CN108218982A - 人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人巨细胞病毒anti‑UL148多克隆抗体及其制备方法与应用。该人巨细胞病毒anti‑UL148多克隆抗体是以UL148重组融合蛋白为抗原对兔子进行免疫得到血清，然后将血清经过纯化处理后获得。本发明中制备得到的多克隆抗体纯度更高、特异性强，用UL148重组蛋白检测多克隆抗体的特异性，Western blot结果显示，感染了HCMV的HFF细胞，经Western blot检测到UL148基因的表达；该多克隆抗体可以特异性的识别大小约54.5kDa的UL148重组蛋白。本发明中的多克隆抗体可以用于HCMV诊断试剂盒、HCMV相关蛋白检测试剂盒的开发。

Description

人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于医学技术领域，特别涉及一种人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体及其制备方法与应用。
背景技术
巨细胞病毒是一种古老的病毒，可以感染大多数的脊椎动物，但每种特定的巨细胞病毒只感染一个物种，几乎没有证据表明巨细胞病毒可以在不同物种之间交叉感染。人类巨细胞病毒，具有大型双链DNA疱疹病毒基因组，可以使大多数人类终生感染。大多数人感染人巨细胞病毒会导致轻微的发热性疾病，但是在免疫功能不全的病人或新生儿中导致严重的症状。几乎所有感染了人巨细胞病毒后会在整个身体中广泛传播，如上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞等不同的细胞类型都会产生高效的病毒感染。此外，病毒诱发大量的免疫调节通路去破坏宿主先天和适应性反应。
在世界人口当中，人类巨细胞病毒是无处不在的。而感染了人类巨细胞病毒的人群，一般来说，在健康个体中常表现为无症状，但它可能在免疫功能低下的患者中，如移植受者免疫抑制，导致严重的疾病。人巨细胞病毒也被认为是子宫内病毒感染的主要发生原因，据估计，在美国大约有0.64％的孕妇会感染人巨细胞病毒。先天性感染了人巨细胞病毒后可能会发生原发性感染，比如在人类巨细胞病毒血清反应呈阴性感染的母亲或HCMV血清反应呈阳性感染女性中会发生。受孕前的女性在感染了天然的人类巨细胞病毒后会产生母源性免疫，这样会使受孕女性将病毒传播给胎儿的风险降低了69％。此外，血清反应阳性的妇女和孩子可防止再次感染人巨细胞病毒。这些结果表明，在水平和垂直方向传播时，天然免疫是预防人巨细胞病毒的一种很好的保护措施，这一观点已被采纳用于人类巨细胞病毒减毒活疫苗的设计和开发，如Towne疫苗。然而，已经获得天然免疫的人并不能够完全预防再次感染人巨细胞病毒。健康的血清反应呈阳性的女性可再次获得继发性感染，基于病毒传染或依据血清学反应抗原所做出的诊断，不同于之前，由人巨细胞病毒所引起的感染。重要的是,再次感染的女性依然会导致先天性传播，先天性感染出生的孩子可能患有类似的后遗症,但通常好过那些由初次感染产妇所引起的孩子。可能是由于宿主细胞免疫缺陷，造成了天然免疫所产生不完整的保护，例如移植受者的免疫抑制。最后，因自然免疫而产生的抗病毒抗体可能具有病毒株型的特异性，在这种条件下，孕前的母源性免疫，可能无法对先天性的不同人巨细胞病毒株的传播进行有效的防治。理解抗体反应的防治范围对于该病毒疫苗的研发与应用，具有很重要的指导意义。
人巨细胞病毒是一种双链DNA病毒，它的基因组可以编码至少20种糖蛋白。人巨细胞病毒在侵染细胞时需要多种糖蛋白复合物的共同作用。糖蛋白gB是一类融合蛋白。糖蛋白gB的膜融合必须与糖蛋白gH和gL一起发挥作用。由gO、gH、gL所构成的三聚体复合物，介导人巨细胞病毒侵染成纤维细胞，也有研究认为gO/gH/gL可能参与病毒侵染所有细胞类型。由gH/gL和UL128、UL130、UL131所组成的五聚体复合物介导病毒侵染上皮细胞、内皮细胞、白细胞，而这一过程很可能是通过受体介导的细胞内吞作用来实现的。体外纯化单克隆抗体揭示了两类抗病毒抗体的特点:一种抗体中和感染了的上皮细胞，它主要识别的抗原表位位于五聚体复合物上，而另一种抗体中和感染了的成纤维细胞和上皮细胞，识别抗原表位位于gB或gH/gL/gO三聚体复合物上。
许多研究和综述都集中在病毒的长期演化和强调了分子特征上。然而，在过去十年中的主要工作已经表明，在感染的宿主中，病毒还在短时间尺度内演化，几天或几个月。在30多年前发表的基于限制性长度多态性(RFLP)的文章已经表明，人巨细胞病毒在不同的个体间的遗传多样性。这些结果后来被证实与重排序的遗传位点有关，主要集中于糖蛋白gB、gN、g0等，以及低传带和临床样本的全基因组数据。最近的研究表明，人巨细胞病毒在单一个体水平上也呈现出显著的遗传多样性。然而，在一个广泛的人群中混合感染人巨细胞病毒占大约四分之一到一半,包括先天性感染患儿、艾滋病患者、移植受者和成人。2011年的一篇重要文章，通过使用超深焦磷酸测序研究来自HCMV感染的移植受者的gO，gN和gH基因座，从而显示出HCMV在患者体内的不同株型的多样性。他们发现，所有被研究患者都有混合感染，在单个患者中观察到多达6种基因型。类似地，直接来自多形性成胶质细胞瘤(GBM)肿瘤的HCMV基因组的81个224碱基对的深度测序显示病毒的高遗传多样性，包括高变位点。将基因组学与高通量测序结合的工作，显示HCMV的多样性不仅限于基因座，而是跨越整个基因组。事实上，HCMV基因组的几乎每个开放阅读框(ORF)都显示出在宿主内遗传多样性。从这些研究中，已经变得清楚的是，HCMV在人类中是高度多样性的。
HCMV传播到胎儿可以发生在任何妊娠期，但如果初次感染发生在怀孕的前半段，产生不良胎儿的风险似乎是最高的。在先天性感染的婴儿中，约10％在出生时具有疾病的体征和症状。虽然剩余的90％的婴儿出生时无症状，10～15％将随后发展永久性后遗症，包括感觉神经性听力损失和智力迟钝。先天HCMV感染的公共卫生影响是重大的，并且未被充分认识：事实上，由于先天性的HCMV感染，使得更多的儿童患有长期神经发育障碍，比如唐氏综合征或胎儿酒精综合征。
Fowler等人的一项研究证明了孕前免疫的影响，与血清阴性妇女相比，HCMV血清阳性的妇女在未来怀孕中先天性HCMV感染的风险降低了69％。不仅使得HCMV的提前免疫的女性再次感染率降低，而且显著的降低了将病毒传播到胎儿的概率。这些关于孕前免疫的保护作用的结论支持了孕产妇疫苗的开发，以达到降低先天性HCMV的发病率，同时降低在垂直传播发生时所产生疾病的严重性。在理论上，HCMV疫苗也可以有益于HCMV高风险疾病的其他患者群体，包括同种异体移植受者，造血干细胞移植患者和恶性肿瘤患者。然而，从经济和公共卫生角度来看，先天性HCMV感染产生的神经发育损伤的影响，使得育龄妇女成为疫苗开发的最重要的目标群体。
目前常见的疫苗包括：重组HCMV包膜gB与MF59佐剂组成的亚单位疫苗；含有HCMVgB和pp65的双组分α病毒复制子疫苗；有或没有重组IL-12佐剂的减毒活HCMV Towne疫苗和DNA疫苗；重组疱疹口腔炎病毒表达鼠巨细胞病毒gB；复制缺陷型腺病毒载体多表位疫苗。HCMV疫苗的发展方向为：gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体亚单位疫苗，及病毒免疫调节基因缺失型减毒活疫苗。
Li等人的一项研究提供了一种如何构建病毒粒子gH/gL复合补体的机制，以及解释病毒粒子的补体如何有助于病毒定向扩散。UL130和UL131在gH/gL/UL148共沉淀中发现，Li等人提出了可逆的gH/gL/UL130/148和gH/gL/UL131/148复合物与gH/gL/UL128-131形成竞争并指导gH/gL形成gH/gL/gO的模型。gH/gL/UL128-131五聚体复合物，是未来HCMV疫苗的一种发展方向。UL148的表达会增加gH/gL/gO复合物的丰度，而gH/gL/UL128-131复合物丰度可能会降低，因此UL148基因功能的进一步研究对gH/gL/UL128-131五聚体复合物作为疫苗的发展具有很重要的影响。gH/gL/UL148共沉淀物中UL130和UL131的存在，可能仅反映UL148与多聚gH/gL复合物的装配期间形成的中间体gH/gL/UL130和gH/gL/UL131复合物的结合，但不能有效地从内质网中输出。这些都显示出UL148在HCMV的致病过程中以及对gH/gL/UL128-131五聚体复合物疫苗的研究具有了重要的作用。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体。
本发明的另一目的在于提供所述人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体的制备方法。
本发明的又一目的在于提供所述人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体，以UL148重组融合蛋白为抗原对兔子进行免疫得到血清，然后将血清经过纯化处理后获得。
所述的UL148重组融合蛋白优选为纯化后的UL148重组融合蛋白；该UL148重组融合蛋白可通过原核表达获得。
所述的原核表达为在大肠杆菌中进行原核表达。
所述的兔子优选为新西兰大白兔。
所述的免疫优选为3次免疫，包括初次免疫、和第一、二次加强免疫。
所述的初次免疫为采用UL148重组蛋白与弗氏完全佐剂乳化后形成的抗原进行免疫。
所述的UL148重组蛋白溶液与弗氏完全佐剂的体积比为1:1。
所述的第一和第二次加强免疫为采用UL148重组蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后形成的抗原进行免疫。
所述的UL148重组蛋白溶液与不弗氏完全佐剂的体积比为1:1。
所述的纯化处理为采用亲和层析法进行纯化处理。
所述的人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)免疫动物
①初次免疫：将400μg UL148重组融合蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，选择兔子脊柱两旁的数点进行皮下注射，每点注射200μl；
②第一次加强免疫：在初次免疫2周后，将200μg UL148重组蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂乳化后，选择兔子脊柱两旁的数点进行皮下注射，每点注射200μl；
③第二次加强免疫：在第一次加强免疫2周后，重复步骤②的操作；
(2)分离血清
第二次加强免疫2周后，采集兔全血，得到UL148重组蛋白的兔抗血清；
(3)UL148重组蛋白的多克隆抗体纯化
采用亲和层析法对步骤(2)中获得的兔抗血清进行纯化，得到人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体。
所述的人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体的制备方法，在步骤(1)④之后还包括用ELISA法测效价的步骤：第二次加强免疫2周后，收集兔血，用ELISA法测效价。
所述的人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体的制备方法，在步骤(2)之后还包括用间接ELISA法测效价的步骤：第二次加强免疫后，采集兔耳静脉血，以免疫前的兔血清为阴性对照，以UL148重组蛋白为抗原，采用间接ELISA法测定兔血清抗体效价，血清稀释倍数为200，400，800，1600，3200，6400，12800，25600，51200，102400。
所述的人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体的制备方法，还包括将步骤(3)中经亲和层析法纯化后的人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体进行透析的步骤。
所述的透析的条件优选为：在0.01M PBS缓冲液中透析过夜。
所述的人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体在制备HCMV诊断试剂盒、或HCMV蛋白检测试剂盒中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明用纯化的UL148重组蛋白免疫新西兰大白兔，从而获得免疫兔血清，然后亲和纯化，获得相应的多克隆抗体，并用ELISA法检测该抗体的效价，经ELISA测定，免疫效价≥204800。用UL148重组蛋白检测多克隆抗体的特异性，Western blot结果显示，感染了HCMV的HFF细胞，经Western blot检测到UL148基因的表达。该多克隆抗体可以特异性的识别大小约54.5kDa的UL148重组蛋白。
2、本发明中将纯化好的UL148蛋白作为抗原去免疫兔子。在初次免疫和两次加强免疫后，在兔的耳静脉取血，然后用纯化好的UL148蛋白包被，ELISA测定兔子的多抗血清的免疫效价≥51200。多抗血清经亲和纯化后，得到的多克隆抗体经ELISA测定，免疫效价≥204800。
附图说明
图1是本发明中用ELISA测定兔抗效价图。
图2是本发明中用ELISA测定纯化后多克隆抗体效价图。
图3是Western blot检测Anti-UL148多克隆抗体特异性的结果图；其中，泳道M为蛋白marker；泳道1为pET32a(+)质粒转化BL21(DE3)表达菌株，经IPTG诱导，菌体超声破菌，离心后沉淀；泳道2为pET32a(+)-UL148重组质粒转化BL21(DE3)表达菌株后，未经IPTG诱导，菌体超声破菌，离心后沉淀；泳道3为pET32a(+)-UL148重组质粒转化BL21(DE3)表达菌株后，经IPTG诱导，菌体超声破菌，离心后沉淀；泳道4为纯化后重组蛋白样品(箭头：指示纯化后的重组蛋白)。
图4是在电子显微镜下观察，生长状态正常的HFF细胞图(明场)。
图5是在电子显微镜下观察，病变后的HFF细胞图(明场)。
图6是在荧光电子显微镜下观察，带有GFP的HCMV感染HFF细胞后的效应图。
图7是PT-PCR检测UL148基因的表达结果图；其中，泳道M为DNA marker；泳道1和2为感染了HCMV的HFF细胞后，检测UL148目的基因表达情况；泳道3为未感染HCMV的HFF细胞，检测UL148目的基因表达情况(箭头指示目的基因的大小)。
图8是Anti-UL148多克隆抗体的Western blot结果图；其中，泳道1为未感染的HFF细胞；泳道2为感染HCMV的HFF细胞(箭头表示UL148蛋白的分子量)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明中涉及的UL148重组蛋白可以通过如下方法制备得到：
1.引物设计
根据pET32a(+)质粒图谱和Genebank上公布的UL148基因的序列，选取NcoI和HindIII两个酶切位点，用软件Primer 5.0和Snapgene设计相应引物来扩增UL148基因，大小约为951bp(核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，蛋白翻译产物如SEQ ID No：2所示)。设计后的引物合成由生工(生工生物工程(上海)股份有限公司)来完成。
表1UL148引物设计
Primers Primer sequence
UL148-sense-NcoI(P1) 5′-CATGCCATGGGCTTGCTGTTCACGCTTGT-3′
UL148-anti-sense-xhoI(P2) 5′-CCGCTCGAGCCGACGCCGCGACA-3′
2.以HCMV BAC Towne(参考文献：Human embryonic lung fibroblasts treatedwith artesunate exhibit reduced rates of proliferation and humancytomegalovirus infection in vitro)为模板扩增出UL148目的基因，然后将UL148目的基因连接到pET32a(+)载体中，获得重组载体pET32a(+)-UL148，再将其转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组质粒表达菌；最后将获得的重组质粒表达菌进行诱导(终浓度为1mM/L的诱导剂IPTG、37℃诱导5h)表达，得到UL148重组蛋白。UL148重组蛋白经进一步的纯化(镍柱纯化)获得纯化后的UL148重组蛋白。
实施例1
一、抗体制备及ELISA测定其效价
1.免疫兔子
(1)免疫用的兔子为2.0kg左右重的新西兰大白兔(购于常州卡文斯实验动物有限公司，雄性，兔龄3个月，体重约2kg)；免疫之前，在兔子的耳朵的静脉取阴性血清。
(2)用75％的乙醇擦拭兔子耳部静脉，待耳部静脉充分扩张，用注射器插入静脉抽取阴性血2ml，全血在室温静置120min后，6000g离心10min，收取血清。
(3)初次免疫，将1ml 400μg(1ml抗原溶液中UL148重组蛋白含量为400μg)纯化后的UL148重组蛋白溶液与1ml弗氏完全佐剂充分乳化后形成的抗原溶液吸入注射器内，选脊柱两旁的数点进行皮下注射，每点注射200μl。
(4)第一次加强免疫(初次免疫2周后)，将1ml 100～200μg(1ml抗原溶液中UL148重组蛋白含量为100～200μg)纯化后的UL148重组蛋白溶液与1ml弗氏不完全佐剂充分乳化后形成的抗原溶液吸入注射器内，同初次免疫一样选几个点，每点注射200μl。
(5)第二次加强免疫(第一次加强免疫2周后)，方法同第一次加强免疫。
(6)第三次加强免疫(第二次加强免疫2周后)，方法同第一次加强免疫。
(7)第三次加强免疫10天后，收集5ml兔血，得到UL148重组蛋白的兔抗血清，然后用ELISA法测效价(图1)。
2.ELISA测定兔抗效价
(1)用包被液稀释抗原(上述免疫获得的血清)，稀释的终浓度为2μg/ml，100μl/孔，4℃条件下过夜，然后用洗液洗涤2次。
(2)每孔加入200μl的封闭液封闭，37℃孵箱，2h，然后用洗液洗涤1次。
(3)多抗血清从200倍开始2倍梯度稀释(见表1)，空白对照为PBS，阴性对照为阴性血清用PBS进行200倍稀释；每孔均为100μl，37℃孵箱，1h；然后用洗液洗涤3次。
(4)加入PBS稀释20000倍的二抗，每孔100μl，37℃孵箱，1h；取出后用洗液洗涤3次。
(5)显色，每孔显色液100μl，显色时间为5～15min。
(6)每孔加入50μl终止液进行终止。
(7)波长450测吸光值，记录保存数据，并做图分析(表2)。
表2间接ELISA检测兔血清效价
稀释倍数 阳性血清 阴性血清 空白(PBS)组
200 1.622 0.016 0.049
400 1.581 0.016 0.051
800 1.545 0.015 0.047
1600 1.446 0.014 0.047
3200 1.385 0.014 0.042
6400 1.316 0.015 0.039
12800 1.173 0.013 0.048
25600 0.946 0.011 0.031
51200 0.9 0.01 0.033
102400 0.775 0.009 0.036
3.亲和层析纯化Anti-UL148多克隆抗体
血清用相应的偶联缓冲液(偶联缓冲液：20mM磷酸钠缓冲液，pH7.0)以1：3的比例进行稀释，并用0.22μm的滤膜过滤，除去细胞残渣及颗粒物。样品处理后进行亲和纯化。
上述纯化过程中得到的抗体，用0.01M PBS缓冲液透析过夜，重复3次。之后ELISA测定纯化后兔抗效价(见表3和图2)。
表3间接ELISA检测纯化后多克隆抗体效价
稀释倍数 阳性血清 空白(PBS)组
200 1.691 0.035
400 1.627 0.037
800 1.608 0.041
1600 1.553 0.034
3200 1.508 0.032
6400 1.495 0.036
12800 1.413 0.046
25600 1.313 0.037
51200 1.239 0.048
102400 1.055 0.035
204800 0.784 0.042
二、检测多克隆抗体的特异性及应用
1.HFF细胞的培养
(1)HFF细胞复苏
把事先准备好的离心管、培养基、培养瓶放于超净工作台中。从液氮罐中取出装有HFF(人包皮成纤维)细胞的冻存管，并迅速放于37℃的恒温水浴锅中，并轻轻摇动使其尽快融化。用移液器取冻存管中的冻存液于离心管中进行短暂离心，后加入细胞培养液，并轻轻吹打混匀。把混匀后的细胞接种到培养瓶，放于CO2培养箱中培养。
(2)HFF细胞传代培养
在光学显微镜下观察细胞生长状态，当培养瓶中的细胞生长到一定数量后进行传代。先把培养瓶中的原有的培养液弃去，并用PBS缓冲液轻轻冲洗细胞3次。向培养瓶中添加1ml左右的胰酶，当培养瓶中出现小空斑时，将胰酶轻轻吸出。用移液器吸取培养液加入培养瓶中，并轻轻把贴壁的细胞吹洗下来，然后进行细胞传代。
(3)HFF细胞冻存
选取对数生长期的细胞，1000g离心5min，弃去上清液。吸取细胞冻存液重悬细胞沉淀，混匀后分装于冻存管中，并注明冻存细胞名称、冻存时间及传代数。先将冻存管置于4℃条件下30min，然后移入-80℃超低温冰箱中过夜，之后放入液氮罐中保存即可。
2.HCMV在HFF细胞中的培养
(1)选取生长状况良好并长满单层的HFF细胞进行HCMV病毒接种。生长状态正常的HFF细胞如图4所示。
(2)将培养瓶中的培养液倒掉，并用PBS洗涤数次后，用移液器加入适量的HCMV病毒悬液。
(3)接种好的培养瓶置于37℃的细胞培养箱中1h，期间要经常要摇晃培养瓶。
(4)1h后取出培养瓶，用PBS洗涤3次，并重新添加培养液，置于37℃的细胞培养箱中培养，直至绝大多数细胞出现病变。病变后的HFF细胞如图5所示；带有GFP(绿色荧光蛋白)的HCMV感染HFF细胞后的效应图如图6所示。
将病变后的细胞置于-20℃冰箱中冻存。
3.HCMV感染HFF细胞后总RNA的提取
(1)贴壁培养细胞的裂解
倒出培养液，使用1×PBS清洗一次；向培养细胞中加入适当量的裂解Buffer RL(使用前先确认已加入50×DTT溶液)，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落；将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。
(2)裂解液室温静置2min。
(3)将gDNA柱子安放到2ml的收集管上；将裂解液转移入到gDNA柱子中；16000g，离心1min。
(4)弃gDNA柱子，保留2ml收集管中的滤液；加入与液体等体积的70％乙醇(此时可能会出现沉淀)，使用移液枪将溶液混合均匀。
(5)立即将混合液(含沉淀)全部转入到RNA柱子(含2ml收集管)中。16000g，离心1min，弃滤液。将RNA柱子放回到2ml收集管中。
(6)将500μl的Buffer RWA加入至RNA柱子中，16000g离心30sec，弃滤液；将600μl的Buffer RWB加入至RNA柱子中，16000g离心30sec，弃滤液。
(7)DNase I消化
取5μl 10×DNase I Buffer，4μl Recombinant DNase I(RNase free，5U/μl)，41μl RNase free dH2O到新的1.5ml RNase Free Tube中，混合均匀；向RNA柱子膜中央加入50μl DNase I反应液，室温静置15min；向RNA柱子膜中央加入350μl的Buffer RWB，16000g离心30sec，弃滤液。
(8)将600μl的Buffer RWB加入至RNA柱子中，16000g离心30sec，弃滤液。
(9)将RNA柱子重新安置于2ml收集管上，16000g离心2min；将RNA柱子安置于1.5ml的RNase Free收集管(试剂盒提供)上，在RNA柱子膜中央处加入50μl的RNase Free dH2O或0.1％DEPC处理水，室温静置5min。
(10)16000g离心2min洗脱RNA；若想提高RNA的收量，可再向RNA Spin Column膜中央加入50μl的RNase Free dH2O或0.1％DEPC处理水洗脱RNA；若要得到高浓度的RNA，也可以将第一次的洗脱液重新加回至RNA柱子中，室温静置5min，16000g离心2min洗脱RNA。
4.RNA逆转录为cDNA
表4RNA逆转录为cDNA的反应体系
成分 体积(μl)
5×PrimeScript RT Master Mix 2μl
总RNA 5μl
RNase Free dH2O 补足至10μl
轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下：
表5反转录反应条件
温度 时间
37℃ 15min
85℃ 5sec
4℃
反转录反应完成后，于-20℃冰箱中保存。
5.RT-PCR方法鉴定HCMV UL148基因表达
以上述逆转录得到的cDNA为模板，反应体系与条件与以HCMV BAC Towne为模板扩增出UL148目的基因相同。经PCR扩增后，将反应物点样于已备好的1％的琼脂糖凝胶中电泳，利用凝胶成像仪扫描分析并保存结果(图7)。
6.Western blot检测Anti-UL148的特异性
(1)SDS-PAGE凝胶电泳结束后，取出玻璃板，并将其拆开，根据目的蛋白的大小，裁取相应位置的凝胶，并浸泡于事先配制好的1×膜转移缓冲液中。
(2)根据量取的凝胶的大小，裁剪与其相应大小的滤纸4块及PVDF膜1张，将裁剪好的PVDF膜放于甲醇中，浸泡约30sec后，与滤纸一起浸泡于膜转移缓冲液中，浸泡20min。
(3)浸泡结束后，吸取适量的膜转移缓冲液，涂抹于Bio-Rad半干转印仪上，从浸泡液中分别按先后顺序取出凝胶、PVDF膜和滤纸，从下往上，按照两层滤纸-PVDF膜-凝胶-两层滤纸的结构，放于半干转印仪上，放置时，层与层之间不能有气泡，设置程序为：恒压25V、1h。
(4)转膜完成后，去除滤纸及凝胶后，轻轻取出PVDF膜，浸泡于事先配制好的1×TBST中，浸泡片刻后，将膜轻轻放入裁剪好的封口袋中，加适量事先配制好的5％的脱脂奶粉，用封口机将袋口封好，并置于室温中的摇床上，低速摇动，封闭1h。
(5)封闭完成后，剪开袋口，从中取出PVDF膜，用1×TBST润洗后，转移至新的并裁剪好的封口袋中，加入按比例稀释好的一抗，放置于4℃层析柜中的摇床上，低速转动，孵育过夜。
(6)第二天，剪开袋口，轻轻取出PVDF膜，放于事先配制好的1×TBST中，放于摇床中，漂洗PVDF膜，每次30min，总共3次。
(7)漂洗结束后，稍微滤干PVDF膜，转入一新的封口袋中，加入适量按比例稀稀释好的二抗，放置于4℃层析柜中的摇床上，低速转动，孵育2h。
(8)孵育结束后，轻轻夹取出PVDF膜，放于事先配制好的1×TBST中，放于摇床上，漂洗PVDF膜，每次30min，总共3次。
(9)漂洗结束后，稍微滤干PVDF膜，滴加适量的ECL显影液，反应1～2min后，放入凝胶成像仪中进行曝光，并拍照保存结果(图3)。
三、Anti-UL148多克隆抗体的检测应用
分别以HCMV感染的HFF细胞和未感染HCMV的HFF细胞裂解物作为抗原，以纯化后的Anti-UL148多克隆抗体作为一抗，进行WesternBlot检测。经检测，在36.5kDa处出现清晰条带(图8)，符合HCMV UL148蛋白的分子量(36.5kDa)。结果显示，制备出Anti-UL148多克隆抗体可识别HCMV UL148基因所编码的蛋白质，并能特异性结合HCMV UL148蛋白。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体及其制备方法与应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 951
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> UL148基因
<400> 1
ctaccgacgc cgcgacacca ggtaggttat caaaacgcga gcccatatcg ccgccatcat 60
tgtaatcagc aatgtgttga ggtactgcac gatgaatctg tctagtgaca ccagccaacc 120
ctctgctttt gcgggcaagc gcgctttcgg tgacagggtg tatcgtacgt agccgcgggt 180
caggcgcgcg ttgtagcggt acacgcagaa atctatccac aggccaacgc ccggctgtag 240
cttaggatgg tggataatag cgcggtgacg tacgccacgg ggctttagaa tctccacctg 300
taaggccatc tcctccaggt agtgggtctg actgcgacgc agcgtccagt tcatgtaaaa 360
gtcggtctcg ccgtgtccgg ccacgtagag gctgcttact aaatcgggcg ccagagctag 420
atcaggcgta tcaaattcca ctgccaggcg acctgattct aacggttcca cgatccggga 480
gagcgtttct agatatagag caaagcgtac cacgtctacc tgcggtgtaa aaaactgttg 540
tgggcgttca ccgtcgttga ccacgtaagc cacgtagagg ccaacatttt ccaccacggg 600
ttctagctgc aggcggcacg taaagcttag aaacgacggc tgtacggttt ggttcccgtg 660
aagctgaagc gtcacttcct tgccggggct caccgtgctg taacgccgca ccgagtcggt 720
catctgctcc agatcggtag accagaaggg cgtgcaatgc atactgtccc agtcgcgaca 780
cgcagcccag cctagctcgg tgaagggtcg acgcacaccc gaaaaagtgt gcttgaagac 840
cagggggtcg cctcggtagc tcagtagccg aacatgcaca tagtcgcggc tagcgttgac 900
agacggcccg tagagggcca gcaggacaag cgtgaacagc aagcgcaaca t 951
<210> 2
<211> 316
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> UL148蛋白
<400> 2
Met Leu Arg Leu Leu Phe Thr Leu Val Leu Leu Ala Leu Tyr Gly Pro
1 5 10 15
Ser Val Asn Ala Ser Arg Asp Tyr Val His Val Arg Leu Leu Ser Tyr
20 25 30
Arg Gly Asp Pro Leu Val Phe Lys His Thr Phe Ser Gly Val Arg Arg
35 40 45
Pro Phe Thr Glu Leu Gly Trp Ala Ala Cys Arg Asp Trp Asp Ser Met
50 55 60
His Cys Thr Pro Phe Trp Ser Thr Asp Leu Glu Gln Met Thr Asp Ser
65 70 75 80
Val Arg Arg Tyr Ser Thr Val Ser Pro Gly Lys Glu Val Thr Leu Gln
85 90 95
Leu His Gly Asn Gln Thr Val Gln Pro Ser Phe Leu Ser Phe Thr Cys
100 105 110
Arg Leu Gln Leu Glu Pro Val Val Glu Asn Val Gly Leu Tyr Val Ala
115 120 125
Tyr Val Val Asn Asp Gly Glu Arg Pro Gln Gln Phe Phe Thr Pro Gln
130 135 140
Val Asp Val Val Arg Phe Ala Leu Tyr Leu Glu Thr Leu Ser Arg Ile
145 150 155 160
Val Glu Pro Leu Glu Ser Gly Arg Leu Ala Val Glu Phe Asp Thr Pro
165 170 175
Asp Leu Ala Leu Ala Pro Asp Leu Val Ser Ser Leu Tyr Val Ala Gly
180 185 190
His Gly Glu Thr Asp Phe Tyr Met Asn Trp Thr Leu Arg Arg Ser Gln
195 200 205
Thr His Tyr Leu Glu Glu Met Ala Leu Gln Val Glu Ile Leu Lys Pro
210 215 220
Arg Gly Val Arg His Arg Ala Ile Ile His His Pro Lys Leu Gln Pro
225 230 235 240
Gly Val Gly Leu Trp Ile Asp Phe Cys Val Tyr Arg Tyr Asn Ala Arg
245 250 255
Leu Thr Arg Gly Tyr Val Arg Tyr Thr Leu Ser Pro Lys Ala Arg Leu
260 265 270
Pro Ala Lys Ala Glu Gly Trp Leu Val Ser Leu Asp Arg Phe Ile Val
275 280 285
Gln Tyr Leu Asn Thr Leu Leu Ile Thr Met Met Ala Ala Ile Trp Ala
290 295 300
Arg Val Leu Ile Thr Tyr Leu Val Ser Arg Arg Arg
305 310 315
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> UL148引物-F
<400> 3
catgccatgg gcttgctgtt cacgcttgt 29
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> UL148引物-R
<400> 4
ccgctcgagc cgacgccgcg aca 23

Claims (9)

1.一种人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体，其特征在于：以UL148重组融合蛋白为抗原对兔子进行免疫得到血清，然后将血清经过纯化处理后获得。
2.根据权利要求1所述的人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体，其特征在于：
所述的免疫为3次免疫，包括初次免疫和第一、二次加强免疫；
所述的初次免疫为采用UL148重组蛋白与弗氏完全佐剂乳化后形成的抗原进行免疫；
所述的第一、第二次加强免疫为采用UL148重组蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后形成的抗原进行免疫。
3.根据权利要求1所述的人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体，其特征在于：
所述的UL148重组蛋白溶液与弗氏完全佐剂的体积比为1:1；
所述的UL148重组蛋白溶液与不弗氏完全佐剂的体积比为1:1。
4.根据权利要求1所述的人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体，其特征在于：所述的兔子为新西兰大白兔。
5.根据权利要求1所述的人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体，其特征在于：所述的纯化处理为采用亲和层析法进行纯化处理。
6.权利要求1～5任一项所述的人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)免疫动物
①初次免疫：将400μg UL148重组融合蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，选择兔子脊柱两旁的数点进行皮下注射，每点注射200μl；
②第一次加强免疫：在初次免疫2周后，将200μg UL148重组蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂乳化后，选择兔子脊柱两旁的数点进行皮下注射，每点注射200μl；
③第二次加强免疫：在第一次加强免疫2周后，重复步骤②的操作；
(2)分离血清
第二次加强免疫2周后，采集兔全血，得到UL148重组蛋白的兔抗血清；
(3)UL148重组蛋白的多克隆抗体纯化
采用亲和层析法对步骤(2)中获得的兔抗血清进行纯化，得到人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体的制备方法，其特征在于，在步骤(1)④之后还包括用ELISA法测效价的步骤，具体为：第二次加强免疫2周后，收集兔血，用ELISA法测效价。
8.根据权利要求6所述的人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体的制备方法，其特征在于：还包括将步骤(3)中经亲和层析法纯化后的人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体进行透析的步骤；
所述的透析的条件为：在0.01M PBS缓冲液中透析过夜。
9.权利要求1～5任一项所述的人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体在制备HCMV诊断试剂盒、或HCMV蛋白检测试剂盒中的应用。
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