JPS58500389A - 相補肝炎ａウイルスゲノムを含有している雑種ｄｎａの調製法、該雑種ｄｎａ、これを含有するプラスミドベクタ−、雑種ｄｎａによって発現されたウイルス特異蛋白質およびこれから調製され、これらを含有するワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 相補肝炎Ａウィルスゲノムを含有している雑種ＤＮＡの調製法、該雑種ＤＮＡ、 これを含有するプラスミドベクター、雑種ＤＮＡによって発現されたウィルス特 異蛋白質およびこれらから調製され、これらを含有するワクチこの発明は、肝炎 Ａウィルス（ＨＡＶ）に特異な相補ゲノムを含有する雑種（ハイブリッド）ＤＮ Ａの調製法、この方法で調製された雑種ＤＮＡ、これを含有するプラスミドベク ター、細菌クローン中で発現された雑種蛋白質または蛋白質、生物学的試料中の 肝炎Ａウィルスを同定するだめの該雑種ＤＮＡの使用、これらから誘導される、 または雑種ＤＮＡのヌクレオチド配列に従って調製される雑種蛋白質または蛋白 質を含有するワクチンに関する。

肝炎Ａは公衆衛生の見地から、依然として極めて重要な疾患であり、その病因は 極く最近みっがったばがシである。失われる、人時は長く、病院経費（例えば患 者の隔離のための）は高い。受動ワクチン、より良好でもつと一般的には活性ワ クチンを予防接種することか、９１康管理上、および経済的に非常に有益である 。

この目的を達成するため、ａ）科学的研究用として、およびｂ）免疫用にウィル ス抗原を使用し得る様にするため、この病気の病因である肝炎Ａウィルス（ＨＡ Ｖ）を多足入手する必要がある。しかしながら、現在の所、それは不”Ｔ能であ る。ウィルス粒子の十分な生化学的１、−’　−−ｐｉ　ウィルス学的研究を行 なうのに必要な量のウィルス材料さえ入手することがてきない。

肝炎Ａは、１９６７〜１９７０年に初めてヒト以外の′に長動物に伝染された（ ＤｅｉｎｈａｒｄＬ、Ｆ、による総説が］　］　３、発行者：Ｆ、Ｂ、Ｂａｎｇ 　ＳＡｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮｅｗＹｏｒｋ）　）。次いで１９７３ 年、Ｆｅ１ｎｓｔｏｎｅらは、急性相の…各の糞便中に、免疫電子顕微鏡によっ てウィルスオ′６子を確認した（ＦｅｉｎｓＬｏｎｅ、Ｓ９Ｍ、、Ａ、Ｚ、　Ｋ ａｐｉｋｉａｎおｌｉｔ　災Ａウィルス（ＩＩＡＶ）の什物物理的および生物化 学的１′１質はＰｒｏｖｏｓｔら（１’、）ｌ、Ｐｒｏｖｏｓｔ、Ｉｓ、Ｓ、Ｗ ｏｌａｎｓｋｉ。

Ｗ、Ｊ、Ｍｉｌｌｅｒ、０．Ｌ、Ｉｔｔｅｎｓｏｈｎ、Ｗ、ＪｌＭｃＡＩ、ｅｅ ｒ　およびＭ、Ｒ。

）、５３２）、ＳｉｅｇｌおよびＦｒ６ｓｎｅｒ（Ｇ、Ｓｉｅｇｌ　オよびＧ、 Ｇ、Ｆｒ８ｓｎｅｒ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、２６　（１９７Ｂ　）　４０および４８ 　）、　Ｃｏｕｌｅｐｉｓ　ら　−八、Ｇ、Ｃｕｕｌ　＝ｐｉｓ、Ｓ、Ａ、Ｌｏ ｃａｒｎｉｎｉ。

Ａ、Ａ、Ｆｅｒｒｉｓ、Ｎ＋ｌ＋Ｌｅｈｍａｎｎ　およびＩ、Ｄ、Ｇｕｓｔ、Ｉ ｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙｌｏ（１９７８）２４、およびＡ、Ｇ、Ｃｏｕｌｅｐ ｉｓ、Ｓ、Ａ。

Ｌｏｃａｒｎｉｎｉおよび１．Ｄ、Ｃ；ｕｓｔ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　３５　（１ ｇ　Ｂ　□）５７２）、Ｂｒａｄｌｅｙら（Ｄ、Ｗ、Ｂｒａｄｌ　ｅｙ、Ｃ，Ｌ 、Ｈｏｒｎｂｅｃｋ。

Ｅ、Ｈ，ＣｏｏｋおよびＪ、ＥｏＭａｙｎａｒｄ、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、旦（，１ ９７８）２２８、およびり、Ｗ、Ｂｒａｄｌｅｙ、Ｈ，Ａ、Ｆｉｅｌｄｓ、に、 Ａ、　ＭｃＣａｕｓ　ｔ　ｌ　ａｎｄ　、Ｅ、Ｈ８Ｃｏｏｋ、Ｃ，Ｒ，Ｇｒａｖ ｅｌ　ｌ　ｅおよびＪ　、ＥＪｂｙｎａｒｄ。

Ｊ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、２　（１９７８）　１　７　５　）、Ｆｅ１ｎｓｔｏ ｎｅら（Ｓ、Ｍ、Ｆｅ１ｎｓ　ｔｏｎｅ　、Ｙ、Ｍｏｒ　ｉｒ　ｓｕｇｕ　、Ｊ 　、Ｗ、に、Ｓｈ　ｉｈ　、Ｊ　、Ｌ。

ＧｅｒｉｎオよひＲ，Ｈ，Ｐｕｒｃｅｌｌ　、　’　Ｖｉｒａｌ　Ｈｅｐａｔｉ ＋　ｉｓ　’、発行：　Ｇ、Ｎ、Ｖｙａｓ、Ｓ、Ｎ、ＣｏｈｅｎおよびＲ，Ｓｃ ｈｍｉｄｔ　、　ＡｂａｃｕｓＰｒｅｓｓ、−ｒｕｒｎｂｒｉｄｇｅ　Ｗｅｙｌ ｓ、　］　９７９　、４１頁）、Ｍａｙｎａｒｄ　オよびＢｒａｄｌｅｙ（Ｊ　 、Ｅ、ＭａｙｎａｒｄおよびＩ）、Ｗ。

Ｂｒａｄｌｅｙ、ｌ　９　３　Ｑ　、　’　Ｖｉｒｕｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｌｉ ｖｅｒ’　、　発行：Ｌ、１３ｉａｎｃｈｉ、Ｗ、Ｇｃｒｏｃｋ、に、Ｓｉｃｋ ｉｎｇｃｒ　および　Ａ。

５ｔａｄｌｅｒ　（ｋｆｆＰＰｒｅｓｓ　Ｌｔｄ、、Ｌａｎｃａｓｔｃｒ、ｇ頁 ））およ４ び１−ｒａＬｓｃｈｉｎら（Ｊ、Ｄ、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ、Ｇ、Ｄｉｅｇｌ、Ｇ 、Ｇ、Ｆｒ６ｓｎｅｒおよ゛びＦ、Ｄｅｉｎｈａｒｄ、　ｌ　９８１　、　Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、印刷）らによって測定され、現在では、ＨＡＶ　は腸内ウィルスの 特徴を大部分持っているピコルナウィルスであると一般に認められている。

ＨＡ　Ｖ　のゲノムは１本鎖の、鎖状ＲＮＡであり（多分、３′末端にポＩＪ　 （Ａ　）を持っている）、分子量は２゜２５〜２．８Ｘ１０６ダルトン、沈降係 数は３２．５〜３３Ｓであり、これは、ポリオウィルスと比較して約６，５００ ヌクレオチドに相当する。）−Ｉ　Ａ　Ｖのゲノム地図および遺伝子の発現につ いては知られていない。ＨＡＶ蛋白質の遺伝子生成物の構造およびその抗原性に ついてはほとんどわかっていない。

最近、Ｉ（Ａ　Ｖは細胞培養で増殖されたか（Ｐ、ＨｏＰｒｏｖｏｓＬおよびＭ 、Ｒ，）１ｉ１１ｅｍａｎ、Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、　 ｌ　５　Ｑ（１９７９）２３１、Ｇ、Ｇ、Ｆｒ６ｓｎｅｒ、Ｆ、Ｄｅｉｎｈａｒ ｄｔ、　Ｒ。

５ｃｈｅ　ｉｄ　、Ｖ、Ｇａｕｓ　ｓ−ＭＧＩ　ｌ　ｅｒ　、Ｎ、Ｈｏｌｍｅ　 ｓ　、ＶｏＭｅｓ　ｓ　ｅｌｂｅｒｇｅ　ｒ　。

７７）８２５およびＦ、Ｄｅｉｎｈａｒｄｔ　、Ｒ，５ｃｈｅｉｄ、Ｖ、Ｇａｕ ｓｓ−Ｍｉｉ　１　ｌ　ｅ　ｒ　、Ｇ−Ｇ、Ｆｒδ５ｅｅｒ　およびＧ−５ｉｅ ｇｌ　、Ｉ’ｒｏｇｒ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ。

特長昭５８−５［１（！３８９　’、３）２７（１９８１）印刷）、感染した細 胞は何ら細胞変性効果（ＣＰＥ）を示さ々かった。即ち、細胞はウィルス感染に よって破壊されず、ウィルス粒子は放出されない。しかし組織培養での増殖期間 は非常に長く、収量は比較的低く、シかもウィルスか培４細胞から放出されない ので細胞を人工的に溶解してウィルスを得なければならず、この間、細胞物質で 汚染される危険性が極めて高いので、非常に制限される。この様な培養からＨＡ Ｖを精製することは、感染した細胞を溶解して破壊しなければならず、そして細 胞の残骸から分離しなければならないので、複雑である。

従って、ＨＡＶに対して免疫させる効果を持ったＨＡＶ抗原を調製するに十分な 量の、ＨＡＶの純粋なウィルス材料を得る必要かある。

この発明は、肝炎Ａウィルスに特異な相補ゲノムを含有する雑種ＤＮＡ、雑種Ｄ ＮＡを含有しているプラスミドベクター、およびＨＡＶに特異な抗原性を持った ＨＡＶ特異蛋白質および雑種蛋白質を、多量に、簡単に調製することを目的とす るものである。この目的、および以下の明細書中に記載したその他の課萌は、本 発明によって解決された。

従って、本発明は、肝炎ＡウィルスのウィルスＲＮＡの逆転写によって誘導され る２本鎖ＤＮＡを細菌プラスミドにクローンすることを特徴とする、肝炎Ａウィ ルスに特異な相補ゲノムを含有する雑種ＤＮＡの調製法に関する。

本発明はまだ、肝炎ＡウィルスのＲＮＡに相補的なある制限フラグメントを持っ た２本鎖雑種ＤＮＡ分子に関する。

本発明は更に、これらの雑種ＤＮＡ分子を含有する形質私換細菌およびプラスミ ドベクターに関する。

また、本発明は肝炎Ａウィルスに対する免疫作用を持った蛋白質フラグメントを 含有する蛋白質の製造方法、これらの蛋白質または雑種蛋白質、およびこれらを 含有するワクチンに関する。

最後に、本発明は肝炎Ａウィルスに特異なＲＮＡ配列の存在を検出するだめの該 雑種ＤＮＡの使用に関、する。

本発明によれば、ＨＡ　Ｖゲノムを、相補ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ　）の形で細菌プ ラスミドにクローンしく組み込み）、この細菌クローンを増殖させ、このゲノム を複製し、個々の遺伝子を発現／させてＨＡＶ特異抗原性を持ったウィルス蛋白 質の部分的なあるいは完全な生産を行わせる。その操作は次の通りである。

糞便から得た肝炎Ａウィルス（ＨＡＶ）を十分に精製した。ＡＭＶ逆転写酵素を 使ってゲノムＲＮＡをＣＤＮＡに転写し、次いでこのＤＮＡをプラスミドｐＢＲ ３２２のＰＳｔ■サイトにクローンし、テトラサイクリンの存在下でクローンを 選択した。大部分のクローンは、ヒト肝細胞癌由来のＨＡＶ感染細胞培養から予 め単離したＨＡＶ特異ＲＮＡと雑種形成する挿入物（ｉｎｓｅｒｔｓ）　をプラ スミド中に含んでいた。クローンのあるものは種々の素のウィルス抗原を発現し ていた。

これはＨＡＶに対する免疫に使用することができる。

この方法は、工業的規模で、細菌懸濁液として得られるウィルス物質を唾とんど 無限に生産し得る点で有利である。また、ウィルス物質、即ち免疫に必要なウィ ルス抗原蛋白質だけを特異的に生産し、異質な物質として生産コストを増大させ るその他のウィルス物質を生産しないこともこの方法の利点である。就中、この クローニングの方法の利点は、異質物質としての、生産コストを上げる、感染性 物質（ウィルスゲノム）を生産しないことである。即ち、この異質物質は分離し ８ たり、精製して除去したりするのに非常に経費がかがる。細菌にはウィルス抗原 の遺伝情報か固定されて残り、細菌はこの免疫性の物質だけを生産する。

本発明によって調製される新規な雑種ＤＮＡは、種々の分野で好適に使用するこ とができる。例えば診断の目的で、臨床試料中にＨＡＶが存在するかどうかを日 常的に調査することができる。例えば、既知の方法により、放射活性物質で標識 した雑種ＤＮＡ分子をこの目的に使用することができ、また発現した蛋白質を使 用することができる。

本発明方法によって得られる、ゲノム中に本発明に係る雑種ＤＮＡを含んでいる 新規なプラスミドベクターは、細菌中で発現させることができ、かくして遊離の または雑種蛋白質Ω形でＨＡＶ特異蛋白質を生産することかできる。この（雑種 ）蛋白質はＨＡ　Ｖ抗原を含んでおり、肝炎Ａに対するワクチンの製造に使用す ることができる。

添付の図面を参照しながら本発明を更に詳細に説明単一の細菌クローンを増殖さ せ、プラスミドを調製′！１９表昭５８−５００３８９　（４）した。プラスミ ドの大きさは電気泳動法により、１％アガロースゲル上で測定し、ＵＶ先光下観 察される帯をエチジウムプロミドで発色させた。写真２および３はＤＮＡ挿入物 を持った２個の典型的なプラスミドを示しており、写真１および４は挿入物を含 まない対照プラスミドｐＢＲ３２２を示している。

との雑種形成 りローンを、ＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓ　（前記）の方法に従っ て、寒天上のニトロセルロースフィルター上で増殖させた。ＨＡＶ感染ＰＬＣ／ ＰＲＦ５細胞（Ａｌ　ｅｘａｎｄｅｒら、１９７８年、前記）カラ得、ｐ　３２ −ｃ　標識したＨＡＶ特異ＲＮＡを、ニトロセルロースフィルター上で増殖した 細菌クローンと雑種形成させた。Ａ）はＨＡＶ特異ＲＮＡで雑種形成させた後の 、増殖クローンヲ含む３枚のフィルターのオートラジオグラフィー、Ｂ怠これら の３枚のフィルターを模式的に表わしたものである。右側の底部の矢印は、挿入 物のないＰＢＲ３２２ＤＮＡを含む対照コロニーを示している（・のクローン： 雑種、形成陽性、○のクローン：雑種形成陰性）。

第３図： 単一の細菌クローンの種々の量のウメ−ターショック溶解質をＨＡＶ放射免疫分 析にかけた。Ａは抗−ＨＡＶ−陽性ヒト血清で被覆したビーズと共に放射免疫分 析したものであり、ＢＭ抗−ＨＡＶ−陰性ヒト血清で被覆したビーズと共に放射 免疫分析したものである。

この分析のため、４目抜典型的な肝炎Ａを示した患者から得た大便からＨＡＶ粒 子を調製した。粒子の全収量はほぼ、約１０〜２０μ２のウィルスマスに相当す るものであった。この粒子から抽出したＲＮＡを、１類骨髄芽球腫ウィルス（Ａ ＭＶ）の逆転写酵素を用いてｃ　Ｄ　Ｎ　Ａに転写した。ゲル電気泳動によりｄ ｃＤＮＡを分析した結果、約８００〜１０００ヌクレオチドに主集団を有する、 異質サイズのＤＮＡ約１０〜５０ｎ７か得られた。このＤＮＡを、プラスミドｐ 　、Ｂ　Ｒ３２２のＰｓｔ■　制限サイトにクローン七た。次いでこの雑種プラ スミドでＥ、ｃｏｌｉ　Ｘ　１７７６を形質転換し、テトラザイクリンの存在下 でクローンを選択した。クローンしたプラスミドを分析した結果、多くのものは ３００〜８００ヌクレオチドの範囲にＤＮＡ挿入物（第１図）を含んでいた。

このＤＮＡ挿入物がＨＡＶに特異なヌクレオチド配列を含んでいるかどうかを調 べるために、この再結合プラスミドをＨＡＶ特異３２ｐ標識ＲＮＡと雑種形成さ せた。このＲＮＡ試料は、非ウィルス性ＲＮＡで汚染されることによって誤まっ た結果が得られない様に、異なったソース、即ち転写に使用された糞便から導か れたもとの（超厚）ウィルスＲＮＡのＨＡＶ感染細胞培養から得た。挿入物を含 む大部分のクローンはこのＨＡＶＲＮＡと雑種形成した（第２図）。

細菌をウォーターショック溶菌した後、細菌クローンの抗原発現を分析しく　Ｖ ｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆ　ら、前記）、このショック液を固相放射免疫分析 で、ＨＡＶ抗原にツいテ試験した（　ＨＡＶＡＢ　ｂｙ　Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

北シカゴ、ＵＳＡ）。、２個のクローンが陽性であ、った。

即ち、これらは陰性バックグラウンドの２〜３倍のレベルで反応した。ショック 液の量を２．２ｏおよび２００ｒｎｌと増やすと、比例して放射免疫分析におけ る放射活性量が増大した。

これらの結果を実証するために、ＨＡＶ陰性血清で被覆した固相（ビーズ）を使 って放射免疫分析を行なった。第３図Ｂは、この条件下ではショック液は反応し なかったことを示しており、このことは、ＨＡＶ特異ポリペプチドかクローン２ ２および２９で発現されることを示すもう１つの証拠である。

この現存するクローンは、ＨＡＶｇ染細胞培養のｋＮＡを使って、さらにｃ　Ｄ 　Ｎ　Ａを生産するだめのプライマーおよび雑種形成プローブとして使用するこ とがＧ、Ｓｉｅｇｌらの方法で、ＨＡＶ粒子を凍結糞便２５Ｆから精製した（　 Ｃ；、ＳｉｅｇｌおよびＧ、Ｇ、Ｆｒ６ｓｎｅｒ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ。

ｌ互、４０および４８．１９７８）。粒子を糞便から手硬かに抽出し、大部分の 無関係の蛋白質を吸着させるために、３０％サッカロースの緩衝物を表面に持っ た予め調製したＣｓＣ１−密度こう配法（密度：１．２５〜１．５０Ｐ／ｉ、平 均密度１．３５グ／ｍり上でバンド化し、サッカロースこう削土、速度遠心法に より、１．３４９／ｍｌの密度を持ったフラクションをバンド化した。

Ａｂｂｏ【ｔ　Ｌａｂｏｒａｉｏｒｉｅｓ　（北シカゴ）のＨＡＶＡｐ試験キッ トを用いて、固相の標準放射免疫分析（Ｇ−Ｇ、Ｆｒ８ｓｎｅｒ。

験した、ｌ（Ａ　Ｖ抗原−陽性フラクションを集め、上記の方法と同様にして、 ＣｓＣ１密度こう配法で再びバンド化した。この遠心分離からの粒子の全収量は １２５　■−標識抗−ＨＡＶのｌＱｃｐｍであった。これはほぼ、ウィルスマス １０〜２０μグに相当する。

相補ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ　）５合成 グアニジンログニド法（Ａ、Ｕ目ｒｉｃｂ、Ｊ、５ｈｉｎｅ、　Ｒ。

Ｃｈｉｒｇｉｖｉｎ、Ｅ、Ｐｉｃｔｅｔ、Ｗ、Ｊ、ＲｕｔｔｅｒおよびＨ，Ｍ、 Ｇｏｏｄｍａｎ。

５ｃｉｅｎｃｅ　１９６　１３１３　、１９７７　）により、粒子からＲＮＡを 抽出し、ＲＮａｓｅ活性のないことを確めた。九類骨髄芽球腫ウィルスの逆転写 酵素１００単位（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　を用いて、プラ イマーとしてのオリゴ（ｄＴ）１２〜１８．８ｍＭのＭ　ｇ　Ａ　Ｃ２，０，０ １％のＮ　Ｐ　−４０（Ｒ）、デオキシアデノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ ）、デオキシグアニジントリホスフェート（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジントリ ホスフェート（ｄＴＴＰ）各１ｍＭ、Ｑ、２ｍＭ　のデオキシシチジントリホス ７エート（ｄＣＴＰ）および放射活性ヌクレオチド前駆体（ＭＥＮ　）としての ３２ｐ　−ｄ　ＣＴＰｏ、５ｍＣ１の存在下、４２°Ｃで２時間、これを転写し た。全イ１ンキュベーション混合物を１分間８０’Ｃで加熱し、急冷し、２本鎖 合成の為に再び５０単位の逆転写酵素４ を添加し、この混合物を３０°Ｃで２時間インキュベートした。ゲル電気泳動で 相補ＤＮＡ　（ｃ　ＤＮＡ　）を分析すると、数百〜２千のヌクレオチド、大部 分が約８００〜１０００のヌクレオチド範囲の不均質サイズのＤＮＡか約１０〜 ５０ｎ７得られたことがわかった。

ｃ　ＤＮＡのプラスミドへのクローニングターミナルトランスフェラーゼ（Ｐ、 −Ｌ、ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓＩｎｃ、　、Ｍｉ　Ｉｗａｕｋｅｅ　）を用い 、このＤＮＡの３１−末端をデオキシシチジン（Ｔ、Ｎｅ１ｓｏｎ　オよびり、 Ｂｒｕｔ　ｌａｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８　、４１ 　（１９７９）、発行二ｋ。

Ｗｕ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）でティリングし、こ れτ、Ｐｓｔ■制限酵素で開裂し次いでその３′末端をデオキシチミジン（ｄＧ ）ホモポリマー（Ｎｅ１ｓｏｎ　およびＢｒｕｔｌａｇ、前記）でティリングし たプラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡと交雑（雑種形成）させた。このハイブリッド プラスミドによってＥ、ｃｏｌｉ　Ｘ　Ｉ　７７６を形質転換し、テトラサイタ リン（１２μＳｔ　／ｍｔ　）　の存在下、Ｌ−ブロス中でクローンを選択した （Ｈ，Ｍ、ＧｏｏｄｍａｎおよびＲ，Ｊ、Ｍａｃｌ）ｏｎａｌｔ、Ｍｅｔｈｏｄ ｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８　７５（１９７９）、発ｆ７．　；　Ｒ ，Ｗｕ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。

プラスミド挿入物の分析 Ｍ、Ｖ、Ｎｏｒｇａｒｄらの方法に従い、単一の細菌クローンをウリジンの存在 下で１００μｌ’！で増殖させ（Ｍ、Ｖ。

Ｎｏｒｇａｒｄ、に、ＥｍｉｎｇｈｏｌｚおよびＪｏＭｏｎａｈａｎ、Ｊ、Ｂａ ｃｔ、　、　３３３．２７０（１９７９））、トリ：ンｘ　−１００（Ｒ）で溶 菌させ、次いでエチジウムプロミドの存在下でＣｓＣｌ密度遠心分離にかけるこ とによりプラスミドを調製した（Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆ、Ｌ、、Ａ、Ｅ ｆｓｔｒａｄｉａｄｉｓ、Ｓ、Ｂｒｏｏｍｅ　。

Ｐ、Ｌｏｍｅｄｉｃｏ、ＲｏＴｉ　ｚａｒｄ、Ｓ、Ｐ、Ｎａｂｅｒ、Ｗ、Ｌ、Ｃ ｈｉｃｋおよびＷ。

Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　、　 ７５　３７２７（１９７８）およびＦ、Ｂｏｌ　１ｖａｒおよびに、Ｂａｃｋｍ ａｎ　。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　６　Ｂ　２４５　（１ｇ　７ 　ｇ　）、発行：　Ｒ，Ｗｕ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ）、プラスミドの大きさを１％アガロースゲル上、電気泳動によっテ分析し、 バンドを既知サイズのＤＮＡ挿入物を持ったプラスミドマーカーと比較した。

ＨＡＶＲＮＡのプラスミドＤＮＡへの交雑Ｇ、Ｍ、Ｇｒｕｎｄｓｔｅｉｎ　らの 方法に従って、単一の細菌クローンを寒天上のニトロセルロースフィルター上で 増殖させた（Ｇ、Ｍ、Ｃ；ｒｕｎｄｓｔｅｉｎおよびＩ）、Ｓ、）（ｏｇｎｅｓ ｓ　、　Ｐｒｏｃ。

ＨＡ　Ｖ−特異ＲＮＡをＨＡ　Ｖ−感染ＰＬＣ／ＰＲＦ５細胞から誘導した（　 Ｊ、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、Ｇ９Ｍａｃｎａｂ、Ｒ１５ａｕｎｄｅｒｓ。

Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ　ｉｎ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、±０　１０３　（１９７ ８）、発行：　Ｍ、Ｐｏ１ｌａｒｄ、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ）。ＨＡＶで感染させて４週間後（Ｆｒｉ；５ｎｅｒら（１９７９）、前記、 およびＤｅｉｎｈａｒｄｔら（１９８１）、前記）、細胞を１２時間燐酸塩欠乏 にし、次いで３２ｐ０４（Ｎ　Ｅ　Ｎ　。

ｘｃｉ／ｉ、担体なし）で２４時間標識化して溶菌した。

ＨＡＶ粒子をＣｓＣ１密度遠心分離により精製した。ＨＡＶ放射免疫分析で陽性 反応を示したＨ　Ａ　Ｖの密度（１，３４９／ｍ／）を有するバンドをフェノー ルで処理し、このｋＮＡ（１００，０００ｃｐｍ／フィルター）を、５０％ホル ムアミド中、５ＸＳＳＣ，４０°Ｃで１５時間、ニトロセルロースフィルター上 で増殖させた細菌クローンに交雑させた。各フィルターは、挿入物を含んでいな い、プラスミドｐＢＲ３２２を持った陰性の対照クローンを含んでいた。

雑種ＤＮＡの配列 エンドデメキシリボヌクレアーゼＰｓｔ■を使ってプラスミドベクターから雑種 ＤＮＡを開裂させ、Ａ、　Ｍ。

Ｍａｘａｍらの方法に従ってそのヌクレオチド配列を決定した（　ＡｏＭｏＭａ ｘａｍおよびＷａｉｔｅｒ　Ｇ１１ｂｅｚ、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、７４　５６０（１９７７）またはＦ、 Ｓａｎｇｅｒ、Ｓ、Ｎ１ｃｋｌｅｎおよびＡ、Ｒ。

Ｃｏｕｌｓｏｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ　Ｓ　Ａ　、７ ４　５４６３（１９７７））。・℃要とされる八けの多くＯ異なった隔離した、 重複しているクローンを使って、ＨＡ■ゲノムの連続ヌクレオチド配列を決定す る。

ＨＡＶ抗原の発現 懸濁液２５０ｒｎｌ中、光学密度（０，Ｄ、　）か０．８になるまで単一の細菌 クローンを増殖させ、その２．２０および２００．ｎｌを遠心分離した。Ｖｉｌ 　ｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｒら（１９７８、前記）の方法に従って、ペレット化し た細菌を水で溶菌させ、ウメ−ターショック液３００μＥをとり、固相ＨＡ　Ｖ 放射免疫分析（前記参照）により、ＨＡＶ抗原について試鹸した。この放射免疫 分析に使用されるポリスチレンビーズを抗−ＨＡ　Ｖ　−陰［血清で被覆し、対 照として使用した。

抗−ＨＡＶペプチドおよびその抗体 ＨＡＶ抗原のアミノ酸配列をＩ］へＶゲノムのヌクレオチド配列から計算し、９ 〜１５アミノ酸の長さを持ったオリゴペプチドを抗原エピトープから合成した。

これらのオリゴペプチドを非免疫性担体蛋白質（例１えばＫＬＨ）とカップリン グさせ、この複合体を、実験動物に於いて、直接免疫にあるいはＨＡＶ抗原に対 する抗体を産生させるのに使用した。

このＨＡＶ−特異ノ＼イブリッドＤＮＡを、天然の弱毒化と等価の人工的突然変 異を生産するのに使用し、弱毒化抗原を製造することもできる（これらは、ＲＮ Ａの生化学的性質のため、ＲＮＡゲノムで行なうことはできない）。

浄店（内容に変更なし〉・ ＦＩＧ、１ 手続補正書（方式） １．事件の表示 ＰＣＴ／ＥＰ　８２１０００６６ ２、発明の名称 相補肝炎Ａウィルスゲ７ムを含有している雑種ＤＮＡの調製法、該雑種ＤＮＡ、 これを含有するプラスミドベクター、雑種ＤＮＡによって発現されたウィルス特 異蛋白質およびこれらから調製され、これらを含有するワクチン ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　ドイツ連邦共和国デー−８０３４ゲメリンク、グラーツェルシ９トラーセ ３３番 氏名　７オン・デ゛ル・ヘルム、クラウス４、代理人　〒５４１ ６、補正の対象：願書の翻訳文（Ｖｌｌ欄の翻訳をしたもの）および図面の翻訳 文 ７、補正の内容：別紙の通り願書の翻訳文および図面の翻訳文（内容に変更なし ）を提出します。

国際調査報告　丁 １＋’ｍｎ＋ａｌゆ間緬１峨−を鱈カー　ＰＣ↑／Ｆ、Ｐ　Ｑｌ／Ｉ’１ＯｎＡ Ａ第１頁の続き ０発　明　者　ヴインナッカー・エルンストーエルドイッ連邦共和国デー−８０ ００ミユンヘン１９工ルフイラシユトラーセ４番 ０発　明　者　ダインハルト・フリードリヒドイツ連邦共和国デー−５ｏｏｏミ ユンヘン９０ヘルミネープラント−シュトラーセ９番 ■出　願　人　ヴインナッカー・エルンストーエルドイツ連邦共和国デー−８０ ００ミユンヘン１９工ルフイラシユトラーセ４番 ０出　願　人　ダインハルト・フリードリヒドイツ連邦共和国デー−８０００ミ ュンヘン９０ヘルミネ−プラントーシュトラーセ９番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、肝炎ＡウィルスのウィルスＲＮＡを逆転写することによって得られる２本鎖 ＤＮＡを細菌プラスミドにクローンすることを特徴とする、肝炎Ａウィルスに特 異な相補ゲノムを含有している雑種ＤＮＡの製造法。 ２．２本鎖ＤＮＡが、逆ポリメラーゼとそれぞれのプレカーサーヌクレオチドと を用いて予め調製した、肝炎Ａウィルスの超厚ＲＮＡから導かれたものである第 １項に記載の方法。 ３．２本鎖ＤＮＡを含有している大腸菌プラスミドをクローニングに使用するこ とを特徴とする第１項または第２項に記載の方法。 ４６クローンしたプラスミドベクターを制限エンドヌクレアーゼで開裂し１．肝 炎ＡウィルスのＤＮＡに相当する２本鎖ＤＮＡを分離することを特徴とする第１ 項〜第３項のいづれかに記載の方法。 ５、そのゲノムか第１項〜第４項のいづれかに記載の雑種ＤＮＡを含んでいるこ とを特徴とするプラスミドベクター。 ６、ＨＡＶ特異抗ＩＰ、を含んでおり、そして第１項または第２項に記載の雑種 ＤＮＡによって暗号化されている、細菌クローン中で発現された蛋白質または雑 種蛋７、分子雑種形成によって肝炎Ａウィルスを同定するだめの、第１項〜第４ 項のいづれかに記載の雑種ＤＮＡまたは第５項に記載のプラスミドベクターの使 用。 ８、診断およびワクチン製造のための、第６項に記載のＨＡＶ特異蛋白質の使用 。 ９、第１項〜４項に従って雑種ＤＮＡを調製し、第５項に従ってプラスミドベク ターにクローンし、第６項に従って蛋白質または雑種蛋白質として発現された、 通常の担体および補助剤を含有してなる肝炎Ａウィルスに対する活性ワクチン。 １０、第６項に記載の蛋白質または雑種蛋白質を含有している肝炎Ａウイル不に 対するワクチン。 １１、第９項または第１０項に記載の蛋白質で実験動物を免疫処置することによ って得られる肝炎Ａウィルスに対する受動ワクチン（免疫グロブリン）。 １２、そのアミノ酸配列が第１項〜第５項の雑種ＤＮＡのヌクレオチド配列から 導かれたものであるオリゴペプチドを免疫処置用、の担体蛋白質およびハプテン として使用するワクチンの製造方法。 ２１ １３、入熱の弱毒化と同等の人為変異を調製するための第１項〜第５項に記載の ＨＡＶ特異雑種ＤＮＡの使用。