JP2554612B2 - 相補肝炎ａウイルスゲノムを含有している雑種ｄｎａの調製法、該雑種ｄｎａ、これを含有するプラスミドベクタ−、雑種ｄｎａによって発現されたウイルス特異蛋白質およびこれから調製され、これらを含有するワクチン - Google Patents

相補肝炎ａウイルスゲノムを含有している雑種ｄｎａの調製法、該雑種ｄｎａ、これを含有するプラスミドベクタ−、雑種ｄｎａによって発現されたウイルス特異蛋白質およびこれから調製され、これらを含有するワクチン

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Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、肝炎Ａウイルス（HAV）に特異な相補ゲ
ノムを含有する雑種（ハイブリツド）DNAの調製法、こ
の方法で調製された雑種DNA、これを含有するプラスミ
ドベクター、細菌クローン中で発現された雑種蛋白質ま
たは蛋白質、生物学的試料中の肝炎Ａウイルスを同定す
るための該雑種DNAの使用、これらから誘導される、ま
たは雑種DNAのヌクレオチド配列に従つて調製される雑
種蛋白質または蛋白質を含有するワクチンに関する。
肝炎Ａは公衆衛生の見地から、依然として極めて重要
な疾患であり、その病因は極く最近みつかつたばかりで
ある。失われる人時は長く、病院経費（例えば患者の隔
離のための）は高い。受動ワクチン、より良好でもつと
一般的には活性ワクチンを予防接種することが、健康管
理上、および経済的に非常に有益である。この目的を達
成するため、ａ）科学的研究用として、およびｂ）免疫
用にウイルス抗原を使用し得る様にするため、この病気
の病因である肝炎Ａウイルス（HAV）を多量入手する必
要がある。しかしながら、現在の所、それは不可能であ
る。ウイルス粒子の十分な生化学的ウイルス学的研究を
行なうのに必要な量のウイルス材料さえ入手することが
できない。
肝炎Ａは、1967〜1970年に初めてヒト以外の霊長動物
に伝染された（Deinhardt,F.による総説が発行されてい
る（Advances in Virus Research,20113、発行者:F.B.B
ang、Academic Press,New York））。次いで1973年、Fe
instoneらは、急性相の患者の糞便中に、免疫電子顕微
鏡によつてウイルス粒子を確認した（Feinstone,S.M.,
A.Z.KapikianおよびR.H.Purcell,Science 182 1026,197
3年）。
肝炎Ａウイルス（HAV）の生物物理的および生物化学
的性質はProvostら（P.H.Provost,B.S.Wolanski,W.J.Mi
ller,O.L.Ittensohn,W.J.McAleerおよびM.R.Hilleman,P
roc.Soc.Exp.Biol.Med.148（1975）,532）、Sieglおよ
びFrsner（G.SieglおよびG.G.Frsner,J.Virol.26
（1978）40および48）、Coulepisら（A.G.Coulepis,S.
A.Locarnini,A.A.Ferris,N.I.LehmannおよびI.D.Gust.I
ntervirology 10（1978）24、およびA.G.Coulepis,S.A.
LocarniniおよびI.D.Gust,J.Virol.35（1980）572）、B
radleyら（D.W.Bradley,C.L.Hornbeck,E.H.Cookおよび
J.E.Maynard,J.Virol.22（1978）228、およびD.W.Bradl
ey,H.A.Fields,K.A.Mc Caustland,E.H.Cook,C.R.Gravel
leおよびJ.E.Maynard,J.Med.Virol.２（1978）175）、F
einstoneら（S.M.Feinstone,Y.Moritsugu,J.W.K.Shih,
J.L.GerinおよびR.H.Purcell,“Viral Hepatitis"、発
行:G.N.Vyas,S.N.CohenおよびR.Schmidt,Abacus Press,
Turnbridge Wells,1979,41頁）、MaynardおよびBradley
（J.E.MaynardおよびD.W.Bradley,1980,“Virus and th
e Liver"、発行:L.Bianchi,W.Gerock,K.Sickingerおよ
びA.Stadler（MTP Press Ltd.,Lancaster,9頁））およ
びTratschinら（J.D.Tratschin,G.Diegl,G.G.Frsner
およびF.Deinhard,1981,J.Virol.印刷）らによつて測定
され、現在では、HAVは腸内ウイルスの特徴を大部分持
つているピコルナウイルスであると一般に認められてい
る。
HAVのゲノムは１本鎖の、鎖状RNAであり（多分、３′
末端にポリ（Ａ）を持つている）、分子量は2.25〜2.8
×106ダルトン、沈降係数は32.5〜33Sであり、これは、
ポリオウイルスと比較して約6,500ヌクレオチドに相当
する。HAVのゲノム地図および遺伝子の発現については
知られていない。HAV蛋白質の遺伝子生成物の構造およ
びその抗原性についてはほとんどわかつていない。
最近、HAVは細胞培養で増殖されたが（P.H.Provostお
よびM.R.Hilleman,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.160（1979）
231、G.G.Frsner,F.Deinhardt,R.Scheid,V.Gauss−Ｍ
ller,N.Holmes,V.Messelberger,G.SieglおよびI.J.Al
exander,Infection ７（1979）303、B.Flehmig,Mnch.
Med.Wschr.119（1977）825およびF.Deinhardt,R.Schei
d,V.Gauss−Ｍller,G.G.FrsnerおよびG.Siegl,Prog
r.Med.Virol.27（1981）印刷）、感染した細胞は何ら細
胞変性効果（CPE）を示さなかつた。即ち、細胞はウイ
ルス感染によつて破壊されず、ウイルス粒子は放出され
ない。しかし組織培養での増殖期間は非常に長く、収量
は比較的低く、しかもウイルスが培養細胞から放出され
ないので細胞を人工的に溶解してウイルスを得なければ
ならず、この間、細胞物質で汚染される危険性が極めて
高いので、非常に制限される。この様な培養からHAVを
精製することは、感染した細胞を溶解して破壊しなけれ
ばならず、そして細胞の残骸から分離しなければならな
いので、複雑である。
従つて、HAVに対して免疫させる効果を持つたHAV抗原
を調製するに十分な量の、HAVの純粋なウイルス材料を
得る必要がある。
この発明は、肝炎Ａウイルスに特異な相補ゲノムを含
有する雑種DNA、雑種DNAを含有しているプラスミドベク
ター、およびHAVに特異な抗原性を持つたHAV特異蛋白質
および雑種蛋白質を、多量に、簡単に調製することを目
的とするものである。この目的、および以下の明細書中
に記載したその他の課題は、本発明によつて解決され
た。
従つて、本発明は、肝炎ＡウイルスのウイルスRNAの
逆転写によつて誘導される２本鎖DNAを細菌プラスミド
にクローンすることを特徴とする、肝炎Ａウイルスに特
異な相補ゲノムを含有する雑種DNAの調製法に関する。
本発明はまた、肝炎ＡウイルスのRNAに相補的なある
制限フラグメントを持つた２本鎖雑種DNA分子に関す
る。
本発明は更に、これらの雑種DNA分子を含有する形質
転換細菌およびプラスミドベクターに関する。
また、本発明は肝炎Ａウイルスに対する免疫作用を持
つた蛋白質フラグメントを含有する蛋白質の製造方法、
これらの蛋白質または雑種蛋白質、およびこれらを含有
するワクチンに関する。
最後に、本発明は肝炎Ａウイルスに特異なRNA配列の
存在を検出するための該雑種DNAの使用に関する。
本発明によれば、HAVゲノムを、相補DNA（cDNA）の形
で細菌プラスミドにクローンし（組み込み）、この細菌
クローンを増殖させ、このゲノムを複製し、個々の遺伝
子を発現させてHAV特異抗原性を持つたウイルス蛋白質
の部分的なあるいは完全な生産を行わせる。その操作は
次の通りである。
糞便から得た肝炎Ａウイルス（HAV）を十分に精製し
た。AMV逆転写酵素を使つてゲノムRNAをcDNAに転写し、
次いでこのDNAをプラスミドpBR322のPst Iサイトにクロ
ーンし、テトラサイクリンの存在下でクローンを選択し
た。大部分のクローンは、ヒト肝細胞癌由来のHAV感染
細胞培養から予め単離したHAV特異RNAと雑種形成する挿
入物（inserts）をプラスミド中に含んでいた。クロー
ンのあるものは種々の量のウイルス抗原を発現してい
た。これはHAVに対する免疫に使用することができる。
この方法は、工業的規模で、細菌懸濁液として得られ
るウイルス物質をほとんど無限に生産し得る点で有利で
ある。また、ウイルス物質、即ち免疫に必要なウイルス
抗原蛋白質だけを特異的に生産し、異質な物質として生
産コストを増大させるその他のウイルス物質を生産しな
いこともこの方法の利点である。就中、このクローニン
グの方法の利点は、異質物質としての、生産コストを上
げる感染性物質（ウイルスゲノム）を生産しないことで
ある。即ち、この異質物質は分離したり、精製して除去
したりするのに非常に経費がかかる。細菌にはウイルス
抗原の遺伝情報が固定されて残り、細菌はこの免疫性の
物質だけを生産する。
本発明によつて調製される新規な雑種DNAは、種々の
分野で好適に使用することができる。例えば診断の目的
で、臨床試料中にHAVが存在するかどうかを日常的に調
査することができる。例えば、既知の方法により、放射
活性物質で標識した雑種DNA分子をこの目的に使用する
ことができ、また発現した蛋白質を使用することができ
る。
本発明方法によつて得られる、ゲノム中に本発明に係
る雑種DNAを含んでいる新規なプラスミドベクターは、
細菌中で発現させることができ、かくして遊離のまたは
雑種蛋白質の形でHAV特異蛋白質を生産することができ
る。この（雑種）蛋白質はHAV抗原を含んでおり、肝炎
Ａに対するワクチンの製造に使用することができる。
添付の図面を参照しながら本発明を更に詳細に説明す
る。
第１図：挿入したDNAの大きさ 単一の細菌クローンを増殖させ、プラスミドを調製し
た。プラスミドの大きさは電気泳動法により、１％アガ
ロースゲル上で測定し、UV光下で観察される帯をエチジ
ウムブロミドで発色させた。写真２および３はDNA挿入
物を持つた２個の典型的なプラスミドを示しており、写
真１および４は挿入物を含まない対照プラスミドpBR322
を示している。
第２図:32p標識HAVRNAとプラスミド挿入物との雑種形成 クローンを、GrunsteinおよびHogness（前記）の方法
に従つて、寒天上のニトロセルロースフイルター上で増
殖させた。HAV感染PLC/PRF5細胞（Alexanderら、1978
年、前記）から得、P32で標識したHAV特異RNAを、ニト
ロセルロースフイルター上で増殖した細菌クローンと雑
種形成させた。Ａ）はHAV特異RNAで雑種形成させた後
の、増殖クローンを含む３枚のフイルターのオートラジ
オグラフイー、Ｂ）はこれらの３枚のフイルターを模式
的に表わしたものである。右側の底部の矢印は、挿入物
のないpBR322DNAを含む対照コロニーを示している（●
のクローン：雑種形成陽性、○のクローン：雑種形成陰
性）。
第３図： 単一の細菌クローンの種々の量のウオータ−シヨツク
溶解質をHAV放射免疫分析にかけた。Ａ）は抗−HAV−陽
性ヒト血清で被覆したビーズと共に放射免疫分析したも
のであり、Ｂ）は抗−HAV−陰性ヒト血清で被覆したビ
ーズと共に放射免疫分析したものである。
この分析のため、４日後典型的な肝炎Ａを示した患者
から得た大便からHAV粒子を調製した。粒子の全収量は
ほぼ、約10〜20μｇのウイルスマスに相当するものであ
つた。この粒子から抽出したRNAを、鳥類骨髄芽球腫ウ
イルス（AMV）の逆転写酵素を用いてcDNAに転写した。
ゲル電気泳動によりdcDNAを分析した結果、約800〜1000
ヌクレオチドに主集団を有する、異質サイズのDNA約10
〜50ngが得られた。このDNAを、プラスミドpBR322のPst
I制限サイトにクローンした。次いでこの雑種プラスミ
ドでE.coli×1776を形質転換し、テトラサイクリンの存
在下でクローンを選択した。クローンしたプラスミドを
分析した結果、多くのものは300〜800ヌクレオチドの範
囲にDNA挿入物（第１図）を含んでいた。
このDNA挿入物がHAVに特異なヌクレオチド配列を含ん
でいるかどうかを調べるために、この再結合プラスミド
をHAV特異32P標識RNAと雑種形成させた。このRNA試料
は、非ウイルス性RNAで汚染されることによつて誤まつ
た結果が得られない様に、異なつたソース、即ち転写に
使用された糞便から導かれたもとの（起原）ウイルスRN
AのHAV感染細胞培養から得た。挿入物を含む大部分のク
ローンはこのHAVRNAと雑種形成した（第２図）。
細菌をウオーターシヨツク溶菌した後、細菌クローン
の抗原発現を分析し（Villa−Komaroffら、前記）、こ
のシヨツク液を固相放射免疫分析で、HAV抗原について
試験した（HAVAB by Abbott Laboratories,北シカゴ、U
SA）。２個のクローンが陽性であつた。即ち、これらは
陰性バツクグラウンドの２〜３倍のレベルで反応した。
シヨツク液の量を２、20および200mlと増やすと、比例
して放射免疫分析における放射活性量が増大した。
これらの結果を実証するために、HAV陰性血清で被覆
した固相（ビーズ）を使つて放射免疫分析を行なつた。
第３図Ｂは、この条件下ではシヨツク液は反応しなかつ
たことを示しており、このことは、HAV特異ポリペプチ
ドがクローン22および29で発現されることを示すもう１
つの証拠である。
この現存するクローンは、HAV感染細胞培養のRNAを使
つて、さらにcDNAを生産するためのプライマーおよび雑
種形成プローブとして使用することができる。
ウイルス粒子の精製 G.Sieglらの方法で、HAV粒子を凍結糞便25gから精製
した（G.SieglおよびG.G.Frsner,J.Virol.26、40およ
び48、1978）。粒子を糞便から手短かに抽出し、大部分
の無関係の蛋白質を吸着させるために、30％サツカロー
スの緩衝物を表面に持つた予め調製したCsCl密度こう配
法（密度:1.25〜1.50g/ml、平均密度1.35g/ml）上でバ
ンド化し、サツカロースこう配上、速度遠心法により、
1.34g/mlの密度を持つたフラクシヨンをバンド化した。
Abbott Laboratories（北シカゴ）のHAVAB試験キツトを
用いて、固相の標準放射免疫分析（G.G.Frsner,Mnc
h.med.Wschr.119 825,1977）で試験した、HAV抗原−陽
性フラクシヨンを集め、上記の方法と同様にして、CsCl
密度こう配法で再びバンド化した。この遠心分離からの
粒子の全収量は125I−標識抗−HAVの107cpmであつた。
これはほぼ、ウイルスマス10〜20μｇに相当する。
相補DNA（cDNA）の合成 グアニジンロダニド法（A.Ullrich,J.Shine,R.Chirgi
vin,E.Pictet,W.J.RutterおよびH.M.Goodman,Science 1
96 1313,1977）により、粒子からRNAを抽出し、RNase
活性のないことを確めた。鳥類骨髄芽球腫ウイルスの逆
転写酵素100単位（Boehringer,Mannheim）を用いて、プ
ライマーとしてのオリゴ（dT）12〜18、8mMのMgAc2、0.
01％のNP−40(R)、デオキシアデノシントリホスフエー
ト（dATP）、デオキシグアニジントリホスフエート（dG
TP）、デオキシチミジントリホスフエート（dTTP）各1m
M、0.2mMのデオキシシチジントリホスフエート（dCTP）
および放射活性ヌクレオチド前駆体（MEN）としての32P
−dCTP0.5mCiの存在下、42℃で２時間、これを転写し
た。全インキユベーシヨン混合物を１分間80℃で加熱
し、急冷し、２本鎖合成の為に再び50単位の逆転写酵素
を添加し、この混合物を30℃で２時間インキユベートし
た。ゲル電気泳動で相補DNA（cDNA）を分析すると、数
百〜２千のヌクレオチド、大部分が約800〜1000のヌク
レオチド範囲の不均質サイズのDNAが約10〜50ng得られ
たことがわかつた。
cDNAのプラスミドへのクローニング ターミナルトランスフエラーゼ（P.−L.Biochemicals
Inc.,Milwaukee）を用い、このDNAの３′−末端をデオ
キシシチジン（T.NelsonおよびD.Brutlag,Methods of E
nzymology,68,41（1979）、発行:R.Wu,Academic Press,
New York）でテイリングし、これを、Pst I制限酵素で
開裂し次いでその３′末端をデオキシグアニジン（dG）
ホモポリマー（NelsonおよびBrutlag、前記）でテイリ
ングしたプラスミドpBR322DNAと交雑（雑種形成）させ
た。このハイブリツドプラスミドによつてE.coli×1776
を形質転換し、テトラサイクリン（12μg/ml）の存在
下、Ｌ−ブロス中でクローンを選択した（H.M.Goodman
およびR.J.MacDonalt,Methods of Enzymology,68 75
（1979）、発行:R.Wu,Academic Press,New York）。
プラスミド挿入物の分析 M.V.Norgardらの方法に従い、単一の細菌クローンを
ウリジンの存在下で100μまで増殖させ（M.V.Norgar
d,K.EmingholzおよびJ.Monahan,J.Bact.,138,270（197
9））、トリトンＸ−100(R)で溶菌させ、次いでエチジ
ウムブロミドの存在下でCsCl密度遠心分離にかけること
によりプラスミドを調製した（Villa−Komaroff,L.,A.E
fstradiadis,S.Broome,P.Lomedico,R.Tizard,S.P.Nabe
r,W.L.ChickおよびW.Gilbert,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
75 3727（1978）およびF.BoliverおよびK.Backman,Met
hods of Enzymology,68 245（1979），発行:R.Wu,Acad
emic Press,New York）．プラスミドの大きさを１％ア
ガロースゲル上、電気泳動によつて分析し、バンドを既
知サイズのDNA挿入物を持つたプラスミドマーカーと比
較した。
HAVRNAのプラスミドDNAへの交雑 G.M.Grundsteinらの方法に従つて、単一の細菌クロー
ンを寒天上のニトロセルロースフイルター上で増殖させ
た（G.M.GrundsteinおよびD.S.Hogness、Proc.Natl.Aca
d.Sci.,USA,72 3961,（1975））。HAV−特異RNAをHAV
−感染PLC/PRF5細胞から誘導した（J.Alexander,G.Macn
ab,R.Saunders,Perspectives in Virology,10 103（19
78）、発行:M.Pollard,Raven Press,New York）。HAVで
感染させて４週間後（Frsnerら（1979）、前記、およ
びDeinhardtら（1981）、前記）、細胞を12時間燐酸塩
欠乏にし、次いで32PO4（NEN;1Ci/ml、担体なし）で24
時間標識化して溶菌した。HAV粒子をCsCl密度遠心分離
により精製した。HAV放射免疫分析で陽性反応を示したH
AVの密度（1.34g/ml）を有するバンドをフエノールで処
理し、このRNA（100,000cpm/フイルター）を、50％ホル
ムアミド中、5XSSC、40℃で15時間、ニトロセルロース
フイルター上で増殖させた細菌クローンに交雑させた。
各フイルターは、挿入物を含んでいない、プラスミドpB
R322を持つた陰性の対照クローンを含んでいた。
雑種DNAの配列 エンドデオキシリボヌクレアーゼPst Iを使つてプラ
スミドベクターから雑種DNAを開裂させ、A.M.Maxamらの
方法に従つてそのヌクレオチド配列を決定した（A.M.Ma
xamおよびWalter Gilbert,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,74
560（1977）またはF.Sanger,S.NicklenおよびA.R.Cou
lson,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,74 5463（1977））。
必要とされるだけの多くの異なつた隔離した、重複して
いるクローンを使つて、HAVゲノムの連続ヌクレオチド
配列を決定する。
HAV抗原の発現 懸濁液250ml中、光学密度（O.D.）が0.8になるまで単
一の細菌クローンを増殖させ、その2,20および200mlを
遠心分離した。Villa−Komaroffら（1978、前記）の方
法に従つて、ペレツト化した細菌を水で溶菌させ、ウオ
ータ−シヨツク液300μをとり、固相HAV放射免疫分析
（前記参照）により、HAV抗原について試験した。この
放射免疫分析に使用されるポリスチレンビーズを抗−HA
V−陰性血清で被覆し、対照として使用した。
抗−HAVペプチドおよびその抗体 HAV抗原のアミノ酸配列をHAVゲノムのヌクレオチド配
列から計算し、９〜15アミノ酸の長さを持つたオリゴペ
プチドを抗原エピトープから合成した。これらのオリゴ
ペプチドを非免疫性担体蛋白質（例えばKLH）とカツプ
リングさせ、この複合体を、実験動物に於いて、直接免
疫にあるいはHAV抗原に対する抗体を産生させるのに使
用した。
このHAV−特異ハイブリツドDNAを、天然の弱毒化と等
価の人工的突然変異を生産するのに使用し、弱毒化抗原
を製造することもできる（これらは、RNAの生化学的性
質のため、RNAゲノムで行なうことはできない）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 999999999 ダインハルト，フリードリヒ ドイツ連邦共和国デー−8000ミュンヘン 90、ヘルミネ−ブラント−シュトラーセ ９番 (72)発明者 フオン・デル・ヘルム・クラウス ドイツ連邦共和国デ−−8034ゲメリン ク・グラ−ツエルシユトラ−セ33番 (72)発明者 ヴインナツカ−・エルンスト−エル ドイツ連邦共和国デ−−8000ミユンヘン 19エルフイラシユトラ−セ４番 (72)発明者 ダインハルト・フリ−ドリヒ ドイツ連邦共和国デ−−8000ミユンヘン 90ヘルミネ−ブラント−シユトラ−セ９ 番 (56)参考文献 特開 昭56−2998（ＪＰ，Ａ) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ，Ｖｏｌ．37，Ｎｏ．１（Ｊａｎ. 1981）Ｐ．473〜477 (54)【発明の名称】 相補肝炎Ａウイルスゲノムを含有している雑種ＤＮＡの調製法、該雑種ＤＮＡ、これを含有する プラスミドベクタ−、雑種ＤＮＡによって発現されたウイルス特異蛋白質およびこれから調製さ れ、これらを含有するワクチン

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ａ）肝炎Ａウイルス（HAV）のウイルスRNA
    の逆転写によってcDNAを調製し、それを大腸菌プラスミ
    ドにクローニングし、 ｂ）該大腸菌プラスミドによって細菌を形質転換し、そ
    して ｃ）放射免疫分析において陰性バックグラウンドの２〜
    ３倍のレベルで反応するクローンを選択することで、HA
    V陽性クローンを選択する、 ことによって得られるハイブリダイゼーションプローブ
    を使用することによりサンプル中のHAVを検出する方法
    であって、サンプル中のHAV由来のRNAに該ハイブリダイ
    ゼージョンプローブをハイブリダイズさせることからな
    る方法。
JP57501141A 1981-03-28 1982-03-26 相補肝炎ａウイルスゲノムを含有している雑種ｄｎａの調製法、該雑種ｄｎａ、これを含有するプラスミドベクタ−、雑種ｄｎａによって発現されたウイルス特異蛋白質およびこれから調製され、これらを含有するワクチン Expired - Lifetime JP2554612B2 (ja)

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DE3112338A DE3112338C2 (de) 1981-03-28 1981-03-28 Verwendung von Hybridisierungssonden zum Nachweis von HAV
DE3112338.4 1981-03-28

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JP57501141A Expired - Lifetime JP2554612B2 (ja) 1981-03-28 1982-03-26 相補肝炎ａウイルスゲノムを含有している雑種ｄｎａの調製法、該雑種ｄｎａ、これを含有するプラスミドベクタ−、雑種ｄｎａによって発現されたウイルス特異蛋白質およびこれから調製され、これらを含有するワクチン

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EP0174669A2 (de) 1986-03-19
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DE3112338A1 (de) 1982-10-07
JPS58500389A (ja) 1983-03-17
WO1982003408A1 (en) 1982-10-14
DE3277915D1 (en) 1988-02-11
EP0061740B1 (de) 1988-01-07
ATE31733T1 (de) 1988-01-15
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