JPS5890517A - Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原を合成する新規な組換え体及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発ＩｔＶ′Ｂ型肝炎゛ウィルスの表面抗原を合成する
新規な組換え体及びその製法に関する。

Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原は、　　Ｂｌｕｍｂｅｒｇ
と共同研究者（Ｂｌｕｍｂｅｒｇ、　Ｂ、　％、、　Ｂ
ｕｌｌ、　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ。

Ｍｅｄ、　４０　（１９６４）　３７７　；　Ｂｌｕｍ
ｂｅｒｇ、　Ｂ、　Ｓ、、　Ａｌｔｅｒ、　Ｈ。

Ｊ、、　Ｖｉｓｎｉｃｈ、　Ｓ、、　ＪＡＭＡ　１９１
　（１９６５）　５４１　）　　により１９６４年にオ
ーストラリアの原住民の血清から発イルスの表面抗原上
定義された。

この表面抗原は分子量約２９，０００の糖タンパクであ
る。本表面抗原の発見により、Ｂ型肝炎ウィルスの存在
と病気との関連については、病理学や疫学的研究の進展
により、Ｂ型肝炎ウィルスがヒト（血清）肝炎の原因ウ
ィルスであることが明らかにされ２世界で２億人が感染
していると云われている。また表面抗原をワクチンとし
て用いる治療に関する研究も大きく前進してきた。

そしてワクチンを作製するに際しては、不活化した原血
清や精製した表面抗原を不活化して用いることが試みら
れてきた。即ち、Ｂ型肝炎ウィルスに感染したヒト血清
を大量に集めることのみでワクチンが得られている。Ｂ
型肝炎ウィルスには一過性感染の他に持続性感染もみら
れることも明らかにされ１手術時に輸血した患者９人工
透析などに関与する医療従事者や医師、看護婦などには
重大な問題であることもはっきりした。またさらに研究
が進むにつれて、Ｂ型肝炎ウィルスが原発性肝癌の原因
ウィルスであるらしいことがいよいよはっきりしてきた
。原発性肝癌は世界で最も多い癌であり、Ｂ型肝炎ウィ
ルスの感染を押えるこ生 とによって原発性肝癌の発＼を押えることが可能と云わ
れる。この意味からも安全なり型肝炎ワクチンは重要で
ある。

それ故、ウィルス粒子の全く存在しない安全なワクチン
が必要であり、その需要が増加しているにもかかわらず
、その入手が限られていると同時に、ワクチンの材料と
して原血清や精製したウィルスを使う為に１００％安全
ではない。そしてまた材料も限られている。そこで他の
方法によるウィルス粒子が全く存在しない安全な表面抗
原の製造が必要とされている。

そして１９７９年にＧａ１ｉｂｅｒｔら（Ｇａｌｉｂｅ
ｒｔ、Ｆ、。

Ｍａｎｄａｒｔ　、　Ｅ、　、　Ｆｉｔｏｕｓｓｉ　、
　Ｆ、　、　Ｔｉｏｌｌａ　ｉｓ　、　Ｐ、　、　Ｃｈ
ａｒｎａｙ　。

Ｐ、　、　Ｎａｔｕｒｅ　２８１　（１９７９）６４６
　〕によりＢ型肝炎ウィルスのゲノム中に表面抗原遺伝
子の存在が報告されたが、現在でも表面抗原はその抽出
材料の入手の困難さから単一のタンパクとして純化する
ことが困難で、Ｂ型肝炎ウィルスの感染を阻止するワク
チンの研究を通しての新しい制癌剤の開発も著しく遅れ
ているのが現状であり９本表面抗原が安全かつ大量に容
易に手に入ることが望ましいことである。このような理
由から１表面抗原を安全にしかも大量に生産する技術の
開発が強く望まれている。

一方、微生物の培養により、この微生物によって作られ
る特定のタンパクを工業的に有利に製造しうろことも知
られている。しかしこの製法は。

所望のタンパクを生産する遺伝子を持つ微生物が見い出
される場合にのみ使用できるが、適当な微生物が存在し
ないため、この方法では多くの有用なタンパクが製造で
きないのが現状である。それ故、特定の遺伝子をこの遺
伝情報を含んでいない微生物中に挿入し、目的とする遺
伝的機能を有する新しい組換え体を製造する遺伝子組換
え技術の開発研究が行われている。この方法の原理は、
　％）わゆるベクターＤＮＡと称するプラスミドＤＮＡ
またはファージＤＮＡに目的とする遺伝子を人工的に挿
入し、微生物たとえば大腸菌に感染させることからなる
。このような新しい遺伝情報の組込みおよび増殖の方法
をクローン化技術と称する。

しかしこれまでに１表面抗原を合成する表面抗原遺伝子
を含む組換え体のクローン化については全く知られてお
らず、またこの方法による表面抗原の製造についても全
く知られていない。

本発明者らは、遺伝子組換え技術により表面抗原を合成
する表面抗原遺伝子をベクターＤＮＡ例えばプラスミド
ＤＮＡに挿入して新規な組換え体をつくり、安全な表面
抗原を大量に製造することが新しい技術であると考え、
この点に関して研究した結果９本発明を完成するに至っ
た。すなわち本発明は、ＤＮＡ供与体としてのＢ型肝炎
ウィルスＤＮＡの表面抗原遺伝子を含むＤＮＡ断片を代
謝酵素遺伝子をもつベクターＤＮＡの代謝酵素遺伝子内
に挿入した表面抗原を合成する新規な組換え体であり、
また本発明は、ＤＮＡ供与体としてのＢ型肝炎ウィルス
ＤＮＡを制限酵素で切断して片 表面抗原遺伝子を片側に含むＤＮＡ断Ｎを分離し。

このＤＮＡ断片をベクターＤＮＡに挿入して組換え体を
つくり、この組換え体ＤＮＡを別の制限酵片を分離し、
このＤＮＡ断片を代謝酵素遺伝子をモツヘクターＤＮＡ
の代謝酵素遺伝子内に挿入することを特徴とする。Ｂ型
肝炎ウィルスの表面抗原を合成する新規な組換え体の製
法であって、その目的とするところは、微生物例えば大
腸菌に表面抗原を生産させることのできる新規な組換え
体を提供することにある。

従来、このようなり型肝炎ウィルスの表面抗原を合成す
る表面抗原遺伝子を含む新規な組換え体は存在せず、上
記の新規な組換え体は本発明者等により始めて得られた
ものである。この新規な組換え体は、微生物たとえば大
腸菌内で表面抗原を大量に生産させるものであって非常
に有用である。

本発明の新規な組換え体は、上記した製法にしたがいＢ
型肝炎ウィルスＤＮＡたとえばサブタイプａｄｒ型のＢ
型肝炎ウィルスＤＮＡを制限酵素（米国Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ　Ｒｅｓ、　Ｌａｂ、社より得ることができる）たと
えばＢａｍＨｒ　で切断して得られる表面抗原遺伝子を
片側に含むＤＮＡ断片を、遺伝子組３２２　ＤＮＡ　（
米国Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓ、　Ｌａｂ、社より得る
ことができる）のようなプラスミドＤＮＡに挿入して最
初の組換え体を作成し、ついで、この組換え体ＤＮＡよ
り別の制限酵素例えばＴａｑ　ｌで切断して得られる表
面抗原遺伝子を内部に含むＤＮＡ断片を代謝酵素遺伝子
をもつベクターＤＮＡの代謝酵素遺伝子中に遺伝子組換
え技術によって挿入すると、上記の表面抗原を合成する
新規な組換え体を得ることが出来る。

次にこの製法について更に具体的に説明する。

まずＢ型肝炎ウィルスの前面抗原遺伝子の供与体として
用いるＢ型肝炎ウィルスＤＮＡは、Ｂ型肝炎ウィルス例
えばサブタイプａｄｒ型から得ることが出来る。すなわ
ち、Ｂ型肝炎ウィルス例えばサブタイプａｄｒ型の感染
した患者の血清よりＬａ−ｎｄｅｒｓらの方法（Ｌａｎ
ｄｅｒｓ、　Ｔ、　Ａ、　、　Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、Ｈ
。

Ｂ、、　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、Ｗ、　ｓ、ｌ　Ｊ、　Ｖｉ
ｒｏｌ、　２３　（１９７７）　３６８　）に従い蔗糖
ゾーン遠心法または塩化セシウム密度勾配平衡遠心法で
Ｄａｎｅ粒子を精製する。Ｄａｎｅ粒子中のＤＮＡには
部分的に１本鎖ＤＮＡが存在する。この部分をあらかじ
め内在性ＤＮＡポリメラーゼの反応を用いて充填し、そ
の後プロテアーゼとドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
で破壊し。

フ゛エノール法〔小池克部：生物化学（ｌｌ）６４３頁
、新実験化学講座９日本化学会編、昭和５３年丸善発行
〕でＤＮＡを抽出し、　　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０
（スエーデンＰｈａｒｍａｃｉａ社から得ることができ
る）によるゲル濾過を行う。このようにして得たＤＮＡ
を制限酵素例えばＢａｍＨＩで切断してＩ）ＮＡ断片に
する。

この中に表面抗原遺伝子を片側に含むＤＮＡ断片が存在
する。また、Ｂ型肝炎ウィルスのサブタイプａｄｒ型の
代りにａｄｗ型や一一烏ないしはａｙｒ型を用いても上
記と同様にして表面抗原遺伝子を片側に含むＤＮＡ断片
を得ることが出来る。さらにまた、Ｂ型肝炎ウィルスに
感染した患者の細胞や組織のＤＮＡを用いても上記した
と同様の制限酵素で切断して表面抗原遺伝子を片側に含
むＤＮＡ断片を得ることが出来る。

プラスミドＤＮＡ例えばｐＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａのテト
ラサイクリン耐性遺伝子のコード領域を制限酵素例えば
ＢａｍＨＩで１ケ所切断しくＨｅｄｇｐｅｔｈ、　Ｊ、
。

Ｇｏｏｄｍａｎ　、　Ｈ，Ｍ、　、　Ｂｏｙｅｒ　、　
Ｈ，Ｗ、　、　ＰＮＡＳ　６９．（１９７２）３４４８
）、上記のようにして得た表面抗原遺伝子を片側に含む
ＤＮＡ断片と混合し１．さらに接続酵素ＤＮＡリガーゼ
（Ｍｏｄｒｉｃｈ　、　Ｐ、　、　Ａｎｒａｋｕ　、　
Ｙ、　、　Ｌｅｈｍａｎ。

１、　Ｒ，、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２４８　
（１９７３）　７４９５　）によってＤＮＡ断片同志を
結合して雑種ＤＮＡを作成する。

これらの雑種ＤＮＡの中に表面抗原遺伝子を含むプラス
ミドＤＮＡが存在することになる。

このようにして得られた雑種ＤＮＡをＤＮＡ感染法（Ｍ
ａｎｄｅｌ　、　Ｍ、　、　Ｈｉｇａ、　Ａ、、　Ｊ、
　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　５３（１９７０）　１５９　
）によりカルシウム処理した大腸菌例えば大腸菌に一１
２株（米国Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓｏ
ｆ　Ｈｅａｌｔｈより得ることができる）に感染させ。

抗生物質アンピシリンまたはテトラサイクリンを含む平
板寒天上にプレートし、アンピシリン存在下テ生シたコ
ロニーのうちテトラサイクリン感受性のコロニーを選別
し、さらにコロニーハイブリダイゼーション法（Ｇｒｕ
ｎｓｔｅｉｎ　、Ｍ、　、　Ｈｏｇｎｅｓｓ　、　Ｄ、
　Ｓ、　。

ＰＮＡＳ　７２　（１９７５）　３９６１　）　　を用
いてスクリーニングすれば９表面抗原遺伝子を含む組換
え体プラスミドを持つコロニーを検出することが出来る
。

このコロニーハイブリダイゼーション法とは次の如きも
ので、ある。予め表面抗原遺伝子ＤＮＡと相同の塩基配
列を持つＢ型肝炎ウィルスより合成した　Ｐ標識ＤＮＡ
を用意しておき、生じたテトラサイクリン感受性でアン
ピシリン耐性の大腸菌□のコロニーをニトロセルロース
ｉ（西Ｆイツ５ｃｈ−一ど Ｉｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｖＩｆ１１社より得ること
ができる）に移し取り９組換え体ＤＮＡを膜にやき付け
てからＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションを行い　
Ｐ標識ＤＮＡの有無によって陽性陰性を判定する。

ハイブリダイゼーション陽性のコロニーは表面抗原遺伝
子を含む組換え体プラスミドに由来するものである。か
くしてハイブリダイゼーション陽性のコロニーを選択す
ることにより９表面抗原遺伝子を含む最初の組換え体が
得られる。

上記のようにして得られた最初の組換え体プラスミドに
挿入されたＤＮＡ断片が表面抗原遺伝子を含むことの確
認は次の如くに行った。

まず組換え体プラスミドを持つ大腸菌例えば大腸菌に一
１２株を大規模に液体培養する。そしてＣｌｅｗｅｌ　
１−Ｈｅ１ｉｎｓｋｉ法（Ｃｌｅｗｅｌ　Ｉ　、Ｄ、　
Ｂ、、　Ｈｅ１ｉｎｓｋ　ｉ　。

Ｄ、　Ｒ，、ＰＮＡＳ　６２　（１９６９）　１１５９
　）により培養菌体の可溶画分より組換え体プラスミド
ＤＮＡをエチジウムプロミド−塩化セシウム密度勾配平
衡遠心法を用いて分離すれば２組換え体ＤＮＡ・が純粋
に得られる。この組換え体ＤＮＡを制限酵素例えばＨｉ
ｎｄ　ＩＩＩと５ａｌｌを用いて切断し、寒天ゲル電気
泳動法（５ｈａｒｐ、　Ｐ、　Ａ、、　Ｓｕｇｄｅｎ、
　Ｂ、、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１２　（１９７３）　３０
５５　Ｊを用いて分離すれば両端にベクターＤＮＡの一
部を持つ表面抗原遺伝子を含むＤＮＡ断片が得られる。

このＤＮＡ断片の塩基配列をＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒ
ｔ法（Ｍａｘａｍ、　Ａ。

Ｍ、、　Ｇ　１ｌｂｅｒｔ　、　Ｗ、、　ＰＮＡＳ　７
４　（１９７７）　５６０　）により決定し９表面抗原
遺伝子を含むＤＮＡが組換え体中の何処にどのように挿
入されているかを確認する。

ついで上記のようにして得た表面抗原遺伝子を含む最初
の組慄え体ＤＮＡより表面抗原遺伝子の外側を別の制限
酵素で切り取り、内部に表面抗原遺伝子を含むＤＮＡ断
片を作製し２代謝酵素遺伝子をもつ、プラスミドＤＮＡ
の代謝酵素遺伝子中に挿入して表面抗原を大量に製造す
る新規な組換え体をつくる。すなわち、ＤＮＡ供与体と
して上記のようにして作製した表面抗原遺伝子を含む最
初の組換釆体プラスミドのＤＮＡを切断して得た表面抗
原遺伝子を内部に含むＤＮＡ断片を、再び代謝酵素遺伝
子をもつプラスミド例えばｐＢＲ３２２ＤＮＡの代謝酵
素遺伝子中に存在するプロモータの下流に接続すると１
表面抗原を合成することが可能となった表面抗原遺伝子
を含む新規な組換え体を得られる。これについて更に詳
しく説明すると次の如くである。

最初の組換え体ＤＮＡを別の制限酵素たとえばＴａｑｌ
（米国Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｈｓ、　Ｌａｂ、より得ら
れる）で切断して表面抗原遺伝子を内部に含む小さｃｓ
ＤＮＡ断片にする。すでに塩基配列が解析されて（為る
ので、この中には構造や配置の明らかになった表面抗原
遺伝子が存在する。

一方２代謝酵素遺伝子をもつベクターＤＮＡ例えばｐＢ
Ｒ３２２ＤＮＡを制限酵素Ｐｓｔ　Ｉ（米国Ｂｅ−ｔｈ
ｅｓｄａ　Ｒｅｓ、　Ｌａｂ、より得ることができる）
で切断すると、−アンピシリン耐性に関与する代謝酵素
遺伝子（β−ラクタマーゼ遺伝子）のコード領域が切断
されることが知られている（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ、　Ｊ
、　Ｇ、。

ＰＮＡＳ互（１９７８）　３７３７　）。この切断部位
を利用することにより表面抗原を大量に合成することの
できる新規な組換え体を作成することができる。たとえ
ば、このｐＢＲ３２２ＤＮＡのβ−ラクタマーゼ遺伝子
中に他の遺伝子ＤＮＡが挿入されると、β−ラクタマー
ゼのプロモータを用いた転写反応が新しく挿入された遺
伝子上でも継続して行われることになる。その結果、新
しく挿入した遺伝子でコードされるタンパクが代謝酵素
例えばβ−ラクタマーゼのＮ端に融合した形で効率よく
合成されることになる。

そこで上記の如くして得た界面抗原遺伝子を内部に含む
ＤＮＡ断片を寒天ゲル電気泳動で分離し、生じた１本鎖
ＤＮＡの切断部位をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（米国Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓ、　Ｌａｂ、より得ることができ
る）と反応させて充てんする。他方、制限酵素Ｐｓｔｌ
”？？切断したｐＢＲ３２２ＤＮＡをｓ１ヌクレアーゼ
（米国Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓ、　Ｌａｂ、より得る
ことができる）と反応させ１本鎖ＤＮＡの切断部位を取
り去、る。以上２種類のＤＮＡ断片を混合し、さらにＴ
４ＤＮＡリガーゼによって結合して！ｌ〜種ＤＮＡを作
成する。これらの雑種ＤＮＡの中に表面抗原を合成する
表面抗原遺伝子を正しい位置に含むプラスミドＤＮＡが
存在することになる。

上記のようにして得られた雑種ＤＮＡをカルシウム処理
した大腸菌たとえば大腸菌に一１２株にＤＮＡ感染法に
より感染させ、抗生物質アンピシリンまたはテトラサイ
クリンを含む平板寒天上にプレートし、テトラサイクリ
ン存在下で生じたコロニーのウチアンビシリン感受性の
コロニーを選択し、コロニーハイブリダイゼーション法
により陽性のコロニーを検出すれば９表面抗原を合成す
る新規な組換え体を得ることが出来る。

この得られた新規な組換え体が表面抗原遺伝子を正しい
位置に含み、かつ表面抗原を産生ずる・か否かの確認は
以下の如くに行った。

新規な組換え体を持つ大腸菌を大規模に液体培養する。

この培養菌体の可溶画分より、　Ｃｌｅｗｅｌｌ−Ｈｅ
ｌｉｎｓｋｉ法によりエチジウムプロミド−塩化セシウ
ム密度勾配平衡遠心法を用いて分離すれば、新規な組換
え体プラスミドＤＮＡが大量に得られる。

この新規な組換え体ＤＮＡを制限酵素例えばＴａｑ　Ｉ
で切断し、寒天ゲル電気泳動法を用いて分離すれば１代
謝酵素醗禰−一たとえばβ−ラクタマーゼのＮ端部分を
含むＤＮＡ断片が得られる。このＤＮＡ断片の塩基配列
をＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法により解析し、遺伝子
コードに基づき、アミノ酸配列を決定し９表面抗原タン
パクが正しくβ−ラクタマーゼのＮ端部分に結合してい
ることを確認する。

こうして得た表面抗原遺伝子を正しい位置に含む新規な
組換え体プラスミドを持つ大腸菌に一１２分を抽出し、
この可溶画分につき、これを適当に希釈してオースリア
Ｉ　Ｉ　−１２５ラジオイムノアツセイ〔米国Ａｂｂｏ
ｔｔ社より得ることができる〕を用いた免疫スクリーニ
ング法で検討し２表面抗原が産生されていることを確認
する。

本発明の新規な組換え体は、これを含む大腸菌の大規模
培養によりＢ型肝炎ウィルスの表面抗原の大量生産が出
来るので、非常に有用である。

次に実施例を示し本発明をさらに具体的に説明するが１
．これにより本発明は制限されるものではない。

実施例 （１）　　ベクターとして用いるプラスミドｐＢＲ３２
２ｔｉｓｓ厘　より得られる）にプラスミドｐＢＲ３２
２の入った誘導体を、　２ｏｍｐのＬＢ−培地（１％ト
リプトン、０．５％塩化ナトリウム、０．５％酵母エキ
ス。

０．１％グ／１／　：ｌ−ｙ、　、　ｐＨ７，０）に５
０μｇ−／ｍ１３チミジンと５０μｆｆ／ｍ１３ジアミ
ノピメリン酸を加えた培地で、３７℃−晩培養し、翌朝
に上記と同じ培地２ノに移植する。３７℃で振盪培養し
、　６００ｍμでの吸光度が０．６に到達したら、クロ
ラムフェニコールを最終濃度５０μｆｆ／ｍ−４になる
ように加え、３７℃で一晩培養し、翌朝にｓ、ｏｏｏ回
転で１０分間の遠心分離を行い菌体を沈澱させる。この
菌体を８０ｍ−ｅの緩衝液（５０７ｆｉＭ）リス−塩酸
、　ｐＨ７，５／　１　ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナ
トリウム１０．１Ｍ塩化ナトリウム）に懸濁して洗滌し
、　ｓ、ｏｏｏ回転で１０分間の遠心分離を行い菌体を
再沈澱させる。この菌体を２０ｍ＃の緩衝液（５０ｍＭ
　）リス−塩酸、ｐＨ８，０／１００ｍＭ塩化ナトリウ
ム）に懸濁し、４ｍ２の５ｍ１／ｍ−ｅリゾチーム液（
米国ＳＩＧＭＡ社から得られる）および８ｍ−ｅの０．
２５ＭＥＤＴＡと３２ｍ１の２％Ｂｒ１ｊ　５８０ 溶液（’Ｍ’ｍＭ）リス−塩酸、　ｐＨ８，０／　１０
０　ｍＭ塩化ナトリウム）を加え、タイプ３０ロータ（
米国Ｂｅ−ｃｋｍａｎ社より得られる）の遠心管に入れ
、　　１０分間３７℃に放置してから、　３５，０００
回転で３０分間遠心し。

ｐＢＲ３２２ＤＮＡを含む上清（可溶画分）を分取する
。

分取した可溶画分に塩化セシウムが０．９５Ｐ／ｍ−６
になるように加え、さらにエチジウムプロミドが５００
μＰ／ｍ　、、ｅになるように加え、１５℃、　３６．
０００回転で３０時間の密度勾配平衡遠心を行う。遠心
後。

紫外線で遠心管を照射すると、ＤＮＡは上下２本の螢光
バンドとして認められるので、下の閉環状ｐＢＲ３２２
ＤＮＡのバンドを遠心管から分画し、エチジウムプロミ
ドをｔ−ブタノールで抽出し、緩衝９、　　　′ 液（２０７７１Ｍ）リス−塩酸、ｐＨ７，８１０，１ｍ
Ｍ　、−ｃチレンジアミン四酢酸ナトリウム）に透析し
て塩化セシウムを除き、ベクターとして用いるプラスミ
ドｐＢＲ３２２ＤＮＡの材料とする。

プラスミドＤＮＡの製造に用いる宿主大腸菌は大腸菌Ｋ
　−１２Ｘ　１７７６株であるが、大腸菌に一１２ＨＢ
　１０１株なども用いられる。ベクターとして製造する
ｐＢＲ３２２ＤＮＡは分子量が２．６Ｘ１０ダルトンで
あり、抗生物質テトラサイクリンとアンピシリンに耐性
の遺伝子を持っており、各々の遺伝子領域には制限酵素
ＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄ　ｍとＰｓｔ　Ｉにより切断
される部位を１ケ所ずつ有している。これら制限酵素に
よる切断部位には異種のＤＮＡ断片の挿入が可能である
。ｐＢＲ３２２ＤＮＡをベクターとして用いる場合には
、制限酵素ＢａｍＨＩで切断後。

Ｕｌｌｒｊｃｈらの方法（Ｕｌｌｒｉｃｈ　、　Ａ、、
　５ｈｉｎｅ　、　Ｊ、、　Ｃｈｉｒｇｗ−ｉｎ、　Ｊ
、、　Ｐｉｃｔｅｔ　、　Ｒ，、Ｔｉ５ｃｈｅｒ、　Ｅ
、、　Ｒｕｔｔｅｒ、　Ｗ、　Ｊ、。

Ｇｏｏｄｍａｎ、　Ｈ，Ｍ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　１９
６　（１９７７）　１３１３　）に従い５’末端のリン
酸をアルカリフォスファターゼで取り除き、それ自身が
環状化しないＤＮＡ断片とする。

上記の緩衝液に溶けたｐＢＲ３２２ＤＮＡ　１μｇ当り
１．５単位の制限酵素ＢａｍＨＩを加え、さらに５０ｍ
Ｍ塩化ナトリウムと１０ｍＭ塩ｆとマグネシウムを加え
。

３７℃で３時間反応させる。２５ｍＭエチレンジアミン
四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）と０．５　Ｍ　酢酸アン
モニウムで反応停止後、３倍量のエタノールを加えて一
８０℃に放置し、生じたＤＮＡの沈澱を１０，０００回
転で５分間遠心して分離回収する。°回収したＤＮＡを
少量の０．３Ｍ酢酸ナニリウムに溶解させ。

３倍量のエタノールを加え一８０℃に放置し、生じたＤ
ＮＡの沈澱を遠心分離する。ＤＮＡ沈澱を少量の緩衝液
（２０ｍＭ　）リス−塩酸、ｐＨ７，８／１ｍＭＥＤＴ
Ａ）に溶かし、ＤＮ心４１当り０．０１単位のアルカリ
フォスファターゼ（米国ＳＩＧＭＡ社より得られる）を
加え、６３℃で３０分間反応させる。反応後に等量のフ
ェノールを加え５分間処理後。

ｓ、ｏｏｏ回転で１０分間遠心して水層を分離する。

水層に０．５Ｍ酢酸アンモニウムを加え、３倍量のエタ
ノールを加えて一８０℃に放置し、生じたＤＮＡ沈澱を
遠心分離する。回収したＤＮＡを少量の０．３Ｍ酢酸ナ
トリウムに溶かし、３倍量のエタノールを加えて一８０
℃に放置し、生じたＤＮＡ沈澱を遠心分離する。最後に
ＤＮＡの沈澱をｊ量の再蒸留水に溶解し、０°９で保存
し、雑種ＤＮＡ作製の材料とする。

（２）Ｂ型肝炎ウィルスＤＮＡの抽出と表面抗原遺伝子
を片側に含むＤＮＡ断片の製造 Ｂ型肝炎ウィルス（サヲタイプＹｄｒ型）に感染しに患
者の血漿的６００ｍ−ｅを、　９，０００回転テ１５分
間遠心して不溶物を除く。得られた血清を、５Ｗ２１０
−タ（米国Ｂｅｃｋｍａｎ社より得られる）を用いて２
１．０００回転、４℃で４時間遠心分離し、　Ｄａｎｅ
粒子とよばれる感染性のあるウィルス粒子を沈澱として
集める。沈澱を１５ｍ１の緩衝液（１０７７１Ｍ　）リ
ス−塩酸、ｐＨ７，５７０，ＩＭ塩化ナトリウム／１ｍ
ＭＥＤＴＡ１０．１９６２−１　ルヵブトエタ／　−７
１／　７１５ｍｙウシ血清アルブミン）に溶解させ、−
８０℃に保存する。これを２１画分と呼ぶ。後に述べる
ように内在性のＤＮＡポリメラーゼ反応を行うに際して
は、　Ｄａｎｅ粒子を高濃度の蔗糖を用いたゾーン遠心
法で精製する。

ＰＩ画分３ｍノを３０％蔗糖溶液（１０７７２Ｍ）リス
ニ塩酸、ｐＨ７，５１０，ＩＭ塩化ナトリウＡ　１ｍＭ
　ＥＤＴＡ、’ｏ、ｔ％２−メルカプトエタノール１０
．１％ウシ血清アルブミン）上に重層し、　５Ｗ４０ロ
ータ　（米国Ｂｅｃｋｍａｎ社より得られる）を用い　
４℃で。

４０．０００回転、４時間のゾーン遠心を行イ、　Ｄａ
ｎｅ粒子を沈澱として回収する。沈澱を上記と同様の緩
衝液に溶解し＋　　３０９６蔗糖溶液上に重層し、ゾー
ン遠心を再度行う。沈澱を２００μ形の緩衝液（１０ｍ
　Ｍトリス−塩酸、　　ｐＨ７，５１０，Ｉ　Ｍ塩化ナ
トリウム１０．５％Ｎ　Ｐ　４０１０．１％２−メルカ
プトエタノール）に溶解させる。これをＮＰ４０−Ｐ２
両分と呼ぶ。

Ｂ型肝炎ウィルスの環状ＤＮＡゲノム中には。

部分的に１本鎖ＤＮＡが存在するが、内在性ＤＮＡポリ
メラーゼの反応でこれを２本鎖ＤＮＡに充填できること
が知られている（　Ｓｕｍｍｅｒｓ　、　Ｊ、　Ａ、、
　Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌ　、　Ａ、、　Ｍｉｌｌｍａｎ、　
１．、　ＰＮＡＳ　７２　（１９７５）　４５９７）。

ウィルスＤＮＡ中に存在子る１本鎖ＤＮＡ部分の内在性
ＤＮＡポリメラーゼによる充填反逆は、下記のように行
う。５０μ！のヌクレオシド三リン酸混合物−（０，２
Ｍ）リス−塩酸、　ｐＨ７，５／８０７ＦＩＭ塩化マク
ネシウ゛ム／　０．２３　Ｍ塩化アンモニウム７１ｍＭ
デオキシヌクレオシド三リン酸）を２００μ！のＮＰ４
０−　Ｐ　２両分に加え、３７℃で３時間ＤＮＡ合成を
行う。反応後に、０．１％ＳＤＳを加えて５分間放置後
、さらに１０ｍＭＥＤＴＡと１７Ｂ−のブａ　ｆ　７−
　セＫを加え、５６℃で２時間消化する。消化後に等量
のフェノールを加えて２０分間処理後、水層を遠心分離
する。このフェノール処理を再度行い、水層を遠心分離
して濃縮する。ついで５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　５０（ス
エーデンＰｈａｒｍａｃｉａ社より得られる）カラム（
０，９Ｘ１０ｃｍ）にチャージし、緩衝液（１０ｍＭ）
リス−塩酸、　ｐＨ７，８１０，０５？ｉＭ　Ｅ　Ｄ　
Ｔ　Ａ　）を用イテゲル瀘過する。ウィルスＤＮＡの分
画を集め。

０．３Ｍ酢酸ナトリウムと、３倍量のエタノールを加え
て一８０℃に放置し、生じたＤＮＡの沈澱を遠心分離す
る。沈澱を乾燥後、５０μ２の緩衝液（１０７ＷＭトリ
ス−塩酸、ｐＨ７，８１０，０５ｍＭＥＤＴＡ）に溶解
し、０℃で保存する。なお、　Ｄａｎｅ粒子の精製には
。

３０％蔗糖を用いた１回目のゾーン遠心分離の後に塩化
セシウムによる密度勾配平衡遠心法を用いる−ことも出
来る・（Ｇｅｔｉｎ、　Ｊ、　Ｌ、、　Ｐｕｒｃｅｌｌ
、Ｒ，Ｈ，、Ｈｏｇｇａｎ。

Ｍ、　Ｄ、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ　４　（１９６９）７
６３　〕。

Ｂ型肝炎ウィつスＤＮＡを供与体としい用いる場合には
、上記のように調製したウィルスＤＮＡ溶液にＤＮＡ　
１μ２当り１．５単位の制限酵素ＢａｍＨ１を加え、さ
らに５ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ２−メルカプトエ
タノール、　　５０７１１Ｍ塩化ナトリウムを加え、３
７℃で３時間反応させる。用いるウィルｘ　ＤＮＡの量
は約２＾６である。２５ｍＭＥＤＴＡで反応停止後１等
量のフェノールを加えて５分間処理後、水層を遠心分離
する。水層に０．５　Ｍ酢酸アンモニウムと３倍量のエ
タノールを加えて一８０℃に放置し、生じたＤＮＡの沈
澱を遠心分離する。

回収したＤＮＡ断片を少量の０．３Ｍ酢酸ナトリウムに
溶解させ、３倍量のエタノールを加えて一８０℃に放置
する。生じた沈澱を遠心分離し、少量の水に溶解し２０
℃で保存し、雑種ＤＮＡ作製の材料とする。

（３）Ｂ型肝炎ウィルスＤＮＡの表面抗原遺伝子領域の
パルスチェイス法による３２Ｐ標識上記（２）で述べた
様に、Ｂ型肝炎ウィルスのゲノム中には部分的に１本鎖
ＤＮＡ領域が存在するが。

この１本鎖ＤＮＡの部分が表面抗原遺伝子の領域に相当
することが知らされている（　Ｃｈａｒｎａｙ、　Ｐ、
。

Ｍａｎｄｅｒｔ　、　Ｅ、、　Ｈａｍｐｅ　、　Ａ、、
　Ｆｉ　ｔｏｕｓｓｉ　、Ｆ、、　Ｔｉｏｌ　Ｉａ　ｉ
ｓ　、Ｐ、。

Ｇａ１ｉｂｅｒｔ　、　Ｆ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅｓ、ヱ（１９７９）　３３５　）。

そこで内在性ＤＮＡポリメラーゼの反応でこれを充填す
る際に、３２Ｐで標識した基質を用いパルスラベルし、
無標識り基質でその後チェイスすると。

表面抗原遺伝子領域が３２ｐで標識されたＢ型肝炎ウィ
ルスＤＮＡを下記の如く作製することが出来る 上記（２）で調製した２００μ２のＮＰ４０−Ｐ２画分
に。

５０μｌのヌクレオシド三リン酸混合物（０，２Ｍ）リ
ス−塩酸、ｐＨ７，５７８０ｍＭ塩化マグネシウム１０
．２３Ｍ塩化アンモニウム／各々が１ｍＭのデオキレア
デノシン三すン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオ
キシチミジン三リン酸と２００μＣｉα（３２Ｐ）デオ
キシシトシン三リン酸（２，０００〜３．０００　Ｃｉ
　／ｍｍｏｌ　）を加え、３７℃で１５分間パルス゛ラ
ベルをする。その後、０．２ｍＭデオキシシトシン三リ
ン酸を反応系に加え、３時間ＤＮＡ合成を行いチェイス
する。反応終了後に０．１％ＳＤＳを加えて５分間処理
後、１０ｍＭＥＤＴＡと１ｍ７７ｍ＃ｉＤプロテアーゼ
Ｋを加え、５６℃で２時間消化する。これ以後のウィル
スＤＮＡの抽出操作は、上記（２）と同じである。この
ように調製した２０μ形の３２Ｐ標識ウイルＸＤＮＡ溶
液に、２μｍｅのＤＮ　ａｓｅ　Ｉ（米国ＳＩＧＭＡ社
から得られる）　（１３３ｎ　Ｆｔ／ｍ１３　）を加え
て１分間反応後、１５μ沼の５００ｍＭ　Ｅ　ＤＴ　Ａ
と３００μｌのＩｍｐ／ｍＪの仔ウシ胸腺ＤＮＡと８μ
矛の１０％ＳＤＳを加え、混合物を５ｅｐｈａｄｅｘ　
Ｇ−５００カラムにチャージし、緩衝液（１０７１１Ｍ
）リス−塩酸、ｐＨ７，５７１ｍＭＥＤＴＡ）を用いて
ゲル濾過し、　　Ｐで標識されたＤＮＡ分画を集める。

このパルスチェイス法によると、Ｂ型肝炎ウィルスＤＮ
Ａの表面抗原遺伝子領域の比放射能が高く標識されるこ
とになる。

これを指標として用いれば、後に述べるようにＢ型肝炎
ウィルスの表面抗原遺伝子を含む組換え体ＤＮＡをＤＮ
Ａ−ＤＮＡハイブリダイゼーション法で特異的に検出す
ることが出来る。

（４）ベクターｐＢＲ３２２ＤＮＡとＢ型肝炎ウィルス
の表面抗原遺伝子を片側に含むＤＮＡ断片から雑種ＤＮ
Ａ分子の製造 上記（１）で得たｐ″ＢＲ３２２ＤＮＡの５０ｎ１に、
上記（２）で得たＢ型肝炎ウィルスの表面抗原遺伝子を
片側に含むＤＮＡ断片８ｎ、９−を加え２０μｐとし２
等量の０．６Ｍ酢酸ナトリウムと３倍量のエタノールを
加えて、−８０℃で放置し、生じたＤＮＡの沈澱を遠心
分離で回収し、４５μ形の再蒸留水に溶解し。

５μ！の１００倍量の緩衝液（２００ｍＭ　）リス−塩
酸。

ｐＨ７，５／１００ｍＭ塩化マグネシウム／１’ｏｏｍ
Ｍジチオスレイトール７１０ｍＭアデノシＮリン酸）を
加える。このＤＮＡ溶液に０．２４単位のＴ４ＤＮＡ　
リガーゼ（米国Ｍｉｌｅｓ社より得られる）を加え、１
０Ｃで一晩反応させて、雑種ＤＮＡ分子を作製する。

反応終了後、０℃に保存して°ＤＮＡ感染実験の試料と
する。

（５）　　ＤＮＡ感染法による表面抗原遺伝子を含む組
換え体の製造 での吸光度が０．６に到達したら、３０ｍＡを遠心分離
して菌体を沈澱させる。この菌体を３０ｍ形の０．０１
Ｍ硫酸マグネシウム溶液に懸濁し、０℃で３０分間放置
し、遠心分離を行い菌体を再沈澱させる。

この菌体を５０ｍ形の５０ｍＭ塩化カルシウム溶液に懸
濁し、０℃で１５分間放置後、遠心分離して菌体を集め
る。さらに１ｍＡの５０７ＦＩＭ塩化カルシウム溶液に
懸濁し、０℃で３０分間放置する。このカルシウム処理
した菌体を以下の実験に供する。

カルシウム処理した菌体０．１ｍ、ｅに、上記（４）の
方法で調製した雑種ＤＮＡの溶液ｏ、ｏ５ｍ−６を加え
。

０℃で４５分間放置する。さらに３７℃で２分間および
室温で１０分間放置後、７５μ沼ずつ２つに分ける。各
々に５０μ２のチミジイと５０μｍのジアミノピメリン
酸を含むＬＢ培地１ｍＡを加え、３７°Ｃで２０分間放
置する。これに別に調製した２、５ｍｎ軟加えて、予め
シャーレに作製した寒天プレート（１００ｍ、６ＬＢ培
地１５ｍＰチミジ：／　／　５　ｍ　ｆ／ジアミノヒメ
リン酸１５ｍＰアンビシリフ　／　０．４％グルコース
／１．２？寒天）上に展開する。３７℃で２４〜４８時
間培養スると、アンピシリン耐性のプラスミドを持った
コロニーが出現する。ついでアンピシリンの代りに同濃
度のテトラサイクリンを含んだ寒天プレートを作製し、
上記のコロニーを塗付し培養すると９組換え体プラスミ
ドを持つコロニーはテトラサイクリン感受性となる。

（６）表面抗原遺伝子を含む組換え体のコロニーハイブ
リダイゼーション法による検出 まず、上記（５）の方法で寒天プレート上に出現したア
ンピシリン耐性のコロニーのレプリカを別の寒天プレー
トに作り、３７℃−晩培養する。その後。

ニトロセルロース膜（西独５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎ
ｄ　Ｓｃ忍？Ｕ社より得られる）を寒天上に密着させ、
生じたコロ＝−ヲ十分移し取る。このニトロセルロース
膜を０．５Ｍ苛性ソーダで浸した３ＭＭ濾紙（英国Ｗｈ
ａｔｍａｎ社より得られる）・上にのせ、５分間アルカ
リ処理する。次いで、このアルカリ処理した膜をＩＭ）
リス−塩酸、ｐＨ７，５を浸し７’、：３ＭＭ瀘紙上に
のせ５分間中和する。さらに、１Ｍトリス−塩酸、ｐＨ
７，５７１，５Ｍ塩化ナトリウムを浸した３ＭＭ瀘紙上
に５分間のせた後、真空デシケータ中で２時間乾燥させ
、８０℃で２時間生処理する。この操作で、コロニーカ
ラニトロセルロース膜上ニ移った組換え体のプラスミド
ＤＮＡが、膜に強く結合する。この膜を６倍濃度のＳＳ
Ｃ／ＳＣ／シン溶液に浸し、６５℃で２時間処理した後
に、プラスチック袋に入れる。さらにこの袋に、９０℃
で５分間熱処理した　Ｐ７標識の表面抗原遺伝子ＤＮＡ
溶液（３００μｆｉ’サケ精子ＤＮＡ／水０．９５ｍ−
ｇ）を１，５ｍ／と。

０．７５ｍ−８の２００倍濃ＳＳＣと０．２５ｍ１のｌ
Ｏ倍濃度。

デンハルト溶液を加え９袋を閉じ、６５℃で一晩反応す
る。ハイブリダイゼーションの後、膜を袋がら取り出し
、２倍濃度のＳＳＣで３０分間１回洗滌し、　　　　　
　　　　゛　　　ついで１０分間１回洗滌し、さらに１
／１ｏ濃度のＳＳＣで室温５分間数回洗滌し、乾燥する
。以上一連の操作によって上記（５）で得られた表面抗
原遺伝子を含む組換え体プラスミドＤＮＡがこの遺伝子
と相同の塩基配列を持つ　Ｐ標識ＤＮＡと特異的にハイ
ブリダイズする。その結果、ニトロセルロース膜上に　
Ｐ標識ＤＮＡとして残存するので、これをＸ線フィル、
ム（米国Ｋｏｄａｋ社より得られる）を用いて数時間オ
ートラジオグラフィーを行えば、　Ｐ標識ＤＮＡの存在
する部分が放射線に照射され、生じた銀粒子が黒化する
ので２表面抗原遺伝子を含む組換え体ブラスミ、ドＤＮ
Ａを持つコロニーの所在がコロニーハイブリダイゼーシ
ョン陽性として検出される。上記の実験操作をコロニー
ハイブリダイゼーション法と称する。なお実験操作に用
いられた一８ＳＣとは、その組成が０．１５Ｍ塩化ナト
リウム１０．０１５Ｍクエ！酸ナトリウム溶液である。

またデンハルト溶液とは、その組成が０．２％フィコー
ル１０．２％ウシ血清アルブミン７０．２％ポリビニル
ピロリドン１５％ＳＤＳの溶液である。

（７）表面抗原遺伝子を含む組換え体ＤＮＡの抽出と挿
入された遺伝子ＤＮＡの構造解析 上記（６）の方法で陽性と判定した大腸菌の大量培養を
行い２組換え体中に挿入された表面抗原遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を分離し、その塩基配列をＭａｘａｍ−Ｇｉ１
％ｅｒｔ法により決定しｋ。ハイブリダイゼーション陽
性のコロニーから菌体を少量かきとり、　２０ｍ−６の
ＬＢ−培地にｉｍｙチミジンと１ｍＰジアミノピメリン
酸を加えた培地で、３７％℃で一晩培養し、翌朝その２
０ｍ、、ｅを上記と同じ組成の培地２ｐに移植し、３７
℃で振盪培養する。これ以降は上記（１）の方法に従い
組換え体ＤＮＡを製造し、ＤＮＡの塩基配列を解析する
材料とする。

緩衝液に溶解した組換え体ＤＮＡ１μｍ当り各々１．５
単位の制限酵素Ｈｉｎｄ　ｌとＳａｌ　ｌを加え、さら
に５０７７１Ｍ塩化ナトリウムと１０ｍＭ塩化マグネシ
ウムを加え、３７℃で３時間反応させる。２５７ｎＭＥ
Ｄ−ＴＡを加え反応停止後、　５ｈａｒｐらの方法に従
い。

０．５μｆ／ｍ−ｅエチジウムプロミドを含む１％寒天
ゲルを用い、８０ｖで３時間の電気泳動を行うと、ＤＮ
Ａ断片のサイズに従い、紫外線下で螢光を発する２本の
ＤＮＡバンド、即ち約３．７４キロ塩基（ｋｂ）のベク
ターｐＢＲ３２２ＤＮＡと約１゜６２　ｋｂの表面抗原
遺伝子の両端にｐＢＲ３２２ＤＮＡの一部を含むＤＮＡ
断片に分離する。この表面抗原遺伝子を含むＤＮＡのバ
ンドを切り出し、０．５Ｍ酢酸アンモニウム１０．１％
ＳＤＳ／１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液テホモシナイスシてＤＮ
Ａを抽出する。抽出液に３倍量のエタノールを加え、−
８０℃で放置しＤＮＡを沈澱させ、遠心分離して回収す
る。なお、電気泳動に用し）る緩衝液は４０ｍＭ）リス
−塩酸、　ｐＨ８，７７２０ｍＭ酢酸ナトリｆｙ　ム／
２０ｍＭＥＤＴＡでｏ、ｓＹｙ／ｍノエチジウムブロミ
ドを含んでいる。ちなみに、制限酵素−ＢａｍＨｌで完
全分解すると、約４．３６　ｋｂのベクターｐＢＲ３２
２ＤＮＡと約１ｋｂの表面抗原遺伝子を含んだ肝炎ウィ
ルスＤＮＡにのみ由−来するＤＮＡ断片に分離する。

上記のように、制限酵素Ｈｉｎｄ置とＳａｌ　ｌで切り
その結果１表面抗原遺伝子を含む組換え体ＤＮＡの中で
９表面抗原遺伝子とベクターとして用いたｐＢＲ３２２
Ｄ　Ｎ　Ａの結合部位が明らかとなる。　さらに得られ
４た塩基配列にもとづき表面抗原のアミノ酸配列を決定
すると２組換え体に挿入された表面抗原遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片の片側に表面抗原遺伝子が位置することが明ら
かとなる。

ついで、上記で得た表面抗原遺伝子を含む組換え体ＤＮ
Ａを別の制限酵素Ｔａｑ　Ｉで切断畝表面抗原遺伝子を
内部に含む小さいＤＮＡ断片を分離し、このＤＮＡ断片
をβ−ラクタマーゼ遺伝子を持つベクターｐＢＲ３２２
Ｄ　Ｎ　Ａのβ−ラクタマーゼの遺伝子内、即ちプロモ
ータの下流に制限酵素ＰｓｔＩの切断部位を介して接続
し、Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原を合成する新規な組換
え体を作製する。

（８）表面抗原を合成する新規な組換え体に用いるベク
ターＤＮＡの作製 上記（１）の方法に従いベクターとして用いるｐＢＲ３
２２Ｄ　Ｎ　Ａを調製し、このｐＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａ
が持っているβ−ラクタマーゼ遺伝子のプロモータの下
流を制限酵素Ｐｓｔ　Ｉで切断し断片とする。生じた１
本鎖ＤＮＡの末端部分をＢｏｌｉｖａｒ−Ｂａｃｋｍａ
ｎの方法（Ｂｏｌｉｖａｒ、Ｆ、、Ｂａｃｋｍａｎ、に
、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

６Ｊ　（１９７９）　２４５．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐ
ｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）を用い以下のように
５１ヌクレアーゼで処理して取り除き平らにする。上記
で得たＤＮＡ断片３μｍを５０μ！の５０ｍＭ酢酸ナト
リウム緩衝液、　ｐＨ４，２（１５０７１ｔＭ塩化Ｊ−
）　！Ｊウム／６ｍＭ塩化亜鉛）に溶がし、３単位の８
１ヌクレアーゼ（米国ＳＩＧＭＡ社より得られる）を加
え、２０℃で５分間反応させる。

反応後に２μ形の５００ｍＭＥＤＴＡと等量のフェノー
ルを加え５分間処理後、水層を遠心分離する。水層に０
．５Ｍ酢酸アンモニウムと３倍量のエタノ−ルを加えて
、−８０℃に放置し、生じたＤＮＡの沈澱を遠心分離す
る。その後、上記（１）で用いたＵｌｌｒ−ｉｃｈらの
方法に従いＳｌヌクレアーゼ処理したＤＮＡ断片の５′
末端のリン酸をアルカリフォスファターゼそ取り除き、
それ自身が環状化できないＤＮＡ断片とする。

（９）表面抗原を合成する新規な組換え体の製造のため
１組換え体ＤＮＡよりの表面抗原遺伝子を内部に含むＤ
ＮＡ断片の作製 上記（７）で示したように１組換え体ＤＮＡより表面抗
原遺伝子を内部に含むＤＮＡ断片を、別の制限酵素Ｔａ
ｑ　Ｉで切り出し、１９６寒天ゲル電気泳動法によりそ
の表面抗原遺伝子を内部に含む約０．６６ｋｂのＤＮＡ
断片を分離し２回収する。っ５ｓで以下に述べるように
７４ＤＮＡポリメラーゼを用いたＢｏｌｉｖａｒ−Ｂ￥
ｃｋｍａｎの方法に従い、ここで得たＤＮＡ断片の末端
の１本鎖ＤＮＡ部分を充填し２本鎖ＤＮＡとする。制限
酵素Ｔａｑ　Ｉで得られたＤＮＡ断片５叶を１８μ影の
緩衝液（６６ｍＭ　）！Ｊスス−酸。

ｐＨ８，６／６．７ｍＭ塩化マグネシウム／１６．６ｍ
Ｍ硫酸アンモニウム／１０ｍＭ２−メルカプトエタノー
ル１５μ？ウシ血清アルブミン）に溶かし、　２０μＭ
のデオキシヌクレオシドゝ（１ン酸と８単位のＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼを加え、１１℃で４時間反応させる。

反応後に等量のフェノールを加え５分間処理し。

水層を遠心分離する。水層に０．５　Ｍ酢酸アンモニウ
ムと３倍量エタノールを加えて一８０℃に放置し。

生じたＤＮＡの沈澱を遠心分離する。

（１０）表面抗原を合成する新規な組換え体の製造のた
めβ−ラクタマーゼ遺伝子部位を切断しにベクターＤＮ
Ａと表面抗原遺伝子を内部に含むＤＮＡ断片からの雑種
ＤＮＡ分子の製造 上記（８）で作製したベクターｐＢＲ３２２ＤＮＡ　０
．２μノ１０倍濃度の緩衝液を加える。このＤＮＡ溶液
に６単位のＴ４ＤＮＡ’）ガーゼを加え、１０℃で一晩
反応させ、雑種ＤＮＡ分子を作製する。反応終了後。

０℃に保存し、ＤＮＡ感染実験の試料とする。

（１１）　　Ｄ　Ｎ　Ａ感染法による表面抗原を合成す
る新１７７６株を培養し、カルシウム処理した菌体０．
１ｍ、６に、上記（１ので作製し、？’、＝ＤＮＡ溶液
ｏ、ｏｓｍ、ｇを加え、軟寒天を用いて寒天プレート上
に展開する。

３７℃で培養後、アンピシリン感受性でテトラサイタリ
ン耐性のプラスミドを持った大腸菌のコロニーを選別す
ると、その中に表面抗原を合成する新規な組換え体が得
られる。

（１２）表面抗原を合成する新規な組換え体ＤＮＡの確
認 まず、上記（６）の方法に従い、上記（４）で作製した
３２ｐ標ｉ表面抗原遺伝子ＤＮＡを指標にし、コロニー
ハイプリタイゼーションを行い、上記（１１）で寒天プ
レート上に出現しん新規な組換え体を持つ大腸菌のコロ
ニーをハイブリダイゼーション陽性として検出する。つ
いで９表面抗原遺伝子を含むと判定された新規な組換え
体を持つ大腸菌を、上記（１）の方法で大規模に液体培
養し、目的とする新規な組換え体ＤＮＡを製造する。上
記（７）と同様の方法で新規な組換え体ＤＮＡ溶液にＤ
ＮＡ１μｍ当り１．５単位の制限酵素Ｔａｑ　Ｉを加え
て分解し、１％寒天ゲル電気泳動法により９表面抗原遺
伝子をその結果１表面抗原遺伝子ＤＮＡとベクターとし
て用いたｐＢＲ３２２ＤＮＡの結合様式が明らかとなり
、β−ラクタマーゼ遺伝子のプロモータの下流にＢ型肝
炎ウィルスの表面抗原遺伝子が正しく接続した表面抗原
を合成する新規な組換え体であることが確認される。

（１３）大腸菌で合成されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原
の免疫スクリーニング法に゛よる検出上記（１２）で新
規な組゛換え体を持つと確認した大腸菌を、上記（１）
の方法に従い２０ｍＡのＬＢ−培地（１ｍ１チミジンと
１ｍ？ジアミノピメリン酸を含む）で３７℃−晩培養し
、翌朝に培養菌体を遠心分離する。以下に述べるように
まず、　Ｒｏｂｅｒｔｓ法（Ｒｏ−ｂｅｒ′Ｖ：Ｊ、　
Ｗ、、　Ｒｏｂｅｒｔｓ　、　Ｃ，Ｗ、、　Ｐ　ＮＡ　
Ｓ　７２　（１９７５）　１４７）で菌体より可溶画分
を抽出し希釈し、ついでオースリアＩＩ　−１２５ラジ
オイムノアツセイ用試薬七ツト（米国Ａｂｂｏｔｔ社よ
り得られる）を用いた免疫スクリーニング法で検討する
。

遠心分離した菌体を、２５０μ２の緩衝液（０，０１Ｍ
　トリス−塩酸、ｐＨ７，９７５ｍＭ塩化マグネシウム
１０．１ｍＭＥＤＴＡ１０．１ｍＭジチオスＬ／イトー
ル１０．ｏｓＭ塩化カリウム／１．５ｍｐリゾチーム）
に懸濁し、凍結融解を５回繰り返す。その後、５００μ
ｌの緩衝液（０，０１Ｍ）リス−塩酸、ｐＨ７，９７０
，０１Ｍ塩化マグ・ネシウム１０．１ｍＭＥＤＴＡ１０
．１ｍＭＤＴＴ１０．０１Ｍ塩化カリウム１５％グリセ
リン／１μｉ％ＤＮａｓｅＩ１０．５μｉ　ＲＮ　ａｓ
ｅ　Ａ　）を加え、室温３０分間反応させ。

２７．０００ｙ−で３０分間遠心し、上清（可溶画分）
を分離する。ここで得た可溶画分を２倍、５倍、１０倍
に蒸留水で希釈しラジオイムノアッセイの検体とする。

各々の検体２００μ２に抗体ビーズ１個を加え。

４５℃で２時間反応させる。反発後液を除去しビーズを
蒸留水５ｍ−ｅで洗滌し、　　■で標識した表面水５ｍ
ノで２回洗滌する。最後に、ビーズに結合した１２５Ｉ
抗体の放射能を測定し９表面抗原が合成されていること
を確認する。以上の実験結果からＢ型肝炎ウィルスの表
面抗原遺伝子を含む新規な組換え体が１表面抗原を合成
することが証明された。

手　　続　　補　　正　　書 昭和３ｇ年−月２２日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 １、事件の表示 昭和５６年特許願第１１６９７１号 ２、発明の名称 Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原を合成する新規な組換え体
及びその製法 ３、補正をする者 ４、代理人 住所　郵便番号　／７１ ５、補正命令の日付 自発補正 ６、補正の対象 願書 ７、補正の内容 （１）願書の適用法規を示す肩書の箇所に「（特肝法第
３ｇ条ただし書の規定による特許出願）」を加入します
。

（２）願書の発明の名称の欄と発明者の欄の間に「２、
特許請求の範囲に記載された発明の数」の欄を設け、発
明の数２を加入します０ （３）願書の「２１発明者、」を「３１発明者」と訂正
、「３．特許出願人」を「４．特許出願人」と訂正、「
４１代理人」を「５１代理人」と訂正、「５゜添附書類
の目録」を「６．添附書類の目録」と訂正、「６．前記
以外の発明者」を「７．前記以外の発明者」と訂正しま
す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＤＮＡ供与体としてのＢ型肝炎ウィルスＤＮＡの
   表面抗原遺伝子を含むＤＮＡ断片を代謝酵素遺伝子をも
   つベクターＤＮＡの代謝酵素遺伝子内に挿入した表面抗
   原を合成する新規な組換え体。
2. （２）　Ｄ　Ｎ　Ａ供与体としてのＢ型肝炎ウィルスＤ
   ＮＡがＢ型肝炎ウィルスの感染した患者の血清。 組織、細胞などのＤＮＡである特許請求の範囲第１項記
   載の新規な組換え体。
3. （３）　Ｄ　Ｎ　Ａ供す一体としてのＢ型肝炎ウィルス
   ＤＮＡを制限酵素で切断して表面抗原遺伝子を片側に含
   むＤＮＡ断片を分離し、このＤＮＡ断片をベクターＤＮ
   Ａに挿入して組換え体をつくり、この組換え体ＤＮＡと
   別の制限酵素で切断して表面抗原遺伝子を内部に含むＤ
   ＮＡ断片を分離し、このＤＮＡ断片を代謝酵素遺伝子を
   もつベクターＤＮＡの代謝酵素遺伝子内に挿入すること
   を特−徴とする。Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原を合成す
   る新規な組換え体の製法。
4. （４）　Ｄ　Ｎ　Ａ供与体としてのＢ型肝炎ウィルスＤ
   ＮＡがＢ型肝炎ウィルスの感染した患者の血清。 組織、細胞などのＤＮＡである特許請求の範囲第３項記
   載の新規な組換え体の製法。