JPS5841899A - 組換えｄｎａ分子およびその製造法 - Google Patents
組換えｄｎａ分子およびその製造法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は全部又は−擲が口蹄疫ＲＭＡに実質的に対応す
る人為的に構成された＆ｌＪヌクレオチド配列よ）なる
ＤＮＡ分子に関する。特に少くとも１つの蛋白質を暗号
づけるＩリヌクレオチｒ配列に関する。特に口蹄疫♂−
ルス（以下ＦＭＤＶと称する）、その前駆体又はその修
飾体に存在する１つはそれ以上の蛋白質の全部又は一部
を暗号づける人為的に構成されたポリヌクレオチｒ配列
より、なるＤＮＡ分子に関する。この様なりＮＡ分子は
ポリペプチドとして表現することが可能である。
る人為的に構成された＆ｌＪヌクレオチド配列よ）なる
ＤＮＡ分子に関する。特に少くとも１つの蛋白質を暗号
づけるＩリヌクレオチｒ配列に関する。特に口蹄疫♂−
ルス（以下ＦＭＤＶと称する）、その前駆体又はその修
飾体に存在する１つはそれ以上の蛋白質の全部又は一部
を暗号づける人為的に構成されたポリヌクレオチｒ配列
より、なるＤＮＡ分子に関する。この様なりＮＡ分子は
ポリペプチドとして表現することが可能である。
口蹄疫（νＭＤ ）は家畜にとって最も有毒で伝染性の
ある病気の一つである。此の病気は世界中の各地の風土
病で、アフリカ、アジア、南米の多くの国々にみること
が出来、この病気はそれ等の地域ではその免疫計画によ
り夫々異なった程度にコン）ａ−ルされている。此の病
気の発生していない国々では厳格な輸入及び検疫コント
ロール及びもしこの病気が発生した場合は屠殺によって
のみその状態を保持してｉる。
ある病気の一つである。此の病気は世界中の各地の風土
病で、アフリカ、アジア、南米の多くの国々にみること
が出来、この病気はそれ等の地域ではその免疫計画によ
り夫々異なった程度にコン）ａ−ルされている。此の病
気の発生していない国々では厳格な輸入及び検疫コント
ロール及びもしこの病気が発生した場合は屠殺によって
のみその状態を保持してｉる。
ＦＭＤＶ Ｆｉｆ ｊ ｋナピリディー科（Ｐｉｃｏｒ
ｎａｖｉｒｉｄａｅ ）（Ｐ、Ｄ Ｃｏｏｐｅｒ等１ｎ
ｔｓｒｖｉｒｏｌｏｇ７１０巻１６５−１８０頁１９７
８年版参照）のアブソパイラス属（ムｐｔｈｏｖｉｒｕ
ｓ ）ｆｆｃ属するものとして分類されているＲＮム（
すＭ核酸）ビールスである。ＩＦＭＤＶ 、には７種類
の血清型が知られている、即ち冒−ロツバ血清型ム０及
びＣ１南アフリカ地域血清型８ムＴ１、ＢＡＴ ２及び
３、及びアジア１血清飄である。此等の血清型の中で更
に抗原的に明瞭な多くの亜型が関められこれ等の亜型は
免疫的に極めて異なっているので亜型に特異的なワクチ
ンが必要である。
ｎａｖｉｒｉｄａｅ ）（Ｐ、Ｄ Ｃｏｏｐｅｒ等１ｎ
ｔｓｒｖｉｒｏｌｏｇ７１０巻１６５−１８０頁１９７
８年版参照）のアブソパイラス属（ムｐｔｈｏｖｉｒｕ
ｓ ）ｆｆｃ属するものとして分類されているＲＮム（
すＭ核酸）ビールスである。ＩＦＭＤＶ 、には７種類
の血清型が知られている、即ち冒−ロツバ血清型ム０及
びＣ１南アフリカ地域血清型８ムＴ１、ＢＡＴ ２及び
３、及びアジア１血清飄である。此等の血清型の中で更
に抗原的に明瞭な多くの亜型が関められこれ等の亜型は
免疫的に極めて異なっているので亜型に特異的なワクチ
ンが必要である。
各々の血清型又は亜型について、数種の遺伝的に異なっ
た変異体が存在する。
た変異体が存在する。
口蹄疫ビールスはＲＮムの一本鎖及びピー１ルスのカシ
シト（外殻）蛋白質を形成する４つの主たるｌリペプチ
ド即ち、ＶＰＩ、ｖｐｓ、ｖｐ５及びＶＰ４よ〕なって
いる。ここでＶＰＩと称する蛋白質は此の分野の他の研
究者によってｖｐ、、ＶＰ、ｈｒ、 ’ＶＰＴなど色々
に称せられている（Ｂａａｈｒａｃｈ、Ｈ，Ｌ、他Ｊ。
シト（外殻）蛋白質を形成する４つの主たるｌリペプチ
ド即ち、ＶＰＩ、ｖｐｓ、ｖｐ５及びＶＰ４よ〕なって
いる。ここでＶＰＩと称する蛋白質は此の分野の他の研
究者によってｖｐ、、ＶＰ、ｈｒ、 ’ＶＰＴなど色々
に称せられている（Ｂａａｈｒａｃｈ、Ｈ，Ｌ、他Ｊ。
ｘｍｍｕｎｏｘｏｇｙ第１１５巻、第１ｔ５３６−１６
４１頁、１９７５ ； ８ｔｒｏｈｍａｉｅｒ、Ｌ等Ｂ
Ｂ１００ｈ８゜Ｂｉｏｐｈｙ＊、 Ｒｓｓ、 Ｏｏｍｍ
、、第８５巻、第一１６４０−１６４５頁、１９７８１
Ｂａａｈｒａａｈ、ｎ、Ｌ他工ｎｔ＠ｒマｉｒ０１０
ｇ７第１２巻、６５−７２，１９７９）。
４１頁、１９７５ ； ８ｔｒｏｈｍａｉｅｒ、Ｌ等Ｂ
Ｂ１００ｈ８゜Ｂｉｏｐｈｙ＊、 Ｒｓｓ、 Ｏｏｍｍ
、、第８５巻、第一１６４０−１６４５頁、１９７８１
Ｂａａｈｒａａｈ、ｎ、Ｌ他工ｎｔ＠ｒマｉｒ０１０
ｇ７第１２巻、６５−７２，１９７９）。
ボリペゾチｙ ＶＰ、、ＴＩ’＝及びＶＰ３は夫々分子
量は約２６，０００であるが、ＶＰ、は分子量が約８，
０００である。そして一般にビールスの中に夫々が約６
０コピーずつあると考えられている。ビールスＲＮムか
ら験訳されたその他のポリペプチドはおそらくビールス
の複製に役割を持つものであろう。
量は約２６，０００であるが、ＶＰ、は分子量が約８，
０００である。そして一般にビールスの中に夫々が約６
０コピーずつあると考えられている。ビールスＲＮムか
ら験訳されたその他のポリペプチドはおそらくビールス
の複製に役割を持つものであろう。
ＦＭＤＶＲｌｉＡ ノー重鎖は約２．６ Ｘ １０’の
分子量を持ち、これは約ｓ、ｏ ｏ ｏのヌクレオチド
に相当する。そしてこれはポリペゾチＹ及びＲＭム合成
に′翻訳する源の鋳型として働く正の極性のものである
。
分子量を持ち、これは約ｓ、ｏ ｏ ｏのヌクレオチド
に相当する。そしてこれはポリペゾチＹ及びＲＭム合成
に′翻訳する源の鋳型として働く正の極性のものである
。
主たる−訳生産吻の１つはＰ８８と指示される蛋白質で
あシ、これはｖｐｌから７Ｐ、に至る４種類のカゾシ「
蛋白質を作るために引き続き切断される。
あシ、これはｖｐｌから７Ｐ、に至る４種類のカゾシ「
蛋白質を作るために引き続き切断される。
上記のカシシト蛋白質ＶＰ１はそのままのビールスがト
リジシンで処理されると切断を受けやすく、ＩＦＭＤＶ
の殆んどの株の感染力の大きな低下をもたらす（Ｗｌｘ
ａ、ｒ、ｙ及びＢｏｏｕｎ、ＩＦ、、 、Ｔ、Ｇｅｎ
ＶｉｒＯ１０ｇ７゜第１巻、第２４７−２５０頁、１９
６７）、）リゾシン処理は又ビールスの中和抗体の生産
を刺戟する能力をも低下させる。この様に、ｖＰｌはＦ
ＭＤＶによる感染の効果的な防御を引き出し得る主要な
免疫原である様に見られる。そして実際ビールス粒子よ
シ分離されたＶＰＩは中和抗体を生産し、ビールスに対
する効果的な防御を引き出す（Ｉａｐｏｒｔｅ。
リジシンで処理されると切断を受けやすく、ＩＦＭＤＶ
の殆んどの株の感染力の大きな低下をもたらす（Ｗｌｘ
ａ、ｒ、ｙ及びＢｏｏｕｎ、ＩＦ、、 、Ｔ、Ｇｅｎ
ＶｉｒＯ１０ｇ７゜第１巻、第２４７−２５０頁、１９
６７）、）リゾシン処理は又ビールスの中和抗体の生産
を刺戟する能力をも低下させる。この様に、ｖＰｌはＦ
ＭＤＶによる感染の効果的な防御を引き出し得る主要な
免疫原である様に見られる。そして実際ビールス粒子よ
シ分離されたＶＰＩは中和抗体を生産し、ビールスに対
する効果的な防御を引き出す（Ｉａｐｏｒｔｅ。
Ｊ、等％Ｏ，Ｒ，ム０ＩＬ（１，日ｃ、Ｐａｒｉｓ、ｔ
２７６シリーズＤ。
２７６シリーズＤ。
３３９９−３４０１．１９７５ 、ｅ Ｂａｃｈｒａａ
ｈ、Ｈ，Ｌ。
ｈ、Ｈ，Ｌ。
等、Ｊ、工ｍ１１ｕｎ０１０ｇ７．第１１５巻、１６３
６−１６４１．１９７５）。よシ安全なワクチンを提供
するための天然に存在するＦ′ＭＤｖカプシド蛋白質、
特にｖｐｌの分離は強力な変性条件の使用を必要とし、
これは一般にこの分野に熟練した人にょシ、最適な免疫
原の保持及び効果的なワクチンの生産にとって不利であ
ると考えられている。
６−１６４１．１９７５）。よシ安全なワクチンを提供
するための天然に存在するＦ′ＭＤｖカプシド蛋白質、
特にｖｐｌの分離は強力な変性条件の使用を必要とし、
これは一般にこの分野に熟練した人にょシ、最適な免疫
原の保持及び効果的なワクチンの生産にとって不利であ
ると考えられている。
過去５年間以上にわたシ開発された技法を使用すれば、
非細菌蛋白質の為のＤＮＡ（デオキシリｌ核酸）暗号づ
けをプラス之ｒ又はそ、の他のクローニング伝播体（ビ
ヒクル）の媒介によシ細菌細胞に導入する事が出来るよ
うｋなった（例えば１１ｕｒｒｅｌｌ、 Ｏ，Ｊ、等、
Ｎａｔｎｒｅ 、第２７９巻、第４３−４７頁、１９７
９参照）。一般に組換えＤＮＡ分子の構成は、非細菌母
体から目的とする蛋白質のＤＮム鋳温湿暗号誘導し、こ
の非相同のＤＮＡ片を細菌プラスｔ Ｐの様なりローユ
ング伝播体に挿入し、適当な細菌宿主を修飾された！ラ
スミドで形質転換させるという手段よ構成っている。組
換えＤＮＡの生成に至る遺伝子操作の一般的討論は８ｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ−・ｒ１０１Ｌｎ第２３３巻、第２４
−３３頁、１９７５に８．０Ｏｈｅｎが発表している。
非細菌蛋白質の為のＤＮＡ（デオキシリｌ核酸）暗号づ
けをプラス之ｒ又はそ、の他のクローニング伝播体（ビ
ヒクル）の媒介によシ細菌細胞に導入する事が出来るよ
うｋなった（例えば１１ｕｒｒｅｌｌ、 Ｏ，Ｊ、等、
Ｎａｔｎｒｅ 、第２７９巻、第４３−４７頁、１９７
９参照）。一般に組換えＤＮＡ分子の構成は、非細菌母
体から目的とする蛋白質のＤＮム鋳温湿暗号誘導し、こ
の非相同のＤＮＡ片を細菌プラスｔ Ｐの様なりローユ
ング伝播体に挿入し、適当な細菌宿主を修飾された！ラ
スミドで形質転換させるという手段よ構成っている。組
換えＤＮＡの生成に至る遺伝子操作の一般的討論は８ｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ−・ｒ１０１Ｌｎ第２３３巻、第２４
−３３頁、１９７５に８．０Ｏｈｅｎが発表している。
数種の非細菌遺伝子が大腸菌（１ａａｈ＠ｒｉａｈｉａ
Ｃｏｌｔ ）の様な細菌に挿入され操作され、そしてイ
ンフルエンデ♂−ルスのへマルグルチニン（Ｐｏｒｔｅ
ｒ。
Ｃｏｌｔ ）の様な細菌に挿入され操作され、そしてイ
ンフルエンデ♂−ルスのへマルグルチニン（Ｐｏｒｔｅ
ｒ。
ム、Ｇ０等ｍａｔｎｒｅ、第２８２巻、第４７１−４７
７頁、１９７９ ）、Ｂ型肝炎ビールス蛋白質（Ｂｕｒ
ｒｅｌｌ。
７頁、１９７９ ）、Ｂ型肝炎ビールス蛋白質（Ｂｕｒ
ｒｅｌｌ。
０、Ｊ、等工ＯＱ、Ｃ１ｔ）Ｆ＜含む数種の非細菌蛋白
質が組換えＤＭム技術を使用して細菌によシ表現されて
いる。組換えＤＮＡ研究に於ける最近の大量の業績にも
拘らず、直ちに実用化に使える様な結果（特に１−ルス
の遺伝物質の操作に関係ある組換えＤＮＡの分野に於て
は）は可成シネ足している。
質が組換えＤＭム技術を使用して細菌によシ表現されて
いる。組換えＤＮＡ研究に於ける最近の大量の業績にも
拘らず、直ちに実用化に使える様な結果（特に１−ルス
の遺伝物質の操作に関係ある組換えＤＮＡの分野に於て
は）は可成シネ足している。
本発明は天然に存在するピコルナビールスのカプシド蛋
白質、特にＦＭＤＶカシシト蛋白質、と実質的に等しい
個々のぼりペプチドの合成の最初の開示を提供するもの
であシ、そして又個別の存在又は２つ又はそれ以上の蛋
白質の融合生産物として、数種のνＭＤｖポリペプチド
の一連の合成をも開示する。更Ｋ、本発明はＦＭＤＶの
培養に伴う数・々の危険なしく１通常異なったＩＦＭＤ
Ｖの変種にょシ暗号づけられる免疫原蛋白質の同時合成
の手段を提供するものである。
白質、特にＦＭＤＶカシシト蛋白質、と実質的に等しい
個々のぼりペプチドの合成の最初の開示を提供するもの
であシ、そして又個別の存在又は２つ又はそれ以上の蛋
白質の融合生産物として、数種のνＭＤｖポリペプチド
の一連の合成をも開示する。更Ｋ、本発明はＦＭＤＶの
培養に伴う数・々の危険なしく１通常異なったＩＦＭＤ
Ｖの変種にょシ暗号づけられる免疫原蛋白質の同時合成
の手段を提供するものである。
本発明の１つの面によれば、ｙｍｎｖｍＮＡの二部又は
全部又社生物学的機能断片（後に定義する）に実質的に
相当するヌクレオチＰ配列よ構成るＤＮＡ分子が提供さ
れる。好ましくはヌクレオチド配列は口蹄疫ビールスの
少くとも１つのボ・リペゾチＰの暗号づけをするもので
ある。この様なりＮム分子は実質的に１つのＩＰＭＤＶ
蛋白質に相当すると認められるプリペプチドとして表現
することが可能である。好ましくはヌクレオチド配列は
ＶＰｌの様なＦＭＤＶの構成蛋白質の暗号づけをするか
又は、全ての構造又はカプシド蛋白質の暗号づけをし、
それ等を隣接して一つの前駆体例えば構成する蛋白質に
迄分解する様なプロテアーゼの様な酵素の抑制因子によ
る安定を要求するＰ８８の様な前駆体、として合成せし
める。又他の選択としてヌクレオチド配列は全部又は一
部のＶＰ、、ＶＰ３及びＶＰ、のいずれかに隣接するＶ
Ｐｌを暗号づけし、特にその配列はｖＰｌ単独の暗号又
はＶＰ３の全部又は一部の暗号を共に与え得る。更に他
の選択として、このヌクレオチド配列は夫々異なったＦ
ＭＤＶの変種から誘導された少くとも２つのＦＭＤＶの
全部又は一部について暗号づけできる。
全部又社生物学的機能断片（後に定義する）に実質的に
相当するヌクレオチＰ配列よ構成るＤＮＡ分子が提供さ
れる。好ましくはヌクレオチド配列は口蹄疫ビールスの
少くとも１つのボ・リペゾチＰの暗号づけをするもので
ある。この様なりＮム分子は実質的に１つのＩＰＭＤＶ
蛋白質に相当すると認められるプリペプチドとして表現
することが可能である。好ましくはヌクレオチド配列は
ＶＰｌの様なＦＭＤＶの構成蛋白質の暗号づけをするか
又は、全ての構造又はカプシド蛋白質の暗号づけをし、
それ等を隣接して一つの前駆体例えば構成する蛋白質に
迄分解する様なプロテアーゼの様な酵素の抑制因子によ
る安定を要求するＰ８８の様な前駆体、として合成せし
める。又他の選択としてヌクレオチド配列は全部又は一
部のＶＰ、、ＶＰ３及びＶＰ、のいずれかに隣接するＶ
Ｐｌを暗号づけし、特にその配列はｖＰｌ単独の暗号又
はＶＰ３の全部又は一部の暗号を共に与え得る。更に他
の選択として、このヌクレオチド配列は夫々異なったＦ
ＭＤＶの変種から誘導された少くとも２つのＦＭＤＶの
全部又は一部について暗号づけできる。
好ましい態様として、ヌクレオチド配列はＦＭＤＶ血清
型のム又は０、更に好ましくはム１０，４！に６１株、
の蛋白質の暗合を与え為、更にそのヌクレオチド配列は
それに隣接して位置するコントロール配列を持ち得る。
型のム又は０、更に好ましくはム１０，４！に６１株、
の蛋白質の暗合を与え為、更にそのヌクレオチド配列は
それに隣接して位置するコントロール配列を持ち得る。
その様なコントロール配列はＦＭＤＶ核酸又は、異種原
よシ誘導される。
よシ誘導される。
本発明のもう１つの側面は後に定義する開始配列及び停
止配列を持つオペロンよ構成る組換えＤＮＡ分子、及び
口蹄疫ビールスの少くとも一つの蛋白質の全部又は−Ｉ
ＩＳｔ−実質的を暗号づける様な、ヌクレオチド配列（
そのヌクレオチド配列はオペロンの開始配列と停止配列
の間に位置している）、を提供する。
止配列を持つオペロンよ構成る組換えＤＮＡ分子、及び
口蹄疫ビールスの少くとも一つの蛋白質の全部又は−Ｉ
ＩＳｔ−実質的を暗号づける様な、ヌクレオチド配列（
そのヌクレオチド配列はオペロンの開始配列と停止配列
の間に位置している）、を提供する。
本発明は更に、開始配列と停止配列を持つオペロンより
成る全部又は一部の’ＦＭＤＶ蛋白質を表現する能力の
ある組換えＤＩムクロー二ング伝播体、及び口蹄疫Ｃ−
ルスの少くとも１つの蛋白質の全部又は一部を実質的に
暗号づける様なヌクレオチド配列（そのヌクレオチド配
列はオペロンの開始配列と停止配列の間に位置している
）を提供する。
成る全部又は一部の’ＦＭＤＶ蛋白質を表現する能力の
ある組換えＤＩムクロー二ング伝播体、及び口蹄疫Ｃ−
ルスの少くとも１つの蛋白質の全部又は一部を実質的に
暗号づける様なヌクレオチド配列（そのヌクレオチド配
列はオペロンの開始配列と停止配列の間に位置している
）を提供する。
更に本発明の側面は、組換えＤＮム・クローニング伝播
体を含む宿主細胞及び／又は上記に定義した組換えＤＭ
ム分子を提供する。
体を含む宿主細胞及び／又は上記に定義した組換えＤＭ
ム分子を提供する。
本発明は又前に定義したＤＭム伝播体によシ形質転換さ
れた宿主細胞によシ作られたＤＩム分子（前に定義した
）の表現によシ調製されたＦＭＤＶ免疫厘免疫水性少く
とも１つのポリペゾチｒよ９成る、ＦＭＤＶ Ｋ対する
抗体生産を刺戟する抗原よ９成っている。
れた宿主細胞によシ作られたＤＩム分子（前に定義した
）の表現によシ調製されたＦＭＤＶ免疫厘免疫水性少く
とも１つのポリペゾチｒよ９成る、ＦＭＤＶ Ｋ対する
抗体生産を刺戟する抗原よ９成っている。
本発明は更にＩＭＤｖの少くとも１つを実質的に暗号づ
けるＤＩム分子の調製法を提供し、（ａ） ＦＭＤＶ
の一本鎖のＲＮＡ ’１１分離し、（１）＞ νＭＤ
ＶＲＮムの一本鎖に相補的なりＭムの第一の一本鎖を調
製し、 （ａ） ＤＩムの二本鎖を作るために％第一のＤＭム
鎖に相補的で水素結合で結合する第二のＤＮムの一本鎖
を作ることより成る。
けるＤＩム分子の調製法を提供し、（ａ） ＦＭＤＶ
の一本鎖のＲＮＡ ’１１分離し、（１）＞ νＭＤ
ＶＲＮムの一本鎖に相補的なりＭムの第一の一本鎖を調
製し、 （ａ） ＤＩムの二本鎖を作るために％第一のＤＭム
鎖に相補的で水素結合で結合する第二のＤＮムの一本鎖
を作ることより成る。
この様に作られたＤＩムの二本鎖はクローニング伝播体
に挿入され、制限エンドヌクレアーゼによりクローニン
グ伝播体を分解し、りｐ−ユング伝播体の遊離端は組換
えクローニング伝播体を作るようＫ ＤＭム分子に接続
される。
に挿入され、制限エンドヌクレアーゼによりクローニン
グ伝播体を分解し、りｐ−ユング伝播体の遊離端は組換
えクローニング伝播体を作るようＫ ＤＭム分子に接続
される。
以下に列挙されたここで使われる用語は以下の意味を有
するニー 、乙ノ」乙オ！Ｌヱ：糖成分（ペンドーズ）、燐酸基、
複素環式窒素塩基よりなるＤＮム又はＲＮＡ単位、塩基
はグリコシド炭素（ベンドーズの１′縦素）によ°ヤ糖
成分に結合し、塩基がヌクレオチＰｖ４１１徴づける。
するニー 、乙ノ」乙オ！Ｌヱ：糖成分（ペンドーズ）、燐酸基、
複素環式窒素塩基よりなるＤＮム又はＲＮＡ単位、塩基
はグリコシド炭素（ベンドーズの１′縦素）によ°ヤ糖
成分に結合し、塩基がヌクレオチＰｖ４１１徴づける。
４つのＤＭム塩基はアデニン（ム）、グアニンＣＧ）、
シトシン（０）及びチタン（テ）である。４つの朋ム塩
基はム、Ｇ、Ｏｌ及びウラシル（υ）である。
シトシン（０）及びチタン（テ）である。４つの朋ム塩
基はム、Ｇ、Ｏｌ及びウラシル（υ）である。
クレオチド配列よ９成ゐ雑種の二本鎖のＤＩム配列、そ
して第一の配列は天然には第二の配列と共には見出され
ないものである。
して第一の配列は天然には第二の配列と共には見出され
ないものである。
クローニング伝播体（ビヒクル）ニー 単細胞微生吻の
中に置かれた時複製することが可能表非染色体二重鎖Ｄ
Ｉム。
中に置かれた時複製することが可能表非染色体二重鎖Ｄ
Ｉム。
クローニング伝播体。
ミノ酸配列の暗号を与えるＤＩムヌクレオチｒの配列。
開始配列ニー 転写又は徽訳の開始を制御するＭムヌク
レオチドの配列。
レオチドの配列。
停止配列ニー 転写又は−訳の停止を示すＤＩムヌクレ
オチＶ配列。
オチＶ配列。
転写ニーＲＮＡポリメラーゼが伝令ＲＮＡを作るＤＩム
配列Ｋｆ８って動かされるプロセス。
配列Ｋｆ８って動かされるプロセス。
翻訳ニー 伝令ＲＮＡから４リペデチドを作るプロセス
。
。
オペロンニー 開始配列によシ先導され停止配列によ妙
受は継がれるポリペプチド表現の暗号を与える構造遺伝
子。
受は継がれるポリペプチド表現の暗号を与える構造遺伝
子。
表現ニー 構造遺伝子からポリペプチドの生産に関与す
るプロセス。
るプロセス。
き出すことが出来る抗原決定子又は抗原決定子の追歯な
確認に要求される蛋白質又は蛋白質の一部、又は生体内
及び／又は生体外でのＩＭＤＶのライフサイクルにとっ
て重要な蛋白質又は蛋白質の一部に暗号を与えるＤＩム
分子。
確認に要求される蛋白質又は蛋白質の一部、又は生体内
及び／又は生体外でのＩＭＤＶのライフサイクルにとっ
て重要な蛋白質又は蛋白質の一部に暗号を与えるＤＩム
分子。
本発明を以下の図を参照して更に詳述する：第１図はＩ
ＭＤＶ ＲＮＡの遺伝子地図及びこれよシ作られる蛋白
質の一覧図である。第２図はＦＭＤＶＲＭムの遺伝子地
図と比較した３つの組換えプラス省ドの位地図である。
ＭＤＶ ＲＮＡの遺伝子地図及びこれよシ作られる蛋白
質の一覧図である。第２図はＦＭＤＶＲＭムの遺伝子地
図と比較した３つの組換えプラス省ドの位地図である。
第６図はＩＦＭＤＶ ＲＭムの構造遺伝子領域の図で組
換え！ラスミドｐＦムロ１／１７６のＦＭＤＶ部がＦＭ
ＤＶの構造遺伝子領域にそって並んでいることを示して
いる。第４図から第７図鑑は第３図の太線によ〕示され
たＤＮムとアミノ酸配列の図である。第８図は５株のＦ
ＭＤＶから得られたｖｐｌの窒素末端のアミノ酸配列！
比較した図である。第９図は組換えシラスミドルツム６
１／１７６におけるＶＰ３の炭素末−のヌクレオチド配
列及びｖｐ工ｘ ｔ Ｙ ｐＦＡ６１／１７６に於ける
ＶＰ、とＶＰ３ｇ暗合づける接点のヌクレオチドとアミ
ノ酬の配列を示す図である。第４１１図はＦＭＤＶＲＮ
ムの構造遺伝子領域の図で組換えシラスｔ Ｙ ｐＩＰ
ｏｌＢｙｓ／１２５１のＦＭＤＶ部がＩＦＭＤＶ Ｋ沿
って並んでいることを示している。
換え！ラスミドｐＦムロ１／１７６のＦＭＤＶ部がＦＭ
ＤＶの構造遺伝子領域にそって並んでいることを示して
いる。第４図から第７図鑑は第３図の太線によ〕示され
たＤＮムとアミノ酸配列の図である。第８図は５株のＦ
ＭＤＶから得られたｖｐｌの窒素末端のアミノ酸配列！
比較した図である。第９図は組換えシラスミドルツム６
１／１７６におけるＶＰ３の炭素末−のヌクレオチド配
列及びｖｐ工ｘ ｔ Ｙ ｐＦＡ６１／１７６に於ける
ＶＰ、とＶＰ３ｇ暗合づける接点のヌクレオチドとアミ
ノ酬の配列を示す図である。第４１１図はＦＭＤＶＲＮ
ムの構造遺伝子領域の図で組換えシラスｔ Ｙ ｐＩＰ
ｏｌＢｙｓ／１２５１のＦＭＤＶ部がＩＦＭＤＶ Ｋ沿
って並んでいることを示している。
第１２図は組換えプラスミｐ ＰＦムム６１／１７６
Ｋ挿入されたＭム配列とＩＦＭＤＶの構造遺伝子領域の
予想されるアミノ酸配列を示す甲である。第１３図は組
換えｆクスミドｐＦＡＡ６１／１７６ Ｋ挿入されたＤ
Ｉム配列とＶＰ、、ＶＰｌｌ、ｖｐ３及びｖｐｌの予想
されるアずノ酸配列を示す図である。第１．４図は表現
シラスずドｐｘｙｉの構造を図示したものである。第１
５図はＩＦＭＤ’Ｖ、ａｓ ｃＤＭムのプラスミドＰＸ
Ｙ工への導入な図示したものである。第１６図は表現プ
ラスイドの構造を図示したものである。第１７図は第１
６図に示したゾ２ス建ドの表現により生産された蛋白質
及びその分子量を図示したものである。第１８図は第１
７図に示した蛋白質の炭素末端のヌクレオチＹとアミノ
酸配列を図示したものである。
Ｋ挿入されたＭム配列とＩＦＭＤＶの構造遺伝子領域の
予想されるアミノ酸配列を示す甲である。第１３図は組
換えｆクスミドｐＦＡＡ６１／１７６ Ｋ挿入されたＤ
Ｉム配列とＶＰ、、ＶＰｌｌ、ｖｐ３及びｖｐｌの予想
されるアずノ酸配列を示す図である。第１．４図は表現
シラスずドｐｘｙｉの構造を図示したものである。第１
５図はＩＦＭＤ’Ｖ、ａｓ ｃＤＭムのプラスミドＰＸ
Ｙ工への導入な図示したものである。第１６図は表現プ
ラスイドの構造を図示したものである。第１７図は第１
６図に示したゾ２ス建ドの表現により生産された蛋白質
及びその分子量を図示したものである。第１８図は第１
７図に示した蛋白質の炭素末端のヌクレオチＹとアミノ
酸配列を図示したものである。
第１９図は少くともＩリム尾部の一部を含むＦＭＤＶ
ＲＮＡの６′末端に相当す；ｂ ｐｌＡ６１／１２４５
のヌクレオチド配列の図である。第１図についてみると
、これは前述した通シ約ｓ、ｏ ｏ ｏのヌクレオチド
の長さがあるＦＭＤＶ ＲＮＡの単純化した地図である
。
ＲＮＡの６′末端に相当す；ｂ ｐｌＡ６１／１２４５
のヌクレオチド配列の図である。第１図についてみると
、これは前述した通シ約ｓ、ｏ ｏ ｏのヌクレオチド
の長さがあるＦＭＤＶ ＲＮＡの単純化した地図である
。
ＲＮＡの翻訳は５′より３′迄である。多くの伝令ＲＭ
＾にみられる様に、１ｉ’ＭＤＶ ＲＮＡは３′末端に
？リアデニル酸配列を含んでいる。更にそれはビールス
の株によシ異なるが約１０．０から２００のヌクレオチ
ドの長さがあるポリシチジル酸部分を含んでいる。
＾にみられる様に、１ｉ’ＭＤＶ ＲＮＡは３′末端に
？リアデニル酸配列を含んでいる。更にそれはビールス
の株によシ異なるが約１０．０から２００のヌクレオチ
ドの長さがあるポリシチジル酸部分を含んでいる。
このポリシチジル酸部分はＲＮＡの５′末端から約４０
０ヌクレオチドの所に位置している（ Ｒｏｗｌａｎｄ
ｓ 。
０ヌクレオチドの所に位置している（ Ｒｏｗｌａｎｄ
ｓ 。
Ｄ、Ｊ等、ｒ、ｖｔｒｏｌｏｇｙ ２６．５３５−５４
３．１９７８ ）。
３．１９７８ ）。
ＦＭＤＶ ＲＮＡはＰ−及び番号で指定される１次生産
物と称する置訳中に数個の大きなポリペプチドに分解さ
れる−り蛋白質としてｌ１ｌｌｌｅされる。此勢の１次
生産物は恐らくプロテアーゼの暗号を持つビールスによ
シ、ＶＰＩの様な最終的゛なポリペプチド生産物迄更に
分解される。ＦＭＤ’ＶＲＮムには蛋白質の為の暗号で
はないが、例えばビールスの生存に影響を与える様な、
生体内外でのＩＦＭＤＶのライフサイクルに重要な役割
を演する部分がある。
物と称する置訳中に数個の大きなポリペプチドに分解さ
れる−り蛋白質としてｌ１ｌｌｌｅされる。此勢の１次
生産物は恐らくプロテアーゼの暗号を持つビールスによ
シ、ＶＰＩの様な最終的゛なポリペプチド生産物迄更に
分解される。ＦＭＤ’ＶＲＮムには蛋白質の為の暗号で
はないが、例えばビールスの生存に影響を与える様な、
生体内外でのＩＦＭＤＶのライフサイクルに重要な役割
を演する部分がある。
ビールス感染細脂及び無細胞蛋白合成系に於けるビール
ス情報のポリペブチＹへの錬訳の反応論的研究から主要
＆ ＩＪペゾチｒの暗号を与える遺伝情報の一一ルスケ
ツムの順序が推論されている（ Ｄｏｅｓ、？、Ｒ等Ｊ
、Ｇ＠ｎ、Ｖｉｒａ１．．第４１巻、第３９５−４０４
頁１．９７８ ； ８ａｎｇ＠ｒ、Ｄ ｖ等’ Ｊ、Ｖ
ｉｒａｌ第３３巻、第５９−６８頁、１９８０ ）。此
等の研究によシ、νＭＤＶ ＲＮＡの５ｒ末端から始め
て最初の５５０のヌクレオチｒは如何なるポリペプチド
の暗号をも与えない事が分った。生体外分析中にＮホル
ミルメチオニンで特異的にラベルしたもので示される様
にＰＩ３及びＰ２Ｏ１Ｌ蛋白質は密接な関係があシ、夫
等はＦＭＤＶ−訳の開始位置を含んでいる（ ８ａｎｇ
＠ｒ、Ｄ、Ｖ等１９８０上記引用）。Ｐ８８番 は１次生産物であＪ） ”／１−４に分断される。先行
技術の評価によ、り ＶＰＩのための遺伝子は約７００
のヌクレオチドであシ、ヌクレオチド位置の２３００と
３８００に仕切られる領域に存在しなければならない。
ス情報のポリペブチＹへの錬訳の反応論的研究から主要
＆ ＩＪペゾチｒの暗号を与える遺伝情報の一一ルスケ
ツムの順序が推論されている（ Ｄｏｅｓ、？、Ｒ等Ｊ
、Ｇ＠ｎ、Ｖｉｒａ１．．第４１巻、第３９５−４０４
頁１．９７８ ； ８ａｎｇ＠ｒ、Ｄ ｖ等’ Ｊ、Ｖ
ｉｒａｌ第３３巻、第５９−６８頁、１９８０ ）。此
等の研究によシ、νＭＤＶ ＲＮＡの５ｒ末端から始め
て最初の５５０のヌクレオチｒは如何なるポリペプチド
の暗号をも与えない事が分った。生体外分析中にＮホル
ミルメチオニンで特異的にラベルしたもので示される様
にＰＩ３及びＰ２Ｏ１Ｌ蛋白質は密接な関係があシ、夫
等はＦＭＤＶ−訳の開始位置を含んでいる（ ８ａｎｇ
＠ｒ、Ｄ、Ｖ等１９８０上記引用）。Ｐ８８番 は１次生産物であＪ） ”／１−４に分断される。先行
技術の評価によ、り ＶＰＩのための遺伝子は約７００
のヌクレオチドであシ、ヌクレオチド位置の２３００と
３８００に仕切られる領域に存在しなければならない。
本発明による組換えＤＩムを調製するのに色々な技術が
可能である。その１つは全体を分離したもの、即ち強毒
ＦＭＤＶから精製したＲＮＡの一本鎖のＤＮムコｆ−（
ｃＤＮム）を逆転写酵素を使って合成する過程よ９成る
ものである。もとのＲＮム鎖が分解した後、ｃＤＮムは
二本鎖（ｅＬａ ｃＤＮム）Ｋ転換される。これは更に
、例えばヌクレアーゼ酵素を使って出来るＤＩムの如何
るループをも除去する様に処理される。二本鎖のｅＤＮ
ムを作るもう一つの方法は良く知られている技法を使う
化学合成法である。
可能である。その１つは全体を分離したもの、即ち強毒
ＦＭＤＶから精製したＲＮＡの一本鎖のＤＮムコｆ−（
ｃＤＮム）を逆転写酵素を使って合成する過程よ９成る
ものである。もとのＲＮム鎖が分解した後、ｃＤＮムは
二本鎖（ｅＬａ ｃＤＮム）Ｋ転換される。これは更に
、例えばヌクレアーゼ酵素を使って出来るＤＩムの如何
るループをも除去する様に処理される。二本鎖のｅＤＮ
ムを作るもう一つの方法は良く知られている技法を使う
化学合成法である。
一旦二重鎖のｃＤＮムが出来れば、次の段階はこれなり
ローニング伝播体、例えば細菌シラスミド又はバクテリ
オファージに挿入することである。
ローニング伝播体、例えば細菌シラスミド又はバクテリ
オファージに挿入することである。
これは最初＆ｌＩ製したクローニング伝播体のＤＮＡを
制限エンドヌクレアーゼ酵素例えばｐ、ｔ １ 、（こ
れは相補ヌクレオチｒが点対称に配列されている位置で
ＤＮＡ Ｙ切断する酵素であるが）を使って切断する二
本鎖のＦＭＤＶ （１８ｃＤＮＡは更にその間に挿入さ
れ、数種の方法の１つを使ってクロー二／グ伝播体の開
放末端に接続される。例えば、ホモポリマー結合法と呼
ばれる方法によりいくつかのＧヌクレオチドはクローニ
ング伝播体の６′末端につけられる。この方法は末端転
移酵素の使用を含むものである。同様にして数種のＯヌ
クレオチドは二本鎖のＦＭＤＶ ｃＤＮＡの３′末端に
つけられる。この接続されたクローニング伝播体と二本
鎖のｃＤＮＡは次に混合されそこで末端アニーリングに
より接着性の末端が作られる。
制限エンドヌクレアーゼ酵素例えばｐ、ｔ １ 、（こ
れは相補ヌクレオチｒが点対称に配列されている位置で
ＤＮＡ Ｙ切断する酵素であるが）を使って切断する二
本鎖のＦＭＤＶ （１８ｃＤＮＡは更にその間に挿入さ
れ、数種の方法の１つを使ってクロー二／グ伝播体の開
放末端に接続される。例えば、ホモポリマー結合法と呼
ばれる方法によりいくつかのＧヌクレオチドはクローニ
ング伝播体の６′末端につけられる。この方法は末端転
移酵素の使用を含むものである。同様にして数種のＯヌ
クレオチドは二本鎖のＦＭＤＶ ｃＤＮＡの３′末端に
つけられる。この接続されたクローニング伝播体と二本
鎖のｃＤＮＡは次に混合されそこで末端アニーリングに
より接着性の末端が作られる。
テーリングには数種の方法がある。その１つは平滑又は
粘着末端を作るエンドヌクレアーゼによるｅＬａ ｃＤ
ＮＡの切断な含むものである。平滑末端はエクソヌクレ
アーゼにより粘着性のものに出来るであろう、もう一つ
の方法では平滑末端Ｖ ＤＮムリガーゼを用いて直接接
続させ得る、更に他の方法では、合成オリイヌクレオチ
ドが平滑末端のむｃＤＮＡに接続され、略直線化された
クローニング伝播体へのりガーゼによる結合に先立って
新しい末端はエキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアー
ゼによ）粘着性のあるものになる。
粘着末端を作るエンドヌクレアーゼによるｅＬａ ｃＤ
ＮＡの切断な含むものである。平滑末端はエクソヌクレ
アーゼにより粘着性のものに出来るであろう、もう一つ
の方法では平滑末端Ｖ ＤＮムリガーゼを用いて直接接
続させ得る、更に他の方法では、合成オリイヌクレオチ
ドが平滑末端のむｃＤＮＡに接続され、略直線化された
クローニング伝播体へのりガーゼによる結合に先立って
新しい末端はエキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアー
ゼによ）粘着性のあるものになる。
一旦二重鎖のＦＭＤＶ ｃＤＮＡがクローニング伝播体
のＤＮＡとアニーリングされれば、適当な宿主、例えば
細菌、は組換えクローニング伝播体に形質転換され、そ
こでその宿主がＦＭＤＶ ｄＪ ｃＤＮＡ ！’表現さ
せ得る様になり、これによｆｉ １ｐＭＤＶの抗原性を
示すポリペプチド又はポリペプチド類を作シ出す。
のＤＮＡとアニーリングされれば、適当な宿主、例えば
細菌、は組換えクローニング伝播体に形質転換され、そ
こでその宿主がＦＭＤＶ ｄＪ ｃＤＮＡ ！’表現さ
せ得る様になり、これによｆｉ １ｐＭＤＶの抗原性を
示すポリペプチド又はポリペプチド類を作シ出す。
ＩＦＭＤＶ蛋白質の表現に使用出来る宿主−クロー二ン
グ伝播体の組合せＫは数種のものがある。例えば有用な
りローユング伝播体はｐＡＴ １５５、（Ｔｗｉｇｇ、
ム、Ｊ、Ｍａｔｗｓ、第２８６巻、第２１６−２１８１
［，１９８０スコツトランドのグラスデー大学のり、
８ｈ＠ｒｒａｔｔ教授から入手可能ｐＢＲ３２２（１ｉ
ｌｎｔｏｌｉｆｆ＠。
グ伝播体の組合せＫは数種のものがある。例えば有用な
りローユング伝播体はｐＡＴ １５５、（Ｔｗｉｇｇ、
ム、Ｊ、Ｍａｔｗｓ、第２８６巻、第２１６−２１８１
［，１９８０スコツトランドのグラスデー大学のり、
８ｈ＠ｒｒａｔｔ教授から入手可能ｐＢＲ３２２（１ｉ
ｌｎｔｏｌｉｆｆ＠。
Ｊ、Ｇ、 ０ｏｌｌ ８ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒｎ
８ｙｍｐｏｓｉｕｎ ｆｏｒＱｕａｎｔｌｔａｔｉｖｅ
ｌＢＬｏｌｏｇｙ、第４３％巻、第７７−９０頁、１
９７８、米国サンフランシスコ大学のＨ０Ｂｏｙ＠、ｒ
博士から入手出来る）其他１．Ｃｏ１１のシラスミド及
び広宿主範囲のシラスミドの様な細菌ゾ２スミＰを含む
。ラムダファージの多くの誘導体の様なバクテリオファ
ージも又適当である。宿主としては１．ａｏｌｉ Ｋ、
１２．例えばＩＣ，ｃｏｌｉ ＨＢ ｉ Ｑ １（Ｂ
ｏｙ＠ｒ、ＨＷ、等Ｊ、Ｍｏｌ ｎ１ｏｘ、、第４１巻
、第４５９−４７２１（，１９６９；米国サンフランシ
スコ大学のＨ，ＢＯｙｅｒ博士より入手し得る）、ｌＩ
：ｃｏｌｉ Ｘ１７７６、（Ｏｕｒｔｉｍｓ、Ｒ，等ム
ｎｎ、Ｒｅｐｏｒｔ Ｄｅｐｔ ｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏ
ｌＯｇｙ Ｕｎｉｖ Ｏｆｆｉａｂａｍａ、 １９７６
ｓ第９６−１０ＳＪ（、；米国パーミンがムのアラバ
マ大学の１％、 ０ｕｒｔ↓ａｓ ｌ博士よシ入手し得
る２、Ｋ、ｃＯｌｌ Ｘ２．２ ｆ３．’ｌ （Ｒ，０
ｕｒｔｉ＠＠ 、ｍ博士より人手し得る）及びｌ、ｏｏ
ｌｉ ＭＲＯ１（英国、ケンプリツー大学８．Ｂｒｅｍ
ｅｒ博士よシ入手し得る）、Ｂａａｌｌｌｕｓ ５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ及びｐｓｓｎａｏｍｏｎｏｓの曹４株等の細
菌菌株、又酵母類、真ｉ＊＊その他の単細胞生物を含む
。然し乍ら全ての宿主が同様に有効であるという事は期
待出来ない。
８ｙｍｐｏｓｉｕｎ ｆｏｒＱｕａｎｔｌｔａｔｉｖｅ
ｌＢＬｏｌｏｇｙ、第４３％巻、第７７−９０頁、１
９７８、米国サンフランシスコ大学のＨ０Ｂｏｙ＠、ｒ
博士から入手出来る）其他１．Ｃｏ１１のシラスミド及
び広宿主範囲のシラスミドの様な細菌ゾ２スミＰを含む
。ラムダファージの多くの誘導体の様なバクテリオファ
ージも又適当である。宿主としては１．ａｏｌｉ Ｋ、
１２．例えばＩＣ，ｃｏｌｉ ＨＢ ｉ Ｑ １（Ｂ
ｏｙ＠ｒ、ＨＷ、等Ｊ、Ｍｏｌ ｎ１ｏｘ、、第４１巻
、第４５９−４７２１（，１９６９；米国サンフランシ
スコ大学のＨ，ＢＯｙｅｒ博士より入手し得る）、ｌＩ
：ｃｏｌｉ Ｘ１７７６、（Ｏｕｒｔｉｍｓ、Ｒ，等ム
ｎｎ、Ｒｅｐｏｒｔ Ｄｅｐｔ ｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏ
ｌＯｇｙ Ｕｎｉｖ Ｏｆｆｉａｂａｍａ、 １９７６
ｓ第９６−１０ＳＪ（、；米国パーミンがムのアラバ
マ大学の１％、 ０ｕｒｔ↓ａｓ ｌ博士よシ入手し得
る２、Ｋ、ｃＯｌｌ Ｘ２．２ ｆ３．’ｌ （Ｒ，０
ｕｒｔｉ＠＠ 、ｍ博士より人手し得る）及びｌ、ｏｏ
ｌｉ ＭＲＯ１（英国、ケンプリツー大学８．Ｂｒｅｍ
ｅｒ博士よシ入手し得る）、Ｂａａｌｌｌｕｓ ５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ及びｐｓｓｎａｏｍｏｎｏｓの曹４株等の細
菌菌株、又酵母類、真ｉ＊＊その他の単細胞生物を含む
。然し乍ら全ての宿主が同様に有効であるという事は期
待出来ない。
夫々のクローニング伝播体の中でＦＭＤＶ （Ｌ！ ｃ
ＤＮＡの挿入のためＫは色々な部位が可能で５あろう。
ＤＮＡの挿入のためＫは色々な部位が可能で５あろう。
夫夫の部位はＤＮＡ Ｖ切断する制限エンｒヌクレアー
ゼによ）指定されている。従って例えばＰｓｔ １酵素
はシラスミドｐＡＴ ｉ ５３をペニシリン耐性の暗号
を与える遺伝子中で切断する。Ｈ１ｎｄ璽及び１ｃｏｋ
Ｉ ＆’含む其他数種の使用出来るエンドヌクレアー
ゼがある。
ゼによ）指定されている。従って例えばＰｓｔ １酵素
はシラスミドｐＡＴ ｉ ５３をペニシリン耐性の暗号
を与える遺伝子中で切断する。Ｈ１ｎｄ璽及び１ｃｏｋ
Ｉ ＆’含む其他数種の使用出来るエンドヌクレアー
ゼがある。
ＦＭＩＩＶ ｄ ｌＩ ＣＤＮムの挿入のためのクロー
ニング伝播体の部位の選択は多くの因子に支配される。
ニング伝播体の部位の選択は多くの因子に支配される。
例えば、表現丁可きポリペプチドのサイズ、開始及び停
止配列の位置。従っであるポリペゾチｙＫとって全ての
部位が同様に効果的ではない。部位の選択は又組換えの
検出に用いられる最初のスフＩＪ 。
止配列の位置。従っであるポリペゾチｙＫとって全ての
部位が同様に効果的ではない。部位の選択は又組換えの
検出に用いられる最初のスフＩＪ 。
ユング法によっても支配されるであろう。例えばＰａｔ
１はシラスミドｐＡ？ １５３ｔ−アンピシリン耐性
の暗号な与える遺伝子中で切断すると述べたがこの様に
ナト２サイクリン耐性を示すがアンピシリンには感受性
を示す被形質転換体（トランスフォーマント）の集落は
少くともいくらかはＦＭＤＶＡｍ ｏＤＮＡ ｔ−含ん
でいそうである。
１はシラスミドｐＡ？ １５３ｔ−アンピシリン耐性
の暗号な与える遺伝子中で切断すると述べたがこの様に
ナト２サイクリン耐性を示すがアンピシリンには感受性
を示す被形質転換体（トランスフォーマント）の集落は
少くともいくらかはＦＭＤＶＡｍ ｏＤＮＡ ｔ−含ん
でいそうである。
クローニング伝播体に挿入されたＩＦＭＤＶ １ｍ ｃ
ＤＮｌは正確なフェーズで読みとられ得る事が絶対必要
である。これを達成するためには、補足ヌクレオチドを
例えば転写の開始点と表現が要求されるＩＦ’ＭＤＶ
ａｓ ｃＤＮＤＮＡの関に挿入する必要があるだろう。
ＤＮｌは正確なフェーズで読みとられ得る事が絶対必要
である。これを達成するためには、補足ヌクレオチドを
例えば転写の開始点と表現が要求されるＩＦ’ＭＤＶ
ａｓ ｃＤＮＤＮＡの関に挿入する必要があるだろう。
この様なヌクレオチｒの付加は勿論綜訳を阻害する様な
ヌクレオチＰ″Ｉｋ生ずるものであってはならない。
ヌクレオチＰ″Ｉｋ生ずるものであってはならない。
クローニング伝播体に挿入され、これＫよシ適する宿主
細胞の形質転換に使用されるＰＭＤＶ ａｓｏＤＭムの
表現はその蛋白質に４１異的な機能の出現により検出出
来る。これはνＭＤＶの場合は免疫活性である。数種の
方法が可能である、例えば、Ｐｒｏ、１ｉａｔ、ムａａ
ａ、８ｏ１１９７８年、第７５巻、第２７４６−２７４
９頁に１１．ＢｒｏｏｎｅとＷ、Ｇ１１ｂ＠ｒｔが発表
した本質的免疫集落スクリーニング法、一つの変法（こ
れはいくらか簡単な技術である）は適轟に操作されたク
ローニング伝播体により形質転換された細菌の培養物か
ら抽出した粗細曹抽出物を実験動物に注射し、適する抗
体の生成をテストする方法である。第二の変法は細菌細
胞の粗抽出物の免疫沈澱を行う方法である。更に他の方
法。
細胞の形質転換に使用されるＰＭＤＶ ａｓｏＤＭムの
表現はその蛋白質に４１異的な機能の出現により検出出
来る。これはνＭＤＶの場合は免疫活性である。数種の
方法が可能である、例えば、Ｐｒｏ、１ｉａｔ、ムａａ
ａ、８ｏ１１９７８年、第７５巻、第２７４６−２７４
９頁に１１．ＢｒｏｏｎｅとＷ、Ｇ１１ｂ＠ｒｔが発表
した本質的免疫集落スクリーニング法、一つの変法（こ
れはいくらか簡単な技術である）は適轟に操作されたク
ローニング伝播体により形質転換された細菌の培養物か
ら抽出した粗細曹抽出物を実験動物に注射し、適する抗
体の生成をテストする方法である。第二の変法は細菌細
胞の粗抽出物の免疫沈澱を行う方法である。更に他の方
法。
は８ａｎａａｒ等がＪ、Ｂａａｔ、１９７９、第１３７
巻、第６９２−６９５頁に発表した「マクシ七ル技法」
である。
巻、第６９２−６９５頁に発表した「マクシ七ル技法」
である。
本発明の組換えＤＮＡ分子の宿主による表現の結果表現
されたポリペブチｒの本質はクローニング伝播体のＤＮ
Ａの挿入点に依存する。従って実際上ＦＭＤＶ ｅＬａ
ａＤＭＡＫよシ暗号を与えられた４リペゾチ「及びク
ローニング伝播体のＤＮＡにょｂ暗号を与えられたぼり
ペゾチ１］成る前駆体ぼりペゾチＶが生ずる。従って例
えばもしシラスｉ Ｙ ｐＡＴ１５３がＰａｔ １によ
）切断されるとベニシリナーゼの一部よ９成る前駆体４
リペデチド及びＦＭＤＶＡｍ ｃＤＮＡ Ｋより暗号を
与えられたｌリペデチドが表現されるであろう。次にそ
の前駆体４リペデチドは不必要なアミノ酸配列から望ま
しいＩＦＭＤＶ ｔ−分離する様に選択的に切断される
。通常切断は当技術に熟達した人によく知られた技法に
よシ微生物培養物の収穫に引き続き宿主の外側で達成さ
れる。切断ＩＦＭＤＶ表現生産物に望ましい活性が発現
出来るための切断が必要である。然し乍ら、微生物培養
物の収穫中、不要なアミノ酸配列が要求されるＦＭＤＶ
／リペゾチドに結合している事実は内因性酵素による
表現生産物の分解の防止を助けている。変法として、切
断は宿主の内部で達成し得る。これは望ましい切断酵素
に暗号を与えるＤＮＡをクローニング伝播体に挿入する
ことにょシ達成される。
されたポリペブチｒの本質はクローニング伝播体のＤＮ
Ａの挿入点に依存する。従って実際上ＦＭＤＶ ｅＬａ
ａＤＭＡＫよシ暗号を与えられた４リペゾチ「及びク
ローニング伝播体のＤＮＡにょｂ暗号を与えられたぼり
ペゾチ１］成る前駆体ぼりペゾチＶが生ずる。従って例
えばもしシラスｉ Ｙ ｐＡＴ１５３がＰａｔ １によ
）切断されるとベニシリナーゼの一部よ９成る前駆体４
リペデチド及びＦＭＤＶＡｍ ｃＤＮＡ Ｋより暗号を
与えられたｌリペデチドが表現されるであろう。次にそ
の前駆体４リペデチドは不必要なアミノ酸配列から望ま
しいＩＦＭＤＶ ｔ−分離する様に選択的に切断される
。通常切断は当技術に熟達した人によく知られた技法に
よシ微生物培養物の収穫に引き続き宿主の外側で達成さ
れる。切断ＩＦＭＤＶ表現生産物に望ましい活性が発現
出来るための切断が必要である。然し乍ら、微生物培養
物の収穫中、不要なアミノ酸配列が要求されるＦＭＤＶ
／リペゾチドに結合している事実は内因性酵素による
表現生産物の分解の防止を助けている。変法として、切
断は宿主の内部で達成し得る。これは望ましい切断酵素
に暗号を与えるＤＮＡをクローニング伝播体に挿入する
ことにょシ達成される。
νＭＤ’Ｖ ａｓ ｏＤＮＡ Ｋよシ暗号を与えられた
ポリペブチｒと例えばペニシリナーゼ酵素の一部の融合
生産物の生産は１．ｏｏ１１中の雑種（ハイブリッド）
蛋白質の安定性を増加させＦＭＤＶ蛋白質の抗原性を増
強さえする。
ポリペブチｒと例えばペニシリナーゼ酵素の一部の融合
生産物の生産は１．ｏｏ１１中の雑種（ハイブリッド）
蛋白質の安定性を増加させＦＭＤＶ蛋白質の抗原性を増
強さえする。
変法として、例えばＩＦＭＤＶ ＲＮムから誘導された
追歯なヌクレオチド配列は、宿主ｌリペゾチドとの融合
生産物としてではな（、ＦＭＤＶ ａｓ ｃＤＮｌが単
独で表現されることを保証する様にＦＭＤｖａｓ ｃＤ
Ｎｌの前に挿入される。
追歯なヌクレオチド配列は、宿主ｌリペゾチドとの融合
生産物としてではな（、ＦＭＤＶ ａｓ ｃＤＮｌが単
独で表現されることを保証する様にＦＭＤｖａｓ ｃＤ
Ｎｌの前に挿入される。
一旦少くともいくらかのＦＭＷ ａｓ ｃＤＮｌ １に
含む被形質転換物が同定されれば、組換えクローニング
伝季体は精製され、ｉＦＭＤＶ ａｓ ｃＤＮｌがどの
位挿入されたかを定量するための分析がなされる。この
ためＫＦｉ組換えクローニング伝播体］）Ｍムは数種ノ
異なった制限エンドヌクレアーゼ、例えば１ａｏｋｌ。
含む被形質転換物が同定されれば、組換えクローニング
伝季体は精製され、ｉＦＭＤＶ ａｓ ｃＤＮｌがどの
位挿入されたかを定量するための分析がなされる。この
ためＫＦｉ組換えクローニング伝播体］）Ｍムは数種ノ
異なった制限エンドヌクレアーゼ、例えば１ａｏｋｌ。
Ｐｓｔｌ、ｓ＆１１、Ｂｇｌ ｌ 、 Ｂａｗｌ（、Ｈ
Ｌｎ６厘及びＨｌｎｆｌの様な酵素によ）処理され、そ
して分解生成物はデル電気泳動によシ分析される。これ
等の結果を用いて、Ｔ１ヌクレアーゼによるＦＭＷ Ｒ
ＮムのＲＮａｓ・分解によ）生産されたＴｌオリ？ヌク
レオチｙが組換えＤＮＡの分離した制限エンＶヌクレア
ーゼ分解生産物と雑種形成された時に得られた結果と共
に、第２図に示したものと同様のりｏ −ユング伝播体
に挿入されたＩＰＭＤＶ ａｓ ａＤ）ｉム地図が作ら
れる。この様な地図から、望ましいνＭＤＶ遺伝子、例
えばＶＰｌの暗号を与える遺伝子、な含む組換え物な選
択することが可能であろう。
Ｌｎ６厘及びＨｌｎｆｌの様な酵素によ）処理され、そ
して分解生成物はデル電気泳動によシ分析される。これ
等の結果を用いて、Ｔ１ヌクレアーゼによるＦＭＷ Ｒ
ＮムのＲＮａｓ・分解によ）生産されたＴｌオリ？ヌク
レオチｙが組換えＤＮＡの分離した制限エンＶヌクレア
ーゼ分解生産物と雑種形成された時に得られた結果と共
に、第２図に示したものと同様のりｏ −ユング伝播体
に挿入されたＩＰＭＤＶ ａｓ ａＤ）ｉム地図が作ら
れる。この様な地図から、望ましいνＭＤＶ遺伝子、例
えばＶＰｌの暗号を与える遺伝子、な含む組換え物な選
択することが可能であろう。
本発明のもう一つの側面は前に定義された組換えＤ）ｉ
ム分子の地図作成法を提供するものでこれは次の段階よ
）成る； （ａ） ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼによシ分解
し生産物を分離する、 （ｂ） Ｔｌリボヌクレアーゼ分解によシ生成するＦ
ＭＤＶＲＮムの標識オリジヌクレオチドを加える、（０
） Ｔｘオリ♂ヌクレチドがこれに雑種形成された制
限エンドヌクレアーゼ分解生産物を同定する。
ム分子の地図作成法を提供するものでこれは次の段階よ
）成る； （ａ） ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼによシ分解
し生産物を分離する、 （ｂ） Ｔｌリボヌクレアーゼ分解によシ生成するＦ
ＭＤＶＲＮムの標識オリジヌクレオチドを加える、（０
） Ｔｘオリ♂ヌクレチドがこれに雑種形成された制
限エンドヌクレアーゼ分解生産物を同定する。
色々のＤＩム分子がＦＭＤＶの生体サンプル中に存在す
る生体外診断のための探査子として使用可能である。特
にＦＭＤＶの発生を引きおこす血清型又は亜型の決定に
使用し得る。この目的のために、ＤＩム分子は公知の方
法で放射性マイソトー！によ）標識される。更に、組換
えクローニング伝播体の表現生産物は血清学的診断及び
ＦＭＤＶに対する単価又は多価ワクチンの生産に、ワク
チン製造としてよく知られている方法により、使用出来
る。
る生体外診断のための探査子として使用可能である。特
にＦＭＤＶの発生を引きおこす血清型又は亜型の決定に
使用し得る。この目的のために、ＤＩム分子は公知の方
法で放射性マイソトー！によ）標識される。更に、組換
えクローニング伝播体の表現生産物は血清学的診断及び
ＦＭＤＶに対する単価又は多価ワクチンの生産に、ワク
チン製造としてよく知られている方法により、使用出来
る。
その様なワクチンはワクチンを投与された動物の抗体を
刺戟しＦＭＤＶから防御するのに有効である。
刺戟しＦＭＤＶから防御するのに有効である。
本発明のもう−の側面は、獣医学的に受容されている担
体と共に前に定義された宿主細胞により生産された：Ｆ
ＭＤＶ免疫原性を示す、少くとも１つの蛋白質よシ成る
哺乳類のＩＦＭＤＶに対する抗体の生産な刺戟するワク
チンを提供するととくある。
体と共に前に定義された宿主細胞により生産された：Ｆ
ＭＤＶ免疫原性を示す、少くとも１つの蛋白質よシ成る
哺乳類のＩＦＭＤＶに対する抗体の生産な刺戟するワク
チンを提供するととくある。
更に本発明の側面は哺乳類のＦＭＤＶに対する抗体生産
を刺戟する方法を提供することにＴｏシ、これは上記に
定義されたワクチンを「免疫的に有効な無毒性量」を投
与することよシ成っている。
を刺戟する方法を提供することにＴｏシ、これは上記に
定義されたワクチンを「免疫的に有効な無毒性量」を投
与することよシ成っている。
「免疫的に有効な無毒性量」という言葉は哺乳類に充分
な抗体を刺戟するのに充分なＦＭＤＶ免疫原性を示す蛋
白量を示すのに使用される。即ち、哺乳類がワクチン投
与後有毒なＦＭＤＶに遭遇した場合、この病気に屈する
ことなく又哺乳類にとって有毒でもないという様な量な
示す。
な抗体を刺戟するのに充分なＦＭＤＶ免疫原性を示す蛋
白量を示すのに使用される。即ち、哺乳類がワクチン投
与後有毒なＦＭＤＶに遭遇した場合、この病気に屈する
ことなく又哺乳類にとって有毒でもないという様な量な
示す。
更に本発明の本質、特徴を次の実施例にょシ述べるが、
これは説明の手段のみとして提供するもので如何なる意
味でも本発明の範囲を限定するものと考えられることは
ない。
これは説明の手段のみとして提供するもので如何なる意
味でも本発明の範囲を限定するものと考えられることは
ない。
例 １
ＦＭＤＶ ＲＮＡの調製
約１０−のイーグル培地中の新・しく収穫したＡ１０型
ＦＭＤＶ（Ａ ６１株）（各国の夫にの必要条件に従い
、英国Ｐｉｒｂｒｉｇｈｔの動物ビールス研究所（Ａｎ
ｉｍａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅａｅａｒｃｈ Ｉｎ５ｔｉ
ｔｕｔｅ 、）に中鎖すれば自由に入手出来る）を約１
０８ＢＨＫ２□細胞の一層を含むルー（Ｒｏｕｘ ）ピ
ン１０本の夫々に加える。６０分間ゆっくりと振盪した
後、培地をデカントし夫々のビンに２０１１７ずつ新し
い培地を加える。ビールス感染が細胞の単層を破壊した
俊（６−４時間）、培地をデカントし、細胞細片を１２
．０００ ｘｇ で１５分間４℃での遠沈により除く
。次にビールスは９０．０００ ｘｇ で１時間４℃
で遠心してペレット化される。このビールペレットをＴ
ＮＨ緩衝液２’、（１０ｍＭ）リス−ＨＣｔ。
ＦＭＤＶ（Ａ ６１株）（各国の夫にの必要条件に従い
、英国Ｐｉｒｂｒｉｇｈｔの動物ビールス研究所（Ａｎ
ｉｍａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅａｅａｒｃｈ Ｉｎ５ｔｉ
ｔｕｔｅ 、）に中鎖すれば自由に入手出来る）を約１
０８ＢＨＫ２□細胞の一層を含むルー（Ｒｏｕｘ ）ピ
ン１０本の夫々に加える。６０分間ゆっくりと振盪した
後、培地をデカントし夫々のビンに２０１１７ずつ新し
い培地を加える。ビールス感染が細胞の単層を破壊した
俊（６−４時間）、培地をデカントし、細胞細片を１２
．０００ ｘｇ で１５分間４℃での遠沈により除く
。次にビールスは９０．０００ ｘｇ で１時間４℃
で遠心してペレット化される。このビールペレットをＴ
ＮＨ緩衝液２’、（１０ｍＭ）リス−ＨＣｔ。
ＰＦ１７．５）、ＮａＣｔｌ ５０ ＷＪ及び１ｍＭの
ＥＤ’ｌ’Ａ （エチレンヂアミｙ ４酢酸）の中に再
懸濁しこの懸濁液は１０分間、２０℃で約５．０００
ｘｇ で遠沈して清澄化する。
ＥＤ’ｌ’Ａ （エチレンヂアミｙ ４酢酸）の中に再
懸濁しこの懸濁液は１０分間、２０℃で約５．０００
ｘｇ で遠沈して清澄化する。
靜澄化された懸濁液をドデシル硫酸ソーダ（８Ｄ８ ）
中でＷ／Ｖ １−濃度とじＴＮ緩衝液（１００ｍ）すＸ
Ｈｃｌ 、 Ｐ）１７．６ 、１００ｍＮａｃＡ ）中
テＱＭｔ勾配置１ｃｂ・ケ（庶糖１５−４５ ＊ｗ／ｖ
）、１０℃で２時間、１００．Ｏｉ、００ ｘｇ で
遠心する。
中でＷ／Ｖ １−濃度とじＴＮ緩衝液（１００ｍ）すＸ
Ｈｃｌ 、 Ｐ）１７．６ 、１００ｍＮａｃＡ ）中
テＱＭｔ勾配置１ｃｂ・ケ（庶糖１５−４５ ＊ｗ／ｖ
）、１０℃で２時間、１００．Ｏｉ、００ ｘｇ で
遠心する。
分画（１１１１）を２６０ ｎｍ で追跡し、−一ルス
な含む分画な１度等量のフェノール：クロロフォルム（
？：１）で抽出し液相を２倍量のエタノールを加えて沈
澱し、２０℃で一夜インキエベートする。ＲＮＡ沈澱は
６０分間４℃で、５．０００ ｘｇ で遠心してペレッ
ト化する。上澄みを捨て、ペレットを取り出し、０．５
ゴのＴＮＥ８緩衝液（１０−のトリス−Ｈｃｊｐｉ（７
−６、１５０ｍＭのＮａｃＡ 、 １ ｍＭのｇＤＴＡ
、 ０−２ ％ Ｗ ／ Ｖ ８ＤＢ） Ｋ溶解す
る・。此の溶液を’Ｉ’ＮＥＳ 中で庶糖密度勾配に
かけ、２０℃で３５時間２００，０００ ｘｇ で遠心
する。３５８で沈澱するＲＮＡを含む分画（Ｑ、５１Ｌ
ｔ）を集め、一度フエノールークロロフォルムチ抽出、
エタノールで沈澱し、上記Ｃ−ルスについて述べた様に
再溶解する。こへに出来た溶液をエタノールで沈澱し最
終的に再蒸量水Ｑ、Ｑ５ａＪに溶解する。
な含む分画な１度等量のフェノール：クロロフォルム（
？：１）で抽出し液相を２倍量のエタノールを加えて沈
澱し、２０℃で一夜インキエベートする。ＲＮＡ沈澱は
６０分間４℃で、５．０００ ｘｇ で遠心してペレッ
ト化する。上澄みを捨て、ペレットを取り出し、０．５
ゴのＴＮＥ８緩衝液（１０−のトリス−Ｈｃｊｐｉ（７
−６、１５０ｍＭのＮａｃＡ 、 １ ｍＭのｇＤＴＡ
、 ０−２ ％ Ｗ ／ Ｖ ８ＤＢ） Ｋ溶解す
る・。此の溶液を’Ｉ’ＮＥＳ 中で庶糖密度勾配に
かけ、２０℃で３５時間２００，０００ ｘｇ で遠心
する。３５８で沈澱するＲＮＡを含む分画（Ｑ、５１Ｌ
ｔ）を集め、一度フエノールークロロフォルムチ抽出、
エタノールで沈澱し、上記Ｃ−ルスについて述べた様に
再溶解する。こへに出来た溶液をエタノールで沈澱し最
終的に再蒸量水Ｑ、Ｑ５ａＪに溶解する。
二本鎖の相補ＤＮＡ （Ｄ８ｃＤＮＡ） の合成ＦＭ
ＤＶ ＲＮＡ （１０４）及びオリゴ−ｄＴ （１２−
１８）ｆライマー （０，５１ｑｉ Ｃｏ１１ａｂｏｒ
ａｔｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ より入手）を０．４ｍ
Ｍ のジチオトレイトール、８ ｍＭ Ｍｇｃｔ２．５
０ｍＭのＰ）４８．１トリス−Ｈｃｊ１１４８ｍＭのＮ
ａｃｊ 、 ０．２ ｍＭ ｆ） ｄＡＴＰ（２，５Ｃ
１／ ｍ ｍｏｌｅ （α”Ｐ ）−ｄＡＴＰ ； Ａ
ｍｅｒｓｈａｍのＲａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｅｎ
ｔｒｅより入手）、０．２ ｍＭのｄＴＴＰ 、 ０．
２ ｍＭのｄＣ’Ｉ’Ｐ 、 ０．２ ｍＭ ｄＧＴＰ
、 ４ ｍＭのＮａ４Ｐ２Ｏ７及びＡＭＶ逆転写酵素
２８単位（フロリダのＬｉｆｅ ５ｃｉｅｎｃｅ社、Ｊ
、Ｂｅａｒｄ博士より供給された）を含む最終容量１
００μｍ で３０℃、２時間インキュベートした。反応
なＥＤＴＡ （２０ｍＭ ）及びＳｎ２ （０，２１Ｗ
／Ｖ ）を加え停止した。反応を停止したこの混合サン
プル（２％）をＤＥ８１吠−パーディスク（Ｗｈａｔｍ
ａｎ社より入手）上２．５０にスデットした。これ等を
５ ％ （Ｗ ／ Ｖ ） Ｎ５Ｌ２ＨＰＯ４中でよく
洗い更に、乾燥とシンチレーンヨンカウントを行う前に
短時間（５分）水で洗った。この操作により、全収量的
２μｇのｃＤＮＡが計算された。
ＤＶ ＲＮＡ （１０４）及びオリゴ−ｄＴ （１２−
１８）ｆライマー （０，５１ｑｉ Ｃｏ１１ａｂｏｒ
ａｔｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ より入手）を０．４ｍ
Ｍ のジチオトレイトール、８ ｍＭ Ｍｇｃｔ２．５
０ｍＭのＰ）４８．１トリス−Ｈｃｊ１１４８ｍＭのＮ
ａｃｊ 、 ０．２ ｍＭ ｆ） ｄＡＴＰ（２，５Ｃ
１／ ｍ ｍｏｌｅ （α”Ｐ ）−ｄＡＴＰ ； Ａ
ｍｅｒｓｈａｍのＲａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｅｎ
ｔｒｅより入手）、０．２ ｍＭのｄＴＴＰ 、 ０．
２ ｍＭのｄＣ’Ｉ’Ｐ 、 ０．２ ｍＭ ｄＧＴＰ
、 ４ ｍＭのＮａ４Ｐ２Ｏ７及びＡＭＶ逆転写酵素
２８単位（フロリダのＬｉｆｅ ５ｃｉｅｎｃｅ社、Ｊ
、Ｂｅａｒｄ博士より供給された）を含む最終容量１
００μｍ で３０℃、２時間インキュベートした。反応
なＥＤＴＡ （２０ｍＭ ）及びＳｎ２ （０，２１Ｗ
／Ｖ ）を加え停止した。反応を停止したこの混合サン
プル（２％）をＤＥ８１吠−パーディスク（Ｗｈａｔｍ
ａｎ社より入手）上２．５０にスデットした。これ等を
５ ％ （Ｗ ／ Ｖ ） Ｎ５Ｌ２ＨＰＯ４中でよく
洗い更に、乾燥とシンチレーンヨンカウントを行う前に
短時間（５分）水で洗った。この操作により、全収量的
２μｇのｃＤＮＡが計算された。
残りの反応混柾二をフェノール−クロロフォルムで抽出
し上記の通り、但しエタノール添加の前に酢酸ソーダを
０．２Ｍ加えた点を除いて、エタノール沈澱を行った。
し上記の通り、但しエタノール添加の前に酢酸ソーダを
０．２Ｍ加えた点を除いて、エタノール沈澱を行った。
乾燥したペレットを１００μｍ の０．１ Ｍ Ｎａ
ＯＨに溶解し、鋳型即ちＦＭＤＶ ＲＮＡ を除去する
ため７０℃で２０分インキュベートした。
ＯＨに溶解し、鋳型即ちＦＭＤＶ ＲＮＡ を除去する
ため７０℃で２０分インキュベートした。
この溶液を酢酸で中和し、分解されたＲＮＡより溶解し
たｃＤＮＡ をビーズ−ｆフェノール−クロロフォルム
のカラム（１００Ｘ１５ｍｎ） を通過させた。乾燥
ペレットを再び最終容量９０μｔで５Ｑｍの−８，６の
トリス−Ｈｃｔ、２０１１７のジチオトレイトール、１
０ｍＭのＭｇｃｔ２．０．４ ｍＭのｄｃ’Ｉ’Ｐ 。
たｃＤＮＡ をビーズ−ｆフェノール−クロロフォルム
のカラム（１００Ｘ１５ｍｎ） を通過させた。乾燥
ペレットを再び最終容量９０μｔで５Ｑｍの−８，６の
トリス−Ｈｃｔ、２０１１７のジチオトレイトール、１
０ｍＭのＭｇｃｔ２．０．４ ｍＭのｄｃ’Ｉ’Ｐ 。
０．４ ｍＭのｄＧＴＰ 、 ０．４ ｍＭのｄＡＴｐ
（５，５，ｃｉ ／ ｍｍｏｌｅ （α”Ｐ ）−Ａ
ＴＰ ： ＡｍｅｒｓｈａｍのＲａｄｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａ４Ｃｅｎｔｒｅ ）、０．４ｍＭのｄＴＴＰ 及び３
６単位の順逆転写酵素中に懸濁した。４５℃で４時間反
応後、ＥＤＴＡ （２０ｍＭ ）及び８Ｄ８ （０，２
＊Ｗ／Ｖ ）を加え反応を停止した。この混合液をフェ
ノール−クロロフォルムで抽出し、Ｎａｃｔ を０．２
Ｍ迄加え、−２０℃で一夜、２倍量のエタノールによす
沈澱させた。乾燥ペレットを再び２００μｌの５０ｍＭ
ＮａｃＡ 、 ０．１ ％ Ｗ ／ Ｖ ８ＤＢ に
懸濁し、上記のセファデックスＧ１００のカラムを通過
させた。ｍ出したピークを２００μｇ のグリコーゲン
担体の存在下でエタノール沈澱した。上記したＤＥ８１
ペーパーディスク分析によれは二本鎖の合成は最大理論
収量の約６０％であった。エタノール沈澱から乾燥した
ペレットを最終容量２００μｍ のｓ１緩衝液（２５ｍ
Ｍ の酢酸ソーダ（ｐＨ４，６）、１５０ｍＭのＮａｃ
ｔ及び１ｍＭのＺｎ８０４ ）中に８懸濁した。このサ
ンプル（サンプルＡ）２８μｔを一２０℃に貯蔵し、残
り（サンダルＢ）は５単位の８１ヌクレアーゼ（８１ｇ
ｍａ より入手）と共に６７℃で３０分間インキエペ
ートした。この反応をラエノールークロロフォルム抽出
により停止し、液相をエタノールで沈澱させた。乾燥ペ
レットを２μｔのＨ２Ｏ中に再懸濁した。二本鎖のＣＤ
ＮＡ甲のループを除くための８０ヌクレアーゼ処理の効
果をチェックするため、少量（２−）のサンプルＡ及び
Ｂを８Ｉ緩衝液中で１００℃で６分加熱し６０°Ｃ迄冷
却し、３単位の８□ を時間を変えて（０゜０．２５
、１及び１４時間）加え、其後６７℃で３０分インキュ
ベートした。８工に対する耐性を上記のＤＥ８１ペーパ
ーディスクパインディングにより定量した。その結果は
サンプルＡ及びＢを６０℃に冷却後直ちに８Ｉと共にイ
ンキュベートした時、５３％以上のサンプルＡが８１
分解に耐性があり、これに比してサンプルＢは２％以下
であ旭ことを示した。８工をサンプルが６０℃に置かれ
てから０．２５時間後加えた場合は此等の数字は夫々８
１チ及び１５ｔｓに上昇した。従って最初の８工処理が
第２の鎖の合成後存在するループを有効に切断したもの
である。
（５，５，ｃｉ ／ ｍｍｏｌｅ （α”Ｐ ）−Ａ
ＴＰ ： ＡｍｅｒｓｈａｍのＲａｄｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａ４Ｃｅｎｔｒｅ ）、０．４ｍＭのｄＴＴＰ 及び３
６単位の順逆転写酵素中に懸濁した。４５℃で４時間反
応後、ＥＤＴＡ （２０ｍＭ ）及び８Ｄ８ （０，２
＊Ｗ／Ｖ ）を加え反応を停止した。この混合液をフェ
ノール−クロロフォルムで抽出し、Ｎａｃｔ を０．２
Ｍ迄加え、−２０℃で一夜、２倍量のエタノールによす
沈澱させた。乾燥ペレットを再び２００μｌの５０ｍＭ
ＮａｃＡ 、 ０．１ ％ Ｗ ／ Ｖ ８ＤＢ に
懸濁し、上記のセファデックスＧ１００のカラムを通過
させた。ｍ出したピークを２００μｇ のグリコーゲン
担体の存在下でエタノール沈澱した。上記したＤＥ８１
ペーパーディスク分析によれは二本鎖の合成は最大理論
収量の約６０％であった。エタノール沈澱から乾燥した
ペレットを最終容量２００μｍ のｓ１緩衝液（２５ｍ
Ｍ の酢酸ソーダ（ｐＨ４，６）、１５０ｍＭのＮａｃ
ｔ及び１ｍＭのＺｎ８０４ ）中に８懸濁した。このサ
ンプル（サンプルＡ）２８μｔを一２０℃に貯蔵し、残
り（サンダルＢ）は５単位の８１ヌクレアーゼ（８１ｇ
ｍａ より入手）と共に６７℃で３０分間インキエペ
ートした。この反応をラエノールークロロフォルム抽出
により停止し、液相をエタノールで沈澱させた。乾燥ペ
レットを２μｔのＨ２Ｏ中に再懸濁した。二本鎖のＣＤ
ＮＡ甲のループを除くための８０ヌクレアーゼ処理の効
果をチェックするため、少量（２−）のサンプルＡ及び
Ｂを８Ｉ緩衝液中で１００℃で６分加熱し６０°Ｃ迄冷
却し、３単位の８□ を時間を変えて（０゜０．２５
、１及び１４時間）加え、其後６７℃で３０分インキュ
ベートした。８工に対する耐性を上記のＤＥ８１ペーパ
ーディスクパインディングにより定量した。その結果は
サンプルＡ及びＢを６０℃に冷却後直ちに８Ｉと共にイ
ンキュベートした時、５３％以上のサンプルＡが８１
分解に耐性があり、これに比してサンプルＢは２％以下
であ旭ことを示した。８工をサンプルが６０℃に置かれ
てから０．２５時間後加えた場合は此等の数字は夫々８
１チ及び１５ｔｓに上昇した。従って最初の８工処理が
第２の鎖の合成後存在するループを有効に切断したもの
である。
アがローズゲル電気泳動によりサンプルＢの分子サイズ
を推定したところ２００ ｂｐ 以下に至る全長コピー
（即ち、約８０００ｂｐ［塩基対〕）の間に分布し平均
値は２，０００−４．０００ ｂｐ であることを示し
た。
を推定したところ２００ ｂｐ 以下に至る全長コピー
（即ち、約８０００ｂｐ［塩基対〕）の間に分布し平均
値は２，０００−４．０００ ｂｐ であることを示し
た。
シラスミドと二本鎖ＣＤＮＡ （ｄｓ ｃＤＮＡ）
のホモポリ（ａ）ベクターのｄＧ結合 約７μｇ の
ベクター、プラスミドｐＡＴ１５３をエンドヌクレアー
ゼＰｓｔｌで本酵素の供給者（ベーリンガー）の指示す
る条件下で分解した。この反応を０．３ Ｍ迄酢酸ソー
ダを加えて停止し、エタノチル沈澱を行った。乾燥した
ペレットを１００μｔのｄＧ−結合緩衝液（カコデル酸
ソーダーＨｃＬｐＨ７，１）、５ｍＭのＭｇｃ１２．５
０ｓ９／ｍｌのウシアルブミン及び１ｍＭと３ のｄＧＴＰ （２００ｍＣｉ （ｆ３−”ｒ −Ｈ：］
−ｄＧＴＰ ／ ｍｍｏｌｅ ） に再懸濁した。
のホモポリ（ａ）ベクターのｄＧ結合 約７μｇ の
ベクター、プラスミドｐＡＴ１５３をエンドヌクレアー
ゼＰｓｔｌで本酵素の供給者（ベーリンガー）の指示す
る条件下で分解した。この反応を０．３ Ｍ迄酢酸ソー
ダを加えて停止し、エタノチル沈澱を行った。乾燥した
ペレットを１００μｔのｄＧ−結合緩衝液（カコデル酸
ソーダーＨｃＬｐＨ７，１）、５ｍＭのＭｇｃ１２．５
０ｓ９／ｍｌのウシアルブミン及び１ｍＭと３ のｄＧＴＰ （２００ｍＣｉ （ｆ３−”ｒ −Ｈ：］
−ｄＧＴＰ ／ ｍｍｏｌｅ ） に再懸濁した。
これに２μｔ （３８単位）の末端転移酵素を加え６７
℃でインキュベートして反応させた。サンノルを２．５
分、５分、１０分後に取り出し“た。夫々の場合、反応
を氷の上で冷し又２０ｍＭ迄ＥＤＴＡを加えて停止させ
た。夫々り込みは起らず、此の時点でのホモポリマー尾
部の平均−の長さは約２５ヌクレオチＰであることな示
した。２．５分のサンプルの残りはＴＥ緩衝液（トリス
−Ｈｃｔ ｐＨ８−０１０ｍＭ 、 ＥＤＴＡ １
ｍＭ ） で１００μｔ に稀釈し等量のＴＥ−飽和
フェノールで１回抽出した。液相をエーテルで４回抽出
した。
℃でインキュベートして反応させた。サンノルを２．５
分、５分、１０分後に取り出し“た。夫々の場合、反応
を氷の上で冷し又２０ｍＭ迄ＥＤＴＡを加えて停止させ
た。夫々り込みは起らず、此の時点でのホモポリマー尾
部の平均−の長さは約２５ヌクレオチＰであることな示
した。２．５分のサンプルの残りはＴＥ緩衝液（トリス
−Ｈｃｔ ｐＨ８−０１０ｍＭ 、 ＥＤＴＡ １
ｍＭ ） で１００μｔ に稀釈し等量のＴＥ−飽和
フェノールで１回抽出した。液相をエーテルで４回抽出
した。
酢酸ナトリウムを０．６Ｍ迄加え、サンプルをエタノー
ルで沈澱させた。乾燥ペレッ）４０μｔのＨ２Ｏに再懸
濁し一１０℃に貯蔵した。この最終溶液中のＤＮＡ 濃
度は１５μＩ／ＴｔＬｌ と推定された。
ルで沈澱させた。乾燥ペレッ）４０μｔのＨ２Ｏに再懸
濁し一１０℃に貯蔵した。この最終溶液中のＤＮＡ 濃
度は１５μＩ／ＴｔＬｌ と推定された。
ｐＨ７，１、ＣＯＣｌ２ １ ｍＭ、 ＤＴＴ Ｏ−
１ｍＭ、ウシ血清７Ｎ ルデミン５０ ｔｔ、１ｉ２／ｍ１． ３Ｈａｃｒｐ
（６Ｄ Ｏｍ Ｃ１（５−３Ｈ）−ＣＴＰ、／ ｍ ｍ
ｏｌ ） ０．５ ｍＭ 中の約０．４ｆｉｇのｄｅｃ
−ＤＮＡを１μｔのＴＴ （１９単位）とインキュベ
ートした。２分及び５分後液を取り出し各々５μｔのサ
ンプルをＴＣＡ沈澱により取り込みを分析した。
１ｍＭ、ウシ血清７Ｎ ルデミン５０ ｔｔ、１ｉ２／ｍ１． ３Ｈａｃｒｐ
（６Ｄ Ｏｍ Ｃ１（５−３Ｈ）−ＣＴＰ、／ ｍ ｍ
ｏｌ ） ０．５ ｍＭ 中の約０．４ｆｉｇのｄｅｃ
−ＤＮＡを１μｔのＴＴ （１９単位）とインキュベ
ートした。２分及び５分後液を取り出し各々５μｔのサ
ンプルをＴＣＡ沈澱により取り込みを分析した。
その結果、２分後のものはホモポリマー属部の平均の長
さが７０ヌクレオチドであり、５分後のものは１６０ヌ
クレオチドであることを示した。この二つの液を合せフ
ェノールで１度沈澱させ、エーテルで４回抽出し、エタ
ノールで沈澱シ、５０μｌのＨ，Ｏに浴解し、−１０℃
に貯蔵した。
さが７０ヌクレオチドであり、５分後のものは１６０ヌ
クレオチドであることを示した。この二つの液を合せフ
ェノールで１度沈澱させ、エーテルで４回抽出し、エタ
ノールで沈澱シ、５０μｌのＨ，Ｏに浴解し、−１０℃
に貯蔵した。
アニーリングしたシラスミドとｄ ｅ ｃ ＤＮＡ の
形質転！ 約０．１２μＩのｄＧをつけたシラスミド１）ＡＴ１５
３（０，０５ｐ ｍｏｌｅｓ）及び０．１μｇのｄＣを
つけたａｓｃＤｊｊＡ（０，２−０，４ｍｏｌｅｓ）を
１００ μｍのＴＮＲｉ ｍ 本（１０１のトリス−Ｈ
ｃｔ ｐＨ８−０，２００ｍＭのＮａｃＬ 、 １ ｍ
Ｍ ｆ） ＥＤＴＡ ）中で６５℃で０．５ 時間イン
キュベートした。インキユベーシヨンのｍＷを４時間か
五って着実に２０℃迄下げ、真性急速に０℃迄下げた。
形質転！ 約０．１２μＩのｄＧをつけたシラスミド１）ＡＴ１５
３（０，０５ｐ ｍｏｌｅｓ）及び０．１μｇのｄＣを
つけたａｓｃＤｊｊＡ（０，２−０，４ｍｏｌｅｓ）を
１００ μｍのＴＮＲｉ ｍ 本（１０１のトリス−Ｈ
ｃｔ ｐＨ８−０，２００ｍＭのＮａｃＬ 、 １ ｍ
Ｍ ｆ） ＥＤＴＡ ）中で６５℃で０．５ 時間イン
キュベートした。インキユベーシヨンのｍＷを４時間か
五って着実に２０℃迄下げ、真性急速に０℃迄下げた。
この溶液を最終的に１５ ｍＭ、のトリス−ＨｃｔｐＨ
７，５，１００ｍＭのＮａｃｊ 、 １，０ 、、ｍＭ
のＭｇ、ＣＬＢ、１０ ｍＭのＣａｃｔｌ 、 ０．５
ｍＭのＥＤＴＡを含む様に２００μｍに稀釈し、０℃
で約３時間貯蔵した。
７，５，１００ｍＭのＮａｃｊ 、 １，０ 、、ｍＭ
のＭｇ、ＣＬＢ、１０ ｍＭのＣａｃｔｌ 、 ０．５
ｍＭのＥＤＴＡを含む様に２００μｍに稀釈し、０℃
で約３時間貯蔵した。
ＩＣ，Ｃ０１ｉ ＨＢ １０１の形質転換能のある培
養物を、１−の定常期培養物を６５１のＬ−プロで（Ｄ
ｉｆｃ。
養物を、１−の定常期培養物を６５１のＬ−プロで（Ｄ
ｉｆｃ。
Ｂａｔｏ ）リゾトン１チ、Ｄｉｆｃｏ Ｂａｔ イ
ーストエケｘ ０．５ ％、ＮａｃｔＯ−５１６ｐｌ″
ｌ７−２ ） に接種し６７°Ｃで約６時間振盪する
ことにより調整した、この振盪時間後人６５０は０．４
であった。菌体は６．００． Ｏｘｇ で５分間、４
℃で遠心してペレットとした。菌体は２５１１の０．１
Ｍ Ｍｇｃｔ２ （０℃）に再懸濁し又再びペレット
化した。此のペレットを２１１１ｔのＯＭ ＣａＣ４（
０°Ｃ）中に再懸濁し０°Ｃで６０分間放置した。この
様な形質転換能のある菌体約０．２１１ｊを肌１ｄの７
ニーリングした１）ＡＴ １５３ ／ ｄｓｃＤＮＡ
と静かに混合し更に０℃で３０分間、引き続き４２℃で
２分間、最後に０°Ｃで３０分間放置した。これに１１
ＬｌのＬ−プロス及び形質転換混合物を加え６７℃で２
５分インキュ１５μｍ１７Ｍ１のテトラサイクリン（シ
グマ社より入手））上に拡げ一夜３７℃でインキュベー
トした。此等１．０箇のプレートより１５０箇のテトラ
サイクリン耐性コロニーが得られその巾約８９６はアン
ビンリン（１０，０μｇ／ｌ、 シグマ）轡受性であっ
た。これはＩ）ＡＴ １５３のＰｓｔ １部位に於ける
ｃＤＮＡ の挿入を示唆している。
ーストエケｘ ０．５ ％、ＮａｃｔＯ−５１６ｐｌ″
ｌ７−２ ） に接種し６７°Ｃで約６時間振盪する
ことにより調整した、この振盪時間後人６５０は０．４
であった。菌体は６．００． Ｏｘｇ で５分間、４
℃で遠心してペレットとした。菌体は２５１１の０．１
Ｍ Ｍｇｃｔ２ （０℃）に再懸濁し又再びペレット
化した。此のペレットを２１１１ｔのＯＭ ＣａＣ４（
０°Ｃ）中に再懸濁し０°Ｃで６０分間放置した。この
様な形質転換能のある菌体約０．２１１ｊを肌１ｄの７
ニーリングした１）ＡＴ １５３ ／ ｄｓｃＤＮＡ
と静かに混合し更に０℃で３０分間、引き続き４２℃で
２分間、最後に０°Ｃで３０分間放置した。これに１１
ＬｌのＬ−プロス及び形質転換混合物を加え６７℃で２
５分インキュ１５μｍ１７Ｍ１のテトラサイクリン（シ
グマ社より入手））上に拡げ一夜３７℃でインキュベー
トした。此等１．０箇のプレートより１５０箇のテトラ
サイクリン耐性コロニーが得られその巾約８９６はアン
ビンリン（１０，０μｇ／ｌ、 シグマ）轡受性であっ
た。これはＩ）ＡＴ １５３のＰｓｔ １部位に於ける
ｃＤＮＡ の挿入を示唆している。
−組換えシラス建ドの大量調製
′シラスミドを含む被形質転換体を。１０ｄの定常期培
養物を５０ローのＬ−□プロスに接種し、３７℃で約４
時間Ａ３９０が約１．０に達するまで振盪することによ
り大量に生育させた。次にクロツムフェニコール（シグ
マ社より入手）を０．１〜／ｄ加え培養物を６７℃で一
夜振盪した。
養物を５０ローのＬ−□プロスに接種し、３７℃で約４
時間Ａ３９０が約１．０に達するまで振盪することによ
り大量に生育させた。次にクロツムフェニコール（シグ
マ社より入手）を０．１〜／ｄ加え培養物を６７℃で一
夜振盪した。
この増幅段階の後、菌体な５．０００ ｘｇ で５分間
４℃で遠心し【ペレットにした。上澄みを消毒して捨て
、菌体ペレットを１２ｄのＲ緩衝液（５０ｍＭのトリス
−ＨＣＡ ｐ）１８．０．４０ ｍＭのＥＤ’ｌ’Ａ、
２５ ＊庶糖）中に再懸濁した。次にリゾチームとＥ
ＤＴＡを夫々１．４ｑ／ｓｕ及び６０ｍＭ加え、懸濁液
を５分間氷の上に放置した。この液１６−に３Ｑｄのト
リトン混合液（０，１−）リドンｘ−１００、ＢＤＴＡ
６２．５ ｍＭ 、 ）すｘ−ＨＣｚ ｐ）（８
，０５０ｍＭ ）を加え、氷の上に１０分間又は粘度が
出る迄放置した。この混合物を次に４８．０００ ｘｇ
で１５分間、４℃で遠心して清澄化した。得られた
上澄な慎重にデカントし１１当り０．９５ ｇのＣｓＣ
１及び１ＱＩＩ９／ｄの臭化エチジウム溶液０．１１を
加えた。
４℃で遠心し【ペレットにした。上澄みを消毒して捨て
、菌体ペレットを１２ｄのＲ緩衝液（５０ｍＭのトリス
−ＨＣＡ ｐ）１８．０．４０ ｍＭのＥＤ’ｌ’Ａ、
２５ ＊庶糖）中に再懸濁した。次にリゾチームとＥ
ＤＴＡを夫々１．４ｑ／ｓｕ及び６０ｍＭ加え、懸濁液
を５分間氷の上に放置した。この液１６−に３Ｑｄのト
リトン混合液（０，１−）リドンｘ−１００、ＢＤＴＡ
６２．５ ｍＭ 、 ）すｘ−ＨＣｚ ｐ）（８
，０５０ｍＭ ）を加え、氷の上に１０分間又は粘度が
出る迄放置した。この混合物を次に４８．０００ ｘｇ
で１５分間、４℃で遠心して清澄化した。得られた
上澄な慎重にデカントし１１当り０．９５ ｇのＣｓＣ
１及び１ＱＩＩ９／ｄの臭化エチジウム溶液０．１１を
加えた。
これをＢｅｃｋｍａｎ ５０ Ｔｉ のローター中で
１２．０００ ｘｇ で２０℃で４０時間遠心した。ゾ
ラスンド帯（バンド）は長波長紫外螢光により検知し、
注射器で管側を突き刺し除去した。シラスミドＤＮ又は
第２のＣａＣＬｌ＾化エチジウム勾配中で平衡に達する
迄遠心した。生じたノ（ンＦをＮａＣｔ飽和のプロパン
−２−Ｏｔ及び水で４回抽出し次にエタノールで沈澱し
、ＴＥ緩衝液に再溶解し、４℃に貯蔵した。
１２．０００ ｘｇ で２０℃で４０時間遠心した。ゾ
ラスンド帯（バンド）は長波長紫外螢光により検知し、
注射器で管側を突き刺し除去した。シラスミドＤＮ又は
第２のＣａＣＬｌ＾化エチジウム勾配中で平衡に達する
迄遠心した。生じたノ（ンＦをＮａＣｔ飽和のプロパン
−２−Ｏｔ及び水で４回抽出し次にエタノールで沈澱し
、ＴＥ緩衝液に再溶解し、４℃に貯蔵した。
制限エンドヌクレアーゼ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ。
８ａｌ Ｉ 、 Ｂｇｌｌｌ及び８ｍａＩ はベーリン
ガー社より購入し、ＢａｍＨＩ、Ｈｌｎｄｌ［、Ｈｉｎ
ｆＩ 、 Ａｖａｉ 、 ＸｂａＩ 。
ガー社より購入し、ＢａｍＨＩ、Ｈｌｎｄｌ［、Ｈｉｎ
ｆＩ 、 Ａｖａｉ 、 ＸｂａＩ 。
及びＨｌｎｃ［はペセスダ研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ ） より購
入し、又Ｋｐｎ Ｉは二ｚ−イングランドパイオラデ（
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ）より購入
した。精製した組換えプラスミドＤＮＡな此等の酵素を
使い供給者の指定する条件で分解した。分解生成物を１
−アガローズ又は７％アクリルアミドｒルを通して電気
泳動により分析し臭化エチジウム染色又は紫外線螢光に
より検知した。
Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ ） より購
入し、又Ｋｐｎ Ｉは二ｚ−イングランドパイオラデ（
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ）より購入
した。精製した組換えプラスミドＤＮＡな此等の酵素を
使い供給者の指定する条件で分解した。分解生成物を１
−アガローズ又は７％アクリルアミドｒルを通して電気
泳動により分析し臭化エチジウム染色又は紫外線螢光に
より検知した。
Ｈｌｎｄｌｌｌ （ペーリンガー）で分解したバクテリ
オファージのラムダＤＮＡ及びＨｉｎｆＩで分解したプ
ラスずド１）ＡＴ １５３ ’Ｉｋ長さの標準（サイズ
マーカー）として用いた。
オファージのラムダＤＮＡ及びＨｉｎｆＩで分解したプ
ラスずド１）ＡＴ １５３ ’Ｉｋ長さの標準（サイズ
マーカー）として用いた。
５′末端を３２ｐで２ベルした探査子として用いるＲＮ
ａｓｅ Ｔ Ｉオリがヌクレオチドを二次限ゲル電気泳
動により調製した。オリイヌクレオチドは電気泳動の前
にハリスの方法’ （ＴＪＲＨａ’ｒｒｉｓ ： Ｎｕ
ｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ 、 ’ ７巻
１７６５−１７８５頁、１９７９）により１−５μｇ
のＲＮＡ及びＲＮａｓｅ Ｔｌ１単位を用いて２ペルす
るか又は二次限ゲルより分゛離して末端ラベルした。後
者の方法に於ては３２ｐで生体内ラベル（ＤＪ Ｒｏｗ
ｌａｎｄｓ、ＴＪＲＨａｒｒｉｓ 及びＦ Ｂｒｏｗ
ｎ 、 １９７８上記）した１００μＩのＲＮＡのＲＮ
ａｓｅ Ｔｌ による分解物を二次限ｒル電気泳動に
より分離しｒルのオートラジオグ２７をオリｔサツカラ
イドの位置づけに使用した。夫々の方法に於てオリイヌ
クレオチドは破砕及び浸漬法（クラツシｚマントソーク
法） （Ａ Ｍａｘａｍ ｃ ｗ Ｇ１１ｂｅｒｔ：Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃ
ａｄｅｍｙ ｏｆ ８ｃｉｅｎｃｅ 。
ａｓｅ Ｔ Ｉオリがヌクレオチドを二次限ゲル電気泳
動により調製した。オリイヌクレオチドは電気泳動の前
にハリスの方法’ （ＴＪＲＨａ’ｒｒｉｓ ： Ｎｕ
ｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ 、 ’ ７巻
１７６５−１７８５頁、１９７９）により１−５μｇ
のＲＮＡ及びＲＮａｓｅ Ｔｌ１単位を用いて２ペルす
るか又は二次限ゲルより分゛離して末端ラベルした。後
者の方法に於ては３２ｐで生体内ラベル（ＤＪ Ｒｏｗ
ｌａｎｄｓ、ＴＪＲＨａｒｒｉｓ 及びＦ Ｂｒｏｗ
ｎ 、 １９７８上記）した１００μＩのＲＮＡのＲＮ
ａｓｅ Ｔｌ による分解物を二次限ｒル電気泳動に
より分離しｒルのオートラジオグ２７をオリｔサツカラ
イドの位置づけに使用した。夫々の方法に於てオリイヌ
クレオチドは破砕及び浸漬法（クラツシｚマントソーク
法） （Ａ Ｍａｘａｍ ｃ ｗ Ｇ１１ｂｅｒｔ：Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃ
ａｄｅｍｙ ｏｆ ８ｃｉｅｎｃｅ 。
ＵＳＡ第７４巻、第’５’６０−５６４頁１９７７）に
よりｒルにより溶出した。ｒツム上のオリイヌクレオチ
ドの順序はＴＪＲＨａｒｒｉｓ、ＫＪＨＲｏｂａｏｎ及
びＦ Ｂｒｏｖｎｎ （Ｊ、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ １９８０印刷中）に報告されている。
よりｒルにより溶出した。ｒツム上のオリイヌクレオチ
ドの順序はＴＪＲＨａｒｒｉｓ、ＫＪＨＲｏｂａｏｎ及
びＦ Ｂｒｏｖｎｎ （Ｊ、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ １９８０印刷中）に報告されている。
精製した組換えＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで分解
し、１饅アガローズデル上で生成物を分離しこれをサデ
ーン（Ｈ，Ｍ ８ｏｕｔｈｅｒｎ： Ｊ、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ 、 ９８巻５０３−５１３頁１
９７５）の方法によりニトロセルローズフィルター上に
移した。このフィルターをハイデリデイゼーンヨン緩衝
液（４０％フォルムアミド、０．４ Ｍ ＮａＣＡ。
し、１饅アガローズデル上で生成物を分離しこれをサデ
ーン（Ｈ，Ｍ ８ｏｕｔｈｅｒｎ： Ｊ、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ 、 ９８巻５０３−５１３頁１
９７５）の方法によりニトロセルローズフィルター上に
移した。このフィルターをハイデリデイゼーンヨン緩衝
液（４０％フォルムアミド、０．４ Ｍ ＮａＣＡ。
１０ ｍＭ ＰＩＰＥ８−ＮａＯＨｐ）（６，４，１０
０μ９／−のＲ，ｃｏｌｉ ｔＭＡ 、 ０．５ ％
ＢＤＢ 、 ０．０４ ％ Ｆｉｃｏｌｌ〔蔗糖と
エビ・クロロヒドリンの合成高分子〕、口・０４％ポリ
ビニールピロリドン４００，０．０４チウンアルデミン
）中で５０℃で２時間密閉したフッスナックバッグ中で
、ラベルしたＲＮａａｅ ’ｒｌオリがヌクレオチ’ｆ
（７５−１５０，０００ｃｐｍ ）を加える前に予備
インキユベートした。１６時間後、２ｘｓｓｃ（８ｘ２
５Ｃ１＋ｊ！６時間以上）中でこのフィルターを洗条し
、空気乾燥し、富士ＸＲフィルム及び増感スクリーンを
用いて一７０℃でオートラジオグラフで検出した。
０μ９／−のＲ，ｃｏｌｉ ｔＭＡ 、 ０．５ ％
ＢＤＢ 、 ０．０４ ％ Ｆｉｃｏｌｌ〔蔗糖と
エビ・クロロヒドリンの合成高分子〕、口・０４％ポリ
ビニールピロリドン４００，０．０４チウンアルデミン
）中で５０℃で２時間密閉したフッスナックバッグ中で
、ラベルしたＲＮａａｅ ’ｒｌオリがヌクレオチ’ｆ
（７５−１５０，０００ｃｐｍ ）を加える前に予備
インキユベートした。１６時間後、２ｘｓｓｃ（８ｘ２
５Ｃ１＋ｊ！６時間以上）中でこのフィルターを洗条し
、空気乾燥し、富士ＸＲフィルム及び増感スクリーンを
用いて一７０℃でオートラジオグラフで検出した。
結果
３つの組換えシラスミド即ちｐＦＡ ６１ ／ ｔ ２
０６、ｐＦＡ ６１ ／ ｔ ２４３及びｐＦＡ６１／
７６、夫等の配列及びＦＭＤＶ 遺伝子との対応（上記
方法の応用により推定されたもの）は第２図に示した。
０６、ｐＦＡ ６１ ／ ｔ ２４３及びｐＦＡ６１／
７６、夫等の配列及びＦＭＤＶ 遺伝子との対応（上記
方法の応用により推定されたもの）は第２図に示した。
最大の組換えｐＦＡ ６１ ／ ｔ ２０６のオリエン
テーシ冒ン（これは約７３１のＦＭＤＶ ＲＮＡ配列に
相幽する約５．８００のヌクレオチド対ｉ含んでいるが
）、はビールＪ ＲＮＡ （Ｈａｒｒｉａ 等１９８
０上記引用）から誘導される前にその上にマッシされた
りポヌクレアーゼＴ１ オリジヌクレオチドを用いて
最初に決定された。Ｔ０オリイヌクレオチドの６゜４．
２０及び２７番はＦＭＤＶ ＲＮＡ 中ノ夫等の位置が
知られていて、正確であるため（第２図に示す）この目
的のためには特に有用であった。組換え１）ＦＡ ６１
／ ｔ ２０６及びＦＭＤＶ ＲＮＡ ４ｃ ＷＡ
スル他（１）組換え体（例えばＴ）ＦＡ ６１ ／ ７
６ ）の配列は組換え体の制限エンドヌクレアーゼ断片
のマツピング及びビールスＭＡより誘導されたＴ１オリ
イヌクレオチドとのハイデリチゼーショにより決定され
た。
テーシ冒ン（これは約７３１のＦＭＤＶ ＲＮＡ配列に
相幽する約５．８００のヌクレオチド対ｉ含んでいるが
）、はビールＪ ＲＮＡ （Ｈａｒｒｉａ 等１９８
０上記引用）から誘導される前にその上にマッシされた
りポヌクレアーゼＴ１ オリジヌクレオチドを用いて
最初に決定された。Ｔ０オリイヌクレオチドの６゜４．
２０及び２７番はＦＭＤＶ ＲＮＡ 中ノ夫等の位置が
知られていて、正確であるため（第２図に示す）この目
的のためには特に有用であった。組換え１）ＦＡ ６１
／ ｔ ２０６及びＦＭＤＶ ＲＮＡ ４ｃ ＷＡ
スル他（１）組換え体（例えばＴ）ＦＡ ６１ ／ ７
６ ）の配列は組換え体の制限エンドヌクレアーゼ断片
のマツピング及びビールスＭＡより誘導されたＴ１オリ
イヌクレオチドとのハイデリチゼーショにより決定され
た。
第２図に示した組換え体の２つは明らかに、ｖＰｌを含
む数種のＦＭＤＶ蛋白質の遺伝情報を含んでいる。
む数種のＦＭＤＶ蛋白質の遺伝情報を含んでいる。
組み変えｐＦＡ ６１ ／ ｔ２０６は、プラスミドの
暗号を持つペーターラクタ脅−ゼと−Ｗ により決定さ
れたがりペフチドとの融合生成物より成るポリペプチド
の表現のためのオリエンテーシ冒ン中ＫｖＰ１を含んで
いる。
暗号を持つペーターラクタ脅−ゼと−Ｗ により決定さ
れたがりペフチドとの融合生成物より成るポリペプチド
の表現のためのオリエンテーシ冒ン中ＫｖＰ１を含んで
いる。
ａ）表現
表現ベクターＰｘＹ工の構造
上記した技術を用い、組換えシラスミドｐＯＰ ２０３
−１３ （米、バーバード大学ｐ’ｏｒｔｅａｔｐ’ｕ
ｉｌｅｒ より入手可能）の大規模な調製を行った。
−１３ （米、バーバード大学ｐ’ｏｒｔｅａｔｐ’ｕ
ｉｌｅｒ より入手可能）の大規模な調製を行った。
１μ９の′ｔＩＩ製したシラスミドＤＮＡを夫々５単位
ずつのＥＣｏＲｌ及び阻ｎｄ［［で６７℃で１時間分解
した。
ずつのＥＣｏＲｌ及び阻ｎｄ［［で６７℃で１時間分解
した。
１μｇのシラスミドｐＡＴ １５３も夫々５単位すっの
上記ＥＣｏＲＩ及びＨｌｎｄｕで分解した。両ＤＮＡサ
イゾルを次に７ガロースｒル上に流、した。０．５ Ｋ
ｂ（キロ塩基対）のｐＯＰ ２０３−１３のＤＮＡ断片
及び５．６ Ｋｂ Ｉ） ｐＡＴ １５３ ノＤＮＡ断
片を７ガロースｒルより切り出しＶｏｇｅｌａｔｅｉｎ
及びＧ１１ｌｅｓｐ１ｅ の方法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ７６巻６１５−６１９頁
、１９７９）で抽出した。この精製したＤＮＡの断片を
０．１単位のＴ、ＤＮＡリガーゼ（Ｍｉｌｅｓ ）と混
合し１５℃で１６時間リガーゼ処理した。このリガーゼ
処理したＤＮＡを可能なＥ・、Ｃｏ１１ ＨＢ １０１
（前記の通り調製した）を形質転換するのに使用し、菌
体をＬ−Ａｐ プレート（Ｌ−プロス＋１．５寒天１
，８１ｇｍａより入手した１００／ｊＩＩ／１１７のア
ンピンリン）上にプレートし３７℃で一夜インキエペー
トした。多くの組換え体が得られたが、その１つは更に
制限マツピングにより特長づけｐＸＹ １（第、５図）
と指定した。ｐＸＹ １のＥｃｏＲＩ独特の部位にクロ
ーンされたＦＭＤＶ ｄａ ＣＤＮＡ断片はβガラクト
シダーゼの最初の８箇のアミノ酸、ＥｃｏＲＩ部位より
２箇のアミノ酸、及び挿入されたＦＭＤＶ ｄｓＣＤＮ
Ａ断片により暗号づけられた多くのアミノ酸よりなるハ
イブリッド蛋白質の表現を生ずる。このように作られた
ハイブリッド蛋白質はラクトーズオペロンのコントロー
ルを受ける。組換えシラスミドが充分量の特異的抑制蛋
白質を含む宿主（ホスト）細菌中にある時は、転写は６
０μｍ１／１１１のＩ Ｐ’Ｉ’Ｇ （イソゾロビル１
−チオーβ−Ｄ−ガラクトピラノシド）の添加により誘
導（増加）させ得る。このことはＬａｃＩｑ 変異を含
むｙファクターを宿主細菌に導入することにより成し逐
げ得る（ Ｈｅｎｎ１ｇ等Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃ
ａｄ、 ８ｃｉ、第７６巻、第４３６０−４３６４頁１
９７９参照）。
上記ＥＣｏＲＩ及びＨｌｎｄｕで分解した。両ＤＮＡサ
イゾルを次に７ガロースｒル上に流、した。０．５ Ｋ
ｂ（キロ塩基対）のｐＯＰ ２０３−１３のＤＮＡ断片
及び５．６ Ｋｂ Ｉ） ｐＡＴ １５３ ノＤＮＡ断
片を７ガロースｒルより切り出しＶｏｇｅｌａｔｅｉｎ
及びＧ１１ｌｅｓｐ１ｅ の方法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ７６巻６１５−６１９頁
、１９７９）で抽出した。この精製したＤＮＡの断片を
０．１単位のＴ、ＤＮＡリガーゼ（Ｍｉｌｅｓ ）と混
合し１５℃で１６時間リガーゼ処理した。このリガーゼ
処理したＤＮＡを可能なＥ・、Ｃｏ１１ ＨＢ １０１
（前記の通り調製した）を形質転換するのに使用し、菌
体をＬ−Ａｐ プレート（Ｌ−プロス＋１．５寒天１
，８１ｇｍａより入手した１００／ｊＩＩ／１１７のア
ンピンリン）上にプレートし３７℃で一夜インキエペー
トした。多くの組換え体が得られたが、その１つは更に
制限マツピングにより特長づけｐＸＹ １（第、５図）
と指定した。ｐＸＹ １のＥｃｏＲＩ独特の部位にクロ
ーンされたＦＭＤＶ ｄａ ＣＤＮＡ断片はβガラクト
シダーゼの最初の８箇のアミノ酸、ＥｃｏＲＩ部位より
２箇のアミノ酸、及び挿入されたＦＭＤＶ ｄｓＣＤＮ
Ａ断片により暗号づけられた多くのアミノ酸よりなるハ
イブリッド蛋白質の表現を生ずる。このように作られた
ハイブリッド蛋白質はラクトーズオペロンのコントロー
ルを受ける。組換えシラスミドが充分量の特異的抑制蛋
白質を含む宿主（ホスト）細菌中にある時は、転写は６
０μｍ１／１１１のＩ Ｐ’Ｉ’Ｇ （イソゾロビル１
−チオーβ−Ｄ−ガラクトピラノシド）の添加により誘
導（増加）させ得る。このことはＬａｃＩｑ 変異を含
むｙファクターを宿主細菌に導入することにより成し逐
げ得る（ Ｈｅｎｎ１ｇ等Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃ
ａｄ、 ８ｃｉ、第７６巻、第４３６０−４３６４頁１
９７９参照）。
ｂ） ＦＭＤＶ ｄａ ｃＤＮＡのｐＸＹ １への導入
前記の通り調整したｐＦＡ ６１ ／ ＋７６ ２μｇ
を６単位のＥｃｏＲＩ及び１単位のＰａｔ Ｉにより６
７°Ｃで１時間分解した。その結果はＥｃｏＨにより完
全分解をもたらしたがＰｓｔＩによっては部分分解しか
示さなかった。完全なｃＤＮＡ 挿入を含む部分分解物
４．０ｘｂを上記のアガロースデル上で分°離した。
前記の通り調整したｐＦＡ ６１ ／ ＋７６ ２μｇ
を６単位のＥｃｏＲＩ及び１単位のＰａｔ Ｉにより６
７°Ｃで１時間分解した。その結果はＥｃｏＨにより完
全分解をもたらしたがＰｓｔＩによっては部分分解しか
示さなかった。完全なｃＤＮＡ 挿入を含む部分分解物
４．０ｘｂを上記のアガロースデル上で分°離した。
これを２．０μ９のｐｘｙｌ（２単位ずつのＥｃｏＲＩ
とＰａｔＩで切断した）に加え、ＤＮＡ断片を、Ｔ、Ｄ
ＮＡリガー−ｔ’ （０，０５単位）と共に１５℃で１
６時間インキエベートすることにより接続した。ＤＮＡ
を形質転換能のあるＥ、Ｃｏ１１ ＨＢ １０１ の
形質転換に使用し、この菌は引き続きＬ −Ｔｃプレー
）（Ｌ−プロス＋１δ−寒天、１０μｉ／Ｍｌのテトラ
サイクリン）上で成育させた。多くの組換え体が得られ
、これ等はアンピシリン感受性であった。このことはＤ
ＮＡ断片のｐＸＹ １のＰｓｔ部位えの挿入を示してい
る。その様な組換えシラスミドの１つは制限マツピング
及び指定ｐＷＲＩ、により更に特徴づけられる。此のプ
ラスミドはラクトーズプロモーター及びｐ８８の暗号を
与えるＦＭＤＶ ｃＤＮＡ配列を正しい方向に含んでい
た。
とＰａｔＩで切断した）に加え、ＤＮＡ断片を、Ｔ、Ｄ
ＮＡリガー−ｔ’ （０，０５単位）と共に１５℃で１
６時間インキエベートすることにより接続した。ＤＮＡ
を形質転換能のあるＥ、Ｃｏ１１ ＨＢ １０１ の
形質転換に使用し、この菌は引き続きＬ −Ｔｃプレー
）（Ｌ−プロス＋１δ−寒天、１０μｉ／Ｍｌのテトラ
サイクリン）上で成育させた。多くの組換え体が得られ
、これ等はアンピシリン感受性であった。このことはＤ
ＮＡ断片のｐＸＹ １のＰｓｔ部位えの挿入を示してい
る。その様な組換えシラスミドの１つは制限マツピング
及び指定ｐＷＲＩ、により更に特徴づけられる。此のプ
ラスミドはラクトーズプロモーター及びｐ８８の暗号を
与えるＦＭＤＶ ｃＤＮＡ配列を正しい方向に含んでい
た。
Ｃ）表現シラスミドｐＷＲＬ １００４の構造ＦＭＤＶ
配列の表現を達成するには、ＦＭＤＶ ｃＤＮＡをラ
クトーズプロモーターより分離するＤＮＡ部分を除去す
る必要がある。１μ９ の精製したｐＷＲＬｌｏｏｏを
１０単位のＳａｃ［で分、解し、エタノールで沈、澱し
た。乾燥ＤＮＡを０．１−の緩衝液（０，１ＭのＮａＣ
Ｌ 、 ０．００５ ＭのＭｇＣｔｓ 、 ０．００５
ＭのＣａＣｔｇ、０．０２ Ｍのトリス−ＨＣＡ 、
、ｐ）Ｉ ８．１．０．００１ ＭのＥＤＴＡ−）
に再溶解し、０．２単位のヌクレアーゼ、Ｂａｔ３１
（ＢＲＬ ）と１８℃で１５分間反応させた。この反
応を５μの０．５Ｍ・ＥＤＴＡ を加え【停止した。此
の様な条件下で、Ｂａｔ３１は約５００ ｂｐのＤＮＡ
を直線の二本鎖のＤＮＡより除く。エタノール沈澱後、
ＤＮＡを５単位のＥｃｏＲＩにより分解し、再びエタノ
ールで沈澱させた。ＤＮＡを４０μｍ のポリメツーゼ
エ緩衝液（０，０６Ｍのトリス−ＨＣｊ、ｐＨ７，５，
０，００８ＭのＭｇＣｔｓ。
配列の表現を達成するには、ＦＭＤＶ ｃＤＮＡをラ
クトーズプロモーターより分離するＤＮＡ部分を除去す
る必要がある。１μ９ の精製したｐＷＲＬｌｏｏｏを
１０単位のＳａｃ［で分、解し、エタノールで沈、澱し
た。乾燥ＤＮＡを０．１−の緩衝液（０，１ＭのＮａＣ
Ｌ 、 ０．００５ ＭのＭｇＣｔｓ 、 ０．００５
ＭのＣａＣｔｇ、０．０２ Ｍのトリス−ＨＣＡ 、
、ｐ）Ｉ ８．１．０．００１ ＭのＥＤＴＡ−）
に再溶解し、０．２単位のヌクレアーゼ、Ｂａｔ３１
（ＢＲＬ ）と１８℃で１５分間反応させた。この反
応を５μの０．５Ｍ・ＥＤＴＡ を加え【停止した。此
の様な条件下で、Ｂａｔ３１は約５００ ｂｐのＤＮＡ
を直線の二本鎖のＤＮＡより除く。エタノール沈澱後、
ＤＮＡを５単位のＥｃｏＲＩにより分解し、再びエタノ
ールで沈澱させた。ＤＮＡを４０μｍ のポリメツーゼ
エ緩衝液（０，０６Ｍのトリス−ＨＣｊ、ｐＨ７，５，
０，００８ＭのＭｇＣｔｓ。
０．２ ｍＭずつのｄＡＴＰ 、 ｄ’Ｉ’ＴＰ 、
ｄｃ’ｌ’Ｐ、 ｄ（）ＴＰ。
ｄｃ’ｌ’Ｐ、 ｄ（）ＴＰ。
０．０１ ＭのＢ−メルカプトエタノール、１ｍＭ の
ＡＴＰ及び１．４単位のに、Ｃｏ１１ ＤＮＡ ポリメ
ラーゼ（大きい断片））中に入れ１０℃で１０分間イン
キｚ ／（−） １．た。直線状プラスミドの平清末端
を次に０．４単位のＴ、ＤＮＡ ＋７が一ゼと共に１５
“℃で１６時間すｒ−トし、Ｆ’ＬａｃＩｑ を含む
Ｅ、Ｃｏ１１ＡＢ２４８０（英国、ニューカッスル大学
のＰ、Ｅｍｍｅｒｓｏｎ より入手）を形質転換に使
用した。
ＡＴＰ及び１．４単位のに、Ｃｏ１１ ＤＮＡ ポリメ
ラーゼ（大きい断片））中に入れ１０℃で１０分間イン
キｚ ／（−） １．た。直線状プラスミドの平清末端
を次に０．４単位のＴ、ＤＮＡ ＋７が一ゼと共に１５
“℃で１６時間すｒ−トし、Ｆ’ＬａｃＩｑ を含む
Ｅ、Ｃｏ１１ＡＢ２４８０（英国、ニューカッスル大学
のＰ、Ｅｍｍｅｒｓｏｎ より入手）を形質転換に使
用した。
Ｌ −Ｔｃプレート上に多くの組換え体が得られた。
組換え体の１つは制限マツピング及び指定ｐＷＲＬ１０
０４により特徴づけた。制限マツピングの結果、ｐＷＲ
Ｌ １００４はラクトーズプロモーターとＦＭＤＶ
ｃＤＮＡ配列の接点に於てＥＣＯＲＩ４ｔ ８生したこ
とが分った。シラスミドの暗号を持つ蛋白質を「マキシ
セル技法Ｊ （８ａｎｃｓｒｒ等、Ｊ、Ｂａｔ。
０４により特徴づけた。制限マツピングの結果、ｐＷＲ
Ｌ １００４はラクトーズプロモーターとＦＭＤＶ
ｃＤＮＡ配列の接点に於てＥＣＯＲＩ４ｔ ８生したこ
とが分った。シラスミドの暗号を持つ蛋白質を「マキシ
セル技法Ｊ （８ａｎｃｓｒｒ等、Ｊ、Ｂａｔ。
第１３７巻、第６９２−６９３頁、１９７９）により紫
外趣感受性株ＡＢ２４８０で調べた。ｐＷＲＬはＦＭＤ
Ｖ ｃＤＮＡにより暗号づけられた大きな蛋白質（５０
，０００ダルトン）を合成することが分つ九ｄ）其の他
の表現シラスミドの構造 １μｇのｐ″ｆｆ１Ｌ １００４を６単位のＰｖｕ［で
分解し、’ ０．２μＩ の合成りＮＡ断片（ＥＣｏＲ
ｉにより線繊され“る配列を含む）の存在下でＴ、 Ｄ
ＮＡ ＋７ガーゼによりりｒ−トした。ＥＣ０ＲＩ ｒ
リンカ−」（コラポレイテイプリサーチより入手）の導
入はＶＰｌのＣ−末端から離れて「停止」コードンの４
つのアミノ酸の導入をもたらした。此のシラスミドは指
定ｐＷＲＬ １１２０でありマクシセル法で調べた場合
ｖＰ１を含む２９，０００ダルトンの蛋白質を生産した
。
外趣感受性株ＡＢ２４８０で調べた。ｐＷＲＬはＦＭＤ
Ｖ ｃＤＮＡにより暗号づけられた大きな蛋白質（５０
，０００ダルトン）を合成することが分つ九ｄ）其の他
の表現シラスミドの構造 １μｇのｐ″ｆｆ１Ｌ １００４を６単位のＰｖｕ［で
分解し、’ ０．２μＩ の合成りＮＡ断片（ＥＣｏＲ
ｉにより線繊され“る配列を含む）の存在下でＴ、 Ｄ
ＮＡ ＋７ガーゼによりりｒ−トした。ＥＣ０ＲＩ ｒ
リンカ−」（コラポレイテイプリサーチより入手）の導
入はＶＰｌのＣ−末端から離れて「停止」コードンの４
つのアミノ酸の導入をもたらした。此のシラスミドは指
定ｐＷＲＬ １１２０でありマクシセル法で調べた場合
ｖＰ１を含む２９，０００ダルトンの蛋白質を生産した
。
２ μｌｌの１）ＷＲＬ １００４を６単位ずつのＰｖ
ｕＩＩ １ｊＬびＰａｔＩ で分解し、４．０ Ｋ１
：＋ の断片を前記の通リアがローズゲルより分離した
。−此のＤＮＡ能のあるＥ’、Ｃｏ１１ の菌体（）
曳スミドｐＷＲＬ １１４０をもたらす）の半分、一方
残りの半分はＬＣｏｌｉ を形質転換するために使用
する前にＥｃｏＲ（１７ンカーの存在下でリテートした
。此の後者の型のプラスミドは導入された余分のＥｃｏ
Ｒ１部位を持つことが見出され、そして指定ｐＷＲＩ、
１１３０（第７図）である。
ｕＩＩ １ｊＬびＰａｔＩ で分解し、４．０ Ｋ１
：＋ の断片を前記の通リアがローズゲルより分離した
。−此のＤＮＡ能のあるＥ’、Ｃｏ１１ の菌体（）
曳スミドｐＷＲＬ １１４０をもたらす）の半分、一方
残りの半分はＬＣｏｌｉ を形質転換するために使用
する前にＥｃｏＲ（１７ンカーの存在下でリテートした
。此の後者の型のプラスミドは導入された余分のＥｃｏ
Ｒ１部位を持つことが見出され、そして指定ｐＷＲＩ、
１１３０（第７図）である。
菫！
ｐＷＲＬ１００４ 、１１２０ 、１１３０友び１１４
０により合成された顕著なプラスミドの暗号°づけをし
たポリペプチドの分子量及びＣ末端の配列な鮪８図及び
下記表図１に示した。ｐＷＲＬ により合成された大き
な部分はＦＭＤＶ のｐ５２ポリペフチドからの配列を
含んでいてこれは不安定である。
０により合成された顕著なプラスミドの暗号°づけをし
たポリペプチドの分子量及びＣ末端の配列な鮪８図及び
下記表図１に示した。ｐＷＲＬ により合成された大き
な部分はＦＭＤＶ のｐ５２ポリペフチドからの配列を
含んでいてこれは不安定である。
１）ＷＲＬ １１２０及び１１６０に生じたより小さな
蛋白質は主としてｖＰ工配列を含みマキンセル法に於て
安定である様に見られた。ｐＷＲＬ １１４０により作
られた４ ０．０００ダルトンの蛋白質はＦＭＤＶ配列
の外にβラクタマーゼのＣ末端の１０４のアミノ酸を含
む融合生成物であり、ポリペプチドの安定をもたらした
。上記した４つのポリペプチドは何れも、細菌が３０μ
Ｉ／ｄのＩ ＰＴＯの存在下で成育する時に多い量で合
成された。これは蛋白質がラクトーズオペロンのコント
ロール下で生産されたことを示している。
蛋白質は主としてｖＰ工配列を含みマキンセル法に於て
安定である様に見られた。ｐＷＲＬ １１４０により作
られた４ ０．０００ダルトンの蛋白質はＦＭＤＶ配列
の外にβラクタマーゼのＣ末端の１０４のアミノ酸を含
む融合生成物であり、ポリペプチドの安定をもたらした
。上記した４つのポリペプチドは何れも、細菌が３０μ
Ｉ／ｄのＩ ＰＴＯの存在下で成育する時に多い量で合
成された。これは蛋白質がラクトーズオペロンのコント
ロール下で生産されたことを示している。
＾ Ｑ
λ 纒
５ ＼
口 ／／／
嘔ト
一ノ Ｎコ
０口
親玉 ＆
ｌ
Ｆ’）
ＭＦヌクレオチド配列分析 ＤＮＡ断片を適当な制限エンドヌクレアーゼによる分解
により組換えプラスミドより調製した。この断片を適当
に末端ラベルし、ヌクレオチド配列をＡ Ｍａｘａｎ及
びＷ Ｇ１１ｂｅｒｔ １９７７ （上記引用）の報告
した方法に従い決定した。これから第３図に示す様に、
ＦＭＤＶ ＲＮＡ の構造遺伝子領域の詳細が決定され
た。下記の表図２．３．５及び６はＶ４ ／ ＶＨの接
点領域及び其の他構造蛋白の色々な領域に於けるＤＮＡ
及びアミノ酸配列の詳細を示している。表図７はｖＰ３
のＣ末端及びｖＰｌのＮ末端のＤＮＡ配列の詳細を示し
ている。表図８はＦＭＤＶＲＮＡの６′末端のヌクレオ
チド配列を示しこれは蛋白質の暗号づけをしていない。
ＭＦヌクレオチド配列分析 ＤＮＡ断片を適当な制限エンドヌクレアーゼによる分解
により組換えプラスミドより調製した。この断片を適当
に末端ラベルし、ヌクレオチド配列をＡ Ｍａｘａｎ及
びＷ Ｇ１１ｂｅｒｔ １９７７ （上記引用）の報告
した方法に従い決定した。これから第３図に示す様に、
ＦＭＤＶ ＲＮＡ の構造遺伝子領域の詳細が決定され
た。下記の表図２．３．５及び６はＶ４ ／ ＶＨの接
点領域及び其の他構造蛋白の色々な領域に於けるＤＮＡ
及びアミノ酸配列の詳細を示している。表図７はｖＰ３
のＣ末端及びｖＰｌのＮ末端のＤＮＡ配列の詳細を示し
ている。表図８はＦＭＤＶＲＮＡの６′末端のヌクレオ
チド配列を示しこれは蛋白質の暗号づけをしていない。
例 ２
例１の組換えプラスミド調製のプロセスを、使用したＦ
ＭＤＶの株がＯよりＦＢ （動物ビールス研究所−Ａｎ
ｉｍａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｉｎ５ｔｉ
ｔｕｔｅ ）である点を除いて同様に反復した。
ＭＤＶの株がＯよりＦＢ （動物ビールス研究所−Ａｎ
ｉｍａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｉｎ５ｔｉ
ｔｕｔｅ ）である点を除いて同様に反復した。
結果 特開昭５８−４１８３９
（１６）組換えプラスミドｐＦｏ□ＢＦＢ ／ ｔ２５
１の物理マツプ及びその整列及びＦＭＤＶ 遺伝子との
対応、（上記方法の応用により推論される）を第４図に
示し、た。
（１６）組換えプラスミドｐＦｏ□ＢＦＢ ／ ｔ２５
１の物理マツプ及びその整列及びＦＭＤＶ 遺伝子との
対応、（上記方法の応用により推論される）を第４図に
示し、た。
ｒｈｏ ｎ栄 ＾Ｌ＾ ｒｙｅ ＾＠Ｎ
ＬＹＳ ＡＬＡ ｐＨｌＩ ＰＮＥ
Ｔ矛＾ＬＡ ＯＬＮ ＴＩＩＲＴＹＩＩ
ＴＩＩＲＯＬＮ ＴＹＩＩ ［ＩＩＩＩＬ
Ｙ １ｌｌＴ１＋４＠ｏ ｓ
＊ｖｏ ’ ＋ｓｏ。
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ＬＹＩＰＨｆＴＨＲＰル＊ｔＲＩＬＥＰ同ｌＹＲす＾し
智ＥＲ＾＾ＡＴＴＣＡｅＣＴＹＴＶｌ：ＡＡＴＣＣｃＴ
ＴＡＣＯＴＯＴＣ龜暴４＋１１４７０．’１４＠Ｏ Ｆ’ｌｌｌ： ＩＬｆ ＩＩＥ？ ＾ＩＦ
Ａ１１Ｉ ＰＩＩＥ ＩＩＡＬ Ｌ
ＹＳ ＩＬＥ ＡＳＮ１９６０１９７０１９１
１０ ８ＥＴＯＬＨＴｌｌ１１８１１ＬＶ＠ＨＩＳＯＬＹＩＬ
ＥＬＩＡＬＯＬＹ２０２０ ２
０４６ ２０４０！Ｉｌｌ
ＡＭＰ ＬｆＬＩ ＩＩＬＬＩ ＩＬＥ
ＩＩＡＬ ＭＡＬ Ａ＊ＯＨｌｌｌ
ＡＳＰ２０Ｂ０ ２０９０
２１ＤＯＰＩＩＤ Ｉ
ＩＬＵ ＡＬＡ ＡＬＡ Ｌ（Ｕ Ｓ
ＥＲＡＢＭ ＴＩＩＲＳＥＲ’Ａｌ１Ｎ２１４０
２１５０
２１４０Ｒ，Ａ１１ｌ＋ １４０
／ＩＬＡ ＬＥＬＩ ＰＲＩＩ ＴＹＲ
ＴＩＩＲＡＬＡ ＦＲＯＨ１ｓ
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２１４０Ｒ，Ａ１１ｌ＋ １４０
／ＩＬＡ ＬＥＬＩ ＰＲＩＩ ＴＹＲ
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第１図はＦＭＤＶ ＲＮＡ及び蛋白質の遺伝子地図であ
る。 第２図はＦＭＤＶ ＭＡ に整列した組換えシラスミド
を示す。 第３図は構造遺伝子の詳細を示す。 第４図はＦＭＤＶ ＲＮＡ に整列した組換えシラスミ
ドを示す。 第５図は表現シラスミドｐＸＹ １の構造を示す図であ
る。 第６図はｐｘＹｌへのＦＭＤＶ ｄｓ ｃＤＮＡ の導
入を示す図である。 第７図は表現プラスミドの構造を示す図である。 第８図は組換えクローン蛋白生産物を示す図である。 代理人 洩 村 皓 外４名 第１頁の続き 優先権主張 ０１９８０年１０月２２日■イギリス（Ｇ
Ｂ）■８０３４１３０ ■１９８０年１１月２７日■イギリス （ＧＢ）■８０３８１４７ ■１９８１年４月８日■イギリスー （ＧＢ）■８１１１０６４ ■１９８１年８月１８日■イギリス （ＧＢ）■８１２５１５０ ０発 明 者 マイクル・デビット・ウインサイギリス
国ケント・ベツケンハ ム・サウス・エデン・パーク・ ロード１０７フラツト３エイ ０発 明 者 デビット・ジョン・ロウランズイギリス
国すレー・ゴダルミン グ・バスブリッジ・レーン９８タ イル・ハウス ０発 明 者 フレッド・ブラウン 。 イギリス国すレー・ノーマンデ ィ・グラジアーズ・レーン（番 地なし）“シンダル″ ０発 明 者 ティ主シイ・ジョン・ロイ・ハリス イギリス国ハンツ・ファーンボ □ ロウ・コウゾ・ミンリイ・ロー ド７０ ＠発明者、ヒーター・アンソニー・ローウニ イギリス国すレー・パーブライ ト・ゴール・ロード８ ■出 願 人 ナショナル・リサーチ・デベロップメン
ト・コーポレーション イギリス国ロンドン・ニス・ダ フリユ１ビクトリア・ストリー ト６６キングスゲイト・ハウス 手続補正書（方式） ％式％ ＩＮ４ ｒ＋ １５１）年（シ側第１キｂデ巧 ；」２
、発明の名称 ３、補正をする者 ド１′１・との関係 特許出願人 昭（１１５７年 １月２６１ｊ ６、補所により増加する発明の数 ７、補正の対象 ＣＣＣＡＡ６＋ｌ二、二１１ａＩ６１ＣＩＣ，，Ｃ，Ｃ
ＩＩＧＣＣＧＣＡ、：、：。７Ａ、、Ｏシ・。、・二・
１．・工・。；：％ 。・−・。７・二＊、 、ｓｒ・
１゜・二・０．・：□ １３ｃ＋４・６１１９６１
シＯ口
る。 第２図はＦＭＤＶ ＭＡ に整列した組換えシラスミド
を示す。 第３図は構造遺伝子の詳細を示す。 第４図はＦＭＤＶ ＲＮＡ に整列した組換えシラスミ
ドを示す。 第５図は表現シラスミドｐＸＹ １の構造を示す図であ
る。 第６図はｐｘＹｌへのＦＭＤＶ ｄｓ ｃＤＮＡ の導
入を示す図である。 第７図は表現プラスミドの構造を示す図である。 第８図は組換えクローン蛋白生産物を示す図である。 代理人 洩 村 皓 外４名 第１頁の続き 優先権主張 ０１９８０年１０月２２日■イギリス（Ｇ
Ｂ）■８０３４１３０ ■１９８０年１１月２７日■イギリス （ＧＢ）■８０３８１４７ ■１９８１年４月８日■イギリスー （ＧＢ）■８１１１０６４ ■１９８１年８月１８日■イギリス （ＧＢ）■８１２５１５０ ０発 明 者 マイクル・デビット・ウインサイギリス
国ケント・ベツケンハ ム・サウス・エデン・パーク・ ロード１０７フラツト３エイ ０発 明 者 デビット・ジョン・ロウランズイギリス
国すレー・ゴダルミン グ・バスブリッジ・レーン９８タ イル・ハウス ０発 明 者 フレッド・ブラウン 。 イギリス国すレー・ノーマンデ ィ・グラジアーズ・レーン（番 地なし）“シンダル″ ０発 明 者 ティ主シイ・ジョン・ロイ・ハリス イギリス国ハンツ・ファーンボ □ ロウ・コウゾ・ミンリイ・ロー ド７０ ＠発明者、ヒーター・アンソニー・ローウニ イギリス国すレー・パーブライ ト・ゴール・ロード８ ■出 願 人 ナショナル・リサーチ・デベロップメン
ト・コーポレーション イギリス国ロンドン・ニス・ダ フリユ１ビクトリア・ストリー ト６６キングスゲイト・ハウス 手続補正書（方式） ％式％ ＩＮ４ ｒ＋ １５１）年（シ側第１キｂデ巧 ；」２
、発明の名称 ３、補正をする者 ド１′１・との関係 特許出願人 昭（１１５７年 １月２６１ｊ ６、補所により増加する発明の数 ７、補正の対象 ＣＣＣＡＡ６＋ｌ二、二１１ａＩ６１ＣＩＣ，，Ｃ，Ｃ
ＩＩＧＣＣＧＣＡ、：、：。７Ａ、、Ｏシ・。、・二・
１．・工・。；：％ 。・−・。７・二＊、 、ｓｒ・
１゜・二・０．・：□ １３ｃ＋４・６１１９６１
シＯ口
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１） ロ蹄疫ビールスＲＮム（・以下？ＭＤＶと称
する）の全体又は一部に実質的に対応するヌクレオチド
配列よ〕成るＤＮＡ分子。：・ 、 （２）少くともＩＰＭＤＶの１つの蛋白、質を実、質的
に暗号づけるヌクレオチド配列よシ成る、特許請求の範
囲第１現記゛載のＤＮＡ分子。 （３） ヌクレオチド配列が実質的にＩＰＭＤＶの外
殻（カゾシｙ）蛋白質の前駆体を暗号づける特許請求の
範囲第２項記載のＤＮＡ分子。 （４） ヌクレオチド配列が実質的にＰＭＤＶ蛋白質
蛋白質上８８づける特許請求の範囲第２項記載のＤＮＡ
分子。 （５） ヌクレオチド配列が実質的Ｋ ＦＭＤＶ 蛋
白質ＶＰ１、ＶＰｓ％ｖＰ３及びｖｐ４を暗号づける特
許請求の範囲第２項記載のＤＮＡ分子。 （６） ヌクレオチド配列が実質的Ｋ ＦＭＤＶ蛋白
質ｖｐ、、ｖＰｓ、ｖｐ５及びＶＰｌを連続し−て暗号
づける特許請求の範囲第２項記載のＤＮＡ分子。 （７） −クレオチド配列が蛋白質ｖｐ、１．ｖｐ５
及びｖｐ、の何れかの全部又は一部と隣接する１１’Ｍ
ＤＶ蛋白質ＶＰｌを実質的に暗号づける特許請求の範囲
第２項記載のＭ人分子。 （８） ヌクレオチド配列が実質的にＦＭｆ）Ｖ蛋白
質−ｖｐ工単独又は全部又は二部のｖｐ３蛋白質に隣接
続して暗号づける特許請求の範囲第２項記載のＤＮＡ分
子。 （９）ヌクレオチド配列が実質的にＰＭＤＶ蛋白質ｖＰ
ｌを暗号づける特許請求の範囲第２項記載のＤＮＡ分子
。 顛 ヌクレオチド配列が実質的にνＭＤＶ蛋白質ｖｐ。 を暗号づける特許請求の範囲゛第２項記載のＤＮＡ分子
。 αυ ヌクレオチド配列が実質的にＰＭＤＶ蛋白質ＶＰ
３を暗号づける特許請求の範囲第２項記載のＤＮＡ分子
。 ａ′ａ ヌクレオチド配列が実質的にＩＦＭＤＶ蛋白
質ＶＰ４を暗号づける特許請求の範囲第２項記載のＤＩ
ム分子。 ａ４ ヌクレオチド配列が１つ又はそれ以上の異なっ
たνＭＤＶ変異体より誘導された少くとも２つのＦＭＤ
’Ｖ蛋白質の全部又は一部を実質的に暗号づける特許請
求の範囲第２項記載のＤＮＡ分子。 Ｑ４） ＩＦＭＤＶ蛋白質又はその一部が異なったＦ
ＭＤＶ変異体由来のｖＰ１蛋白質である特許請求の範囲
第れたものである特許請求の範囲第９項記載のＤＮＡれ
たものである特許請求の範囲第１０項記載のれたもので
ある特許請求の範囲第１１項記載のれたものである特許
請求の範囲第１２項記載のＤＮＡ分子。 ａｌ ヌクレオチド配列が生物学的機能性断片を暗号
づける特許請求の範囲第１項から第１８項のいずれか１
項に記載のＤＮＡ分子。 （２）ヌクレオチド配列がＲＮＡ Ｋ対応するか又はＦ
ＭＤＶ血清型血清型面清型０の蛋白質を暗号づける、特
許請求の範囲第１項から第１９項のいずれか１項に記載
のＭＡ分子二 Ｑυ ヌクレオチド配列がＩＰＭＤＶ血清型ム、亜型Ａ
１０株６１の蛋白質を暗号づける特許請求の範囲第２０
項記載のＤＮＡ分子。 ＠ 前記の通シ定義された、開始配列及び停止配列を持
つオペロン、少くともＦＭＤＶの１つの蛋白質の全部又
は一部を実質的に暗号づけるヌクレオチド配列ｌ包含し
、そしてヌクレオチド配列はオペロンの開始配列と停止
配列の間に位置する組換えＤＮＡ分子。 （至）ヌクレオチド配列が特許請求の範囲第２項から第
２１項のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む特許請求の
範囲第２２項記載の組換えＤＮＡ分子。 （財）特許請求の範囲第２２項又は第２３項記載の組換
えＤＮＡより成るＰＭＤＶ蛋白質の全部又は一部を表現
し得る組換えＤＮＡクローニング伝播体（ビヒクル）。 （ハ）特許請求の範囲第２４項記載の組換えクローニン
グ伝播体を少くとも１つ含む宿主（ホスト）細胞。 ・＠ 哺乳類のＦＭＤ’Ｖに対する抗体生産を特徴する
特許請求の範囲第２４項記載の組換えＤＮＡクローニン
グ伝播体くよシ形質転換された宿主細胞によシ作られた
抗原。 （イ）獣医学的に使用し得る担体と共Ｋ、特許請求の範
囲第２５項記載の宿主細胞により作られたＦＭＤｖ免疫
原性を示す少くとも１つの蛋白質より成る、哺乳類のＦ
ＭＤＶに対する抗体の生産を刺戟するワクチン。 ＠（ａ） ＦＭＤＶの１本鎖のＲＮＡ ｇ分離し；（
１） その１本鎖のＲＭＡ Ｋ相補的なりＩムの第１
の１本鎖を調製し； （０） 第１のＤｌｉム鎖に相補的で水素結合するＤ
ＮＡの第２鎖を作ることを特徴とする特許請求の範囲第
１項から第２１項のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子の
製造法。 Ｃ１ｌ （ＳＬ） 遊離末端を作るためクローニング
伝播体を切断し； （ｂ） 特許請求の範囲第２８項によ〕調製したＤＮ
Ａ分子を中間的な位置ではあるがクローニング伝播体の
遊離末端である必要はない位置に挿入し； （０） それ自身公知の方法によりＤＮム分子ｔクロ
ーニング伝播体の末端に接続することを特徴とする特許
請求の範囲第２４項記載の組換えクローニング伝播体を
製造する方法。 ０Ｉ 特許請求の範囲第２９項に従い調製された組換
えクローニング伝播体によシ宿主細胞を形質転換させる
とと！特徴とする特許請求の範囲第２５項記載の宿主細
胞を製造する方法。 Ｃ（１）（ＳＬ） ＤｌｆＡ ＆制限二ンｒヌクレア
ーゼ酵素により分解し、生産物を分離し； （１）） テｌす？ヌクレアーゼ分解によシ作られた
ラベルしたＦＭＤＶ ＲＭＡのオリｆヌクレオチドｔ加
え； （（ｊ） Ｔｌオリデヌクレオチドが交離された（ハ
イブリッド化）、制限二ンｒヌクレアーゼ分解生成物を
同定することを特徴とする特許請求の範囲第１項から第
２１項の何れか１項記載の組換えＤＮＡのマツピング法
。 ０３ 特許請求の範囲第２８項の方法によりｅａｔ。 た、特許請求の範囲第１項から第２１項の何れか１項に
記載されたＤＮＡ分子。 ｃ１３ＩＦ＃許請求の範囲第２９項の方法によシ調製し
た、特許請求の範囲第２４項記載の組換えＤＮＡクロー
ニング伝播体。 （ロ）特許請求の範囲第３０項の方法で調製した、特許
請求の範囲第２５項記載の宿主細胞。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8030208 | 1980-09-18 | ||
| GB8030208 | 1980-09-18 | ||
| GB8034130 | 1980-10-22 | ||
| GB8038147 | 1980-11-27 | ||
| GB8111064 | 1981-04-08 | ||
| GB8125150 | 1981-08-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5841899A true JPS5841899A (ja) | 1983-03-11 |
Family
ID=10516151
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56146965A Pending JPS5841899A (ja) | 1980-09-18 | 1981-09-17 | 組換えｄｎａ分子およびその製造法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5841899A (ja) |
| BE (1) | BE890393A (ja) |
| ZA (1) | ZA816469B (ja) |
-
1981
- 1981-09-17 ZA ZA816469A patent/ZA816469B/xx unknown
- 1981-09-17 BE BE0/205994A patent/BE890393A/fr not_active IP Right Cessation
- 1981-09-17 JP JP56146965A patent/JPS5841899A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA816469B (en) | 1983-04-27 |
| BE890393A (fr) | 1982-03-17 |
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