. • En un aspecto de la invención, se consideran las 5 vacunaciones profilácticas para la prevención de infección por HPV las cuales incorporan las proteínas estructurales Ll y L2 del virus de papiloma. El desarrollo de una vacuna de este tipo enfrenta obstáculos importantes debido a que los virus de papiloma no pueden ser propagados a títulos 4fc 10 adecuados en cultivos de células u otros sistemas experimentales para proporcionar las proteína virales en cantidad suficiente para la producción económica de la vacuna. Además, las metodologías recombinantes para expresar las proteínas no siempre son directas y con frecuencia dan origen a bajo rendimiento de la proteína. Recientemente, las partículas tipo virus (VLP) , semejantes en constitución a las estructuras de la cápside viral, han sido descritas las fl cuales se forman en células de insecto Sf-9 en la expresión de las proteínas virales Ll y L2 (o la propia Ll) utilizando vacuna recombinante o baculovirus. La purificación de las VLP puede lograrse simplemente por medio de centrifugación en CsCl ó gradientes de sacarosa [Kimbaurer, y col., Proc. Na ti . Acad. Sci . (USA) , 99: 12180-12814 (1992); Kirnbaurer, y col., J. Virol . , 67:6929-6936 (1994); Proso, y col., J.

Virol . 6714 : 1936-1944 (1992); Sasagawa, y col., Virology 2016:126-195 (1995); Volpers, y col., J. Virol . 69:3258-3264 (1994); Zhou, y col., J. Gen . Virol . 74 : 162-169 (1993); Zhou, y col., Virology 185: 251-251 (1991)]. WO 93/02184 describe un método en el cual las partículas tipo virus de papiloma (VLP) se utilizan para aplicaciones de diagnóstico o como una vacuna contra infecciones causadas por virus de papiloma. WO 94/00152 describe la producción recombinante de la proteína Ll que imita el epitomo neutralizante conformacional en viriones de papiloma humano y animal. En otro aspecto de la invención, se proporcionan las vacunaciones terapéuticas para aliviar complicaciones de, por ejemplo, carcinoma cervical o lesiones precursoras resultantes de infección por virus de papiloma, y así representar una alternativa a la intervención profiláctica. Las vacunaciones de este tipo pueden contener proteínas tempranas de virus de papiloma, principalmente E6 ó E7, que se expresan en las células persistentemente infectadas. Se supone que, después de la administración de una vacuna de este tipo, las células T citotóxicas pueden ser activadas contra células persistentemente infectadas en lesiones genitales. La población objetivo para intervención terapéutica es pacientes con lesiones genitales premalignas o malignas asociadas con HPV. La solicitud de patente del PCT WO 93/20844 describe que la proteína temprana E7 y los fragmentos antigénicos de la misma del virus de papiloma provenientes de HPV o VPB es terapéuticamente eficaz en la regresión, pero no en la prevención, de tumores de virus de papiloma en mamíferos. Aunque las proteínas tempranas de HPV han sido producidas por expresión recombinante en E. coli o tipos de células eucarióticas adecuadas, se ha confirmado la dificultad de la purificación de proteínas recombinantes debido a la baja solubilidad inherente y los procedimientos de purificación complejos que generalmente requieren una combinación de pasos, incluida la cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel y de afinidad. De acuerdo con la presente invención, se proporcionan las formulaciones de vacunas conteniendo capsómeros de virus de papiloma que contienen: (i) una primera proteína que es una proteína viral intacta expresada como una proteína de fusión compuesta en parte de residuos de aminoácidos de una segunda proteína; (ii) una proteína viral truncada; (iii) una proteína viral truncada expresada como una proteína de fusión compuesta en parte de residuos de aminoácidos de una segunda proteína, ó (iv) alguna combinación de los tres tipos de proteínas. De acuerdo con la invención, se proporcionan las formulaciones de vacunas conteniendo capsómeros de virus de papiloma bovino (VPB) y virus de papiloma humano. Los capsómeros de virus de bovino preferidos consisten en proteínas de virus de papiloma bovino tipo I . Los capsómeros de virus humanos preferidos consisten en proteínas de cualquiera de las cepas de virus de papiloma humano HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 33, HPV 35 y HPV 45. Las formulaciones de vacunas más preferidas contienen capsómeros consistiendo en proteínas de HPV 16. En un aspecto, las formulaciones de vacunas de capsómeros de la invención contienen una primera proteína viral intacta expresada como una proteína de fusión con residuos aminoácidos adicionales de una segunda proteína. Las proteínas virales intactas preferidas son las proteínas virales de papiloma, estructurales Ll y L2. Los capsómeros compuestos de fusiones de proteínas virales intactas pueden ser producidos utilizando las proteínas Ll y L2 juntas o la proteína Ll sola. Los capsómeros preferidos están constituidos completamente de proteínas de fusión Ll, la secuencia de aminoácidos de las cuales se establecen en la SEQ ID NO: 2 y codificada por la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 1. Los aminoácidos de la segunda proteína puede ser obtenidos de numerosas fuentes (incluidos los residuos aminoácidos de la primera proteína) siempre y cuando la adición de los residuos aminoácidos de la segunda proteína a la primera proteína permita la formación de los capsómeros. De preferencia, la adición de los residuos de aminoácidos de la segunda proteína inhibe la capacidad de la proteína viral intacta para formar estructuras de partículas tipo virus; de mayor preferencia, los residuos de aminoácidos de la segunda proteína favorecen la formación del capsomero . En una modalidad de la invención, la segunda proteína, puede ser cualquier antígeno de tumor humano, antígeno viral o antígeno bacteriano que sea importante en la estimulación de una respuesta inmune en estados de enfermedad neoplásticos o infecciosos. En una modalidad preferida, la segunda proteína también es una proteína de virus de papiloma. También se prefiere que la segunda proteína sea el producto de expresión del gen temprano del virus de papiloma. También se prefiere, no obstante, que la segunda proteína sea seleccionada del grupo de El, E2, E3, E4, E5, E6 y E7, los productos genéticos tempranos codificados en el genoma de las cepas de virus de papiloma HPV6, HPV11, HPV18, HPV33, HPV35 ó HPV 5. Es más preferible que la segunda proteína sea codificada por el gen HPV16 E7, el marco de lectura abierto del cual se establece en la SEQ ID NO: 3. Los capsómeros ensamblados de las. subunidades de las proteínas de fusión son mencionados en la presente como capsómeros quiméricos. En una modalidad, la formulación de vacunas de la invención esta compuesta de capsómeros quiméricos, en donde los residuos de aminoácidos de la proteína Ll constituyen aproximadamente de 50 a 99% de los residuos aminoácidos de la proteína de fusión total. En otra modalidad, los residuos aminoácidos de Ll constituyen aproximadamente 60 a 90% de los residuos aminoácidos de la proteína de fusión total; en una modalidad particularmente preferida, los aminoácidos de Ll constituyen aproximadamente 80% de los residuos aminoácidos de la proteína de fusión. En otro aspecto de la invención, se proporcionan las formulaciones de vacunas de capsómero que están compuestas de proteínas virales truncadas teniendo una deleción de 1 ó más residuos aminoácidos necesarios para la formación de una partícula tipo virus. Se prefiere que la deleción de aminoácidos no inhiba la formación de los capsómeros por la proteína truncada, y se prefiere más que la deleción favorezca la formación de los capsómeros. Las formulaciones de vacuna preferidas de este tipo incluyen capsómeros compuestos de Ll truncada con o sin proteínas virales L2. Los capsómeros particularmente preferidos están compuestos de proteínas Ll truncadas. Las proteínas truncadas contempladas por la invención incluyen aquellas que tienen uno o más residuos aminoácidos con deleción del carboxi terminal de la proteína, o uno o más residuos aminoácidos con deleción del amino terminal de la proteína o uno o más residuos aminoácidos con deleción de la región interna (es decir, de ningún término) de la proteína. Las formulaciones de vacuna de capsómeros preferida esta compuesta de proteínas truncadas en el carboxi terminal. En las formulaciones que incluyen proteína Ll proveniente de HPV16, se prefiere que se realice la deleción de 1 a 34 residuos aminoácidos carboxi terminales. También se contemplan deleciones relativamente más cortas que ofrezcan la ventaja de menor modificación de las propiedades antigénicas de las 5 proteínas Ll y los capsómeros formados de las mismas. No obstante, se prefiere más que se realice la deleción de 34 residuos aminoácidos a partir de la secuencia de Ll, correspondiente a los aminoácidos 472 a 505 en el HPV16 establecido en la SEQ ID NO: 2, y codificado por la fl 10 secuencia de nucleótidos correspondiente a los nucleótidos 1414 a 1516 en la Ll del HPV16 humano que codifica la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1. Cuando la formulación de vacuna de capsómeros está constituida de proteínas portadoras de una deleción interna, se prefiere que la secuencia de aminoácidos con deleción comprenda la región de localización nuclear de la proteína. En la proteína Ll del HPV16, la señal de localización nuclear se encuentra desde cerca del residuo aminoácido 499 a cerca del residuo aminoácido 505. Después de la expresión de las proteínas Ll en donde el NLS ha sido sometido a deleción, el ensamble de las estructuras del capsómero ocurre en el citoplasma de la célula hospedera. En consecuencia, es posible la purificación de los capsómeros a partir del citoplasma en lugar del núcleo donde las proteínas Ll intactas se ensamblan en capsómeros. Los capsómeros que resultan del ensamble de las proteínas truncadas en donde las secuencias de los aminoácidos adicionales no reemplazan las secuencias de la proteína con deleción son necesariamente de naturaleza no quimérica. En todavía otro aspecto de la invención, se proporcionan formulaciones de vacunas de capsómeros conteniendo proteína viral truncada expresada como una proteína de fusión adyacente a los residuos aminoácidos de una segunda proteína. Las proteínas virales truncadas preferidas de la invención son las proteínas Ll y L2 virales de papiloma estructurales. Los capsómeros compuestos de fusiones de proteínas virales truncadas pueden ser producidas utilizando los componentes de la proteína Ll y L2 juntos o la proteína Ll sola. Los capsómeros preferidos son aquellos compuestos de residuos de aminoácidos de la proteína Ll. Los componentes de la proteína viral truncada de las proteínas de fusión incluyen aquellos que tienen uno o más residuos aminoácidos con deleción del carboxi terminal de la proteína, o uno o más residuos aminoácidos con deleción del amino terminal de la proteína, o uno o más residuos aminoácidos con deleción de una región interna (es decir, de ningún término) de la proteína. Las formulaciones de vacuna de capsómeros preferidas están compuestas de proteínas truncadas en el carboxi terminal. En estas formulaciones que incluyen la proteína Ll derivada de HPV16, se prefiere que se realice la deleción de, desde 1 a 34 residuos aminoácidos carboxi terminales. Las deleciones más cortas también están contempladas las cuales ofrecen la ventaja de menor • modificación de las propiedades antigénicas del componente 5 de la proteína Ll de la proteína de fusión y los capsómeros formados de la misma. No obstante, se prefiere más que se realice deleción de 34 residuos aminoácidos desde la secuencia Ll, correspondiente a los aminoácidos 472 a 505 en el HPV16 establecido en la SEQ ID NO: 2, y codificado por la secuencia de polinucleótidos correspondiente" a los • nucleótidos 1414 a 1516 en la secuencia codificante de la HPV16 Ll humana establecida en la SEQ ID NO: 1. Cuando la formulación de vacuna esta compuesta de capsómeros constituidos de proteínas portadoras de una deleción interna, se prefiere que la secuencia de aminoácidos con deleción contenga la región de localización nuclear, o secuencia, de la proteína. Los aminoácidos de la segunda proteína pueden ser • obtenidos de diversas fuentes siempre y cuando la adición de los residuos aminoácidos de la segunda proteína a la primera proteína permita la formación de los capsómeros. De preferencia, la adición de los residuos aminoácidos de la segunda proteína favorece o promueve la formación de capsómero. Los residuos aminoácidos de la segunda proteína pueden ser obtenidos de diversas fuentes, incluidos los residuos aminoácidos de la primera proteína. En una modalidad preferida, la segunda proteína también es una proteína de virus de papiloma. También se prefiere que la segunda proteína sea el producto de expresión del gen temprano del virus de papiloma. No obstante, es más preferible que la segunda proteína sea seleccionada del grupo de productos del gen temprano que codifiquen para los genes El, E2, E3, E4, E5, E6, y E7 del virus de papiloma. En una modalidad, la formulación de la invención esta compuesta de capsómeros quiméricos, en donde los residuos aminoácidos de la proteína Ll constituyen aproximadamente 50 a 99% de los residuos aminoácidos de la proteína de fusión total. En otra modalidad, los residuos aminoácidos de Ll constituyen aproximadamente 60 a 90% de los residuos aminoácidos de la proteína de fusión total; en una modalidad particularmente preferida, los aminoácidos de Ll constituyen aproximadamente 80% de los residuos aminoácidos de la proteína de fusión. En una modalidad preferida de la invención, las proteínas de las formulaciones de vacuna se producen por metodologías recombinantes, pero en formulaciones que contienen proteína viral intacta, las proteínas pueden ser aisladas de fuentes naturales. Las proteínas intactas aisladas de fuentes naturales pueden ser modificadas in vi tro para incluir residuos aminoácidos adicionales para proporcionar una proteína de fusión de la invención utilizando técnicas de modificación covalente bien conocidas y practicadas de manera habitual en la técnica. De la misma manera, en las formulaciones que contienen proteínas virales truncadas, las proteínas pueden ser aisladas de fuentes naturales como proteínas intactas e hidrolizadas in vi tro utilizando hidrólisis química o digestión enzimática con cualquiera de un número de proteasas específicas de sitio o generales, la proteína truncada posteriormente modificada para incluir residuos aminoácidos adicionales como se describe antes para proporcionar la proteína de fusión truncada de la invención. En la producción de los capsómeros, es posible utilizar técnicas recombinantes en biología molecular para producir DNA que codifica para la proteína intacta deseada, la proteína truncada o la proteína de fusión truncada. Las metodologías recombinantes que se requieren para producir un DNA que codifique para una proteína deseada son bien conocidas y se practican de manera habitual en la técnica. Los manuales de laboratorio, por ejemplo, Sambrook, y col., (eds.), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, NY (1989) y Ausebel y col., (eds.), PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc. (1994-1997), describe técnicas con detalle necesario para realizar las manipulaciones del DNA necesarias. Para la producción a gran escala de capsómeros quiméricos, la expresión de la proteína puede realizarse utilizando vectores virales o eucarióticos. Los vectores preferibles incluyen cualquiera de los vectores de expresión procarióticos bien conocidos, baculovirus recombinantes, vectores específicos de células COS, recombinantes de vacunas o construcciones de expresión específicas de levadura. Cuando se utilizan proteínas recombinantes para proporcionar los capsómeros de la invención, las proteínas pueden primero ser aisladas de la célula hospedera de su expresión y después incubadas bajo condiciones que permitan el autoe samble para producir los capsómeros. De otro modo, las proteínas pueden ser expresadas bajo condiciones en donde ser formen los capsómeros en la célula hospedera. La invención también contempla los procesos para producir capsómeros de las- formulaciones de vacuna. En un método, las proteínas Ll se expresan desde DNA que codifica para seis histidinas adicionales en el carboxi terminal de la secuencia codificante de la proteína Ll. Las proteínas Ll expresadas con histidinas adicionales (proteínas His Ll) de mayor preferencia se expresan en E. coli y las proteínas His Ll pueden ser purificadas utilizando cromatografía de afinidad con níquel. Las proteínas His Ll en lisado de células se suspenden en una solución amortiguadora para desnaturalización, por ejemplo, clorhidrato de guanidina 6M o una solución amortiguadora de capacidad desnaturalizante equivalente, y luego se someten a cromatografía con níquel.

La proteína eluida del vaso de cromatografía con níquel recupera su naturaleza, por ejemplo en NaCl 150 M, CaCl2 lmM, Triton-X 100 al 0.01%, HEPES 10 mM (ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N' -2-etansulfónico) , pH 7.4. De acuerdo con un método preferido de la invención, el ensamble de los capsómeros toma lugar después de la diálisis de las proteínas purificadas, de preferencia después de la diálisis contra NaCl 150 mM, Ca2+ 25 mM, DMSO 10% (dimetilsulfóxido) , Triton-X 100 al 0.1%, ácido tristtris- (hidroximetil) aminometano] acético 10 mM con un valor de pH de 5.0. La formación de los capsómeros puede ser supervisada por microscopio electrónico y, en casos en donde los capsómeros estén compuestos de proteínas de fusión, la presencia de diferentes componentes de proteína en el capsómero ensamblado pueden ser confirmados por análisis Western blot utilizando antisueros específicos. De acuerdo con la presente invención, se proporcionan los métodos para tratamiento terapéutico de personas infectadas con HPV consistiendo en el paso de administrar a un paciente en necesidad del mismo, una cantidad de una formulación de vacuna de la invención eficaz para reducir el nivel de infección por HPV. La invención también ofrece los métodos para tratamiento profiláctico de personas susceptibles a infección de HPV consistiendo en el paso de administrar a una persona susceptible de infección por HPV una cantidad de una formulación de vacuna de la invención, eficaz para prevenir la infección de HPV. Aunque las personas infectadas pueden ser fácilmente identificadas utilizando las técnicas de diagnóstico normales, las personas susceptibles pueden ser identificadas, por ejemplo, como aquellas que se comprometen en relaciones sexuales con un individuo infectado. No obstante, debido a la elevada frecuencia de infección por HPV, todas las personas con actividad sexual son susceptibles a infección por virus de papiloma. La administración de una formulación de vacuna puede incluir uno o más componentes adicionales como portadores, diluyentes, coadyuvantes y/o soluciones amortiguadoras farmacéuticamente aceptables. Las vacunas pueden ser administradas una sola vez o en múltiples ocasiones. La formulación de vacunas de la invención puede ser suministrada por diferentes vías que incluyen, por ejemplo, la vía de administración oral, intravenosa, intramuscular, nasal, rectal, transdérmica, vaginal, subcutánea e intraperitoneal . Las formulaciones de vacunas de la invención ofrecen diversas ventajas cuando se comparan con las preparaciones de las vacunas tradicionales. Como parte de una vacunación terapéutica, los capsómeros pueden favorecer la eliminación de las células persistentemente infectadas en, por ejemplo, pacientes con NIC o carcinoma cervical. Además, las vacunaciones terapéuticas de este tipo también pueden servir como para un propósito profiláctico en la protección de pacientes con lesiones por NIC de reinfección. Como una ventaja adicional, los capsómeros pueden escapar a la neutralización por anticuerpos anticapside preexistentes y por tanto posee mayor vida media circulante en comparación con las partículas tipo virus quiméricas. Las formulaciones de vacuna que contienen capsómeros quiméricos pueden proporcionar la ventaja adicional de mayor antigenicidad de ambos componentes proteínicos de la proteína de fusión a partir de la cual se forma el capsómero. Por ejemplo, en una VLP, los componentes proteínicos del capsómero subyacente pueden ser ocultados o enterrados en la estructura total como resultado del posicionamiento internalizado dentro de la propia VLP. De la misma manera, los epítopos de los componentes proteínicos pueden ser obstruidos estéricamente como resultado del contacto capsómero a capsómero, y por tanto inaccesibles para presentar una respuesta inmune. Los resultados preliminares utilizando las proteínas de fusión L1/E7 para producir las VLP dan soporte a esta posición en cuanto a que ninguna respuesta de anticuerpo fue detectada contra el componente E7. Esta observación es consistente con los resultados anteriores que indican que la región carboxi terminal de la Ll forma estructuras de brazos interpentaméricos que permiten el ensamble de los capsómeros en las cápsides [García, y col., J. Virol . 71:2988-2995 (1997)]. Se supone que en una estructura quimérica de capsómero, ambos componentes proteínicos de la subestructura de la proteína de fusión son accesibles para evocar una respuesta inmune. Las vacunas de capsómeros, por tanto, ofrecerían la ventaja adicional de mayor antigenicidad contra cualquier componente proteínico, incluyendo, por ejemplo, epítopos neutralizantes de otras proteínas de virus, expresados como una fusión con secuencias de aminoácidos de Ll .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se ilustra por los siguientes ejemplos. El Ejemplo 1 describe la construcción de los vectores de expresión para producir proteínas virales de fusión o quiméricas. El Ejemplo 2 se refiere a la producción de baculovirus recombinante por expresión de proteínas virales. El Ejemplo 3 se ocupa de la purificación de los capsómeros. El Ejemplo 4 describe un protocolo de inmunización para la producción de antisueros y anticuerpos monoclonales. El Ejemplo 5 proporciona un ELISA del péptido para cuantificar la formación del capsómero. El Ejemplo 6 describe un ELISA para captura del antígeno para cuantificar la formación del capsómero. El Ejemplo 7 proporciona un • ensayo de hemaglutinina para ensayar la inducción de los 5 anticuerpos neutralizantes.

Ejemplo 1 Construcción de genes de Ll quiméricos El DNA que codifica para el marco de lectura abierto de F 10 Ll del HPV16 fue escindido del plásmido 16-114/k-Ll/L2- pSynxtVI" [Kirnbauer y col., J. Virol . 67:6929-6936 (1994)] utilizando BglII y el fragmento resultante fue subclonado en pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA) previamente linearizado en el sitio de restricción JSamHI único. Dos construcciones de expresión básicas fuero primero producidas para permitir la inserción subsecuente del DNA para permitir la expresión de la proteína de fusión. Una construcción codificó Ll_310 del HPV 16 teniendo una deleción de nueve aminoácidos; la región con deleción fue conocida para mostrar poca homología de nivel con todas las demás proteínas Ll del virus de papiloma. La segunda construcción, L1_C del HPV16 codificó una proteína teniendo una deleción a 34 aminoácidos de los residuos de Ll en carboxi terminal. Otras construcciones incluyen un sitio de restricción EcoRV en la posición de la deleción para inserción facilitada del DNA que codifica para otras secuencias de proteínas. La adición del sitio EcóRV codificad dos aminoácidos que no son de la proteína Ll, aspartato e isoleucina. • A. Producción de una construcción de expresión Ll_310 de HPV 16 Dos cebadores (SEQ ID NO: 5 y 6) fueron diseñados para amplificar el vector pUC19 y la secuencia codificante de la Ll de HPV 16 completa, excepto los nucleótidos 916 a 942 en ?) 10 la SEQ ID NO: 1. Los cebadores fueron sintetizados para también inducir un sitio de restricción EcoRV único (subrayado en las SEQ ID NO: 5 y 6) en los términos del producto de amplificación. CCCCGATATCGCCTTTAATGTATAAATCGTCTGG 15 SEQ ID NO: 5 CCCCGATATCTCAAATTATTTTCCTACACCTAGTG SEQ ID NO: 6 El producto de la PCR resultante fue digerido con EcoRV • para proporcionar extremos complementarios y el producto de la digestión fue circulado por ligación. El DNA ligado fue transformado en E. coli utilizando las técnicas normales y los plásmidos de las colonias resultantes fueron detectados para la presencia de un sitio de restricción EcoRV. Un clon denominado Ll_310 del HPV16 fue identificado teniendo la deleción adecuada de 27 nucleótidos y esta construcción fue utilizada para insertar fragmentos de DNA que codifican para otras proteínas del HPV 16 en el sitio EcoRV como se describe más adelante.

B. Producción de construcciones de expresión L1_C de un HPV 16 Dos cebadores (SEQ ID NO: 7 y 8) fueron designados complementarios para el marco de lectura abierto de Ll del HPV 16 de modo que los cebadores se empalmaron entre sí para fc 10 permitir la amplificación en direcciones inversas en el DNA plantilla conteniendo las secuencias codificantes de Ll del HPV 16 en pUC19 antes descrito. AAAGATATCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCCTAAAGGAAAC SEQ ID NO: 7 15 AAAGATATCTAATCTACCTCTACAACTGCTAAACGCAAAAAACG SEQ ID NO: 8 Cada cebador introduce un sitio de restricción EcoRV en el término del producto de amplificación. En el cebador corriente abajo (SEQ ID NO: 8), el sitio EcoRV fue seguido por un codón sin sentido de traducción TAA ubicado de modo que el producto de la amplificación, con la ligación de los extremos EcoRV se ciclen, incluirían la deleción de los 34 aminoácidos de Ll carboxi terminales. Se realizó la PCR para amplificar el marco de lectura abierto de Ll parcial y el vector completo. El producto de la amplificación fue disociado con £coRV, ciclado con T4 DNA ligasa y transformado en células DH5 a de E. coli. Los plásmidos de los clones viables fueron analizados para la presencia de un sitio EcoRV que varía lineal al plásmido. Una construcción positiva designada pUCHPV16Ll_C fue identificada y utilizada para insertar DNA de otras proteínas de HPV 16 utilizando el sitio £coRV.

C. Inserción de fragmentos de DNA en HPV 16 Ll_310 y HPV 16 L1_c Los fragmentos de DNA del HPV 16 E7 que codifica para los aminoácidos 1-50, 1-60, 1-98, 25-75, 40-98, 50-98 en la SEQ ID NO: 4 fueron identificados utilizando los cebadores que introdujeron los sitios de restricción EcoRV 5' terminales para facilitar la inserción del fragmento en la secuencia modificada HPV 16 Ll_310 y HPV 16 L1_C. En las diferentes reacciones de amplificación, el cebador E7.1 (SEQ ID NO: 9) fue utilizado en combinación con el cebador E7.2 (SEQ ID NO: 10) para generar un fragmento de DNA que codifique para 1-50 aminoácidos de E7; con el cebador E7.3 (SEQ ID NO: 11) generar un fragmento de DNA que codifique para los aminoácidos 1-60 de E7; o con el cebador E7.4 (SEQ ID NO: 12) generar un fragmento de DNA que codifique para los aminoácidos 1-98 de E7. En otras reacciones de amplificación, los pares de cebadores E7.5 (SEQ ID NO: 13) y E7.6 (SEQ ID NO: 14) fueron utilizados para amplificar un fragmento de DNA que codifique para los aminoácidos 25-75 de E7; E7.7 (SEQ ID NO: 15) y E7.4 (SEQ ID NO: 12) fueron utilizados para amplificar un fragmento de DNA que codifique para los aminoácidos 40-98 de E7; y E7.8 (SEQ ID NO: 16) y E7.4 (SEQ ID NO: 12) fueron utilizados para amplificar un fragmento de DNA que codifique para los aminoácidos 50-98 de E7. Cebador E7.1 SEQ ID NO: 9 AAAAGATATCATGCATGGAGATACACCTACATTGC Cebador E7.2 SEQ ID NO: 10 TTTTGATATCGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCC Cebador E7.3 SEQ ID NO: 11 TTTTGATATCCTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGG (ilegible) Cebador E7.4 SEQ ID NO: 12 AAAAGATATCTGGTTTCTGAGAACAGATGGGGCAC Cebador E7.5 SEQ ID NO: 13 TTTTGATATCGATTATGAGCAATTAAATGACAGCTCAG Cebador E7.6 SEQ ID NO: 14 TTTTGATATCGTCTACGTGTGTGCTTTGTACGCAC Cebador E7.7 SEQ ID NO: 15 TTTATCGATATCGGTCCAGCTGGACAAGCA (ilegible) Cebador E7.8 SEQ ID NO: 16 TTTTGATATCGATGCCCATTACAATATTGTA De la misma manera, los nucleótidos del DNA que codifican para la proteína matriz de influenza (SEQ ID NO: 17) fue amplificada utilizando el primer cebador que se establece en las SEQ ID NO: 19 y 20. Ambos cebadores 5 introdujeron un sitio de restricción EcóRV en el producto de la amplificación. TTTTGATATCGATATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATC SEQ ID NO: 19 TTTTGATATCGTTGTTTGGATCCCCATTCCCATTG 10 SEQ ID NO: 20 • Los productos de la PCR de cada reacción de amplificación fueron desdoblados con EcoRV e insertados en el sitio EcoRV en las secuencias HPV 16 Ll_310 y HPV 16 L_C anteriormente linearizados con la misma enzima. Para determinar la orientación de los insertos en los plásmidos que codifican para los aminoácidos 25-75 y 50-98 de E7 y el plásmido que incluye la proteína matriz de influenza, se empleó la digestión con Clal, aprovechando una superposición • del sitio de restricción del sitio de restricción EcoRV recién creado (GATATCGAT) e incubados en el cebador corriente arriba. Para las tres construcciones de expresión que incluyen la metionina iniciadora de HPV 16 E7, la orientación del inserto fue determinada utilizando un sitio de restricción Nsll dentro de la región codificante de E7. 25 Una vez que las construcciones de expresión teniendo los insertos adecuados fueron identificadas, la región codificante de la proteína para Ll y los aminoácidos insertados fue escindida como una unidad utilizando las enzimas de restricción Xbal y Smal y el DNA aislado ligado en el plásmido pVL 1393 (Invitrogen) para generar baculovirus recombinantes.

D. Eliminación de los sitios de restricción JScoRV en las construcciones de expresión f 10 La secuencia HPV 16 L1_C incluye el DNA del sitio EcoRV que da origen a la traducción de los aminoácidos que normalmente no se encuentran en los polipéptidos de Ll tipo silvestre. Así, se diseñó una serie de construcciones de expresión en la que se eliminó el sitio EcoRV [sic] artificial. La secuencia de Ll para esta serie de construcciones de expresión fue denominada HPV 16 L1_C* . Para generar una construcción de expresión conteniendo A la secuencia de HPV 16L1-C*, se realizaron dos reacciones. PCR para amplificar dos fragmentos superpuestos del pUC- 20 HPV16L1_C se codifica para los aminoácidos 1-50 de E7. Los fragmentos de DNA resultantes se traslaparon en la posición del límite L1/E7 pero no contenían los dos sitios de restricción EcoRV. El fragmento 1 fue producido utilizando los cebadores Pl (SEQ ID NO: 21) y P2 (SEQ ID NO: 22) y el fragmento 2 utilizando los cebadores P3 (SEQ ID NO: 23 y P4 (SEQ ID NO: 24) . Cebador Pl SEQ ID NO: 21 GTTATGACATACATACATTCTATG • Cebador P2 SEQ ID NO: 22 CCATGCATTCCTGCTTGTAGTAAAAATTTGCGTCC Cebador P3 SEQ ID NO: 23 CTACAAGCAGGAATGCATGGAGATACACC Cebador P4 SEQ ID NO: 24 CATCTGAAGCTTAGTAATGGGCTCTGTCCGGTTCTG 10 • Después de las primeras dos reacciones de amplificación, los dos productos purificados fueron utilizados como plantillas en otra reacción de PCR utilizando los cebadores Pl y P4 solamente. El producto de la amplificación resultante fue digerido con enzima EcoNI y HindI I I insertadas en la construcción de expresión de HPV 16L1_C antes descrita después de la digestión con las mismas enzimas. La construcción de expresión resultante fue diferente de la construcción HPV 16 L1_C original con el DNA que codifica para los aminoácidos 1-50 de Ll y E7 por pérdida de dos sitios de restricción EcóRV internos. El primer sitio EcoRV fue sustituido por DNA que codifica para los aminoácidos alanina y glicina de Ll nativa en esta posición y el segundo fue sustituido por una señal de interrupción (stop) de traducción. Además, la construcción de expresión, denominada HPV 16L1_C* E7 1-52, contenía los primeros 52 aminoácidos de HPV 16 E7 como resultado de utilizar el cebador P4 que también codifica para los residuos aminoácidos de E7 histidina en la posición 51 y tirosina en la posición 52. Luego se utilizó HPV 16 L1_C* E7 1-52 para producir construcciones de expresión HPV 16 L1_C adicionales además incluyendo DNA que codifica para los aminoácidos 1-55 de E7 utilizando el cebador Pl (SEQ ID NO: 21) en combinación con el cebador P5 (SEQ ID NO: 25), los aminoácidos 1-60 de E7 con el par cebador Pl y P6 (SEQ ID NO: 26), y los aminoácidos 1-65 de E7 con el primer par Pl y P7 (SEQ ID NO: 27) . Las secuencias de DNA que codifican para aminoácidos adicionales en los productos de amplificación surgen del diseño de cebadores que incluyan nucleótidos adicionales para los aminoácidos deseados. Cebador P5 SEQ ID NO: 25 CATCTGAAGCTTAACAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG Cebador P6 SEQ ID NO: 26 CATCTGAAGCTTACTTGCAACAAAAGGTTA- CAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG Cebador P7 SEQ ID NO: 27 CATCTGAAGCTTAAAGCGTAGAGTCACACTTGCAAC- AAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG De la misma manera, el HPV 16 Ll C* E7 1-70 fue generado utilizando el DNA plantilla que codifica para el HPV 16 L1_C* E7 1-66 y el par de cebadores Pl y P8 (SEQ ID NO: 28) .

Cebador P8 SEQ ID NO: 28 CATCTGAAGCTTATTGTACGCACAAC- CGAAGCGTAGAGTCACACTTG Después de cada reacción PCR, los productos de la amplificación fueron digeridos con EcoNI y HindlII e insertados en HPV 16 L1_C previamente digerido con las mismas enzimas. Las secuencias de cada una de las construcciones fueron determinadas utilizando un instrumento de secuenciación Applied Biosystems Prism 377 con dideoxinucleótidos con terminación de cadenas fluorescentes [Prober y col., Science 238:336-341 (1987)].

Ejemplo 2 Producción de baculovirus resombinante Células de Spodoptera frugiperda (Sf9) fueron crecidas en cultivos en suspensión o monocapa a 27° en medio TNMFH (Sigma) complementado con 10% suero bovino fetal y glutamina 2 mM. Para la construcción del baculovirus recombinante basado en HPV 16 Ll, las células Sf9 fueron transfectadas con 10 µg de plásmido de transferencia junto con 2 µg de DNA Baculo-Gold linealizado (PharMingen, San Diego, CA) . Los virus recombinantes fueron purificados de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. Para probar la expresión de la proteína Ll de HPV 16, 105 células Sf9 fueren infectadas con baculovirus recombinante a una multiplicidad de infección (m.d.i.) de 5 a 10. Después de la incubación durante tres a cuatro días a 28°C, el medio fue eliminado y las células fueron lavadas con PBS. Las células fueron usadas en solución amortiguadora muestra SDS y analizadas por SDS-PAGE en Western blot utilizando anticuerpos anti-HPV 16 Ll y anti-HPV 16 E7. Para determinar la expresión de las proteínas Ll quiméricas que de manera preferencial producirían capsómeros, los extractos de las células transfectadas fueron sometidos a centrifugación en gradiente. Las fracciones obtenidas del gradiente fueron analizadas para el contenido de proteína Ll por Western blot y para la formación de VLP por microscopio electrónico. Los resultados se muestran en la Tabla 1. La proteína HPV Ll intacta, así como los productos de la expresión HPV 16 L1?310 y HPV 16 Ll?C, cada uno mostró producir capsómeros y partículas tipo virus en proporciones iguales. Cuando las secuencias codificantes de E7 fueron insertadas en el vector HPV 16 L1?310, solo proteínas de fusión incluyendo los aminoácidos 1 a 50 de E7 producidas dieron origen a formación de capsómeros detectable. Cuando el DNA que codifica para E7 fue insertado en el vector HPV 16 Ll C, se encontró que todas las proteínas de fusión producen capsómeros; las proteínas quiméricas, incluidos los residuos aminoácidos 40-98 de E7 produjeron la concentración más alta de estructuras exclusivamente de capsómeros. Las proteínas quiméricas que incluyen los aminoácidos 1-98 y 25-75 de E7 ambas produjeron principalmente capsómeros, aunque también se observó formación de partículas tipo virus. La proteína quimérica que incluye los aminoácidos 1-60 de E7 dio origen a concentraciones casi iguales de producción de capsómeros y partículas tipo virus. Cuando las secuencias de E7 fueron insertadas en el vector HPV 16 L1*C, todas las proteínas de fusión mostraron producir capsómeros. La inserción de DNA que codifica para los residuos 1-52, 1-55 y 1-60 de E7 produjo la concentración más alta de capsómeros, pero se observaron concentraciones iguales de producción de partículas tipo virus. Aunque la inserción de DNA que codifica para los residuos 1-65, 1-70, 25-75, 40-98 y 1-98 del DNA de E7 dio origen a concentraciones comparativamente enoies concentraciones no detectables de cápside, los capsómeros fueron producidos en cantidades altas.

TABLA 1 CAPACIDAD DE FORMACIÓN DE CAPSÓMEROS Y CAPSIDE DE LAS f PROTEÍNAS HPV Ll QUIMÉRICAS Construcción de la expresión Ll Inserto Rendimiento del capsómero Rendimiento de la cápsida • 10 HVP 16 Ll [sic] Ninguno +++++ +++++ 15 HPV 16 Ll 310 Ninguno • +++ ++ 20 HPV 16 Ll C Ninguno ++++ ++++ 25 HPV 16 Ll 310 E7 1-98 HPV 16 Ll 310 E7 1-50 ++ • HPV 16 Ll 310 E7 25-75 HPV 16 Ll 310 E7 50- 98 • HPV 16 Ll C E7 1- 98 +++ + 25 HPV 16 Ll C E7 25-75 +++ HPV 16 Ll C E7 50- 98 + + 10 • HPV 16 Ll C E7 1-60 +++++ +++++ 15 HPV 16 Ll C E7 40-98 ++++ • HPV 16 Ll C Influenza +++ + 25 HPV 16 Ll *C E7 1-52 +++++ +++++ HPV 16 Ll *C E7 1-55 +++++ +++++ 10 • HPV 16 Ll *C E7 1-60 +++ ++++ 15 HPV 16 Ll *C E7 1-65 ++ • HPV 16L1 *C E7 1-70 ++ Ejemplo 3 Purificación de capsómeros Células Trichopulsia ni (TN) High Five fueron crecidas a una densidad de aproximadamente 2 x 106 células/ml en medio Ex-Cell 405 libre de suero (JRH Biosciences) . Aproximadamente 2 x 108 células fueron empacadas por centrifugación a 1000 x g durante 15 minutos, resuspendidas en 20 ml de medio e infectadas con baculovirus recombinante a m.d.i. de 2 a 5 durante una hora a temperatura ambiente. Después de la adición de 200 ml de medio, las células fueron plaqueadas e incubadas durante 3 a 4 días a 27°C. Después de la incubación, las células fueron cosechadas, empacadas y resuspendidas en 10 ml de solución amortiguadora para extracción. Se realizaron los siguientes pasos a 4°C. Las células fueron sonificadas durante 45 segundos a 60 watts y el lisado de células resultante fue centrifugado a 10,000 rpm en un rotor Sorval SS34. El sobrenadante fue separado y reservado mientras el paquete resultante fue resuspendido en 6 ml de solución amortiguadora para extracción, sonificado durante 3 segundos adicionales a 600 watts y centrifugado nuevamente. Los dos sobrenadantes fueron combinados, se dividieron en capas en un gradiente de dos pasos conteniendo 14 ml de sacarosa al 40% en la parte superior de 8 ml de solución de CsCl (4.6 g de CsCl por 8 ml en la solución amortiguadora de extracción) , y centrifugados en un rotor de cubeta oscilante Sorval AH629 durante dos horas a 27,000 rpm a 10°C. La región de la interfase entre el CsCl y la sacarosa junto con la capa completa de CsCl fueron recolectados en tubos Quickseal de 13.4 ml (Beckman) y se adicionó solución amortiguadora de extracción para ajustar el volumen a 13.4 ml. Las muestras fueron centrifugadas durante la noche a 50,000 rmp a 20°C en un rotor Beckman 70 TI. Los gradientes fueron fraccionados (1 ml por fracción) penetrando tubos en la parte superior e inferior con una aguja de calibre 21. Las fracciones fueron recolectadas para cada tubo y 2.5 µl de cada fracción fueron analizados mediante un gel 10% SDS-poliacrilamida y Western blot utilizando un anticuerpo anti-HPV16 Ll. Las partículas tipo virus y los capsómeros fueron separados de las fracciones identificadas en lo anterior por sedimentación en gradientes de 10 a 50% de sacarosa. Las fracciones pico de los gradientes CsCl fueron combinados y dializados durante dos horas contra HEPES 5 mM (pH 7.5). la mitad del dializado se utilizó para producir capsómeros mediante el desensamblado de las VLP intacta durante la noche adicionando EDTA (concentración final 50 mM) , EGTA (50 Mm) , DTT (30 mM) , NaCl (100 M) y Tris/HCl, pH 8.0, (10 mM) . Como control, solo se adicionaron NaCl y Tris/HCl a la otra mitad.

Para el análisis de los capsómeros producidos del desensamblado de las VLP, se adicionó EDTA, EGTA y DTT (concentración final 5 mM cada una) a los cojines de sacarosa que fueron centrifugados a 250,000 x g durante dos horas a cuatro horas a 4°C. Las fracciones fueron recolectadas penetrando tubos desde la parte inferior. Una dilución 1:10 de cada fracción fue luego analizada por captura del antígeno con ELISA.

Ejemplo 4 Protocolo de inmunización para la producción de antisueros policlonales y anticuerpos monoclonales Ratones Balb/c se inmunizan por vía subcutánea tres veces, cada cuatro semanas con aproximadamente 60 µg de capsómeros quiméricos de HPV mezclados 1:1 con coadyuvante de Freund completo o incompleto en un volumen total de 100 µl. Seis semanas después de la tercera inmunización, los ratones fueron sacrificados y se recolectó la sangre por punción cardiaca.

Ejemplo 5 ELISA del péptido para cuantificar la formación de capsómeros Placas de microtitulación (Dynatech) se recubren durante la noche con 50 µl de péptido E701 [Muller y col., 1982] a una concentración de 10 µg/ml en PBS. Los pozos se bloquean durante dos horas a 37°C con 100 µl de solución amortiguadora conteniendo 5% BSA y 0.05% Tween 20 en PBS y se lavan tres • veces con PBS conteniendo 0.05% de Tween 20. Después del 5 tercer lavado, 50 µl de suero diluido 1:5000 en BSA/Tween 20/PBS se adiciona a cada pozo y se realiza la incubación durante una hora. Las placas se lavan otra vez como antes y se adiciona 50 µl de conjugado peroxidasa anti-ratón de cabra en una dilución 1:5000. Después de una hora las placas se ^fc 10 lavan y se tiñen utilizando sustrato ABTS (0.2 mg/ml, ácido 2,2' -azino-bis (3-etilbenziazolin-ß-sulfónico en solución amortiguadora acetato de Na-fosfato 0.1 M (pH 4.2) con 4 µl de H202 al 30% por 10 ml. La extinción se mide después de una hora a 490 nm en un lector de placas- automatizado Dynatech. 15 Ejemplo 6 Captura del antigeno ELISA para cuantificar la formación de A capsómeros Para permitir la cuantificación relativa de las 20 partículas tipo virus y los capsómeros en las fracciones de los gradientes de CsCl, se utilizó captura de antígeno por ELISA. Las placas de microtitulación fueron recubiertas durante la noche con 50 µl/pozo de una dilución 1:500 (concentración final de 2 µg por ml, en PBS) con un 25 anticuerpo monoclonal de ratón purificado proteína A- inmuno específico para HPV 16 Ll (anticuerpos 25/C, MM07 y Ritti 1 fueron obtenidos de ratones inmunizados con las VLP de HPV 16) . Las placas fueron bloqueadas con 5% de leche/PBS durante una hora y 50 µl de fracciones de gradientes de CsCl fueron adicionados durante una hora a 37°C utilizando una dilución 1:300 (en 5% leche/PBS). Después de tres lavados con PBS/0.05% Tween 20, 50 µl de un antisuero policlonal de conejo (1:3000 dilución en leche/PBS), aumentado contra las VLP de HPV 16 fueron adicionados y las placas fueron incubadas a 37°C durante una hora. Las placas fueron enjuagadas otra vez y además incubadas con 50 µl de un conjugado peroxidasa anticonejo de cabra (Sigma) diluido 1:5000 en PBS conteniendo 5% de leche durante una hora. Después del lavado final, las placas fueron teñidas con sustrato ABTS durante 30 minutos y se midió la extinción a 490 nm en un lector de placas automatizado Dynatech. Como control negativo el ensayo también incluyó pozos recubiertos solo con PBS. Para probar los anticuerpos monoclonales para la especificidad de los capsómeros, las VLP con EDTA/DTT para desensamblar las partículas. Las preparaciones de partículas tratadas fueron ensayadas en ELISA para captura de antígenos y las lecturas comparadas con los controles no tratados. Para el desensamblado, 40 µl de las VLP fueron incubados durante la noche a 4°C en 500 µl de solución amortiguadora para rompimiento conteniendo DTT 30 mM, EGTA 50 mM, EDTA 60 mM, NaCl 100 mM y Tris/HCl 100 mM, pH 8.0. Se utilizaron alícuotas de las partículas tratadas y no tratadas en el ensayo ELISA para captura anterior en una dilución 1:20-1:40.

Ejemplo 7 Ensayo de inhibición de la hemaglutinina Para determinar el grado en el que las vacunas de capsómeros quiméricos evocan la producción de anticuerpos neutralizantes, se realizó el ensayo de inhibición de la hemaglutinación como se describe brevemente más adelante. Este ensayo se basa en las observaciones anteriores que las partículas tipo virus son capaces de hemaglutinación de los eritrocitos. Los ratones se inmunizan con una vacuna de capsómeros quiméricos y los sueros se recolectan como se describió antes en el Ejemplo 4. Como controles positivos, las partículas tipo virus (VLP) de HPV 16 Ll y las VLP de PV1 (BPV) Ll de bovino se ensayan en paralelo con preparación de capsómeros quiméricos. Para establecer una base positiva, las VLP de HPV 16 ó BPV 1 primero se incuban con o sin sueros recolectados de los ratones inmunizados, después de lo cual se adicionan los eritrocitos. El grado en el que la preincubación con sueros de ratón inhibe la hemaglutinación de los eritrocitos es un indicio de la capacidad neutralizante de los sueros de ratón. Entonces se repiten los experimentos utilizando capsómeros quiméricos para determinar el efecto neutralizante de los sueros de ratón en la vacuna. A continuación se describe un protocolo breve del ensayo de inhibición de hemaglutinación. 100 microlitos de heparina (1000 unidades usp/ml) se adicionan a 1 ml de sangre fresca de ratón. Los eritrocitos se lavan tres veces con PBS seguido por centrifugación y resuspensión en un volumen de 10 ml . Después, los eritrocitos se resuspenden en 0.5 ml de PBS y se almacenan a 4°C durante hasta tres días. Para el ensayo de hemaglutinina, 70 µl de la suspensión se utiliza por pozo en una placa de 96 pozos. Las alícuotas de capsómeros quiméricos de los gradientes de CsCl se dializan durante una hora contra Hepes 10 mM (pH 7.5) y 100 µl de diluciones dobles en serie en PBS se adicionan a los eritrocitos de ratón en placas de microtitulación de 96 pozos, de fondo redondo que además se incuban durante 3-16 horas a 4°C. Para la inhibición de la hemaglutinación, los capsómeros se incuban con diluciones de anticuerpos en PBS durante 60 minutos a temperatura ambiente y luego se adicionan a los eritrocitos. El nivel de hemaglutinación de los eritrocitos y, por tanto, la presencia de anticuerpos neutralizantes se determina por los métodos normales. En los resultados preliminares, los sueros de ratones generados contra capsómeros quiméricos conteniendo la proteína HPV16L1?C en asociación con los residuos 5 aminoácidos 1-98 de E7 se observó que inhibe la hemaglutinación por HPV16 VLP, pero no por BPV VLP. Los sueros de ratón fueron, por tanto, positivos para neutralizar anticuerpos contra las VLP humanas y esta neutralización diferencial probablemente fue el resultado de Jfc 10 la especificidad del anticuerpo por los epítopos contra los cuales fueron aumentados los anticurepos. Numerosas modificaciones y variaciones en la invención como se establecen en los ejemplos ilustrativos anteriores se espera que realicen los expertos en la técnica. En consecuencia, solo limitaciones como las que aparecen en las reivindicaciones anexas deben ser puestas en la invención.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL • ¡i) SOLICITANTE: (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: FORMULACIONES DE VACUNA DEL CAPSOMERO DEL VIRUS DE PAPILOMA Y MÉTODOS DE USO (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 27 • (iv) DOMICILIO POSTAL (A) DESTINATARIO: Marshall, O' Toóle, Gerstein, Murria & Borun 15 (B) CALLE: 233 South Wacker Drive, 6300 Sears Tower (C) CIUDAD: Chicago (D) ESTADO: Illinois (E) PAÍS: EU • ( F) CÓDIGO POSTAL : 60606- 6402 20 (v) : FORMA DE CÓMPUTO LEGIBLE: (A) TIPO DE MEDIO: disco flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS 25 (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, versión #1.30 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL (A) SOLICITUD NUMERO: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DEL ABOGADO/APODERADO (A) NOMBRE: Williams Jr., Joseph A. (B) NUMERO DE REGISTRO: 38,659 (C) REFERENCIA/EXPEDIENTE NÚMERO: 27013-34028 (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES (A) TELÉFONO: 312-474-6300 (B) TELEFAX: 312-474-0448 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1518 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1..1518 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1: ATG TCT CTT TGG CTG CCT AGT GAG GCC ACT GTC TAC TTG CCT CCT GTC 48 Met Ser leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val 1 5 10 15 CCA GTA TCT AAG GTT GTA AGC ACG GAT GAA TAT GTT GCA CGC ACÁ AAC 96 Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn 20 25 30 ATA TAT TAT CAT GCA GGA ACÁ TCC AGA CTA CTT GCA GTT GGA CAT CCC 144 lie Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro 35 40 45 TAT TTT CCT ATT AAA AAA CCT AAC AAT AAC AAA ATA TTA GTT CCT AAA - 192 Tyr Phe Pro lie Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys lie Leu Val Pro Lys 50 55 60 GTA TCA GGA TTA CAA TAC AGG GTA TTT AGA ATA CAT TTA CCT GAC CCC 240 Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg lie His Leu Pro Asp Pro 65 70 75 80 AAT AAG TTT GGT TTT CCT GAC ACC TCA TTT TAT AAT CCA GAT ACÁ CAG 288 Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln 85 90 95 CGG CTG GTT TGG GCC TGT GTA GGT GTT GAG GTA GGT CGT GGT CAG CCA 336 Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro 100 105 110 TTA GGT GTG GGC ATT AGT GGC CAT CCT TTA TTA AAT AAA TTG GAT GAC 384 Leu Gly Val Gly He Ser Gly Hiß Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp 115 120 125 ACÁ GAA AAT GCT AGT GCT TAT GCA GCA AAT GCA GGT GTG GAT AAT AGA 432 Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg 130 135 140 GAA TGT ATA TCT ATG GAT TAC AAA CA ACÁ CAA TTG TGT TTA ATT GGT 480 Glu Cys He Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu He Gly 145 150 155 160 TGC AAA CCA CCT ATA GGG GAA CAC TGG GGC AAA GGA TCC CCA TGT ACC 528 Cys Lys Pro Pro He Gly Glu His Trp Gly Lyß Gly Ser Pro Cyß Thr 165 170 175 AAT GTT GCA GTA AAT CCA GGT GAT TGT CCA CCA TTA GAG TTA ATA AAC 576 Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu He Asn 180 185 190 ACÁ GTT ATT CAG GAT GGT GAT ATG GTT GAT ACT GGC TTT GGT GCT ATG 62 Thr Val He Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met 195 200 205 GAC TTT ACT ACÁ TTA CAG GCT AAC AAA AGT GAA GTT CCA CTG GAT ATT 672 Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp He 210 215 220 TGT ACÁ TCT ATT TGC AAA TAT CCA GAT TAT ATT AAA ATG GTG TCA GAA 720 Cys Thr Ser He Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr He Lys Met Val Ser Glu 225 230 235 240 CCA TAT GGC GAC AGC TTA TTT TTT TAT TTA CGA AGG GAA CAA ATG TTT 768 Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe 245 250 255 GTT AGA CAT TTA TTT AAT AGG GCT GGT GCT GTT GGT GAA AAT GTA CCA 816 Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val Gly Glu Asn Val Pro 260 265 270 GAC GAT TTA TAC ATT AAA GGC TCT GGG TCT ACT GCA AAT TTA GCC AGT 864 Asp Asp Leu Tyr He Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser 275 280 285 TCA AAT TAT TTT CCT ACÁ CCT AGT GGT TCT ATG GTT ACC TCT GAT GCC 912 Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala 290 295 300 CAA ATA TTC AAT AAA CCT TAT TGG TTA CAA CGA GCA CAG GGC CAC AAT 960 Gln He Phe Asn Lyß Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn 305 310 315 320 AAT GGC ATT TGT TGG GGT AAC CAA CTA TTT GTT ACT GTT GTT GAT ACT 1008 ?5 Asn Gly He Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr 325 330 335 ACÁ CGC AGT ACÁ AAT ATG TCA TTA TGT GCT GCC ATA TCT ACT TCA GAA 1056 Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala He Ser Thr Ser Glu 340 345 350 ACT ACÁ TAT AAA AAT ACT AAC TTT AAG GAG TAC CTA CGA CAT GGG GAG 1104 Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu 355 360 365 0 GAA TAT GAT TTA CAG TTT ATT TTT CAA CTG TGC AAA ATA ACC TTA ACT 1152 Glu Tyr Asp Leu Gln Phe He Phe Gln Leu Cys Lys He Thr Leu Thr 370 375 380 GCA GAC GTT ATG ACÁ TAC ATA CAT TCT ATG AAT TCC ACT ATT TTG GAG 1200 Ala Asp Val Met Thr Tyr He His Ser Met Asn Ser Thr He Leu Glu 385 390 395 400 GAC TGG AAT TTT GGT CTA CAA CCT CCC CCA GGA GGC ACÁ CTA GAA GAT 1248 Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp 405 410 415 5 ACT TAT AGG TTT GTA ACC TCC CAG GCA ATT GCT TGT CAA AAA CAT ACÁ 1296 Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala He Ala Cys Gln Lys His Thr - 420 425 430 CCT CCA GCA CCT AAA GAA GAT CCC CTT AAA AAA TAC ACT TTT TGG GAA 1344 Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu 435 440 445 GTA AAT TTA AAG GAA AAG TTT TCT GCA GAC CTA GAT CAG TTT CCT TTA 1392 Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu 450 455 460 GGA CGC AAA TTT TTA CTA CAA GCA GGA TTG AAG GCC AAA CCA AAA TTT 1440 Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu .Lys Ala Lys Pro Lys Phe 465 470 475 480 ACÁ TTA GGA AAA CGA AAA GCT ACÁ CCC ACC ACC TCA TCT ACC TCT ACÁ 1488 Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr 485 490 495 ACT GCT AAA CGC AAA AAA CGT AAG CTG TAA 1518 Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu * 500 505 ( 2 ) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO : 2 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 506 aminoácidos (B ) TIPO : aminoácido ( D) TOPOLOGÍA: lineal ( ii ) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 2 Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val 1 5 10 15 Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn 20 25 30 He Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro 35 40 45 Tyr Phe Pro He Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lyß He Leu Val Pro Lys 50 55 60 Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg He His Leu Pro Asp Pro €5 70 75 80 Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln 85 90 95 Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro 100 105 110 Leu Gly Val Gly He Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp 115 120 125 Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg 130 135 140 Glu Cys He Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu He Gly 145 150 155 160 Cys Lyß Pro Pro He Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr 165 170 175 Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu He Asn 180 185 190 Thr Val He Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met 195 200 205 Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp He 210 215 220 Cys Thr Ser He Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr He Lys Met Val Ser Glu 225 230 235 240 Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe 245 250 255 • Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val Gly Glu Asn Val Pro 260 265 270 Aßp Asp Leu Tyr He Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser 275 280 285 Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala 290 295 300 Gln He Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn 305 310 315 320 • 10 Asn Gly He Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr 325 330 335 Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala He Ser Thr Ser Glu 340 345 350 Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu 355 360 365 15 Giu Tyr Asp Leu Gln Phe He Phe Gln Leu Cys Lys He Thr Leu Thr 370 375 380 Ala Asp Val Met Thr Tyr He His Ser Met Asn Ser Thr He Leu Glu 385 390 395 400 Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp 405 410 415 20 Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala He Ala Cys Gln Lys His Thr 420 425 430 Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu 435 440 445 Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu 450 455 460 Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lye Ala Lys Pro Lys Phe 465 470 475 480 • Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr 485 490 495 Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu * 500 505 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: f 10 (A) LONGITUD: 297 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1..297 20 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: ATG CAT GGA GAT ACÁ CCT ACÁ TTG CAT GAA TAT ATG TTA GAT TTG CAA 48 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Aßp Leu Gln 1 5 10 15 O CCA GAG ACÁ ACT GAT CTC TAC TGT TAT GAG CAA TTA AAT GAC AGC TCA 96 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 GAG GAG GAG GAT GAA ATA GAT GGT CCA GCT GGA CAA GCA GAA CCG GAC 144 Glu Glu Glu Asp Glu He Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 4S AGA GCC CAT TAC AAT ATT GTA ACC TTT TGT TGC AAG TGT GAC TCT ACG 192 Arg Ala His Tyr Asn He Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 CTT CGG TTG TGC GTA CAA AGC ACÁ CAC GTA GAC ATT CGT ACT TTG GAA 240 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp He Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 10 • GAC CTG TTA ATG GGC ACÁ CTA GGA ATT GTG TGC CCC ATC TGT TCT CAG 288 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly He Val Cys Pro He Cys Ser Gln 85 90 95 AAA CCA TAA 297 Lys Pro * (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 98 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: sencilla 20 (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4; 25 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu He Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala Hiß Tyr Asn He Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp He Arg Thr Leu Glu €5 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly He Val Cys Pro He Cys Ser Gln • 85 90 95 Lys Pro * (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 5: 15 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 34 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla • (D) TOPOLOGÍA: lineal 20 (Ü) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: CCCCGATATC GCCTTTAATG TATAAATCGT CTGG 34 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: f (A) LONGITUD: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 5 (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN f 10 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: CCCCGATATC TCAAATTATT TTCCTACACC TAGTG 35 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 7: 15 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 40 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico f (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal 20 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: AAAGATATCT TGTAGTAAAA ATTTGCGTCC TAAAGGAAAC 40 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 44 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 5 (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8: • AAAGATATCT AATCTACCTC TACAACTGCT AAACGCAAAA AACG 44 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 9: 15 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla • (D) TOPOLOGÍA: lineal 20 (Ü) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9: AAAAGATATC ATGCATGGAG ATACACCTAC AGTC 35 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 34 pares de bases • (B) TIPO: ácido nucleico 5 (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: • TTTTGATATC GGCTCTGTCC GGTTCTGCTT GTCC 34 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 11: 15 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 44 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla • (D) TOPOLOGÍA: lineal 20 (Ü) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11 TTTTGATATC CTTGCAACAA AAGGTTACAA TATTGTAATG GGCC 44 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 5 (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN f 10 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12: AAAAGATATC TGGTTTCTGA GAACAGATGG GGCAC 35 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 13:' 15 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico f (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal 20 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13: TTTTGATATC GATTATGAGC AATAAATGA CAGCTCAG 38 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 5 (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN f 10 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14: TTTTGATATC GTCTACGTGT GTGCTTTGTA CGCAC 35 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 15: 15 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 39 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla • (D) TOPOLOGÍA: lineal 20 (Ü) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15: TTTATCGATA TCGGTCCAGC TGGACAAGCA GAACCGGAC 38 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 39 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 5 (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN • 10 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:.16: TTTTGATATC GATGCCCATT ACAATATTGT AACCTTTTG 39 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 17: 15 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 294 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico • (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal 20 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS 25 (B) LOCALIZACIÓN: 1..294 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17: P.TG AGT CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG CTT ACC AGA AAC GGA TGG GAG 48 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Leu Thr Arg Aßn Gly Trp Glu • 1 5 10 15 TGC AAA TGC AGC GAT TCA AGT GAT CCT CTC ATT ATC GCA GCG AGT ATC 96 Cys Lys Cys Ser Asp Ser Ser Asp Pro Leu He He Ala Ala Ser He 20 25 30 ATT GGG ATC TTG CAC TTG ATA TTG TGG ATT TTT TAT CGT CTT TTC TTC 144 He Gly He Leu His Leu He Leu Trp He Phe Tyr Arg Leu Phe Phe 40 45 AAA TGC ATT TAT CGT CGC CTT AAA TAC GGT TTG AAA AGA GGG CCT TCT 192 Lys Cys He Tyr Arg Arg Leu Lys Tyr Gly Leu Lys Arg Gly Pro Ser • 50 55 60 ACG GAA GGA GCG CCT GAG TCT ATG AGG GAA GAA TAT CGG CAG GAA CAG 240 Thr Glu Gly Ala Pro Glu Ser Met Arg Glu Glu Tyr Arg Gln Glu Gln 65 70 75 80 CAG AGT GCT GTG GAT GTT GAC GAT GTT CAT TTT GTC AAC ATA GAG CTG 288 Gln Ser Ala Val Aßp Val Asp Asp Val His Phe Val Asn He Glu Leu 85 90 95 15 GAG TAA 294 Glu * ( 2 ) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO : 18 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 20 (A) LONGITUD : 97 aminoácidos (B) TIPO : aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal ( ii ) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 25 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Leu Thr Arg Asn Gly Trp Glu 1 5 10 15 • Cys Lys Cys Ser Asp Ser Ser Asp Pro Leu He He Ala Ala Ser He 20 25 30 He Gly He Leu Hie Leu He Leu Trp He Phe Tyr Arg Leu Phe Phe 35 40 45 Lys Cys He Tyr Arg Arg Leu Lys Tyr Gly Leu Lys Arg Gly Pro Ser 50 55 60 Thr Glu Gly Ala Pro Glu Ser Met Arg Glu Glu Tyr Arg Gln Glu Gln 65 70 75 80 • 10 Gln Ser Ala Val Asp Val Asp Asp Val His Phe Val Asn He Glu Leu 85 90 95 Glu (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 40 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla 20 (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19: 25 TTTTGATATC GATATGGAAT GGCTAAAGAC AAGACCAATC 40 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 20: • (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal • 10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20: TTTTGATATC GTTGTTTGGA TCCCCATTCC CATTG 35 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 20 (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21: GTTATGACAT ACATACATTC TATG 24 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal • 10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22: CCATGCATTC CTGCTTGTAG TAAAAATTTG CGTCC 35 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: • (A) LONGITUD: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 20 (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23: CTACAAGCAG GAATGCATGG AGATACACC 29 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 24: • (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 36 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24: CATCTGAAGC TTAGTAATGG GCTCTGTCCG GTTCTG 36 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 20 (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25: CATCTGAAGC TTATCAATAT TGTAATGGGC TCTGTCCG 38 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 54 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26: CATCTGAAGC TTACTTGCAA CAAAAGGTTA CAATATTGTA ATGGGCTCTG TCCG 54 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 69 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27: CATCTGAAGC TTAAAGCGTA GAGTCACACT TGCAACAAAA GGTTACAATA TTGTAATGGG 60 CTCTGTCCG 69 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 28: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 47 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28: CATCTGAAGC TTATTGTACG CACAACCGAA GCGTAGAGTC ACACTTG 47

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Una formulación de vacuna que contiene un capsómero de virus de papiloma humano, el capsómero conteniendo una proteína de fusión que consiste en los residuos aminoácidos adyacentes a la proteína Ll del virus de papiloma humano de una segunda proteína.

2. Una formulación de vacuna que contiene un capsómero de virus de papiloma humano, el capsómero consistiendo en una proteína Ll de virus de papiloma humano truncada teniendo una deleción de uno o más residuos aminoácidos necesarios para la formación de una partícula tipo virus.

3. La formulación de vacuna de la reivindicación 2, en donde el capsómero contiene una proteína de fusión que consiste en los residuos aminoácidos adyacentes a la proteína Ll del virus de papiloma humano truncada de una segunda proteína.

4. La formulación de vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 6 3, en donde la proteína Ll es codificada en el genoma de un virus de papiloma humano seleccionado del grupo que consiste en HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35 y HPV45.

5. La formulación de vacuna de la reivindicación 4, en donde el virus de papiloma es HPV16.

6. La formulación de vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 ó 5 en donde los residuos aminoácidos carboxi terminales sufren deleción de la proteína Ll .

7. La formulación de vacuna de la reivindicación 6, en donde se somete a deleción de 1 a 34 residuos aminoácidos carboxi terminales de la proteína Ll.

8. La formulación de vacuna de la reivindicación 7, en donde se sometes a deleción de 34 residuos aminoácidos carboxi terminales de la proteína Ll .

9. La formulación de vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 ó 5, en donde se somete a deleción los residuos aminoácidos amino terminales de la proteína Ll .

10. La formulación de vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 6 5, en donde se somete a deleción los residuos aminoácidos internos de la proteína Ll .

11. La formulación de vacuna de la reivindicación 10, en donde los residuos aminoácidos sometidos a deleción de la proteína Ll contienen una señal de localización nuclear.

12. La formulación de vacuna de las reivindicaciones 2. ó 3, en donde los residuos aminoácidos de la segunda proteína se obtienen de una proteína de HPV.

13. La formulación de vacuna de la reivindicación 12, en donde la proteína de HPV es una proteína temprana de HPV.

14. La formulación de vacuna de la reivindicación 12, en donde la proteína temprana de HPV se selecciona del grupo que consiste en El, E2, E3, E4, E5, E6 y E7.

15. Un método de tratamiento a una persona infectada con un virus de HPV consiste en el paso de administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad de formulación de vacuna de las reivindicaciones 1, 2, 3, 5, 7, 8, 11, 13 ó 14 eficaz para reducir el nivel de infección por HPV.

16. Un método para prevenir infección de virus de papiloma comprende el paso de administrar a una persona susceptible a la misma una cantidad de formulación de vacuna de las reivindicaciones 1, 2, 3, 5, 7, 8, 11, 13 ó 14 eficaz para inhibir la infección por HPV.