CN111057754B

CN111057754B - 鉴定适用于hbv研究的动物模型的方法和应用

Info

Publication number: CN111057754B
Application number: CN201911376846.4A
Authority: CN
Inventors: 周亮; 张新尚; 朱献军
Original assignee: Institute For Laboratory Animal Research Sichuan Academy Of Medical Sciences & Sichuan Provincial People's Hospital
Current assignee: Institute For Laboratory Animal Research Sichuan Academy Of Medical Sciences & Sichuan Provincial People's Hospital
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2021-01-12
Anticipated expiration: 2039-12-27
Also published as: CN111057754A

Abstract

本发明公开了一种鉴定适用于HBV研究的动物模型的方法和应用，涉及生物技术领域。该方法包括：将获得的待鉴定藏酋猴的MHC‑DPA基因和MHC‑DPB基因的序列分别与SEQ ID NO.1所示的第一参考序列和SEQ ID NO.2所示的第二参考序列比较。该方法可以快速鉴定出适用于HBV研究的藏酋猴模型，有利于提高藏酋猴在HBV研究中的使用效率，避免资源损失。

Description

鉴定适用于HBV研究的动物模型的方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种鉴定适用于HBV研究的动物模型的方法和应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是噬肝DNA病毒属小包膜DNA 病毒，HBV感染严重威胁人类生命健康，可引起急、慢性肝炎、肝衰竭、肝硬化和肝癌以致死亡。HBV感染是一个全球性的健康问题，世界人口的 1/3有既往或持续感染HBV的血清学证据。全球约有3.5亿HBV慢性携带者，每年约有100万人死于急、慢性HBV感染。我国是HBV感染高发区，约50％-70％的人口感染过HBV，约8-12％的人口为HBV携带者，其传播途径中母婴垂直传播占30％-50％，感染年龄越小，变成慢性携带者的概率越高，90％在新生儿期感染慢性HBV患者会发展为慢性乙型肝炎，慢性感染者面临较大的肝硬化和肝癌的风险，因此，HBV感染在我国是一个严重的公共卫生问题。

乙肝疫苗则可以主动刺激人体特异性免疫反应，清除病毒，但是作用时间长，且起效较慢。尽管乙肝疫苗已广泛使用，在一定程度对乙肝有预防作用，但也存在不应答和不良反应，导致肝炎流行范围广，慢性化程度高，临床缺乏有效地治疗方法。在HBV感染中，病毒清除和疾病发病机制主要由适应性免疫应答介导。从感染HBV到慢性HBV感染的进程受到年龄、环境及宿主基因构成的影响。目前针对乙型肝炎的治疗药物中，诸如干扰素、核苷类似物、多肽类药物、治疗性疫苗及中草药等，虽然有一定的治疗反应外，还没有更为确切的抗病毒治疗方法。而乙肝免疫球蛋白 (HBIG)是高效免疫球蛋白的制剂，通过浓缩和纯化具有乙肝病毒表面抗体阳性的血清制成，可与体内乙肝病毒表面抗原发生中和，达到清除病毒的作用，具有特异性被动免疫的功能。目前乙肝免疫球蛋白在阻断乙型肝炎围产期传播、预防输血后乙型肝炎病毒感染、乙肝病毒阳性病人肝移植后的被动免疫预防、治疗慢性乙肝病毒携带者及预防意外感染事故方面已得到广泛的临床应用。近几年，虽然有不少单克隆抗体、基因工程抗体，包括人源化抗体、小分子抗体的研制开发，但由于基因工程抗体是一种新开发的技术，现在仅用于临床诊断和肿瘤治疗，此种抗体的效果如何，有待实践来证实。随着临床需求逐年增多，目前通过临床人源血分离得到的该制品存在一定的限制。因此开发其他物种来源的与其疗效相同的乙肝免疫球蛋白尤为必要。2012年，李文辉课题组证实NTCP作为功能性受体可以介导HBV及丁型肝炎病毒(hepatitis D virus，HDV)进入肝细胞，为HBV 相关研究开启了一扇崭新的大门。后期研究还发现除NTCP外，可能还存在其他途径介导HBV的侵染。主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)作为脊椎动物中一个与免疫相关的多基因家族，其庞大的等位基因数量及高丰度的多态性，赋予机体巨大潜力以适应内外环境，识别病原微生物入侵。最近对中国、日本和韩国人的全基因组关联分析研究发现了13种单核苷酸突变(SNP)与慢性HBV感染有关，其中11个SNP定位于MHC区域。这11个SNP位点主要位于 HLA-DP/DQ/DOA/C及CFB、NOTCH4等基因中。尽管这些结果证实了 MHC区域与HBV感染之间的关系，但其致病变异和潜在机制仍不清楚。另有研究表明HLA-DPB1基因的相关突变在免疫抑制剂治疗病人的HBV 再激活过程中起到关键作用。

选取合适的动物模型来研究HBV是具有重要意义的。前期研究发现恒河猴在给予乙肝疫苗后，只在注射后几天内表达低浓度的乙肝表面抗体，为一过性，这种模型对HBV研究来说是不合适的。因此，不断发掘适合 HBV研究的动物模型，对开展HBV模型建立、药物筛选及评价提供科学依据具有重要意义，但目前缺乏有效的鉴定适合HBV研究的动物模型的相关方法和配套产品。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴定适用于HBV研究的动物模型的方法、试剂盒和应用。采用该方法可以有效地鉴定适用于HBV研究的动物模型。

本发明是这样实现的：

藏酋猴(Macaca thibetana)，又名四川短尾猴、大青猴，灵长目(Primates) 猴科(Cercopithecidae)猕猴属(Macaca)，与恒河猴、食蟹猴等亲缘关系较近。藏酋猴为我国特有的非人灵长类物种，猕猴属中体型最大的物种，是理想的医学模式动物候选物种。在免疫系统、凝血功能、血型、生理、生化和人类有高度的相似性，对免疫抑制剂、抗凝药物、抗生素等具有与人类相同的反应和效应，已广泛应用于异种器官移植、疾病动物模型的研究中。

通过对藏酋猴全基因组测序分析，并与恒河猴和人进行比较，发现其免疫系统与其他物种存在较大差异，发现了多个与免疫相关基因的纯合非同义突变SNPs，许多携带着SNPs突变的基因都与一些人类疾病有密切的关联性。这些研究提示藏酋猴可以作为研究HBV侵染及治疗的潜在动物模型。

目前关于藏酋猴的相关研究鲜有报道，其种群遗传结构还不明确，极大限制了其在疾病动物模型研究中的应用。因此，有必要发掘和利用藏酋猴对HBV易感及抗病基因，为开展HBV模型建立、药物筛选及评价提供科学依据。

第一方面，本发明实施例提供一种鉴定适用于HBV研究的动物模型的方法，其包括如下步骤：

对比步骤：将获取于待鉴定动物的MHC-DPA基因和MHC-DPB基因的序列分别与第一参考序列和第二参考序列比较；其中，第一参考序列如 SEQ ID NO.1所示，第二参考序列如SEQ ID NO.2所示；

所述待鉴定动物为藏酋猴。

本发明的研究显示，部分藏酋猴在给予HBV表面抗原后可以持续大量地产生乙肝表面抗体，这种藏酋猴是理想的HBV研究模型，进一步研究发现，可以持续大量地产生乙肝表面抗体的藏酋猴具有独特的MHC-DPA基因和MHC-DPB基因序列，其序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。该MHC-DPA基因和MHC-DPB基因与持续大量地产生乙肝表面抗体的表型相关。因此，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2作为参考序列，将待鉴定动物的MHC-DPA基因和MHC-DPB基因与参考序列比较，根据序列的同一性对比结果可以鉴定出待鉴定动物是否是适用于HBV研究的动物模型,有利于提高藏酋猴在HBV研究中的使用效率，并减少资源损失。

本发明提供的鉴定方法可以快速、准确地鉴定出适用于HBV研究的动物模型，可以为HBV研究提供模型建立、药物筛选及评价提供科学依据。

通过本发明的鉴定方法鉴定的HBV藏酋猴模型研究，为HBV感染机制及机体免疫机制研究提供极佳材料，也为该疾病的治疗提供可能新的候选靶点，也为藏酋猴MHC等位基因遗传多样性研究提供基础。

当然，需要说明的是，序列比较时，可以采用本领域常见的软件进行比对，如DNAMAN、Vector NTI等，除了使用软件比对外，也可以使用在线工具进行比对，如NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的序列比对工具。

在可选的实施方式中，所述方法还包括：

鉴定步骤：如果所述待鉴定动物的MHC-DPA基因的序列与所述第一参考序列的同一性(Identity)在98％以上，优选为99％以上，进一步优选为100％，以及所述待鉴定动物的MHC-DPB基因的序列与所述第二参考序列的同一性在98％以上，优选为99％以上，进一步优选为100％，则指示所述待鉴定动物适用于HBV研究。

本发明的研究显示，以与参考序列具有98％以上的同一性作为阈值，判断待鉴定动物是否适用于HBV研究，其具有更高的准确性，选择的同一性的值更高，鉴定结果更准确。

在可选的实施方式中，在所述对比步骤之前，所述方法还包括：

基因序列获取步骤：使用引物扩增提取自所述待鉴定动物的核酸样品以得到MHC-DPA基因和MHC-DPB基因的序列。

在可选的实施方式中，所述引物包括扩增MHC-DPA基因的第一引物对和扩增MHC-DPB基因的第二引物对，所述第一引物对的碱基序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述第二引物对碱基序列如SEQ ID NO.5 和SEQ ID NO.6所示。

利用SEQ ID NO.3-6所示的引物可以较好地完成对MHC-DPA基因和 MHC-DPB基因的扩增，具有更好的灵敏度和特异性。扩增的到的产物通过测序即可获得MHC-DPA基因和MHC-DPB基因的序列。

需要说明的是，MHC-DPA基因和MHC-DPB基因的获取可以通过PCR 扩增的方式再测序的方式获得，也可以不通过PCR扩增直接对核酸样本如转录组测序方式获得，无论以何种方式获得MHC-DPA基因和MHC-DPB 基因的序列均落入本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，所述核酸样品为cDNA。

在可选的实施方式中，所述适用于HBV研究的动物模型在给予HBV 表面抗原后可持续大量表达乙肝表面抗体。

优选地，乙肝表面抗体的表达持续时间为20个月以上，第20个月的表达量高于500IU/L；

优选地，所述HBV表面抗原选自重组乙肝表面抗原和乙肝疫苗中的至少一种。

第二方面，本发明实施例提供分离的DNA片段，其碱基序列如SEQ ID NO.1或SEQID NO.2所示。

本发明提供的DNA片段即MHC-DPA(SEQ ID NO.1)和MHC-DPB (SEQ ID NO.2)基因序列与高表达乙肝表面抗体有关，在藏酋猴物种中首次被发现，该基因序列为群体的遗传背景提供重要信息，为其他疾病动物模型研究提供基础资料，同时为高效建立HBV藏酋猴模型提供首要信息。藏酋猴MHC-DP基因序列的发现，为HBV侵染途径及机体清除机制研究提供极佳的研究材料。

另外，本发明提供的DNA片段即MHC-DPA基因(SEQ ID NO.1)和 MHC-DPB基因(SEQID NO.2)在已被证实与HBV侵染及清除有关，以该基因为基础，结合建立的HBV藏酋猴模型，可为HBV侵染、机制研究及治疗找到新的位点，为下一步深入开发HBV藏酋猴模型提供基本资料，同时也为藏酋猴其他疾病模型研究及其他等位基因研究提供重要参考。

第三方面，如上所述的DNA片段在筛选或培育适用于HBV研究的动物品种中的应用，所述动物为藏酋猴。

本发明的研究研究显示，部分藏酋猴在给予HBV表面抗原后可以持续大量地产生乙肝表面抗体，这种藏酋猴是理想的HBV研究模型，进一步研究发现，可以持续大量地产生乙肝表面抗体的藏酋猴具有独特的MHC-DPA 基因和MHC-DPB基因序列，其序列分别如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2 所示。因此，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的DNA片段可以作为分子标记，于辅助育种，即用于培育适用于HBV研究的藏酋猴品种，为HBV侵染途径及机体清除机制等研究提供极佳的研究材料。

在可选的实施方式中，所述应用包括以下步骤：

选择步骤：选择MHC-DPA基因与SEQ ID NO.1所示具有98％以上，优选为99％以上，进一步优选为100％同一性和MHC-DPB基因与SEQ ID NO.2具有98％以上，优选为99％以上，进一步优选为100％同一性的候选藏酋猴作为亲本或子代用于筛选或培育适用于HBV研究的藏酋猴品种。

在可选的实施方式中，在选择步骤前，所述应用还包括：

基因序列获取步骤：使用引物扩增提取自所述候选藏酋猴的核酸样品以得到MHC-DPA基因和MHC-DPB基因的序列；

优选地，所述引物包括扩增MHC-DPA基因的第一引物对和扩增 MHC-DPB基因的第二引物对，所述第一引物对的碱基序列如SEQ ID NO.3 和SEQ ID NO.4所示，所述第二引物对碱基序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

优选地，所述核酸样品为cDNA。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为藏酋猴(MATH)、人(HLA)和恒河猴(MAMU)三者的 MHC-DPA基因和MHC-DPB基因序列比对结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

藏酋猴MHC-DPA\MHC-DPB基因的挖掘

实验动物：藏酋猴，由四川省医学科学院四川省人民医院实验动物研究所提供。

主要试剂：血液RNA提取试剂TRIZOL(Invitrogen)，反转录试剂盒 (Fermentas)，通用型DNA纯化回收试剂及pGM-Simple-T Fast克隆试剂盒，DH5α感受态细胞均购买于北京天根生化科技有限公司；红细胞裂解液，GoldView I型核酸染色剂,氨苄青霉素购买于北京Solarbio科技有限公司；

GXL Premix购买于北京TaKaRa宝生物工程有限公司；2×Taq PCR MasterMix和D2000 plus DNALadder购买于北京天根生化科技有限公司。

引物：参照人类及恒河猴已知的MHC-DPA\MHC-DPB基因序列设计全长引物对藏酋猴MHC-DPA\MHC-DPB基因序列进行扩增。

MHC-DPA上游引物序列：ATGCGCCCTGAAGACAGAATG(SEQ ID NO.3)；

MHC-DPA下游引物序列：TCACAGGGGCCCCTGG(SEQ ID NO.4)；

MHC-DPB上游引物序列：ATGATGGTTCTTCCAGTTTCTGG(SEQ ID NO.5)；

MHC-DPB下游引物序列：TTATACAGATCCTCGTTGAACTTTCTT (SEQ ID NO.6)。

藏酋猴MHC-DPA\MHC-DPB基因序列获取步骤如下：

1、样品的处理：500ul全血样品中加入3倍体积的红细胞裂解液，充分颠倒混匀，12,000r/min离心1min，小心吸去上清，沉淀应为白色或淡红色(如果裂解不彻底，可重复以上述步骤一次)。

2、沉淀中加入1ml TRIZOL，颠倒混匀，充分裂解。

3、加入200uL，剧烈震荡15s，室温放置5-10min。

4、12000rpm/min，离心10min，取上清。

5、加入等体积异丙醇(约500uL)，颠倒混匀。

6、12000rpm/min，离心5min，弃上清。

7、沉淀中加入1ml 95％乙醇，上下颠倒，12000rpm/min，离心2min，弃上清。

8、室温干燥，乙醇挥发干净，加入50uL水，重悬沉淀。

9、配置反转录体系，体系如下：

反转录体系	体积
		RNA	13uL
反转录酶	1uL
		PRIMER	1uL
Rnase抑制剂	1uL
		5*BUFFER	4uL
总体积	20uL

10、反转录程序：45度60min，75度，5min。

11、上述反应产物-20度冻存备用。

DNA扩增体系及步骤如下：

12、PCR体系：

13、扩增条件：

14、琼脂糖凝胶电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯下切取目的条带。

琼脂糖凝胶回收目的条带，具体步骤如下：

15、加入3倍体积的Buffer B2，50度，水浴5-10min，间隔混匀，直至胶块完全融化。

16、将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中，室温放置2min,12,000 r/min离心1min,倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。

17、向吸附柱CB2中加入600uL漂洗液PW(使用前先检查是否已加入无水乙醇)，12,000r/min离心1min,倒掉废液，将吸附柱CB2放回收集管中。

18、重复操作步骤4。

19、将吸附柱CB2放回收集管中，12,000r/min离心2min,除去漂洗液。将吸附柱CB2置于室温放置10min，彻底地晾干。

20、将吸附柱CB2放入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50uL的无菌无酶水(RNase-Free Water)，室温放置2min。12,000 r/min离心2min收集纯化DNA溶液。所得DNA溶液放于-20度备用。

目的基因克隆及测序，详细步骤如下：

21、在无菌离心管中分别加入基因组DNA的PCR产物4uL， RapiLigation Mix(2×)5uL，pGM-Simple-T Fast Vector(50ng/uL)1uL。

22、轻弹离心管混匀内容物，离心5s。将混合液置于室温(22℃)反应5min。反应结束后，将离心管置于冰上，进行后续的转化反应。

23、热激转化及培养：首先制备含有氨苄青霉素终浓度100ug/mL的 LB琼脂糖平板。将平板放置在37℃，预热20min。然后把刚从－70℃冰箱取出放于冰浴上解冻的50uLDH5α感受态细胞加入连接产物重，轻弹混匀，冰浴30min。再次，将离心管置于42℃水浴90s，取出管后立即放于冰上3min，中途不要摇晃离心管。接着向离心管中加入350uL，37℃预热的LB(不含抗生素)培养基，180r/min、37℃振荡培养60min。其目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。将离心管中的菌液混匀，吸取200uL加到含氨苄青霉素的LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。平板正放，37℃培养1h。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12h。

24、阳性克隆检测：挑取白色菌落直接进行PCR检测(M13引物)。

25、基因测序

每个个体挑选阳性菌株10个，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序仪器为ABI 3730x1 DNA测序仪。

经上述步骤后，测序得到序列片段大小分别为783bp、777bp。序列如下：

MHC-DPA基因序列如SEQ ID NO.1所示，MHC-DPB基因序列如SEQ ID NO.2所示。

所得基因序列MHC-DPA\MHC-DPB与Genebank中没有找到完全相同的序列，表明为藏酋猴新序列，单个基因通过10个以上的克隆证实无误。与人(HLA)、恒河猴(MAMU)同源序列相似度分别为95.1％、97.4％和 91.4％、90.3％(见图1)。

黑猩猩可以感染HBV病毒，但由于其资源稀缺，目前已无法用来作为研究HBV的疾病模型，树鼩虽然可以感染HBV病毒，但由于其和人及非人灵长类动物在遗传上有一定的差距，因此，本发明中藏酋猴携带 MHC-DPA\MHC-DPB基因序列的个体可以用来作为研究HBV侵染、机制研究及治疗的良好动物模型。

实施例2

藏酋猴MHC-DPA\MHC-DPB基因的应用

本实施例提供一种鉴定适用于HBV研究的动物模型的方法，包括如下步骤：

1、选取待鉴定的藏酋猴(共7只，编号1#-7#)。

2、后肢静脉采血，用EDTA处理，按实施例1的方法提取血液RNA，反转录为cDNA作为模板，备用。

3、以上述cDNA作为模板，用实施例1的引物和扩增方法，进行 MHC-DPA\MHC-DPB基因的扩增。

4、按实施例1的引方法进行目的条带的琼脂糖凝胶回收及载体连接转化和测序。

5、将测序结果MHC-DPA测得序列与SEQ ID NO.1比较，MHC-DPB 测得序列和SEQ IDNO.2所示序列，选择二者完全一致即100％的同一性的 4只个体(1-4#)及同一性为大于99％小于100％的3只个体(5-7#)用于HBV感染研究。

根据序列比对结果，预测1-4#的藏酋猴给予HBV抗原后可持续大量表达乙肝表面抗体。

实验例1

对上述7只动物分别在0月，1月，3月三次接种0.5ug重组乙肝病毒表面抗原(preS2，ProSpec)，在0月，1月，3月，6月，10月，15月，20 月检测乙肝表面抗体表达水平(电化学发光法)，结果见表1。

表1 7只藏酋猴在不同时间乙肝表面抗体表达水平(单位：IU/L)

从表1结果可以看出，1#-4#的藏酋猴持续表达乙肝表面抗体，持续水平在20个月上，在第6个月以后的表达水平高于1000IU/L，实际检测结果与预测结果吻合，说明鉴定适用于HBV研究的动物模型的方法具有较高的准确率，同一性为大于99％小于100％的6#个体持续表达乙肝表面抗体，说明优先选择与SEQ ID NO.1和2同一性100％的个体进行HBV研究。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川省医学科学院.四川省人民医院实验动物研究所

<120> 鉴定适用于HBV研究的动物模型的方法和应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 783

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgcgccctg aagacagaat gttccagacc agagctgtta tcttgagaac cctctccttg 60

gctttgctgc tgagtctcgg aggagctggg gccatcaagg cggaccatgt atcaacttat 120

gccttgtttg tacagacaca tagaccaaca ggggagtata tgtttgagtt tgatgaggat 180

gagatgttct atgtggatct ggacaagaag gagaccgtct ggcatctgga ggagtttggc 240

cgagcctttt cctttgaggc tcagggcggg ctggctaaca ttgctatatt gaaccacaac 300

ttgaatgtca cgatccagcg ttccaactac actcaggccg ccaatgatcc ccctgaggtg 360

accgtgtttc ccaaggagcc tgtggagctg ggccaaccca acaccctcat ctgccacatt 420

gacaagttct tccctccagt gctcaacgtc acgtggctgt gcaacgggga gccagccact 480

gagggtgtcg ctgagagcct cttcctgccc agaacagatt atagcttcca caagttccat 540

tacctgacct ttgtgccctc agccgaggac tactatgact gcagggtgga gcattggggc 600

ttggaccagc cgctcctcaa acactgggag gcccaagagc caatccagat ccctgagaca 660

acggagactg tgctctgtgc cctgggcctg gtgctgggcc tagtgggcat catcgtgggc 720

accgtcctca tcataaggtc tctgcgatct ggccgtgacc cccgggccca ggggcccctg 780

tga 783

<210> 2

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgatggttc ttccagtttc tggggccccc tggacagtga ctctgacggc gttactgatg 60

gtgctgctca catctgtggt ccagggcagg gccactccag agaattacgt gtaccagaga 120

cggtttgaat gctatgcgtt taatggggca cagcgcctcc ttgacagatc catctacaac 180

caggaggagt tcgtgcgcct cgacagcgac ctgggggagt accgggcagt gatggagctg 240

ggacggccta ctgctgagcg ctggaacagc cagaaggaca tcctggagca ggagcgggcc 300

gaggtggaca gggtgtgcag acacaactat gagctggatg agccactcat ccggaagcgc 360

cgagtccagc cgagggtgaa cgtctccccc tccaagaagg ggcccttaca gcaccacaac 420

ctgctcgtct gccacgtgac agatttctac ccaggcagca ttcaagtccg gtggttcctg 480

aatggacagg aggaaacagc tggggtcgtg tccaccaacc tcatccgtaa tggagactgg 540

accttccaga tcctggtgat gctggaaatg acgccccagc agggagacgt ctacacctgc 600

caagtagagc accccagcct ggacagtcct gtcaccatgg agtggaaggc acagtctgat 660

tctgcccgga gtaagacgct gacgggagcc gggggcttcg tgctggggct catcacctgt 720

ggagtgggca tcttcatgca caggaggagc aagaaagttc aacgaggatc tgtataa 777

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgcgccctg aagacagaat g 21

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcacaggggc ccctgg 16

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgatggttc ttccagtttc tgg 23

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttatacagat cctcgttgaa ctttctt 27

Claims

1.一种鉴定适用于HBV研究的动物模型的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

对比步骤：将获得的待鉴定动物的MHC-DPA基因和MHC-DPB基因的序列分别与第一参考序列和第二参考序列比较；其中，第一参考序列如SEQ ID NO.1所示，第二参考序列如SEQID NO.2所示；

所述待鉴定动物为藏酋猴；

所述方法还包括：

鉴定步骤：如果所述待鉴定动物的MHC-DPA基因的序列与所述第一参考序列的同一性为100%，以及所述待鉴定动物的MHC-DPB基因的序列与所述第二参考序列的同一性为100%，则指示所述待鉴定动物适用于HBV研究。

2.根据权利要求1所述的鉴定适用于HBV研究的动物模型的方法，其特征在于，在所述对比步骤之前，所述方法还包括：

基因序列获取步骤：使用引物扩增提取自所述待鉴定动物的核酸样品以获得MHC-DPA基因和MHC-DPB基因的序列。

3.根据权利要求2所述的鉴定适用于HBV研究的动物模型的方法，其特征在于，所述引物包括扩增MHC-DPA基因的第一引物对和扩增MHC-DPB基因的第二引物对，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述第二引物对核苷酸序列如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示。

4.根据权利要求2所述的鉴定适用于HBV研究的动物模型的方法，其特征在于，所述核酸样品为cDNA。

5.根据权利要求1所述的鉴定适用于HBV研究的动物模型的方法，其特征在于，所述适用于HBV研究的动物模型在给予HBV表面抗原后可持续大量表达乙肝表面抗体。

6.根据权利要求5所述的鉴定适用于HBV研究的动物模型的方法，其特征在于，乙肝表面抗体的表达持续时间为20个月以上，第20个月的表达量高于1000IU/L。

7.根据权利要求5所述的鉴定适用于HBV研究的动物模型的方法，其特征在于，所述HBV表面抗原选自重组乙肝表面抗原和乙肝疫苗中的至少一种。

8.DNA片段在筛选或培育适用于HBV研究的动物品种中的应用，其特征在于，DNA片段包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的片段；所述动物为藏酋猴；

所述应用包括以下步骤：

选择步骤：选择MHC-DPA基因与SEQ ID NO.1所示具有100%同一性和MHC-DPB基因与SEQID NO.2具有100%同一性的候选藏酋猴作为亲本或子代用于筛选或培育适用于HBV研究的藏酋猴品种。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，在选择步骤前，所述应用还包括：

基因序列获取步骤：使用引物扩增提取自所述候选藏酋猴的核酸样品以获得MHC-DPA基因和MHC-DPB基因的序列。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述引物包括扩增MHC-DPA基因的第一引物对和扩增MHC-DPB基因的第二引物对，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述第二引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

11.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述核酸样品为cDNA。

12.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述适用于HBV研究的动物模型在给予HBV表面抗原后可持续大量表达乙肝表面抗体。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，乙肝表面抗体的表达持续时间为20个月以上，第20个月的表达量高于500IU/L。

14.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述HBV表面抗原选自重组乙肝表面抗原和乙肝疫苗中的至少一种。